筛选方法
阅读：736发布：2020-06-26
专利汇可以提供筛选方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供筛选神经 精神病 发作或倾向于发作之 哺乳动物 的方法。更特别地，本发明提供通过筛选蛋白14-3-3ζ之功能性 水 平的降低来筛选 精神分裂症 发作或倾向于发作之哺乳动物的方法。在一个相关的方面中，本发明还提供了通过筛选蛋白14-3-3ζ功能性水平的变化来监测经诊断患有神经精神病(如精神分裂症)之患者的装置/手段。本发明可能在例如评价 预防 性或 治疗 性处理方案的效 力 或者另外监测可能发生于患者的生理或代谢变化之影响的情形下有用。本发明的方法在广泛的应用中有用，包括尤其是，提供了鉴定易感于神经精神病症(如以一种或更多种精神分裂症症状为特征的病症)发作的哺乳动物的装置/手段，因此使得能够实施预防性或者早期治疗性干预以努力减少或者防止病症的发作。本发明还提供了确认诊断的装置/手段，否则其将仅仅基于阳性和 阴性症状 的评估。，下面是筛选方法专利的具体信息内容。
1.一种筛选发作或倾向于发作神经精神病症之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平以及将蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低相对于对照水平相关联，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
2.一种在经诊断患有神经精神病症发作的哺乳动物中监测所述病症进展的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平以及将蛋白14-3-3ζ功能性水平的改变相对于之前针对该哺乳动物所获得的水平相关联，其中与之前针对该哺乳动物所获得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平相等或较低是不良预后的指示，而与之前针对该哺乳动物所获得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平较高是改善预后的指示。
3.根据权利要求1或者2的方法，其中所述神经精神病症以一种或者更多种精神分裂症的症状为特征。
4.根据权利要求3的方法，其中所述病症为精神分裂症、分裂型人格障碍、精神病、两极性障碍、躁狂抑郁症、情感障碍、精神分裂症样疾病、分裂情感障碍、精神病性抑郁症、孤独症、药物引起的精神病、谵妄、酒精戒断综合征或者痴呆引起的精神病。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其中作为测试对象的哺乳动物已经呈现一种或者更多种阳性或阴性症状或思维障碍。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平为蛋白
14-3-3ζ功能的水平。
7.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平为蛋白
14-3-3ζ的绝对水平。
8.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ的功能性水平通过选自下述的方法确定：
(i)筛选蛋白14-3-3ζ翻译产物的水平；
(ii)筛选蛋白14-3-3ζRNA的水平；
(iii)筛选与蛋白14-3-3ζ基因相关之染色质蛋白的变化；
(iv)筛选蛋白14-3-3ζDNA甲基化的变化；以及
(v)筛选蛋白14-3-3ζ与DISC1形成复合体之能力的变化。
9.根据权利要求8的方法，其中所述RNA为mRNA。
10.根据权利要求8的方法，其中所述甲基化变化为超甲基化。
11.根据权利要求8的方法，其中所述蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体为蛋白14-3-3ζ和
75kDa DISC1同工型间的复合体。
12.根据权利要求1-11任一项的方法，其中所述哺乳动物为人。
13.根据权利要求1-12任一项的方法，其中所述生物样品为脑脊液、外周血或者成体来源神经干细胞。
14.根据权利要求13的方法，其中所述成体来源神经干细胞分离自牙髓、毛囊或者鼻窝。
15.功能性蛋白14-3-3ζ缺陷的非人哺乳动物，其中编码蛋白14-3-3ζ的基因已经缺失。
16.根据权利要求15的哺乳动物，其中所述哺乳动物为小鼠。
17.筛选模拟蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1复合体形成或者以其他方式改善精神分裂症表型症状之物质的方法，所述方法包括向权利要求15或者16的非人哺乳动物施用推定的调节性物质和筛选表达改变的表型。
18.根据权利要求17的方法，其中所述表达改变的表型为使用下面任一种或更多种来评估的行为：
(i)运动功能测试；
(ii)物体识别测试；
(iii)高架十字杆测试；
(iv)PPI测试；
(v)逃脱水迷宫测试。
筛选方法
技术领域
[0001] 本发明提供筛选神经精神病(neuropsychiatric disorder)发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法。更特别的，本发明提供通过筛选蛋白14-3-3ζ之功能性水平的降低筛选精神分裂症(schizophrenia)发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法。在相关的方面中，本发明还提供了通过筛选蛋白14-3-3ζ功能性水平的变化监测经诊断患有神经精神病(如精神分裂症)患者的手段/装置(means)。本发明可能在例如评价预防性或者治疗性处理方案的效力或者另外监测可能发生于患者的生理或代谢变化之影响的情形下有用。本发明的方法在广泛的应用中有用，包括尤其是，提供了鉴定易感于神经精神病症(如以一种或更多种精神分裂症症状为特征的病症)发作的哺乳动物的手段/装置，因此使得预防性或者早期治疗性干预能够实施以努力减少或者防止病症的发作。本发明还提供了确认诊断的手段/装置，否则其将仅仅基于阳性和阴性症状的评估。
[0002] 在相关的方面中，本发明还提供了动物模型，其可用于筛选或者评价在治疗神经精神病症中有用的物质，等等。
背景技术
[0004] 本说明书中对任何现有技术的参考不是也不应该作为对所述现有技术形成在澳大利亚公知常识之部分的承认或者任何形式的暗示。
[0005] 精神分裂症是对于人类已知的最能致残和情绪上最有破坏性的疾病之一。不幸地是，因为长久以来一直对精神分裂症存在误解，所以使得其受到相对小的关注且其受害者受到不应有的污蔑。事实上，精神分裂症是非常普遍的病症。其对两种性别的影响是相当的并且侵袭了全世界约1％的人群。另外的2-3％具有分裂型人格障碍(schizotypal personality disorder)，其为所述疾病的温和形式。因为其流行性和严重性，已经对精神分裂症进行了广泛的研究以努力开发出用于诊断该疾病更好的标准。
[0006] 精神分裂症的特征是一系列独特和可预测的症状。将最普遍与疾病相关的所述症状称为阳性症状，其表示非常异常行为的存在。所述异常行为包括思维障碍(thought disorder)(难以跟上讲话或者从一个主题跳到另一个而没有逻辑联系)、妄想(delusion)(迫害、罪行、夸大或者被外部控制的错误信念)和幻觉(hallucination)(视觉的或者听觉的)。思维障碍是清晰且有逻辑的进行思考之能力的降低。其经常表现为无联系和无意义的语言，这致使患有精神分裂症的人不能参与交谈，使得其与家庭、朋友和社会疏远。妄想在患有精神分裂症的个体中间非常普遍。受影响的人可能相信其被阴谋地对待了(称为“偏执型妄想(paranoid delusion)”)。“播散(Broadcasting)”描述了妄想的一种，其中患有所述疾病的个体相信其他人可以听见他的想法。幻觉可以是听到、看到或者甚至感觉到的。其最经常的是仅被受折磨的人以声音的形式听到。所述声音可以描述所述人的行为、警告他有危险或者告诉他做什么。有时个体可以听到许多声音进行交谈。比上述“阳性症状”和“思维障碍”更不明显但是同样严重的是缺陷或者阴性症状，其代表正常行为的不存在。所述行为包括淡漠或者迟钝的情感(affect)(即缺少情绪表达)、冷漠、社会戒断和缺乏自知力(insight)。
[0007] 精神分裂症的发作通常发生在青春期或者成年早期，虽然已知在老人中出现。发作可以伴随急性症状是快速的在几周内产生，或者其可以是缓慢的在几个月或几年形成。虽然精神分裂症可以在生命中的任何点影响任何人，然而在遗传上易患该病的人群中其在一定程度上更普遍，一般在青春期晚期或者成年早期发生第一次精神病情节(first psychotic episode)。作为都无该疾病父母之后代发展成精神分裂症的可能性为1％。作为父母之一患有该疾病之后代发展成精神分裂症的可能性大约为13％。作为父母二者都患有该疾病之后代发展成精神分裂症的可能性大约为35％。这表明了遗传联系的存在。
[0008] 患有精神分裂症人中有四分之三在16和25岁间发展成疾病。发作在30岁后不普遍且在40岁后很少。在16-25岁年龄组中，精神分裂症影响更多的男性，而不是女性。在25-30岁组中，在女性中的事件多于男性。
[0009] 通常，任何疾病的研究需要有用于诊断的良好标准。事实上，诊断应该最终基于病因，即基于疾病是由遗传缺陷、病毒或细菌感染、毒素还是胁迫所导致。不幸地是，大多数精神疾病的病因是未知的，因此这些病症仍然根据下面受影响的4种主要精神力(mental faculty)进行分类：
[0010] (i)思维和认知障碍
[0011] (ii)情绪障碍
[0012] (iii)社会行为障碍；以及
[0013] (iv)学习、记忆和智力障碍。
[0014] 因此，由于对所述病症的生物学原因知之甚少，所以仍然需要阐明导致并发展所述疾病的机制。
[0015] 14-3-3蛋白构成了高度保守的调节分子家族，其在整个发育过程中和在成体组织中大量表达。这些蛋白质包括7种不同同工型(β、ζ、ε、γ、η、τ、σ)，其结合多种功能不同的信号分子以控制细胞周期调节、增殖、迁移、分化和凋亡(Berg et al.Nat Rev Neurosci2003；4(9)：752-762；Fu et al.Annu Rev Pharmacol Toxicol2000；40：617-647；Toyo-oka et al.Nat Genet2003Jul；34(3)：274-285；Aitken A.，Semin Cancer Biol2006；
16(3)：162-172；Rosner et al.Amino Acids2006；30(1)：105-109)。
16(3)：162-172；Rosner et al.Amino Acids2006；30(1)：105-109)。
[0016] 至今，蛋白14-3-3家族分子在精神分裂症中的作用(如果有的话)依然是难以描述的。尽管到目前为止尚未得出结论，一些研究已经关注于鉴定与倾向于发展成神经精神病症(如精神分裂症)相关的单核苷酸多态性。研究旨在调查蛋白14-3-3同工型水平的变化，不考虑那些分子是否突变，已经趋向聚焦于η和θ同工型水平的变化，虽然至今还没有任何其为神经精神病症发作之可靠标记物的结论性证据。关于蛋白质14-3-3其他同工型(如β和ζ)，Wong等人(2005)发现在精神分裂症和两极性障碍(bipolar disorder)中的表达水平无变化。Middleton等人(2005)进行的更加深入并陈述这些特别的同工型似乎不直接与发展成精神分裂症的遗传风险相关，且没有标记物提供了与精神分裂症强烈的关系。
[0017] 然而，与所述发现相反，在作为本发明先导的工作中，已经确定了蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低与神经精神病(例如以一种或者更多种精神分裂症症状为特征的病症)发作或者倾向于发作相关。更进一步，还已经确定14-3-3ζ/DISC1复合体形成水平的降低具有类似的诊断作用。这些发现目前已经促进了方法的设计从而常规地和准确地筛选个体来确认神经精神病发作或者倾向于发作。
发明内容
[0018] 下面整个说明书和权利要求，除非上下文另有要求，词“包括”和变化(如“包含”和“含有”)将理解为指包含所陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但是并不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。
[0019] 如本文所使用，术语“来源于”用来表示特定的整体或者整体的组已源自特定的物类，但是并不一定直接从所述特定的来源获得。而且，如本文使用的没有数词限定的表述包括复数，除非上下文清楚地另有规定。
[0020] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明归属的领域之普通技术人员之一所通常理解的具有同样的意义。
[0021] 本领域技术人员会意识到除了那些特别描述的，本文描述的本发明可进行变化和修改。应了解本文描述的本发明包括所有所述的变化和修改。本发明还包括所有这样的步骤、特征、在本说明书中个别地或全体地提到或者表明的组合物和化合物，以及任何和所有任何两种或多种所述步骤或特征的组合。
