一种含二氧化钛纳米粒子用于预防或治疗癌症的药物组合物及其应用
阅读：607发布：2023-02-05
专利汇可以提供一种含二氧化钛纳米粒子用于预防或治疗癌症的药物组合物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种二 氧 化 钛 纳米粒子 (TiO2)，及包含所述二氧化钛纳米粒子的用于非光动 力 疗法、非光热和非声动力疗法的药物组合物，所述二氧化钛纳米粒子可通过调节细胞内渗透压，上调通道蛋白αENaC，使细胞线粒体膜电位发生去极化，诱 导线 粒体孔蛋白VDAC1上调，造成Cyt-c和ATP的流失，进一步激活caspase-3，可显著促进 肿瘤 细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的生长和增殖，使其细胞周期出现S期阻滞，而对正常细胞系的 生物 学功能无明显影响。本发明进一步提供了一种包含所述二氧化钛纳米粒子的抑制肿瘤的材料，以及所述二氧化钛纳米粒子及其药物组合物在 治疗 和 预防 癌症中的应用。，下面是一种含二氧化钛纳米粒子用于预防或治疗癌症的药物组合物及其应用专利的具体信息内容。
1.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其特征在于包含二氧化钛纳米粒子，并且所述的药物组合物并非是用于癌症的光动力疗法、光热和声动力疗法的药物组合物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于所述二氧化钛纳米粒子为10-15纳米的颗粒大小的二氧化钛纳米粒子。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物还包含一种或多种对癌症有效的其他活性成分。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于所述对癌症有效的其他活性成分是紫杉醇。
5.根据权利要求2或3中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物还可以包含至少一个针对癌细胞或肿瘤组织中的生物部分的靶向部分。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于所述靶向部分为唾液酸，其专一性地与仅存在在肿瘤组织或肝癌细胞中的分子标志物唾液酸受体结合。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述的癌症选自肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、胰腺癌、眼癌、骨髓癌、淋巴系统癌或甲状腺癌。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于所述的癌症为肝癌。
9.一种抑制肿瘤的材料，其特征在于所述材料包含10-15纳米颗粒大小的二氧化钛纳米粒子。
10.10-15纳米的颗粒大小的二氧化钛纳米粒子在制备治疗或预防癌症或促进癌细胞凋亡的药物组合物中的用途，其特征在于所述的药物组合物并非用于癌症的光动力疗法、光热和声动力疗法的药物组合物。
一种含二氧化钛纳米粒子用于预防或治疗癌症的药物组合
物及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物治疗学领域，更具体的说，是属于癌症治疗领域。特别地，本发明涉及一种包含纳米材料二氧化钛纳米粒子的用于非光动力疗法、非光热和非声动力疗法的药物组合物、包含二氧化钛纳米粒子的抑制肿瘤的材料以及利用所述二氧化钛纳米粒子和所述药物组合物来治疗和预防癌症，尤其是肝癌的方法。
背景技术
[0002] 2012年全球新增1400万癌症患者，两成以上在中国。2012年全球共新增癌症病例1400万，820万人死亡，新增病例近一半在亚洲。2015年2月3日，世界卫生组织(WHO)发布了《全球癌症报告2014》，这是6年来首篇概述全球癌症情况的报告。据WHO预测，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，到2035年将达到2400万人。相比世卫组织的报告数据，中国自己的数据形势更为严峻。在全国肿瘤登记中心发布的《2013中国肿瘤登记年报》中显示：我国年新发癌症病例数309万例，250万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。中国庞大人口基数，令中国癌症新增病例和死亡人数均居世界首位，每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤。恶性肿瘤严重影响国民健康，其发病与各种环境和遗传因素相关，其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinorma，HCC)是我国常见的消化道恶性肿瘤。据世界卫生组织统计数据显示，目前全球每年肝癌新发病例63万例，死亡人数约60万。在我国每年超过30万新发患者，是死亡率居第二位的癌症“杀手”，常见于中年男性。因恶性度高、进展快，确诊时大多已属中晚期，治疗难度大、死亡率高，诊断后未治疗患者中位生存期仅为6个月，5年生存率小于5％。
[0003] 肝癌的发病机制不清，可能与如下多种因素有关：病毒性肝炎与肝硬化、黄曲霉毒素、其他化学致癌物、寄生虫等。近年来，随着分子生物学技术的不断进步，对HCC发病机制的研究愈发深入。其发病机制可能与如下几方面相关：①抑癌基因，如WWOX基因、Parkin基因、RB基因等；②癌基因，如陷阱受体3、垂体瘤转化基因1；③生长因子，如HGF、TGF、血小板源生长因子；④病毒相关基因，如HBV及HCV的主要功能蛋白编码基因。我国肝癌主要致病因素是慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染，HBV一方面通过与免疫分子相互作用影响机体免疫系统；另一方面通过其编码蛋白影响细胞增殖和肿瘤的发生,其预后差的根本原因是HBV相关肝癌的发病机制至今未能明确、且缺乏有效的治疗方法。明确肝癌尤其是HBV相关肝癌的发病机制一直是传染病防治研究中的关键领域之一，而有效治疗肝癌的药物更是国内外多年研究探求的目标。
