本发明涉及Mst蛋白质或编码Mst蛋白质的核苷酸序列在治疗血栓栓 塞疾病中的用途，并涉及一种筛选Mst蛋白质或编码Mst蛋白质的核苷酸 序列的调节剂的方法。

最近几年来出现了几种抗血小板疗法，其范围从阿司匹林到氯苄噻啶 和氯吡格雷，并且它们的益处详细记载。尽管所有这些不同的疗法增加了 治疗血栓栓塞疾病的额外好处，但是它们经常与不良副作用有关，并且即 使结合治疗的效力也是不充足的。因此迫切需要治疗血栓栓塞疾病的新方 法。

STE20相关的激酶组成了丝氨酸/苏氨酸激酶的一个进化保守家族。 Ste20p是这个激酶家族的奠基者，它是一种MEK激酶激酶激酶(MAP4K)， 它与芽殖酵母的外激素反应通路有关(Leberer，E.等人(1992)EMBO J.11， 4815-4824)。最近几年来鉴定到了许多哺乳动物和酵母的Ste20同源物。它 们分为两类：结合Cdc42和/或Rac1(p21激活的激酶或PAKs)的，以及看 起来不是按这种方式调控的(生发中心激酶或GCKs)(综述参见Dan，C.等 人(2001)J.Biol.Chem.276，32115-32121)。Mst1是后面一类中的一员：它 贯穿整个激酶结构域与酵母Ste20和哺乳动物Pak酶同源，但是不包含p21 GTPase结合结构域，在此激酶结构域外与Ste20或Pak也不具有任何显 著同源性。

人Mst1(Mammalian Sterile Twenty-样)最初用针对丝氨酸/苏氨酸激 酶催化结构域进行扩增所设计的简并引物，通过PCR筛选人淋巴细胞 cDNA文库分离得到(Creasy，C.L.等人(1995)J.Biol.Chem.270， 21695-21700；Creasy，C.L.等人(1995)Gene 167，303-306)。在那之后不久， 同一作者鉴定到了Mst1的接近的同源物Mst2。在一项早期研究中，Mst1 和Mst2显示出对应激条件和凋亡剂应答，从而被激活，因此它们备选地 命名为应激条件响应激酶(Krs)1和2。

最近的出版物表明Mst1和Mst2在凋亡中起一定作用。响应凋亡刺激 (如CD95/Fas的连接或用星形孢菌素处理)，Mst1和Mst2都经受胱天蛋白 酶介导的蛋白水解(Graves，J.D.等人(1998)EMBO J 17，2224-2234；Lee， K.K.等人(1998)Oncogene 16，3029-3037)。尽管Mst1具有两个不同的胱 天蛋白酶-剪切位点，从而产生两个在生物化学上不同的催化片断，但是根 据报道Mst2只有一个胱天蛋白酶-剪切位点。由于Mst1和Mst2的C-末 端结构域的负调控效应，通过胱天蛋白酶-剪切除去C-末端结构域在体外 和体内激活所生成形式的激酶活性，并引起细胞移动(Creasy，C.L.等人 (1996)J.Biol.Chem.271，21049-21053；Deng，Y.等人(2003)J.Biol.Chem. 278，11760-11767；Graves，J.D.等人(2001)J.Biol.Chem.276， 14909-14915；Graves，J.D.等人(1998)同上；Lee，K.K.等人(1998)同 上)。此外，Mst1的过表达在人B淋巴细胞中诱导凋亡特有的形态学变化 (Graves，J.D.等人(2001)，同上)。在小鼠和线虫中Mst同源物的cDNA克 隆显示胱天蛋白酶剪切序列在进化上是保守的。

Mst1的过表达分别通过MKK4/MKK7和MKK3/MKK6激活JNK 和p38MAP激酶通路(Graves，J.D.等人(2001)同上；Ura，S.等人(2001) Genes Cells 6，519-530)。由于Mst1的表达导致胱天蛋白酶-3的激活，所 以Mst1不仅是胱天蛋白酶的靶标，而且是胱天蛋白酶的激活物。此胱天 蛋白酶激活和凋亡变化通过JNK发生，因为JNK的显性失活突变体的共 表达抑制Mst1所诱导的形态学变化和胱天蛋白酶激活(Ura，S.et al.(2001) 同上)。在近期的一篇文献中(Khokhlatchev，A.等人(2002)Curr.Biol.12， 253-265)表明强烈支持存在一种新的影响细胞存活的Ras效应物通路。按 照此模型，激活的Ras可以结合由Nore和Mst1所组成的复合体，随后影 响下游信号通路(Khokhlatchev，A.等人(2002)同上)。然而，迄今为止还 没有鉴定Mst1的潜在生理上直接的底物。Mst1在巨核细胞(血小板的祖细 胞)中表达(Sun，S.等人(1999)J.Cell Biochem.76，44-60)。巨核细胞经历核 内有丝分裂细胞周期作为它们成熟过程的一部分。除了多倍化之外，在成 熟的巨核细胞中还开启一组基因(如血小板因子1(PF4)，乙酰胆碱酯酶和糖 蛋白IIb(GPIIb))。细胞因子血小板生成素(TPO)作为c-Mpl受体的配体促 进巨核细胞的分化。TPO信号传递到DNA水平调节是通过Janus激酶家 族成员JAK2和Tyk2、Shc、Stat-蛋白3和5，和通过细胞外信号调控激 酶2进行的。在培养的骨髓细胞和小鼠巨核细胞系Y10/L8057中，Mst1 的表达和Mst1激酶活性被Mpl配体上调。此外，Mst1的诱导表达增强各 种分化标志物的表达，并且响应PMA增加多倍化(Sun，S.等人(1999)同 上)。

根据最近报道，Mst2参与Raf-1信号通路：在血清饥饿的情况下，在 带有Flag标签的Raf-1转染的COS-1细胞中和没有转染的细胞中，Mst2 与Raf-1共沉淀(O’Neill，E.等人(2004)Science 306，2267-2270)。Mst2是 一种激酶，促凋亡剂通过同源二聚化和转磷酸作用可以增加其活性(Deng， Y.等人(2003)同上；Lee，K.K.等人(1998)同上)。O’Neill及其同事显示 Raf-1通过一种不依赖于Raf-1激酶活性，但是可能依赖于募集还没有确定 的Mst2磷酸化酶的机制抑制这些过程(O’Neill，E.等人(2004)同上)。

我们通过蛋白质组学方法发现Mst1和Mst2在人血小板中表达。同时 其他研究者证实了这些发现：O’Neill等人通过用传统的基于双向凝胶的蛋 白质组学方法分析血小板细胞提取物，证实了Mst2在血小板中的表达 (O’Neill，E.(2002)Proteomics 2，288-305)。此外，Kris Gevaert与合作者通 过使用联合分级对角线层析(Combined Fractional Diagonal Chromatography)(Gevaert，K.等人(2003)Nat.Biotechnol.21，566-569)， 从血小板中鉴定到了Mst1和Mst2磷蛋白(Gevaert，K.等人.“Novel Strategies and Applications for Non-gel Proteomics”，Proteomic Forum München 2003-International Meeting on Proteome Analysis，9月.14-17， 2003，慕尼黑，德国)。然而，尽管在血小板中鉴定到了Mst1和/或Mst2， 但是这些研究都没有提供任何关于Mst激酶在血小板中的潜在功能的数 据。因此，到目前为止，还没有描述Mst家族激酶在血小板信号传递和血 小板激活中的潜在角色。

现在，本发明涉及如下发现，即Mst蛋白质与最终导致血小板激活与 聚集的信号转导事件有关。

因此，本发明针对Mst蛋白质(尤其是Mst1和/或Mst2)，或编码Mst 蛋白质(尤其是Mst1或Mst2)的核苷酸序列在治疗血栓栓塞疾病中的用 途，尤其是生产用于治疗血栓栓塞疾病的药物的用途。Mst蛋白质(尤其是 Mst1和/或Mst2)优选为人Mst蛋白质。注意到通常人Mst1与人Mst2在 氨基酸水平上具有77.6％的同一性。斑马鱼基因组只包含一个代表Mst1 和Mst2的同源物，其氨基酸同一性分别为76.8％和88.8％。人与大鼠MST2 序列在氨基酸水平上具有96.7％的同一性。

在一个优选的实施方案中，人Mst1蛋白或其核苷酸序列的特征分别 在于SEQ ID NO：1的氨基酸序列或SEQ ID NO：2的核苷酸序列，人Mst 2蛋白或其核苷酸序列的特征分别在于SEQ ID NO：3的氨基酸序列或 SEQ ID NO：4的核苷酸序列。