[0022] 本说明书含有使用程序PatentIn3.5版准备的核苷酸序列信息，本文在书目后呈现所述信息。每条核苷酸序列在序列表中通过数字指示符(numeric indicator)<210>来识别，随后为序列标识(sequence identifier)(例如<210>1、<210>2等)。序列的长度、类型(DNA、RNA等)和每条核苷酸序列的来源生物分别以数字指示域<211>、<212>和<213>提供的信息表明。说明书中提到的核苷酸序列通过指示符SEQ ID NO：来确定，然后为序列标识(例如：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等)。说明书中提到的序列标识与序列表中的数字指示域<400>提供的信息相关联，所述数字指示域后跟着序列标识(例如<400>1、<400>2等)。就是说，说明书中详述的SEQ ID NO：1与序列表中指明的<400>1序列相关联。
[0023] 本发明的一个方面涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0024] 本发明的另一个方面提供筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0025] 因此在另一方面中提供筛选以一种或更多种精神分裂症症状为特征的病症的发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0026] 在另一方面中提供筛选精神分裂症的发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是精神分裂症发作或倾向于发作的指示。
[0027] 因此，本发明提供在呈现一种或者更多种阳性或阴性症状或思维障碍之人中诊断神经精神病症发作的方法，所述方法包括在来自所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作的指示。
[0028] 本发明的另一个方面涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定编码蛋白14-3-3ζ基因的表达水平，其中与对照水平相比所述表达水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0029] 本发明的另一个方面涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成的水平，其中与对照水平相比所述复合体形成水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0030] 本发明的另一个方面涉及监测在经诊断患有神经精神病症发作的哺乳动物中所述病症进展的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与之前从所述哺乳动物获得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或较低是不良预后的指示，而与之前从所述哺乳动物获得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平较高是改善预后的指示。
[0031] 本发明的另一个方面涉及监测已确定神经精神病症倾向于发作之患者的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与之前从所述哺乳动物获得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或较低是改善预后的指示。
[0032] 本发明的另一个方面涉及功能性蛋白14-3-3ζ缺陷的非人哺乳动物，其中已检测了编码蛋白14-3-3ζ的基因。
[0033] 本发明的另一个方面涉及筛选模拟蛋白14-3-3ζ功能(functionality)或者14-3-3ζ/DISC1复合体形成或者以其他方式改善精神分裂症表型症状之物质的方法，所述方法包括向14-3-3ζ敲除之非人动物施用推定的调节性物质和针对改变的表型进行筛选。
附图说明
附图说明
[0034] 图1：14-3-3ζ缺陷小鼠证明异常认知和行为特性。(a)在旷场试验(open field062-/- 062+/+
test)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11)比14-3-3ζ 同窝幼畜(littermate)(实心柱；n＝11)在5-30周龄时具有更多的探索行为。(b)在高架十字迷宫(elevated plus
062-/- 062+/+
maze)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝12)比14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝12)在
062-/-
开放臂花费更长时间。(c)在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ 小鼠(空心圆；n＝
062+/+
12)比14-3-3ζ 小鼠(封闭方形；n＝12)具有更低的空间学习(1-6天)和记忆(M1
062+/+ 062-/-
和M2)能力。(d)相比14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝11)，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；
n＝11)具有减少的PPI，具有在70dB基准线上2、4、8和16dB的前脉冲(PP)和100毫秒(msec)的刺激间时间间隔。还显示了来自所有PP强度的数据平均值(Avg)。来自雄性和雌性小鼠的数据在所有图中汇集。误差柱以平均+SEM呈现。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
test)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11)比14-3-3ζ 同窝幼畜(littermate)(实心柱；n＝11)在5-30周龄时具有更多的探索行为。(b)在高架十字迷宫(elevated plus
062-/- 062+/+
maze)中，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝12)比14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝12)在
062-/-
开放臂花费更长时间。(c)在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ 小鼠(空心圆；n＝
062+/+
12)比14-3-3ζ 小鼠(封闭方形；n＝12)具有更低的空间学习(1-6天)和记忆(M1
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和M2)能力。(d)相比14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝11)，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；
n＝11)具有减少的PPI，具有在70dB基准线上2、4、8和16dB的前脉冲(PP)和100毫秒(msec)的刺激间时间间隔。还显示了来自所有PP强度的数据平均值(Avg)。来自雄性和雌性小鼠的数据在所有图中汇集。误差柱以平均+SEM呈现。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
[0035] 图2：14-3-3ζ在阿蒙氏角(Ammon's horn)的锥体细胞和齿状回的颗粒神经元中的表达。(a)(i)通过14.5dpc小鼠胚胎脑的冠状切面的图示，描绘了海马(hippocampus)的不同区域。V，脑室(ventricle)；IZ，中间区(intermediate zone)；VZ，脑室区(ventricular zone)。(ii)通过P0小鼠海马的冠状切面的图示。来自起源于脑室神经上皮(淡蓝)和接近伞部(fimbria)的神经上皮(深蓝)之海马原基的神经元。所述三个亚区包含组成阿蒙氏角和其层的海马角(CA1-3)的锥体神经元(s0，始层(stratum oriens)；sp，锥体层(stratum pyramidale)；sl，透明层(stratum lucidum)；sr，辐射层(stratum radiatum))，其以涉及在齿状回(DG)中的颗粒神经元的位置描绘。(b)(i-ii)在14.5dpc发育海马的中间区中检测到的14-3-3ζ免疫反应性。(iii-iv)在P0，14-3-3ζ阳性神经元位于锥体细胞层。(v)锥体神经元(星号)的更高放大倍数显示了14-3-3ζ具有点状胞质定位(punctate cytoplasmic localisation)。(c)X-gal染色显示14-3-3ζ在P0、
062+/-
P7和成体14-3-3ζ 海马中的内源表达。14-3-3ζ-lacZ的高水平表达在锥体和颗粒神经元中明显。(d)海马神经元培养物。(i)用EB1染色的14-3-3ζ(红)。(ii)MAP2阳性(绿)海马神经元。(iii)14-3-3ζ和MAP2的重叠突出在MAP2阳性神经突中的共表达(箭头)。(e)14-3-3ζ蛋白(27kDa)在WT小鼠阿蒙氏角和齿状回中表达。来自成体WT
062-/-
和14-3-3ζ 小鼠裂解物的蛋白质印迹与针对14-3-3ζ的抗体(EB1)进行免疫印迹和探针探测。使用抗(3-肌动蛋白(42kDa)抗体作为加样对照。比例尺＝100μm(bi-iv；c；
di-iii)，25μm(bv)。
062+/-
P7和成体14-3-3ζ 海马中的内源表达。14-3-3ζ-lacZ的高水平表达在锥体和颗粒神经元中明显。(d)海马神经元培养物。(i)用EB1染色的14-3-3ζ(红)。(ii)MAP2阳性(绿)海马神经元。(iii)14-3-3ζ和MAP2的重叠突出在MAP2阳性神经突中的共表达(箭头)。(e)14-3-3ζ蛋白(27kDa)在WT小鼠阿蒙氏角和齿状回中表达。来自成体WT
062-/-
和14-3-3ζ 小鼠裂解物的蛋白质印迹与针对14-3-3ζ的抗体(EB1)进行免疫印迹和探针探测。使用抗(3-肌动蛋白(42kDa)抗体作为加样对照。比例尺＝100μm(bi-iv；c；
di-iii)，25μm(bv)。
[0036] 图3：14-3-3ζ缺陷小鼠显示海马分层(lamination)的缺陷。(a)尼氏染色显062-/-
示WT和14-3-3ζ 小鼠从14.5dpc直至出生后56天(P56)海马的发育。海马细胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的锥体层中(sp)分散(iv、vi、viii)。楔形突出了在辐射层(stratum radiatum，sr)中海马锥体神经元重复的层。星号突出了在始层(stratum oriens，s0)中异位定位的锥体细胞。箭头标明了在齿状回中松散排列的颗粒神经元。(b)将Thy1-YFP转
062 062-/-
基因表达引入14-3-3ζ 背景揭示了在14-3-3ζ 小鼠中海马锥体神经元的严重解体。
蓝，DAPI；绿，Thy1表达。(c)从所示基因型的P0(i-iv)和P56(v-vi)小鼠中获得的海马的冠状切面。更深层的锥体层由WT海马中的NeuN阳性锥体细胞组装(iii，黄楔形)形成
062-/-
从CA1至CA3的一致成熟区(uniform mature zone)。在14-3-3ζ 海马中，具有一些在CA3锥体区更深区(黄楔形)和表面区(白楔形)异位定位的NeuN阳性成熟锥体细胞的成
062-/-
熟区更不一致。在P5614-3-3ζ 小鼠中，对在重复CA3亚区中NeuN突出的锥体细胞进行免疫染色，表明异位细胞达到了成熟(vi)。比例尺：100μum。
示WT和14-3-3ζ 小鼠从14.5dpc直至出生后56天(P56)海马的发育。海马细胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的锥体层中(sp)分散(iv、vi、viii)。楔形突出了在辐射层(stratum radiatum，sr)中海马锥体神经元重复的层。星号突出了在始层(stratum oriens，s0)中异位定位的锥体细胞。箭头标明了在齿状回中松散排列的颗粒神经元。(b)将Thy1-YFP转
062 062-/-
基因表达引入14-3-3ζ 背景揭示了在14-3-3ζ 小鼠中海马锥体神经元的严重解体。
蓝，DAPI；绿，Thy1表达。(c)从所示基因型的P0(i-iv)和P56(v-vi)小鼠中获得的海马的冠状切面。更深层的锥体层由WT海马中的NeuN阳性锥体细胞组装(iii，黄楔形)形成