[0004] 临床实践中只有约15％的肝癌患者适宜手术，且术后易复发；而放疗、化疗、瘤内无水酒精注射等仅能限制肿瘤发展，无法逆转病情；肝移植术后长期应用免疫抑制剂使患者极易复发，在发展中国家由于供体来源及费用问题仍难以推广；新型多靶点靶向治疗药物索拉非尼，其研究对象主要为欧美白种人，在人种及致病因素之间与我国都存在明显差异，更为关键的是价格昂贵，即使在国外也难以负担，在我国更无法成为晚期肝癌患者的常规治疗方法。目前应用的多种药物以及多种给药方案，总体评价疗效并不理想，其复发率高，5年生存期极低，缺乏有效的治疗方法。肝癌是我国当前和今后相当长时期内危害人民健康的重要因素，揭示其发病机制、研发有效的药物是国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题。因此，治疗肝癌药物的研究也变得极为重要和迫切。
[0005] 然而用化学疗法药物治疗癌症存在一些重大的不足，包括：i)药物对于正常组织和肿瘤组织的非特异性毒性；ii)向靶细胞递送药物的无效率；以及iii)药物不合适的释放。
[0006] 二氧化钛作为一种重要的无机材料，被应用于各个领域。传统上，二氧化钛被广泛应用于涂料、陶瓷、化妆品等领域。而作为一种活性材料，纳米结构的二氧化钛则被广泛应用于传感器、电致变色显示、气相催化剂、燃料电池、锂离子电池、光伏、光电化学电池及光催化等领域。与其他无机材料相比，二氧化钛具有几个优点:地球存储量大、低毒性、化学和热力学稳定性及抗光腐蚀性。而纳米二氧化钛具有良好的紫外线吸收性能、小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应等，导致纳米微粒的热、磁、光、敏感特性和表面稳定性等性能不同于常规粒子，可用于疾病的光动力学、光热及声动力学治疗，但并没有发现纳米二氧化钛作为常规药物组合物用于治疗癌症，尤其是肝癌。
发明内容
[0007] 本发明是基于申请人发现二氧化钛纳米粒子可调节细胞内渗透压，上调通道蛋白αENaC，使细胞线粒体膜电位发生去极化，诱导呼吸链关键蛋白ACSS1表达水平下调，线粒体相关蛋白SirT3和VDAC1的表达水平上调，造成Cyt-c和ATP的流失，并进一步激活caspase-3，可显著促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的生长和增殖，使其细胞周期出现S期阻滞，而对正常细胞系的生物学功能无明显影响。由此发现二氧化钛纳米粒子可以用于癌症，尤其是肝癌的生物治疗。
[0008] 因此本发明的一个方面提供了一种包含所述二氧化钛纳米粒子的药物组合物，优选所述二氧化钛纳米粒子为10-15纳米的颗粒大小的二氧化钛纳米粒子。
[0009] 所述药物组合物可用于治疗和预防以肿瘤生长、转移和血管生成为特征的人体或动物体疾病，尤其是癌症，能够促进癌细胞的凋亡。优选所述治疗和预防方法不是光动力疗法、光热和声动力疗法。
[0010] 原则上，本发明所述的二氧化钛纳米粒子或包含二氧化钛纳米粒子的药物组合物可治疗任何类型的癌症，并避免与药物抗性肿瘤相关的问题。例如本发明所述的二氧化钛纳米粒子或包含二氧化钛纳米粒子的药物组合物可用于治疗肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、胰腺癌、眼癌、骨髓癌、淋巴系统癌或甲状腺癌等癌症。优选用于治疗肝癌。
[0011] 当用于治疗或预防上述癌症时，二氧化钛纳米粒子和/或其药物组合物可单独给药或应用，也可与其它药物活性剂联合用药。因此本发明所述的药物组合物除二氧化钛纳米粒子外还任选地可包含一种或多种其他对癌症有效的活性成分。优选其他对癌症有效的活性成分为具有细胞毒性作用的可用于化疗的化合物，更优选其他对癌症有效的活性成分为紫杉醇。
[0012] 本发明所述的药物组合物还可以包含至少一个靶向部分，所述靶向部分为对通常仅存在于癌细胞或肿瘤组织中的生物部分例如分子标志或结构(例如，基因、蛋白质)具有优先的结合亲和力的分子。优选所述靶向部分为唾液酸，其专一性地与仅存在于肿瘤组织或癌细胞表面的分子标志物唾液酸受体结合，使本发明的药物组合物能够特异性地靶向肿瘤组织或肝癌细胞。更优选所述唾液酸与二氧化钛纳米粒子通过共价键缀合。
[0013] 本发明的另一个方面提供了一种抑制肿瘤的材料，所述材料包含二氧化钛纳米粒子，优选包含10-15纳米颗粒大小的二氧化钛纳米粒子。
[0014] 本发明的再一个方面提供了二氧化钛纳米粒子在制备治疗癌症的药物组合物中的应用，优选所述的药物组合物并非用于癌症的光动力疗法、光热和声动力疗法的药物组合物，更加优选所述的二氧化钛纳米粒子的颗粒大小为10-15纳米。
[0015] 进一步地，本发明还提供了二氧化钛纳米粒子及包含所述二氧化钛纳米粒子的药物组合物在治疗和预防癌症以及促进癌细胞凋亡中的应用。优选所述治疗和预防方法不是光动力疗法、光热和声动力疗法，更加优选所述的二氧化钛纳米粒子的颗粒大小为10-15纳米。
[0016] 进一步地，本发明还提供了二氧化钛纳米粒子在制备治疗或预防癌症或促进癌细胞凋亡的药物组合物中的应用。优选所述的药物组合物并非用于癌症的光动力疗法、光热和声动力疗法的药物组合物，更加优选所述的二氧化钛纳米粒子的颗粒大小为10-15纳米。
