癌的治疗和/或预防用药物组合物
阅读：561发布：2023-01-14
专利汇可以提供癌的治疗和/或预防用药物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供以在癌细胞的表面特异性地表达的癌 抗原 蛋白质 为靶的 抗体 及其作为癌的 治疗 和/或 预防 剂的用途，具体地，提供包含与含有序列号5所示的 氨 基酸序列或与该氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列的CAPRIN‑1部分多肽具有免疫 反应性 的抗体或其 片段 、以及以包含该抗体或其片段作为有效成分为特征的用于癌的治疗和/或预防的药物组合物。，下面是癌的治疗和/或预防用药物组合物专利的具体信息内容。
1.抗体，与CAPRIN-1部分多肽特异性地结合，所述CAPRIN-1部分多肽由序列号5所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗体，对表达CAPRIN-1蛋白质的癌细胞具有细胞毒活性。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的抗体，是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体。
5.根据权利要求1或2所述的抗体，包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合，所述重链可变区包含序列号8的互补决定区CDR1、序列号9的互补决定区CDR2和序列号10的互补决定区CDR3，所述轻链可变区包含序列号12的互补决定区CDR1、序列号13的互补决定区CDR2和序列号14的互补决定区CDR3。
6.根据权利要求1或2所述的抗体，缀合了抗肿瘤剂。
7.用于表达CAPRIN-1蛋白质的癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～6的任一项所述的抗体作为有效成分。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，所述癌是乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌、肺癌、脑瘤、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤或纤维肉瘤。
9.用于表达CAPRIN-1蛋白质的癌的治疗和/或预防的组合药物，包含：权利要求7或8所述的药物组合物、和含有抗肿瘤剂的药物组合物。
10.DNA，编码权利要求1～5的任一项所述的抗体。
癌的治疗和/或预防用药物组合物
技术领域
背景技术
[0002] 癌是占所有死亡原因的第一位的疾病，现行的治疗是以手术疗法为主、组合放疗法和化疗法的治疗。尽管近年来开发了新的手术方法、发现了新的抗癌剂，但现状是除了一部分癌以外，癌的治疗成绩并没有多大提高。近年来，随着分子生物学、癌免疫学的进步，与癌特异性地反应的抗体类、由细胞毒性T细胞识别的癌抗原类、编码癌抗原的基因类等被鉴定，对以癌抗原类为靶的特异性的癌治疗法的期待正在提高(非专利文献1)。
[0003] 在癌治疗方法中，为了减轻副作用，期望作为癌抗原被识别的肽、多肽或蛋白质在正常细胞中几乎不存在，而在癌细胞中特异性地存在。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等通过使用了自身癌细胞株和癌反应性T细胞的cDNA表达克隆化法分离了由CD8阳性T细胞所识别的人黑素瘤抗原MAGE1(非专利文献2)。之后，报告了SEREX(重组表达克隆化的抗原血清学分析，serological identification of antigens by recombinant expression cloning)法，其采用基因的表达克隆化的方法来鉴定由在癌患者的活体内与自身的癌反应而产生的抗体所识别的肿瘤抗原(非专利文献3和专利文献1)，利用该方法，在正常细胞中几乎没有表达、在癌中特异性地表达的几种癌抗原被分离(非专利文献4～9)。进一步地，实施了使用以其一部分为靶而与癌抗原特异性反应的免疫细胞的细胞疗法、含有癌抗原的疫苗等的癌特异性免疫疗法的临床试验。
[0004] 另一方面，近年来，以癌细胞上的抗原蛋白质为靶的、用于治疗癌的各种抗体药物在世界上兴起。作为癌特异性治疗药获得了一定的药效而受到关注，但成为靶的抗原蛋白质大部分在正常细胞中也表达，作为抗体施与的结果，不仅是癌细胞，连表达抗原的正常细胞也被毒害，其结果所产生的副作用成为问题。因此，如果能够鉴定在癌细胞表面特异性地表达的癌抗原、并使用以该癌抗原为靶的抗体作为药物，则可以期待实现副作用更少的利用抗体药物的治疗。
[0005] 细胞质增殖相关蛋白1(Cytoplasmic-and proliferation-associateed protein 1，CAPRIN-1)作为已知在分裂间期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达，并在细胞内与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的转运、翻译的控制等的细胞内蛋白质被知晓，并被发现在癌细胞的表面特异性地表达，作为用于癌治疗的抗体药物的靶正在被进行研究(专利文献2)。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献1：美国专利第5698396号
[0009] 专利文献2：WO2010/016526
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献1：秋吉毅，“癌と化学療法”、1997年、第24卷、p551-519(癌と化学療法社、日本)
[0012] 非专利文献2：Bruggen P.et al.，Science，254：1643-1647(1991)
[0013] 非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11810-11813(1995)
[0014] 非专利文献4：Int.J.Cancer，72：965-971(1997)
[0015] 非专利文献5：Cancer Res.，58：1034-1041(1998)
[0016] 非专利文献6：Int.J.Cancer，29：652-658(1998)
[0017] 非专利文献7：Int.J.Oncol.，14：703-708(1999)
[0018] 非专利文献8：Cancer Res.，56：4766-4772(1996)
[0019] 非专利文献9：Hum.Mol.Genet6：33-39，1997
发明内容
[0020] 发明要解决的课题
[0021] 本发明的目的是制作出以在癌细胞的表面特异性地表达的CAPRIN-1为靶的与现有的抗体相比抗肿瘤活性优异的抗体，提供作为癌的治疗和/或预防剂的用途。
[0022] 用于解决课题的方法
[0023] 本发明具有以下特征。
[0024] 本发明提供与CAPRIN-1的部分多肽具有免疫反应性的抗体或其片段、以及以包含该抗体或其片段作为有效成分为特征的用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，所述CAPRIN-1的部分多肽具有序列号5所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。
[0026] 在其他实施方式中，上述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0027] 在其他实施方式中，上述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、或多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
[0029] 发明的效果
[0030] 本发明的针对CAPRIN-1的抗体毒害癌细胞。因此，针对CAPRIN-1的抗体在癌的治疗和/或预防中有用。
具体实施方式
[0031] 本发明的抗体是识别并结合CAPRIN-1的规定的部分多肽的抗体，具有抗肿瘤活性。本发明的抗体更具体地是对包含序列号5所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的CAPRIN-1蛋白质的部分多肽(CAPRIN-1部分多肽)进行识别(即，具有免疫反应性)抗体。在本发明中，弄清楚了该抗体显示抗肿瘤活性。本发明涉及与如上所述的CAPRIN-1蛋白质的片段结合、且显示抗肿瘤活性的全部抗体。
[0032] 本发明的上述针对CAPRIN-1的抗体只要能够发挥抗肿瘤活性就可以是任何种类的抗体，包含例如，重组抗体(例如，合成抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFv)等)、人抗体、它们的抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv)等。这些抗体及其片段还可以通过本领域技术人员公知的方法制备。希望本发明的抗体与CAPRIN-1蛋白质或其部分多肽具有免疫反应性，即，介由抗原-抗体反应与CAPRIN-1蛋白质结合，优选与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合。这里，“与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合”，是指与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合，与除了CAPRIN-1蛋白质以外的蛋白质实质上不结合。
本发明的抗体优选为单克隆抗体，但只要能够稳定地生产均质的抗体，则也可以是多克隆抗体。另外，在受试者是人的情况下，为了避免或抑制排斥反应，优选为人抗体或人源化抗体。
本发明的抗体优选为单克隆抗体，但只要能够稳定地生产均质的抗体，则也可以是多克隆抗体。另外，在受试者是人的情况下，为了避免或抑制排斥反应，优选为人抗体或人源化抗体。
[0033] 本发明的针对CAPRIN-1多肽的抗体的抗肿瘤活性，如后所述，可以通过在活体内检查对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过在活体外检查对表达该多肽的肿瘤细胞是否显示介由免疫细胞或补体的细胞毒活性，来进行评价。
[0035] 以下，关于本发明进行更详细的说明。
[0036] ＜抗体制作用抗原的制作＞
[0037] 作为用于获取本发明的针对CAPRIN-1的抗体的致敏抗原使用的蛋白质或其片段，可以来源于人、狗、猫、牛、马、小鼠、大鼠、鸡等，对成为其来源的动物种类没有限制。但是优选考虑与在细胞融合中使用的母细胞的相容性来选择，一般来说，优选来源于哺乳动物的蛋白质，特别优选来源于人的蛋白质。例如当CAPRIN-1是人CAPRIN-1时，可以使用人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽、表达人CAPRIN-1的细胞等。
[0038] 人CAPRIN-1及其同源物的碱基序列和氨基酸序列例如可以通过访问GenBank(美国NCBI)，利用BLAST、FASTA等算法(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993；Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)来得到。
[0039] 在本发明中，当以人CAPRIN-1的碱基序列(序列号1或3)或氨基酸序列(序列号2或4)为基准时，包含与它们的ORF或成熟部分的碱基序列或氨基酸序列具有70％～100％、优选80％～100％、更优选90％～100％、进一步优选95％～100％、例如97％～100％、98％～
100％、99％～100％或99.5％～100％的序列同一性的序列的核酸或蛋白质成为靶CAPRIN-
1(此外，将序列号2与序列号4的氨基酸序列比较，则690位以后的氨基酸残基不同)。这里，“％序列同一性”是将2个序列在导入间隙或不导入间隙的情况下以形成最大的类似度(或一致度)的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总数(包含间隙的数)的百分比(％)。
100％、99％～100％或99.5％～100％的序列同一性的序列的核酸或蛋白质成为靶CAPRIN-
1(此外，将序列号2与序列号4的氨基酸序列比较，则690位以后的氨基酸残基不同)。这里，“％序列同一性”是将2个序列在导入间隙或不导入间隙的情况下以形成最大的类似度(或一致度)的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总数(包含间隙的数)的百分比(％)。