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从CA1至CA3的一致成熟区(uniform mature zone)。在14-3-3ζ 海马中，具有一些在CA3锥体区更深区(黄楔形)和表面区(白楔形)异位定位的NeuN阳性成熟锥体细胞的成
062-/-
熟区更不一致。在P5614-3-3ζ 小鼠中，对在重复CA3亚区中NeuN突出的锥体细胞进行免疫染色，表明异位细胞达到了成熟(vi)。比例尺：100μum。
[0037] 图4：BrdU脉冲追逐分析(BrdU-pulse-chase analysis)表明在14-3-3ζ缺陷小鼠中的神经元迁移缺陷。在14.5dpc：P7(i-v)和16.5dpc：P7(vi-x)的BrdU脉冲追逐分析证明BrdU阳性细胞(黑)位于WT海马CA3亚区中的锥体层(stratum pyramidale，sp)(ii&vii)。(v)图总结了在14.5dpc：P7的异位海马神经元的百分比。带BrdU标记的062-/-
14-3-3ζ 小鼠细胞为异位定位的。神经元在始层(s0)中停止，或者迁移越过锥体层并进入透明层(stratum lucidum，sl)(iv&ix中的楔形)。(x)图总结了在16.5dpc：P7的异位海马神经元的百分比。比例尺：100μm
14-3-3ζ 小鼠细胞为异位定位的。神经元在始层(s0)中停止，或者迁移越过锥体层并进入透明层(stratum lucidum，sl)(iv&ix中的楔形)。(x)图总结了在16.5dpc：P7的异位海马神经元的百分比。比例尺：100μm
[0038] 图5：14-3-3ζ缺陷小鼠中的异常苔藓纤维通路(mossy fibre pathway)。062+/+ 062-/-
14-3-3ζ (i、iii、v和vii)和14-3-3ζ (ii、iv、vi和viii)小鼠中下锥体(IPMF，黄楔形)和上锥体(SPMF，白楔形)苔藓纤维轨道(trajectory)的钙结合蛋白免疫染色。
062-/-
与WT对照相似，14-3-3ζ 缺陷神经突最初在从齿状回(DG)导向离开后分支为SPMF和
062-/-
IPMF分枝。然而，14-3-3ζ 小鼠的IPMF分枝在锥体细胞胞体间异常的导向(sp，白箭
062-/
头)。此外，14-3-3ζ -小鼠SPMF分枝的扩散侵入CA3中重复的锥体细胞层。比例尺：
100μm。
14-3-3ζ (i、iii、v和vii)和14-3-3ζ (ii、iv、vi和viii)小鼠中下锥体(IPMF，黄楔形)和上锥体(SPMF，白楔形)苔藓纤维轨道(trajectory)的钙结合蛋白免疫染色。
062-/-
与WT对照相似，14-3-3ζ 缺陷神经突最初在从齿状回(DG)导向离开后分支为SPMF和
062-/-
IPMF分枝。然而，14-3-3ζ 小鼠的IPMF分枝在锥体细胞胞体间异常的导向(sp，白箭
062-/
头)。此外，14-3-3ζ -小鼠SPMF分枝的扩散侵入CA3中重复的锥体细胞层。比例尺：
100μm。
[0039] 图6：异位CA3锥体细胞和错误路线(misrouted)的苔藓纤维之间功能性突触连062+/+
接。(a)(i-iv)用针对突触泡蛋白(Syp)的抗体染色来自P5614-3-3ζ 小鼠的海马切片，显示在IPMF(白楔形)和SPMF(黄楔形)二者中的免疫反应性。Syp染色位于围绕在
062
CA3之锥体胞体的始层(s0)和透明层(sl)中。(v-viii)Syp染色的来自14-3-3ζ -/-小鼠的海马切片揭示了苔藓纤维在CA3锥体层中异常的导向(星号，V，Vii)，形成功能性突触。(ix-xii)异位成熟的CA3锥体细胞(通过NeuN染色；用星号描绘)与来自错误路线的苔藓纤维之突触蛋白(Syp，绿)联系。比例尺：100μm。(b)高尔基染色揭示WT或者
062-/
14-3-3ζ -成体小鼠(P35)之锥体细胞的树突分支。表明与错误路线的苔藓纤维突触结(MFB，斜线)之连接点的一组刺样膨大(thorny excrescence)位于WT神经元中CA3锥体细
062-/-
胞的近顶端树突上。两组刺样膨大位于14-3-3ζ 小鼠中的顶端树突树上，一组在近顶端树突而另一组在末梢树突分枝中(＊)。(c)示意图描绘了错误路线的苔藓纤维轨道和
062-/-
与WT海马相比，14-3-3ζ 小鼠中苔藓纤维结与异位CA3锥体细胞联系的异常突触点。
接。(a)(i-iv)用针对突触泡蛋白(Syp)的抗体染色来自P5614-3-3ζ 小鼠的海马切片，显示在IPMF(白楔形)和SPMF(黄楔形)二者中的免疫反应性。Syp染色位于围绕在
062
CA3之锥体胞体的始层(s0)和透明层(sl)中。(v-viii)Syp染色的来自14-3-3ζ -/-小鼠的海马切片揭示了苔藓纤维在CA3锥体层中异常的导向(星号，V，Vii)，形成功能性突触。(ix-xii)异位成熟的CA3锥体细胞(通过NeuN染色；用星号描绘)与来自错误路线的苔藓纤维之突触蛋白(Syp，绿)联系。比例尺：100μm。(b)高尔基染色揭示WT或者
062-/
14-3-3ζ -成体小鼠(P35)之锥体细胞的树突分支。表明与错误路线的苔藓纤维突触结(MFB，斜线)之连接点的一组刺样膨大(thorny excrescence)位于WT神经元中CA3锥体细
062-/-
胞的近顶端树突上。两组刺样膨大位于14-3-3ζ 小鼠中的顶端树突树上，一组在近顶端树突而另一组在末梢树突分枝中(＊)。(c)示意图描绘了错误路线的苔藓纤维轨道和
062-/-
与WT海马相比，14-3-3ζ 小鼠中苔藓纤维结与异位CA3锥体细胞联系的异常突触点。
[0040] 图7：14-3-3ζ与DISC1相互作用以控制神经元发育。(a-b).来自P7小鼠脑的等量裂解物与抗DISC1抗体或者抗14-3-3抗体免疫沉淀，并用DISC1(a)或者EB1纯化的抗血清(b)进行免疫印迹以识别14-3-3ζ。还通过直接免疫印迹确定用于免疫共沉淀的DISC1同工型和来自5％总细胞裂解物(输入(input))的14-3-3ζ的相对表达水平。箭头标明了DISC1的主要100kDa带和75kDa带(a)和代表14-3-3ζ的27kDa带(b)。星号代表来自免疫沉淀的背景IgG带。(c)14-3-3ζ在神经元迁移和轴突生长中作用的图示。(i)14-3-3ζ结合CDK5磷酸化的Ndel1以促进与LIS1的相互作用，因此促进神经元迁移。
(ii)14-3-3ζ也在LIS1/Ndel1/DISC1复合体中存在以控制轴突生长动力学。
(ii)14-3-3ζ也在LIS1/Ndel1/DISC1复合体中存在以控制轴突生长动力学。
[0041] 图8：14-3-3ζ基因的基因陷阱(trap)突变。(a)示意性地显示小鼠系Gt(OST062)Lex Gt(OST390)Lex14-3-3ζ 和(b)小鼠系14-3-3ζ 的插入点。基因陷阱载体包含融合到
选择性标记物基因(0半乳糖苷酶/新霉素磷酸转移酶融合基因的BGEO)的剪接受体序列(splice acceptor sequence SA)，因此所述基因在内源14-3-3ζ启动子下表达。当整合入
14-3-3ζ的上游外显子时，BGEO产生了干扰mRNA转录的融合转录。所述载体还包含PGK启动子，其后跟着剪接供体(SD)信号上游的Bruton's络氨酸激酶基因(BTK)的第一外显子。在所有阅读框中BTK包含终止密码子以防止下游融合转录的翻译。所述基因陷阱载体以在两个长末端重复(LTR)之间的逆转录病毒形式描述。在两幅图中，箭头表示用于基因分型的引物。红盒表示非编码的未翻译序列，而绿盒表示编码序列。
选择性标记物基因(0半乳糖苷酶/新霉素磷酸转移酶融合基因的BGEO)的剪接受体序列(splice acceptor sequence SA)，因此所述基因在内源14-3-3ζ启动子下表达。当整合入
14-3-3ζ的上游外显子时，BGEO产生了干扰mRNA转录的融合转录。所述载体还包含PGK启动子，其后跟着剪接供体(SD)信号上游的Bruton's络氨酸激酶基因(BTK)的第一外显子。在所有阅读框中BTK包含终止密码子以防止下游融合转录的翻译。所述基因陷阱载体以在两个长末端重复(LTR)之间的逆转录病毒形式描述。在两幅图中，箭头表示用于基因分型的引物。红盒表示非编码的未翻译序列，而绿盒表示编码序列。
[0042] 图9：蛋白质印迹分析证明14-3-3ζ表达在突变体小鼠的所有组织中降低：从062-/- 062+/+
(a)雄性和雌性二者的14-3-3ζ 和年龄匹配的14-3-3ζ 小鼠中以及(b)雄性和
390-/- 390+/+
雌性二者的14-3-3ζ 和年龄匹配的14-3-3ζ 小鼠中收获组织。所有样品在包含如材料和方法中所述之蛋白酶抑制剂的NP40裂解缓冲液中匀浆。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Pierce BCA Protain Assay Kit)确定蛋白质浓度，且每道加入10μg蛋白质。印迹用EB-1抗体探针探测以检测14-3-3ζ，且使用抗β肌动蛋白(1：5000)作为加样对照。
用HRP缀合的次级抗体(1：20000，Pierce-Thermo Scientific)检测结合的抗体。通过ECL可视化免疫反应性蛋白质。注意，EB1抗体也可检测除了14-3-3ζ之外的14-3-3同工型。
(a)雄性和雌性二者的14-3-3ζ 和年龄匹配的14-3-3ζ 小鼠中以及(b)雄性和
390-/- 390+/+
雌性二者的14-3-3ζ 和年龄匹配的14-3-3ζ 小鼠中收获组织。所有样品在包含如材料和方法中所述之蛋白酶抑制剂的NP40裂解缓冲液中匀浆。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Pierce BCA Protain Assay Kit)确定蛋白质浓度，且每道加入10μg蛋白质。印迹用EB-1抗体探针探测以检测14-3-3ζ，且使用抗β肌动蛋白(1：5000)作为加样对照。
用HRP缀合的次级抗体(1：20000，Pierce-Thermo Scientific)检测结合的抗体。通过ECL可视化免疫反应性蛋白质。注意，EB1抗体也可检测除了14-3-3ζ之外的14-3-3同工型。
[0043] 图10：14-3-3同工型的mRNA水平在14-3-3ζ缺陷小鼠脑中保持恒定：在来自062-/-
14-3-3ζ 小鼠的脑组织中，响应于14-3-3ζ同工型缺失的所有14-3-3同工型的转录
062-/- 062+/+
水平无变化。从3只14-3-3ζ 小鼠和3只年龄匹配的14-3-3ζ 对照的全脑中分离出RNA。使用Quantitect试剂盒(Qiagen)从1μgRNA中生成互补DNA(cDNA)。使用Sybr Green(Qiagen)进行实时PCR并使用Rotor Gene机(Corbett)以确定相比所有14-3-3同工型样品中之GAPDH的mRNA水平。引物细节参见表1。
14-3-3ζ 小鼠的脑组织中，响应于14-3-3ζ同工型缺失的所有14-3-3同工型的转录
062-/- 062+/+
水平无变化。从3只14-3-3ζ 小鼠和3只年龄匹配的14-3-3ζ 对照的全脑中分离出RNA。使用Quantitect试剂盒(Qiagen)从1μgRNA中生成互补DNA(cDNA)。使用Sybr Green(Qiagen)进行实时PCR并使用Rotor Gene机(Corbett)以确定相比所有14-3-3同工型样品中之GAPDH的mRNA水平。引物细节参见表1。
[0044] 图11：14-3-3ζ缺陷小鼠显示在学习和记忆中的认知功能紊乱(cognitive062-/-
dysfunction)。在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ 小鼠(空心圆；n＝12)比
062+/+
14-3-3ζ 小鼠(封闭方形；n＝12)具有更低的空间学习(1-6天)和记忆能力。在整
062-/-
个训练时期和在记忆测试期(M1和M2)中，14-3-3ζ 小鼠花费更久到达逃脱平台。汇集来自雄性和雌性小鼠的数据。误差柱以平均±SEM呈现。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
dysfunction)。在十字迷宫逃脱任务测试中，14-3-3ζ 小鼠(空心圆；n＝12)比
062+/+
14-3-3ζ 小鼠(封闭方形；n＝12)具有更低的空间学习(1-6天)和记忆能力。在整
062-/-
个训练时期和在记忆测试期(M1和M2)中，14-3-3ζ 小鼠花费更久到达逃脱平台。汇集来自雄性和雌性小鼠的数据。误差柱以平均±SEM呈现。＊，p<0.05；＊＊，p<0.01；＊＊＊，p<0.001。
[0045] 图12：14-3-3ζ缺陷小鼠显示减少的惊吓反射(startle reflex)。在4个115dB062-/-
的单独脉冲块(pulse-alone block)期间14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝13)的惊吓幅
062+/+
度低于14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝14)。还显示了来自所有块的平均(Avg)惊吓。＊＊，<0.05。
的单独脉冲块(pulse-alone block)期间14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝13)的惊吓幅