按照本发明，术语Mst蛋白质一般指任何自然发生的Mst蛋白质以及 具有生物学活性的Mst突变体。自然发生的Mst蛋白质包括不同物种(如 斑马鱼，优选脊椎动物，更优选哺乳动物)的Mst蛋白质，以及具有生物 学活性的剪接变体。最优选的Mst蛋白质上文已经提及。

术语“具有生物学活性的Mst突变体”指来自Mst蛋白质，并且保持 其生物学活性(即激酶活性)的蛋白质。因此，在本案例中术语“生物学活性 的”指Mst激酶活性，它可以用任何众所周知的激酶测定进行测量，例如 本说明书所描述的测定，尤其是实施例中所描述的ATP消耗测定。简而言 之，ATP消耗测定指体外激酶测定，其含有具有ATP和Mg2+离子或Mn2+ 离子的激酶缓冲液，以及将检测的激酶(此处为Mst突变体)。通常通过生 物发光测定ATP消耗以及激酶活性。

更特别地，术语“具有生物学活性的Mst突变体”指如下描述的氨基 酸序列，它在一个或多个氨基酸上不同于自然发生的Mst序列，但是保持 它的激酶活性。这种突变体与野生型多肽的区别在于替代、插入或缺失了 一个或多个氨基酸。优选半保守的，更优选保守的氨基酸替代。典型的替 代发生在脂肪族氨基酸中，包括具有脂肪族羟基侧链的氨基酸中，具有酸 性残基的氨基酸中，酰胺衍生物中，具有碱性残基的氨基酸中，或者具有 芳香族残基的氨基酸中。典型的半保守和保守替代是：

  氨基酸   保守替代   半保守替代   A   G；S；T   N；V；C   C   A；V；L   M；I；F；G   D   E；N；Q   A；S；T；K；R；H   E   D；Q；N   A；S；T；K；R；H   F   W；Y；L；M；H   I；V；A   G   A   S；N；T；D；E；N；Q   H   Y；F；K；R   L；M；A   I   V；L；M；A   F；Y；W；G   K   R；H   D；E；N；Q；S；T；A   L   M；I；V；A   F；Y；W；H；C   M   L；I；V；A   F；Y；W；C；   N   Q   D；E；S；T；A；G；K；R   P   V；I   L；A；M；W；Y；S；T；C；F   Q   N   D；E；A；S；T；L；M；K；R   R   K；H   N；Q；S；T；D；E；A   S   A；T；G；N   D；E；R；K   T   A；S；G；N；V   D；E；R；K；I   V   A；L；I   M；T；C；N   W   F；Y；H   L；M；I；V；C   Y   F；W；H   L；M；I；V；C

另外，如果新的半胱氨酸保留游离巯基的话，那么从A、F、H、I、L、 M、P、V、W或Y到C的变化是半保守的。此外，技术人员知道不应当 替代在空间位置上苛求的甘氨酸，并且P(脯氨酸)不应当引入到具有α-螺 旋或β-折叠结构的蛋白质部分中。

突变体通常在一级结构(氨基酸序列)上不同，但是相对于自然发生蛋 白在二级或三级结构上，或者在它的功能(激酶活性)上可能有或没有显著 不同。无论如何，突变体与野生型Mst1蛋白质或Mst2蛋白质的同一性 至少为70％，优选至少为75％，更优选至少85％，更优选至少95％，最 优选至少99％。

具有点突变的生物学活性Mst突变体的实例为：

D326N，其抵抗在DEMD326S中蛋白酶(即胱天蛋白酶)剪切，D349E， 其抵抗在TMTD349G中蛋白酶剪切，和D326N-D349E，其是一种双蛋白 酶抵抗形式(Graves J.D.等人(2001)，同上)。

T183E、T175E、T175A、T177E和T177A以及D326N、S327A和 S327E，它们是在MST激活环中的突变(Glantschnig，H.等人(2202)J. Biol.Chem.，277，42987-42996)。

T175A和T177A也是在MST激活环中的突变，L444P和T120A以 及双突变体S438A-T440A是二聚体缺陷变体(Praskova，M.等人(2004) Biochem.J.，381，453-462)

具有点突变的生物学活性的Mst2突变体的实例为：

T117A和T384A(Deng，Y.等人(2003)，同上)。

突变体还可以是足够满足其激酶活性的Mst蛋白质的一部分。此部分 包含至少30个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少300个氨基酸， 更优选至少450个氨基酸，对于Mst1最优选至少482个氨基酸，对于Mst2 最优选至少486个氨基酸。此类似物部分可以与野生型多肽部分不同指出 在于上文所详述的一个或多个氨基酸的替代、插入或缺失。在一个实施方 案中，Mst蛋白质或具有生物学活性的Mst突变体可以与另一个分子(例如， 蛋白和/或标志物，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST))融合。

具有生物学活性的Mst1片段的实例为：

Δ327-487和Δ350-487，其是Mst1的两个具有催化活性的胱天蛋白酶 剪切产物(Graves，J.D.等人(2001)，同上；Lee，K.K.等人(2001)J.Biol. Chem.276，19276-19285；Glantschnig，H.等人(2002)，同上)，截短的Mst1 形式氨基酸1-455、1-430、1-360和1-330，缺失Δ331-360和Δ331-394 (Creasy，C.L.等人(1996)，同上)，以及如图12所示的Mst1激酶结构域。

具有生物学活性的Mst2片段的实例为：

Δ323-491，其是Mst2的具有催化活性的胱天蛋白酶剪切产物(Deng， Y.等人(2003)，同上)。

此外，本发明还针对Mst蛋白质(尤其是Mst1和/或Mst2)，或编码 Mst蛋白质的核苷酸序列在发现Mst蛋白质的调节剂(尤其是抑制剂)、作 为治疗血栓栓塞疾病药物中的用途。Mst蛋白质(尤其是Mst1和/或Mst2 蛋白)优选为人Mst蛋白质，这也在上文已经详细说明。

通常，将所描述的Mst蛋白质或者编码Mst蛋白质的核苷酸序列与受 试化合物相接触，并且测量或检测受试化合物对Mst蛋白质的影响。

按照本发明，术语“Mst蛋白质调节剂”是指Mst蛋白质生物活性的调 节分子(“调节剂”)，尤其是抑制或激活分子(“抑制剂”或“激活剂”)，特别是 按照本发明的测定方法可以确定的Mst蛋白质抑制剂。抑制剂通常是化合 物，它例如结合到至少一种优选上文所详细描述的Mst蛋白质(尤其是人 Mst1蛋白)、部分或全部阻断其活性、减少、阻止、延迟其活化、失活、 脱敏或者下调其活性或表达。激活剂通常是化合物，它例如增加、打开、 激活、促进、增强至少一种优选上文所详细描述的Mst蛋白质(尤其是人 Mst1蛋白)、敏化、激动或上调其活性或表达。这种调节剂包括自然发生 或合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、核 酶、小有机分子，等等。

在本发明的另一个优选的实施方案中，上文提及的血栓栓塞疾病是由 血小板激活和/或聚集引起的。按照本发明，血栓栓塞疾病选自心肌梗塞、 不稳定型心绞痛、急性冠状动脉综合征、冠状动脉病、再狭窄、中风、短 暂性缺血发作、肺栓塞、左心室功能障碍、患有心血管和/或脑血管疾病患 者的临床血管并发症的二级预防、动脉粥样硬化和/或血管介入的结合给药 法，尤其是中风、心肌梗塞、动脉粥样硬化和/或再狭窄。

本发明还涉及筛选Mst蛋白质或编码Mst蛋白质的核苷酸序列调节剂 的方法，其中该方法包括步骤：

(a)在选自血栓形成相关测定、激酶测定和/或基于报道分子的细胞 系统测定中将Mst蛋白质或编码Mst蛋白质的核苷酸序列与受试化合物相 接触，并且

(b)测量或者检测受试化合物对Mst蛋白质活性的影响。

在一个优选的实施方案中，血栓相关形成测定是血小板聚集测定，其 中血小板聚集是通过诱导物(如ADP、凝血酶、TRAP、胶原、convulxin、 钙离子载体和/或瑞斯托菌素)诱导的。

特别地，优选使用体外激酶测定(如上文和实施例中所描述的ATP消 耗测定)。优选的测定条件是存在MnCl2，特别是浓度为2nM的MnCl2。 最佳缓冲液为例如pH7.5的40mM Hepes。

另一个优选测定是基于均相荧光偏振(FP)的测定。基于FP的测定是 使用偏振光激发溶液中的荧光底物肽的测定。这些荧光肽在溶液中是自由 的并且转动，从而引起发射光去偏振。当底物肽结合到较大分子(如(P)-Tyr) 时，它的转动速率大幅降低，并且发射光保持高度偏振。对于激酶测定通 常有两种选择：