[0040] 作为CAPRIN-1蛋白质的片段，使用包含作为由抗体所识别的最小单位的表位(抗原决定簇)、且具有该表位氨基酸长度～小于该蛋白质的全长的长度的片段。表位是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7～12个氨基酸、例如8～11个氨基酸。本发明的抗体的制作中使用的CAPRIN-1蛋白质的片段优选是包含由本发明的抗体所识别的序列号5所示的氨基酸序列(相当于序列号2或序列号4的氨基酸序列中的141位～156位的序列)或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的片段，或至少包含这些氨基酸序列中的连续的约7～12个氨基酸、例如连续的8～11个氨基酸的表位的片段。
[0041] 上述的人CAPRIN-1蛋白质和/或包含其部分肽的多肽片段可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等化学合成法来合成(日本生化学会编、生化学实验讲座1、蛋白质的化学(蛋白质的化学)IV、化学修飾と肽合成(化学修饰和肽合成)、东京化学同人(日本)、1981年)。另外，还可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法合成。
[0042] 另外，还可以使用公知的基因工程学方法(Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley&Sons等)，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体中并导入宿主细胞，在该宿主细胞中生产多肽，从而得到作为目的的人CAPRIN-1蛋白质和/或其多肽片段。
[0043] 编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程学方法和/或使用了市售的核酸合成仪的常规方法来容易地制备。例如包含人CAPRIN-1基因的碱基序列的DNA可以通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板，使用以能扩增该碱基序列的方式设计的一对引物进行PCR，从而制备。PCR的反应条件可以适当设定，可以列举例如，使用耐热性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶、Pfu聚合酶等)和含有Mg2+的PCR缓冲液，将包含在94℃保持30秒(变性)、在55℃保持30秒～1分钟(退火)、在72℃保持2分钟(延伸)的反应过程作为1个循环，例如进行30个循环后，在72℃反应7分钟的条件等，但不限定于此。对于PCR的方法、条件等，例如记载于Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley&Sons(特别是第15章)中。
[0044] 另外，可以基于CAPRIN-1基因碱基序列和CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列信息，制备合适的探针和/或引物，使用该探针和/或引物来对人等的cDNA文库进行筛选，从而分离所需的DNA。cDNA文库优选由表达CAPRIN-1的蛋白质的细胞、器官或组织来制作。这样的细胞或组织的例子是来源于精巢、白血病、乳癌、淋巴瘤、脑瘤、肺癌、胰癌、大肠癌等的癌或肿瘤的细胞或组织。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆化等操作对于本领域技术人员而言是已知的，可以按照例如Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)、Ausbel等(上述)等所记载的方法来进行。由这样得到的DNA，可以获得编码人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽的DNA。
[0045] 作为导入表达载体的上述宿主细胞，只要是可表达上述多肽的细胞，就可以是任何细胞，作为原核细胞的例子可以列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物细胞、人胎儿肾脏细胞株HEK293、小鼠胚胎皮肤细胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母细胞、蚕细胞、爪蟾卵细胞等，但不限于这些。
[0046] 当使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能在原核细胞中复制的复制起点(Origin)、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺陷型互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。此时，也可以将该多肽制成与其他蛋白质的融合蛋白质来表达。
[0047] 当使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区、多聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这样的表达载体，可以例示pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pYES2等。与上述同样地，如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，可以作为附加了His标签(例如(His)6～(His)10)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质，而表达上述多肽。
[0049] 为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以将公知的分离操作组合来进行。可以列举例如，利用脲等变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析和/或溶剂分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、反相层析等，但不限于此。
[0050] 为了制作本发明的抗体，可以将如上制作的抗原如后述那样作为致敏抗原使用。
[0051] ＜抗体的结构＞
[0052] 抗体(免疫球蛋白)通常是至少含有2条重链和2条轻链的杂多聚体糖蛋白质。除了IgM以外，免疫球蛋白是由2条相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链构成的约150kDa的杂四聚体糖蛋白质。典型地，各个轻链通过1个二硫共价键与重链连接，但各种免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键的数有变化。各个重链和轻链还具有链内二硫键。各个重链在一端具有可变区(VH区)，几个恒定区与其连接。各个轻链具有可变区(VL区)，在其相反端具有1个恒定区。轻链的恒定区与重链最初的恒定区对齐，且轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体的可变区通过被称为互补性决定区(CDR)的特定区域而表现特定的可变性，从而赋予抗体以结合特异性。可变区的相对保守的部分被称为框架区(FR)。完整的重链和轻链的可变区分别包含通过3个CDR连接的4个FR。3个CDR在重链中从其N末端依次被称为CDRH1、CDRH2、CDRH3，同样在轻链中被称为CDRL1、CDRL2、CDRL3。在抗体对抗原的结合特异性中，CDRH3最为重要。另外，各链的CDR通过FR区以接近的状态被保持在一起，与来自其他链的CDR一同有助于抗体的抗原结合部位的形成。恒定区不直接有助于抗体与抗原结合，但表现各种效应器功能，例如，显示与抗体依赖性细胞性细胞毒活性(ADCC)的相关、介由对Fcγ受体的结合而产生的吞噬作用、介由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除速度、介由补体级联的C1q构成要素的补体依赖性细胞毒(CDC)。
[0053] ＜抗体的制作＞
[0054] 本发明中的抗CAPRIN-1抗体是指与CAPRIN-1蛋白质的全长或其片段具有免疫反应性的抗体。特别是本发明的抗CAPRIN-1抗体是与包含作为CAPRIN-1蛋白质的部分多肽(CAPRIN-1部分多肽)的表位的包含序列号5所示的氨基酸序列的肽、或包含与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的多肽免疫结合的抗体。本发明的抗体优选识别包含序列号5所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列中的、连续的约7～12个氨基酸、例如连续的8～11个氨基酸的表位。本发明的该抗CAPRIN-1抗体可以与全长CAPRIN-1蛋白质特异性地结合。本发明的抗体可以如下获得：通过常规方法从以CAPRIN-1蛋白质或其片段作为抗原而得到的抗体中选择与包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽、或包含与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的多肽免疫结合的抗体。
[0055] 这里，“免疫反应性”是指在生物体内抗体与CAPRIN-1抗原(CAPRIN-1蛋白质的全长或其部分多肽)结合的特性。介由本发明的抗体对CAPRIN-1的这样的结合而对肿瘤细胞发挥毒害(例如，死灭、抑制或衰退)的功能。本发明的抗体与CAPRIN-1蛋白质结合，从而可以毒害肿瘤例如乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌(例如结肠癌)、肺癌、脑瘤、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑素瘤等。
[0056] 本发明的抗体可以是任意的种类(类型)的抗体。作为本发明的抗体的种类的例子，包含单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2、Fv)等。另外，抗体是免疫球蛋白分子的任意类例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY，或任意亚类例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、gA1、IgA2等。
[0058] 以下显示各种抗体的制作例。
[0059] 当抗体是单克隆抗体时，例如将表达CAPRIN-1的乳癌细胞株SK-BR-3等施与小鼠而进行免疫，从该小鼠取出脾脏，将细胞分离，然后使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从所得的融合细胞(杂交瘤)中选择产生具有癌细胞增殖抑制作用的抗体的克隆。或可以选择产生与包含序列号5所示的氨基酸序列的多肽、或包含与该氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列的多肽结合的抗体的克隆。分离产生具有癌细胞增殖抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤或产生针对序列号5等多肽的单克隆抗体的杂交瘤，培养该杂交瘤，从培养上清通过一般的亲和纯化法来纯化抗体，从而制备本发明的抗体。
[0060] 产生单克隆抗体的杂交瘤例如也可以如下地制作。首先，按照公知的方法，用致敏抗原对动物进行免疫。作为一般的方法，可以通过将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮下注射来进行。具体来说，可以将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate-Buffered Saline)和/或生理盐水等稀释成适当量、进行悬浮，在所得的产物中根据需要适量混合通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂，乳化后，每4～21天对哺乳动物施与，施与数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用合适的载体。
[0061] 这样将哺乳动物进行免疫，确认在血清中所需的抗体水平升高，然后从哺乳动物采取免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞，特别可以列举脾细胞。
[0062] 作为与上述免疫细胞融合的其他母细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。作为该骨髓瘤细胞，优选使用公知的各种细胞株，例如P3U1(P3-X63Ag8U1)、P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(deSt.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
[0063] 上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法，例如Kohler和Milstein的方法(Kohler，G.and Milstein，C.Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等来进行。