062+/+
度低于14-3-3ζ 小鼠(实心柱；n＝14)。还显示了来自所有块的平均(Avg)惊吓。＊＊，<0.05。
[0046] 图13：14-3-3ζ表达在海马神经元中的维持。X-gal染色显示14-3-3ζ在P0以062+/-
及P714-3-3ζ 海马和小脑中的内源表达。海马中14-3-3ζ-lacZ的高水平表达在阿蒙氏角的锥体神经元和成熟齿状神经元中明显，但在出生后小脑中不明显。比例尺：25μm。
及P714-3-3ζ 海马和小脑中的内源表达。海马中14-3-3ζ-lacZ的高水平表达在阿蒙氏角的锥体神经元和成熟齿状神经元中明显，但在出生后小脑中不明显。比例尺：25μm。
[0047] 图14：14-3-3ζ缺陷小鼠中海马分层的缺陷。尼氏染色显示WT(i、iii、v)062-/-
和14-3-3ζ (ii、iv、vi)小鼠从14.5dpc直至出生(P0)海马的发育。海马细胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的锥体层(sp)中分散。楔形突出了在辐射层(sr)中海马锥体神经元复制的层。星号突出了在始层(s0)中异位定位的锥体细胞。比例尺：25μm。
和14-3-3ζ (ii、iv、vi)小鼠从14.5dpc直至出生(P0)海马的发育。海马细胞在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠的锥体层(sp)中分散。楔形突出了在辐射层(sr)中海马锥体神经元复制的层。星号突出了在始层(s0)中异位定位的锥体细胞。比例尺：25μm。
[0048] 图15：14-3-3ζ缺陷小鼠中误定位的神经元生存进入成年期。在海马原基(a-f)-/-和成熟海马(g-h)中的凋亡细胞。在14-3-3ζ 海马未检测到片段化、凋亡细胞核(如aii和bii中绿色TUNEL阳性细胞所示)的增加。比例尺：100μm。
[0049] 图16：14-3-3ζ控制谷氨酸能通路以介导感觉运动门控(sensorimotor gating)。062+/+ 062-/-
与14-3-3ζ 小鼠相比(灰柱；n＝11；5雄性和6雌性)，14-3-3ζ 小鼠(灰色
斜条柱；n＝11；5雄性和6雌性)具有减少的PPI，具有在70dB基准线上16dB的前脉冲(PP)和100毫秒的刺激间时间间隔。MK801(MK)和阿扑吗啡(Apomorphine)(APO)引起
062+/+ 062-/-
14-3-3ζ 小鼠中的PPI缺陷。相反地，仅APO引起14-3-3ζ 小鼠中的PPI进一步缺陷。
与14-3-3ζ 小鼠相比(灰柱；n＝11；5雄性和6雌性)，14-3-3ζ 小鼠(灰色
斜条柱；n＝11；5雄性和6雌性)具有减少的PPI，具有在70dB基准线上16dB的前脉冲(PP)和100毫秒的刺激间时间间隔。MK801(MK)和阿扑吗啡(Apomorphine)(APO)引起
062+/+ 062-/-
14-3-3ζ 小鼠中的PPI缺陷。相反地，仅APO引起14-3-3ζ 小鼠中的PPI进一步缺陷。
[0050] 图17：14-3-3ζ控制多巴胺能通路以介导运动行为(locomotor activity)。在旷062-/-
场试验中，当用D-安非他明(Amphetamine)处理时，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11；
062+/+
6雄和5雌)比14-3-3ζ 同窝幼畜在30周龄时具有更多的探索行为。Sal，盐水。来自雄性和雌性小鼠的数据在所有图中汇集。误差柱以平均±SEM呈现。＊，p<0.05。
场试验中，当用D-安非他明(Amphetamine)处理时，14-3-3ζ 小鼠(空心柱；n＝11；
062+/+
6雄和5雌)比14-3-3ζ 同窝幼畜在30周龄时具有更多的探索行为。Sal，盐水。来自雄性和雌性小鼠的数据在所有图中汇集。误差柱以平均±SEM呈现。＊，p<0.05。
[0051] 图18：14-3-3ζ缺陷小鼠具有降低的棘密度。
[0052] (A)与14-3-3ζ062+/+小鼠(n+4，每只动物计数20个树突)相比，树突棘在062-/-
14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只动物计数20个树突)齿状回(DG)的颗粒神经元中减少。
062+/+ 062-/-
(B)与14-3-3ζ 小鼠(n+4，每只动物计数20个树突)相比，树突棘在14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只动物计数20个树突)海马角(CA)的锥体神经元中也减少。左侧图显示了
062-/- 062+/+
在14-3-3ζ 和14-3-3ζ DG树突或者CA树突中棘的代表性图像。右侧图表明了有相应p值的定量。注意，对于所有动物棘数量的打分是完全盲性(blind)的。
14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只动物计数20个树突)齿状回(DG)的颗粒神经元中减少。
062+/+ 062-/-
(B)与14-3-3ζ 小鼠(n+4，每只动物计数20个树突)相比，树突棘在14-3-3ζ 小鼠(n＝3，每只动物计数20个树突)海马角(CA)的锥体神经元中也减少。左侧图显示了
062-/- 062+/+
在14-3-3ζ 和14-3-3ζ DG树突或者CA树突中棘的代表性图像。右侧图表明了有相应p值的定量。注意，对于所有动物棘数量的打分是完全盲性(blind)的。
具体实施方式
[0053] 本发明部分地基于蛋白14-3-3ζ功能性水平降低的确定(如在蛋白14-3-3ζ绝对水平或者蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成水平的情形下)指示神经精神病症(如精神分裂症或者相关病症)发作或倾向于发作。因此所述发现已促进用于评估对神经精神病症易感性或者诊断神经精神病症发作的简单但非常有用之测试的开发。也促进了不表达蛋白14-3-3ζ的经遗传修饰动物的产生及其使用方法(如在开发或者测试已知或新的治疗性或预防性处理方案或者筛选可用于所述方案之调节性物质的情形下)。
[0054] 因此，本发明的一个方面涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0055] 不将本发明限于任何一种理论或者作用模式，14-3-3蛋白为保守的二聚磷酸丝氨酸结合蛋白家族，所述家族与多种细胞蛋白相互作用并调控其功能，从而调节许多信号通路(Tzivion and Avruch2002，J.Biol.Chem.277：3061-64；Fu et al.2000，Ann.Rev.Pharma.Tox.40：617-47)。14-3-3蛋白由两个30kDa的单体单元构成，所述单元每个都能够通过两亲性沟(amphipathic groove)结合磷酸丝氨酸基序。14-3-3的二聚物通过N-末端α螺旋形成，其中一个单体的螺旋1与另一个的螺旋3和4相互作用。功能上，14-3-3蛋白在调节细胞蛋白活性中扮演多个角色，且重要的是，14-3-3的所述功能依赖于其二聚化结构(Xing et al.2000，supra；Yaffe2002，FEBS Letts.513：53-57)。14-3-3蛋白为7种磷酸丝氨酸结合蛋白的高度保守家族。所述7种同工型为β、ε、γ、η、σ、τ和ζ(NCBI参考序列号NM_003406.3；SEQ ID NO：1)型。
[0056] 提到“蛋白14-3-3ζ”应理解为包括涉及蛋白14-3-3ζ的所有形式，其包括功能性等位基因或者多态变体(polymorphic variant)。提到“变体”应理解为扩展至功能性突变体。提到“同源物(homologue)”应理解为指代来自除人以外其他物种的14-3-3蛋白。提到“功能性”14-3-3蛋白应理解为涉及可经历DISC1复合体形成并因此促进通过DISC1调节之网络进行的信号转导的分子。应了解在本说明书中“蛋白14-3-3ζ”也可互换的称为“14-3-3ζ”。两个术语应理解为指代相同的分子。在一个实施方案中，所述蛋白14-3-3ζ为人14-3-3ζ。
[0057] 根据所述实施方案，提供了筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0058] 提到“神经精神病症”应理解为指代以基于神经生物学的认知、情绪和行为扰动为特征的病症。所述病症的实例包括尤其以下列为特征的病症：精神分裂症的一种或更多种症状、精神分裂症、分裂型人格障碍、精神病、两极性障碍、躁狂抑郁症(manic depression)、情感障碍(affective disorder)、或者精神分裂症样疾病(schizophreniform)或分裂情感障碍(schizoaffective disorder)、精神病性抑郁症、孤独症、药物引起的精神病、谵妄(delirium)、酒精戒断综合征或者痴呆引起的精神病。
[0059] 在一个实施方案中，所述神经精神病症为以精神分裂症的一种或者更多种症状为特征的病症。
[0060] 根据所述实施方案，因此提供了筛选以一种或者更多种精神分裂症的症状特性为特征的病症发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0061] 提到“精神分裂症的症状特性”应理解为指代可以发生在遭受精神分裂症个体中的任何一种或更多种症状。所述症状可以在整个病程(disease course)中显现或者其可以仅仅瞬时的或周期性的显现。例如，与精神分裂症相关的幻觉通常周期性发作，而典型的社会戒断可展现为持续显现。还应了解对象症状不一定由遭受精神分裂症的所有个体展现。例如，一些个体可以仅遭受听觉幻觉而其他可仅遭受视觉幻觉。然而，就本发明的目的而言，所述定义涵盖任何这样的症状，而不考虑有多少精神分裂症患者曾经确实展现出特定的症状。不将本发明限于任何理论或者作用模式，与疾病最通常相关的症状称为阳性症状(其表明存在非常异常的行为)、思维障碍和阴性症状。思维障碍和阳性症状包括难以跟上讲话或者从一个主题跳到另一个而没有逻辑联系，妄想(迫害、罪行、夸大或者被外部控制的错误信念)和幻觉(视觉的或者听觉的)。思维障碍为清晰且有逻辑思考之能力的降低。其经常通过无联系和无意义的语言表现，所述语言致使患有精神分裂症的人不能参与交谈，使得所述人与家庭、朋友和社会疏远。妄想在患有精神分裂症的个体中间普遍。受影响的人可能相信其被阴谋地对待了(称为“偏执型妄想”)。“播散”描述了妄想的一种类型，其中患有所述疾病的个体相信其他人可以听见其想法。幻觉可以为听到、看见或者甚至感觉到。其最经常的是仅被受折磨的人以声音的形式听到。所述声音可以描述所述人的行为，警告危险或者告诉他做什么。有时个体可以听到许多声音进行交谈。相比于上述“阳性症状”较不明显但是同样严重的是缺陷或者阴性症状，其代表正常行为的不存在。所述行为包括淡漠或者迟钝的情感(即缺少情绪表达)、冷漠、社会戒断和缺乏自知力。阳性症状和阴性症状二者应理解为落入“精神分裂症的症状特性”定义中。
[0062] 除了精神分裂症患者间所展现出来的症状方面可能有显著变化的事实，还应了解还有以一种或者更多种所述症状为特征的其他神经精神病症。例如，在患有如两极性障碍、精神病性抑郁症、谵妄和痴呆引起的精神病之患者中也普遍观察到幻觉。因此，提到以一种或者更多种精神分裂症的症状特性为特征的病症，应理解为指代任何以一种或者更多种所述症状存在为特征的神经精神病症。在一个实施方案中，所述病症为精神分裂症。
[0063] 根据所述实施方案，提供了筛选精神分裂症发作或者倾向于发作之人的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述发作或倾向于发作精神分裂症的指示。
[0064] 本文使用的术语“哺乳动物”包括人、灵长类、牲畜动物(如马、牛、羊、猪、驴)、实验室试验动物(如小鼠、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(如狗、猫)和圈养野生动物(如袋鼠、鹿、狐狸)。优选地，所述哺乳动物为人或者实验室试验动物。更优选地，所述哺乳动物为人。
[0065] 一般认为展现蛋白14-3-3ζ水平低于正常范围的个体相对于其发作的易感体质已经经受了对象病症的发作，其中也有一种或更多种如上文所描述的阳性或阴性症状发作的迹象。应该了解诊断神经精神病症(如精神分裂症)的限制之一是在所述病症的早期，观察到的症状为非特异性的且经常可归结于非神经精神原因。这使得诊断非常困难，特别是当与患有如精神分裂症的病症相关的病耻感(stigma)可以导致在此诊断不存在绝对确定性下健康专业人员或者患者家属不情愿承认这样的诊断时。当作出了不正确的诊断时，结果可以很严重，因为治疗处理方案可能事实上设计的将不会起效或者可能甚至是有害的。因此，因为现在可以对神经精神病症特征性症状之发作的观察结果与生物化学读出(readout)一起进行评估以提供坚实的诊断，所以本发明的方法现提供在这些类型情况下获得确实诊断的装置/手段。
