抗APOB反义缀合物化合物
阅读：36发布：2020-05-18
专利汇可以提供抗APOB反义缀合物化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及靶向ApoB的LNA反义寡核苷酸(寡聚物)的缀合物。，下面是抗APOB反义缀合物化合物专利的具体信息内容。
1.一种反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物包含LNA寡聚物的第一区域(区域A，如LNA间隔聚体寡聚物)，所述第一区域靶向ApoB核酸、与另一个区域(区域C)共价连接，所述另一个区域包含选自由靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物和亲脂性缀合物组成的组的缀合物部分，其中所述亲脂性缀合物以及任选地所述靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物经由生物可切割接头与所述LNA寡聚物连接。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分(C)包含固醇，如胆固醇或生育酚，如Conj 5或Conj 6。
3.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分(C)包含GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)部分，如三价GalNac部分。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述生物可切割接头包含肽或多肽，如赖氨酸接头、或生理学上不稳定的核苷酸接头。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述LNA寡聚物经由一个或多个磷酸酯连接的核苷，如DNA或RNA核苷的区域(区域B)，如磷酸二酯核苷酸接头，与所述缀合物部分共价连接。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的反义寡聚物缀合物，其中所述LNA寡聚物经由
1-6个磷酸酯连接的DNA核苷的区域B(区域B)与所述缀合物部分共价连接。
7.根据权利要求6所述的反义寡聚物缀合物，其中区域B(磷酸二酯核苷酸连接)包含
1、2或3个连续DNA磷酸二酯核苷酸，如两个连续DNA磷酸二酯核苷酸，如5’CA 3’二核苷酸。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的反义寡聚物，其中所述LNA寡聚物和区域B形成连续核苷酸序列，其中区域A与所述ApoB靶标的相应区域互补，并且区域B可以与或者可以与或者可以不与所述ApoB靶标的所述相应区域互补。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分还包含将所述缀合物部分与所述LNA寡聚物或与所述一个或多个磷酸酯连接的DNA或RNA核苷酸的区域(区域B)共价连接的接头(Y)。
10.根据权利要求9所述的反义寡聚物缀合物，其中所述接头区域Y包含脂肪酸，如C6接头。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述缀合物部分包含选自由以下组成的组的三价GalNac部分：Conj1、Conj2、Conj3、Conj4、Conj1a、Conj2a、Conj3a和Conj4a。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，其中所述LNA寡聚物包含选自由以下组成的组的连续核苷酸序列：SEQ ID No 1或SEQ ID No 2：
SEQ ID NO 1(3833)GCattggtatTCA
SEQ ID NO 2(4955)GTtgacactgTC
其中大写字母表示LNA核苷，如β-D-氧基LNA，小写字母表示DNA核苷，LNA胞嘧啶任选为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间连接是硫代磷酸酯。
13.根据权利要求12所述的反义寡核苷酸缀合物，所述反义寡核苷酸缀合物选自由SEQ ID NO 7、20、28或30组成的组。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含：根据权利要求1-13中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物，以及药用稀释剂、载体、盐或辅剂。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物，所述反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用作药物，如用于治疗：急性冠状动脉综合征或高胆固醇血症或相关病症，如选自由以下组成的组的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，异常脂血症，例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、耐他汀类的高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)、和冠心病(CHD)。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗：急性冠状动脉综合征或高胆固醇血症或相关病症，如选自由以下组成的组的病症：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，异常脂血症，例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、耐他汀类的高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)、和冠心病(CHD)。
17.一种治疗急性冠状动脉综合征或高胆固醇血症或相关病症如选自由以下组成的组的病症的方法：动脉粥样硬化，高脂血症，高胆固醇血症，HDL/LDL胆固醇失衡，异常脂血症，例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症、耐他汀类的高胆固醇血症、冠状动脉疾病(CAD)、和冠心病(CHD)，所述方法包括向罹患或可能罹患高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据权利要求1-14中任一项所述的反义寡核苷酸缀合物或药物组合物。
18.一种用于在表达ApoB的细胞中抑制ApoB的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用根据权利要求1-14中任一项所述的寡聚物或缀合物或药物组合物，从而抑制所述细胞中的ApoB。
抗APOB反义缀合物化合物
发明领域
[0001] 本发明涉及靶向ApoB的LNA反义寡核苷酸(寡聚物)的缀合物。
[0002] 相关案件
[0003] 本申请要求EP12192773.5、EP13153296.2、EP13157237.2和EP13174092.0的优先权，这些申请通过引用结合于此。
背景技术
[0004] 参见WO2007/031081、WO2008/113830、WO2010142805、和WO2010076248的背景部分，其通过引用结合于此。SPC3833和SPC4955(其具有SEQ ID NO 1和2)是之前已经被确定为靶向人ApoB mRNA的强效化合物的两种LNA化合物。
[0005] WO2007/146511报道了比较长化合物明显更强效并且更低毒性的短双环(LNA)间隔聚体(gapmer)反义寡核苷酸。所例示出的化合物似乎长度为14nts。
[0006] 根据van Poelgeest等人(American Journal of Kidney Disease(美国肾病期刊),2013Oct；62(4):796-800)，在人临床试验中LNA反义寡核苷酸SPC5001的施用可能会造成急性肾脏损伤。
[0007] 根据EP 1 984 381B1、Seth等 人Nucleic Acids Symposium Series(核 酸学术讨论会丛刊)2008No.52 553-554和Swayze等人Nucleic Acid Research(核酸研究)2007,vol 35,pp687-700，LNA寡核苷酸引起动物中明显的肝毒性。根据
WO2007/146511，可以通过使用短至长度为12-14个核苷酸的LNA间隔聚体避免LNA寡核苷酸的毒性。EP 1 984 381B1建议使用6’取代的双环核苷酸降低LNA寡核苷酸的肝毒性可能性。根据Hagedorn等人Nucleic Acid Therapeutics(核酸治疗)2013，可以根据它们的序列和修饰模式预测反义寡核苷酸的肝毒性可能性。
WO2007/146511，可以通过使用短至长度为12-14个核苷酸的LNA间隔聚体避免LNA寡核苷酸的毒性。EP 1 984 381B1建议使用6’取代的双环核苷酸降低LNA寡核苷酸的肝毒性可能性。根据Hagedorn等人Nucleic Acid Therapeutics(核酸治疗)2013，可以根据它们的序列和修饰模式预测反义寡核苷酸的肝毒性可能性。
[0008] 已经广泛评价寡核苷酸缀合物用于siRNA，其中认为它们是必需的以获得足够的体内效力。例如，参见WO2004/044141涉及通过RNA干扰途径调节基因表达的修饰的寡聚化合物。所述寡聚化合物包括一个或多个可以改变或增强所连接的寡聚化合物的药代动力学和药效学性质的缀合物部分。
[0009] WO2012/083046报道了用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分。
[0010] 相比之下，在治疗上通常施用单链反义寡核苷酸而不用缀合或配制。反义寡核苷酸的主要靶标组织是肝脏和肾脏，然而通过反义形式许多其他组织也可进入的，包括淋巴结、脾、骨髓。
[0011] WO 2005/086775涉及利用治疗性化学部分、可切割接头和标记区域的治疗剂向特定器官的靶向递送。可切割接头可以是，例如，二硫基、肽或限制性酶可切割的寡核苷酸区域。
[0012] WO 2011/126937涉及寡核苷酸通过与小分子配体缀合的靶向细胞内递送。
[0013] WO2009/025669涉及含有二硫吡啶部分的聚合物(聚乙二醇)接头。还参见Zhao等人，Bioconjugate Chem.2005 16 758-766。
[0014] Chaltin等人，Bioconjugate Chem.2005 16 827-836报道了用于将反义寡核苷酸结合至阳离子脂质体中以制备树枝状聚合物递送系统的胆固醇修饰的单体、二聚体和四聚体寡核苷酸。胆固醇经由赖氨酸接头与寡核苷酸缀合。
[0015] 其他不可切割胆固醇缀合物已经用于将siRNA和antagomir靶向至肝脏，参见，例如，Soutscheck等人Nature 2004vol.432 173-178和Krützfeldt等人Nature 2005vol438,685-689。对于部分硫代磷酸酯化的siRNA和antagomir来说，发现使用胆固醇作为靶向肝脏的实体对于体内活性是必需的。
[0017] 发明概述
[0018] 本发明提供一种反义寡核苷酸缀合物(本发明的化合物)，所述反义寡核苷酸缀合物包含寡聚物的第一区域(区域A，如LNA寡聚物，间隔聚体寡聚物或LNA间隔聚体寡聚物)，所述第一区域靶向ApoB核酸、与另一个区域(区域C)共价连接，所述另一个区域包含选自由靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物和亲脂性缀合物组成的组的缀合物部分，其中所述亲脂性缀合物以及任选地所述靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物经由生物可切割接头与所述LNA寡聚物连接。
[0019] 本发明提供一种缀合物，所述缀合物包含靶向ApoB核酸的LNA反义寡聚物(本发明的化合物)(A)和至少一个与所述寡聚物(A)共价连接的非核苷酸或非多核苷酸部分(C)，其中所述非多核苷酸部分选自由靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物和亲脂性缀合物组成的组，其中所述亲脂性缀合物以及任选地所述靶向脱唾液酸糖蛋白受体的缀合物经由生物可切割接头(区域B)与LNA反义寡聚物共价连接。
[0020] 在一些实施方案中，本发明提供一种寡聚化合物(本发明的化合物)，其靶向ApoB核酸靶标，其包含三个区域：
[0021] i)第一区域(区域A)，其包含7-26个与ApoB核酸靶标互补的连续核苷酸；
[0022] ii)第二区域(区域B)，其包含1-10个之间的核苷酸，其与第一区域的5’或3’核苷酸共价连接，如经由核苷间连接基团，如磷酸二酯连接，其中
[0023] a.第一和第二区域之间的核苷间是磷酸二酯连接并且与第一区域相邻[如直接相邻]的第二区域的核苷是DNA或RNA；和/或
[0024] b.第二区域的至少1个核苷是磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷；
[0025] iii)第三区域(C)，其包含缀合物部分、靶向部分、反应性基团、活化基团、或阻断部分，其中第三区域与第二区域共价连接。
[0026] 在一些实施方案中，区域A和区域B形成长度为8-35个核苷酸的单个连续核苷酸序列。
[0027] 在一些方面中，第一和第二区域之间的核苷间连接可以被认为是第二区域的一部分。
[0028] 在一些实施方案中，在第二和第三区域之间存在含磷连接基团。该磷连接基团可以是，例如，磷酸酯(磷酸二酯)基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基、硼代磷酸酯基。
[0029] 在一些实施方案中，这种含磷连接基团位于第二区域和与第三区域连接的接头区域之间。在一些实施方案中，磷酸酯基是磷酸二酯。
[0030] 因此，在一些方面中，寡聚化合物包含至少两个磷酸二酯基，其中至少一个正如根据以上本发明陈述的，并且另一个位于第二和第三区域之间，任选地在接头基团和第二区域之间。
[0031] 在一些实施方案中，第三区域是活化基团，如在缀合中使用的活化基团。就此而言，本发明还提供一种活化寡聚物，所述活化寡聚物包含区域A和B以及活化基团，例如适用于随后与第三区域连接，如适用于缀合的中间体。
[0032] 在一些实施方案中，第三区域是反应性基团，如在缀合中使用的反应性基团。就此而言，本发明还提供一种寡聚物，所述活化寡聚物包含区域A和B以及反应性基团，例如适用于随后与第三区域连接，如适用于缀合的中间体。在一些实施方案中，反应性基团可以包含胺基或醇基，如胺基。
[0033] 在一些实施方案中，区域A包含至少一个，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24个不同于磷酸二酯的核苷间连接，如(任选地、独立地)选自由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和硼代磷酸酯组成的组的核苷间连接、以及甲基膦酸酯，如硫代磷酸酯。在一些实施方案中，区域A包含至少一个硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，区域A内的至少50％，如至少75％，如至少90％的核苷间连接，如所有核苷间连接是不同于磷酸二酯，例如是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，区域A中的所有核苷间连接是不同于磷酸二酯。
[0034] 在一些实施方案中，寡聚化合物包含反义寡核苷酸，如反义寡核苷酸缀合物。反义寡核苷酸可以是或者可以包含第一区域，以及任选地第二区域。就此而言，在一些实施方案中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核碱基序列的一部分。在其它实施方案中，区域B可以缺少与靶标的互补性。
[0035] 换言之，在一些实施方案中，本发明提供一种非磷酸二酯连接的，如硫代磷酸酯连接的寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)，其具有至少一个经由磷酸二酯连接与寡核苷酸的相邻核苷连接的末端(5’和/或3’)DNA或RNA核苷，其中所述末端DNA或RNA核苷任选经由接头部分与缀合物部分、靶向部分或阻断部分进一步共价连接。
[0036] 本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的化合物，以及药用稀释剂、载体、盐或辅剂。
[0037] 本发明提供用作药物的本发明的化合物或药物组合物，所述药物如用于治疗：急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)或高胆固醇血症(hypercholesterolemia)或相关病症，如选自由以下组成的组的病症：动脉粥样硬化(atherosclerosis)，高脂血症(hyperlipidemia)，高胆固醇血症(hypercholesterolemia)，HDL/LDL胆固醇失衡(cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症(acquired hyperlipidemia)、耐他汀类的高胆固醇血症(statin-resistant hypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)。
[0038] 本发明提供本发明的化合物或药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗：急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)或高胆固醇
血症(hypercholesterolemia)或相关病症，如选自由以下组成的组的病症：动
脉 粥 样 硬 化(atherosclerosis)，高 脂 血 症 (hyperlipidemia)，高 胆 固 醇 血症 (hypercholesterolemia)，HDL/LDL 胆 固 醇 失 衡 (cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例 如家族性高脂 血症(FCHL)、获得性高脂 血
症(acquired hyperlipidemia)、耐他 汀 类 的 高胆 固 醇 血症 (statin-resistant hypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)。
血症(hypercholesterolemia)或相关病症，如选自由以下组成的组的病症：动
脉 粥 样 硬 化(atherosclerosis)，高 脂 血 症 (hyperlipidemia)，高 胆 固 醇 血症 (hypercholesterolemia)，HDL/LDL 胆 固 醇 失 衡 (cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例 如家族性高脂 血症(FCHL)、获得性高脂 血
症(acquired hyperlipidemia)、耐他 汀 类 的 高胆 固 醇 血症 (statin-resistant hypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)。
[0039] 本发明提供一种治疗急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome)或高胆固醇血症(hypercholesterolemia)或相关病症，如选自由以下组成的组的病
症的方法：动脉粥样硬化(atherosclerosis)，高脂血症(hyperlipidemia)，高胆固醇血 症(hypercholesterolemia)，HDL/LDL胆 固醇 失衡 (cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例 如家族性高脂 血症(FCHL)、获得性高脂 血
症(acquired hyperlipidemia)、耐他 汀 类 的 高胆 固 醇 血症 (statin-resistant hypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)，所述方法包括向罹患或可能罹患高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据本发明的化合物或药物组合物。
症的方法：动脉粥样硬化(atherosclerosis)，高脂血症(hyperlipidemia)，高胆固醇血 症(hypercholesterolemia)，HDL/LDL胆 固醇 失衡 (cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例 如家族性高脂 血症(FCHL)、获得性高脂 血
症(acquired hyperlipidemia)、耐他 汀 类 的 高胆 固 醇 血症 (statin-resistant hypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)，所述方法包括向罹患或可能罹患高胆固醇血症或相关病症的患者施用有效量的根据本发明的化合物或药物组合物。
[0040] 本发明提供一种用于在表达ApoB的细胞中抑制ApoB的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用本发明的化合物，从而抑制所述细胞中的ApoB。
[0041] 本发明提供在药品(medicine)中使用的本发明的化合物，如用作药物(medicament)的本发明的化合物。
[0042] 本发明还提供一种LNA寡聚物，所述LNA寡聚物包含与ApoB核酸靶标的相应区域互补的12-24个硫代磷酸酯连接的核苷的连续区域，并且还包含与所述LNA寡聚物相连的1至6个之间的DNA核苷，其中DNA之间的和/或与一个或多个DNA核苷相邻的核苷间连接是生理学上不稳定的，如是磷酸二酯连接。这种LNA寡聚物可以是如在本文中所描述的缀合物形式的，或者可以是，例如将要在随后的缀合步骤中使用的中间体。当缀合时，例如，缀合物可以是或包含固醇，如胆固醇或生育酚，或者可以是或包含(非核苷酸)碳水化合物，如GalNac缀合物，如GalNac簇，例如triGalNac，或如在本文中所描述的另一种缀合物。
[0043] 本发明提供一种LNA反义寡聚物(其在本文中可以被称为区域A)，所述LNA反义寡聚物包含含有与ApoB核酸靶标的相应区域互补的12-24个硫代磷酸酯连接的核苷的连续区域的反义寡聚物，以及靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分缀合物部分，如GalNAc部分，其可以形成另一个区域(被称为区域C)的一部分。LNA反义寡聚物可以是12-24个，并且可以是间隔聚体寡聚物形式的。
[0045] 图1：与活化基团(即作为第三区域的受保护的反应性基团)连接的本发明的寡聚物的非限制性说明。核苷间连接L可以是，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，如磷酸二酯。PO是磷酸二酯连接。化合物a)具有含有单个DNA或RNA的区域B，第二和第一区域之间的连接是PO。化合物b)具有通过磷酸二酯连接而连接的两个DNA/RNA(如DNA)核苷。化合物c)具有通过磷酸二酯连接而连接的三个DNA/RNA(如DNA)核苷。在一些实施方案中，区域B可以通过额外的磷酸二酯DNA/RNA(如DNA核苷)进一步伸长。活化基团在每个化合物的左侧示出，并且可以任选地经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者在一些实施方案中三唑连接)与区域B的末端核苷连接。化合物d)、e)、&f)在区域B和活化基团之间还包含接头(Y)，并且区域Y可以经由例如磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者在一些实施方案中三唑连接)与区域B连接。
[0046] 图2：与图1中所示的等同的化合物，但是使用反应性基团代替活化基团。在一些实施方案中，反应性基团可以是活化基团的活化(例如去保护)的结果。在非限制性实例中，反应性基团可以是胺或醇。