[0064] 更具体地，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需要为了提高融合效率，还可以添加使用二甲基亚砜等助剂。
[0065] 免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意地设定。例如优选使免疫细胞相对于骨髓瘤细胞为1～10倍。作为在上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如，适合上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其他可以在这种细胞培养中使用的通常的培养液，进一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
[0066] 在细胞融合中，将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，将预先加温至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000～6000左右)以通常30～60％(w/v)的浓度添加、混合，由此形成作为目的的杂交瘤。接着，优选将逐次添加适当的培养液、离心除去上清的操作反复进行，由此除去对于杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0067] 这样得到的杂交瘤可以通过在通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养来选择。上述HAT培养液中的培养持续对于除了作为目的的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死灭充分的时间(通常数天～数周)。然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。
[0068] 另外，除了对除人以外的动物免疫抗原来得到上述杂交瘤以外，还可以将人淋巴细胞、例如感染了EB病毒的人淋巴细胞在体外(in vitro)用蛋白质、蛋白质表达细胞或其溶解物致敏，使致敏淋巴细胞与来源于人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266(注册号TIB196)融合，得到产生具有所希望的活性(例如，细胞增殖抑制活性)的人抗体的杂交瘤。
[0069] 这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养，另外，可在液氮中长期保存。
[0070] 即，可以使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，从而制作。
[0071] 可以在本发明中使用的抗体的其他例是多克隆抗体。多克隆抗体例如可以如下得到。
[0072] 将天然的CAPRIN-1蛋白质、或作为与GST等的融合蛋白质而在大肠杆菌等微生物中表达的重组CAPRIN-1蛋白质、或其部分肽免疫小鼠、产生人抗体的小鼠、兔等小动物，获得血清。或者，将包含作为CAPRIN-1的片段的序列号5所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列的多肽(优选由该氨基酸序列组成的多肽)，或含有包含序列号5所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上的序列同一性的氨基酸序列中的连续的约7～12个氨基酸、例如连续的8～11个氨基酸的表位(优选由该表位组成)的多肽作为致敏抗原，免疫哺乳动物，获得血清。将这些血清通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE离子交换层析、偶联了CAPRIN-1蛋白质和/或合成肽的亲和柱等来纯化，从而可以制备抗CAPRIN-1多克隆抗体。本发明的多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如小鼠)免疫CAPRIN-1蛋白质而得的抗体。
[0073] 这里，作为产生人抗体的小鼠，已知例如KM小鼠(キリンファーマ/Medarex)和Xeno小鼠(Amgen)(例如，国际公开第WO02/43478号、国际公开第WO02/092812号等)。将这样的小鼠用CAPRIN-1蛋白质或其片段进行免疫时，可以从血液得到完全人多克隆抗体。另外，可以从免疫后的小鼠中取出脾脏细胞，利用与骨髓瘤细胞的融合法来制作人型单克隆抗体。
[0074] 抗原的制备可以根据例如使用了动物细胞的方法(日本特表2007-530068)和/或使用了杆状病毒的方法(例如，国际公开第WO98/46777号等)等来进行。当抗原的免疫原性低时，可以使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合而进行免疫。抗原也可以与佐剂一起施与而进行免疫。
[0075] 本发明的抗体进一步还可以作为将其抗体基因由杂交瘤克隆化，整合到适当的载体中，并将其导入宿主，使用基因重组技术而产生的基因重组型抗体而得到(参照例如Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体来说，由杂交瘤的mRNA使用逆转录酶来合成抗体的可变区(V区)的cDNA。如果可得到编码目的抗体的V区的DNA，则将其与编码所希望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将连接产物整合到表达载体中。或者也可以将编码抗体的V区的DNA整合到包含抗体C区的DNA的表达载体中。上述DNA以在表达控制区域、例如增强子、启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。接着可以用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
[0076] 本发明的抗CAPRIN-1抗体优选为单克隆抗体。但是，也可以是多克隆抗体、基因改变抗体(嵌合抗体、人源化抗体等)等。
[0077] 单克隆抗体包含人单克隆抗体、非人动物单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)、嵌合单克隆抗体等。单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来制作，所述杂交瘤通过将来自用CAPRIN-1蛋白质或其片段免疫的非人哺乳动物(例如小鼠、产生人抗体的小鼠、鸡、兔等)的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合而得到。嵌合抗体是将来源于不同动物的序列组合而制作的抗体，例如是包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体等。嵌合抗体的制作可以使用公知的方法来进行，例如可以通过将编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中并导入宿主，而使其产生，从而得到。
[0079] 人源化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的改变抗体。人源化抗体通过将来源于免疫动物的抗体的CDR移植到人抗体的互补性决定区中来构建。其一般的基因重组方法也是已知的。
[0080] 具体来说，通过PCR法，由以末端部具有重叠部分的方式制作的数个寡核苷酸，合成以将例如小鼠抗体、兔抗体和/或鸡抗体的CDR与人抗体的框架区(framework region；FR)连接的方式设计的DNA序列。将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主而使其产生，从而得到人源化抗体(参照欧洲专利申请公开第EP239400号、国际公开第WO96/02576号)。介由CDR连接的人抗体的FR可以选择形成互补性决定区良好的抗原结合部位的FR。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的框架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato K.et al.，Cancer Research 1993，53：851-856)。另外，FR可以替换为不同类或亚类的来源于人抗体的框架区(参考国际公开第WO99/51743号)。
[0081] 在制作嵌合抗体或人源化抗体后，可以将可变区(例如，FR)和/或恒定区中的氨基酸用其他氨基酸替换等。
[0082] 氨基酸的替换例如是小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选1～5个氨基酸、更优选1或2个氨基酸的替换，替换抗体应与未替换抗体在功能上等同。期望替换是保守的氨基酸替换，这是电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸之间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。
[0083] 作为抗体修饰物，可以列举例如与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明的抗体修饰物中，不限定所结合的物质。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得的抗体实施化学修饰来得到。这些方法在本领域已经被确立。
[0084] 这里，“在功能上等同”是指成为对象的抗体与本发明的抗体具有同样的生物学或生物化学活性，具体来说，是指具有毒害肿瘤的功能、以及在对人应用时本质上不发生排斥反应等。作为这样的活性，可以列举例如细胞增殖抑制活性、或结合活性。
[0085] 作为用于制备与某多肽在功能上等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知在多肽中导入突变的方法。例如只要是本领域技术人员，就可以使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.，(1995)Gene 152，271-275、Zoller，MJ.，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.et al.，(1984)Nucleic Acids Res.12，
9441-9456、Kramer，W.and Fritz，HJ.，(1987)Methods Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，
2763-2766)等，在本发明的抗体中导入适当的突变，由此制备与该抗体在功能上等同的抗体。
9441-9456、Kramer，W.and Fritz，HJ.，(1987)Methods Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，
2763-2766)等，在本发明的抗体中导入适当的突变，由此制备与该抗体在功能上等同的抗体。
[0086] 上述识别CAPRIN-1蛋白质的表位或包含该表位的CAPRIN-1片段多肽的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过下述方法等来得到：通过通常的方法(例如表位作图(epitope mapping)、后述的表位鉴定的方法等)确定由上述所得的具有癌细胞增殖抑制作用的抗CAPRIN-1抗体所识别的CAPRIN-1蛋白质的表位，以具有该表位中所含的氨基酸序列的多肽为免疫原来制作抗体的方法；确定通过通常的方法制作的抗体的表位，选择表位与抗CAPRIN-1抗体相同的抗体的方法等。这里，“表位”是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7～12个氨基酸、优选8～11个氨基酸。
[0087] 本发明的抗体是与CAPRIN-1具有免疫反应性的抗体、或特异性地识别CAPRIN-1的抗体、或者与CAPRIN-1特异性地结合的抗体，并且是显示对癌的细胞毒活性、或肿瘤增殖抑制作用的抗体。该抗体优选是具有能够在施与该抗体的对象动物中几乎避免或完全避免产生排斥反应那样的结构的抗体。作为这样的抗体，例如在对象动物为人时，可以列举人抗体、人源化抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合抗体)、单链抗体、双特异性抗体等。这些抗体是作为重链和轻链的可变区来源于人抗体的抗体；或重链和轻链的可变区包含来源于非人动物抗体的互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和来源于人抗体的框架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的抗体；或重链和轻链的可变区来源于非人动物抗体、且重链和轻链的恒定区来源于人抗体的抗体的重组型抗体。优选的抗体是前2种抗体。