[0066] 因此，本发明提供诊断呈现一种或者更多种阳性或阴性症状或思维障碍之人中神经精神病症发作的方法，所述方法包括在来源于所述人之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与对照水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平较低是所述病症发作的指示。
[0067] 在一个实施方案中，所述病症是以一种或者更多种精神分裂症症状为特征的病症。
[0068] 在另一个实施方案中，所述病症为精神分裂症。
[0069] 如上文详述，本发明还提供了确定患者是否有发展出神经精神病症倾向的装置/手段。这种情况下，所述个体通常尚未展现出神经精神病症的任何症状。然而，由于许多因素中的任何一个(例如家族史)，可能需要确定个体是否有易患所述病症发作的倾向。这可以提供有价值的信息，所述信息可以使得能够进行生活方式的改变或者执行预防性药物治疗方案。因此在这点上提到“倾向于”应理解为表示，相对于正常个体，对所述病症发作的趋向或易感性增加。其并不意味着个体将必须发展出病症，例如如果个体没有暴露于所述病症发作的触发物，而仅仅在可以触发所述病症发作的环境下，有易患所述病症倾向的人将比无倾向的人更可能形成所述病症。提到对所述病症发作“无倾向”的个体应理解为具有相反的意义。提到“倾向于”也期望为描述展现出相对于普通群体发展出神经精神病症风险增加的个体。
[0070] 本发明基于确定蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低作为神经精神病症发作或者发作之敏感体质的指示。提到“功能性水平”应理解为指代除了蛋白14-3-3ζ本身绝对水平以外的生物有效水平。就是说，蛋白14-3-3ζ影响下文描述的生物通路的能力是关键问题，其被除了仅仅蛋白14-3-3ζ的绝对水平之外的可测量因素所影响。
[0071] 不将本发明限于任何理论或者作用模式，14-3-3ζ结合磷酸化的Ndel1，维持Ndel1的磷酸化并因此促进了Ndel1结合LIS1和调节核运动的胞质动力蛋白重链。然而，现也已确定蛋白14-3-3ζ与三联DISC1/Ndel1/LIS1复合体相互作用以促进驱动蛋白马达结合和Ndel1/LIS1的移位(relocation)以生长轴突。进一步，其优先地以同工型特异方式发生，伴随14-3-3ζ/DISC1复合体形成且信号优先地发生于DISC175kDa同工型情形下而非100kDa同工型。这些发现与之前的发现相反，之前的发现曾证明Ndel1事实上与DISC1的100kDa同工型相互作用。
[0072] DISC1蛋白在人中由DISC1基因编码(Millar et al.2000，Hum.Mol.Genet.9(9)：1415-23)。与广泛的相互作用伴侣配合，DISC1已经显示参与细胞增殖、分化、迁移、神经元轴突和树突长出(outgrowth)、线粒体转运、分裂和/或融合以及细胞间粘附的调节。DISC1位于染色体1q42.1并与DISC2开放阅读框重叠。已经在RNA水平(包括TSNAX-DISC1转基因剪接变体)和蛋白质水平鉴定了多种DISC1同工型(Nakata et al.(2009).Proc Natl Acad Sci U S A.106(37)：15873-8)。分离的RNA同工型中，4种已经确认被翻译，即长型(L)、长变体同工型(Lv)、短同工型(S)和特别短同工型(Es)。人DISC1转录为两个主要的剪接变体，L型和Lv同工型。L和Lv转录分别利用外显子11中的近端和远端剪接位点在。已经表征编码不同同工型的替代转录剪接变体。DISC1同源物已经在普通黑猩猩、猕猴、家鼠、棕色大鼠、斑马鱼、河豚、牛和狗中被鉴定(Taylor et al.(2003)Genomics81(1)：67-77)。
[0073] 由所述基因编码的蛋白质预计含有富集卷曲螺旋基序的C-末端结构域和N-末端球状结构域(Taylor et al.2003supra)。所述N-末端包含两个推定核定位信号(putative nuclear localization signal)和未知意义的丝氨酸-苯丙氨酸富集的基序。所述C-末端包含有卷曲螺旋形成潜力的多个区域和两个可介导蛋白质间相互作用的亮氨酸拉链。DISC1蛋白不具有已知的酶促活性；相反地，其通过相互作用施加其影响至多种蛋白质以在时间和空间上调控所述蛋白质功能性状态和生物活性(Bradshaw and Porteous(2010-12-31).“DISC1-binding proteins in neural development，signalling and schizophrenia.”.Neuropharmacology)。
[0074] 提到“DISC1”应理解为具有关于“蛋白14-3-3ζ”提供的相应的意义。
[0075] 仍然不以任何方式对本发明进行限制，在精神分裂症小鼠模型情形下蛋白14-3-3ζ功能性水平的降低引起了行为和认知缺陷特性的精神分裂症。所述缺陷以运动功能增加、不能识别新物体、对空旷环境焦虑的减少、学习或记忆能力的严重降低和异常感觉运动门控的形式被注意。还鉴定到海马中神经元的解剖学失调(anatomical disturbance)并推测其来自异常的神经元迁移。还鉴定到特异性轴突导向缺陷和海马苔藓纤维的异常突触连接，这作为突触病症的精神分裂症是一致的。更特别的，在14-3-3ζ功能性不利影响处破坏了海马的分层性组织。所述缺陷主要来自海马神经元从脑室下区(subventricular zone)至其在锥体层中通常停留处的异常迁移。因此，14-3-3ζ/DISC1轴在精神分裂症的病理生理学中是居中心地位的生物通路，且观察到的解剖学缺陷与以下事实一致：与精神分裂症相关的认知缺陷来自神经发育缺陷和突触失调二者。
[0076] 在评估蛋白14-3-3ζ功能(functionality)的“生物有效水平”方面，应了解其不仅仅可以评估蛋白14-3-3ζ绝对水平方面，还可评估蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成的水平，因为实际上所述复合体的形成支持了必须的神经发育。蛋白14-3-3ζ绝对水平的缺陷将影响所述复合体的形成但是蛋白14-3-3ζ分子或DISC1分子中其他结构或功能性缺陷也会如此，这是因为其导致有效复合体形成不能发生。没有复合体形成，通过所述复合体引起的下游信号发出事件不能发生。因此，可以筛选在蛋白14-3-3ζ表达中的缺陷和其他可能不一定影响蛋白14-3-3ζ水平但是其对14-3-3ζ与DISC1形成功能性复合体能力有不利影响的类型中的缺陷。例如，可以筛选：
[0077] (i)；蛋白14-3-3ζ翻译产物水平的降低；
[0078] (ii)；蛋白14-3-3ζ转录产物水平的降低(例如初级RNA或者mRNA)；
[0079] (iii)与14-3-3基因相关联的染色质蛋白的变化，例如在氨基酸位置9或27位赖氨酸甲基化的组蛋白H3(抑制性修饰)或者起下调表达作用的DNA自身的变化(如DNA甲基化的变化)；
[0080] (iv)蛋白14-3-3ζ与DISC1形成复合体之能力的降低。
[0081] 根据所述实施方案，本发明涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定编码蛋白14-3-3ζ基因的表达水平，其中与对照水平相比所述表达水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0082] 应了解提到蛋白14-3-3ζ基因的“表达”意在评估编码所述特定蛋白14-3-3同工型的转录产物(例如mRNA)或者翻译蛋白质(即蛋白质)自身的水平。
[0083] 在另一个实施方案中，所述表达水平为mRNA表达。
[0084] 在另一个实施方案中，所述表达水平为蛋白质表达。
[0085] 在另一个实施方案中，所述表达水平通过筛选基因组DNA的变化(如DNA甲基化特别是超甲基化的变化)来评估。
[0086] 在另一个实施方案中，所述表达水平通过筛选所述基因相关联的染色质蛋白的变化来评估。
[0087] 在另一个实施方案中，本发明涉及筛选神经精神病症发作或者倾向于发作之哺乳动物的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成的水平，其中与对照水平相比所述复合体形成水平较低是所述病症发作或者倾向于发作的指示。
[0088] 在一个实施方案中，所述复合体为蛋白14-3-3ζ和75kDa DISC1同工型的复合体。
[0089] 本领域技术人员应了解提到“蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体”为表示包含蛋白14-3-3ζ和DISC1二者但不一定只包含这两种分子的复合体。就是说，所述复合体可包含其他分子，如Ndel1和LIS1。还应了解14-3-3ζ蛋白不一定直接或者仅仅与DISC1相互作用。就是说，所述蛋白也可以与Ndel1和/或LIS1相互作用。
[0090] 本发明的方法基于相对蛋白14-3-3ζ标记物对照水平的生物样品中蛋白14-3-3ζ表达水平的分析。所述“对照水平”可以为“正常水平”，所述正常水平为在取自没有遭受对象神经精神病症个体的相应样品中蛋白14-3-3ζ表达的水平，或者为在患病患者之前时间点收获的样品。后者的情况有关于使用本发明的方法监测患者一段时间，例如评估治疗性或者预防性处理方案的效力。这将在下文更详细的讨论。还应了解对象蛋白
14-3-3ζ可以通过定量或者定性读出评估或者监测。
14-3-3ζ可以通过定量或者定性读出评估或者监测。
[0091] 可使用符合用于分析但是已经从没有形成病症也没有形成病症倾向的个体分离之样品的生物样品确定正常水平。然而，应了解可能最方便的是分析相对于标准结果的试验结果，所述标准结果反映了个体或者从健康个体获得的汇集结果。后一种形式的分析事实上是分析的优选方法，因为其使得需要收集和分析单个生物样品试剂盒的设计成为感兴趣的试验样品。提供正常水平的标准结果可以通过本领域技术人员公知的任何合适手段计算。例如，正常组织的群体可以按照14-3-3ζ的水平评估，因此提供了标准值或者值的范围，依靠所述值分析所有将来的试验样品。应了解正常水平可以从特定群体的对象确定并针对来源于所述群体之试验样品来使用。因此，可能有确定的许多相应不同特性(如年龄、性别、种族或健康状态)群体的标准值或者范围。所述“正常水平”可以为离散的水平或者水平的范围。
[0092] 虽然优选的方法为检测蛋白14-3-3ζ水平的降低以诊断对象病症发作或者倾向于发作，在某些情况下可能期望蛋白14-3-3ζ水平升高的检测。例如，可能寻求监测个体疾病状态的变化或者关于精神病形成或急性发作的预兆，如在患者预防性或者治疗性处理期间。作为替代地，例如，可监测呈现精神分裂症症状或者形成所述病症之遗传或环境易感体质的患者。应了解根据本发明的所述方面，14-3-3ζ功能性蛋白水平将可能相对于一个或者更多个之前获得的结果进行评估，如上文所描述。
[0093] 因此，本发明的方法可用作一次性试验(one off test)，用作对那些被认为有形成所述病症风险之个体的持续监测或者用作涉及抑制或者以其他方式减缓所述病症发作或进程的治疗或预防处理方案之效力的监测。因此，本发明的方法应理解为扩展至监测个体中与正常水平(如上文所定义)相比或与从所述个体确定的一种或更多种较早期水平相比蛋白14-3-3ζ水平的升高或降低。
[0094] 因此，本发明的另一个方面涉及在经诊断有神经精神病发作的哺乳动物中监测所述病症进程的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与之前从所述哺乳动物获得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或较低是不良预后的指示，而与之前从所述哺乳动物获得的水平相比蛋白14-3-3ζ水平较高是改善预后的指示。
[0095] 本发明的另一个方面涉及监测已确定为倾向于神经精神病症发作之患者的方法，所述方法包括在来源于所述哺乳动物之生物样品中确定蛋白14-3-3ζ的功能性水平，其中与之前从所述哺乳动物获得的水平相比所述蛋白14-3-3ζ水平相等或较低是改善预后的指示。
[0096] 在一个实施方案中，所述病症以精神分裂症的一种或者更多种症状为特征。
[0097] 在另一个实施方案中，所述病症为精神分裂症。
[0098] 在另一个实施方案中，所述哺乳动物为人。
[0099] 在另一个实施方案中，所述表达水平为mRNA表达。
[0100] 在另一个实施方案中，所述表达水平为蛋白质表达。
[0101] 在另一个实施方案中，所述表达水平通过筛选基因组DNA的变化(如DNA甲基化特别是超甲基化的变化)评估。
[0102] 在另一个实施方案中，所述表达水平通过筛选所述基因相关联的染色质蛋白的变化评估。
[0103] 在另一个实施方案中，所述功能性水平为蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成的水平，更特别的为14-3-3ζ/75kDa DISC1同工型复合体形成。