[0017] 本发明的药物组合物除有效的活性成分外还包含一种或多种药学可接受的成分或载体的药物组合物。合适的药学可接受的成分和载体是本领域技术人员熟知的，例如，盐水溶液、等渗溶液、稀释剂、赋形剂、佐剂、填充剂、缓冲液、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、稳定剂、增溶剂、表面活性剂(例如，润湿剂)、掩蔽剂、着色剂、调味剂和甜味剂。在标准药学教科书中可找到合适的载体、稀释剂、赋形剂等。
[0019] 通常，治疗癌症或癌症的治疗包括经口服(例如通过吞咽)或更优选肠胃外对受治疗者施用。优选肠胃外施用包括，但不限于皮下、皮内、肌肉内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、包膜下、眼眶内、腹腔内、气管内、角质层下、关节内、蛛网膜下和胸骨内注射。给药可为系统或局部的。各种递送系统(例如包囊化在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中)也可用于给药化合物和/或其药物组合物。给药的优选模式由实施者来判断，并部分有赖于给药位点的情况。在大多数情况下，给药将导致所述化合物和/或其药物组合物释放到血液中。
[0020] 药物组合物可以是液体、溶液或悬浮液(例如，水溶液或非水溶液)、乳液(例如，水包油型、油包水型)、酏剂、糖浆、药糖剂、片剂(例如，包衣片)、颗粒、粉末、糖锭、锭剂、胶囊(例如硬质和软质明胶胶囊)、丸剂、安瓿、大药丸、酊剂、凝胶、糊剂或油的形式。
[0021] 通常，药物组合物会包含治疗有效量的本发明的二氧化钛纳米粒子。本领域技术人员将理解二氧化钛纳米粒子或包含二氧化钛纳米粒子的药物组合物的适当剂量可因患者而异。测定最佳剂量将通常包括针对任何风险或有害副作用平衡疗效水平。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括施用途径、施用时间、二氧化钛纳米粒子的排泄速率、治疗的持续时间、组合使用的其他化合物和/或材料、病症的严重度和患者的物种、性别、年龄、重量、病症、综合健康状况和之前的医疗史。尽管通常会选择在作用部位达到实现期望作用的局部浓度的剂量，但剂量和施用途径将最终依据医师或临床医生的判断。
[0022] 通常，本发明的用于治疗癌症的治疗或方法包括对受治疗者施用治疗有效量的本发明所述的二氧化钛纳米粒子或包含二氧化钛纳米粒子的药物组合物，优选所述的二氧化钛纳米粒子的颗粒大小为10-15纳米。
[0023] 可以在整个治疗过程中以一种剂量连续或间歇地(例如，在以合适间隔的分次剂量)进行施用。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员熟知的，且随用于疗法的制剂、疗法的目的、被治疗的靶组织或细胞和被治疗的受治疗者而变化。并可以供治疗医师或临床医生选择不同的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
[0025] 术语“患者”或“受治疗者”可互换使用，是指哺乳动物如人和非人灵长类动物，以及实验动物如兔，大鼠和小鼠，及其它动物。
[0026] “癌症”或者“肿瘤”是同义术语，是指特征在于细胞不受控制的异常增殖、病变细胞的局部传播或者通过血液和淋巴系统播散至机体其它部分(即转移)的能力以及许多特征性结构和/或分子学特征的任一种疾病。“癌症”或者“肿瘤”细胞是指具有特异性结构性质、缺少分化并且能浸润和转移的细胞。癌症例如是肺癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、头颈癌、脑癌、卵巢癌、前列腺癌、肠癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、子宫癌、胰腺癌、眼癌、骨髓癌、淋巴系统癌或甲状腺癌等癌症。优选用于治疗肝癌。
[0027] 本文所用术语“治疗癌症”是指阻止、减轻、改善、停止、遏制、减缓或者逆转肿瘤进展，或者降低哺乳动物中的肿瘤发育和增加凋亡率，或者在肿瘤细胞中诱导凋亡。
[0028] “治疗有效量”，是指当施用给病人用于疾病的治疗时，足够实施对这种疾病的治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病和其严重性，以及被治疗的病人的年龄、体重等变化。
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，在此描述的特定实施方式仅通过举例的方式来解释本发明，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可对本发明做出各种不背离本发明的精神和范围的修改，这些等价形式同样落于本发明所要求保护的范围。
附图说明
[0030] 图1是二氧化钛纳米粒子(TiO2)对HepG2细胞生长的抑制。其中图1A的细胞计数结果显示TiO2对L02细胞的生长状态无明显影响，图1B的细胞计数结果显示TiO2明显抑制HepG2细胞的生长,且抑制结果呈一定的浓度依耐性，并且不同浓度之间的抑制差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0031] 图2是二氧化钛纳米粒子(TiO2)对HepG2细胞增殖的抑制。细胞与TiO2共培养12h、24h、48h后于3个时间点分别检测细胞增殖情况。其中图2A的结果显示，对于L02细胞，在12h、24h、48h三个时间点，与对照组相比，四个浓度实验组的细胞增殖能力虽稍有抑制，但均无统计学差异。图2B的结果显示，对于HepG2细胞，四个浓度实验组的细胞增殖能力均明显下降，并且有明显的的浓度依赖性，与对照组相比，培养12h时0D值无统计学差异，24h时0D值明显降低，48h时降低更明显，差异有统计学意义(*P<0.05,*P<0.01)。