[0088] 这些重组型抗体可以如下制作。由杂交瘤等产生抗体的细胞克隆化编码针对人CAPRIN-1的单克隆抗体(例如，人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)的DNA，将其作为模板利用RT-PCR法等来制作编码该抗体的轻链可变区和重链可变区的DNA，例如可以基于Kabat EU numbering system(Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))来确定轻链和重链的各可变区的序列、或各CDR1、CDR2、CDR3的序列、或各FR1、FR2、FR3、FR4的序列。
[0089] 进一步地，使用基因重组技术(Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))或DNA合成仪来制作编码这些各可变区的DNA或编码各CDR的DNA。其中，产生上述人单克隆抗体的杂交瘤可以通过在对产生人抗体的动物(例如，小鼠)免疫人CAPRIN-1后，使从该免疫动物切除的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制作。与此分别地，根据需要使用基因重组技术或DNA合成仪来制作编码来源于人抗体的轻链或重链的可变区和恒定区的DNA。
[0090] 在人源化抗体的情况下，可以制作将编码来源于人抗体的轻链或重链的可变区的DNA中的CDR编码序列替换成与它们对应的来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等)的抗体的CDR编码序列而得的DNA，将由此得到的DNA分别与编码来源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，从而制作编码人源化抗体的DNA。
[0091] 在嵌合抗体的情况下，可以通过将编码来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等)的抗体的轻链或重链的可变区的DNA，分别与编码来源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，从而制作编码嵌合抗体的DNA。
[0092] 在单链抗体的情况下，该抗体是将重链可变区和轻链可变区通过连接物以直线状连接而成的抗体，可以通过将编码重链可变区的DNA、编码连接物的DNA、和编码轻链可变区的DNA结合，从而制作编码单链抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体，或者来源于仅CDR被来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。另外，连接物包含12～19个氨基酸，可以列举例如15个氨基酸的(G4S)3(G.-B.Kim等，Protein Engineering Design and Selection 2007，20(9)：425-432)。
[0093] 在双特异性抗体(例如，diabody)的情况下，该抗体是可与2个不同的表位特异性地结合的抗体，例如可以通过将编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变区B的DNA、和编码轻链可变区A的DNA以该顺序进行结合(其中编码轻链可变区B的DNA与编码重链可变区B的DNA可介由编码如上所述的连接物的DNA来结合)，从而制作编码双特异性抗体的DNA。这里，重链可变区和轻链可变区都来源于人抗体，或者来源于仅CDR被来源于除人以外的动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。
[0094] 可以将如上所述制作的重组DNA整合到1个或多个适当的载体中，将其导入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等)，进行(共)表达，从而制作重组型抗体(P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS；J.W.Goding.，Monoclonal Antibodies：principles and practice.，1993ACADEMIC PRESS)。
[0095] 作为通过上述的方法制作的本发明的抗体，可列举例如，后述的实施例中获得的以下的抗体(a)。
[0096] (a)含有包含序列号8、9和10的互补决定区的重链可变区以及包含序列号12、13和14的互补决定区的轻链可变区的抗体(例如包含序列号11的重链可变区和序列号15的轻链可变区的抗体)。
[0097] 这里，序列号8、9和10所示的氨基酸序列分别是来源于小鼠的抗体的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，另外，序列号12、13和14所示的氨基酸序列分别是来源于小鼠的抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
[0098] 另外，本发明的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或双特异性抗体可以是例如以下的抗体(i)～(iii)。
[0099] (i)抗体，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有分别包含序列号8、9和10的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3以及来源于人源化抗体的框架区，所述轻链可变区含有分别包含序列号12、13和14的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3以及来源于人抗体的框架区。
[0100] (ii)抗体，包含重链和轻链，所述重链包含重链可变区和来源于人抗体的重链恒定区，所述重链可变区含有分别包含序列号8、9和10的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3以及来源于人抗体的框架区，所述轻链包含轻链可变区和来源于人抗体的轻链恒定区，所述轻链可变区含有分别包含序列号12、13和14的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3以及来源于人抗体的框架区。
[0101] (iii)抗体，包含重链和轻链，所述重链包含含有序列号11的氨基酸序列的重链可变区和来源于人抗体的重链恒定区，所述轻链包含含有序列号15的氨基酸序列的轻链可变区和来源于人抗体的轻链恒定区。
[0102] 此外，人抗体重链和轻链的恒定区和可变区的序列例如可以由NCBI(美国：GenBank、UniGene等)获得，例如关于人IgG1重链恒定区，可以参照注册号J00228的序列，关于人IgG2重链恒定区，可以参照注册号J00230的序列，关于人IgG3重链恒定区，可以参照注册号X03604的序列，关于人IgG4重链恒定区，可以参照注册号K01316的序列，关于人轻链κ恒定区，可以参照注册号V00557、X64135、X64133等的序列，关于人轻链λ恒定区，可以参照注册号X64132、X64134等的序列。
[0103] 上述抗体优选具有细胞毒活性，由此可以发挥抗肿瘤效果。
[0104] 另外，可以明确上述抗体中的重链和轻链的可变区和/或CDR的特定序列仅仅是用于例示，并不限于特定的序列。制作可产生针对人CAPRIN-1的其他人抗体或非人动物抗体(例如小鼠抗体)的杂交瘤，回收由杂交瘤产生的单克隆抗体，以与人CAPRIN-1的免疫结合性和细胞毒活性作为指标，来判定是否为目的抗体。由此识别产生目的单克隆抗体的杂交瘤后，如上所述，由该杂交瘤制作编码目的抗体的重链和轻链的可变区的DNA，进行序列确定，将该DNA用于其他抗体的制作。
[0105] 进一步地，本发明的上述抗体只要具有特异性地识别CAPRIN-1这样的特异性，则各抗体的特别是框架区的序列和/或恒定区的序列中，可以有1个或数个氨基酸的替换、缺失或添加。这里数个是指2～5个、优选2个或3个。
[0106] 本发明的抗体对CAPRIN-1蛋白质或其片段的亲和常数Ka(kon/koff)优选至少为107M-1、至少为108M-1、至少为5×108M-1、至少为109M-1、至少为5×109M-1、至少为1010M-1、至少为5×1010M-1、至少为1011M-1、至少为5×1011M-1、至少为1012M-1、或者至少为1013M-1。
[0107] 本发明的抗体可以与抗肿瘤剂缀合。抗体与抗肿瘤剂的结合可以介由具有与氨基、羧基、羟基、硫醇基等为反应性的基团(例如，琥珀酰亚胺基、甲酰基、2-吡啶基二硫代基、马来酰亚胺基、烷氧基羰基、羟基等)的间隔物来进行。
[0108] 抗肿瘤剂的例子包含通过文献等而公知的下述抗肿瘤剂，即，紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycin1、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类、例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮
(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵
(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙
(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)，以及它们的药学上容许的盐或衍生物。
(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵
(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙
(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)，以及它们的药学上容许的盐或衍生物。
[0109] 另外，通过将本发明的抗体与抗肿瘤剂合并使用施与，可以得到更高的治疗效果。本方法对表达CAPRIN-1的癌患者可以适应外科的手术前后的任一阶段。特别地在手术后，对目前用抗肿瘤剂单独处置的表达CAPRIN-1的癌，可以得到更好的癌复发防止和/或生存时间的延长。
[0110] 用于与本发明的抗体合并使用施与的抗肿瘤剂的例子，也包含通过文献等而公知的下述抗肿瘤剂，即，紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycin1、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾榴塞洛素
(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、
spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸
(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷
(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙
(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺
(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)，以及它们的药学上容许的(公知的)盐或(公知的)衍生物。上述中，特别优选使用环磷酰胺、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨。
(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、
spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸
(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷
(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙
(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺
(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西他赛、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)，以及它们的药学上容许的(公知的)盐或(公知的)衍生物。上述中，特别优选使用环磷酰胺、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨。
[0111] 或者，本发明的抗体中也可以结合通过文献等而公知的211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153SM、212Bi、32P、175Lu、176Lu、89Sr、64Cu、111In等放射性同位素(Hideo Saji,YAKUGAKU ZASSHI 128(3)323-3328(2008),Jpn)。放射性同位素期望是可有效地用于治疗或诊断肿瘤的放射性同位素。这样的放射性同位素也包含在本发明中的抗肿瘤剂中。