(a)荧光磷酸肽示踪物结合到(P)-特异抗体。磷酸化产物将会与抗 体竞争荧光磷酸肽，这导致偏振从高变低。

(b)磷酸化底物肽结合到磷酸特异抗体，这导致偏振从低变高。

另一个优选测定是离芯片孵育迁移率变动测定(off-chip incubation mobility shift assay)，它用微流芯片来测量荧光肽底物向磷酸化产物的转 变。在这种测定中，来自微量滴定板孔的反应混合物通过毛细管滴到芯片 上，在那里肽底物和磷酸化产物通过电泳进行分离，并通过激光诱导荧光 进行检测。因此荧光信号的标记揭示了反应的程度。这种测定可从例如 Caliper LifeSciences，Hopkinton，MA，USA公司以名称“LabChipAssay for Mst2”商购。

另一种优选用于二级筛选的测定是基于报道分子的细胞系统测定，在 过表达自然发生或突变的Mst1基因后，可以通过测量对下游报告基因的 基因表达的影响来检测扰动对激活或失活内源通路的影响。这种报道基因 可以是由转录因子(例如NFκB、AP1或p53)诱导的在启动子元件控制下的 荧光素酶。报道基因和Mst1可以在细胞系(如Hela或HEK293细胞)中共 表达。这些细胞优选接种到多孔检测板的一个孔中。Hill，S.J.等人(2001) Curr.Opin.Pharmacol.，1，526-532和Hexdall，L.等人(2001) Biotechniques，1134-8，1140中描述了类似的基于细胞的测定的实例。还可 以在Bronstein，I.等人(1994)Anal.Biochem.，219，169-181中找到最常使 用的报道基因和检测方法概述。

除了上文所描述的激酶测定，还可以用如下的多相和均相测定来确定 Mst蛋白质或Mst突变体的激酶活性：

多相测定包括如ELISA(酶联免疫吸附测定)，DELFIA(解离增强镧系 元素荧光免疫测定)，SPA(闪烁亲近测定法)和闪烁板测定。

许多公司都提供基于ELISA(酶联免疫吸附测定)的测定。这种测定使 用可以被激酶如Mst磷酸化的随机肽。将包含激酶的样品通常稀释到反应 缓冲液(包含如ATP和必需的阳离子)中，然后加到板孔中。通过简单地除 去此混合物终止反应。其后，漂洗微孔板。反应可以通过例如向激酶加入 生物素化的底物来起始。反应后加入特异性的抗体。通常样品转移到预封 闭的G蛋白板上，洗涤之后加入例如链霉抗生物素蛋白-HRP。之后除去 未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)，通过加入过氧化物酶 底物起始过氧化物酶的颜色反应，用适当的光密度计测量光密度。

基于DELFIA(解离增强镧系元素荧光免疫测定)的测定是固相测定。 通常用铕或另一种镧系元素标记抗体，在洗除未结合的铕标记抗体后，检 测铕荧光。

SPA(闪烁亲近测定法)和闪烁板测定通常使用生物素/亲和素相互作用 来捕获放射性标记的底物。通常反应混合物包括激酶，生物素化的肽底物 和γ-[P33]ATP。反应之后，用链霉抗生物素蛋白捕获生物素化的肽。在SPA 检测中，链霉抗生物素蛋白结合到包含闪烁体的小珠上，而在闪烁板检测 中，链霉抗生物素蛋白结合到包含闪烁体的微孔板的孔内部。一旦固定化， 放射性标记的底物足够接近闪烁体，从而激发光的发射。

均相测定法包括例如TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)测定、上 文所描述的FP(荧光偏振)测定、ALPHA(放大发光亲近均相测定)、EFC(酶 片段互补)测定。

基于TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)的测定通常使用铕和 APC(一种修饰的别藻蓝蛋白或其它具有重叠谱的染料，如Cy3/Cy5或 Cy5/Cy7(Schobel，U.等人(1999)Bioconjugate Chem.10，1107-1114))之间 的荧光共振能量转移。用337nm的光激发如铕之后，分子在620nm发荧 光。但是如果荧光团足够接近APC，那么铕将会将其激发能量转移到APC， APC在665nm发荧光。激酶底物通常为生物素标记的底物。在激酶反应 之后，铕-标记的-(P)特异抗体随同链霉抗生物素蛋白-APC一起加入。磷酸 化的肽使铕标记的抗体与链霉抗生物素蛋白-APC紧密接触。由于APC荧 光，APC与铕荧光团的紧密接近将会引起铕荧光的猝灭(FRET)。

基于ALPHA(放大发光亲近均相测定)的测定法依赖于由磷酸化肽使 之接近的供体珠和受体珠之间的单线态氧转移。在680nm激发时，供体 珠中的光敏剂把周围的氧转换为单线态氧，其扩散长达200nm的距离。 受体珠中的化学发光基团转移能量到珠内的荧光受体，然后在大约600nm 处发射光。

基于EFC(酶片段互补)的测定或等价测定尤其可以用于高通量筛选化 合物。EFC测定基于工程化的β-半乳糖苷酶，它由两个片段-酶受体(EA) 和酶供体(ED)组成。当这两个片段分离后，没有β-半乳糖苷酶活性，但是 当这两个片段在一起时，它们结合(互补)而形成有活性的酶。EFC测定使 用ED-分析物缀合物，其中分析物可以通过特异性结合蛋白(如抗体或受体) 识别。在没有特异性结合蛋白的情况下，ED-分析物缀合物能够与EA互 补，从而形成活性的β-半乳糖苷酶，并产生阳性发光信号。如果ED-分析 物缀合物被特异性结合蛋白结合，那么阻止与EA的互补，因此没有信号。 如果提供游离分析物(在一个样品中)，它将与ED-分析物缀合物竞争结合 特异性结合蛋白。游离分析物将会释放ED-分析物缀合物，使之与EA互 补，从而产生依赖于样品中游离分析物的量的信号。

在一个优选的实施方案中，上文所描述的测定包括通过比较存在和不 存在受试化合物时测定中的变化，进一步选择具有抵抗血栓栓塞疾病活性 的受试化合物。

如上文所描述，Mst蛋白质(尤其是Mst1和/或Mst2蛋白质)是人Mst 蛋白质。

通常以化合物文库的形式提供受试化合物。为了筛选化合物文库，优 选使用技术人员已知的或可通过商业途径获得的高通量测定。按照本发明， 术语“化合物文库”是指从任何多种来源(包括化学合成分子和自然产物或 组合化学文库)聚集的多种化合物。本发明的方法有利地在阵列上和/或机 器人系统中执行，例如包括机器人平板接种和机器人液体转移系统，例如， 使用微观流体，即有槽的结构化的。

优选地，检测到的受试化合物是血小板激活和/或血小板聚集的抑制 剂，特别是检测到的受试化合物降低血栓形成和/或血液凝结的风险。

本发明的另一个实施方案针对生产治疗血栓栓塞疾病药物的方法，此 方法包括如下步骤：

(a)执行上文所描述的方法，

(b)分离一种检测到的适合治疗血栓栓塞疾病的受试化合物，

(c)用一种或多种可药用载体或辅助物质配制检测的受试化合物。

优选地，所述的血栓栓塞疾病是由血小板激活和/或聚集引起的，尤其 选自上文所描述的血栓栓塞疾病。

对于药物生产，药学活性化合物或其可药用盐通常是药物剂型的形式， 由成分的混合物组成，如可药用载体或辅助物质与药学活性化合物组合提 供所需的特征。

制剂通常包含至少一种可药用载体或辅助物质。这种辅助物质的例子 有脱矿质水、等渗盐水、林格液、缓冲液、有机或无机酸和碱以及它们的 盐、氯化钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠或磷酸二钙、二元醇(如丙二醇)、酯(如 油酸乙酯和十二酸乙酯)、糖(如葡萄糖、蔗糖和乳糖)、淀粉(如玉米淀粉和 马铃薯淀粉)、增溶剂和乳化剂(如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、 苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(如花生油、 棉子油、玉米油、大豆油、蓖麻油、合成脂肪酸酯(如油酸乙酯、肉豆蔻酸 异丙酯)、聚合佐剂(如明胶、葡聚糖、纤维素及其衍生物、白蛋白、有机 溶剂)、螯合剂(如柠檬酸盐和尿素)、稳定剂(如蛋白酶或核酸酶抑制剂、优 选抑酶肽、ε-氨基己酸或抑胃酶肽A)、防腐剂(如苯甲醇)、氧化抑制剂(如 亚硫酸钠)、蜡和稳定剂(如EDTA)。在组合物中还可以存在着色剂、释放 剂、包衣衣料、甜味剂、调味剂、芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。生理缓冲 液优选pH大约为6.0-8.0，尤其pH为大约6.8-7.8，特别是pH大约为7.4， 并且/或者摩尔渗透压浓度大约为200-400毫渗摩/升，优选为大约290-310 毫渗摩/升。通常用适当的有机或无机缓冲液调节药物的pH，例如，优选 用磷酸缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟 乙基)哌嗪]-乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。各自缓冲液的选 择通常依赖于所需缓冲摩尔浓度。例如，磷酸缓冲液适合注射和输注溶液。 配制药物的方法以及可药用载体或辅助物质是本领域的技术人员公知的。 根据流行的剂型和鉴定的化合物选择可药用载体和辅助物质等等。