[0047] 图3：本发明的化合物的非限制性说明。与图1相同的命名法。在一些实施方案中，X可以是缀合物，如亲脂性缀合物如胆固醇，或另一种缀合物如在本文中所描述的那些。此外，或者备选地，X可以是靶向基团或阻断基团。在一些方面中，X可以是活化基团(参见图1)，或反应性基团(参见图2)。X可以经由磷核苷连接基团，如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯与区域B连接，或者可以经由备选的连接，例如三唑连接而连接(参见化合物d)、e)、和f)中的L)。
[0048] 图4.本发明的化合物的非限制性说明，其中所述化合物在第三区域(X)和第二区域(区域B)之间包含任选的接头。与图1相同的命名法。适合的接头在本文中公开，并且包括，例如烷基接头，例如C6接头。在化合物A、B和C中，X和区域B之间的接头经由磷核苷连接基团，如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯与区域B连接，或者可以经由备选的连接例如三唑连接(Li)而连接。在这些化合物中，Lii表示第一(A)和第二区域(B)之间的核苷间连接。
[0049] 图5a和b.5b示出了本发明的化合物的合成方法的非限制性实例。US表示寡核苷酸合成载体，其可以是固体载体。X是第三区域，如缀合物、靶向基团、阻断基团等。在任选的预先步骤中，将X加入至寡核苷酸合成载体。否则，可以得到已经连接了X的载体(i)。在第一步中，合成区域B(ii)，接着是区域A(iii)，并且随后是本发明的寡聚化合物从寡核苷酸合成载体的切割(iv)。在备选的方法中，预先步骤包括提供连接了区域X和接头基团(Y)的寡核苷酸合成载体(参见图5a)。在一些实施方案中，X或Y(如果存在的话)经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。
[0050] 图6.在第三区域(X)和第二区域(B)之间包含接头(Y)的本发明的化合物的合成方法的非限制性实例。US表示寡核苷酸合成载体，其可以是固体载体。X是第三区域，如缀合物、靶向基团、阻断基团等。在任选的预先步骤中，将Y加入至寡核苷酸合成载体。否则，可以得到已经连接了Y的载体(i)。在第一步中，合成区域B(ii)，接着是区域A(iii)，并且随后是本发明的寡聚化合物从寡核苷酸合成载体的切割(iv)。在一些实施方案中(如示出的)，可以在切割步骤后将X加入至接头(Y)中(v)。在一些实施方案中，Y经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。
[0051] 图7.使用活化基团的本发明的化合物的合成方法的非限制性实例。在任选的预先步骤中，活化基团与寡核苷酸合成载体连接(i)，或者另外得到具有活化基团的寡核苷酸合成载体。在步骤ii)中，合成区域B，接着是区域A(iii)。之后将寡聚物从寡核苷酸合成载体上切割(iv)。之后可以将中间体寡聚物(包含活化基团)活化(vI)或(viii)，并且可以加入第三区域(X)(vi)，任选地经由接头(Y)(ix)加入。在一些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。
[0052] 图8.其中使用双官能寡核苷酸合成载体(i)的本发明的化合物的合成方法的非限制性实例。在这种方法中，在一系列初始步骤(ii)-(iii)中合成寡核苷酸，接着连接第三区域(任选地经由接头基团Y)，之后可以切割本发明的寡聚化合物(v)。备选地，如在步骤(vi)-(ix)中所示，第三区域(任选地具有接头基团(Y))与寡核苷酸合成载体连接(这可以是任选的预先步骤)，或者另外提供具有第三区域(任选地具有Y)的寡核苷酸合成载体，之后合成寡核苷酸(vii-viii)。之后可以切割本发明的寡聚化合物(ix)。在一些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。在一些实施方案中，在方法(如预先步骤)前，US可以包括加入允许寡核苷酸的独立合成和基团X、Y(或X和Y)与载体(如示出的)的共价连接的双向(双官能)基团的步骤，这可以是例如使用三唑或核苷基团获得的。之后可以从载体上切割连接了寡聚物的双向(双官能)基团。
[0053] 图9.本发明的化合物的合成方法的非限制性实例：在初始步骤中，合成第一区域(A)(ii)，接着是区域B。在一些实施方案中，之后将第三区域与区域B连接(iii)，任选地经由磷酸酯核苷连接(或例如三唑连接)。之后可以切割本发明的寡聚化合物(iv)。在一些实施方案中，当使用接头(Y)时，可以接着进行步骤(v)-(viii)：在区域B合成之后，加入接头基团(Y)，并且之后与(Y)连接或者在随后的步骤中，加入区域X(vi)。之后可以切割本发明的寡聚化合物(vii)。在一些实施方案中，X(或Y，当存在时)经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。
[0054] 图10.本发明的化合物的合成方法的非限制性实例：在这种方法中，使用活化基团：步骤(i)-(iii)同图9。然而，在寡核苷酸合成(步骤iii)之后，将活化基团(或反应性基团)加入至区域B中，任选地经由磷酸酯核苷连接。之后从载体(v)上切割寡核苷酸。可以随后将活化基团活化以制备反应性基团，并且之后将第三区域(X)，如缀合物、阻断基团或靶向基团加入至反应性基团(其可以是活化的活化基团或反应性基团)，以制备寡聚物(vi)。如在(vii)-(viii)中所示，在切割之后，加入接头基团(Y)(vii)，并且之后与(Y)连接或者在随后的步骤中，加入区域X以制备寡聚物(viii)。应认识到的是，在备选方案中，可以在寡核苷酸合成载体上进行全部步骤(ii)-(viii)，并且在这种实例中，可以进行从载体上切割寡聚物的最终步骤。在一些实施方案中，反应性基团或活化基团经由磷核苷连接基团(如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼代磷酸酯或甲基膦酸酯，或者备选的连接，如三唑连接)与区域B连接。
[0055] 图11.利用胆固醇-缀合物的ApoB mRNA体内沉默。用单一剂量的1mg/kg未缀合LNA-反义寡核苷酸(#3833)或等摩尔量的利用不同接头与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸(Tab.3)对小鼠进行注射，并且在给药之后1、3、7和10天处死。从肝脏和肾脏中分离RNA并且进行ApoB特异性RT-qPCR A。来自肝脏样品的ApoB mRNA的量化标准化至GAPDH并且以等效盐水对照B的平均值的百分数表示。来自肾脏样品的ApoB mRNA的量化标准化至GAPDH并且以等效盐水对照的平均值的百分数表示。
[0056] 图12.示出了可以用作本发明的化合物、以及实施例中使用的特异性化合物(包括本发明的特异性化合物)中的X-Y-的胆固醇C6缀合物。
[0057] 图13：可以使用的tri-GalNac缀合物的实例。缀合物1-4示出了适合的GalNac缀合物部分，并且缀合物1a-4a是指与用于将缀合物与寡聚物(区域A或与生物可切割接头如区域B连接)连接的额外接头部分(Y)相同的缀合物。波浪线表示与寡聚物共价连接。
[0058] 图14：胆固醇和生育酚缀合物部分的实例。波浪线表示与寡聚物共价连接。
[0059] 图15：利用不同缀合物的ApoB mRNA的体内沉默(参见实施例4)。用1mg/kg的具有不同缀合物(不具有生物可切割接头、具有二硫基接头(SS)或具有DNA/PO接头(PO))的ASO处理小鼠。从肝脏(A)和肾脏样品(B)中分离RNA并且分析ApoB mRNA敲减(knock down)。数据与盐水(＝1)比较显示。
[0060] 图16：实施例8-ApoB mRNA表达
[0061] 图17：实施例8-血清中的总胆固醇
[0062] 图18：实施例8-肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量
[0063] 发明详述
[0064] 在一些实施方案中，本发明涉及靶向ApoB核酸的寡聚化合物，如LNA反义寡核苷酸，其经由包含(例如1-10个)磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷的短区域与缀合物基团、靶向基团、反应性基团、活化基团、或阻断基团共价连接。
[0065] 寡聚物
[0066] 本发明上下文中的术语“寡聚物”是指通过两个以上核苷酸的共价连接形成的分子(即，寡核苷酸)。在本文中，单核苷酸(单元)也可以被称为单体或单元。在一些实施方案中，术语“核苷”、“核苷酸”、“单元”和“单体”可互换使用。应认识到的是，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基，如A、T、G、C或U的序列。
[0067] 本发明的寡聚物可以是LNA寡聚物，即包含至少一个LNA核苷单元，或间隔聚体，如LNA间隔聚体。
[0068] 本发明的寡聚物可以包含长度为10-22，如12-22之间的核苷酸。本发明的寡聚物可以包含10-20个与相应长度的ApoB核酸靶标(如NM_000384或genbank登录号：NG_011793、NM_000384.2GI：105990531和NG_011793.1GI：226442987，通过引用结合于此)互补如完全互补的核苷酸的连续序列。例如，10-20个核苷酸的连续序列可以通过硫代磷酸酯连接而连接。
[0069] 例如，本发明的寡聚物可以包含SEQ ID NO 1或SEQ ID No 2中所示的核碱基的序列。
[0070] 本发明的化合物(例如寡聚物或缀合物)靶向ApoB，并且因此能够抑制表达所述ApoB的细胞中的ApoB，如人ApoB。
[0071] 在一些实施方案中，连续序列的核苷间连接可以是硫代磷酸酯连接，并且可以包含亲和力增强的核苷酸类似物。
[0072] 在一些实施方案中，核苷酸类似物是糖修饰的核苷酸，如独立地或非独立地选自由以下组成的组的糖修饰的核苷酸：锁核酸(LNA或BNA)单元；2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、和2’-氟-DNA单元。
[0073] 在一些实施方案中，核苷酸类似物包含或是锁核酸(LNA，也被称为BNA)单元。
[0074] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物包含或者是间隔聚体，如LNA间隔聚体寡核苷酸。
[0075] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物包含13、14、15或16个与相应长度的ApoB核酸靶标互补的核苷酸的连续序列，并且可以任选地包含另外的1-10，例如1-6个核苷酸，其可以形成或包含生物可切割核苷酸区域，如磷酸酯核苷酸接头。适宜地，生物可切割核苷酸区域由小段(例如1、2、3、4、5或6个)生理学上不稳定的核苷酸形成。这可以通过与DNA/RNA核苷一起使用磷酸二酯连接而获得，或者如果可以维持生理学稳定性，可以使用其他核苷。
[0076] 因此本发明的寡聚物可以包含长度为10-20nt的与相应长度的ApoB核酸靶标互补的连续核苷酸序列(第一区域、或区域A)。本发明的寡聚物可以包含另一个核苷酸区域。在一些实施方案中，另一个核苷酸区域包含生物可切割核苷酸区域，如磷酸酯核苷酸序列(第二区域，区域B)，其可以将区域A共价连接至非核苷酸部分，如缀合物基团(第三区域，或区域C)。在一些实施方案中本发明的寡聚物的连续核苷酸序列(区域A)与区域C直接共价连接。在一些实施方案中，区域C是生物可切割的。
[0077] 寡聚物可以由长度为10-22，如13、14、15、16、17、18、19、20、21的核苷酸，如长度为13-16、或13或14、或15或16的核苷酸的连续核苷酸序列组成，或者包含它们。因此寡聚物可以是指区域A和区域B，例如(区域A 10-16nt)和区域B(1-6nt)的相加的长度。
[0078] 在多个实施方案中，本发明的化合物不包含RNA(单元)。在一些实施方案中，根据本发明的化合物、第一区域、或第一和第二区域一起(例如，作为单一连续序列)是直链分子或作为直链分子合成。因此寡聚物可以是单链分子。在一些实施方案中，寡聚物不包含，例如，与相同寡聚物内的等同区域互补的至少3、4或5个连续核苷酸的短区域(即，双链体)。在一些实施方案中，寡聚物可以不是(基本上)双链。在一些实施方案中，寡聚物基本上不是双链，如不是siRNA。
[0079] 靶标
[0080] 适宜地，本发明的寡聚物能够下调APO-B基因，如ApoB-100或ApoB-48(APOB)的表达。在这点上，本发明的寡聚物可以影响APOB的抑制，通常在哺乳动物如人细胞，如肝细胞中。在一些实施方案中，本发明的寡聚物与靶标核酸结合，并且与正常表达水平相比，产生至少10％或20％的表达的抑制，与正常表达水平相比，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制。在一些实施方案中，当使用0.04和25nM之间、如0.8和20nM之间的浓度的本发明的化合物时，可以看到这种调节。在相同或不同的实施方案中，表达的抑制小于100％，如小于98％抑制、小于95％抑制、小于90％抑制、小于80％抑制，如小于70％抑制。可以通过测量蛋白质水平来测定表达水平的调节，例如，通过以下方法如SDS-PAGE，接着使用针对靶标蛋白产生的适合的抗体进行蛋白质印迹。备选地，可以通过测量mRNA的水平来测定表达水平的调节，例如，通过RNA印迹或定量RT-PCR。当通过mRNA水平测量时，在一些实施方案中，使用适合剂量如0.04和25nM之间、如0.8和20nM之间的浓度时下调的水平，通常达到不存在本发明的化合物的正常水平的10-20％之间的水平。
[0081] 因此本发明提供下调或抑制表达APO-B蛋白和/或mRNA的细胞中APO-B蛋白和/或mRNA的表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用本发明的化合物以下调或抑制所述细胞中APO-B蛋白和/或mRNA的表达。适宜地，细胞是哺乳动物细胞如人细胞。在一些实施方案中，施用可以在体外进行。在一些实施方案中，施用可以在体内进行。
[0082] 如在本文中所使用的，术语“靶标核酸”是指编码哺乳动物APO-B多肽，如人APO-B100，如人APO-B100mRNA的DNA或RNA。编码APO-B100的核酸或其自然存在的变体、以及来源于其的RNA核酸，优选为mRNA，如前mRNA，然而优选成熟的mRNA。在一些实施方案中，例如当在研究或诊断中使用时，“靶标核酸”可以是来源于以上DNA或RNA核酸靶标的cDNA或合成寡核苷酸。根据本发明的寡聚物优选能够与靶标核酸杂交。应认识到的是，人APO-B mRNA是cDNA序列，并且因此对应于成熟的mRNA靶序列，然而在cDNA序列中尿嘧啶被胸苷代替。
[0083] 术语“其自然存在的变体”是指在定义的分类群，如哺乳动物，如小鼠、猴子，并且优选人中自然存在的核酸序列的APO-B1多肽的变体。典型地，当提及多核苷酸的“自然存在的变体”时，该术语还可以包括任何通过染色体转位或复制编码APO-B的基因组DNA以及来源于其的RNA如mRNA的等位基因变体。“自然存在的变体”还可以包括来源于APO-B100mRNA的可变剪接的变体。例如，当提及特异性多肽序列时，该术语还包括可以蛋白质的自然存在的形式，其因此可以被加工，例如，通过翻译或翻译后修饰，如信号肽切割、蛋白水解切割、糖基化等。
[0084] 寡聚物(区域A)可以包含对应于例如人APO-B mRNA中存在的核苷酸序列的反向互补体的连续核苷酸序列，或者由其组成。
[0085] 寡聚物(区域A)可以包含与编码哺乳动物APO-B的核酸(例如，人APO-B100mRNA)的等同区域完全互补(优选互补)的连续核苷酸序列，或者由其组成。因此，寡聚物(区域A)可以包含反义核苷酸序列，或者由其组成。
[0086] 然而，在一些实施方案中，当与靶序列杂交时，寡聚物可以容忍1或2个错配并且仍然足够与靶标结合，以显示出所需的效果，即，靶标的下调。例如，可以通过增加的寡聚物核苷酸序列的长度和/或增加的核苷酸序列内存在的核苷酸类似物如LNA的数量来补偿错配。
[0087] 应认识到的是，在一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列可以包含额外的5’或3’核苷酸，如，独立地，1、2、3、4、5或6个额外的核苷酸5’和/或3’，它们与靶序列是非互补的，这种非互补的寡核苷酸可以形成区域B。就此而言，在一些实施方案中，本发明的寡聚物可以包含5’和或3’侧翼有额外的核苷酸的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，额外的5’或3’核苷酸是自然存在的核苷酸，如DNA或RNA。在一些实施方案中，额外的5’或3’核苷酸可以代表本文中间隔聚体寡聚物的上下文中所称的区域D。在一些实施方案中，额外的核苷酸之间、以及任选地额外的核苷酸和寡聚物之间的核苷间连接是磷酸二酯连接。
[0088] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由根据SEQ ID NO:1的核苷酸序列、或其至少10或12个核碱基的子序列组成，或者包含它们。
[0089] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由根据SEQ ID NO:2的核苷酸序列、或其至少10或12个核碱基的子序列组成，或者包含它们。
[0090] 下表提供了寡聚物和缀合物的特定组合：
[0091]
[0092] 表1：寡聚物/缀合物组合。请注意，在缀合物部分(C)和寡聚物(A)之间可以存在或可以不存在生物可切割接头(B)。对于Conj1-4和1a-4a来说，GalNac缀合物本身是利用GalNac簇中的肽接头生物可切割的，并且因此可以使用或可以不使用另外的生物可切割接头(B)。然而，初步数据表明，包括在本文中所公开的生物可切割接头(B)，如磷酸酯核苷酸接头可以增强这种GalNac簇寡聚物缀合物的活性。对于与Conj 5和Conj 6一起使用来说，生物可切割接头的使用大幅增强了化合物活性，建议包括在本文中所公开的生物可切割接头(B)，如磷酸酯核苷酸接头。可以将缀合物部分(以及区域B或区域Y或B和Y)定位，例如SEQ ID的5’或3’，如区域A的5’。
[0093] 术语“对应于”和“与……对应”是指寡聚物的核苷酸序列(即，核碱基或碱基序列)或连续核苷酸序列(第一区域/区域A)和核酸靶的反向互补体或其子区域之间的比较。
[0094] 核苷酸类似物与它们的等同或相应的核苷酸直接比较。在优选的实施方案中，寡聚物(或其第一区域)与靶标区域或子区域互补，如完全互补。
[0095] 如在本文中所使用的术语“反向互补体”、“反向互补的”和“反向互补性”可与术语“互补体”、“互补的”和“互补性”互换。
[0096] 术语“相应核苷酸类似物”和“相应核苷酸”意在表示核苷酸类似物和自然存在的核苷酸中的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“相应核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(与2-脱氧核糖不同)。
[0097] 术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分并且涵盖自然存在的以及非自然存在的变体二者。因此，“核碱基”不仅涵盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还涵盖它们的杂环类似物和互变异构体。应认识到的是，区域B的DNA或RNA核苷可以具有一个或多个自然存在的和/或非自然存在的核碱基。
[0098] 核碱基的实例包括，但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些实施方案中，核碱基可以独立地选自由以下组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，核碱基可以独立地选自由以下组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、和5-甲基胞嘧啶。
[0099] 在一些实施方案中，寡聚物中存在的至少一个核碱基是选自由以下组成的组的修饰的核碱基：5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤、和2-氯-6-氨基嘌呤。
[0100] 长度
[0101] 寡聚物可以包含长度为总计10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、或22之间的连续核苷酸的连续核苷酸序列，或者由其组成。例如，长度可以包括区域A或区域A和B。
[0102] 在一些实施方案中，寡聚物包含长度为总计10-22，如12-18，如13-17或12-16，如13、14、15、16之间的连续核苷酸的连续核苷酸序列，或者由其组成。
[0103] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物由不多于22个核苷酸，如不多于20个核苷酸，如不多于18个核苷酸，如15、16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中，本发明的寡聚物包含小于20个核苷酸。
[0104] 核苷酸类似物
[0105] 如在本文中所使用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的基团如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团的糖苷，并且既涵盖自然存在的核苷酸如DNA或RNA，也涵盖包含修饰的糖和/或碱基部分的非自然存在的核苷酸，其在本文中也被称为“核苷酸类似物”。在本文中，单核苷酸(单元)也可以被称为单体或核酸单元。
[0106] 在生物化学领域中，术语“核苷”常用于指代包含糖部分和碱基部分的糖苷，并且因此可以在提及通过寡聚物核苷酸之间的核苷酸间连接而共价连接的核苷酸单元时使用。
[0107] 如本领域普通技术人员将认识到的，寡核苷酸的5’核苷酸不包含5’核苷酸间连接基团，然而可以包含或可以不包含5’末端基团。
[0108] 非自然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，如2’取代的核苷酸。
[0109] 由于糖和/或碱基部分中的修饰，“核苷酸类似物”是天然核苷酸如DNA或RNA核苷酸的变体。类似物原则上可以是仅对寡核苷酸的上下文中的天然核苷酸“沉默”或“等同”的，即对寡核苷酸抑制靶标基因表达的作用方式不具有功能作用。然而，例如，如果它们制造更容易或更廉价，或者储存或制造条件更稳定，或者代表标签或标记物，则此类“等同”的类似物可以是可用的。然而，优选地，类似物将会对寡聚物抑制靶标基因表达的作用方式具有功能作用；例如通过产生与靶标的增加的结合亲和力和/或对细胞内核酸酶的增加的抵抗性和/或向细胞中运输的增加的容易性。借助例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development(当前药物发展中的意见),2000,3(2),293-213，在方案1中描述了核苷类似物的具体实例：
[0110]
[0111] 方案1
[0112] 因此寡聚物可以包含自然存在的核苷酸的简单序列，或者由其组成，所述核苷酸优选2’-脱氧核苷酸(在这里通常被称为“DNA”)，而且还可以是核糖核苷酸(在这里通常被称为“RNA”)，或者此类自然存在的核苷酸和一个或多个非自然存在的核苷酸即核苷酸类似物的组合。此类核苷酸类似物可以适合地增强寡聚物对靶序列的亲和力。
[0113] 适合的和优选的核苷酸类似物的实例由WO2007/031091提供或者在其中引用。可以在本发明的寡聚物中使用的其他核苷酸类似物包括三环核酸，例如，请参见WO2013154798和WO2013154798，其通过引用结合于此。
[0114] 寡聚物中增强亲和力的核苷酸类似物如LNA或2’取代的糖类的结合可以允许特异性结合的寡聚物的尺寸减小，并且还可以降低发生非特异性或异常结合之前的寡聚物的尺寸的上限。
[0115] 在一些实施方案中，寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在目前最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是锁核酸(LNA)；例如核苷酸类似物中的至少3个或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或8个可以是LNA。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物都可以是LNA。