[0112] ＜表位的鉴定＞
[0113] 本发明的抗体如以下的实施例所示，与序列号5所示的氨基酸序列中的表位结合。作为确认针对本发明的抗体的表位的方法之一，可列举将序列号5的多肽中的表位固定化于板，评价针对本表位的抗体的反应性的方法。具体地，可以介由低聚乙二醇等间隔物使序列号5的多肽中的表位与带有吸电子性官能团的板反应而进行固定化，然后使本发明的抗体与其反应，再与用HRP(辣根过氧化物酶，Horseradish Peroxidase)等标记的、与本发明的抗体结合的二抗反应，从而评价抗体的反应性(确认本发明的抗体所结合的表位)。此外，固定化于板的序列号5的多肽中的表位可使用序列号5的序列中至少包含该表位的序列本身，或其部分修饰物(例如，N末端残基和/或C末端残基修饰了数个任意氨基酸和/或KLH等蛋白质的修饰物、或对MAP蛋白质修饰了(多)肽的修饰物等)，可以对这些任一(多)肽结合本发明的抗体。
[0114] 另一方面，即使是本发明的抗体也可能有时在上述方法中不与序列号5的多肽反应(不能确认表位)。这时，可以在抗原与抗体容易结合的溶液条件下使抗原与抗体反应，通过免疫沈降法获得抗原-抗体复合体，然后分离与抗体结合的部分多肽，研究其氨基酸序列，从而确认本发明的抗体的表位。此外，抗原可以是例如，上述的序列号5的多肽本身、其部分修饰物、或CAPRIN-1蛋白质，都可以通过上述方法确认与本发明的抗体反应的表位。
[0115] ＜抗肿瘤效果＞
[0116] 认为本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体对表达CAPRIN-1的癌细胞的抗肿瘤效果，是由以下机制所引起的：表达CAPRIN-1的细胞的效应器细胞抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、和表达CAPRIN-1的细胞的补体依赖的细胞毒性(CDC)。但是并不意味着由该机制而限定本发明的范围。
[0117] 另外，已知由上述机制产生的抗肿瘤效果与在癌细胞的细胞表面表达的、与抗体结合的靶分子的数相关(Niwa R.,Clinical Cancer Research 2005Mar 15；11(6)：2327-2336)。在癌细胞的细胞表面表达的靶分子的数可以使用能够测定细胞表面的分子数的现有的测定试剂盒来检查。即，抗体所结合的靶分子的数，可以将针对靶分子的抗体等作为一抗而使其与癌细胞反应，与预先已知分子数的标准曲线珠一起，使其与荧光标记后的抗一抗反应，测定样品的平均荧光强度，得到标准曲线，从而获知靶分子的数。
[0118] 因此，本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体的活性评价，如以下实施例中具体显示的那样，可以通过在生物体外对表达CAPRIN-1的癌细胞测定上述ADCC活性或CDC活性来进行评价，或者通过检查在使用本发明中的抗CAPRIN-1抗体作为一抗时在癌细胞的细胞表面表达的CAPRIN-1分子的数来进行评价。
[0119] 认为本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体与癌细胞上的CAPRIN-1蛋白质结合，通过上述活性而显示抗肿瘤作用，因此在癌的治疗或预防中是有用的。即，本发明提供以抗CAPRIN-1抗体为有效成分的、用于癌的治疗和/或预防的药物组合物。在将抗CAPRIN-1抗体以施与人体的目的(抗体治疗)使用时，为了使免疫原性降低，优选制成人抗体和/或人源化抗体。
[0120] 此外，抗CAPRIN-1抗体与癌细胞表面上的CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性越高，越可以由抗CAPRIN-1抗体得到更强的抗肿瘤活性。因此，本发明的抗体由于与CAPRIN-1蛋白质具有高的结合亲和性，因而可以期待更强的抗肿瘤效果，可以适应制成以癌的治疗和/或预防为目的的药物组合物。本发明的抗体作为高的结合亲和性，如上所述，优选具有至少107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、或至少1013M-1的结合常数(亲和常数)Ka(kon/koff)。
[0121] 另外，与抗CAPRIN-1抗体结合的癌细胞表面上的CAPRIN-1分子的数越多，则越可以由抗CAPRIN-1抗体得到更强的抗肿瘤活性。为了期待抗肿瘤效果，CAPRIN-1分子的数在测定中使用本发明的抗CAPRIN-1抗体的情况下，每1个与该抗体结合的癌细胞的CAPRIN-1分子的数期望为104个以上，优选为105个以上。细胞表面上的CAPRIN-1分子的数多的肿瘤(癌细胞)特别优选作为成为本发明的抗体的施与对象的癌。
[0122] ＜对表达抗原的细胞的结合＞
[0123] 抗体与CAPRIN-1结合的能力可以利用如实施例中所述那样的使用了例如ELISA法、蛋白质印迹法、免疫荧光和流式细胞仪分析等的结合分析来特定。
[0124] ＜免疫组织化学染色＞
[0125] 识别CAPRIN-1的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法中的免疫组织化学，使用由外科手术期间从患者得到的组织、和/或从担载了接种有自然地或在转染后表达CAPRIN-1的细胞系的异种移植组织的动物得到的组织进行低聚甲醛或丙酮固定而得的冷冻切片，或用低聚甲醛固定并进行石蜡包埋而得的组织切片，关于与CAPRIN-1的反应性进行试验。
[0126] 为了进行免疫组织化学染色，可以用各种方法使对CAPRIN-1具有反应性的抗体染色。例如可以通过与辣根过氧化物酶复合山羊抗小鼠抗体、山羊抗兔抗体和/或山羊抗鸡抗体反应，从而进行可视化。
[0127] ＜药物组合物、和癌的治疗和/或预防方法＞
[0128] 本发明的用于癌的治疗和/或预防的药物组合物的靶，只要是表达CAPRIN-1基因的癌(细胞)就没有特别限定。
[0129] 本说明书中使用的“肿瘤”和“癌”这样的术语是指恶性新生物，可以互换使用。
[0130] 作为在本发明中成为对象的癌，是表达编码CAPRIN-1蛋白质的基因的癌，优选为乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌、肺癌、脑瘤、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑素瘤。
[0131] 这些特定的癌中，包含例如乳腺癌、复合型乳腺癌、乳腺恶性混合肿瘤、乳管内乳头状腺癌、肺腺癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、大细胞癌、作为神经上皮组织性肿瘤的神经胶质瘤、室管膜瘤、神经元肿瘤、胎儿型的神经外胚层肿瘤、神经鞘瘤、纤维神经瘤、脑脊膜瘤、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、消化道淋巴瘤、消化器官淋巴瘤、小～中细胞型淋巴瘤、盲肠癌、升结肠癌、降结肠癌、横结肠癌、乙状结肠癌、直肠癌、卵巢上皮癌、胚细胞瘤、间质细胞瘤、胰管癌、浸润性胰管癌、胰癌的腺癌、腺泡细胞癌、腺扁平上皮癌、巨细胞瘤、胰管内乳头粘液性肿瘤、粘液性囊腺癌、胰母细胞瘤、浆液性囊腺癌、固体乳头状癌、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、胰岛素瘤、多发性内分泌腺瘤综合症1(Wermer综合症)、非功能性胰岛细胞瘤、生长激素抑制素瘤、VIP产生瘤，但不限于这些。
[0132] 另外，成为对象的优选的受试者(患者)是哺乳动物，例如是包含灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选是人、狗和猫。
[0133] 当将本发明中使用的抗体作为药物组合物使用时，可以利用本领域技术人员公知的方法进行制剂化。例如，可以以与水或除水以外的药学上容许的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂的形式非经口地使用。例如，认为可以与药理学上容许的载体或介质、具体来说为灭菌水和/或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、防腐剂、结合剂等适当组合，通过以一般认为的制药实施所要求的单位用量方式混和来进行制剂化。这些制剂中的有效成分量，是可得到所指示的范围的适当的用量那样的量。
[0134] 用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的媒介物，按照通常的制剂实施来处方。
[0135] 作为注射用的水溶液，可以列举例如生理盐水、含有葡萄糖和/或其他辅助剂、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠的等渗液，也可以与适当的溶解助剂、例如醇、具体为乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-60合并使用。
[0136] 作为油性液可以列举芝麻油、大豆油，其也可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇合并使用。另外，还可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。制备的注射液通常填充到适当的安瓿中。
[0137] 施与为经口或非经口，优选非经口施与，具体来说，可以列举注射剂型、经鼻施与剂型、经肺施与剂型、经皮施与型等。作为注射剂型的例子，可以通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部性地施与。
[0138] 另外，可以根据患者的年龄、体重、性别、症状等选择适当的施与方法。作为含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的施与量，例如可以在一次每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围中选择。或者例如可以在每个患者0.001～100000mg/个体的范围中选择施与量，但未必限于这些数值。施与量、施与方法根据患者的体重、年龄、性别、症状等不同而变化，只要是本领域技术人员就可以适当选择。
[0139] 通过将包含本发明的抗体或其片段的上述药物组合物施与受试者，可以治疗和/或预防癌，优选为乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌、肺癌、脑瘤、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑素瘤。
[0140] 进一步地，本发明还包含癌的治疗和/或预防方法，该方法包括以下步骤：将本发明的药物组合物与如上述所例示的抗肿瘤剂或包含抗肿瘤剂的药物组合物组合，合并使用施与受试者。本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂可以同时施与受试者，或者分别施与受试者。分别施与时，任一药物组合物可以在先也可以在后，它们的施与间隔、施与量、施与途径和施与次数可由专业医师适当选择。同时施与的其他药物剂型还包含例如将本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂在药理学上容许的载体(或介质)中混合并进行制剂化而得的药物组合物。另外，对于含有抗肿瘤剂的上述药物组合物和剂型的任一者，可以适用对于含有本发明的抗体的药物组合物和剂型的处方、制剂化、施与途径、用量、癌等的说明。
[0141] 因此，本发明还提供：包含本发明的药物组合物、和含如以上所例示的抗肿瘤剂的药物组合物的用于癌的治疗和/或预防的组合药物，以及包括施与该组合药物的步骤的癌的治疗和/或预防方法。另外，本发明还提供在包含本发明的抗体或其片段和抗肿瘤剂的同时、还包含药理学上容许的载体的用于癌的治疗和/或预防的药物组合物。
[0142] ＜多肽和DNA＞
[0143] 本发明进一步提供编码本发明的上述抗体或其片段(抗体结合片段)的DNA。这样的DNA既可以是编码上述抗体的重链和/或轻链的DNA，也可以是编码上述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA。这样的DNA还可以是单独或组合编码上述抗体的各互补决定区的DNA。这样的DNA例如，在上述抗体(a)的情况下，包含：包含编码序列号8、9和10的氨基酸序列的碱基序列的编码重链可变区的DNA、包含编码序列号12、13和14的氨基酸序列的碱基序列的编码轻链可变区的DNA，等等。
[0144] 由于由这些序列的DNA所编码的互补决定区(CDR)是决定抗体的特异性的区域，因而编码抗体的除此以外的区域(即，恒定区和框架区)的序列可以是来源于其他抗体的序列。这里其他抗体也包含来源于除人以外的生物的抗体，但从降低副作用的观点考虑优选来源于人的抗体。即，在上述的DNA中，编码重链和轻链的各框架区和各恒定区的区域优选包含编码来源于人抗体的对应氨基酸序列的碱基序列。