[0104] 不以任何方式限制本发明，本发明的方法特别有用，因为蛋白14-3-3ζ表达在脑外可检测。多数之前鉴定的精神分裂症标记物以突变的形式存在于仅在脑中表达的基因转录产物中。从诊断观点看，这不是期望的，因为收获脑组织用于试验(特别是常规试验)的前景对于患者是难以接受的，且由于其高度创伤性，潜在地易引起严重并发症的形成(如感染)。然而，本发明的发现已使得能够使用其他生物来源，包括脑脊液、外周血和来自组织(如牙髓、毛囊或者鼻窝)的成体来源的神经干细胞。这一试验的开发已使得能够显著地更加简单和常规的针对精神分裂症对个体进行测定。
[0105] 因此，提到“生物样品”应理解为任何来源于动物的生物材料，比如但不限于细胞材料、组织活检标本(tissue biopsy specimen)或者体液(如脑脊液或血液)。根据本发明的方法进行试验的生物样品可直接试验或者在试验前可能需要一些形式的处理。例如，活检样品在检测前可能需要匀浆或者其可能需要切片以用于原位试验。而且，就生物样品不为液体形式来说，(如果试验需要所述形式)可能需要添加试剂(比如缓冲液)以活动化(mobilise)所述样品。优选地，所述生物样品为外周血淋巴细胞或者成体来源神经干细胞样品。
[0106] 就存在于生物样品中的目标分子来说，生物样品可以直接进行试验或者可以在试验前分离生物样品中存在的所有或者一些核酸材料或蛋白质。在另一个实例中，样品可以部分纯化或者另外在分析前富集。例如，就包含非常多样的细胞群的生物样品来说，如果mRNA为分析的对象，可能期望选出特定感兴趣的亚群(例如CNS细胞)。在试验前对目标核酸或者蛋白质分子的预处理是在本发明范围内的，例如活病毒的失活或者跑胶(run0n a gel)。还应了解生物样品可以新鲜地收获或者其可在试验前储藏(例如通过冷冻)或者另外在试验前处理(如通过进行培养)。
[0107] 根据本文公开的方法选择什么类型的样品最合适进行试验将依赖于所面临情况的性质。
[0108] 如上文详细提到的“表达”应理解为指代核酸分子的转录和/或翻译。提到“RNA”应理解为包括任何形式的RNA(如初级RNA或者mRNA)。不以任何方式限制本发明，导致RNA合成增加或减少的基因转录调控也会与所述RNA转录本(如mRNA)翻译为蛋白质产物相关。因此，本发明还扩展至检测方法学，所述方法学涉及筛选蛋白14-3-3ζ产物的调控水平或模式作为细胞或者细胞群瘤状态的指示物。虽然方法用来筛选mRNA转录物和/或相应的蛋白质产物，但是应了解本发明并不限于此并扩展至筛选任何其他形式的表达产物(比如，例如初级RNA转录本)。
[0109] 在筛选蛋白14-3-3ζ表达下调的方面也是本领域技术人员公知的，其在DNA水平上可检测的变化是基因表达活性变化的指示，因此是表达产物水平的指示。所述变化包括但不限于DNA甲基化的变化。因此，本文提到的“筛选表达水平”和将这些“表达水平”与对照的“表达水平”相比较应理解为用于评估关于转录的DNA因子(如基因/DNA甲基化模式)。
[0110] 本领域技术人员还已知的是染色质结构的变化是基因表达变化的指示。基因表达的沉默经常与染色质蛋白的修饰相关，组蛋白H3的9和27位之一或者二者的赖氨酸的甲基化是经过充分研究的实例，而活性染色质的标志在于组蛋白H3之9位赖氨酸的乙酰化。因此，基因序列与带有抑制性或者活性修饰之染色质的关联可用于进行基因表达水平的评估。
[0111] 提到“核酸分子”应理解为指代脱氧核糖核酸分子和核糖核酸分子二者以及其片段。因此，本发明扩展至在生物样品中直接筛选mRNA水平或者筛选已经从感兴趣的mRNA群体逆转录的互补eDNA。在本领域技术人员的技术中已经很好的设计了针对筛选DNA或者RNA的方法。如上所述，本发明的方法也扩展至筛选由对象mRNA或者基因组DNA自身翻译的蛋白质产物。
[0112] 在一个实施方案中，通过参考mRNA或者蛋白质产物来测量蛋白14-3-3ζ表达水平。
[0113] 在另一个实施方案中，通过分析基因组DNA甲基化评估所述基因表达。在另一个实施方案中，通过DNA与带有抑制性修饰的染色质蛋白的关联(例如组蛋白H3的9或27位赖氨酸的甲基化)来评估表达。
[0114] 术语“蛋白质”应理解为包括肽、多肽和蛋白质(包括蛋白质片段)。蛋白质可以是糖基化或非糖基化的和/或可以包括各种其他与蛋白质融合、连接、结合或以其他方式相关联的分子(如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其他肽、多肽或蛋白质)。本文提到“蛋白质”包括含有氨基酸序列的蛋白质以及与其他分子(如氨基酸、脂质、碳水化合物或者其他肽、多肽或蛋白质)相关联的蛋白质。
[0115] 提到“片段”应理解为指代对象核酸分子或者蛋白质的一部分。这与筛选调控的RNA水平特别相关，因为所述片段为固有不稳定的分子，且可在表达高水平酶的样品中筛选。在此情况下，对象RNA可能已经降解或者以其他形式被片段化。因此，可事实上检测对象RNA分子的片段，所述片段依靠使用合适的特异性探针来鉴定。
[0116] 在生物样品中评估蛋白14-3-3ζ的手段可以通过本领域技术人员公知的任何合适的方法来实现。为此，应了解就检测同源细胞群或者组织切片来说，可利用广泛的技术(如原位杂交、通过微测定评估表达谱、免疫测定等等，下文更详细描述)以检测感兴趣的一种或者更多种标记物表达水平的不存在或者下调。然而，就筛选异源细胞群或者其中发现细胞异源群的体液(如血液样品)来说，由于也存在于所述样品中其他细胞亚群的蛋白14-3-3ζ的固有表达，特定细胞亚群的蛋白14-3-3ζ表达水平的不存在或者降低可能更难以检测。就是说，细胞亚组表达水平的降低可能无法检测。在此情况下，经由间接手段(例如表观遗传学变化的检测)是检测蛋白14-3-3ζ表达水平降低的更适当机制。
[0117] 如上文详述，在发育期间，基因表达受到以下过程的调节：所述过程改变不同细胞谱系中进行表达的基因的可用性而没有改变基因序列，并且这些状态可以通过细胞分裂而遗传，该过程称为表观遗传(epigenetic inheritance)。通过DNA甲基化(修饰胞嘧啶以形成5-甲基胞嘧啶，5meC)的组合和包装DNA之组蛋白染色体蛋白的修饰来确定表观遗传。因此，DNA在CpG位点的甲基化和修饰(如组蛋白H3在9位赖氨酸的脱乙酰作用和在9或
27位赖氨酸的甲基化)与失活染色质相关，而DNA甲基化、组蛋白H3的9位赖氨酸乙酰化的缺少的相反状态则与开放染色质和活化的基因表达相关。
27位赖氨酸的甲基化)与失活染色质相关，而DNA甲基化、组蛋白H3的9位赖氨酸乙酰化的缺少的相反状态则与开放染色质和活化的基因表达相关。
[0118] 可用多种方法检测特定基因的异常甲基化DNA，甚至在大量正常DNA存在下(Clark2007)。因此，除了通过免疫组织化学外，难以在蛋白质或RNA水平检测的基因表达的丧失经常可以通过基因启动子的超甲基化DNA的存在来检测。表观遗传学改变和染色质变化在经修饰的组蛋白与特定基因之发生改变的关联中也是明显(Esteller，2007)；例如阻遏基因经常与组蛋白H3相关联地被发现，所述组蛋白在9位赖氨酸是脱乙酰化和甲基化的。使用抗体靶向改变的组蛋白允许分离与特定染色质状态相关联的DNA和其在癌症诊断中的潜在使用。
[0119] 检测基因表达水平变化的其他方法包括但不限于：
[0120] (i)体内检测
[0121] 在施用能够揭示蛋白14-3-3ζ表达改变的成像探针或试剂后可以使用分子成像。分子成像(Moore et al.，BBA，1402：239-249，1988；Weissleder et al.，Nature Medicine6：351-355，2000)是分子表达的体内成像，所述成像与目前可视化使用“经典”诊断成像技术(如X射线、计算机断层扫描(CT)、MRI、正电子发射断层(PET)或内窥镜术)的宏观特征相关。
[0122] (ii)RNA筛选
[0123] 通过荧光原位杂交(FISH)在细胞中或者通过技术(如定量逆转录酶聚合酶链式反应(QRTPCR)或竞争RT-PCR产物的流式细胞术定性)在来自细胞的提取物中检测RNA表达的下调(Wedemeyer et al.，Clinical Chemistry48：91398-1405，2002)。
[0124] (iii)RNA表达谱的评估，例如通过阵列技术(array technology)(Alon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：96，6745-6750，6月1999)。
[0125] “微阵列”是在固体支持物表面上形成的，各自具有限定面积的，优选离散区域的线性或者多维阵列。在微阵列上所述离散区域的密度由单个固相支持物表面上待检测的目标多核苷酸的总数量来确定。如本文所使用的，DNA微阵列是置于芯片或者其他表面上的寡核苷酸探针的阵列，以用于扩增或克隆目标多核苷酸。因为阵列中每个探针特定组的位置是已知的，所以可以基于目标多核苷酸结合微阵列中特定位置确定其身份。
[0126] DNA微阵列技术最近的发展使得其可能在单个固相支持物上操作多个目标核酸分子的大尺度阵列。美国专利号5,837,832(Chee et al.)和相关的专利申请描述了固定寡核苷酸探针阵列以杂交并检测样品中的特定核酸序列。从感兴趣的组织分离的感兴趣的目标多核苷酸向DNA芯片杂交，并基于目标多核苷酸在离散探针位置杂交的优先性和程度来检测特定序列。阵列的一个重要用途是在差异化基因表达分析中，其中将不同细胞或组织(经常是感兴趣的组织和对照组织)中的基因表达谱进行比较，并鉴定在各自组织间基因表达的任何差异。所述信息可用于在特定组织类型中基因表达类型的鉴定和基于表达谱进行病症的诊断。
[0127] 所述阵列可根据任何方便的方法学产生，如预成型多核苷酸微阵列元件，然后稳定地将其与表面相关联。作为替代地，寡核苷酸可以在表面上合成，其为本领域已知。许多不同的阵列构造和其产生方法对于本领域技术人员是已知的，并在WO95/25116和WO95/35505(光版印刷技术)、美国专利号5,445,934(通过光版印刷术原位合成)、美国专利号5,384,261(通过机械指引流程(mechanically directed flow path)原位合成)；和美国专利号5,700,637(通过点样、印刷或偶联合成)中公开；所述的公开全部通过参考并入本文。另一个偶联DNA至珠的方法使用特异附着至DNA末端的配体以连接至附着珠的配体结合分子。可能的配体结合伴侣对包括生物素-抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白，或者各种抗体/抗原对(如digoxygenin-抗digoxygenin抗体)(Smith et al.，Science258：
1122-1126(1992))。DNA的共价化学附着至支持物可通过使用标准偶联剂完成，通过磷酰胺键将DNA上的5’磷酸盐连接至包被的微球。很好地建立了固定寡核苷酸至固态基底的方法。参见Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)：5022-5026(1994)。附着寡核苷酸至固态基底的优选方法由Guo等人描述(Guo et al.，Nucleic Acids Res.22：
5456-5465(1994))。固定可通过原位DNA合成(Maskos and Southern，Nuc.Acids Res.20：
1679-84，1992)或者通过化学合成的寡核苷酸的共价附着(Guo et al.，supra)与自动阵列技术组合来完成。
1122-1126(1992))。DNA的共价化学附着至支持物可通过使用标准偶联剂完成，通过磷酰胺键将DNA上的5’磷酸盐连接至包被的微球。很好地建立了固定寡核苷酸至固态基底的方法。参见Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)：5022-5026(1994)。附着寡核苷酸至固态基底的优选方法由Guo等人描述(Guo et al.，Nucleic Acids Res.22：
5456-5465(1994))。固定可通过原位DNA合成(Maskos and Southern，Nuc.Acids Res.20：
1679-84，1992)或者通过化学合成的寡核苷酸的共价附着(Guo et al.，supra)与自动阵列技术组合来完成。
[0128] 除了以生物芯片阵列为代表的固相技术，也可使用液相阵列来对基因表达进行定量。一个这样的系统为动力学聚合酶链式反应(PCR)。动力学PCR允许同时扩增和定量特异性核酸序列。所述特异性来源于设计成优先粘附包含目标位点之单链核酸序列的合成寡核苷酸引物。所述寡核苷酸引物对在目标序列的每条链上形成特异非共价结合复合体。这些复合体促进双链DNA在相反方向的体外转录。反应混合物的温度循环产生了引物结合、转录和核酸至各个链重熔解的连续循环。结果是目标dsDNA的指数增加。所述产物可以通过使用插入染料或者序列特异性探针来进行实时定量。SYBR(r)Green1是插入染料的实例，其优先地结合dsDNA造成伴随的荧光信号升高。序列特异性探针(如TaqMan技术所使用的)由荧光染料和共价结合寡核苷酸相反末端的淬灭分子(quenching molecule)组成。所述探针设计来选择地结合两个引物间的目标DNA序列。当在PCR反应期间合成了DNA链，通过聚合酶的核酸外切酶活性从探针切割荧光染料，造成信号去淬灭。所述探针信号方法可以比插入染料方法更加特异，但是在各个情况下，信号强度与所产生的dsDNA产物成比例。每种类型的定量方法可以在多孔液相阵列中使用，所述阵列中的每个孔代表对于感兴趣的核酸序列特异的引物和/或探针。当与组织或者细胞系的信使RNA制备物一起使用时，探针/引物反应的阵列可同时定量多个感兴趣基因产物的表达。参见Germer et al.，Genome Res.10：258-266(2000)；Heid et al.，Genome Res.6：986-994(1996)。