[0116] 应认识到的是，当提及仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，本发明的由该序列定义的寡聚物可以包含代替一个或多个所述序列中存在的核苷酸的相应核苷酸类似物，如LNA单元或其他核苷酸类似物，它们提高了寡聚物/靶标双链体的双链体稳定性/Tm(即，增强亲和力的核苷酸类似物)。
[0117] Tm测定：将寡核苷酸：寡核苷酸和RNA靶标(PO)双链体在500ml无RNA酶水中稀释至3mM并且与500ml 2x Tm缓冲液(200mM NaCl，0.2mM EDTA，20mM磷酸钠，pH 7.0)混合。将溶液加热至95℃3分钟，并且之后使其在室温下退火30分钟。在配备有使用PE Templab软件(Perkin Elmer)的Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40UV/VIS分光光度计上测量双链体熔融温度(Tm)。将温度从20℃升高至95℃并且之后降至25℃，在260nm记录吸收。
使用熔融和退火二者的一阶导数和局部最大值评估双链体Tm。
使用熔融和退火二者的一阶导数和局部最大值评估双链体Tm。
[0118] LNA
[0119] 术语“LNA”是指包含C2*-C4*二基团(桥)的双环核苷类似物，并且被称为“锁核酸”。其可以指LNA单体，或者，当在“LNA寡核苷酸”的上下文中使用时，LNA是指含有一个或多个此类双环核苷酸类似物的寡核苷酸。在一些方面中，双环核苷类似物是LNA核苷酸，并且因此这些术语可以是可互换使用的，并且在此类实施方案中，二者的特征在于在核糖糖环的C2’和C4’之间存在接头基团(如桥)。
[0120] 在一些实施方案中，第一区域(A)中存在的至少一个核苷类似物是双环核苷类似物，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个(除了区域B的DNA和或RNA核苷之外)是糖修饰的核苷类似物，如双环核苷类似物，如LNA，例如β-D-X-LNA或αL-X-LNA(其中X是氧基、氨基或硫基)，或者在本文中所公开的其他LNA，包括但不限于(R/S)cET、cMOE或5’-Me-LNA。
[0122]e
[0123] 其中Y选自由以下组成的组：-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(R)和/或-CH2-；Z和Z*H独立地选自：核苷酸间连接、R、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分H a b c d e
(核碱基)，并且R选自氢和C1-4-烷基；R、RR、R和R 任选独立地选自由以下组成的组：
氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基C1-6-烷基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团、以及配体，其中芳基和杂芳基可以是任a b
选取代的，并且其中两个成对的取代基R和R 可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)；
H a b c d e
并且R选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方案中，R、RR、R和R 任选独立地选自由氢和C1-6烷基如甲基组成的组。对于所有手性中心来说，可以发现非对称基团为R或S取向，例如，两种示例性立体化学异构体包括β-D和α-L同种型，其可以如下表示：
(核碱基)，并且R选自氢和C1-4-烷基；R、RR、R和R 任选独立地选自由以下组成的组：
氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-烷氧基烷基、C2-12-烯氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二(C1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基C1-6-烷基-氨基羰基、单和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-烷酰氧基、砜基、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报告基团、以及配体，其中芳基和杂芳基可以是任a b
选取代的，并且其中两个成对的取代基R和R 可以一起表示任选取代的亚甲基(＝CH2)；
H a b c d e
并且R选自氢和C1-4-烷基。在一些实施方案中，R、RR、R和R 任选独立地选自由氢和C1-6烷基如甲基组成的组。对于所有手性中心来说，可以发现非对称基团为R或S取向，例如，两种示例性立体化学异构体包括β-D和α-L同种型，其可以如下表示：
[0124]
[0125] 以下示出具体的示例性LNA单元：
[0126]
[0127] 术语“硫代-LNA”包括在其中以上通式中的Y选自S或-CH2-S-的锁核苷酸。硫代-LNA可以是β-D和α-L-构型二者。
[0128] 术语“氨基-LNA”包括在其中以上通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、和-CH2-N(R)-的锁核苷酸，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以是β-D和α-L-构型二者。
[0129] 术语“氧基-LNA”包括在其中以上通式中的Y表示-O-的锁核苷酸。氧基-LNA可以是β-D和α-L-构型二者。
[0130] 术语“ENA”包括在其中以上通式中的Y是-CH2-O-的锁核苷酸(其中-CH2-O-的e氧原子与相对于碱基B的2’位连接)。R是氢或甲基。
[0131] 在一些示例性实施方案中，LNA选自β-D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，尤其是β-D-氧基-LNA。
[0132] 如在本文中所使用的，“双环核苷”是指修饰的包含双环糖部分的核苷。双环核苷的实例包括，但不限于，在4’和2’核糖基环原子之间包含桥的核苷。在一些实施方案中，在本文中提供的化合物包括其中桥包含4’至2’双环核苷的一种或多种双环核苷。此类4’至2’双环核苷的实例包括，但不限于下列各式中的一个：4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’和4’-CH(CH2OCH3)-O-2*，及其类似物(参见美国专利7,399,845，于2008年7月15日公布)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’，及其类似物(参见公布的PCT国际申请WO2009/006478，于2009年1月8日公布)；
4’-CH2-N(OCH3)-2’，及其类似物(参见公布的PCT国际申请WO2008/150729，于2008年12月11日公布)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见公布的美国专利申请US2004/0171570，于2004年9月2日公布)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H、C1-C10烷基、或保护基团(参见美国专利
7,427,672，于2008年9月23日授权)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4’-CH2-C(＝CH2)-2’，及其类似物(参见公布的PCT国际申请WO 2008/154401，于2008年12月8日公布)。还参见，例如：Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron(四面体),1998,54,3607-3630；
Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh 等 人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；
Srivastava 等 人，J.Am.Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi 等 人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch 等 人，Chem.Biol,2001,8,1-7；
Oram等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专 利号U.S.6,670,461、
7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,399,845；公 布的PCT国际申请WO 2004/106356、WO 94/14226、WO 2005/021570、和WO 2007/134181；美国专利申请号US2004/0171570、US2007/0287831、和US2008/0039618；以及美国序列号
12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154、和PCT/US2008/068922。可以制备前述双环核苷中的每一个，其具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如a-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCT DK98/00393，于1999年3月25日作为WO 99/14226公布)。
4’-CH2-N(OCH3)-2’，及其类似物(参见公布的PCT国际申请WO2008/150729，于2008年12月11日公布)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(参见公布的美国专利申请US2004/0171570，于2004年9月2日公布)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R是H、C1-C10烷基、或保护基团(参见美国专利
7,427,672，于2008年9月23日授权)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(参见Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4’-CH2-C(＝CH2)-2’，及其类似物(参见公布的PCT国际申请WO 2008/154401，于2008年12月8日公布)。还参见，例如：Singh等人，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人，Tetrahedron(四面体),1998,54,3607-3630；
Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh 等 人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；
Srivastava 等 人，J.Am.Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi 等 人，Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch 等 人，Chem.Biol,2001,8,1-7；
Oram等人，Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专 利号U.S.6,670,461、
7,053,207、6,268,490、6,770,748、6,794,499、7,034,133、6,525,191、7,399,845；公 布的PCT国际申请WO 2004/106356、WO 94/14226、WO 2005/021570、和WO 2007/134181；美国专利申请号US2004/0171570、US2007/0287831、和US2008/0039618；以及美国序列号
12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、和61/099,844；以及PCT国际申请号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154、和PCT/US2008/068922。可以制备前述双环核苷中的每一个，其具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如a-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCT DK98/00393，于1999年3月25日作为WO 99/14226公布)。
[0133] 在一些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括，但不限于，在呋喃戊糖基糖部分的4’和2’位置之间具有至少一个桥的化合物，其中此类桥连独立地包含独立地选自下列各项中的1个或2至4个连接基团：-[CiRaXRb)],,-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-、和-N(Ra)-；其中：x是0、1、或2；n是1、2、3、或4；Ra和Rb各自独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-Ci2烯基、取代的C2-C12烯基、C2-Ci2炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基团、取代的杂环基团、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或磺氧基(sulfoxyl)(S(＝O)-J1)；并且J1和J2各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C2o芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基团、取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
[0134] 在一些实施方案中，双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或、-C(RaRb)-O-N(R)-。在一些实施方案中，桥是4’-CH2-2’,4’-(CH2)2-2’,4’-(CH2)3-2’,4’-CH2-O-2’,4*-(CH2)2-O-2’,4’-CH2-O-N(R)-2’、和4’-CH2-N(R)-O-2’-，其中R各自独立地为H、保护基团、或C1-C12烷基。
[0135] 在一些实施方案中，双环核苷由异构构型另外限定。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥的核苷可以处于a-L构型或者处于β-D构型。之前，已经将a-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA结合至显示出反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人，核酸研究(Nucleic Acids Research),2003,21,6365-6372)。
[0136] 在一些实施方案中，双环核苷包括，但不限于，如以下描绘的(A)a-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA、(G)亚甲基-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA、和(J)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA。
[0137]
[0138] 其中Bx是碱基部分并且R独立地为H、保护基团或C1-C2烷基。在某些实施方案中，双环核苷具有式I：
[0139]
[0140] 其中：
[0141] Bx是杂环碱基部分；
[0142] -Qa-Qb-Qc-是-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-、或-N(Rc)-O-CH2；
[0143] Rc是C1-C12烷基或氨基保护基团；并且
[0144] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接。
[0145] 在一些实施方案中，双环核苷具有式II：
[0146]
[0147] 其中：
[0148] Bx是杂环碱基部分；
[0149] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接；Za是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇、或取代的硫基。
[0150] 在一些实施方案中，取代的基团各自独立地被独立地选自下列各项的取代基单取代或多取代：卤素、氧代、羟基、OJc、NJd、SJC、N3、OC(＝X)Jc、和NJeC(＝X)NJcJd，其中Jc、Jd、和Je独立地为H、C1-C6烷基、或取代的C1-C6烷基并且X是O或NJC。
[0151] 在一些实施方案中，双环核苷具有式III：
[0152]
[0153] 其中：
[0154] Bx是杂环碱基部分；
[0155] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接；
[0156] Rd是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、或取代的酰基(C(＝O)-)。
[0157] 在一些实施方案中，双环核苷具有式IV：
[0158]
[0159] 其中：
[0160] Bx是杂环碱基部分；
[0161] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接；
[0162] Rd是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基；qb、qc和qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-Ce烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的Q-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基、或取代的C1-C6氨基烷基；
[0163] 在一些实施方案中，双环核苷具有式V：
[0164]
[0165] 其中：
[0166] Bx是杂环碱基部分；
[0167] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接；qa、qb、qc和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；或qe和qf一起为＝C(qg)(qh)；qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、或取代的C1-C12烷基。
[0168] 已经描述了亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、和尿嘧啶的合成与制备，连同它们的寡聚化，以及核酸识别性质(参见，例如，Koshkin等人，Tetrahedron(四面体),1998,54,3607-3630)。在WO 98/39352和WO99/14226中也描述了BNA及其制备。
[0169] 也已经制备了亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、和2’-硫代-BNA的类似物(参见，例如，Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。也已经描述了包含寡聚脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶的底物的锁核苷类似物的制备(参见，例如，Wengel等人，WO 99/14226)。此外，本领域中已经描述了新型构象受限的高亲和力寡核苷酸类似物2’-氨基BNA的合成(参见，例如，Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，已经制备了2’-氨基和2’-甲基氨基-BNA，并且之前已经报道了其具有互补的RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
[0170] 在一些实施方案中，双环核苷具有式VI：
[0171] 在某些实施方案中，双环
[0172]
[0173] 其中：
[0174] Bx是杂环碱基部分；
[0175] Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基团、缀合物基团、反应性磷基团、磷部分、或与载体介质的共价连接；每个qj、qj、qk和ql独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C2-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk、或(H)C(＝S)NJjJk；并且qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、或取代的C1-C6烷基。
[0176] 已经描述了一种具有4’-(CH2)3-2’桥和烯基类似物桥4’-CH＝CH-CH2-2’的碳环双环核苷(参见，例如，Freier等人，Nucleic Acids Research(核 酸研究 ),1997,25(22),4429-4443 和 Albaek 等 人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-77‘40)。
也已经描述了碳环双环核苷的合成和制备连同其寡聚化和生物化学研究(参见，例如，Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
也已经描述了碳环双环核苷的合成和制备连同其寡聚化和生物化学研究(参见，例如，Srivastava等人，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
[0177] 如在本文中所使用的，“4’-2’双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含含有连接2’碳原子和4’碳原子的桥的呋喃糖环的双环核苷。
[0178] 如在本文中所使用的，“单环核苷”是指包括修饰的不为双环糖部分的糖部分的核苷。在一些实施方案中，可以在任何位置修饰或取代核苷的糖部分或糖部分类似物。
[0179] 如在本文中所使用的，“2’修饰的糖”意指在2’位置修饰的呋喃糖。在一些实施方案中，此类修饰包括选自下列各项的取代基：卤化物，包括但不限于，取代的和未取代的烷氧基、取代的和未取代的硫代烷基、取代的和未取代的氨基烷基、取代的和未取代的烷基、取代的和未取代的烯丙基、和取代的和未取代的炔基。在一些实施方案中，2’修饰选自下列取代基，包括但不限于：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)，，NH2、O(CH2)，，CH3、O(CH2)，，ONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他的2’-取代基还可以选自：C1-C12烷基；取代的烷基；烯基；炔基；烷芳基；芳烷基；O-烷芳基或O-芳烷基；SH；SCH3；OCN；CI；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；S02CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；R；切割基团；报告基团(reporter group)；嵌入剂；用于改善药代动力学性质的基团；以及用于改善反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在一些实施方案中，修饰的核苷包含2’-MOE侧链{参见，例如，Baker等人，J.Biol.Chem.,1997,272,1 1944-12000)。这种2’-MOE取代已经被描述为，与未修饰的核苷相比并且与其他修饰的核苷如2’-O-甲基、O-丙基、和O-氨基丙基相比，改善了结合亲和力。已经显示具有2-MOE取代基的寡核苷酸为具有对于体内使用来说有前景的特征的基因表达的反义抑制剂{参见，例如，Martin,P.,He/v.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等人，Chimia,1996,50,168-176；Altmann等人，Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；以及Altmann等人，NucleosidesNucleotides(核苷酸),1997,16,917-926)。