[0032] 图3是二氧化钛纳米粒子(TiO2)对HepG2细胞周期S期的抑制。与TiO2共培养48h后，应用7-AAD染色流式细胞术检测对TiO2对L02和HepG2细胞周期G1、S、G2期的变化。图3A的结果显示，TiO2对L02细胞的G1、S、G2期无明显影响。图3B的结果显示，在HepG2细胞中，随着浓度的增加，细胞周期G1期的比例增加，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.05)。而S期的比例随着浓度的增加比例明显降低，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.01)。G2期细胞比例无明显变化。
[0033] 图4是二氧化钛纳米粒子(TiO2)诱导HepG2细胞的凋亡。与TiO2共培养48h后收集细胞应用Annexin V/7-AAD双染色法流式细胞术检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响。图4A和图4B的结果显示，48h后L02细胞未出现明显的凋亡。图4C和图4D的结果显示，在HepG2细胞中，随着浓度的增加，细胞凋亡率增加，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0034] 图5是二氧化钛纳米粒子(TiO2)诱导凋亡相关蛋白caspase-3，线粒体相关蛋白SirT3、VDAC1、ACSS1和膜通道蛋白αENaC的表达结果。细胞与不同浓度的TiO2-NPS共培养48h后通过Western Blot分析细胞中caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1、VDAC1的表达。图5A的结果显示在L02细胞中，caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1以及VDAC1的表达量与对照组比较，没有明显变化。图5B的结果显示在HepG2细胞中，caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表达明显上调，ACSS1的表达明显下调，均具有浓度依赖性。提示TiO2通过线粒体途径诱导HepG2细胞的凋亡,并且所述凋亡可能与αENaC有关。
[0035] 图6是二氧化钛纳米粒子(TiO2)对caspase3/7活性的影响。图6A的结果显示TiO2对L02细胞中caspase 3/7的活性无明显影响。图6B的结果显示TiO2可诱导HepG2细胞中caspase 3/7活性的显著增加，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。这些发现进一步证明，TiO2能够降低HepG2细胞活力，促进细胞凋亡，使caspase 3/7活性增加。
[0036] 图7是二氧化钛纳米粒子(TiO2-NPS)使HepG2细胞膜电位去极化的结果。通过JC-10检测试剂盒检测L02和HepG2细胞膜电位的变化，图7A的结果显示，与TiO2共培养48h后，L02细胞线粒体膜电位无明显变化。图7B的结果显示，在HepG2细胞中，线粒体膜电位出现逐渐去极化趋势，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0037] 图8是二氧化钛纳米粒子(TiO2)使HepG2细胞ADP/ATP比例升高的结果。通过ADP/ATP检测试剂盒检测细胞内ADP/ATP比例的变化，图8A的结果显示，与TiO2共培养48h后，L02细胞内ADP/ATP比例无明显变化。图8B的结果显示，在HepG2细胞中，ADP/ATP比例逐渐升高，呈浓度和时间依赖性，差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0038] 图9是二氧化钛纳米粒子(TiO2)-Taxol(紫杉醇)联合抑制HepG2细胞生长的结果。图9A的结果显示，在与NPS(唾液酸)、TiO2和TiO2-NPS共培养48h的实验组中，TiO2-NPS对HepG2细胞生长的抑制作用更为显著(*P<0.05)。图9B的结果显示，在与TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol共培养48h的实验组中，TiO2-Taxol对HepG2细胞生长的抑制作用相比单独使用TiO2或Taxol对HepG2细胞生长的抑制作用更为显著(*P<0.05,**P<0.01)。单独使用Taxol的抑制率为17.8％；单独使用TiO2-NPS的抑制率为24.9％；而TiO2-Taxol两者联用的抑制率则达到58.7％。由此可见TiO2与Taxol两者的联合使用对于HepG2细胞生长产生了协同抑制的效果。
[0039] 图10是TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol抑制HepG2细胞生长的结果。图10的结果显示，在与TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol共培养48h的实验组中，5ug/ml TiO2-NPS-Taxol对HepG2细胞生长就能够达到比10ug/ml TiO2–Taxol更好的抑制效果，
10ug/ml TiO2-NPS-Taxol的抑制作用更为显著(*P<0.05)。
10ug/ml TiO2-NPS-Taxol的抑制作用更为显著(*P<0.05)。
[0040] 图11是TiO2-NPS-Taxol毒性实验结果。上述结果显示，14d内观察动物正常，无死亡现象。
[0041] 图12是TiO2-NPS-Taxol体内抑制裸鼠荷瘤实验结果。上述结果显示，TiO2-NPS-Taxol可以显著抑制肝癌细胞HepG2诱导的荷瘤裸鼠体内肿瘤的生长。