可以制造药物组合物用于经口、鼻、胃肠外或局部给药。胃肠外给药 包括皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹膜内给药。

可以以多种剂型配制药物，包括用于口服的固体剂型(如胶囊剂、片剂、 丸剂、粉剂和粒剂)、用于口服的液体剂型(如可药用乳剂、微乳剂、溶液 剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂、可注射制剂(如无菌注射的水性或油性混悬剂))、 局部或经皮给药的剂型(如软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶 液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂)。

对于任何特定的患者，特定有效治疗剂量水平依赖于多种因素，包括 鉴定的化合物的活性、剂型、患者的年龄、体重和性别、治疗持续时间等 在医学领域众所周知的因素。

以单次或分份剂量施用于人或其他哺乳动物的本发明化合物的总日剂 量为大约0.01到大约100mg/kg体重，或者更优选从大约50到大约75 mg/kg体重。单剂量组合物可以包含这种量或者其约数量以组成日剂量。 依照本发明的治疗方案通常包括给需要这种治疗的患者每天以单剂或多剂 施用大约10mg到大约1000mg本发明的化合物。

如下的图、表、序列和实施例将解释本发明，但不限制本发明的范围。

附图描述

图1显示富集磷蛋白的级分的凝胶分析。

泳道A：静息的血小板；

泳道B：凝血酶刺激的血小板；

箭头标明通过LC-MS/MS鉴定所发现的Mst同源物的位置。在条带 A和B中检测到了Sok1，而在上方和下方的条带C中鉴定到了Mst1和 Mst2的肽(参见表1)。

图2显示表1所列出的Mst1/2特异性肽AGNILLNTEGHAK的 MS/MS谱的实例。

图3显示Mst1在睾丸和来自个人供体的人血小板提取物中的表达。

泳道A：睾丸；

泳道B：静息的血小板；

泳道C：凝血酶激活的血小板；

用SDS-PAGE分离对应于30μg总蛋白质的睾丸和人血小板提取物， 通过蛋白质印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用特异性抗体检测 Mst1。

图4显示在人血小板和睾丸提取物中Mst2的表达。

泳道A：睾丸；

泳道B：静息的血小板；

泳道C：凝血酶激活的血小板；

用SDS-PAGE分离对应于30μg总蛋白质的睾丸和人血小板提取物， 通过蛋白质印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用特异性抗体检测 Mst2。

图5显示Mst1在多种人组织提取物中的表达。用SDS-PAGE分离来 自血小板、脑、结肠、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、骨骼肌、皮肤、睾丸和 胸腺的30μg总蛋白质，通过蛋白质印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。 用特异性抗体检测Mst1。

图6显示Mst2在多种人组织中的表达。用SDS-PAGE分离来自血小 板、脑、结肠、心脏、肾脏、肝脏、胰腺、骨骼肌、皮肤、睾丸和胸腺的 30μg总蛋白质，通过蛋白质印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用特异 性抗体检测Mst2。

图7概述了体内转基因斑马鱼血栓形成分析的结果，并显示BC048033 (Mst1/Mst2)的击倒影响ADP诱导的血小板聚集。因此，BC048033 (Mst1/Mst2)对于斑马鱼中血栓形成是重要的。此测定利用转基因血小板特 异的荧光斑马鱼系(用Zygogen公司专有的Z-TagTM技术，用绿色珊瑚礁荧 光蛋白特异性的标记血小板而产生)。将反义吗啉代随机化匿名样品注射到 单细胞期的纯合子Z3胚胎中。所有的样品等体积(4nL)注射到Z3受精卵 中，对照为0.2％酚红，GPIIb为1.7ng，ADP受体P2Y12为1.7ng，DAT (多巴胺转运蛋白)为1.7ng，Mst1/2为16.6ng。胚胎放到28℃培养箱 中。在6dpf(受精后天数)，注射ADP(大约90pmol)到发育的幼虫心腔中。 记录幼虫是否发生血小板移动。合并数据并取平均值。在每种条件下，至 少用6个独立实验分析至少60个幼虫。每种条件与ADP处理的模拟品注 射的幼虫比较。观察到所有样品(除DAT以外)关于对照的统计学显著性 (＊＝p＜0.01，＊＊＝p＜0.001)。

图8显示瑞斯托菌素刺激的CD-血小板的FACS分析实例：FACS测 量重组的逆转录病毒感染的CD-血小板，它表达融合到GFP的显性失活的 Mst1突变体Mst1K59R(“Mst1”)或者仅仅GFP(“GFP(对照)”)。显示了平均 荧光值在基础值上的相对增加(％)。此图显示CD41、CD62P(P-选择蛋白) 和CD40L的依赖于激动剂的表面表达。此图显示来自巨核细胞的4次独 立分离的CD-血小板进行的12个独立实验的结果与标准差。＊p＜0.05。

图9显示凝血酶所诱导的聚集的原始记录。重组的逆转录病毒感染的 CD-血小板响应0.5U/mL凝血酶的代表性的聚集迹线，所述CD-血小板表 达融合到GFP的显性失活的Mst1突变体Mst1K59R(“DN-突变体”)或者仅 仅GFP(“GFP”)。

图10显示在不同的缓冲条件下GST-Mst1激酶测定。与GST-对照相 比，在2mM MnCl2存在的情况下得到GST-Mst1激酶最高的活性(通过测 量ATP消耗)。

图11显示星形孢菌素对MST1激酶活性的S形剂量反应曲线。每个 剂量的作用都用一式三份样品测试。在体外测定中，星形孢菌素可以完全 抑制MST1激酶活性所引起的ATP消耗。来自最佳拟合值的EC50为 608.1pM。

图12显示SEQ ID NO：1，即人Mst1的氨基酸序列，其中Mst1激 酶结构域用粗体显示。加下划线的氨基酸显示胱天蛋白酶剪切位点，数字 指出不破坏Mst1激酶活性的点突变的实例。

序列描述

SEQ ID NO：1显示人Mst1的氨基酸序列(Swissprot登记号 Q13043)；

SEQ ID NO：2显示编码人Mst1的核苷酸序列(Genbank登记号 NM_006282)；

SEQ ID NO：3显示人Mst2的氨基酸序列(Swissprot登记号 Q13188)；

SEQ ID NO：4显示编码人Mst2的核苷酸序列(Genbank登记号 NM_006281)；

SEQ ID NO：5显示人显性失活Mst1：Mst1K59R；

SEQ ID NO：6显示斑马鱼中Mst1 & Mst2同源物(NCBI登记号 AAH48033；相应于BC048033的核苷酸序列)；

SEQ ID NO：7-10显示表1中所列出的SOK-1和Mst特异性肽。

表1：

用磷蛋白质组学方法鉴定的Mst特异性肽

 肽   静息血小板   凝血酶激活   的血小板   蛋白质  LADFGVAGQLTDTKQIK   +   +   SOK-1  TLIEDEIATILK   -   +   Mst2  AGNILLNTEGHAK   -   +   Mst1和/或   Mst2  ATATQLLQHPFVR   -   +   Mst1

表2：

人Mst1mRNA和Mst2mRNA在各种人体组织中的表达模式。用特 异性引物通过定量RT-PCR(Taqman)检测Mst1和Mst2mRNAs。

  组织类型   表达水平   Mst1   Mst2   肾上腺   低   低   骨髓   中   低   脑   高   低   结肠   低   低   胎儿脑   高   低   胎儿肝   中   低   心脏   低   低   肾   低   低   肝   低   低   肺   低   低   乳腺   低   低   胰腺   低   低

  胎盘   低   低   前列腺   低   低   唾液腺   低   低   骨骼肌   低   低   小肠   低   低   脊髓   低   低   脾脏   低   低   胃   低   低   睾丸   高   高   胸腺   中   低   甲状腺   低   低   气管   低   低   子宫   低   低

实施例

材料与方法

试剂：

以包含HEPES(pH7.9)，MgCl2，KCl，EDTA，蔗糖，甘油，脱氧胆酸 钠，NP-40，和蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中提供的组织匀浆购自 “BioCat GmbH，Heidelberg”。抗Mst1和Mst2的抗体购自“Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，USA”，“Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，USA”，和“Upstate(由Biomol GmbH，Hamburg供给)”。