[0180] 如在本文中所使用的，“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指具有替代正常核苷中呋喃戊糖残基的六元四氢吡喃“糖”(糖替代物)的核苷。修饰的？THP核苷包括，但不限于，本领域被称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA){参见Leumann,CJ.Bioorg.and Med.Chem.(2002)10:841-854)、氟代HNA(F-HNA)的那些，或具有式X的那些化合物：
[0181]
[0182] X，其中独立地对于所述式X的至少一个四氢吡喃核苷类似物的每一个来说：
[0183] Bx是杂环碱基部分；
[0184] T3和T4各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4之一是将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团并且T3和T4中的另一个是H、羟基保护基团、连接的缀合物基团、或5’或3’-末端基团；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2之一是氢并且另一个选自卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ、J2、SJ、、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2、和CN，其中X是O、S、或NJ1并且J1、J2、和J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
[0185] 在一些实施方案中，提供式X的修饰的THP核苷，其中qm、qn、qp、qr、qs、qt、和qu分别为H。在一些实施方案中，qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一个不是H。在一些实施方案中，qm、qn、qp、qr、qs、qt和qu中的至少一个是甲基。在一些实施方案中，提供式X的THP核苷，其中R1和R2之一是F。在一些实施方案中，R1是氟并且R2是H，R1是甲氧基并且R2是H，并且R1甲氧基乙氧基并且R2是H。
[0186] 如在本文中所使用的，“2’-修饰的”或“2’-取代的”是指包含在2’位置含有除H或OH外的取代基的糖的核苷。2’-修饰的核苷包括，但不限于具有非桥连的2’取代基的核苷，如烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2’-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和R，，各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。2’-修饰的核苷还可以包括其他修饰，例如，在糖的其他位置上和/或在核碱基上。
[0187] 如在本文中所使用的，“2’-F”是指在2’位置包含氟基团的糖。
[0188] 如在本文中所使用的，“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”分别是指包含在糖环的2’位置含有-OCH3基团的糖的核苷。
[0189] 如在本文中所使用的，“寡核苷酸”是指包含多个连接核苷的化合物。
[0190] 在一些实施方案中，多个核苷中的一个或多个是修饰的。在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
[0191] 本领域还已知许多其他双环和三环糖替代物环体系，它们可以用于修饰核苷以用于结合至反义化合物中(参见，例如，综述文章：Leumann,J.C,Bioorganic and Medicinal Chemistry(生物有机和药用化学),2002,10,841-854)。此类环体系可以经历多个额外的取代以提高活性。用于制备修饰的糖类的方法是本领域技术人员公知的。在具有修饰的糖部分的核苷酸中，维持核碱基部分(天然的、修饰的、或其组合)与适合的核酸靶杂交。
[0192] 在一些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2’-MOE。在一些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷酸排列在间隔聚体基序中。在一些实施方案中，修饰的糖部分是cEt。在一些实施方案中，cEt修饰的核苷酸排列在间隔聚体基序的整个侧翼(wing)中。
[0193] 在 一 些 实 施 方 案 中，在 BNA(LNA) 中，R4*和R2*一起表示二基团-O-CH(CH2OCH3)-(2’O-甲氧基乙基双环核酸，Seth等人，2010,J.Org.Chem)，其为R-或S-构型。
[0194] 在 一 些 实 施 方 案 中，在 BNA(LNA) 中，R4*和R2*一起表示二基团-O-CH(CH2CH3)-(2’O-乙基双环核酸，Seth等人，2010,J.Org.Chem)，其为R-或S-构型。
[0195] 在一些实施方案中，在BNA(LNA)中，R4*和R2*一起表示二基团-O-CH(CH3)-，其4* 2*
为R-或S-构型。在一些实施方案中，R 和R 一起表示二基团-O-CH2-O-CH2-(Seth等
人，,2010,J.Org.Chem)。
为R-或S-构型。在一些实施方案中，R 和R 一起表示二基团-O-CH2-O-CH2-(Seth等
人，,2010,J.Org.Chem)。
[0196] 在一些实施方案中，在BNA(LNA)中，R4*和R2*一起表示二基团-O-NR-CH3-(Seth等人.,2010,J.Org.Chem)。
[0197] 在一些实施方案中，LNA单元具有选自以下基团的结构：
[0198]
[0199] 寡聚物中增强亲和力的核苷酸类似物如BNA，(例如)LNA或2’取代的糖类的结合可以允许特异性结合的寡聚物的尺寸减小，并且还可以降低发生非特异性或异常结合之前的寡聚物的尺寸的上限。
[0200] 在一些实施方案中，寡聚物包含至少1个核苷酸类似物。在一些实施方案中，寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在目前最优选的实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是BNA，如锁核酸(LNA)；例如核苷酸类似物中的至少3个或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或8个可以是BNA，如LNA。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物都可以是BNA，如LNA。
[0201] 应认识到的是，当提及仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，本发明的由该序列定义的寡聚物可以包含代替一个或多个所述序列中存在的核苷酸的相应核苷酸类似物，如BNA单元或其他核苷酸类似物，它们提高了寡聚物/靶标双链体的双链体稳定性/Tm(即，增强亲和力的核苷酸类似物)。
[0202] 优选的核苷酸类似物是LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA、和α-L-氧基-LNA)、和/或氨基LNA(如β-D-氨基-LNA和α-L-氨基LNA)和/或硫代-LNA(如
β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。
β-D-硫代-LNA和α-L-硫代-LNA)和/或ENA(如β-D-ENA和α-L-ENA)。
[0203] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物，如区域A，可以包含BNA或LNA单元和其他核苷酸类似物。本发明的寡聚物中存在的另外的核苷酸类似物独立地选自，例如：2’-O-烷基-RNA单元，2’-氨基-DNA单元，2’-氟-DNA单元，BNA单元，例如LNA单元，阿糖基核酸(ANA)单元，2’-氟-ANA单元，HNA单元，INA(嵌入核酸，Christensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30:4918-4925，通过引用结合于此)单元和2’MOE单元。在一些实施方案中，仅存在以上类型的本发明的寡聚物中存在的核苷酸类似物中的一种，如第一区域，或其连续核苷酸序列。
[0204] 在一些实施方案中，根据本发明的寡聚物(区域A)因此可以包含至少一个BNA，例如锁核酸(LNA)单元，如1、2、3、4、5、6、7、或8个BNA/LNA单元，如3-7或4至8个BNA/LNA单元，或3、4、5、6或7个BNA/LNA单元。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物都是BNA，如LNA。在一些实施方案中，寡聚物可以包含β-D-氧基-LNA以及以下LNA单元中的一种或多种：硫代-LNA、氨基LNA、氧基-LNA、和/或β-D或α-L构型的ENA或它们的组合。在一些实施方案中，所有BNA，如LNA、胞嘧啶单元都是5’甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方案中，寡聚物(如第一区域和任选地第二区域)可以包含BNA和LNA以及DNA单元二者。在一些实施方案中，LNA和DNA单元的相加的总和是10-25，如10-24，优选10-20，如10-18，如12-16。在本发明的一些实施方案中，寡聚物的核苷酸序列、其第一区域的核苷酸序列，如连续核苷酸序列的核苷酸序列，包括至少一个BNA、例如LNA，并且其余的核苷酸单元是DNA单元。在一些实施方案中，寡聚物或其第一区域仅包含任选地具有修饰的核苷酸间连接如硫代磷酸酯的BNA，例如LNA、核苷酸类似物和自然存在的核苷酸(如RNA或DNA，最优选DNA核苷酸)。
[0205] RNA酶募集
[0206] 应认识到的是，寡聚化合物可以通过靶mRNA的非RNA酶介导的降解发挥作用，如通过翻译的空间位阻或其他方法。在一些实施方案中，本发明的寡聚物能够募集核糖核酸内切酶(RNA酶)，如RNA酶H。
[0207] 优选的是，此类寡聚物，如区域A、或连续核苷酸序列，包含至少6个、如至少7个连续核苷酸单元、如至少8个或至少9个连续核苷酸单元(残基)的区域，包含7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续核苷酸，当在具有互补的靶标RNA的双链体中形成时，其能够募集RNA酶(如DNA单元)。如在本文中所描述的间隔聚体的上下文所提及的，能够募集RNA酶的连续序列可以是区域Y’。在一些实施方案中，能够募集RNA酶的连续序列，如区域Y’的尺寸可以是较高的，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸单元。
[0208] EP 1 222 309提供了用于测定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于测定募集RNA酶H的能力。当与互补的RNA靶标一起提供时，使用由EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果其具有使用仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的至少1％、如至少5％、如至少10％或、大于20％的以pmol/l/分钟测量的初始速率，则认为寡聚物能够募集RNA酶H，所述仅DNA寡核苷酸具有相同的碱基序列但是仅含有DNA单体，没有2’取代，在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接基团。
[0209] 在一些实施方案中，当与互补的RNA靶标和RNA酶H一起提供时，如果以pmol/l/分钟测量的RNA酶H初始速率为使用相当的仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的小于1％，如小于5％、如小于10％或小于20％，所述仅DNA寡核苷酸没有2’取代，在寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团，使用由EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，则认为寡聚物基本上不能募集RNA酶H。
[0210] 在其他实施方案中，当与互补的RNA靶标和RNA酶H一起提供时，如果以pmol/l/分钟测量的RNA酶H初始速率为使用相当的仅DNA寡核苷酸测定的初始速率的至少20％，如至少40％，如至少60％，如至少80％，所述仅DNA寡核苷酸没有2’取代，在寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团，使用由EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，则认为寡聚物能够募集RNA酶H。
[0211] 通常，当在具有互补的靶标RNA的双链体中形成时，形成连续核苷酸单元的寡聚物的区域能够募集由形成类似DNA/RNA的双链体的核苷酸单元组成的RNA酶。本发明的寡聚物，如第一区域，可以包含含有核苷酸和核苷酸类似物二者并且可以为例如间隔聚体形式的核苷酸序列。
[0212] 间隔聚体设计
[0213] 在一些实施方案中，本发明的寡聚物，如第一区域，包含或是间隔聚体。间隔聚体寡聚物是包含一段连续的核苷酸的寡聚物，所述一段连续的核苷酸能够募集RNA酶，如RNA酶H，如至少6或7个DNA核苷酸的区域，在本文中被称为区域Y’(Y’)，其中区域Y’是5’和3’二者侧翼有增强亲和力的核苷酸类似物的区域，如1-6个核苷酸类似物5’和3’到一段连续的能够募集RNA酶的核苷酸，这些区域分别被称为区域X’(X’)和Z’(Z’)。在WO2004/046160、WO2008/113832、和WO2007/146511中公开了间隔聚体的实例。
[0214] 在一些实施方案中，能够募集RNA酶的单体选自由以下组成的组：DNA单体、α-L-LNA单体、C4’烷基化的DNA单体(参见PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，通过引用结合于此)、以及UNA(解锁核酸)核苷酸(参见Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，通过引用结合于此)。UNA是解锁核酸，通常其中已经移除了核糖的C2-C3C-C键，形成解锁的“糖”残基。优选地，间隔聚体包含式(5’至3’)X’-Y’-Z’的(聚)核苷酸序列，其中；区域X’(X’)(5’区域)由至少一个核苷酸类似物，如至少一个BNA(例如LNA)单元，如1-6个核苷酸类似物，如BNA(例如LNA)单元组成，或包含它们，并且；区域Y’(Y’)由能够募集RNA酶(当在具有互补的RNA分子如mRNA靶标的双链体中形成时)的至少五个连续核苷酸如DNA核苷酸组成或包含它们，并且区域Z’(Z’)(3’区域)由至少一个核苷酸类似物如至少一个BNA(例如LNA单元)，如1-6个核苷酸类似物，如BNA(例如LNA)单元组成或包含它们。
[0215] 在一些实施方案中，区域X’由1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物，如BNA(例如LNA)单元，如2-5个核苷酸类似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元组成；和/或区域Z’由1、2、3、4、5或6个核苷酸类似物，如BNA(例如LNA)单元，如2-5个核苷酸类似物，如2-5个BNA(例如LNA单元)，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个BNA(例如LNA)单元组成。
[0216] 在一些实施方案中，Y’由5、6、7、8、9、10、11或12个能够募集RNA酶的连续核苷酸，或6-10个、或7-9个，如8个能够募集RNA酶的连续核苷酸组成或包含它们。在一些实施方案中，区域Y’由至少一个DNA核苷酸单元，如1-12个DNA单元，优选4-12个DNA单元，更优选6-10个DNA单元，如7-10个DNA单元，最优选8、9或10个DNA单元组成或包含它们。
[0217] 在一些实施方案中，区域X’由3或4个核苷酸类似物如BNA(例如LNA)组成，区域X’由7、8、9或10个DNA单元组成，并且区域Z’由3或4个核苷酸类似物如BNA(例如LNA)组成。此类设计包括(X’-Y’-Z’)3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3。
[0218] 在WO2004/046160中公开了另外的间隔聚体设计，其通过引用结合于此。通过引用结合于此的要求根据US临时申请60/977,409的优先权的WO2008/113832，涉及“短聚物(shortmer)”间隔聚体寡聚物。在一些实施方案中，在这里给出的寡聚物可以是此类短聚物间隔聚体。
[0219] 在一些实施方案中，寡聚物例如区域X’由总计10、11、12、13或14个核苷酸单元的连续核苷酸序列组成，其中所述连续核苷酸序列包含或是式(5’-3’)X’-Y’-Z’，其中；X’由1、2或3个核苷酸类似物单元如BNA(例如LNA)单元组成；Y’由当在具有互补的RNA分子(如mRNA靶标)的双链体中形成时能够募集RNA酶的7、8或9个连续核苷酸单元组
成；并且Z’由1、2或3个核苷酸类似物单元如BNA(例如LNA)单元组成。
成；并且Z’由1、2或3个核苷酸类似物单元如BNA(例如LNA)单元组成。
[0220] 在一些实施方案中，X’由1个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，X’由2个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，X’由3个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，Z’由1个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，Z’由2个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，Z’由3个BNA(例如LNA)单元组成。在一些实施方案中，Y’由7个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，Y’由8个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，Y’由9个核苷酸单元组成。在某些实施方案中，区域Y’由10个核苷单体组成。在某些实施方案中，区域Y’由1-10个DNA单体组成或包含它们。在一些实施方案中，Y’包含1-9个DNA单元，如2、3、4、5、6、7、8或9个DNA单元。在一些实施方案中，Y’由DNA单元组成。在一些实施方案中，Y’包含至少一个α-L构型的BNA单元，如2、3、4、
5、6、7、8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方案中，Y’包含至少一个α-L-氧基BNA/LNA单元或者其中所有α-L-构型的LNA单元都是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方案中，X’-Y’-Z’中存在的核苷酸的数量选自由以下组成的组：(核苷酸类似物单元-区域Y’-核苷酸类似物单元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、
1-8-4、2-8-4、 或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1。在一些实施方案中，X’-Y’-Z’中核苷酸的数量选自由以下组成的组：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、和
4-7-3。在某些实施方案中，区域X’和Y’各自由三个BNA(例如LNA)单体组成，并且区域Y’由8或9或10个核苷单体、优选DNA单体组成。在一些实施方案中，X’和Z’二者各自均由两个BNA(例如LNA)单元组成，并且Y’由8或9个核苷酸单元、优选DNA单元组成。在多个实施方案中，其他间隔聚体设计包括以下那些：其中区域X’和/或Z’由3、4、5或6个核苷类似物、如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的单体或含有2’-氟-脱氧核糖的单体组成，并且区域Y’由8、9、10、11或12个核苷、如DNA单体组成，其中区域X’-Y’-Z’具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4单体。在WO 2007/146511A2中公开了另外的间隔聚体设计，其通过引用结合于此。
5、6、7、8或9个α-L-构型的LNA单元。在一些实施方案中，Y’包含至少一个α-L-氧基BNA/LNA单元或者其中所有α-L-构型的LNA单元都是α-L-氧基LNA单元。在一些实施方案中，X’-Y’-Z’中存在的核苷酸的数量选自由以下组成的组：(核苷酸类似物单元-区域Y’-核苷酸类似物单元)：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、
1-8-4、2-8-4、 或；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、或；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1。在一些实施方案中，X’-Y’-Z’中核苷酸的数量选自由以下组成的组：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、和
4-7-3。在某些实施方案中，区域X’和Y’各自由三个BNA(例如LNA)单体组成，并且区域Y’由8或9或10个核苷单体、优选DNA单体组成。在一些实施方案中，X’和Z’二者各自均由两个BNA(例如LNA)单元组成，并且Y’由8或9个核苷酸单元、优选DNA单元组成。在多个实施方案中，其他间隔聚体设计包括以下那些：其中区域X’和/或Z’由3、4、5或6个核苷类似物、如含有2’-O-甲氧基乙基-核糖(2’-MOE)的单体或含有2’-氟-脱氧核糖的单体组成，并且区域Y’由8、9、10、11或12个核苷、如DNA单体组成，其中区域X’-Y’-Z’具有3-9-3、3-10-3、5-10-5或4-12-4单体。在WO 2007/146511A2中公开了另外的间隔聚体设计，其通过引用结合于此。
[0221] BNA和LNA间隔聚体：BNA间隔聚体是包含至少一个BNA核苷酸的间隔聚体寡聚物(区域A)。LNA间隔聚体是包含至少一个LNA核苷酸的间隔聚体寡聚物(区域A)。SEQ ID NO 2和3是LNA间隔聚体寡聚物。具有10-16个与SEQ ID NO 33或34的相应长度互补的核苷酸的连续序列的寡聚物也可以是间隔聚体寡聚物，如BNA间隔聚体或LNA间隔聚体。
[0222] 核苷酸间连接
[0223] 在本文中所描述的寡聚物(例如第一和第二区域)的核苷单体经由[核苷间]连接基团偶联在一起。适宜地，每个单体经由连接基团与3’相邻单体连接。
[0224] 本领域普通技术人员将理解的是，在本发明上下文中，在寡聚物末端的5’单体不包含5’连接基团，然而其可以包含或可以不包含5’末端基团。