[0129] (iv)通过例如免疫测定对细胞提取物中改变的蛋白14-3-3ζ水平的测量。
[0130] 在生物样品中检测蛋白质瘤标志物表达产物可以通过本领域技术人员公知的许多合适方法中的任意一种进行。合适方法的实例包括但不限于组织切片、活检标本或者体液样品的抗体筛选。就使用基于抗体的诊断方法来说，以许多方式(如通过蛋白质印迹、ELISA或流式细胞术过程)可确定蛋白质的存在。当然，所述方式包括单个位点和两个位点或者非竞争类型的“夹心法”测定(sandwich assay)以及传统的竞争性结合测定。所述测定还包括直接将带标签的抗体结合至目标。
[0131] 夹心法测定是有用和常用的测定。存在许多夹心法测定技术的变化，且本发明包括所有变化。简要地，在典型的正向测定中，未加标签的抗体固定于固体基底上，且使待测样品与结合分子接触。在一段合适的孵育期后，所述时期的时间足以允许形成抗体-抗原复合体，然后加入对抗原特异、有能够产生可检测信号的报道分子标签的第二抗体并孵育，允许充足的时间来形成另一个抗体-抗原-加标签抗体的复合体。洗掉任何未反应的材料，通过观察报道分子产生的信号确定抗原的存在。结果可以通过可见信号的简单观察是定性的，或者可以通过与对照样品比较是定量的。正向测定的变化包括同时测定，其中同时添加样品和加标签的抗体至结合抗体。所述技术对本领域技术人员是公知的，包括任何小的变化同样容易明显。
[0132] 在典型的正向夹心法测定中，具有对标志物或者其抗原性部分特异性的第一抗体共价或者被动结合至固体表面。所述固体表面通常为玻璃或者聚合物，最常使用的聚合物为纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以有管、珠、微板的盘或者任何其他适合于进行免疫测定的表面的形式。结合过程在本领域是公知的，通常由交联、共价结合或物理吸附组成，聚合物-抗体复合体在制备试验样品中洗涤。然后，添加要试验的样品的等分试样至固相复合体并在合适的条件下(例如25℃)孵育充足的时间段(例如2-40分钟)，以允许抗体内存在的任何亚基的结合。在所述孵育期后，洗涤抗体亚基固相并干燥，与对所述抗原的一部分特异的第二抗体孵育。所述第二抗体连接至用于指示第二抗体与抗原结合的报道分子。
[0133] 作为替代的方法包括在生物样品中固定目标分子，然后将固定的目标暴露于特异性抗体，所述抗体可以或可以不带有报道分子标签。依赖于目标的量和报道分子信号的强度，可通过直接给抗体加标签来检测结合的目标。作为替代地，特异于第一抗体的带标签第二抗体暴露于目标-第一抗体复合体以形成目标-第一抗体-第二抗体的三级复合体。所述复合体通过报道分子发出的信号检测。
[0134] 本说明书中使用的“报道分子”，意指这样的分子，其通过自身的化学性质提供了允许检测抗原结合抗体的分析性可鉴定信号。所述检测可以是定性或定量的。在此类型的测定中最常使用的报道分子是酶、荧光团或者含有放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。
[0135] 在酶免疫测定的情况下，酶通常通过戊二醛或者高碘酸盐缀合到第二抗体。然而，因为会容易的识别，存在多种不同的缀合技术，所述技术对本领域技术人员来说是容易得到的。普遍使用的酶包括辣根过氧化酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶，以及其他。与特异性酶一起使用的底物通常选择用于产生、通过相应酶水解、有可检测的颜色变化。合适酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化酶。也可能使用荧光底物，其产生荧光产物而非上面提到的显色底物。在所有情况下，添加酶标签的抗体至第一抗体半抗原复合体，使之结合，然后洗掉多余的试剂。然后添加含有合适底物的溶液至抗体-抗原-抗体复合体。所述底物将与连接到第二抗体的酶反应，产生定性的可见信号，所述信号可进一步定量(通常通过分光光度法)以产生在样品中存在的抗原量的指示。“报道分子”还扩展至细胞黏着或者黏着之抑制(如乳胶珠(latex bead)上的红细胞等等)的使用。
[0136] 作为替代地，荧光化合物(如荧光素和罗丹明)可以化学偶联至抗体而不改变其结合能力。当通过特定波长的光照射活化时，带荧光染料标签的抗体吸收光能，引起分子中的激发态，其后发射用光学显微镜视觉上可检测特定颜色的光。当在EIA中时，允许所述带荧光标签的抗体结合至第一抗体-半抗原复合体。在洗掉未结合的试剂后，然后将剩下的三级复合体暴露于合适波长的光，观察到的荧光表明感兴趣的半抗原的存在。免疫荧光和EIA技术都在本领域很好的建立，且对于本方法是特别优选的。然而，也可以使用其他报道分子(如放射性同位素、化学发光或生物发光分子)。
[0137] (v)基于任何合适的功能性试验、酶促试验或者除了在上面的点(iv)中详述的那些之外的免疫试验确定改变的蛋白质表达。
[0138] (vi)就筛选蛋白14-3-3ζ/DISC1复合体形成来说，可以使用多种方法，所述方法包括在固体支持物上固定一个或其他分子，然后将固定的目标暴露于生物样品并筛选复合体形成。所述筛选技术在上文中一般地描述。也可方便地利用免疫共沉淀技术。作为替代地，可使用biocore蛋白质相互作用系统(biocore protein interaction system)。
[0139] 如上文所详述，技术人员应理解设计检测复合体形成的测定可能需要包含除了仅DISC1和蛋白14-3-3ζ外的分子，因为Nedl1和LIS1也涉及功能性复合体的形成。所述测定的设计在本领域技术人员中公知。
[0140] 在这些类型筛选方法的情形下，应了解所述方法的益处为不一定需要知道可能存在于蛋白14-3-3ζ分子或DISC1分子之一或二者中缺陷的性质。而是，因为仅仅是筛选复合体形成的发生或者免疫共沉淀与否，所以缺陷的特征变得不相关。
[0141] 本发明相关的一个方面提供其中已经敲除了蛋白14-3-3ζ基因表达的非人哺乳动物。所述动物的开发促进了筛选和分析可调控神经精神病症发作和进程(如精神分裂症表型)之治疗性和/或预防性有效蛋白质或非蛋白质分子。所述开发现提供了尤其对于研究蛋白14-3-3ζ涉及精神分裂症发作和理性地设计预防和/或治疗处理方案之功能性作用极其有价值的装置/手段。
[0142] 因此，本发明的另一个方面涉及在功能性蛋白14-3-3ζ中有缺陷的非人哺乳动物，其中编码蛋白14-3-3ζ的基因已经缺失。
[0143] 术语“表型”应理解为指代通过生物体基因型与其存在的环境相互作用确定的动物的功能性和结构性特性的全体，或者任何特别特性或者特性集合。在本发明的情形下，对象表型为精神分裂症的发作、倾向于精神分裂症发作或者与精神分裂症相关的一种或更多种症状的发作/倾向于发作。本文提到的表型为“精神分裂症表型”。
[0144] 优选地，所述非人哺乳动物为小鼠。
[0145] 应了解本发明还提供包括上述14-3-3ζ敲除的细胞和细胞系。所述细胞/细胞系可来源于任何合适的来源或者可通过任何合适的手段产生。
[0146] 现在，本发明哺乳动物(本文提到的“14-3-3ζ敲除”)的开发促进了广泛的非常有用的应用，包括但不限于鉴定模拟蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1复合体形成或者以其他方式改善所述哺乳动物精神分裂症表型症状之物质的筛选方法。
[0147] 因此，本发明的另一个方面涉及筛选模拟蛋白14-3-3ζ功能或者14-3-3ζ/DISC1复合体形成或者以其他方式改善精神分裂症表型症状之物质的方法，所述方法包括向14-3-3ζ敲除之非人动物施用推定的调节性物质和针对改变的表型进行筛选。
[0148] 提到“物质”应理解为来源于天然、重组或者合成来源的任何蛋白质或非蛋白质分子，所述来源包括融合蛋白质或下列的例如天然产物筛选和达到本发明目的的来源。所述物质的合成来源包括例如化学合成的分子。在其他实例中，可以针对肽筛选噬菌体展示文库，而可以针对现有小分子筛选化学文库。
[0149] 例如，可以筛选多样性文库(如随机组合肽或者非肽文库)。可以使用许多公开或者商业可用的文库，如化学合成文库、重组(例如噬菌体展示文库)和基于体外翻译的文库。
[0150] 化学合成文库的实例在Fodor et al.PNAS USA91：11422-26(1991)；Houghten et al.Nature354：84-88(1991)；Lam et al.Nature354：82-84(1991)；Medynski，Bio/Technology12：709-710(1994)；Gallop et al.J.Medicinal Chemistry37(9)：1233-1251(1994)；Ohlmeyer etal.PNAS USA91：9022-9026(1993)；Erb etal.PNAS USA91：
11422-26(1994)；Houghten et al.Biotechniques13(3)：412-421(1992)；Jayawickreme et al.PNAS USA91：1614-1618(1994)；Salmon et al.PNAS USA90：11708-11712(1993)；国际专利公开号WO93/20242；和Brenner and Lerner，PNAS USA89：5381-3(1992)中描述。
11422-26(1994)；Houghten et al.Biotechniques13(3)：412-421(1992)；Jayawickreme et al.PNAS USA91：1614-1618(1994)；Salmon et al.PNAS USA90：11708-11712(1993)；国际专利公开号WO93/20242；和Brenner and Lerner，PNAS USA89：5381-3(1992)中描述。
[0151] 噬菌体展示文库的实例由Scott and Smith，Science249：386-390(1990)；Devlin et al.Science249：404-406(1990)；Christian et al.J.Mol.Biol.227：711-718(1992)；Lenstra，J.Immun.Methods152：149-157(1992)；Kay et al.Gene128：59-65(1993)和国际专利公开号WO94/18318描述。
[0152] 基于体外翻译的文库包括但不限于在Mattheakis et al.PNAS USA91：9022-9026(1994)中描述的。
[0153] 不以任何方式限制本发明，试验的化合物可以为大分子(如生物聚合物)，包括多肽、多糖和核酸。可用作潜在治疗剂的化合物可以通过本领域技术人员公知的方法产生，例如生产多种化合物(包括化学或者生物分子如简单或复杂有机分子、含金属化合物、碳水化合物、肽、蛋白质、肽模拟物(peptidomimetic)、糖蛋白、脂蛋白、核酸、抗体等等)的公知方法在本领域公知并在例如Huse，美国专利号5,264,563；Francis et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：422-428(1998)；Tietze etal.，Curr.Biol.，2：363-381(1998)；Sofia，Molecule.Divers.，3：75-94(1998)；Eichler et al.，Med.Res.Rev.15：481-496(1995) 等等中描述。也可从商业来源获得含有大量天然和合成化合物的文库。分子的组合文库可以使用公知的组合化学方法制备(Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1233-1251(1994)；Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1385-1401(1994)；Gordon et al.，Acc.Chem.Res.29：
144-154(1996)；Wilson and Czarnik，eds.，Combinatorial Chemistry：Synthesis andApplication，John Wiley&Sons，New York(1997))。
144-154(1996)；Wilson and Czarnik，eds.，Combinatorial Chemistry：Synthesis andApplication，John Wiley&Sons，New York(1997))。
[0154] 提到检测“表达改变的表型”应理解为检测与14-3-3ζ功能调控相关之任何形式的变化。这些可以是可检测的，例如，作为细胞内变化、细胞外观察到的变化(例如，检测下游产物水平或活性的变化)或者在非人哺乳动物对象之表型/病症中的变化。例如，接下来向本发明的14-3-3ζ敲除小鼠施用所述物质，可以进行如实施例1描述的一种或者更多种行为测定，如：