用于蛋白质印迹分析的血小板的分离与激活：

把抽取自健康供体的新鲜血液收集到酸-柠檬酸盐-葡萄糖配方 A(ACD-A)溶液(Fresenius Hemocare，Redmond，USA)中。将血液于150g 室温离心20分钟，并回收富含血小板的血浆(PRP)。1体积ACD-A溶液加 到9体积PRP中。进一步在120g离心15分钟，然后用0.5ug/ml PgE1 (SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)处理PRP，通过在360g离心15分钟使 血小板沉淀。用Tyrode溶液(137mM NaCl，2.7mM KCl，12mM NaHCO3， 0.36mM NaH2PO4，1mM MgCl2，10mM Hepes，5.5mM Glucose，0.1％BSA， pH7.4)重悬血小板，然后在室温下不处理或者用1U/ml人凝血酶 (SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)处理血小板1到5分钟，于360g离心 15分钟使血小板沉淀。

蛋白质印迹分析：

按如下制备用于通过蛋白质印迹进行蛋白质表达分析的血小板全SDS 裂解物：按上述方法所获得的血小板沉淀重悬于包含20mM Hepes，100mM NaCl，1％SDS，1mM Na3VO4，10mM NaF pH7.4，5mM EDTA并且补充完 全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的冰预冷的 裂解缓冲液中。将裂解液于4℃摇动20分钟，然后在台式离心机中于 13000RPM，4℃离心20分钟。测定上清中的蛋白质浓度，并且用4-12％ NuPAGE(在组织分布分析的情况下)或10％NuPAGE凝胶 (Invitrogen GmbH，Karlsruhe)分离30ug蛋白，然后转到硝酸纤维素膜上 (Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg)。为了检测Mst1，使用 兔多克隆抗体抗-Mst1(Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，USA)或者 兔多克隆抗体抗-Mst1/Krs-2(Upstate(由Biomol GmbH，Hamburg供 给))。为了检测Mst2，使用山羊多克隆抗体Krs-1(N-19)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，USA)。简言之，用包含5％脱脂奶粉的 TBS-T(20mM Tris-Cl pH7.6，137mM NaCl，0.1％Tween 20 (SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)封闭印迹膜，在4℃摇动，然后用溶于 包含5％脱脂奶粉的TBS-T的兔多克隆抗体抗-Mst1或山羊多克隆抗体 Krs-1(N-19)进行探测。用缀合过氧化物酶的二级抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Cambridgeshire，UK和 SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)温育后，将膜与Lumi-Light Western Blotting Substrate按照制造商的说明书(Roche Diagnostics GmbH， Mannheim)温育，从而进行探测。

磷蛋白的富集：

按如下使用Qiagen公司的磷蛋白纯化试剂盒进行选择性富集：将血小 板沉淀(静息的/凝血酶激活的)重悬浮3ml Qiagen Lysis Buffer(QLB)并 离心(30min，13000xg)。使用BCA试剂盒(Perbio Science Deutschland GmbH，Bonn)确定上清液的蛋白质浓度，并周QLB将蛋白质浓度调节至 2.5mg/25ml。

用4ml QLB平衡磷蛋白质纯化柱后，将血小板溶液以2部分加到柱 子上部。收集穿过级分，然后再加入6ml QLB洗涤柱子。之后，加入500 ul Qiagen洗脱缓冲液，收集洗脱液级分。重复洗脱4次，产生5个洗脱液 级分。测定所有收集级分的蛋白质，显示级分3中蛋白质的量最高。

TCA沉淀后，将每一个关于级分3的30ug蛋白质(静息的/凝血酶 激活的)装到1D-凝胶(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Nupage10％)上。按 照Roth(Carl Roth GmbH+Co.，Karlsruhe)进行胶体考马斯蓝染色。

蛋白质鉴定

凝胶内蛋白质消化：切下考马斯蓝染色的蛋白质并切成直径大约1-2 mm3小块。用100μl洗涤液(50％乙腈/25mM NH4HCO3，pH8.0)洗涤三 次进行脱色，每次洗15-30min。加入50μl乙腈干燥凝胶块；大约10分 钟后除去过量的溶液。然后用15μl胰蛋白酶溶液(5μg/ml)(rec.，蛋白质 组级别，Roche Diagnostics GmbH，Mannheimm)再水化凝胶块，并在对流 箱中37℃温育过夜。然后用30μl 50％乙腈/5％TFA温育萃取肽(三次)。 合并肽萃取物，在真空离心机中冻干并用13μl 0.1％TFA重构。

Nano-LC-MS/MS分析：用nano-ESI-LC-MS/MS系统分析肽样品， 此系统由Ultimate HPLC系统(LC Packings，Amsterdam)及与之相连的 LCQ Deka XP质谱仪(Thermo Finnigan，San Jose)组成。用Famos自动 加样器(LC Packings，Amsterdam)注入13μl样品体积。样品用Switchos组 件(LC Packings，Amsterdam)在C18预装柱(PepMap，内径300μm，长 度5mm)上脱盐；用2％乙腈/0.1％三氟乙酸以流速30μL/min装载与 洗涤样品10分钟。用C18 nanocolumn(PepMap，内径75μm，长度150 mm，LC Packings，Amsterdam)以流速200nL/min分离肽。流动相由2％ 乙腈/0.1％甲酸(溶剂A)和98％乙腈/0.1％甲酸(溶剂B)组成。在45 分钟内从5％B到35％B的线性梯度，然后在10分钟内到100％B的 线性升高实现了肽的洗脱。

nano-LC的毛细管通过MicroTee(Upchurch Scientific，Inc.，Oak Harbor，USA)(此处电压为1.2kV)与电喷雾针相连。由熔融石英毛细管(内 径25μm，外径280μm，Grom Chromatography GmbH， Rottenburg-Hailfingen)通过在实验室拉伸(Sutter Instruments Co.，Novato， USA，Model P-2000)制备nano电喷雾针，针孔直径大约为3μm。

通过XCalibur软件(Thermo Finnigan，San Jose)控制质谱分析，在阳 离子模式下使用基于数据的采集。转移毛细管的温度恒定保持在180℃， 毛细管电压和电子管透镜偏移电压分别为46V和55V。在MS模式(m/z 500-2000，3microscans，最大注射时间50ms)下通过首次扫描事件来检测 从柱子中洗脱的肽，然后使用35％相对碰撞能量(相应于XCalibur软件 设置)进行三次连续的基于数据的MS/MS扫描事件(分离宽度3Da，4 microscans，最大注射时间400ms，激活时间30ms)采集三个最高丰度的 离子(大于5×105计数)。按如下设置动态排阻参数：″重复计数″2，″重复持 续时间″0.5min，″排阻列表大小″25，″排阻质量宽度″+/-1.5Da，″排阻持 续时间″1.50min，不排斥。

质谱：使用SpectrumMill处理质量数据。使用如下参数将原始数据转 换为.pkl-文件：没有″半胱氨酸修饰(cystein modification)″，″最小序列标 签(minimal sequence tag)″＞1，″扫描范围(scan range)″1-9999(全部)， ″[M+H]+″500-4000Da，″(亲本电荷分配parent charge assignment)″find force 1 through 4/find max(z)7/min MS S/N 25，″合并具有相同亲本的扫 描(merge scans with the same parent)″m/z+/-1scan(不合并图谱)。通过 搜索SwissProt数据库鉴定蛋白质，分类限定为哺乳动物。进行搜索时， 母离子和片段的质量匹配耐受性分别设定为+/-1.5Da和+/-0.7Da。允许 的最大胰蛋白酶错切数为2。当鉴定结果在确认过滤中符合如下参数设置 时，认为肽序列标签是可信的：″蛋白质得分(protein score)″＞8，″肽得分 (peptide score)″＞8，″％SPI″＞70；此外，手动检查所有谱图。

斑马鱼分析：

为了确定Z-Tag血栓形成测定中的靶标，使用设计成识别从翻译起始 位点开始前25个核苷酸的反义吗啉代寡核苷酸(morpholinos)。吗啉代寡核 苷酸是从Gene Tools，Inc.Philomath，USA订购的，并且在Z-Tag血栓形 成测定中进行检验。通过向单细胞期Z3胚胎中注射几种浓度(范围是0.83 ng-33.2ng)的每种吗啉代寡核苷酸构建体来评估吗啉代寡核苷酸的有效 浓度。检验在发育的过程中没有展现出任何关于所用浓度的不利改变的 6dpf幼虫对ADP的反应。将注射的胚胎放到28℃，直到进行血栓形成测 定分析。将大约90pmol的ADP注射到吗啉代寡核苷酸注射的幼虫心腔 中。其后5分钟用荧光立体显微镜观察注射ADP的幼虫，估计并记录血小 板移动与否。