具体实施方式
[0042] 实施例1.载有不同浓度的TiO2-NPS培养板的制备
[0043] 二氧化钛纳米粒子通过本领域常规方式制备,称取5.0mg二氧化钛纳米粒子(TiO2)粉末(所使用的纳米粒子颗粒大小为10纳米和15纳米两种)溶于100ml 75％酒精溶液中，终浓度为50.0ug/ml。充分混匀，然后分装保存。根据前期预实验结果，采用如下4个浓度进行实验组分组实验：2.5ug/ml、5.0ug/ml、7.5ug/ml、10.0ug/ml；分别根据培养板孔径所加培养液的体积，加入相应量的TiO2-NPS混悬液，6孔板分别加入100μl、200μl、300μl、400μl，96孔板分别加入5μl、10μl、15μl、20μl；然后用75％酒精将分组液体补齐使液体体积一致，对照组加等量的75％酒精溶液。使悬液均匀平铺于孔底面。将实验孔板置于电热恒温干燥箱，恒定于60℃，待酒精彻底蒸发后取出置于超净工作台内，于紫外线灯照射2h，备用。
[0044] 实施例2.细胞培养、传代及分板
[0045] 人类正常肝细胞系L02，人肝癌细胞株HepG2。均来自首都医科大学传染病研究所冻存。
[0046] 2.1.细胞复苏
[0047] 取出液氮冻存的细胞迅速放于37℃水浴箱中水浴，使其快速融化。将冻存管内的细胞迅速加入含2ml DMEM液体培养基(已加入10％胎牛血清，下同)的离心管中，800rpm，离心3min，弃去上清。向离心管中加入2ml DMEM液体培养基使细胞重悬，将混匀的细胞移至加有3ml DMEM液体培养基的培养瓶中，轻轻水平十字摇晃培养瓶，使细胞分布均匀，室温下置于超净台内静置数分钟，使细胞沉淀，显微镜下观察。将细胞置于37℃，5％CO2孵箱中培养(将培养瓶口拧松)。24小时后细胞换液，去除漂浮的死亡细胞。
[0048] 2.2.细胞传代
[0049] 小心弃去DMEM液体培养基，1×PBS缓冲液将细胞洗涤2次。0.25％胰酶(含0.02％EDTA)1ml消化融合度达80％至90％的细胞，显微镜下观察。待细胞间隙清晰可见时，迅速加入2ml DMEM液体培养基终止消化，然后将细胞转移至离心管中。1000rpm，离心
5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。将混匀的细胞分装至加有DMEM液体培养基的培养瓶中，37℃，5％CO2孵箱中培养。或进行分板，用于后续的细胞实验。
5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。将混匀的细胞分装至加有DMEM液体培养基的培养瓶中，37℃，5％CO2孵箱中培养。或进行分板，用于后续的细胞实验。
[0050] 2.3.细胞分板
[0051] 消化收集处于对数生长期的细胞。1000rpm，离心5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。吸取混匀细胞液10μl，采用记数板记数。
[0052] 计数方法如下：细胞数(个/ml)＝(记数板4个大方格细胞总数/4)×104。用5
DMEM液体培养基将细胞终浓度稀释至1×10个/ml，然后加入到制备好的TiO2-NPS培养板中。
DMEM液体培养基将细胞终浓度稀释至1×10个/ml，然后加入到制备好的TiO2-NPS培养板中。
[0053] 六孔板每孔中加入2ml稀释好的细胞液，“十字法”摇匀，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。96孔板每孔中加入100μl稀释好的细胞液，“十字法”摇匀，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。
[0054] 实施例3.细胞计数法检测TiO2对L02和HepG2细胞生长情况的影响
[0055] 分别使用颗粒大小为10纳米和15纳米两种TiO2与6孔板中细胞(进行实验)共同培养48h后消化收集细胞于5ml离心管中。1000rpm，离心5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。吸取混匀细胞液10μl，采用记数板记数，记下各组细胞数目。
[0056] 结果分析：细胞计数结果显示，TiO2对L02细胞的生长状态无明显影响(如图1A所示)，对HepG2细胞的生长明显抑制(如图1B所示),呈一定的浓度依赖性，并且不同浓度之间的抑制差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。图中1中所示为10纳米颗粒大小的TiO2的实验结果，15纳米颗粒大小的TiO2-NPS实验结果与10纳米颗粒大小的相同，在此没有给出具体图谱。
[0057] 实施例4.CCK-8法检测TiO2-NPS对L02和HepG2细胞增殖的影响
[0058] 在经10纳米颗粒大小TiO2制备好的96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)。将培养板放在培养箱中培养(在37℃,5％CO2的条件下)。分别取12、24、48h 3个时间点进行检测，在培养相应时间后向每孔加入10μl的CCK-8溶液，然后在培养箱内孵育1小时。用酶标仪测定样本在450nm处的吸光度值(OD值)。
[0059] 结果分析：我们采用CCK-8细胞增殖与活性检测试剂盒来分析TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响。细胞计数结果显示，在L02细胞中，在12h、24h、48h三个时间点，与对照组相比，四个浓度实验组的细胞增殖能力稍有抑制，但均无统计学差异(如图2A所示)。在HepG2细胞中，四个浓度实验组的细胞增殖能力均明显下降，有明显的的浓度依赖性，与对照组相比，培养12h时0D值无统计学差异，24h时0D值明显降低，48h时降低更明显，差异有统计学意义(*P<0.05,*P<0.01)(如图2B所示)