[0145] 进而，编码本发明的抗体的DNA的其他例，例如在上述抗体(a)的情况下，是包含编码序列号11的氨基酸序列的碱基序列的包含编码重链可变区的碱基序列的DNA、编码轻链可变区的区域包含编码序列号15的氨基酸序列的碱基序列的DNA等。这里，编码序列号11的氨基酸序列的碱基序列的例子是序列号16的碱基序列。另外编码序列号15的氨基酸序列的碱基序列的例子是序列号17的碱基序列。这些DNA包含编码重链和轻链的各恒定区的区域的情况下，该区域优选包含编码来源于人抗体的对应氨基酸序列(重链和轻链的各恒定区的氨基酸序列)的碱基序列。
[0146] 这些抗体的DNA可以通过例如上述的方法或以下的方法得到。首先，从产生本发明的抗体的杂交瘤使用市售的RNA提取试剂盒制备总RNA，使用随机引物等通过逆转录酶合成cDNA。接着通过使用了已知的在小鼠抗体重链基因和轻链基因的各可变区中分别保守的序列的寡核苷酸作为引物的PCR法，来扩增编码抗体的cDNA。对于编码恒定区的序列，可以通过将已知的序列用PCR法扩增来得到。DNA的碱基序列可以插入到序列确定用质粒或噬菌体中等，通过常规方法来确定。
[0147] 本发明进一步还提供与上述抗体(a)相关的以下的多肽和DNA。
[0148] (i)包含序列号11的氨基酸序列的多肽、和编码该多肽的DNA(例如，包含序列号16的碱基序列的DNA)。
[0149] (ii)包含序列号15的氨基酸序列的多肽、和编码该多肽的DNA(例如，包含序列号17的碱基序列的DNA)。
[0150] (iii)选自序列号8、9和10所示的氨基酸序列中的重链CDR多肽、和编码该多肽的DNA。
[0151] (iv)选自序列号12、13和14所示的氨基酸序列中的轻链CDR多肽、和编码该多肽的DNA。
[0152] 这些多肽和DNA如上所述，可以使用基因重组技术来制作。
[0153] ＜本发明的归纳＞
[0154] 以下归纳以上所说明的本发明。
[0155] (1)抗体或其片段，与CAPRIN-1部分多肽具有免疫反应性，所述CAPRIN-1部分多肽包含序列号5所示的氨基酸序列或与该氨基酸序列具有80％以上的序列同一性的氨基酸序列。
[0156] (2)根据上述(1)所述的抗体或其片段，对表达CAPRIN-1蛋白质的癌细胞具有细胞毒活性。
[0157] (3)根据上述(1)或(2)所述的抗体或其片段，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0158] (4)根据上述(1)～(3)的任一项所述的抗体或其片段，是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体。
[0159] (5)根据(1)～(4)的任一项所述的抗体或其片段，包含重链可变区和轻链可变区，且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫反应，所述重链可变区包含序列号8的互补决定区CDR1、序列号9的互补决定区CDR2和序列号10的互补决定区CDR3，所述轻链可变区包含序列号12的互补决定区CDR1、序列号13的互补决定区CDR2和序列号14的互补决定区CDR3。
[0160] (6)根据上述(1)～(5)的任一项所述的抗体或其片段，缀合了抗肿瘤剂。
[0161] (7)用于癌的治疗和/或预防的药物组合物，其特征在于，包含上述(1)～(6)的任一项所述的抗体或其片段作为有效成分。
[0162] (8)根据上述(7)所述的药物组合物，所述癌是乳癌、肾癌、胰癌、大肠癌、肺癌、脑瘤、胃癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、食道癌、白血病、淋巴瘤、纤维肉瘤、肥大细胞瘤或黑素瘤。
[0163] (9)用于癌的治疗和/或预防的组合药物，包含：上述(7)或(8)所述的药物组合物、和含有抗肿瘤剂的药物组合物。
[0164] (10)DNA，编码上述(1)～(5)的任一项所述的抗体或其片段。
[0165] (11)癌的治疗和/或预防方法，包括将上述(1)～(6)的任一项所述的抗体或其片段、(7)或(8)所述的药物组合物、或上述(9)所述的组合药物施与受试者的步骤。
[0166] 实施例
[0167] 以下基于实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围不受这些具体例限制。
[0168] 实施例1各组织中的CAPRIN-1表达分析
[0169] 按照WO2010/016526的实施例1(4)通过RT-PCR法来检查CAPRIN-1基因在狗和人的正常组织和各种细胞株中的表达。其结果发现，对于健常的狗组织，在精巢中发现强表达，另一方面在狗乳癌和腺癌组织中发现表达。进而，同时确认了在人组织中的表达，结果与狗CAPRIN-1基因同样地，在正常组织中能确认表达的仅为精巢，对于癌细胞，在人乳癌细胞株8种(ZR75-1、MCF7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-157、BT-20、MDA-MB-231V、MRK-nu-1)和胰癌细胞株4种(Capan-2、MIAPaCa-2、Panc-1、BxPc-3)等多种癌细胞株中检出了表达。由该结果确认了，CAPRIN-1在除精巢以外的正常组织中看不到表达，另一方面，在乳癌细胞株和胰癌细胞株中表达。
[0170] 实施例2针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体的制作
[0171] (1)小鼠单克隆抗体的制作
[0172] 将WO2010/016526的实施例3中制备的具有序列号2的氨基酸序列的人CAPRIN-1蛋白质100μg与等量的MPL+TDM佐剂(シグマ社制)混合，将所得的混合物作为每1只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与至6周龄的Balb/cc小鼠(日本SLC社制)的腹腔内后，每1周施与，施与7次，从而完成免疫。将从最后的免疫起3天后摘出的各个脾脏夹在灭菌后的2片载玻片中磨碎，将使用PBS(-)(日水社制)洗涤、以1500转/分钟离心10分钟并除去上清的操作重复3次，从而得到脾脏细胞。将所得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(从ATCC购入)以10:1的比率混和，在其中加入混合加温至37℃的包含10％FBS的RPMI1640培养基200μl和PEG1500(ベーリンガー社制)800μl而制备的PEG溶液，并静置5分钟，从而进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，除去上清，然后用加入了2％当量的Gibco社制的HAT溶液的含15％FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)150ml悬浮细胞，以96孔板(ヌンク社制)的每1孔各100μl接种于15块板中。以7天、37℃、5％CO2的条件培养，从而得到脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤。
[0173] 以由制作的杂交瘤所产生的抗体的针对CAPRIN-1蛋白的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将用WO2010/016526的实施例3所记载的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次后，在每1孔中添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(シグマ社制)400μl，在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen社制)100μl，在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。
其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
其结果是，筛选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。
[0174] 将筛选出的杂交瘤以96孔板每1孔0.5个的方式添加到板中进行培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。将这些孔的细胞进行进一步培养，以由克隆化的杂交瘤产生的抗体的针对CAPRIN-1蛋白的结合亲和性为指标筛选杂交瘤。将通过WO2010/016526的实施例3所记载的方法制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml在96孔板的每1孔中添加100μl，在4℃静置18小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加0.5％BSA溶液400μl，并在室温静置3小时。除去溶液，对每1孔用400μl的PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加上述所得的杂交瘤的各培养上清100μl，在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，在每1孔中添加用PBS稀释至5000倍的HRP标记抗小鼠IgG(H+L)抗体(インビトロジェン社制)100μl并在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，并静置15～
30分钟，从而显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了61个产生对CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
30分钟，从而显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，得到了61个产生对CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的杂交瘤株。
[0175] 接着在这些单克隆抗体中，筛选对表达CAPRIN-1的乳癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，在其中添加上述各杂交瘤的培养上清100μl，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用含0.1％FBS的PBS稀释了500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(インビトロジェン社制)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，对使用了以杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的未经过任何处理6周龄的Balb/c小鼠的血清代替抗体的样品进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，筛选出了1个与对照相比荧光强度强、即与乳癌细胞的细胞表面反应的单克隆抗体(抗CAPRIN-1抗体#1)。
[0176] (2)由抗CAPRIN-1单克隆抗体#1所识别的CAPRIN-1表位的鉴定
[0177] 使用(1)中获得的、与癌细胞的细胞表面反应的针对CAPRIN-1的单克隆抗体(抗CAPRIN-1抗体#1)进行所识别的CAPRIN-1表位区域的鉴定。合成包含人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中的12～16个氨基酸的93个候选肽，分别用DMSO溶解至1mg/ml的浓度。
[0178] 将各肽在0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)中溶解至30μg/ml的浓度，在96孔板(Nunc社制、制品号：436006)的每1孔中各添加100μl并在4℃静置一夜。丢弃液体，将10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.6)在每1孔中各添加200μl，在室温静置1小时后，丢弃液体，用含
0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，从而制作固相化了各肽的板。
0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤2次，从而制作固相化了各肽的板。
[0179] 在其中将含抗CAPRIN-1抗体#1的细胞培养上清在每1孔中添加50μl，在室温振荡1小时后，除去液体，用PBST洗涤3次。接着，将被HRP标记的抗小鼠IgG(Invitrogen社制)抗体用PBST稀释至3000～4000倍而得的二抗溶液在孔中各添加50μl后，除去液体，用PBST洗涤6次。
[0180] 在每1孔中添加TMB底物溶液(Thermo社制)100μl，静置15～30分钟，从而进行显色反应。显色后，在每1孔中添加1N硫酸100μl使反应停止，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。