CD-血小板的产生：

按照Ungerer，M.等人(2004)Circ.Res.95，e36-e44产生表达Mst1的 显性失活突变体的转基因小鼠血小板。

简言之，通过冲洗小鼠的股骨和胫骨收获小鼠骨髓细胞。在允许大部 分细胞分化为巨核细胞的条件下培养来自新鲜分离骨髓的巨核细胞前体细 胞。将Mst1显性失活突变体Mst1K59R的cDNA克隆到购自Clontech， Heidelberg，Germany的质粒pLEGFP-C1中。一种泛嗜性逆转录病毒包装 细胞系人GP2-293在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中生长，此培养 基包含Glutamax(Invitrogen GmbH，Karlsruhe)，并补充10％胎牛血清 (PAA，Clbe，Germany)，1％丙酮酸钠，100mmol/L(Biochrom AG， Berlin)，1％青霉素/链霉素(Biochrom AG，Berlin)。NIH 3T3细胞生长在补 充5％胎牛血清的DMEM/Glutamax中。在转染前24小时，将细胞按1∶2分 到150mm的培养皿中。通过可以从Clontech得到的加入氯喹(50mmol/L， SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)的磷酸钙共沉淀进行转染。转染后30分 钟，每24小时收集病毒，至少持续三天。

在收获病毒并确定病毒的滴定度后，在48孔板中只加入干细胞因子的 IMDM中培养巨核细胞前体。分离后两天，在存在1，5-二甲基-1，5-二氮十一 亚甲基聚甲溴化物(8μg/mL)和DEAE葡聚糖(1mg/mL)的情况下，用2-5 cfu/细胞的MOI感染细胞。对于共培养实验，在存在10mL IMDM，10mL DMEM，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物和DEAE葡聚糖的情 况下，6×106个转染的GP2-293生产细胞与1.5×106个分离的巨核细胞(分离 后两天)共同培育。这种共培养在37℃培育24小时，并且将具有巨核细胞的 培养基转移到6孔板中培养4-6周。感染后36小时或者共培养开始后36小时， 用细胞的完全培养基(Ungerer，M.等人(2004)同上)和遗传霉素(380 μg/mL)从未感染的细胞中选择感染的细胞。

通过离心和洗涤收获来自培养的血小板。按照各自的说明书，分别用 胶原，凝血酶或瑞斯托菌素激活血小板10分钟。抗小鼠CD41、CD-40L、 CD61和CD62P的抗体购自Pharmingen，Leiden，The Netherlands。用所 描述的FACS分析来评估这些抗原的表达。对于聚集实验，用300μL富 含血小板的血浆或者在包含纤维蛋白原(480μg/mL)和氯化钙(2.5 mmol/L)的Tyrode′s改良缓冲液中的107CD-血小板/mL混合物充满 Chrono-Log 500VS集合度计(aggregometer)。加入各自的激动剂之后的20 分钟连续记录光透射。在存在2mmol/L纤溶酶抑制肽(GPRP)的情况下检 测凝血酶所导致的曲线。

GST-Mst蛋白质在细菌中的表达和Mst激酶测定：

通过RT-PCR从Hela细胞的RNA开始扩增人Mst1和Mst2的全长 序列。按照Invitrogen GatewayTechnology的操作指南，在BP重组反 应中使用所产生的PCR产物获得进入克隆。然后将此序列转移到pDEST15 中用于细菌表达。将pDEST15-MST载体转化到大肠杆菌BL21-AI菌株中， 并且在氨苄青霉素上生长以选择携带目的DNA的转化体。单个菌落接种 到包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，直到达到适当的细胞密度。然 后用0.2％阿拉伯糖(SIGMA-ALDRICH，Taufkirchen)在37℃诱导2.5小 时。诱导结束后，用冰预冷的PBS洗涤细菌，并重悬于裂解缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4，5mM NaF，3mM EDTA，pH7.5补加0.25％Triton X-100，0.25％CHAPS，1mM Na3 VO4和 蛋白酶抑制剂)。用弗氏压碎器成功裂解细菌后，在20000g，4℃离心30 分钟使裂解液澄清。

按照制造商的说明书，用MagneGST蛋白纯化系统(Promega GmbH， Mannheim)从澄清的裂解液中纯化GST重组蛋白。

为了确定体外激酶测定(ATP消耗测定)的最佳条件，将1μg GST(谷胱 甘肽-S-转移酶)-Mst蛋白质与2μg MBP(髓鞘碱性蛋白)和2μM ATP在包 含补加10mM MgCl2或2mM MnCl2的40mM Hepes pH7.5的激酶缓冲液 中进行温育。此外，我们评估了1mM DTT和/或0.02％BSA对激酶活性 的影响。此反应在32℃进行30分钟，并在ATP监测试剂(Monitoring Reagent)(Cambrex Bio Science Nottingham Ltd，Nottingham，UK)中加入 1μM星形孢菌素终止反应，用ATP消耗的生物发光测量与GST对照相比 较。

为了评估非特异性激酶抑制剂星形孢菌素(SIGMA-ALDRICH， Taufkirchen)对Mst1激酶活性的影响，用1μg GST-Mst1蛋白与星形孢菌 素的连续稀释液在32℃预温育30分钟。然后按照上文描述测定激酶活性。 每个测定都以一式三份进行。依照与未处理样品相比ATP消耗的降低来确 定处理的成功。

结果

在血小板中Mst2的初始鉴定

通过对富集的血小板膜使用所称作的PST技术，结合实验生物信息学 分配程序(Kuhn，K.(2003)J.Proteome Res 2，598-609)来鉴定Mst2。使用 该基于LC-MS的分析鉴定Mst2。Mst2被6个高度可信的PST鉴定出来。

通过磷蛋白质组学方法对Mst激酶的鉴定

为了鉴定信号相关蛋白质，用Qiagen公司的IMAC亲和介质从静息 或凝血酶刺激的血小板中富集磷酸化蛋白质。用一维凝胶分离包含大部分 洗脱蛋白的级分。将整个泳道切成条带，并通过胶内胰蛋白酶消化结合 LC-MS/MS分析来鉴定其中所包含的蛋白质。如图1和表1所示，在凝胶 的多个位置发现Mst激酶。除了Mst1和Mst2，还检测到Mst1和2的另 一个同源物SOK1(图1和表1)。这是第一次在血小板中鉴定到SOK1。在 不同分子量的两个条带鉴定到SOK1，这可能是由于SOK1的蛋白酶降解 造成的。

质谱数据给出一些关于功能信息的最早的暗示，因为只在凝血酶激活 的血小板提取物中发现Mst1和Mst2的肽，这可能暗示Mst1和/或Mst2 的刺激物诱导的特异磷酸化。在这些实验中，主要可以鉴定表观分子量约 为35kDa的Mst1和Mst2的蛋白酶切割的形式。

人组织中Mst1和Mst2的表达模式

首先通过Taqman分析来研究Mst1和Mst2在不同人组织中的组织 分布。

根据Taqman分析，Mst1 mRNA在人脑、胎儿脑和睾丸中高水平表 达(表2)。在骨髓、胎儿肝和胸腺中发现中等水平表达。在所有其它组织中 Mst1 mRNA低于检测极限，因此不表达或者低水平表达。因此，Mst1只 在少数组织中表达。与Mst1相比，Mst2 mRNA仅在睾丸中检测到高表达 水平。像Mst1所观察到的一样，在所有其它组织中Mst2 mRNA低于检测 极限，因此不表达或者低水平表达(表2)。

与有核细胞相比，无核血小板仅包含非常少量的mRNA。此外，与从 有核细胞中所获得的mRNA相比，常发现从血小板中分离的mRNA被更 多的降解。因此，在我们的Taqman结果中不包含血小板mRNA，而是用 蛋白质抽提物和蛋白质印迹分析来评估Mst1和Mst2在血小板和其他组织 中的蛋白质表达水平。

Mst1和Mst2在人血小板中表达

为了验证Mst1和Mst2在人血小板中的表达，通过几个步骤从个体供 体的全血中纯化血小板(参见材料与方法)。结果，可以避免其它细胞类型 和血清成分的污染。然后通过在包含SDS的缓冲液中裂解获得血小板沉淀 的全细胞提取物。

Mst1和Mst2在氨基酸水平上具有77.6％的同一性。为了通过蛋白质 印迹区分它们，使用已经通过重组蛋白检验过特异性的抗体。

由于Taqman分析显示Mst1 mRNA在睾丸中具有非常高的表达水平， 因此在通过蛋白质印迹分析Mst1的蛋白表达时，使用人睾丸提取物作为 阳性对照。

如图3所示，Mst1的蛋白水平在睾丸中也是弱表达的，这在一定程度 上确认了Taqman分析的结果。在人血小板中检测到的Mst1的表达水平 远远高于睾丸中的表达水平。此结果在多个供体中都得到了确认。