[0060] 实施例5. 7-AAD染色流式细胞术检测对TiO2对L02和HepG2细胞周期时相的影响
[0061] 细胞与10纳米颗粒大小TiO2在6孔板中共培养48h后消化收集细胞于5ml流式管中。用冷的PBS洗涤2次。加入300μl PBS重悬后，缓慢加入800μl冰冷的无水乙醇进行固定，4℃过夜。固定好的细胞800rpm，离心3min，然后加入500μl PBS洗涤2次。细胞重悬后加入100μl PBS，然后加入5μl 7-AAD，室温染色15min。上机检测。
[0062] 结果分析：与TiO2共培养48h后，应用7-AAD染色流式细胞术检测对TiO2对L02和HepG2细胞周期G1、S、G2期的变化。结果显示，TiO2对L02细胞的G1、S、G2期无明显影响(如图3A所示)。但在HepG2细胞中，随着浓度的增加，细胞周期G1期的比例增加，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.05)。而S期的比例随着浓度的增加比例明显降低，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.01)。G2期细胞比例无明显变化(如图3B所示)。
[0063] 实施例6.Annexin V/7-AAD双染色法流式细胞术检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响
[0064] 在6孔板中细胞与10纳米颗粒大小TiO2共同培养48h后消化收集细胞于5ml流式管中。用冷的PBS洗涤2次。然后用1×Binding Buffer缓冲液重悬。细胞800rpm离心3分钟后，在流式管中加入100μl 1×Annexin V Binding Buffer。加入5μl的Annexin V-FITC和5μl 7-AAD进行双染，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。1小时内使用流式细胞仪测定结果。
[0065] 结果分析：与TiO2共培养48h后收集细胞应用Annexin V/7-AAD双染色法流式细胞术检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响。结果显示，48h后L02细胞细胞未出现明显凋亡(如图4A、4B所示)。在HepG2细胞中，随着浓度的增加，细胞凋亡率增加(如图4C、4D所示)，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0066] 实施例7.Western Blot检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡相关蛋白caspase-3，膜蛋白αENaC，线粒体相关蛋白SirT3、VDAC1、ACSS1表达的影响
[0067] 7.1.总蛋白提取
[0068] 细胞培养、传代及分板的方法与实施例2相同。弃去细胞培养基，加入1ml1×PBS液，洗去细胞碎片，弃液。0.25％胰酶消化收集细胞，离心，1200rpm，5min，弃上清。1ml1×PBS液，吹匀细胞，移至1.5ml EP管中，低温高速离心，4℃，12000rpm，15min，彻底弃除上清(可选用移液器吸取)。每管中加细胞裂解液30至50μl(已按100:1比例已加入PMSF)，混匀。冰上放置30min至60min，充分裂解。低温高速离心，4℃，12000rpm，15min，吸取上清液。测蛋白浓度，于-80℃冰箱保存。
[0069] 7.2.蛋白浓度测定
[0070] 配置工作液：根据标准品和样品数量，将BCA试剂盒中的A试剂与B试剂按体积比50:1进行配置。充分混匀，现配现用。
[0071] 标准品的稀释：按照表1所示进行标准品稀释。将稀释好的标准品加入20μl至96孔板的标准品孔中。
[0072] 加20μl的蛋白稀释液(2μl蛋白+18μl ddH2O)到96孔板的样品孔中。每个孔加入200μl的BCA工作液，37℃避光放置30min。冷却到室温，用酶标仪测定，设置波长为562nm。
[0073] 表1.标准品的稀释
[0074]
[0075] 7.3.蛋白变性
[0076] 蛋白中加入裂解液体积1/3的4×SDS Buffer，混匀，使其终浓度为1×SDS。99℃，500rpm，震荡10min后冰浴5min，冷却至室温后，分装，-80℃保存。
[0077] 7.4.配制浓缩胶及分离胶
[0078] 按照表1所示进行浓缩胶及分离胶的配制。
[0079] 表2 10％Gel SDS-PAGE分离胶(5ml)及5％SDS-PAGE浓缩胶(2ml)配制方法[0080]
[0081] 7.5.配置电泳缓冲液及转膜缓冲液
[0082] 按照表3所示进行电泳缓冲液及转膜缓冲液的配制。
[0083] 表3电泳缓冲液及转膜缓冲液配制方法
[0084]
[0085]
[0086] 7.6.蛋白电泳
[0088] 电泳条件：上层胶90V，20min；下层胶120V，60至90min。注意目的条带不要跑出胶外。
[0089] 7.7.转膜
[0090] 根据预染蛋白分子量Marker切胶，剪裁大小合适的滤纸及PVDF膜。提前将PVDF膜在无水甲醇中浸泡10min，ddH2O浸泡5min，转膜缓冲液浸泡15min；同时将滤纸浸泡于转膜缓冲液中。转膜槽中倒入转膜缓冲液，放置冰盒中预冷。将夹板放入盛有转膜缓冲液的培养皿中，负极(黑板)向下，由下向上分别放置：滤纸、胶、PVDF膜、滤纸，两端夹盖海棉，赶出气泡，按电极方向安装至转膜槽中。
[0091] 转膜条件：GAPDH(36kDA)16W，30min；目的条带根据分子量大小采用不同的功率和转膜时间。