[0181] 其结果是，作为由实施例2(1)中得到抗CAPRIN-1抗体#1所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定了序列号5的多肽。
[0182] (3)抗CAPRIN-1抗体#1的可变区基因的克隆化
[0183] 对于实施例2(1)中所得的单克隆抗体，按照WO2010/016526的实施例5所记载的方法分析编码可变区的基因序列及其氨基酸序列。其结果是，单克隆抗体#1含有包含序列号11所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号15所示的氨基酸序列的轻链可变区。编码所得的单克隆抗体#1的重链可变区的基因序列示于序列号16，并且氨基酸序列示于序列号
11，编码轻链可变区的基因序列示于序列号17，并且氨基酸序列示于序列号15。
11，编码轻链可变区的基因序列示于序列号17，并且氨基酸序列示于序列号15。
[0184] 进而显示，实施例2(1)所得的单克隆抗体#1含有包含序列号11所示的氨基酸序列的重链可变区和包含序列号15所示的氨基酸序列的轻链可变区，其中，重链可变区中的CDR1～3分别包含序列号8、序列号9、序列号10所示的氨基酸序列，轻链可变区中的CDR1～3分别包含序列号12、序列号13、序列号14所示的氨基酸序列。
[0185] 实施例3针对存在于癌细胞表面上的CAPRIN-1的部分多肽的多克隆抗体的制作[0186] 为了获得针对存在于癌细胞表面上的CAPRIN-1的部分多肽的多克隆抗体，合成了包含实施例2中获得的抗CAPRIN-1抗体#1的表位区域的多肽(序列号5所示的来源于CAPRIN-1的肽)、序列号2的人CAPRIN-1的氨基酸序列中的氨基酸残基号50-98区域的多肽和序列号2中的氨基酸残基号233-305区域的多肽。将这些肽各1mg作为抗原，与等体积的弗氏不完全佐剂(IFA)溶液混合，将其每2周在兔的皮下施与，施与4次。然后采取血液，得到包含各多克隆抗体的抗血清。进一步将这些抗血清使用蛋白G载体(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行纯化，用PBS进行置换，从而得到针对存在于癌细胞表面上的CAPRIN-1的部分多肽的多克隆抗体。另外，将未施与抗原的兔的血清与上述同样地使用蛋白G载体纯化后作为对照抗体。
[0187] 实施例4癌细胞膜面上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析
[0188] 接着对于确认了大量的CAPRIN-1基因的表达的人乳癌细胞株8种(ZR75-1、MCF7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-157、BT-20、MDA-MB-231V、MRK-nu-1)，检查其细胞表面上是否表达CAPRIN-1蛋白质。在1.5ml的微量离心管中离心分离在上述确认了基因表达的各人乳癌细胞株各5×105细胞。对此添加在本实施例3中如上所述制备的针对序列号5所示的来源于CAPRIN-1的肽的多克隆抗体2μg(5μl)和95μl的含0.1％胎牛血清的PBS进行混合，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加1μl的Alexa488标记山羊抗兔IgG抗体(インビトロジェン社制)和98μl的包含0.1％胎牛血清(FBS)的PBS进行混合，在冰上静置30小时。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。另一方面，使用在实施例3中如上所述制备的对照抗体代替针对来源于CAPRIN-1的肽的多克隆抗体进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，添加了抗CAPRIN-1抗体的细胞与对照相比任一癌细胞均荧光强度强35％以上。由此确认，CAPRIN-1蛋白在上述人癌细胞株的细胞膜表面上表达。此外，上述荧光强度的增强率用各细胞中的平均荧光强度(MFI值)的增加率来表示，通过以下的计算式算出。
[0189] 平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。
[0190] 另外，使用同样的上述方法，对于肾癌细胞株2种(Caki-1、Caki-2)、膀胱癌细胞株(T24)、卵巢癌细胞株(SKOV3)、肺癌细胞株2种(QG56、A549)、前列腺癌细胞株(PC3)、宫颈癌细胞株(SW756)、纤维肉瘤细胞株(HT1080)、脑瘤细胞株2种(T98G、U87MG)、胃癌细胞株(MKN28)、大肠癌细胞株3种(Lovo、DLD-1、HCT-116)、胰癌细胞株4种(Capan-2、MIAPaCa-2、Panc-1、BxPC-3)测定荧光强度，结果与对照相比，任一癌细胞均荧光强度强35％以上。
[0191] 此外，本结果在使用实施例2中获得的抗CAPRIN-1抗体#1的情况下，也同样地确认了癌细胞膜面上的CAPRIN-1蛋白质的表达。
[0192] 实施例5人-小鼠嵌合单克隆抗体的制作
[0193] 将包含实施例2所得的、抗CAPRIN-1抗体#1的重链可变区的基因扩增片段的两端进行限制酶处理后纯化，按照常规方法插入已经插入了来源于小鼠抗体的前导序列和包含序列号6的氨基酸序列的人IgG1的H链恒定区的pcDNA4/myc-His(Invitrogen社制)载体中。另外，将包含抗CAPRIN-1抗体#1的轻链可变区的基因扩增片段的两端进行限制酶处理后纯化，按照常规方法插入已经插入了来源于小鼠抗体的前导序列和包含序列号7的氨基酸序列的人IgG1的L链恒定区的pcDNA3.1/myc-His(Invitrogen社制)载体中。
[0194] 接着，将插入了上述的抗CAPRIN-1抗体#1的重链可变区的上述重组载体、和插入了轻链可变区的上述重组载体导入到CHO-K1细胞(从理研セルバンク获得)中。具体地，将在12孔培养板的每1孔中用1ml含有10％FBS的Ham’sF12培养基(Invitrogen社制)培养而得的2×105个CHO-K1细胞用PBS(-)洗涤后，以每1孔1ml的量重新加入含有10％FBS的Ham’sF12培养基，在加入后的孔中添加将溶解在30μl的OptiMEM(Invitrogen社制)中的上述各载体250ng与Polyfect transfection reagent(QIAGEN社制)30μl混合而成的混合物。将导入了上述重组载体的CHO-K1细胞在添加了200μg/ml Zeocin(Invitrogen社制)和200μg/mlGeneticin(ロシュ社制)的含有10％FBS的Ham’sF12培养基中培养后，向96孔板中以每孔0.5个的方式接种导入了上述重组载体的CHO-K1细胞，从而制作稳定地产生具有实施例2中所得的抗CAPRIN-1抗体#1的可变区的人-小鼠嵌合单克隆抗体#1的细胞株。
[0195] 将制作的细胞株，使用150cm2烧瓶以5×105个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基(Invitrogen社制)30ml培养5天，得到包含人-小鼠嵌合单克隆抗体#1的培养上清。
[0196] 另外，作为比较抗体，对于WO2010/016526中记载的作为来源于小鼠的抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号26的重链可变区和序列号27的轻链可变区的比较抗体1、具有序列号28的重链可变区和序列号29的轻链可变区的比较抗体2、具有序列号30的重链可变区和序列号31的轻链可变区的比较抗体3、具有序列号32的重链可变区和序列号33的轻链可变区的比较抗体4、具有序列号34的重链可变区和序列号35的轻链可变区的比较抗体5、具有序列号36的重链可变区和序列号37的轻链可变区的比较抗体6、具有序列号38的重链可变区和序列号39的轻链可变区的比较抗体7、具有序列号40的重链可变区和序列号41的轻链可变区的比较抗体8、具有序列号42的重链可变区和序列号43的轻链可变区的比较抗体9、具有序列号44的重链可变区和序列号45的轻链可变区的比较抗体10、具有序列号46的重链可变区和序列号47的轻链可变区的比较抗体11、WO2011/096517中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号43的重链可变区和序列号47的轻链可变区的比较抗体12、具有序列号43的重链可变区和序列号的轻链可变区的比较抗体13、WO2011/096528中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号43的重链可变区和序列号47的轻链可变区的比较抗体14、具有序列号51的重链可变区和序列号
55的轻链可变区的比较抗体15、具有序列号59的重链可变区和序列号63的轻链可变区的比较抗体16、具有序列号76的重链可变区和序列号80的轻链可变区的比较抗体17、具有序列号84的重链可变区和序列号88的轻链可变区的比较抗体18、具有序列号92的重链可变区和序列号96的轻链可变区的比较抗体19、WO2011/096519中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号42的重链可变区和序列号46的轻链可变区的比较抗体20、WO2011/096533中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有序列号43的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体21、具有序列号47的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体22、具有序列号63的重链可变区和序列号67的轻链可变区的比较抗体23、WO2011/
096534中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号43的重链可变区和序列号47的轻链可变区的比较抗体24、具有序列号43的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体25、具有序列号63的重链可变区和序列号67的轻链可变区的比较抗体26，也与上述同样地制作分别稳定地产生作为比较样品的人-小鼠嵌合比较抗体1～26的细胞
2 5
株，将制作的细胞株使用150cm 烧瓶以5×10 个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基
(Invitrogen社制)30ml培养5天，得到包含人-小鼠嵌合比较单克隆抗体1～26的培养上清。
55的轻链可变区的比较抗体15、具有序列号59的重链可变区和序列号63的轻链可变区的比较抗体16、具有序列号76的重链可变区和序列号80的轻链可变区的比较抗体17、具有序列号84的重链可变区和序列号88的轻链可变区的比较抗体18、具有序列号92的重链可变区和序列号96的轻链可变区的比较抗体19、WO2011/096519中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号42的重链可变区和序列号46的轻链可变区的比较抗体20、WO2011/096533中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有序列号43的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体21、具有序列号47的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体22、具有序列号63的重链可变区和序列号67的轻链可变区的比较抗体23、WO2011/
096534中记载的作为抗CAPRIN-1单克隆抗体的具有同一文献中的序列号43的重链可变区和序列号47的轻链可变区的比较抗体24、具有序列号43的重链可变区和序列号51的轻链可变区的比较抗体25、具有序列号63的重链可变区和序列号67的轻链可变区的比较抗体26，也与上述同样地制作分别稳定地产生作为比较样品的人-小鼠嵌合比较抗体1～26的细胞
2 5
株，将制作的细胞株使用150cm 烧瓶以5×10 个/ml使用不含血清的OptiCHO培养基
(Invitrogen社制)30ml培养5天，得到包含人-小鼠嵌合比较单克隆抗体1～26的培养上清。
[0197] 实施例6使用了抗CAPRIN-1单克隆的各种癌细胞表面的CAPRIN-1的表达
[0198] 接着对于确认了CAPRIN-1基因的表达的人乳癌细胞株8种(ZR75-1、MCF7、T47D、SK-BR-3、MDA-MB-157、BT-20、MDA-MB-231V、MRK-nu-1)、肾癌细胞株2种(Caki-1、Caki-2)、膀胱癌细胞株(T24)、卵巢癌细胞株(SKOV3)、肺癌细胞株2种(QG56、A549)、前列腺癌细胞株(PC3)、宫颈癌细胞株(SW756)、纤维肉瘤细胞株(HT1080)、脑瘤细胞株2种(T98G、U87MG)、胃癌细胞株(MKN28)、大肠癌细胞株3种(Lovo、DLD-1、HCT-116)、胰癌细胞株4种(Capan-2、MIAPaCa-2、Panc-1、BxPC-3)，