[0225] 术语“连接基团”或“核苷酸间连接”意指能够将两个核苷酸共价偶联在一起的基团。具体和优选的实例包括磷酸酯基和硫代磷酸酯基。
[0226] 本发明的寡聚物的核苷酸或其连续核苷酸经由连接基团偶联在一起。适宜地，每个核苷酸经由连接基团与3’相邻核苷酸连接。
[0227] 适合的核苷酸间连接包括在WO2007/031091中列出的那些，例如在WO2007/031091的第34页第一段列出的核苷酸间连接(通过引用结合于此)。
[0228] 在一些实施方案中，除了区域B(在存在的情况下)的一个或多个磷酸二酯连接之外，优选的是将核苷酸间连接从其正常的磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击更具抗性的核苷酸间连接，如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯，这二者可通过RNA酶H切割，还允许对减少靶基因表达中的反义抑制的途径。
[0229] 如在本文中提供的适合的含有核苷酸间连接的硫(S)可以是优选的，如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。硫代磷酸酯核苷酸间连接也是优选的，尤其是对于第一区域来说，如在间隔聚体、混聚物(mixmer)、antimir剪接切换寡聚物、和totalmer。
[0230] 对于间隔聚体来说，寡聚物中的核苷酸间连接可以是，例如，硫代磷酸酯或硼代磷酸酯，从而允许靶向RNA的RNA酶H切割。对于提高的核酸酶抗性和其他原因来说，如制造的容易性，硫代磷酸酯是优选的。
[0231] 在一个方面中，除了第一和第二区域之间的磷酸二酯连接之外，并且任选在区域B内，本发明的寡聚物、核苷酸和/或核苷酸类似物的其余的核苷间连接借助硫代磷酸酯基彼此连接。在一些实施方案中，第一区域中核苷之间的至少50％、如至少70％、如至少80％、如至少90％如全部的核苷间连接不是磷酸二酯(磷酸酯)，而是如选自由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、或硼代磷酸酯组成的组。在一些实施方案中，第一区域中核苷之间的至少50％、如至少70％、如至少80％、如至少90％如全部的核苷间连接是硫代磷酸酯。
[0232] WO09124238涉及具有至少一个通过中性核苷间连接与3’或5’末端连接的双环核苷的寡聚化合物。本发明的寡聚物因此可以具有至少一个通过中性核苷间连接，如一个或多个磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛或硫代甲缩醛与3’或5’末端连接的双环核苷。其余的连接可以是硫代磷酸酯。
[0233] 寡聚物缀合物
[0234] 已经与寡核苷酸一起使用的代表性缀合物部分可以包括：亲脂性分子(芳族和非芳族)，包括类固醇分子；蛋白质(例如，抗体、酶、血清蛋白)；肽；维生素(水溶性或脂溶性)；聚合物(水溶性或脂溶性)；小分子，包括药物、毒素、报告分子、和受体配体；碳水化合物复合物；核酸切割复合物；金属螯合剂(例如，卟啉、德克萨卟啉(texaphyrin)、冠醚等)；嵌入剂，包括杂合光核酸酶/嵌入剂；交联剂(例如，光活性的、氧化还原活性的)、以及它们的组合和衍生物。例如，在WO 93/07883和美国专利号6,395,492中，提供了许多适合的缀合物部分、它们的制备以及与寡聚化合物的连接，其每一个通过引用整体结合在本文中。在Manoharan的Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications(反义药物技术、原理、策略、和应用),S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development(反义和核酸药物发展),2002,12,103的综合性的综述中，还报道了寡核苷酸缀合物及其合成，其每一个通过引用整体结合在本文中。
[0235] 在一些实施方案中，将本发明的寡聚物靶向至肝脏，即在全身施用之后，化合物在肝细胞(如肝实质细胞(hepatocyte))中积累。可以通过添加缀合物部分(C)大幅增强靶向至肝脏。然而，为了使寡聚物的功效最大化，通常所需的是将缀合物(或靶向部分)经由生物可切割接头(B)如核苷酸磷酸酯接头与寡聚物连接。因此所需的是使用在肝实质细胞中增强吸收和活性的缀合物部分。活性的增强可以归因于增强的吸收，并且其可以归因于化合物在肝实质细胞中增强的效力。
[0236] 在一些实施方案中，寡聚化合物是BNA或LNA寡聚物，如间隔聚体，或例如LNA反义寡聚物(其在本文中可以被称为区域A)，其包含反义寡聚物、任选的生物可切割接头如区域B、和碳水化合物缀合物(其可以被称为区域C)。LNA反义寡聚物可以是长度为7-30，如8-26的核苷，并且其包含至少一个LNA单元(核苷)。在一些实施方案中，碳水化合物部分不是直链碳水化合物聚合物。
[0237] 在一些实施方案中，寡聚化合物是LNA寡聚物，例如LNA反义寡聚物(其在本文中被称为区域A)，其包含反义寡聚物、如在本文中定义的区域B、和脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分缀合物部分，如GalNAc部分(其可以被称为区域C)。碳水化合物部分可以是多价的，如，例如2、3、4或4个相同或不相同的碳水化合物部分可以任选经由一个或多个接头(如区域Y)与寡聚物共价连接。
[0238] GalNac缀合物部分
[0239] 在一些实施方案中，碳水化合物部分不是直链碳水化合物聚合物。然而，碳水化合物部分可以是多价的，如，例如2、3、4或4个相同或不相同的碳水化合物部分可以任选经由一个或多个接头与寡聚物共价连接。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的寡聚物和碳水化合物缀合物部分的缀合物。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的寡聚物和脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分缀合物部分如GalNAc部分(其可以形成另一个区域(被称为区域C)的一部分)的缀合物。
[0240] 本发明还提供与靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分缀合的LNA反义寡核苷酸。在一些实施方案中，缀合物部分(如第三区域或区域C)包含靶向脱唾液酸糖蛋白受体的部分，如半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、和N-异丁酰基半乳糖胺。在一些实施方案中，缀合物包含半乳糖簇，如N-乙酰半乳糖胺三聚体。在一些实施方案中，缀合物部分包含GalNAc(N-乙酰半乳糖胺)，如单价、二价、三价或四价GalNAc。三价GalNAc缀合物可以用于将化合物靶向至肝脏。GalNAc缀合物已经与甲基膦酸酯和PNA反义寡核苷酸(例如US 5,994517和Hangeland
等人，Bioconjug Chem.1995Nov-Dec；6(6):695-701)以及siRNA(例如WO2009/126933、WO2012/089352&WO2012/083046)一起使用。GalNAc参考文献和在其中使用的具体缀合物通过引用结合于此。WO2012/083046公开了具有包含可切割药代动力学调节剂的GalNAc缀合物部分的siRNA，其适合在本发明中使用，优选的药代动力学调节剂是C16疏水基团如棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基。‘046可切割药代动力学调节剂还可以是胆固醇。
等人，Bioconjug Chem.1995Nov-Dec；6(6):695-701)以及siRNA(例如WO2009/126933、WO2012/089352&WO2012/083046)一起使用。GalNAc参考文献和在其中使用的具体缀合物通过引用结合于此。WO2012/083046公开了具有包含可切割药代动力学调节剂的GalNAc缀合物部分的siRNA，其适合在本发明中使用，优选的药代动力学调节剂是C16疏水基团如棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基。‘046可切割药代动力学调节剂还可以是胆固醇。
[0241] ‘靶向部分(缀合物部分)可以选自由以下组成的组：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、N-异丁酰基半乳糖胺、半乳糖簇、和N-乙酰半乳糖胺三聚体，并且可以具有选自由以下组成的组的药代动力学调节剂：具有16个以上碳原子的疏水基团、具有16-20个碳原子的疏水基团、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基、和胆固醇。‘046中公开的某些GalNac簇包括：(E)-十六碳-8-烯酰基(C16)、油烯基(C18)、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基(C18)、辛酰基(C8)、十二烷酰基(C12)、C-20酰基、C24酰基、二辛酰基(2xC8)。靶向部分——药代动力学调节剂靶向部分可以经由生理学上不稳定的键、或例如二硫键、或PEG接头与多核苷酸连接。本发明还涉及在寡聚物和缀合物基团之间使用磷酸二酯接头(这些在本文中被称为区域B，并且适合地位于LNA寡聚物和碳水化合物缀合物基团之间)。
[0242] 为了靶向肝脏中肝实质细胞，优选的靶向配体是半乳糖簇。
[0243] 半乳糖簇包含具有例如包含二至四个末端半乳糖衍生物的分子。如在本文中所使用的，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和具有等于或大于半乳糖的脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力的半乳糖衍生物二者。末端半乳糖衍生物通过其C-l碳与分子连接。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)对于肝实质细胞来说是独特的并且结合支链半乳糖末端糖蛋白。优选的半乳糖簇具有三个各自具有对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力的末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。更优选的半乳糖簇具有三个末端N-乙酰基半乳糖胺。本领域中其他常见的术语包括三分支半乳糖、三价半乳糖和半乳糖三聚体。已知的是，三分支半乳糖衍生物簇以比二分支或单分支半乳糖衍生物结构更大的亲和力与ASGPr结合(Baenziger和Fiete，1980,Cell,22,611-620；Connolly等人，1982,1.Biol.Chern.,257,939-945)。需要多价以实现nM亲和力。根据WO 2012/083046，当与递送聚合物共同施用时，对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的单一半乳糖衍生物的连接不能实现体内RNAi多核苷酸向肝实质细胞的功能递送。
[0244] 半乳糖簇可以包含两个或优选三个各自与中心分支点连接的半乳糖衍生物。半乳糖衍生物通过糖的C-l碳与中心分支点连接。半乳糖衍生物优选经由接头或间隔体与分支点连接。优选的间隔体是柔性亲水性间隔体(美国专利5885968；Biessen等人，J.Med.Chern.1995Vol.39p.1538-1546)。优选的柔性亲水性间隔体是PEG间隔体。优选的PEG间隔体是PEG3间隔体。分支点可以是任何允许三个半乳糖衍生物连接并且进一步允许分支点与寡聚物连接的小分子。示例性的分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子含有三个胺基(三个半乳糖衍生物可以通过其连接)以及羧基反应性基团(二赖氨酸可以通过其与寡聚物连接)。可以通过接头或间隔体进行分支点与寡聚物的连接。优选的间隔体是柔性亲水性间隔体。优选的柔性亲水性间隔体是PEG间隔体。优选的PEG间隔体是PEG3间隔体(三个乙烯单元)。半乳糖簇可以利用本领域中已知的方法与寡聚物的3'或5'末端连接。
[0245] 优选的半乳糖衍生物是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的其他糖类可以选自包括下列的列表：半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺、和N-异丁酰基半乳糖胺。已经研究了许多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力(参见例如：Jobst,S.T.和Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686)或者使用本领域中典型的方法容易将其测定。
[0246]
[0247] 下面说明本发明的缀合物的另外的实例：
[0248]
[0249]
[0250] 在以上GalNac簇中的疏水性或亲脂性(或另外的缀合物)部分(即药代动力学调节剂)处的情况下，当使用BNA或LNA寡聚物时，缀合物是，如任选的LNA反义寡核苷酸。
[0251] 参见在本研究中使用的具体Galnac簇的图，Conj1、2、3、4以及Conj1a、2a、3a和4a(它们与将GalNac簇与寡聚物连接的任选的C6接头一起示出)。
[0252] Galnac簇(例如GalNAc)的各个碳水化合物部分因此可以经由间隔体，如(聚)乙二醇接头(PEG)，如二、三、四、五、六-乙二醇接头与寡聚物连接。如以上所示的，PEG部分形成半乳糖部分和肽(示出三赖氨酸)接头之间的间隔体。
[0253] 在一些实施方案中，GalNac簇包含肽接头，例如Tyr-Asp(Asp)三肽或Asp(Asp)二肽，其经由二基团接头与寡聚物(或与区域Y或区域B)连接，例如GalNac簇可以包含以下二基团接头：
[0254]
[0255] R1是优选选自下列的二基团：-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-环己基(-C6H10-)、1,4-苯基(-C6H4-)、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-或-C2H4(OC2H4)3-。
[0256] 碳水化合物缀合物(例如GalNAc)、或碳水化合物-接头部分(例如碳水化合物-PEG部分)可以经由分支点基团如氨基酸、或肽与寡聚物共价结合(连接)，所述分支点基团适宜地包含两个以上氨基(如3、4、或5个)，如赖氨酸、二赖氨酸或三赖氨酸或四赖氨酸。三赖氨酸分子含有四个胺基(三个碳水化合物缀合物基团，如半乳糖&衍生物(例如GalNAc)和另外的缀合物如疏水性或亲脂性部分/基团可以通过其连接)以及羧基反应性基团(三赖氨酸可以通过其与寡聚物连接)。另外的缀合物，如亲脂性/疏水性部分可以与连接至寡聚物的赖氨酸残基连接。
[0257] 药代动力学调节剂
[0258] 本发明的化合物还可以包含一个或多个额外的缀合物部分，其亲脂性或疏水性部分尤其是令人感兴趣，如当缀合物基团是碳水化合物部分时。此类亲脂性或疏水性部分可以起药代动力学调节剂的作用，并且可以任选地经由接头如生物可切割接头，与碳水化合物缀合物、将碳水化合物缀合物与寡聚物连接的接头或连接多个碳水化合物缀合物(多价)缀合物的接头共价连接，或者与寡聚物共价连接。
[0259] 寡聚物或缀合物部分因此可以包含药代动力学调节剂，如亲脂性或疏水性部分。此类部分在WO2012/082046中的siRNA缀合物的上下文中公开。疏水性部分可以包含
C8-C36脂肪酸，其可以是饱和的或不饱和的。在一些实施方案中，可以使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。疏水性基团可以具有16个以上碳原子。示例性的适合的疏水性基团可以选自包括下列的组：固醇、胆固醇、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基。根据WO’346，具有小于16个碳原子的疏水性基团在增强多核苷酸靶向方面不太有效，但是它们可以以多份使用(例如2x，如2x C8或C10、C12或C14)以增强功效。可用作多核苷酸靶向部分的药代动力学调节剂可以选自由以下组成的组：胆固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、和芳炔基，其每一个均可以是直链的、支链的或环状的。药代动力学调节剂优选为仅含有碳和氢原子的烃。然而，可以允许维持疏水性的取代基或杂原子，例如氟。
C8-C36脂肪酸，其可以是饱和的或不饱和的。在一些实施方案中，可以使用C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32和C34脂肪酸。疏水性基团可以具有16个以上碳原子。示例性的适合的疏水性基团可以选自包括下列的组：固醇、胆固醇、棕榈酰基、十六碳-8-烯酰基、油烯基、(9E,12E)-十八碳-9,12-二烯酰基、二辛酰基、和C16-C20酰基。根据WO’346，具有小于16个碳原子的疏水性基团在增强多核苷酸靶向方面不太有效，但是它们可以以多份使用(例如2x，如2x C8或C10、C12或C14)以增强功效。可用作多核苷酸靶向部分的药代动力学调节剂可以选自由以下组成的组：胆固醇、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、和芳炔基，其每一个均可以是直链的、支链的或环状的。药代动力学调节剂优选为仅含有碳和氢原子的烃。然而，可以允许维持疏水性的取代基或杂原子，例如氟。
[0260] 在一些实施方案中，缀合物是或可以包含碳水化合物或者包含碳水化合物基团。在一些实施方案中，碳水化合物选自由以下组成的组：半乳糖、乳糖、正乙酰半乳糖胺、甘露糖、和甘露糖-6-磷酸。在一些实施方案中，缀合物基团是或可以包含甘露糖或甘露糖-6-磷酸。碳水化合物缀合物可以用于在组织，如肝脏和/或肌肉范围内的递送或活性。参见，例如，EP1495769，WO99/65925，Yang等人，Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21，Zatsepin&Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17。
[0261] 意外地，本发明的发明人已经发现，与LNA寡聚物一起使用的GalNac缀合物不需要药代动力学调节剂，并且因此在一些实施方案中，GalNac缀合物不与亲脂性或疏水性部分如在本文中描述的那些共价连接，例如不包含C8-C36脂肪酸或固醇。因此本发明还提供不包含亲脂性或疏水性药代动力学调节剂或缀合物部分/基团的LNA寡聚物GalNac缀合物。
[0262] 亲脂性缀合物
[0263] 在一些实施方案中，缀合物基团是或可以包含亲脂性部分，如固醇(例如，胆固醇、胆固醇基、胆甾烷醇、豆甾醇、胆烷酸和麦角固醇)。在一些实施方案中缀合物是或包含生育酚。在一些实施方案中，缀合物是或可以包含胆固醇。
[0264] 在一些实施方案中，缀合物是或可以包含脂质、磷脂或亲脂性醇，如阳离子脂质、中性脂质、鞘脂、以及脂肪酸如硬脂酸、油酸、反油酸、亚油酸、反亚油酸、亚麻酸、和肉豆蔻酸。在一些实施方案中，脂肪酸包含C4-C30饱和或不饱和烷基链。烷基链可以是直链的或支链的。
[0265] 亲脂性缀合物部分可以用于，例如，反转寡聚化合物的亲水性并且增强细胞穿透。
[0266] 亲脂性部分包括，例如，固醇、甾烷醇、和类固醇以及有关化合物如胆固醇(美国专利号4,958,013和Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl Acids Res.,1992,20,533)、羊毛固醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角固醇、钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌激素酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄甾酮、脱氧皮质酮、可的松、17-羟基皮质酮、它们的衍生物等。在一些实施方案中，缀合物可以选自由以下组成的组：胆固醇、硫代胆固醇、羊毛固醇、粪甾醇、豆甾醇、麦角固醇、钙化醇、胆酸、脱氧胆酸、雌激素酮、雌二醇、雌三醇、孕酮、己烯雌酚、睾酮、雄甾酮、脱氧皮质酮、可的松、和17-羟基皮质酮。其他亲脂性缀合物部分包括脂族基团，如，例如，直链、支链、和环状的烷基、烯基、和炔基。脂族基团可以具有，例如，5至约50个、6至约50个、8至约50个、或10至约50个碳原子。脂族基团的实例包括十一烷基、十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、萜、冰片基、金刚烷基、它们的衍生物等。在一些实施方案中，脂族基中的一个或多个碳原子可以被杂原子如O、S、或N代替(例如，香叶基氧基己基)。另外的适合的亲脂性缀合物部分包括甘油的脂族衍生物如烷基甘油、双(烷基)甘油、三(烷基)甘油、甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。在一些实施方案中，亲脂性缀合物是二己基癸基-rac-甘油或1,2-二-O-己基癸基-rac-甘油(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；
Shea等人，Nuc.Acids Res.,1990,18,3777)或它们的膦酸酯。饱和和不饱和的脂肪官能团，如，例如，脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、和脂肪胺，还可以充当亲脂性缀合物部分。在一些实施方案中，脂肪官能团可以含有约6个碳至约30或约8至约22个碳。脂肪酸的实例包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二烷酸等。
Shea等人，Nuc.Acids Res.,1990,18,3777)或它们的膦酸酯。饱和和不饱和的脂肪官能团，如，例如，脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、和脂肪胺，还可以充当亲脂性缀合物部分。在一些实施方案中，脂肪官能团可以含有约6个碳至约30或约8至约22个碳。脂肪酸的实例包括癸酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二烷酸等。
[0267] 在进一步的实施方案中，亲脂性缀合物基团可以是具有6至约50、10至约50、或14至约40个碳原子的多环芳基。多环芳基的实例包括芘、嘌呤、吖啶、呫吨、芴、菲、蒽、喹啉、异喹啉、萘、它们的衍生物等。其他适合的亲脂性缀合物部分包括薄荷醇、三苯甲基(例如，二甲氧基三苯甲基(DMT))、吩 嗪、硫辛酸、磷脂、醚、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、它们的衍生物等。在本领域中充分地描述了寡聚化合物的亲脂性缀合物的制备，如在，例如Saison-Behmoaras等人，EMBO J.,1991,10,1111；Kabanov等人，FEBSLett.,1990，
259，327；Svinarchuk 等 人，Biochimie,1993,75,49；(Mishra等 人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229，以及Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651。
259，327；Svinarchuk 等 人，Biochimie,1993,75,49；(Mishra等 人，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229，以及Manoharan等人，Tetrahedron Lett.,1995,36,3651。
[0268] 含有对低密度脂蛋白(LDL)具有亲和力的缀合物部分的寡聚化合物可以辅助提供有效的靶向递送系统。对于LDL的受体在肿瘤细胞上的高表达水平使得LDL是用于药物向这些细胞的选择性递送的吸引人的载体(Rump等人，Bioconjugate Chem.,1998,9,341；Firestone，Bioconjugate Chem.,1994,5,105；Mishra 等 人，Biochim.Biophys.