由于Mst2 mRNA也在睾丸中高表达(如Taqman结果所示(表2))，在 通过蛋白质印迹分析Mst2的蛋白表达时，使用人睾丸提取物作为阳性对 照。如图4所示，Mst2在睾丸中在蛋白质水平上表达，从而确认了Taqman 分析的结果。此外，Mst2还在人血小板中以与睾丸中所观察到的相当的水 平表达，但是其数量显示出少许依赖于供体的可变性。

Mst1和Mst2的组织分布

研究了Mst1和Mst2在包括血小板的多种人组织提取物中的组织分 布。

在蛋白质水平上，Mst1在血小板、睾丸和胸腺中明确表达，其中恒定 在血小板中发现最高表达水平。Mst1在检查的其它组织中不表达(图5)。 在某些样品中，尤其是在结肠、心脏、肾脏和皮肤中，可以在50kDa左右 检测到一条额外的带。通过用不同的Mst1特异性抗体(Upstate(由Biomol GmbH，Hamburg供给))探测相同的样品，验证了这种信号的非特异性性 质：与图5所示的结果一致，可以确定Mst1在血小板、睾丸和胸腺中表 达，而在其它组织中没有检测到信号(数据未显示)。与Taqman结果(表2) 相比，在脑中没有在蛋白水平上检测到Mst1。

在蛋白质水平上，Mst2在几种组织(包括睾丸、胸腺和皮肤)中强烈表 达(图6)。在血小板、肾脏和心脏中可以检测到中等到高水平表达。在结肠、 胰腺和肝脏中观察到低水平表达(图6)。

Mst2的这些组织分布分析的另一个重要发现是，在蛋白质水平上与 mRNA水平上发现的结果明显不同，其中只在睾丸中检测到了Mst2 mRNA的表达(表2)。

斑马鱼中Mst1和Mst2的功能确认

开发了用于化合物筛选和靶标鉴定与确认的转基因斑马鱼体内血栓形 成测定。在测定中，特异性标记具有荧光蛋白的血小板(血小板的斑马鱼等 同物)。使用Z-Tag(Zygogen，LLC)，通过注射相关的激动剂到具有荧光 血小板的TG(GPIIb:G-RCFP)Z3斑马鱼品系的Z-Tag胚胎心腔中，开发 了一种用ADP作为血小板激动剂的血栓形成相关测定。两个已知的并且经 过确认的血小板靶标GPIIb受体和P2Y12受体在斑马鱼中是保守的，并用 快速反义吗啉代技术展示了它们在ADP诱导的血小板聚集中的作用，从而 确认了斑马鱼模型系统。

使用基于吗啉代的反义技术((Zygogen，LLC))将Mst1和Mst2表征为 潜在血栓形成靶基因。与人的情况相比，斑马鱼基因组只包含一个代表 Mst1和Mst2的同源序列。此基因产物BC048033(与人Mst1和Mst2分 别具有76.8％和88.8％的同一性)代表完整的斑马鱼直向同源物。斑马鱼 中另一个潜在的同源基因BC045867显示出与Mst1和Mst2的另一个人同 源序列Mst3具有更高程度的相似性(Schinkmann，K.等人(1997)J.Biol. Chem.272，28695-28703)。BC045867对于人Mst3具有～76％的保守性，但 是对于人Mst1和Mst2分别只有～45％和～47％。相比，BC048033对于 人Mst3具有仅仅～45％的保守性。在Sanger中心斑马鱼基因组数据库中 搜索时没有鉴定到任何其它潜在的Mst1或Mst2斑马鱼基因，这提示在人 类中存在的两种同源物(Mst1和Mst2)可以代表基因复制事件。因此，通过 使用反义技术消除斑马鱼BC048033的表达，与人的情况相比，Mst1和 Mst2的表达被平行地“击倒”。

为了验证Z-Tag血栓形成测定中的靶标，设计成识别从翻译起始位点 开始前25个核苷酸的反义吗啉代寡核苷酸已经表明是有效的。因此确定 BC048033的5’末端。吗啉代寡核苷酸是从Gene Tools，Inc.Philomath， USA订购的，并且在Z-Tag血栓形成测定中进行检验。吗啉代研究分两个 阶段进行。第一部分是初步阶段，评估每种吗啉代寡核苷酸的有效浓度。 这通过向单细胞期Z3胚胎中注射几种浓度(范围是0.83ng-33.2ng)的吗 啉代寡核苷酸构建体来确定。对于Mst1/Mst2吗啉代寡核苷酸，没有观察 到所检验的浓度对于胚胎发育不利的副作用。使用GPIIb受体和P2Y12受 体的击倒作为这些实验的阳性对照。

进行盲法研究的这些实验的结果明确的提示Mst1/Mst2对于ADP诱 导的血小板聚集是重要的(图7)。此外，在盲法研究中，作为阳性对照的 GPIIb和P2Y12吗啉代寡核苷酸是有效的(图7)。使用针对多巴胺转运蛋 白(DAT)的吗啉代寡核苷酸作为阴性对照。已经发现该吗啉代寡核苷酸在 神经退行性疾病模型中是有效的(Zygogen未发表数据)。正如所预测的， DAT吗啉代寡核苷酸对于ADP诱导的血小板聚集没有任何效果。

在本研究中，斑马鱼中Mst1/Mst2的同源物BC048033是最优候选基 因。它对ADP诱导的聚集的影响频率大于所观察的任何其它基因(包括 GPIIb和P2Y12受体)。此外，基因击倒不是致命的，不会引起斑马鱼幼虫 发育的任何延迟。这可能暗示针对此蛋白药物的负作用是很小的(如果有的 话)，从而强烈支持它是开发抗-血栓形成药物的潜在的靶基因。

在培养来源血小板中Mst1的功能验证

使用从巨核细胞前体细胞产生培养来源(CD)血小板的系统，它可用于 过表达转基因CD-血小板中的靶基因及突变体(Ungerer，M.等人(2004) 同上)。此系统曾用于确认小鼠巨核细胞前体细胞来源的CD血小板中的 Mst1。在培养来源的血小板(CD血小板)中过表达Mst1的显性失活突变体 Mst1K59R，目的是研究由所产生的对天然Mst1活性的干扰所引起的这些血 小板的任何功能变化。

逆转录病毒诱导的Mst1K59R的过表达没有改变巨核细胞的形态，与只 表达绿色荧光蛋白的细胞或未转染的对照细胞相比，无论是脱落的CD血 小板还是巨核细胞特异的标志物的表达都没有改变。所产生的CD血小板 的数目也与其它血小板组中的类似。产生的转基因表达CD血小板用于研 究表面受体的依赖于激活的表达，聚集谱和密度和α颗粒释放。

通过研究CD41和CD61在CD血小板上的表达来检验激动剂刺激后 纤维蛋白原受体的表面募集。如图8所示，显性失活突变体对Mst1的抑 制导致纤维蛋白原受体激活标志物CD41的瑞斯托菌素诱导的表面募集的 显著抑制。对于CD61的表面募集，也观察到了类似结果。CD40L用作血 小板储备和颗粒分泌物的标志物，通过研究P选择蛋白(CD62P)的表面转 运来检验α脱粒。响应瑞斯托菌素，CD40L和P选择蛋白的表面募集在表 达显性失活Mst1突变体Mst1K59R的CD血小板中显著降低(图8)。

此外，在表达Mst1K59R的CD血小板中凝血酶诱导的聚集被抑制(图 9)。类似地，在表达Mst1K59R的CD血小板中瑞斯托菌素诱导的聚集((0.8 mg/ml瑞斯托菌素))被抑制。

总而言之，在哺乳动物培养来源的血小板中的结果证实了在斑马鱼中 所进行的实验所阐明的功能相关性。此外，它们强调Mst1作为开发干扰 血小板激活和聚集的药物新靶标的作用。

Mst1和Mst2体外激酶测定

为了评估适合最终完成调节剂鉴定的体外激酶测定的条件，在不同的 缓冲液中检验了细菌中表达的重组GST-Mst蛋白质的体外活性。如图10 所示，对于GST-Mst1，在所有包含2mM MnCl2并且独立地加入1mM DTT 或0.02％BSA的样品中，我们观察到ATP含量的最大的减少，从而相应 于最高水平的激酶活性。对于GST-Mst2也观察到了类似的结果，尽管总 的ATP消耗从来没达到对GST-Mst1所观察到的程度，这提示GST-Mst2 重组蛋白具有较低的激酶活性。