[0092] 7.8膜封闭及抗体孵育
[0093] 用TBST缓冲液浸泡洗膜，再用5％脱脂奶粉溶液封闭，室温，置摇床上2h。同时将胶用考马斯蓝染色，置摇床上2h。孵育一抗，4℃过夜。TBST缓冲液浸泡洗膜，摇床，每次10min，共3次。孵育二抗，置于摇床上室温孵育1h(羊抗鼠多克隆抗体IgG以1:5000稀释，羊抗兔多克隆抗体IgG以1:5000稀释)。TBST缓冲液洗膜，置于摇床上，每次10min，共3次。
[0094] 7.9化学发光显影
[0096] 结果分析：为了进一步研究TiO2诱导HepG2细胞发生凋亡的分子作用机制，将细胞与不同浓度的TiO2共培养48h后通过western Blot分析细胞caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1、VDAC1的表达。结果显示，在L02细胞中，caspase-3、αENaC、SirT3、ACSS1以及VDAC1的表达量与对照组比较没有明显变化(如图5A所示)。在HepG2细胞中，caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表达明显上调，ACSS1的表达明显下调，均具有浓度依赖性(如图5B所示)。提示TiO2通过线粒体途径诱导HepG2细胞的凋亡,并且所述凋亡可能与αENaC有关。
[0097] 实施例8.Caspase3/7活性实验检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响
[0098] 在96孔板中细胞与10纳米颗粒大小TiO2共同培养24h和48h后，每孔加入100ul Caspase 3/7活性检测试剂后，用酶标仪直接检测其在440-460nm处的荧光值。
[0099] 结果分析：与TiO2共培养48h后收集细胞应用Caspase3/7活性实验检测TiO2对L02和HepG2细胞凋亡的影响。结果显示，48h后L02细胞未出现明显凋亡(如图6A所示)。在HepG2细胞中，随着作用时间及浓度的增加，细胞凋亡率增加(如图6B所示)，与对照组比较，差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)。
[0100] 实施例9.JC-10检测试剂盒检测TiO2对L02和HepG2细胞线粒体膜电位的影响[0101] 细胞与10纳米颗粒大小TiO2置于6孔板中共培养48h后收集细胞于5ml流式管中。PBS洗涤2次。将200×JC-10抗体(A液)用缓冲液(B液)稀释成1×JC-10染色液备用。细胞洗涤后每管加入500μl JC-10染色液进行染色。避光孵育40分钟后上机检测，FL1通道为绿色荧光信号，FL2通道为红色荧光信号。计算各组FL1/FL2的荧光强度比值。
[0102] 结果分析：通过JC-10检测试剂盒检测L02和HepG2细胞膜电位的变化。结果显示，与TiO2共培养48h后，L02细胞线粒体膜电位无明显变化(如图7A所示)。在HepG2细胞中，线粒体膜电位出现逐渐去极化趋势，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)(如图7B所示)。提示TiO2使HepG2细胞线粒体相关蛋白SirT3、VDAC1的表达明显上调，可能跟线粒体内渗透压改变诱导细胞膜电位发生变化有关。
[0103] 实施例10.ADP/ATP检测试剂盒检测TiO2对L02和HepG2细胞内ADP/ATP比值的影响
[0104] 按表4所示组分配制检测反应液。
[0105] 表4 ADP/ATP检测反应体系
[0106] Table 3-8.Detection system of ADP/ATP
[0107]
[0108] 细胞与10纳米颗粒大小TiO2置于96孔板中共培养48h。将反应液按100μl/孔加入到与细胞培养孔相对应的新的白色96孔培养板中。上机读数，记为：数据A。
[0109] 移除细胞培养板中的培养液，PBS洗涤2次。向每孔中加入50μl核苷酸释放液(Nucleotide ReleAsing Buffer)，室温轻轻晃动5分钟。转移至预先加有反应液的96孔板的对应的孔中，2分钟后上机读数，记为：数据B。
[0110] 将ADP转化酶(ADP Converting Enzyme)与220μl核苷酸释放液轻轻混匀后，将混合液取出部分稀释10倍备用。为了提高准确性，此时再次上机读数，记为：数据C。
[0111] 向培养板每孔中加入稀释好的ADP转化酶混合液10μl，2分钟后上机读数，记为：数据D。
[0112] 计算ADP/ATP＝(数据A–数据B)/(数据C–数据D)。
[0113] 结果分析：通过ADP/ATP检测试剂盒检测细胞内ADP/ATP比例的变化，结果显示，与TiO2共培养48h后，L02细胞内ADP/ATP比例无明显变化(如图8A所示)。在HepG2细胞中，ADP/ATP比例逐渐升高，呈浓度和时间依赖性，差异有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01)(如图8B所示)。提示TiO2使HepG2细胞线粒体相关蛋白ACSS1的表达明显下调，可能在TiO2进入细胞线粒体后导致呼吸链受抑制，从而导致ATP生成障碍，造成ADP在线粒体内堆积。同时TiO2使HepG2细胞线粒体膜电位去极化，有可能会使ATP进一步流失。
[0114] 实施例11.二氧化钛纳米粒子(TiO2)-Taxol(紫杉醇)对HepG2细胞生长的抑制作用