Acta,1995,1264,229)。对LDL具有亲和力的部分包括许多亲脂性基团如类固醇(例如，胆固醇)、脂肪酸、它们的衍生物以及它们的组合。在一些实施方案中，具有LDL亲和力的缀合物部分可以是胆酸如鹅去氧胆酸和石胆酸的二油基酯。
Acta,1995,1264,229)。对LDL具有亲和力的部分包括许多亲脂性基团如类固醇(例如，胆固醇)、脂肪酸、它们的衍生物以及它们的组合。在一些实施方案中，具有LDL亲和力的缀合物部分可以是胆酸如鹅去氧胆酸和石胆酸的二油基酯。
[0269] 在一些实施方案中，亲脂性缀合物可以是或可以包含生物素。在一些实施方案中，亲脂性缀合物可以是或可以包含甘油酯(glyceride)或甘油酯(glyceride ester)。
[0270] 亲脂性缀合物，如固醇、甾烷醇、和他汀类(stain)，如胆固醇或如在本文中所公开的，可以用于增强寡核苷酸向例如肝脏(通常肝实质细胞)的递送。
[0271] 以下参考文献也涉及亲脂性缀合物的使用：Kobylanska等人，Acta Biochim Pol.(1999)；46(3):679-91.Felber等人，Biomaterials(生物材料)(2012)33(25):599-65)；Grijalvo 等 人，J Org Chem(2010)75(20):6806-13.Koufaki 等 人，Curr Med
Chem(2009)16(35):4728-42。Godeau等人J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6。
Chem(2009)16(35):4728-42。Godeau等人J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6。
[0272] 接头(例如区域Y)
[0273] 连接或接头是将一个目标化学基团或区段经由一个或多个共价键与另一个目标化学基团或区段连接的两个原子之间的连接。缀合物部分(或靶向或阻断部分)可以与寡聚化合物直接连接或通过连接部分(接头或系绳(tether))-接头连接。接头是用于将第三区域例如缀合物部分与寡聚化合物(如与区域B)共价连接的双官能部分。在一些实施方案中，接头包含链结构或重复单元如乙二醇或氨基酸单元的寡聚物。接头可以具有至少两个官能团，一个用于连接寡聚化合物并且另一个用于连接缀合物部分。接头官能团的实例可以是亲电的，用于与寡聚物或缀合物部分上的亲核基团反应，或者是亲核的，用于与亲电基团反应。在一些实施方案中，接头官能团包括氨基、羟基、羧酸、硫醇、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸酯、亚磷酸酯、不饱和(例如，双键或三键)等。接头的一些实例包括8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、6-氨基己氧基、4-氨基丁酸、4-氨基环己基羧酸、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(LCSMCC)、琥珀酰亚胺基间马来酰亚胺基苯甲酰酯(MBS)、琥珀酰亚胺基N-e-马来酰亚胺基己酰酯(EMCS)、琥珀酰亚胺基6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、琥珀酰亚胺基N-(a-马来酰亚胺基乙酸酯)(AMAS)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、β-丙氨酸(β-ALA)、苯基甘氨酸(PHG)、4-氨基环己酸(ACHC)、β-(环丙基)丙氨酸(β-CYPR)、氨基十二烷酸(ADC)、亚烷基二醇、聚乙二醇、氨基酸等。
[0274] 在本领域中已知各种各样的另外的接头基团，其可用于缀合物部分与寡聚化合物的连接。例如，在Antisense Research and Applications(反义研究与应用),S.T.Crooke和B.Lebleu,Eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,p.303-350中，可以找到许多可用的接头基团的综述。二硫醚连接已经用于将寡核苷酸的3'端与肽连接(Corey等人，Science1987,238,1401；Zuckermann等人，J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；以及Corey等人，J Am.Chem.Soc.1989,111,8524)。Nelson等人，Nuc.Acids Res.1989,17,7187描述了用于将生物素与寡核苷酸的3'-端连接的连接试剂。这种试剂N-Fmoc-O-DMT-3-氨基-1,2-丙二醇可以以3'-胺的名称商购自Clontech Laboratories(Palo Alto,Calif.)。其还可以以3'-氨基改性剂试剂的名称商购自Glen Research Corporation(Sterling,Va.)。如由Judy等人，Tetrahedron Letters(四面体通讯)1991,32,879报道的，这种试剂还用于将肽与寡核苷酸连接。用于与寡核苷酸的5'-端连接的类似的商业试剂是5'-氨基改性剂C6。这些试剂可从Glen Research Corporation(Sterling,Va.)获得。由Krieg等人，Antisense Research and Development(反义研究与发展)1991,1,161使用了这些化合物或类似的化合物以将荧光素与寡核苷酸的5'-端连接。其他化合物如吖啶已经经由聚亚甲基连接与寡核苷酸的3'-末端磷酸酯基连接(Asseline等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA
1984,81,3297)。[0074]以上基团中的任何一个均可以被用作单一接头或者与一个或多个另外的接头组合。
1984,81,3297)。[0074]以上基团中的任何一个均可以被用作单一接头或者与一个或多个另外的接头组合。
[0275] 接头及其在制备寡聚化合物的缀合物中的用途在整个本领域中提供，如在下列各项中：WO 96/11205和WO 98/52614和美国专利编号4,948,882；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,580,731；5,486,603；5,608,046；4,587,044；4,667,025；
5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5、510475；5,512,667；5,574,142；
5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；和6,335,437、Wo2012/083046，其中的每一个通过引用整体结合。
5,254,469；5,245,022；5,112,963；5,391,723；5、510475；5,512,667；5,574,142；
5,684,142；5,770,716；6,096,875；6,335,432；和6,335,437、Wo2012/083046，其中的每一个通过引用整体结合。
[0276] 如在本文中所使用的，生理学上不稳定的键是在哺乳动物体内通常所遇见的或与所遇见的那些相似的条件下可切割的不稳定的键(也被称为可切割接头)。选择生理学上不稳定的连接基团，从而当在某些生理条件下存在时使其经历化学转化(例如，切割)。哺乳动物的细胞内条件包括在哺乳动物细胞中发现的或者与在哺乳动物细胞中所遇到的那些相似的化学条件如pH、温度、氧化或还原条件或试剂、和盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常在哺乳动物细胞中存在的酶活性的存在，如蛋白水解或水解酶。在一些实施方案中，可切割接头对可以例如在靶标细胞中表达的一种或多种核酸酶敏感，并且因此，如在本文中所详述的，接头可以是短区域(例如1-10个)磷酸二酯连接的核苷，如DNA核苷。
[0277] 化学转化(不稳定键的切割)可以通过将药用试剂加入至细胞而开始，或者可以在含有不稳定键的分子达到适合的细胞内和/或细胞外环境时自发进行。例如，可以在分子进入酸化的内体时切割pH不稳定键。因此，可以认为pH不稳定键是内体可切割键。当暴露于酶，如内体或溶酶体中或细胞质中存在的那些时，可以将酶可切割的键切割。当分子进入细胞质的更具还原性的环境时，可以切割二硫键。因此，可以认为二硫键是细胞质可切割键。如在本文中所使用的，pH不稳定键是在酸性条件(pH<7)下选择性地断裂的不稳定键。此类键也可以被称为内体不稳定键，因为细胞内体和溶酶体具有小于7的pH。
[0278] 寡聚物连接的生物可切割缀合物
[0279] 寡聚化合物可以任选地包含位于寡聚物(被称为区域A)和缀合物(被称为区域C)之间的第二区域(区域B)。区域B可以是接头，如可切割接头(也被称为生理学上不稳定的连接)。(参见实施例7)
[0280] 核酸酶敏感的生理学上不稳定的连接：在一些实施方案中，本发明的寡聚物(也被称为寡聚化合物)(或缀合物)包含三个区域：
[0281] iv)第一区域(区域A)，其包含10-18个连续核苷酸；
[0282] v)第二区域(区域B)，其包含生物可切割接头
[0283] vi)第三区域(C)，其包含缀合物部分、靶向部分、活化部分，其中第三区域与第二区域共价连接。
[0284] 在一些实施方案中，区域B可以是磷酸酯核苷酸接头。例如，当缀合物是亲脂性缀合物，如脂质、脂肪酸、固醇，如胆固醇或生育酚时，可以使用此类接头。磷酸酯核苷酸接头也可以用于其他缀合物，例如碳水化合物缀合物，如GalNac。
[0285] 肽接头
[0286] 在一些实施方案中，生物可切割接头(区域B)是肽，如三赖氨酸肽接头，其可以在多GalNac缀合物如三GalNac缀合物中使用。其他在本领域中已知的可以使用的接头包括二硫键接头。
[0287] 磷酸酯核苷酸接头
[0288] 在一些实施方案中，区域B包含1-6个之间的核苷酸，其诸如经由核苷间连接基团如磷酸二酯连接与第一区域的5’或3’核苷酸共价连接，其中
[0289] a.第一和第二区域之间的核苷间连接是磷酸二酯连接并且与第一区域相邻[如直接相邻]的第二区域的核苷是DNA或RNA；和/或
[0290] b.第二区域的至少1个核苷是磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷；
[0291] 在一些实施方案中，区域A和区域B形成长度为12-22的核苷酸的单个连续核苷酸序列。
[0292] 在一些方面中，第一和第二区域之间的核苷间连接可以被认为是第二区域的一部分。
[0293] 在一些实施方案中，在第二和第三区域之间存在含磷连接基团。磷连接基团可以是，例如，磷酸酯(磷酸二酯)基、硫代磷酸酯基、二硫代磷酸酯基、或硼代磷酸酯基。在一些实施方案中，这种含磷连接基团位于第二区域和与第三区域连接的接头区域之间。在一些实施方案中，磷酸酯基是磷酸二酯。
[0294] 因此，在一些方面中，寡聚化合物包含至少两个磷酸二酯基，其中至少一个正如根据以上发明陈述的，并且另一个位于第二和第三区域之间，任选在接头基团和第二区域之间。
[0295] 在一些实施方案中，第三区域是活化基团，如在缀合中使用的活化基团。就此而言，本发明还提供一种活化的寡聚物，所述活化的寡聚物包含区域A和B以及活化基团，例如适用于随后与第三区域连接，如适用于缀合的中间体。
[0296] 在一些实施方案中，第三区域是反应性基团，如在缀合中使用的反应性基团。就此而言，本发明还提供一种寡聚物，所述寡聚物包含区域A和B以及反应性基团，例如适用于随后与第三区域连接，如适用于缀合的中间体。在一些实施方案中，反应性基团可以包含胺基或醇基，如胺基。
[0297] 在一些实施方案中，区域A包含至少一个，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或21个不同于磷酸二酯的核苷间连接，如(任选地、独立地)选自由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、和硼代磷酸酯组成的组的核苷间连接、以及甲基膦酸酯，如硫代磷酸酯。在一些实施方案中，区域A包含至少一个硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，区域A内的至少50％，如至少75％，如至少90％的核苷间连接，如所有核苷间连接不同于磷酸二酯，例如是硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，区域A中的所有核苷间连接是不同于磷酸二酯。
[0298] 在一些实施方案中，寡聚化合物包含反义寡核苷酸，如反义寡核苷酸缀合物。反义寡核苷酸可以是或者可以包含第一区域，以及任选地第二区域。就此而言，在一些实施方案中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核碱基序列的一部分。在其它实施方案中，区域B可以缺少与靶标的互补性。
[0299] 换言之，在一些实施方案中，本发明提供一种非磷酸二酯连接，如硫代磷酸酯连接的寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)，其具有至少一个经由磷酸二酯连接与相邻寡核苷酸的核苷连接的末端(5'和/或3')DNA或RNA核苷，其中所述末端DNA或RNA核苷任选经由接头部分与缀合物部分、靶向部分或阻断部分进一步共价连接。
[0300] 在一些实施方案中，寡聚化合物包含反义寡核苷酸，如反义寡核苷酸缀合物。反义寡核苷酸可以是或者可以包含第一区域，以及任选的第二区域。就此而言，在一些实施方案中，区域B可以形成与(核酸)靶标互补的连续核碱基序列的一部分。在其它实施方案中，区域B可以缺少与靶标的互补性。
[0301] 在一些实施方案中，第二区域的至少两个连续核苷是DNA核苷(如至少3或4或5个连续DNA核苷酸)。
[0302] 在这种实施方案中，可以根据下式描述本发明的寡核苷酸：
[0303] 5’-A-PO-B[Y)X-3’或3’-A-PO-B[Y)X-5’
[0304] 其中A是区域A，PO是磷酸二酯连接，B是区域B，Y是任选的连接基团，并且X是缀合物、靶向、阻断基团或反应性或活化基团。
[0305] 在一些实施方案中，区域B包含3’-5’或5’-3’：i)区域A的5’核苷的磷酸二酯连接，ii)DNA或RNA核苷，如DNA核苷，和iii)另外的磷酸二酯连接
[0306] 5’-A-PO-B-PO-3’或3’-A-PO-B-PO-5’
[0307] 另外的磷酸二酯连接将具有一个或多个另外的核苷、如一个或多个DNA或RNA核苷的区域B核苷连接，或者可以任选经由连接基团(Y)与X(是缀合物、靶向或阻断基团或反应性或活化基团)连接。
[0308] 在一些实施方案中，区域B包含3’-5’或5’-3’：i)区域A的5’核苷的磷酸二酯连接，ii)2-10个之间的DNA或RNA磷酸二酯连接的核苷，如DNA核苷，以及任选地iii)另外的磷酸二酯连接：
[0309] 5’-A-[PO-B]n-[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n-[Y]-X 5’
[0310] 5’-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 3’或3’-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 5’
[0311] 其中A表示区域A，[PO-B]n表示区域B，其中n是1-10，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，PO是在区域B和X(或Y，如果存在的话)之间的任选的磷酸二酯连接基团。
[0312] 在一些实施方案中，本发明提供根据(或包含)下式之一的化合物：
[0313] 5’[区域A]-PO-[区域B]3’-Y-X
[0314] 5’[区域A]-PO-[区域B]-PO 3’-Y-X
[0315] 5’[区域A]-PO-[区域B]3’-X
[0316] 5’[区域A]-PO-[区域B]-PO 3’-X
[0317] 3’[区域A]-PO-[区域B]5’-Y-X
[0318] 3’[区域A]-PO-[区域B]-PO 5’-Y-X
[0319] 3’[区域A]-PO-[区域B]5’-X
[0320] 3’[区域A]-PO-[区域B]-PO 5’-X
[0321] 区域B可以例如包含下列或者由其组成：
[0322] 5’DNA3’
[0323] 3’DNA 5’
[0324] 5’DNA-PO-DNA-3’
[0325] 3’DNA-PO-DNA-5’
[0326] 5’DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
[0327] 3’DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
[0328] 5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
[0329] 3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
[0330] 5’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3’
[0331] 3’DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5’
[0332] 应认识到的是，磷酸酯连接的生物可切割接头可以采用除DNA和RNA外的核苷。例如，可以使用实施例7中的测定来鉴别生物可切割核苷酸接头。
[0333] 在一些实施方案中，本发明的化合物包含生物可切割接头(也被称为生理学上不稳定的接头、核酸酶敏感的生理学上不稳定的连接、或核酸酶敏感的接头)，例如磷酸酯核苷酸接头(如区域B)或将寡聚物(或连续核苷酸序列或区域A)与缀合物部分(或区域C)连接的肽接头。
[0334] 在实施例7中所示的测定中对切割的易感性可以用于确定接头是生物可切割的还是生理学上不稳定的。
[0335] 根据本发明的生物可切割接头是指在靶标组织中，例如在肝脏和/或肾脏中对切割敏感的(即生理学上不稳定的)接头。优选的是，靶标组织所见到的切割速率大于在血清中所发现的。在实施例6中找到了用于测定组织(例如肝脏或肾脏)中和血清中切割的水平(％)的适合的方法。在一些实施方案中，在实施例7的肝脏或肾脏匀浆测定中，在本发明的化合物中，生物可切割接头(也被称为生理学上不稳定的接头、或核酸酶敏感接头)，如区域B，是至少约20％切割的，如至少约30％切割的，如至少约40％切割的，如至少约50％切割的，如至少约60％切割的，如至少约70％切割的，如至少约75％切割的。在一些实施方案中，如在实施例7中的测定中所使用的，血清中的切割(％)小于约30％、小于约20％，如小于约10％，如小于5％，如小于约1％。
[0336] 在一些可以相同或不同的实施方案中，在本发明的化合物中，生物可切割接头(也被称为生理学上不稳定的接头、或核酸酶敏感接头)，如区域B对S1核酸酶切割敏感。可以使用实施例7中所示的S1核酸酶测定来评价对S1切割的易感性。在一些实施方案中，在根据实施例7中使用的测定用S1核酸酶温育120min之后，在本发明的化合物中，生物可切割接头(也被称为生理学上不稳定的接头、或核酸酶敏感接头)，如区域B，是至少约
30％切割的，如至少约40％切割的，如至少约50％切割的，如至少约60％切割的，如至少约
70％切割的，如至少约80％切割的，如至少约90％切割的，如至少95％切割的。
30％切割的，如至少约40％切割的，如至少约50％切割的，如至少约60％切割的，如至少约
70％切割的，如至少约80％切割的，如至少约90％切割的，如至少95％切割的。
[0337] 第二区域中的序列选择：
[0338] 在一些实施方案中，当寡核苷酸区域A和B与互补靶标序列比对时，区域B不形成互补序列。
[0339] 在一些实施方案中，当寡核苷酸区域A和B与互补靶标序列比对时，区域B形成互补序列。就此而言，区域A和B可以一起形成与靶标序列互补的单一连续序列。
[0340] 在一些实施方案中，基于靶标组织或细胞或子细胞区室中存在的主要的核酸内切酶裂解酶，选择区域B中碱基的序列以提供最佳的核酸内切酶酶切位点。就此而言，通过从靶标组织和非靶标组织中分离细胞提取物，可以基于与非靶标细胞(例如肾脏)相比在所需靶标细胞(例如肝脏/肝实质细胞)中的优先切割活性，选择在区域B中使用的核酸内切酶切割序列。就此而言，可以针对所需的组织/细胞优化用于靶标下调的化合物的效力。
[0341] 在一些实施方案中，区域B包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC、或GG的二核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，和/或T可以被U代替。在一些实施方案中，区域B包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC、和GGG的三核苷酸，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，和/或T可以被U代替。在一些实施方案中，区域B包含序列AAAX、AATX、AACX、AAGX、ATAX、ATTX、ATCX、ATGX、ACAX、ACTX、ACCX、ACGX、AGAX、AGTX、AGCX、AGGX、TAAX、TATX、TACX、TAGX、TTAX、TTTX、TTCX、TAGX、TCAX、TCTX、TCCX、TCGX、TGAX、TGTX、TGCX、TGGX、CAAX、CATX、CACX、CAGX、CTAX、CTGX、CTCX、CTTX、CCAX、CCTX、CCCX、CCGX、CGAX、CGTX、CGCX、CGGX、GAAX、GATX、GACX、CAGX、GTAX、GTTX、GTCX、GTGX、GCAX、GCTX、GCCX、GCGX、GGAX、GGTX、GGCX、和GGGX的三核苷酸，其中X可以选自由A、T、U、G、C及其类似物组成的组，其中C可以是5-甲基胞嘧啶和/或T可以被U代替。应认识到的是，当提及(自然存在的)核碱基A、T、U、G、C时，这些可以被发挥等同的天然核碱基(例如具有互补的核苷的碱基对)的作用的核碱基类似物取代。
[0342] 氨基烷基中间体
[0343] 本发明还提供包含反义LNA寡聚物的LNA寡聚物中间体，所述反义LNA寡聚物包含(例如末端，5’或3’)氨基烷基，如C2-C36氨基烷基，包括，例如C6和C12氨基烷基。可以将氨基烷基加入至LNA寡聚物作为标准寡核苷酸合成的一部分，例如使用(例如受保护的)氨基烷基亚磷酰胺。氨基烷基和LNA寡聚物之间的连接基团可以是例如硫代磷酸酯或磷酸二酯，或者例如，是在本文中所提及的其他核苷连接基团中的一个。氨基烷基可以与例如LNA寡聚物的5’或3’共价连接，如通过核苷连接基团，如硫代磷酸酯或磷酸二酯连接。
[0344] 本发明还提供包括LNA寡聚物的连续合成，如固相寡核苷酸合成的LNA寡聚物的合成方法，所述方法包括，如，例如，在寡核苷酸合成的第一轮或最后一轮期间，将氨基烷基加入至寡聚物的步骤。合成方法还可以包括使缀合物与氨基烷基-LNA寡聚物反应的步骤(缀合步骤)。缀合物可以包含适合接头和/或分支点基团，以及任选地，另外的缀合物基团，如在本文中所描述的疏水性或亲脂性基团。缀合步骤可以在将寡聚物与固体载体结合的同时进行(例如，在寡核苷酸合成之后，但是在从固体载体上洗脱寡聚物之前)，或者随后进行(即在洗脱之后)。本发明提供氨基烷基接头在本发明的寡聚物的合成中的用途。
[0345] 制造/合成的方法
[0346] 本发明提供合成(或制造)寡聚化合物，如本发明的寡聚化合物的方法，所述方法包括下列各项之一：
[0347] a)提供下列各项中的一个[第三区域]与其连接的[固相]寡核苷酸合成载体的步骤：
[0348] i)接头基团(-Y-)
[0349] ii)选自由以下组成的组的基团：缀合物、靶向基团、阻断基团、反应性基团[例如胺或醇]或活化基团(X-)
[0350] iii)-Y-X基团