在对于Mst1和Mst2建立最优缓冲条件(40mM Hepes pH7.5，2mM MnCl2)后，我们研究了非特异性激酶抑制剂星形孢菌素对GST-Mst1激酶 活性的影响。在存在不同浓度(1μM到244pM)抑制剂的情况下进行 GST-Mst1激酶测定。如图11所示，星形孢菌素可以完全抑制MST1的活 性，IC50约为600pM。

这些结果显示可能优化Mst1激酶测定的条件。此外，这些条件成功 用于研究激酶抑制剂星形孢菌素的作用，因此证实这种测定可用于依照本 发明体外筛选测定作为Mst1和/或Mst2活性调节剂的化合物。

基于报道分子的通路作图

使用不同的细胞系和刺激，建立了用于通路作图的基于报道分子的细 胞系统。这种测定允许研究过表达的目的蛋白对内源通路的影响。通过测 量下游报道基因荧光素酶(其表达是由通路特异性启动子所驱动的)的诱导 扰动，可以评估目的蛋白参与特异的信号转导通路的情况。

据显示，与未诱导的对照载体相比，Mst1在HEK293T细胞中的过表 达引起AP-1、NF-κB和p53启动子的显著激活。因此可以用Mst1过表达 并且这种诱导型启动子用于读出的系统检验Mst1活性调节剂的细胞作用 和功效。

序列表

<110>塞诺菲-安万特股份有限公司

<120>Mst蛋白质在治疗血栓栓塞疾病中的用途

<130>DE2005/013

<150>05006359.3

<151>2005-03-23

<160>10

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>487

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Met Glu Thr Val Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys

1               5                   10              15

Leu Asp Glu Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu Val Phe Asp Val

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Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Ser Val Tyr Lys Ala Ile

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Ser Asp Leu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys

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Glu Glu Asp Glu Met Asp Ser Gly Thr Met Val Arg Ala Val Gly Asp

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Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln

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Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys

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<210>2

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<212>DNA

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<210>3

<211>491

<212>PRT

<213>人

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Ser Gly Gln Val Val Ala Ile Lys Gln Val Pro Val Glu Ser Asp Leu

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Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys Asp Ser Pro

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Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg Lys Ile His

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Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Met Ala

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Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu Val

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Gln Gln Arg Glu Leu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Ser Asp Glu Asp Glu

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Leu Asp Ser His Thr Met Val Lys Thr Ser Val Glu Ser Val Gly Thr

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His Lys Glu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ile Arg Gln Val Pro Val Glu

    50                  55                  60

Ser Asp Leu Gln Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys

65                  70                  75                  80

Asp Ser Pro His Val Val Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr

                85                  90                  95

Asp Leu Trp Ile Val Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Val Ser Asp

            100                 105                 110

Ile Ile Arg Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Thr

        115                 120                 125

Ile Leu Gln Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg

    130                 135                 140

Lys Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu

145                 150                 155                 160

Gly His Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp

                165                 170                 175

Thr Met Ala Lys Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala

            180                 185                 190

Pro Glu Val Ile Gln Glu Ile Gly Tyr Asn Cys Val Ala Asp Ile Trp

        195                 200                 205

Ser Leu Gly Ile Thr Ala Ile Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr

    210                 215                 220

Ala Asp Ile His Pro Met Arg Ala Ile Phe Met Ile Pro Thr Asn Pro

225                 230                 235                 240

Pro Pro Thr Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp

                245                 250                 255

Phe Val Lys Gln Cys Leu Val Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala

            260                 265                 270

Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe Val Arg Ser Ala Lys Gly Val Ser

        275                 280                 285

Ile Leu Arg Asp Leu Ile Asn Glu Ala Met Asp Val Lys Leu Lys Arg

    290                 295                 300

Gln Glu Ser Gln Gln Arg Glu Val Asp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser

305                 310                 315                 320

Glu Glu Asp Glu Met Asp Ser Gly Thr Met Val Arg Ala Val Gly Asp

                325                 330                 335

Glu Met Gly Thr Val Arg Val Ala Ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn

            340                 345                 350

Thr Met Ile Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln Leu Gly Thr Met

        355                 360                 365

Val Ile Asn Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr Met Lys Arg Arg

    370                 375                 380

Asp Glu Thr Met Gln Pro Ala Lys Pro Set Phe Leu Glu Tyr Phe Glu

385                 390                 395                 400

Gln Lys Glu Lys Glu Asn Gln Ile Asn Ser Phe Gly Lys Ser Val Pro

                405                 410                 415

Gly Pro Leu Lys Asn Ser Ser Asp Trp Lys Ile Pro Gln Asp Gly Asp

            420                 425                 430

Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr Val Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu

        435                 440                 445

Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Gln Glu Ile Glu Glu Ile Arg Gln

    450                 455                 460

Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp Ala Ile Glu Ala Lys

465                 470                 475                 480

Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe

                485

<210>6

<211>492

<212>PRT

<213>斑马鱼(Brachydunio rerio)

<400>6

Met Glu His Ser Val Pro Lys Asn Lys Leu Lys Lys Leu Ser Glu Asp

1               5                   10                  15

Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu Val Phe Asp Val Leu Glu Lys Leu

            20                  25                  30

Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Ser Val Phe Lys Ala Ile His Lys Glu Ser

        35                  40                  45

Gly Gln Val Val Ala Ile Lys Gln Val Pro Val Glu Ser Asp Leu Gln

    50                  55                  60

Glu Ile Ile Lys Glu Ile Ser Ile Met Gln Gln Cys Asp Ser Pro Tyr

65                  70                  75                  80

Val Val Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr Asp Leu Trp Ile

                85                  90                  95

Val Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Val Ser Asp Ile Ile Arg Leu

            100                 105                 110

Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu Ile Ala Thr Val Leu Lys Ser

        115                 120                 125

Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg Lys Ile His Arg

    130                 135                 140

Asp Ile Lys Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala Lys

145                 150                 155                 160

Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Met Ala Lys

                165                 170                 175

Arg Asn Thr Val Ile Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu Val Ile

            180                 185                 190

Gln Glu Ile Gly Tyr Asn Cys Val Ala Asp Ile Trp Ser Leu Gly Ile

        195                 200                 205

Thr Ser Ile Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr Ala Asp Ile His

    210                 215                 220

Pro Met Arg Ala Ile Phe Met Ile Pro Thr Asn Pro Pro Pro Thr Phe

225                 230                 235                 240

Arg Lys Pro Glu His Trp Ser Asp Asp Phe Thr Asp Phe Val Lys Lys

                245                 250                 255

Cys Leu Val Lys Asn Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala Thr Gln Leu Leu

            260                 265                 270

Gln His Pro Phe Ile Val Gly Ala Lys Pro Val Ser Ile Leu Arg Asp

        275                 280                 285

Leu Ile Thr Glu Ala Met Asp Met Lys Ala Lys Arg Gln Gln Glu Gln

    290                 295                 300

Gln Arg Glu Leu Glu Glu Asp Asp Glu Asn Ser Glu Glu Glu Val Glu

305                 310                 315                 320

Val Asp Ser His Thr Met Val Lys Ser Gly Ser Glu Ser Ala Gly Thr

                325                 330                 335

Met Arg Ala Thr Gly Thr Met Ser Asp Gly Ala Gln Thr Met Ile Glu

            340                 345                 350

His Gly Ser Thr Met Leu Glu Ser Asn Leu Gly Thr Met Val Ile Asn

        355                 360                 365

Ser Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Gly Ser Met Arg Arg Asn

    370                 375                 380

Pro Thr Ser Gln Gln Ile Gln Arg Pro Ser Phe Met Asp Tyr Phe Asp

385                 390                 395                 400

Lys Gln Asp Ser Asn Lys Ala Gln Glu Gly Phe Asn His Asn Gln Gln

                405                 410                 415

Asp Pro Cys Leu Ile Ser Lys Thr Ala Phe Pro Asp Asn Trp Lys Val

            420                 425                 430

Pro Gln Asp Gly Asp Phe Asp Phe Leu Lys Asn Leu Asp Phe Glu Glu

        435                 440                 445

Leu Gln Met Arg Leu Thr Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Arg Glu Ile

    450                 455                 460

Glu Glu Leu Arg Gln Arg Tyr Thr Ala Lys Arg Gln Pro Ile Leu Asp

465                 470                 475                 480

Ala Met Asp Ala Lys Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe

                485                 490

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>7

Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Ile

1               5                   10                  15

Lys

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>8

Thr Leu Ile Glu Asp Glu Ile Ala Thr Ile Leu Lys

1               5                   10

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>9

Ala Gly Asn Ile Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala Lys

1               5                   10

<210>10

<211>13

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>10

Ala Thr Ala Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe Val Arg

1               5                   10