[0116] 将6孔板中细胞分别与浓度均为10ug/ml的NPS(唾液酸)、10纳米颗粒大小TiO2、TiO2-NPS(其中TiO2为10纳米颗粒大小)共同培养48h后消化收集细胞于5ml离心管中。以及将6孔板中的细胞分别与浓度均为10ug/ml的10纳米颗粒大小的TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol(其中TiO2为10纳米颗粒大小)共同培养48h后消化收集细胞于5ml离心管中。1000rpm，离心5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。吸取混匀细胞液10μl，采用记数板记数，记下各组细胞数目。
[0117] 结果分析：实验结果显示，在与NPS(唾液酸)、TiO2和TiO2-NPS共培养48h的实验组中，相同使用浓度下，NPS对HepG2细胞生长无抑制作用，而TiO2和TiO2-NPS对HepG2细胞生长具有明显的抑制作用，其中TiO2-NPS对HepG2细胞生长的抑制作用更为显著，说明在TiO2-NPS中NPS对于HepG2细胞具有一定的靶向作用，使得相同浓度的TiO2-NPS较TiO2的抑制效果更好(*P<0.05)(如图9A所示)。在与TiO2、Taxol以及TiO2-Taxol共培养48h的实验组中，TiO2-Taxol对HepG2细胞生长的抑制作用相比单独使用TiO2或Taxol对HepG2细胞生长的抑制作用更为显著(*P<0.05,**P<0.01)(如图9B所示)。单独使用Taxol的抑制率为17.8％；单独使用TiO2的抑制率为24.9％；而TiO2-Taxol两者联用的抑制率则达到58.7％。由此可见TiO2与Taxol两者的联合使用对于HepG2细胞生长产生了协同抑制的效果，这是在进行试验之前无法预料到的结果。
[0118] 实施例12.TiO2-NPS-Taxol和TiO2–Taxol对HepG2细胞生长的抑制作用。
[0119] 用p25强碱处理二氧化钛纳米粒子(TiO2)以及实施例11中所制备的TiO2-NPS，然后与Taxol一起加热搅拌，使之表面连接上Taxol，经红外光谱及拉曼光谱检测特异峰值后确定。
[0120] 将6孔板中细胞分别与TiO2-NPS-Taxol(5ug/ml，10ug/ml)和TiO2–Taxol(10ug/ml)共培养48h，其中TiO2的颗粒大小均为10纳米，共同培养48h后消化收集细胞于5ml离心管中。1000rpm，离心5min，弃上清。加入2ml DMEM液体培养基，将细胞吹匀，重悬。吸取混匀细胞液10μl，采用记数板记数，记下各组细胞数目。
[0121] 结果分析：实验结果显示，在实验组中，5ug/ml TiO2-NPS-Taxol对HepG2细胞生长就能够达到比10ug/ml TiO2–Taxol更好的抑制效果，10ug/ml TiO2-NPS-Taxol的抑制作用更为显著(*P<0.05)。说明在TiO2-NPS-Taxol中NPS对于HepG2细胞具有一定的靶向作用，因此降低TiO2-NPS-Taxol的使用量仍然能够达到较TiO2–Taxol更为显著的抑制效果(如图10所示)。
[0122] 实施例13 TiO2-NPS-Taxol的毒性实验。
[0123] TiO2-NPS-Taxol的制备方法参见实施例12。购买16只健康ICR小鼠，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。动物适应3天环境，自由饮水饮食，室温(23+/-1)℃，湿度(60+/-10)％。随后给予尾静脉注射TiO2-NPS-Taxol(其中TiO2的颗粒大小均为10纳米)。动物分为4组，每组4只(雌雄各半)。尾静脉注射TiO2-NPS-Taxol溶液，浓度分别为10mg/kg；1mg/kg；100ug/kg；10ug/kg。
[0124] 结果提示，14d内观察动物的行为变化，所有动物于14天内生存状态正常，无死亡现象(如下列表格所示)。
[0125]
[0126] 实施例14 TiO2-NPS-Taxol体内抑制裸鼠荷瘤实验。
[0127] TiO2-NPS-Taxol的制备方法参见实施例12。
[0128] 购买24只健康BalB/C nu/nu裸鼠，雄性，五周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。动物适应3天环境，自由饮水饮食，室温(23+/-1)℃，湿度(60+/-10)％。取对数期生长肝癌细胞HepG2胰酶消化得单细胞悬液。按5X107个/只细胞量进行裸鼠腋下皮下注射荷瘤。动物分为3组：对照组，尾静脉注射给药组与皮下注射给药组；每组8只。肿瘤长出后，注射TiO2-NPS-Taxol溶液(其中TiO2的颗粒大小均为10纳米)，浓度为10mg/kg。每三天记录肿瘤体积，共给药四次。第四次给药24h后，动物处死，称取肿瘤重量，计算肿瘤系数。(肿瘤系数＝肿瘤重量/体重X1000)
[0129] 结果提示，二氧化钛纳米粒子TiO2-NPS-Taxol可以显著抑制肝癌细胞HepG2诱导的荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长(如图11所示)。
[0130] 除上述10纳米颗粒大小的TiO2纳米粒子的实验外，申请人还做了颗粒为15纳米的TiO2纳米粒子的实验，实验结果显示，15纳米颗粒大小与10纳米颗粒大小的TiO2纳米粒子实验结果完全相同，也能够抑制HepG2细胞的增殖，减少HepG2细胞周期的S期比例，诱导HepG2细胞的凋亡，在HepG2细胞中，诱导caspase-3、αENaC、SirT3以及VDAC1的表达，抑制ACSS1的表达，诱导HepG2细胞中caspase 3/7活性的显著增加，使HepG2细胞线粒体膜电位出现去极化趋势，提高ADP/ATP比例，与紫杉醇联合使用有协同作用，在体内能抑制肝癌细胞HepG2诱导的实体瘤，且对小鼠无明显毒性。
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