[0199] 使用包含实施例2所得的抗CAPRIN-1抗体#1的培养上清，检查各细胞的细胞表面上的CAPRIN-1蛋白质的表达。在1.5ml容量的微量离心管中离心分离各细胞株各106细胞。添加包含上述抗体的各细胞培养上清(100μl)，在冰上静置1小时。用PBS洗涤后，添加用包含0.1％FBS的PBS稀释后的FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体(Jackson ImmunoResearch社制)，在4℃静置30分钟。用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度。阴性对照使用仅与二抗反应了的物质。其结果是，抗CAPRIN-1抗体#1显示与阴性对照相比荧光强度强30％以上的反应性。由此确认，CAPRIN-1蛋白质在上述人癌细胞株的细胞膜表面上表达。此外，上述荧光强度的增强率用各细胞中的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下的计算式算出。
[0200] 平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)-(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。
[0201] 实施例7针对来源于CAPRIN-1的肽(序列号5)的抗体对癌细胞的抗肿瘤活性
[0202] 为了评价针对序列号5所示的来源于CAPRIN-1的肽的抗体对表达CAPRIN-1的癌细胞的细胞毒性的强度，测定ADCC活性。使用实施例3中制备的针对序列号5所示的肽的多克隆抗体进行评价。作为比较的抗体，使用针对其他来源于人CAPRIN-1的肽的多克隆抗体(实施例3中制备的、针对人CAPRIN-1的序列号2的氨基酸序列中的氨基酸残基号50-98的多克隆抗体和针对氨基酸残基号233-305的多克隆抗体)，作为阴性对照，使用实施例3中制备的来源于兔血清的对照抗体同样地进行评价。
[0203] 将106个确认了CAPRIN-1的表达的人乳癌细胞株MDA-MB-231V、人大肠癌细胞株DLD-1、人胰癌细胞株Capan-2、人肺癌细胞株QG56收集在50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤3次，在96孔V底板的每1孔中分别添加2×103个。在其中添加针对上述序列号5所示的来源于人CAPRIN-1的肽的多克隆抗体和上述的针对其他来源于人CAPRIN-1的肽的多克隆抗体2种(针对人CAPRIN-1的序列号2的氨基酸残基号50-98的多克隆抗体和针对氨基酸残基号233-305的多克隆抗体)各1μg，进一步分别添加从人和兔的末梢血按照常规方法分离出的淋巴细胞各4×105个，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的癌细胞中释放的培养上清中的铬(Cr)51的量，计算出针对各来源于人CAPRIN-1的肽的多克隆抗体对癌细胞的ADCC活性。其结果是，在免疫具有人CAPRIN-1的序列号2的氨基酸残基号50-98和氨基酸残基号233-305的氨基酸序列的人CAPRIN-1部分肽而得的多克隆抗体的情况下，任一抗体在人乳癌细胞株MDA-MB-231V、人大肠癌细胞株DLD-1、人胰癌细胞株Capan-2、人肺癌细胞株QG56中的活性均分别小于8％，与此相对，添加了针对序列号5所示的来源于人CAPRIN-1的肽的多克隆抗体的组，对任一癌细胞株均确认了27％以上的细胞毒活性。阴性对照的抗体对任一癌细胞均为小于5％的活性。因此，弄清楚了针对序列号5所示的CAPRIN-1的抗体对表达CAPRIN-1的癌细胞发挥强的细胞毒活性。
[0204] 此外，细胞毒活性如上所述，是显示将本发明中使用的针对CAPRIN-1的抗体、淋巴细胞和摄入了铬51的2×103个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出的对癌细胞株的细胞毒活性的结果。
[0205] *式：细胞毒活性(％)＝从加入了针对CAPRIN-1的抗体和淋巴细胞时的靶细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的靶细胞游离的铬51游离量×100。
[0206] 评价实施例5中得到的人-小鼠嵌合单克隆抗体对人癌细胞的细胞毒活性。将产生上述抗体的各细胞培养上清使用Hitrap ProteinA SepharoseFF(GEヘルスケア社制)进行纯化，置换成PBS(-)并用0.22μm的过滤器(ミリポア社制)过滤，使用所得物质作为活性测定用的抗体。将106个乳癌细胞株MDA-MB-231V、人大肠癌细胞株DLD-1、人胰癌细胞株Capan-2、人肺癌细胞株QG56收集在50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51在37℃孵育2小时。然后用含10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，在96孔V底板的每1孔中添加各2×103个，作为靶细胞。在其中添加上述纯化抗体人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#1和实施例5中得到的人-小鼠嵌合比较单克隆抗体1～26各0.75μg，进一步从按照常规方法制备的人末梢血淋巴细胞中使用常规方法分离包含人NK细胞的细胞群。包含人NK细胞的细胞群使用以下细胞群：
将使用末梢血单核细胞分离用的比重分离液Histopaque(シグマアルドリッチ社)分离的人末梢血单核细胞，与用FITC荧光色素标记的抗体(抗人CD3抗体、抗人CD20抗体、抗人CD19抗体、抗人CD11c抗体、抗HLA-DR抗体(ベクトンアンドディッキンソン社))反应，使用细胞分选仪(FACS Vantage SE(ベクトンアンドディッキンソン社))分离包含不被上述抗体染色的NK细胞的细胞群而得的细胞群；或使用人NK细胞分离试剂盒(ミルテニー社制)分离而得的细胞群。将分离的包含NK细胞的细胞在每1孔中添加2×105个，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞中释放的培养上清中的铬51的量，计算出抗CAPRIN-1抗体对癌细胞的细胞毒活性。阴性对照使用添加了同种型对照抗体的物质。其结果是，使用了同种型对照抗体的情况的细胞毒活性，对任一癌细胞均小于5％，使用了人-小鼠嵌合比较单克隆抗体1～26的情况的细胞毒活性，对MDA-MB-231V小于5％，对DLD-1小于
8％，对Capan-2小于10％，对QG56小于10％，与此相对，人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对MDA-MB-231V为12％以上，对DLD-1为22％以上，对Capan-2为28％以上，对QG56为21％以上。
同样地，确认了对于其他癌细胞、乳癌细胞株T47D、Hs578T、BT-20、SK-BR-3、MCF7、MRK-nu-
1、神经胶质瘤细胞株T98G、肺癌细胞株A549、肾癌细胞株Caki-1、宫颈癌细胞株SW756、膀胱癌细胞株T24、胃癌细胞株MKN28大肠癌细胞株SW480、白血病细胞株AML5和淋巴瘤细胞株Ramos，使用了同种型对照抗体的情况和使用了比较抗体1～比较抗体26的情况均小于4％，与此相对，人-小鼠嵌合单克隆抗体的情况细胞毒活性为10％以上。由以上的结果显示，针对序列号5所示的来源于CAPRIN-1的肽的抗体通过ADCC活性而毒害表达CAPRIN-1的癌细胞，弄清楚了与比较抗体1～26相比，人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对人癌细胞显示强的细胞毒活性。
将使用末梢血单核细胞分离用的比重分离液Histopaque(シグマアルドリッチ社)分离的人末梢血单核细胞，与用FITC荧光色素标记的抗体(抗人CD3抗体、抗人CD20抗体、抗人CD19抗体、抗人CD11c抗体、抗HLA-DR抗体(ベクトンアンドディッキンソン社))反应，使用细胞分选仪(FACS Vantage SE(ベクトンアンドディッキンソン社))分离包含不被上述抗体染色的NK细胞的细胞群而得的细胞群；或使用人NK细胞分离试剂盒(ミルテニー社制)分离而得的细胞群。将分离的包含NK细胞的细胞在每1孔中添加2×105个，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到毒害的肿瘤细胞中释放的培养上清中的铬51的量，计算出抗CAPRIN-1抗体对癌细胞的细胞毒活性。阴性对照使用添加了同种型对照抗体的物质。其结果是，使用了同种型对照抗体的情况的细胞毒活性，对任一癌细胞均小于5％，使用了人-小鼠嵌合比较单克隆抗体1～26的情况的细胞毒活性，对MDA-MB-231V小于5％，对DLD-1小于
8％，对Capan-2小于10％，对QG56小于10％，与此相对，人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对MDA-MB-231V为12％以上，对DLD-1为22％以上，对Capan-2为28％以上，对QG56为21％以上。
同样地，确认了对于其他癌细胞、乳癌细胞株T47D、Hs578T、BT-20、SK-BR-3、MCF7、MRK-nu-
1、神经胶质瘤细胞株T98G、肺癌细胞株A549、肾癌细胞株Caki-1、宫颈癌细胞株SW756、膀胱癌细胞株T24、胃癌细胞株MKN28大肠癌细胞株SW480、白血病细胞株AML5和淋巴瘤细胞株Ramos，使用了同种型对照抗体的情况和使用了比较抗体1～比较抗体26的情况均小于4％，与此相对，人-小鼠嵌合单克隆抗体的情况细胞毒活性为10％以上。由以上的结果显示，针对序列号5所示的来源于CAPRIN-1的肽的抗体通过ADCC活性而毒害表达CAPRIN-1的癌细胞，弄清楚了与比较抗体1～26相比，人-小鼠嵌合抗CAPRIN-1抗体#1对人癌细胞显示强的细胞毒活性。
[0207] 此外，细胞毒活性如上所述，是显示将本发明中使用的针对CAPRIN-1的抗体、淋巴3
细胞(包含NK细胞的细胞群)和摄入了铬51的2×10 个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出的对癌细胞株的细胞毒活性的结果。
细胞(包含NK细胞的细胞群)和摄入了铬51的2×10 个各癌细胞株混合并培养4小时，测定培养后释放到培养基中的铬51的量，通过以下计算式*算出的对癌细胞株的细胞毒活性的结果。
[0208] *式：细胞毒活性(％)＝从加入了针对CAPRIN-1的抗体和淋巴细胞(包含NK细胞的细胞群)时的靶细胞游离的铬51游离量÷从加入了1N盐酸的靶细胞游离的铬51游离量×100。
[0209] 实施例8由抗CAPRIN-1抗体#1所识别的各种癌细胞表面的CAPRIN-1的分子数
[0210] 对于人乳癌细胞株(MDA-MB-231V)、肾癌细胞株(Caki-1)、膀胱癌细胞株(T24)、卵巢癌细胞株(SKOV3)、肺癌细胞株(QG56、A549)、胰癌细胞株(Capan-2)、前列腺癌细胞株(PC3)、宫颈癌细胞株(SW756)、纤维肉瘤细胞株(HT1080)、脑瘤细胞株(T98G)、胃癌细胞株(MKN28)、大肠癌细胞株(Lovo、DLD-1)、白血病细胞株(AML5)、淋巴瘤细胞株(Ramos)，使用分子数测定试剂盒“QIFIKIT”(DAKO社制)检查由抗CAPRIN-1抗体#1所识别的各种癌细胞表面的CAPRIN-1分子的数。同样地，对于实施例5所制作的抗CAPRIN-1单克隆抗体的比较单克隆抗体1～26，也检查各种癌细胞表面的CAPRIN-1分子的数。
[0211] 按照附带方案，对各细胞株，将抗CAPRIN-1抗体#1和比较抗体1～比较抗体26用PBS稀释至最终浓度5μg/ml，添加到各细胞株中使其反应30分钟。用PBS洗涤后，与试剂盒附带的标准曲线珠一起向各细胞株添加试剂盒所附带的经荧光标记的二抗即抗小鼠IgG抗体，在冰上静置45分钟。将各细胞株和标准曲线珠用PBS洗涤后，用ベクトンディッキンソン株式会社的FACSCalibur测定荧光强度，得到平均荧光强度值(mean)。另外，对于比较抗体也进行同样的测定，得到mean。阴性对照使用与同种型对照抗体反应而得的物质，得到mean。使用各平均荧光强度值(mean)按照试剂盒所附带的方法计算出分子数。其结果是，由抗CAPRIN-1单克隆抗体以及比较抗体12～26所识别的各种癌细胞表面的CAPRIN-1的分子数，在调查的全部人癌细胞中，为每1个细胞105个以上。另一方面，对于比较抗体1～11，每1个细胞1个少于105个。
[0212] 产业可利用性
[0213] 本发明的抗体对于癌的治疗和/或预防是有用的。
[0214] 将本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。
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