[0351] 以及
[0352] b)区域B和随后的区域A的[连续]寡核苷酸合成的步骤，
[0353] 和/或：
[0354] c)第一区域(A)和第二区域(B)的[连续]寡核苷酸合成的步骤，其中合成步骤之后是
[0355] d)加入第三区域的步骤[包含亚磷酰胺]
[0356] i)接头基团(-Y-)
[0357] ii)选自由以下组成的组的基团：缀合物、靶向基团、阻断基团、反应性基团[例如胺或醇]或活化基团(X-)
[0358] iii)-Y-X基团
[0359] 之后是
[0360] e)从[固相]载体上切割寡聚化合物
[0361] 其中，所述方法任选还包括选自下列各项的另外的步骤：
[0362] f)其中第三基团是活化基团，将活化基团活化以制备反应性基团、接着任选经由接头基团(Y)将缀合物、阻断、或靶向基团加入至反应性基团的步骤；
[0363] g)其中第三区域是反应性基团，任选经由接头基团(Y)将缀合物、阻断、或靶向基团加入至反应性基团的步骤。
[0364] h)其中第三区域是接头基团(Y)，将缀合物、阻断、或靶向基团加入至接头基团(Y)的步骤。
[0365] 其中步骤f)、g)或h)在从寡核苷酸合成载体切割寡聚化合物之前或之后进行。在一些实施方案中，该方法可以利用标准亚磷酰胺化学，并且因此可以在结合至寡聚物中之前提供作为亚磷酰胺的区域X和/或区域X或区域X和Y。请参见图5-10，其说明了本发明的方法的非限制性方面。
[0366] 本发明提供合成(或制造)寡聚化合物，如本发明的寡聚化合物的方法，所述方法包括：
[0367] 第一区域(A)和任选地第二区域(B)的[连续]寡核苷酸合成的步骤，其中合成步骤之后是加入第三区域的步骤[包含亚磷酰胺的]区域X(也被称为区域C)或Y，如包含选自由以下组成的组的基团的区域：缀合物、靶向基团、阻断基团、官能团、反应性基团[例如胺或醇]或活化基团(X)，或-Y-X基团，随后进行从[固相]载体切割寡聚化合物。
[0368] 然而，应认识到的是，可以在从固体载体上切割之后加入区域X或X-Y。备选地，合成方法可以包括合成第一(A)和任选的第二区域(B)、接着从载体上切割寡聚物的步骤，以及随后的将第三区域如X或X-Y基团加入至寡聚物的步骤。借助实例，通过在寡聚物合成(在载体上)的最终步骤中加入氨基亚磷酰胺单元，在从载体上切割之后其可以用于任选经由X或Y(当存在时)基团上的活化基团与X或X-Y基团连接可以实现第三区域的加入。在其中可切割接头不是核苷酸区域的实施方案中，区域B可以是非核苷酸可切割接头，例如肽接头，其可以形成区域X(也被称为区域C)的一部分或者是区域Y(或其一部分)。
[0369] 在该方法的一些实施方案中，区域X(如C)或(X-Y)，如缀合物(例如GalNAc缀合物)包含活化基团，(活化的官能团)，并且在该合成方法中，将活化的缀合物(或区域x、或X-Y)加入至第一和第二区域中，如氨基连接的寡聚物。可以借助标准亚磷酰胺化学将氨基加入至寡聚物中，例如作为寡聚物合成的最终步骤(这通常将会在寡聚物的5’末端处产生氨基)。例如，在寡核苷酸合成的最后一步期间，使用受保护的氨基烷基亚磷酰胺，例如TFA-氨基C6亚磷酰胺(6-(三氟乙酰基氨基)-己基-(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)-亚磷酰胺)。可以通过NHS酯法活化区域X(或如在本文中所提及的区域C)，如缀合物(例如GalNac缀合物)，并且之后加入氨基连接的寡聚物。例如，可以使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为用于用于区域X(或区域C，如缀合物，如GalNac缀合物部分)的活化基团。本发明提供通过本发明的方法制备的寡聚物。
[0370] 在一些实施方案中，区域X和/或区域X或区域X和Y可以经由磷酸酯核苷连接(如在本文中所描述的那些，包括磷酸二酯或硫代磷酸酯)或经由备选的基团(如三唑基团)与区域B共价结合(连接)。
[0371] 在一些实施方案中，第一和第二区域之间的核苷间连接是与第二区域的第一(或仅仅是)DNA或RNA核苷连接的磷酸二酯，或者区域B包含至少一个磷酸二酯连接的DNA或RNA核苷。
[0372] 在一些实施方案中，第二区域可以包含可以是磷酸二酯连接的另外的DNA或RNA核苷。第二区域进一步与第三区域共价连接，所述第三区域可以是例如缀合物、靶向基团、反应性基团、和/或阻断基团。
[0373] 在一些方面中，本发明基于提供不稳定区域，第二区域，连接第一区域，例如反义寡核苷酸，以及缀合物或官能团，例如靶向或阻断基团。不稳定区域包含至少一个磷酸二酯连接的核苷，如DNA或RNA核苷，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸二酯连接的核苷，如DNA或RNA。在一些实施方案中，寡聚化合物包含可切割的(不稳定)接头。就此而言，可切割接头优选存在于区域B中(或者在一些实施方案中，在区域A和B之间)。
[0374] 换言之，在一些实施方案中，本发明提供一种非磷酸二酯连接的，如硫代磷酸酯连接的寡核苷酸(例如反义寡核苷酸)，其具有至少一个经由磷酸二酯连接与相邻寡核苷酸的核苷连接的末端(5'和/或3')DNA或RNA核苷，其中所述末端DNA或RNA核苷任选经由接头部分与缀合物部分、靶向部分或阻断部分进一步共价连接。
[0375] 组合物
[0376] 本发明的寡聚物可以在药物制剂和组合物中使用。适宜地，此类组合物包括药用稀释剂、载体、盐或辅剂。WO2007/031091提供了适合的和优选的药用稀释剂、载体和辅剂，其通过引用结合于此。在WO2007/031091中还提供了适合的适合的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与用其他治疗剂的组合、前药制剂，其也通过引用结合于此。
[0377] 应用
[0379] 在研究中，此类寡聚物可以用于特异性抑制细胞和实验动物中APOB蛋白质的合成(通常通过降解或抑制mRNA并且由此阻止蛋白质形成)，因此有助于靶标的功能分析或者其作为用于治疗干预的靶标的可用性的评价。
[0380] 在诊断中，寡聚物可以用于通过RNA印迹、原位杂交或类似的技术检测并量化细胞和组织中的APOB表达。
[0381] 对于治疗来说，通过施用根据本发明的寡聚化合物，治疗可以通过调节APOB的表达而治疗的怀疑患有疾病或病症的动物或人。还提供了，通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡聚物或组合物，治疗哺乳动物，如治疗怀疑患有与APOB的表达相关的疾病或病况或具有这种倾向的人的方法。通常以有效量施用根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。
[0382] 本发明还提供所描述的本发明的化合物或缀合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗如在本文中所提及的病症，或者提供治疗如在本文中所提及的病症的方法。
[0383] 本发明还提供用于治疗如在本文中所提及的病症的方法，所述方法包括向需要其的患者施用如在本文中描述的根据本发明的化合物、和/或根据本发明的缀合物、和/或根据本发明的药物组合物。
[0384] 医学适应症
[0385] 根据本发明的寡聚物和其他组合物可以用于治疗与ApoB的突变形式的过度表达或表达相关的病况。
[0386] 本发明还提供本发明的化合物在制造药物中的用途，所述药物用于治疗如在本文中所提及的疾病、病症或病况。
[0387] 概括而言，本发明的一个方面涉及治疗罹患与APOB的异常水平和/或活性相关的病况或对所述病况敏感的哺乳动物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的被靶向至APOB的包含一种或多种LNA单元的寡聚物。通常以有效量施用根据本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。
[0388] 在一些实施方案中，如在本文中所提及的疾病或病症可能与APOB基因或其蛋白质产物与APOB相关或相互作用的基因中的突变有关。因此，在一些实施方案中，靶标mRNA是APOB序列的突变形式。
[0389] 本发明的令人感兴趣的方面涉及如在本文中定义的寡聚物(化合物)或如在本文中定义的缀合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗如在本文中所提及的疾病、病症或病况。
[0390] 优选采用本发明的方法，用于治疗或预防由异常的APOB水平和/或活性导致的疾病。
[0391] 换言之，在一些实施方案中，本发明还涉及用于治疗异常的APOB水平和/或活性的方法，所述方法包括向需要其的患者施用本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合物。
[0392] 本发明还涉及如在本文中定义的用作药物的寡聚物、组合物或缀合物。
[0393] 本发明还涉及如在本文中定义的化合物、组合物、或缀合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗异常的APOB水平和/或活性或APOB的突变形式(如等位基因变体，如与在本文中提及的疾病之一有关的那些)的表达。
[0394] 此外，本发明涉及治疗罹患如在本文中所提及的那些疾病或病况的受试者的方法。
[0395] 需要治疗的患者是罹患或可能罹患所述疾病或病症的患者。
[0396] 在一些实施方案中，如在本文中所使用的术语“治疗”是指治疗现有疾病(例如，如在本文中所提及的疾病或病症)或防止疾病，即预防二者。因此，应认识到的是，在一些实施方案中，如在本文中所提及的治疗可以是预防性的。
[0397] 在一个实施方案中，本发明涉及包含用于治疗高胆固醇血症和相关病症的化合物或组合物，或使用此类用于治疗高胆固醇血症和相关病症的化合物或组合物的治疗方法，其中当提及高胆固醇血症时术语“相关病症”是指选自由以下组成的组的病况中的一种或多种：动脉粥样硬化(atherosclerosis)，高脂血症(hyperlipidemia)，高胆固醇血症(hypercholesterolemia)，家族性高胆固醇血症(familiar hypercholesterolemia)如APOB的功能突变获得，HDL/LDL胆固醇不平衡(cholesterol imbalance)，异常脂血症(dyslipidemias)，例如家族性高脂血症(FCHL)、获得性高脂血症(acquired hyperlipidemia)、耐他汀类的高胆固醇血症(statin-resistanthypercholesterolemia)、冠状动脉疾病(coronary artery disease，CAD)、和冠心病(coronary heart disease，CHD)。
实施例
实施例
[0398] 寡核苷酸
[0399] 靶向ApoB的化合物
[0400] 寡核苷酸序列基序
[0401]GCATTGGTATTCA(SEQ ID NO 1)
GTTGACACTGTC(SEQ ID NO 2)
GTTGACACTGTC(SEQ ID NO 2)
[0402]
[0403]
[0404] 具有FAM标记物缀合物的靶向ApoB的化合物
[0405]SEQ ID Seq(5’-3’) 可切割接头(B) 缀合物(C)
9 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’tca3’) FAM
10 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
11 GCattggtatTCA 1PO-DNA(5’a3’) FAM
12 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’gac3’) FAM
13 GCattggtatTCA 无 FAM
9 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’tca3’) FAM
10 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
11 GCattggtatTCA 1PO-DNA(5’a3’) FAM
12 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’gac3’) FAM
13 GCattggtatTCA 无 FAM
[0406]SEQ ID NO Seq(5’-3’) 可切割接头(B) 缀合物
14 GCattggtatTCA 无 叶酸
15 GCattggtatTCA SS 叶酸
16 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 叶酸
17 GCattggtatTCA 无 单GalNAc
18 GCattggtatTCA SS 单GalNAc
19 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 单GalNAc
20 GCattggtatTCA GalNAc簇Conj2a
21 GCattggtatTCA 无 FAM
22 GCattggtatTCA SS FAM
23 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
24 GCattggtatTCA 无 生育酚
25 GCattggtatTCA SS 生育酚
26 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 生育酚
14 GCattggtatTCA 无 叶酸
15 GCattggtatTCA SS 叶酸
16 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 叶酸
17 GCattggtatTCA 无 单GalNAc
18 GCattggtatTCA SS 单GalNAc
19 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 单GalNAc
20 GCattggtatTCA GalNAc簇Conj2a
21 GCattggtatTCA 无 FAM
22 GCattggtatTCA SS FAM
23 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
24 GCattggtatTCA 无 生育酚
25 GCattggtatTCA SS 生育酚
26 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 生育酚
[0407]30 GCattggtatTCA GalNAc簇Conj1a
[0408]SEQ ID NO Seq(5’-3’) 可切割接头(B)
7 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
20 GCattggtatTCA GalNAc簇Conj2a
28 GTtgacactgTC 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
29 GTtgacactgTC GalNAc簇Conj2a
31 GTtgacactgTC GalNAc簇Conj1a
7 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
20 GCattggtatTCA GalNAc簇Conj2a
28 GTtgacactgTC 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
29 GTtgacactgTC GalNAc簇Conj2a
31 GTtgacactgTC GalNAc簇Conj1a
[0410] 剂量施用和取样：
[0411] 使用7-10周龄C57Bl6-N小鼠，将动物年龄和性别匹配(雌性用于研究1、2和4，研究3中为雄性)。将化合物静脉内(i.v.)注射至尾部静脉中。对于中间血清取样，通过面静脉穿刺收集2-3滴血液，最后的血液从下腔静脉中获取。在含凝胶的血清分离管(Greiner)中收集血清并且保持冷冻直到分析。
[0412] 用在盐水中根据所示的信息配制的1mg/kg ASO的单剂量(或所示的量)或单独盐水对C57BL6小鼠静脉内给药。例如在给药之后第4天或第7天(或所示的时间)将动物处死并且对肝脏和肾脏取样。
[0413] RNA分离和mRNA分析：使用Qantigene mRNA量化试剂盒(“bDNA-测定”，Panomics/Affimetrix)，按照制造商规程，从组织进行mRNA分析。对于组织裂解物，通过在1ml含有蛋白酶K的裂解缓冲液中超声波处理将50-80mg的组织裂解。裂解物直接用于bDNA测定而不经过RNA提取。由Panomics定制设计得到用于靶标和GAPDH的探针组。为了分析，将得到的用于靶标基因的发光单元标准化为管家GAPDH。
[0414] 在“Cobas INTEGRA 400plus”临床化学平台(Roche Diagnostics)上，使用10μl的血清进行对ALT、AST和胆固醇的血清分析。
[0415] 对于凝血因子VII血清水平的量化，根据制造商规程使用BIOPHEN FVII酶活性试剂盒(#221304，Hyphen BioMed)。
[0416] 对于寡核苷酸量化，将荧光标记的PNA探针与组织裂解物中目标寡核苷酸(oligo)杂交。对于bDNA测定，使用相同的裂解物，仅利用精确称重的组织。使用AEX-HPLC和荧光检测量化异源双链体。
[0417] 实施例1：化合物的合成
[0418] 以4μmol的规模在Expedite 8900/MOSS合成仪(多寡核苷酸合成系统)上使用亚磷酰胺法在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。在合成的终点，使用氨水在室温下将寡核苷酸从固体载体上切割1-2小时，并且在65℃进一步进行去保护16小时。将寡核苷酸通过反相HPLC(RP-HPLC)纯化并且通过UPLC描述特征，并且通过ESI-MS进一步确认分子量。更多细节，参见以下。
[0419] 寡核苷酸的延伸
[0420] 通过使用0.1M的5’-O-DMT-保护的亚酰胺(amidite)在乙腈中和作为活化剂的DCI(4,5-二氰基咪唑)在乙腈中(0.25M)的溶液，进行β-氰基乙基-亚磷酰胺
(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-S-S接头)的偶联。对于最终的循环，以0.1M在DCM中使用可商购的C6-连接的胆固醇亚磷酰胺。通过使用氢化苍耳烷(xanthane)(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)，进行用于引入硫代磷酸酯的硫醇化。使用在THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘引入二磷酸酯连接。其余的试剂是典型地用于寡核苷酸合成的试剂。对于固相合成后缀合，在固相合成的最后一次循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在去保护和从固体载体上切割之后，分离氨基连接的去保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化将缀合物引入。
(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T或C6-S-S接头)的偶联。对于最终的循环，以0.1M在DCM中使用可商购的C6-连接的胆固醇亚磷酰胺。通过使用氢化苍耳烷(xanthane)(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)，进行用于引入硫代磷酸酯的硫醇化。使用在THF/吡啶/水7:2:1中的0.02M碘引入二磷酸酯连接。其余的试剂是典型地用于寡核苷酸合成的试剂。对于固相合成后缀合，在固相合成的最后一次循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在去保护和从固体载体上切割之后，分离氨基连接的去保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化将缀合物引入。
[0421] 借助RP-HPLC的纯化：
[0422] 通过制备RP-HPLC在Phenomenex Jupiter C1810μ150x10mm柱上将粗化合物纯化。在5mL/分钟的流速下，使用0.1M乙酸铵pH 8和乙腈作为缓冲液。将收集的级分冻干得到通常为白色固体的纯化的化合物。
[0423] 缩写：
[0424] DCI：4,5-二氰基咪唑
[0425] DCM：二氯甲烷
[0426] DMF：二甲基甲酰胺
[0427] DMT：4,4'-二甲氧基三苯甲基
[0428] THF：四氢呋喃
[0429] Bz：苯甲酰基
[0430] Ibu：异丁酰基
[0431] RP-HPLC：反相高效液相色谱法
[0432] 实施例2：LNA反义寡核苷酸的设计
[0433] 在实施例和附图中使用的寡聚物。SEQ#是在整个实施例和附图中使用的标识符。
[0434]
[0435] 实施例3.利用胆固醇缀合物的ApoB mRNA的体内敲减。
[0436] 用单一剂量盐水或1mg/kg未缀合LNA-反义寡核苷酸(#3)或等摩尔量的利用不同接头与胆固醇缀合的LNA反义寡核苷酸对C57BL6/J小鼠进行注射，并且根据下表在第1-10天处死。从肝脏和肾脏中分离RNA并且利用ApoB特异性引物和探针进行qPCR以分析ApoB mRNA敲减。
[0437] 结论：利用由2或3个具有磷酸二酯骨架的DNA组成的接头(Seq#4和5)与ApoB LNA反义寡核苷酸缀合的胆固醇显示出对肝脏ApoB的特异性敲减的偏好(图11)。与未缀合的化合物(Seq#3)相比，并且与具有稳定接头(Seq#4)和具有二硫醚接头(Seq.#5)的胆固醇缀合物连同肾脏组织中Seq#6和#7的较少敲减活性相比，这种方式增加了肝脏组织中ApoB mRNA敲减的效率和持续时间。
[0438] 材料和方法：
[0439] 实验设计：
[0440]
[0441]
[0442] 剂量施用。以10ml/kg BW(根据第0天的体重)的根据上表在盐水中配制的化合物或单独盐水，对送达时大约20g的C57BL/6JBom雌性动物进行静脉内给药。
[0443] 肝脏和肾脏组织的取样。根据上表将动物用70％CO2-30％O2麻醉并且通过颈椎脱臼处死。将一半大肝叶和一个肾脏切碎并且浸入RNAlater中。
[0444] 总RNA分离和第一链合成。在RLT-裂解缓冲液的存在下，使用QiagenRNeasy试剂盒(Qiagen cat.no.74106)，根据厂商说明书，从最多30mg的通过珠磨均化的组织中提取总RNA。使用来自Ambion的反转录酶试剂，根据厂商说明书，进行第一链合成。
[0445] 对于每个样品来说，利用无RNA酶的H2O将0.5μg总RNA调节为(10.8μl)，并且与2μl随机十聚体(50μM)和4μl dNTP混合物(每个dNTP为2.5mM)混合，并且在3分钟内加热至70℃，之后将样品在冰上迅速冷却。将2μl 10x缓冲液RT、1μl MMLV反转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)加入至每个样品中，接着在42℃下温育60分钟，在95℃下进行酶的热失活10分钟，并且之后将样品冷却至4℃。将cDNA样品以1:5稀释，并且使用Taqman快速通用PCR主混合物(Fast Universal PCR Master Mix)2x(Applied Biosystems Cat#4364103)和Taqman基因表达测定(mApoB、Mn01545150_m1和mGAPDH#4352339E)按照制造商规程进行RT-QPCR，并且在Applied Biosystems
RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行处理。
RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行处理。
[0446] 实施例4.利用不同缀合物的ApoB mRNA的体内沉默。
[0447] 为了研究不同缀合部分和接头对ApoB化合物的活性的影响，使用不可切割接头或生物可切割接头(二硫基(SS)或2个具有磷酸二酯骨架(PO)的DNA核苷酸)将SeqID#3与单GalNAc、叶酸、FAM或生育酚缀合。另外，将单GalNAc与GalNAc簇(缀合物2a)比较。用盐水对照或用单剂量的1或0,25mg/kg的ASO缀合物静脉内处理C57BL6In小鼠。
在7天之后，将动物处死并且从肝脏和肾脏样品中分离RNA并且分析ApoB mRNA表达(图
15)。
在7天之后，将动物处死并且从肝脏和肾脏样品中分离RNA并且分析ApoB mRNA表达(图
15)。
[0448] 结论：与未缀合的ApoB化合物(#3)相比，利用DNA/PO-接头(#26)与ApoB化合物缀合的生育酚增加了肝脏中的ApoB敲减，同时降低了肾脏中的活性(比较图15A和B)。这指出了生育酚将ApoB化合物从肾脏重新导向至肝脏的能力。不可切割的(#24)和SS-接头(#25)在两个组织中均是非活性的。具有不可切割的(#17)和具有生物可切割的DNA/PO接头(#19)的单GalNAc缀合物显示出保持肾脏中的未缀合化合物(#3)的活性同时提高肝脏中的活性的倾向。SS-接头的引入降低了两个组织中的活性(比较图15A和B)。不同GalNAc缀合物例如单GalNAcPO(#19)和GalNAc簇(#20)的缀合还允许焦点集中在肝脏或肾脏的化合物活性的细微调节(图15C)。具有可切割DNA/PO-接头(SEQ ID No 16和
23)的叶酸和FAM缀合物表现出可与未缀合化合物(3)相比的行为。在这里，不可切割的(14和21)或SS-接头(15和22)的引入也降低了两个组织中的化合物活性(比较图15a
和15b)。
23)的叶酸和FAM缀合物表现出可与未缀合化合物(3)相比的行为。在这里，不可切割的(14和21)或SS-接头(15和22)的引入也降低了两个组织中的化合物活性(比较图15a
和15b)。
[0449] 材料和方法：
[0450] 实验设计：
[0451]
[0452]
[0453]
[0454] 剂量施用和取样。用在盐水中根据上表配制的1mg/kg或0,25mg/kgASO的单剂量或单独盐水对C57BL6小鼠静脉内给药。在给药之后第7天将动物处死并且对肝脏和肾脏取样。RNA分离和mRNA分析。从肝脏和肾脏样品中提取总RNA并且使用分支DNA测定来分析ApoB mRNA水平。
[0455] 实施例5：非人灵长类动物研究
[0456] 本研究的主要目的是，在向食蟹猴(cynomolgus monkey)单一缓慢推注注射抗ApoB LNA缀合化合物之后7周内，研究所选择的脂质标记，并且评估化合物在猴子中的潜在毒性。在本研究中使用的化合物是SEQ ID NO 7、20、28&29，其在无菌盐水(0.9％)中以0.625和2.5mg/ml的初始浓度制备。
[0457] 使用至少24月龄的雌猴，并且每天为每只动物分配给定的自由获取的自来水和180g的OWM(E)SQC SHORT膨化食物(Dietex France,SDS,Saint Gratien,法国)。根据当天笼子中动物的数量计算每个笼子中分配的食物的总量。此外，每天将为每只动物提供水果或蔬菜。在处理期开始之前至少14天的时间段内，使动物适应研究条件。在这个时间段期间，将会进行预处理研究。如果，例如，剂量为0.25mg/kg或1mg/kg，则对动物进行静脉内给药。剂量体积将会是0.4mL/kg。每组使用2只动物。将在三周之后分析数据，并且可以开始使用更高或更低的给药方案的第二组动物，初始剂量设定为0.5mg/kg和1mg/kg，或低于基于第一数据组的剂量。
[0458] 剂量制剂在第1天将施用一次。将在处理后7周的时间段内观察动物，并且在第51天从研究退出。第1天对应于处理期的第一天。将在研究之前和期间记录临床观察和体重和食物摄入(每组)。
[0459] 在以下时间点对血液取样并且分析：
[0460]
[0461] RCP 0常规临床病理学，LSB＝肝脏安全性生物化学，PK＝药代动力学，OA＝其他分析，L＝脂质。
[0462] 血液生物化学
[0463] 对于所有存活的动物，将在以下指定的情况下确定以下参数：
[0464] ·完整的生物化学栏(完整的下表)，第8、15和50天，
[0465] ·肝脏安全性(仅ASAT、ALP、ALAT、TBIL和GGT)，第4、8、22和36天，
[0466] ·脂质分布(总胆固醇、HDL-C、LDL-C和甘油三酯)以及仅Apo-B，第1、4、8、22、29、36、和43天。
[0467] 将血液(大约1.0mL)装入肝素锂试管(使用ADVIA 1650血液生物化学分析仪)：Apo-B、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、HDL-C、LDL-C、尿素、肌酸酐、总胆红素(TBIL)、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALAT)、天冬酰胺氨基转移酶(ASAT)、肌酸激酶、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶、总蛋白质、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。
[0468] 血液分析：将在第-8、-1、4、8、15、22、29、36、43和50天仅从第1-16组的动物(即用抗PCSK9化合物处理的动物)收集用于ApoB分析的血液样品。将从每只动物中适合的静脉中将静脉血(大约2mL)收集至血清分离管(SST)中并且允许其在室温下凝血至少60±30分钟。血液将在冷藏条件下(设定为维持+4℃)以1000g离心10分钟。将血清转
移至3个单独的试管中并且在-80℃下储存直到使用ELISA方法在CitoxLAB France上分析(Circulex Human PCSK9 ELISA试剂盒，CY-8079，有效用于来自食蟹猴的样品)。
移至3个单独的试管中并且在-80℃下储存直到使用ELISA方法在CitoxLAB France上分析(Circulex Human PCSK9 ELISA试剂盒，CY-8079，有效用于来自食蟹猴的样品)。
[0469] 其他分析：WO2010142805提供了用于以下分析的方法：qPCR、ApoB mRNA分析。其他分析包括ApoB蛋白质ELISA、利用ELISA的血清Lp(a)分析(Mercodia No.10-1106-01)、组织和血浆寡核苷酸分析(药物含量)、样品提取、标准样品和QC样品、借助ELISA的寡核苷酸含量测定。
[0470] 实施例6：大鼠中的肝脏和肾脏毒性评估。
[0471] 可以评价本发明的化合物它们在啮齿动物中，如在小鼠或大鼠中的毒性特征。通过举例，可以使用以下规程：使用大约8周龄的Wistar Han Crl:WI(Han)。在这种周龄，雄性应该重大约250g。所有动物自由获取SSNIFF R/M-H粒化维持性食物
(SSNIFF GmbH,Soest,Germany)以及在瓶中容纳的自来水(用0.22μm过
滤器过滤)。使用10和40mg/kg/剂的剂量水平(皮下施用)并且在第1和8天给药。在
第15天将动物安乐死。在第7和14天收集尿液和血液样品。在第14天进行临床病理学评估。在研究前，在施用的第一天，在尸检前1周，测定体重。每天将评估每组的食物消耗。
在禁食6小时之后经由尾部静脉取得血液样品。进行以下血清分析：红细胞计数、平均细胞体积、红细胞压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、血小板计数、白细胞计数、白细胞分类计数及细胞形态、网状细胞计数、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、尿素、肌酸酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬酰胺氨基转移酶、总蛋白质、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。进行尿分析，α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、丛生蛋白(Clusterin)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(Cystatin)C、KIM-1、骨桥蛋白(Osteopontin)、TIMP-1、VEGF、和NGAL。七个分析物(钙结合蛋白、丛生蛋白、GST-α、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF)将在面板1下量化( MAP大鼠肾脏毒性
磁珠面板1，RKTX1MAG-37K)。三种分析物(β-2微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、脂质运载蛋白(Lipocalin)-2/NGAL)将在面板2下量化( MAP大鼠肾脏毒
性磁珠面板2，RKTX2MAG-37K)。用于确定大鼠尿液中这些生物标记物的浓度的测定基于Luminex 技术。包被有抗α-GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/丛生蛋白/抑半
胱氨酸蛋白酶蛋白C/KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体的微球是以两种不同的荧光染料编码的颜色。确定以下参数(使用ADVIA 1650的尿)：尿蛋白、尿肌酸酐。定量的参数：体积、pH(使用10-Multistix SG测试带/Clinitek 500尿液分析仪)、比重(使用折射计)。半定量的参数(使用10-Multistix SG测试带/Clinitek 500尿液分析仪)：蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、尿胆素原、沉淀物的细胞学(通过显微镜检查)。
定性的参数：外观、颜色。在处死之后，测定体重以及肾脏、肝脏和脾脏的重量，并且计算器官与体重的比。肾脏和肝脏样品将会以冷冻或储存在福尔马林中的形式取得。进行显微镜分析。
(SSNIFF GmbH,Soest,Germany)以及在瓶中容纳的自来水(用0.22μm过
滤器过滤)。使用10和40mg/kg/剂的剂量水平(皮下施用)并且在第1和8天给药。在
第15天将动物安乐死。在第7和14天收集尿液和血液样品。在第14天进行临床病理学评估。在研究前，在施用的第一天，在尸检前1周，测定体重。每天将评估每组的食物消耗。
在禁食6小时之后经由尾部静脉取得血液样品。进行以下血清分析：红细胞计数、平均细胞体积、红细胞压积、血红蛋白、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、血小板计数、白细胞计数、白细胞分类计数及细胞形态、网状细胞计数、钠、钾、氯化物、钙、无机磷、葡萄糖、尿素、肌酸酐、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬酰胺氨基转移酶、总蛋白质、白蛋白、白蛋白/球蛋白比率。进行尿分析，α-GST、β-2微球蛋白、钙结合蛋白、丛生蛋白(Clusterin)、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白(Cystatin)C、KIM-1、骨桥蛋白(Osteopontin)、TIMP-1、VEGF、和NGAL。七个分析物(钙结合蛋白、丛生蛋白、GST-α、KIM-1、骨桥蛋白、TIMP-1、VEGF)将在面板1下量化( MAP大鼠肾脏毒性
磁珠面板1，RKTX1MAG-37K)。三种分析物(β-2微球蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、脂质运载蛋白(Lipocalin)-2/NGAL)将在面板2下量化( MAP大鼠肾脏毒
性磁珠面板2，RKTX2MAG-37K)。用于确定大鼠尿液中这些生物标记物的浓度的测定基于Luminex 技术。包被有抗α-GST/β-2微球蛋白/钙结合蛋白/丛生蛋白/抑半
胱氨酸蛋白酶蛋白C/KIM-1/骨桥蛋白/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体的微球是以两种不同的荧光染料编码的颜色。确定以下参数(使用ADVIA 1650的尿)：尿蛋白、尿肌酸酐。定量的参数：体积、pH(使用10-Multistix SG测试带/Clinitek 500尿液分析仪)、比重(使用折射计)。半定量的参数(使用10-Multistix SG测试带/Clinitek 500尿液分析仪)：蛋白质、葡萄糖、酮、胆红素、亚硝酸盐、血液、尿胆素原、沉淀物的细胞学(通过显微镜检查)。
定性的参数：外观、颜色。在处死之后，测定体重以及肾脏、肝脏和脾脏的重量，并且计算器官与体重的比。肾脏和肝脏样品将会以冷冻或储存在福尔马林中的形式取得。进行显微镜分析。
[0472] 实施例7具有FAM标记物缀合物的靶向ApoB的化合物
[0473]# Seq(5’-3’) 可切割接头(B) 缀合物(C)
32 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’tca3’) FAM
33 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
34 GCattggtatTCA 1PO-DNA(5’a3’) FAM
35 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’gac3’) FAM
36 GCattggtatTCA 无 FAM
32 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’tca3’) FAM
33 GCattggtatTCA 2PO-DNA(5’ca3’) FAM
34 GCattggtatTCA 1PO-DNA(5’a3’) FAM
35 GCattggtatTCA 3PO-DNA(5’gac3’) FAM
36 GCattggtatTCA 无 FAM
[0474] 大写字母是LNA核苷(如β-D-氧基LNA)，小写字母是DNA核苷。记号s表示硫代磷酸酯核苷间连接。LNA胞嘧啶任选为5-甲基胞嘧啶。
[0475] 在S1核酸酶提取物、肝脏或肾脏匀浆或血清中，对具有不同DNA/PO-接头的FAM标记的ASO进行体外切割。
[0476] 通过S1核酸酶，在核酸酶缓冲液(60U pr.100μl)中，对具有不同DNA/PO-接头的FAM标记的ASO 100μM进行体外切割20和120分钟(参见下表)。通过将EDTA加入至缓冲溶液中来终止酶活性。之后在Dionex Ultimate 3000上，使用Dionex DNApac p-100柱和范围为10mM-1M高氯酸钠的梯度，在pH 7.5下，对溶液进行AIE HPLC分析。使用615nm的荧光检测器和260nm的uv检测器二者，针对标准品，测定切割的和未切割的寡核苷酸的含量。
[0477]SEQ ID NO 接头序列 20分钟S1后切割的％ 120分钟S1后切割的％
36 -- 2 5
34 a 29.1 100
33 ca 40.8 100
32 tca 74.2 100
35 gac 22.9 n.d
36 -- 2 5
34 a 29.1 100
33 ca 40.8 100
32 tca 74.2 100
35 gac 22.9 n.d
[0478] 结论：PO接头(或如在本文中所提及的区域B)造成缀合物(或基团C)被切掉，并且接头的长度和/或序列组成两者都可以用于调节对区域B的溶核切割的易感性。如在核酸酶S1提取物中20分钟之后所看到的，DNA/PO-接头的序列可以调节切割速率。因此对区域B(例如对DNA/PO-接头)的序列选择还可以用于调节血清中和靶标组织的细胞中的切割的水平。
[0479] 肝脏、肾脏和血清用寡核苷酸SEQ ID NO 32猛增(spike)至200 μg/g组织的浓度(参见下表)。将从NMRI小鼠收集的肝脏和肾脏样品在均化缓冲液(0.5％ Igepal CA-630、25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl、pH 8.0(用1N NaOH调节))中均化。将匀浆在37°下温育24小时并且之后用苯酚-氯仿提取匀浆。使用以上HPLC方法，针对标准品，确定来自肝脏和肾脏以及来自血清的提取物中切割的和非切割的寡核苷酸的含量。
[0480]
[0481] 结论：PO接头(或如在本文中所提及的区域B)造成缀合物(或基团C)在肝脏或肾脏匀浆中但不在血清中从寡核苷酸的切割。注释：以上测定中的切割是指可切割接头的切割，寡聚物或区域A应该保持功能上完整。
[0482] 在实施例7中所示的测定中对切割的易感性可以用于确定接头是否是生物可切割的或者生理学上不稳定的。
[0483] 实施例8.利用GalNAc-缀合物的ApoB mRNA的体内敲减、组织含量、和总胆固醇。
[0484] 化合物
[0485]SEQ ID NO Seq(5’-3’)(A) 可切割接头(B) 缀合物(C)
3 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA 无 无
30 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA GalNAc簇Conj1a
20 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA GalNAc簇Conj2a
7 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
3 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA 无 无
30 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA GalNAc簇Conj1a
20 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA GalNAc簇Conj2a
7 GsCsaststsgsgstsastsTsCsA 2PO-DNA(5’ca3’) 胆固醇
[0486] 大写字母是LNA核苷(如β-D-氧基LNA)，小写字母是DNA核苷。记号s表示硫代磷酸酯核苷间连接(区域A)。LNA胞嘧啶任选为5-甲基胞嘧啶。2PO接头(区域B)相对于序列区域A是5’，并且包含两个通过磷酸二酯连接而连接的DNA核苷，并且在区域A的
3’DNA核苷和区域A的5’LNA核苷之间的核苷间连接也是磷酸二酯。连接基团(Y)可以用于将缀合物基团(当存在时)与区域B、或A(SEQ ID NO 7、20和30)连接。
3’DNA核苷和区域A的5’LNA核苷之间的核苷间连接也是磷酸二酯。连接基团(Y)可以用于将缀合物基团(当存在时)与区域B、或A(SEQ ID NO 7、20和30)连接。
[0487] 用单一剂量盐水或0,25mg/kg未缀合LNA-反义寡核苷酸(SEQ ID NO3)或等摩尔量的与GalNAc1、GalNAc2、或胆固醇(2PO)缀合的LNA反义寡核苷酸对C57BL6/J小鼠进行静脉内(iv)或者皮下(sc)注射，并且根据下表(实验设计)在第1-7天处死。
[0488] 从肝脏和肾脏中分离RNA并且利用ApoB特异性引物和探针进行qPCR以分析ApoB mRNA敲减。使用ELISA方法测量寡核苷酸含量并且测量血清中的总胆固醇。
[0489] 结论：与ApoB LNA反义寡核苷酸(SEQ ID NO 30和20)缀合的GalNAc1和GalNAc2显示出比未缀合的ApoB LNA更好的ApoB mRNA的敲减(图16)。对于GalNAc 1缀合物(SEQ ID NO 30)来说，似乎静脉内给药比皮下给药更好，这是令人惊讶的，因为对于另一种GalNAc簇的报道是相反的(Alnylam,8th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society(寡核苷酸治疗协会第8次年会))。总胆固醇数据显示出了，在静脉内和皮下施用的GalNAc簇缀合物(SEQ ID NO 30和20)是如何提供比未缀合的和胆固醇缀合的化合物(SEQ ID NO 7)更好的效果(图17，a和b)。寡核苷酸的组织含量(图18、a-f)示出了，与母体化合物相比，缀合物是如何增强肝脏中的吸收同时提供肾脏中较少的吸收。这适用于静脉内和皮下施用二者。当静脉内给药时，当与GalNAc 2(SEQ ID NO 20)相比时，GalNAc 1(SEQ ID NO 30)提供肝脏中非常大的吸收，但是因为活性对于两种化合物来说均良好，所以GalNAc 2缀合物似乎诱导比GalNAc 1缀合物更高的特异性活性，表明GalNAc缀合物在没有药代动力学调节剂的情况下尤其可以用于与LNA反义寡核苷酸一起使用。
[0490] 材料和方法：
[0491] 实验设计：
[0492]
[0493]
[0494]
[0495] 剂量施用。以10ml/kg BW(根据第0天的体重)的根据上表在盐水中配制的化合物或单独盐水，对送达时大约20g的C57BL/6JBom雌性动物进行静脉内或皮下给药。
[0496] 肝脏和肾脏组织的取样。根据上表将动物用70％CO2-30％O2麻醉并且通过颈椎脱臼处死。将一半大肝叶和一个肾脏切碎并且浸入RNAlater中。将另一半肝脏和另一个肾脏冷冻并且用于组织分析。
[0497] 总RNA分离和第一链合成。在RLT-裂解缓冲液的存在下，使用Qiagen RNeasy试剂盒(Qiagen cat.no.74106)，根据厂商说明书，从最多30mg的通过珠磨均化的组织中提取总RNA。使用来自Ambion的反转录酶试剂，根据厂商说明书，进行第一链合成。
[0498] 对于每个样品来说，利用无RNA酶的H2O将0.5μg的总RNA调节为(10.8μl)，并且与2μl随机十聚体(50μM)和4μl dNTP混合物(每个dNTP为2.5mM)混合，并且在3分钟内加热至70℃，之后将样品在冰上迅速冷却。将2μl 10x缓冲液RT、1μl MMLV反转录酶(100U/μl)和0.25μl RNA酶抑制剂(10U/μl)加入至每个样品中，接着在42℃下温育60分钟，在95℃下进行酶的热失活10分钟，并且之后将样品冷却至4℃。将cDNA样品以1:5稀释，并且使用Taqman快速通用PCR主混合物(Fast Universal PCR Master Mix)2x(Applied Biosystems Cat#4364103)和Taqman基因表达测定(mApoB、Mn01545150_m1和mGAPDH#4352339E)按照制造商规程进行RT-QPCR，并且在Applied Biosystems
RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行处理。通过夹心ELISA方法测量肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量。
RT-qPCR仪器(7500/7900或ViiA7)中以快速模式进行处理。通过夹心ELISA方法测量肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量。
[0499] 血清胆固醇分析：在即将处死之前，使用用于血清制备的S-monovette血清-凝胶小瓶(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)收集眶后窦(retro-orbital sinus)血液。使用ABX Pentra胆固醇CP(Triolab,Brondby,Denmark)根据厂商说明书分析血清的总胆固醇。
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