[0155] (i)运动功能测试(locomotor function test)；
[0156] (ii)物体识别测试(object recognition test)；
[0157] (iii)高架十字杆测试(elevated cross bar test)；
[0158] (iv)逃脱水迷宫测试(escape water maze test)；或者
[0159] (v)PPI测试。
[0160] 如果需要进行更详细的分子试验来验证或另外进一步研究在行为水平观察到的表型变化，那么然后可以从对象敲除动物收获细胞或者组织以使得在细胞或者分子水平能够进行更详细的分析。作为替代地，可以试验产生自所述动物的细胞系。
[0161] 应理解本方面的这些方面不仅提供筛选新型物质的手段，所述新型物质调控展现受损的14-3-3ζ功能之个体的精神分裂症表型，而且提供评估在所述患者组情形下现有治疗方案之益处/副作用的方法。
[0162] 本发明通过参考下面的非限制性实施例进一步描述。
[0163] 实施例1
[0164] 材料和方法
[0165] 小鼠。携带含有Geo报道基因之基因陷阱构建体的14-3-3ζGt(OST062)Lex和Gt(OST390)Lex14-3-3ζ 突变体小鼠分别来源于Lexicon Genetics ES细胞系OST062和
Gt(OST062)Lex
OST390。在14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱载体插入14-3-3ζ的第一内含子，而
Gt(OST390)Lex
14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱载体插入14-3-3ζ的第二内含子。扩增ES细胞系并将其注射入SV129胚泡。产生的生殖系传递雄性(germ line transmitting male)在SV129背景中维持或者经6代回交至C57/B16和BA1.BC背景。使用全组织样品的qRT-PCR和蛋白质印迹来确认所述小鼠品系中基因的完全敲除(KO)。使用附表1详述的引物通过基因组Gt(OST062)Lex
尾DNA的PCR扩增确定14-3-3C基因型。WT等位基因扩增288bp(14-3-3ζ )或者Gt(OST390)Lex Gt(OST062)
445bp(14-3-3ζ )的带，而突变体基因陷阱等位基因扩增165bp(14-3-3ζ
Lex Gt(OST390)Lex
)或者203bp(14-3-3ζ )的带。小鼠以对WT同窝幼畜表型不能区别的杂合育种对(breeding pairs)形式维持。根据医学和兽医科学研究所(Institute of Medical and Veterinary Sciences)以及阿德莱德大学(University of Adelaide)的动物伦理委员会(Animal Ethics Committee)的指南进行动物实验。
Gt(OST062)Lex
OST390。在14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱载体插入14-3-3ζ的第一内含子，而
Gt(OST390)Lex
14-3-3ζ 小鼠中基因陷阱载体插入14-3-3ζ的第二内含子。扩增ES细胞系并将其注射入SV129胚泡。产生的生殖系传递雄性(germ line transmitting male)在SV129背景中维持或者经6代回交至C57/B16和BA1.BC背景。使用全组织样品的qRT-PCR和蛋白质印迹来确认所述小鼠品系中基因的完全敲除(KO)。使用附表1详述的引物通过基因组Gt(OST062)Lex
尾DNA的PCR扩增确定14-3-3C基因型。WT等位基因扩增288bp(14-3-3ζ )或者Gt(OST390)Lex Gt(OST062)
445bp(14-3-3ζ )的带，而突变体基因陷阱等位基因扩增165bp(14-3-3ζ
Lex Gt(OST390)Lex
)或者203bp(14-3-3ζ )的带。小鼠以对WT同窝幼畜表型不能区别的杂合育种对(breeding pairs)形式维持。根据医学和兽医科学研究所(Institute of Medical and Veterinary Sciences)以及阿德莱德大学(University of Adelaide)的动物伦理委员会(Animal Ethics Committee)的指南进行动物实验。
[0166] 行为测定。所有的过程在8.00am至12.00pm的正常光条件下进行。行为 表 型 分 析 如 之 前 描 述 的 进 行 (Coyle et al.Behav Brain Res2009，197(1)：210-218；Summers et al.Pediatr Res2006；59(1)：66-71；van denBuuse et al.Int J Neuropsychopharmacol2009；12(10)：1383-1393)。使用5、10、20和40周龄时间点的一群小鼠进行旷场试验。使用12周龄的一群小鼠进行空间工作记忆(spatial working memory)，然后进行高架十字迷宫和物体识别任务。使用12周龄的另一群不同小鼠进行PPI。
[0167] 运动功能测试。在旷场中测量小鼠的探索行为和焦虑水平，所述旷场由一个将基底分为15个方格(square)(9cm x10cm)的盒子(50cm x27cm)制成。将每只小鼠引入到盒子面向右侧顶角的相同位置。观察小鼠行为3分钟，以越线(line crossing)度量(即，当小鼠将所有4个爪子从一个方格移入另一个时)的形式对运动行为进行打分。当小鼠将两只前爪均离开基底时，对暴跳(rear up)的数量打分。在测试段(session)之间移除尿和粪便材料并用80％乙醇彻底清洁盒子以除去任何留存的气味。
[0168] 物体识别测试。物体识别任务利用了新事物对小鼠的天然吸引力；识别出之前见过(熟悉)物体的小鼠将花费更长时间探索新物体(Dere et al.Neurosci Biobehav Rev2006；30(8)：1206-1224；Sik etal.Behav Brain Res2003；147(1-2)：49-54)。简要地，装置由填充垫料的塑料场地组成(长；50cm，宽；35cm，深；20cm)。使用两组不同的物体；带黄盖的塑料罐(高，6cm；底部直径，4.3cm)和红色塑料球(bulb)(长：8cm，宽：4cm)。当所述物体两者都提供时，小鼠花费相等量的时间，不管它们处于场地中的什么位置(未显示数据)。评估用于空间学习和记忆测试的12周龄同群小鼠的物体识别记忆。在没有任何物体提供的情况下给每只小鼠5分钟来探索所述测试盒以使所述小鼠适应测试场地。小鼠进行包含两个尝试(trial)的测试段。每个尝试持续3分钟。在第一尝试期间(样品阶段)，盒子含有两个同样的放置于盒子西北(左)和东北(右)角(离墙5cm远)的物体(a，样品)。总是将小鼠面向南边墙壁放置于装置中。在第一探索期后，将小鼠放回其住笼(homecage)。在15分钟保持间隔后，将所述小鼠放置于装置中进行第二尝试(选择阶段)，但是现在有一个熟悉的物体(a，样品)和一个新物体(b)。用乙醇在测试段间彻底清洁物体以去除任何存留的气味。记录在尝试1和尝试2期间探索每个物体花费的时间。探索定义为用鼻子触碰物体或者在物体2cm内。在物体识别任务中基础的度量是在尝试1和尝试2期间探索物体花费的时间。在所述测试期间测量许多变量：e1(a+a)和e2(a+b)分别为尝试1和尝试2期间两个物体总探索时间的度量。h1是通过由尝试1至尝试2总探索时间的差异(e1-e2)测量的适应指数。认为d1(b-a)和d2(d1/e2)是新的和熟悉物体间辨别(discrimination)的指数度量。因此，d2为校正对探索行为(e2)d1辨别的相对度量。0以上的辨别指数描述了相比熟悉物体对新物体更多的探索。对于任一物体没有偏好的动物将具有近于0的指数。将尝试期间在样品或者选择阶段少于7s总探索时间的小鼠从分析中排除，因为已发现探索时间的度量在所述阈值之下不可靠(van den Buuse et al.supra；de Bruin et al.Pharmacol Biochem Behav2006；85(1)：253-260)。
[0169] 高架十字杆测试。使用之前描述的高架十字迷宫评估基于小鼠对空旷和高架区之天然厌恶的焦虑行为(Komada et al.J Vis Exp2008；(22)；Walf et al.NatProtoc2007；2(2)：322-328)。简要地，装置以十字的形状由黑树脂玻璃制成，并由两条开放臂(25cm x5cm)和两条封闭臂(25cmx5cm x16cm)组成，所述臂在互相垂直的中间交叉。臂的中间有中央平台(5cm x5cm)。所述迷宫从地面升起1m。将个体小鼠面向开放臂在实验者对面引入所述装置中央，并用录像观察记录5分钟。对在探索两种类型臂中进入开放和封闭臂的次数打分。测量小鼠的天然行为(如探头(head dipping)次数、站起(rear)次数和伸展姿势(stretch attended posture)的次数)。在每个尝试后，用乙醇彻底清洁所有的臂和中央区域以除去任何存留的气味。
[0170] 逃脱水迷宫测试。使用之前描述的十字迷宫逃脱任务评估空间学习和记忆(Coyle et al.2009，supra)。用透明塑料制成十字迷宫(长，72cm；臂维度，长26cm x宽20cm)，且放置于维持在23℃的圆形水池中(1m直径)。将奶粉混入水中以隐藏淹没的(水面下0.5cm)位于迷宫北侧臂远端的逃脱平台。所述池通过黑色塑料壁围起来(高，90cm)。在迷宫的每条臂上且通过在训练和测试过程期间总是站在南端的实验者安排了持续的空间提示。通过将12周大的小鼠放置于没有逃脱平台的水池中并允许其游60s以单独适应迷宫环境。在6天的训练期进行学习尝试，其中要求小鼠从其他三个(东、南、西)不含有逃脱平台的臂中学习到淹没的逃脱平台的位置。给每只小鼠6天每天尝试(通过30分钟休息间隔分开的两块的3个尝试)，其中选择三条臂中的每一条以随机方式作为开始点(每天2次)。对于每一个尝试，将小鼠面向壁放置在臂的远端，并允许60s到达逃脱平台，小鼠在那里保持
10s。将没有在给定时间爬上逃脱平台的小鼠放置于平台上10s。然后将所述小鼠放于笼子
10s，继续接下来的尝试。评估小鼠逃脱平台地点的长期保持力，所述地点在学习阶段期间位于相同的位置。在学习的最终日后，测试记忆14(M1)和28(M2)天，且所述天由如学习期描述之6个尝试的单日组成。记录每只小鼠每个尝试中其逃脱潜伏期(latency)(即，游至平台花费的时间)、正确尝试次数(即，如果小鼠找到了在第一臂入口的平台)和不正确进入/再进入次数(即，小鼠进入不含逃脱平台臂的次数)的数据。
10s。将没有在给定时间爬上逃脱平台的小鼠放置于平台上10s。然后将所述小鼠放于笼子
10s，继续接下来的尝试。评估小鼠逃脱平台地点的长期保持力，所述地点在学习阶段期间位于相同的位置。在学习的最终日后，测试记忆14(M1)和28(M2)天，且所述天由如学习期描述之6个尝试的单日组成。记录每只小鼠每个尝试中其逃脱潜伏期(latency)(即，游至平台花费的时间)、正确尝试次数(即，如果小鼠找到了在第一臂入口的平台)和不正确进入/再进入次数(即，小鼠进入不含逃脱平台臂的次数)的数据。
[0171] PPI测试。使用如之前所述的8单元自动系统(SR-LAB，San Diego Instruments，USA)评估惊吓、惊吓适应和惊吓的PPI(van den Buuse et al.2009supra)。简要地，将小鼠放置于透性树脂玻璃筒中，所述筒的每一面都是封闭的，且通过盒天花板的扬声器递送超70-dB背景噪音的声音刺激。每个测试段由平均尝试间间隔25s的104个尝试组成。最初和最后的8个尝试仅由单个40-ms、115dB脉冲惊吓刺激组成。中间的88个尝试由伪随机递送的16个仅有115dB脉冲刺激，期间递送的8个无刺激尝试和64个前脉冲尝试组成。
仅有115-dB脉冲的总共32个尝试表现为四块的8个，并用来确定惊吓适应。前脉冲尝试由单个115-dB脉冲组成，所述脉冲通过30ms或者100ms的刺激间时间间隔(ISI)与20ms在70-dB基准线上2、4、8或16bB的非惊吓刺激先导(precede)。通过附在平台下的压电式加速计单元(piezo-electric accelerometer unit)将全体惊吓反应(wholy-body startle response)转化为定量值。前脉冲抑制百分比(％PPI)计算为单脉冲惊吓反应-前脉冲+脉冲惊吓反应/单脉冲惊吓反应x100。
仅有115-dB脉冲的总共32个尝试表现为四块的8个，并用来确定惊吓适应。前脉冲尝试由单个115-dB脉冲组成，所述脉冲通过30ms或者100ms的刺激间时间间隔(ISI)与20ms在70-dB基准线上2、4、8或16bB的非惊吓刺激先导(precede)。通过附在平台下的压电式加速计单元(piezo-electric accelerometer unit)将全体惊吓反应(wholy-body startle response)转化为定量值。前脉冲抑制百分比(％PPI)计算为单脉冲惊吓反应-前脉冲+脉冲惊吓反应/单脉冲惊吓反应x100。
[0172] 统计分析。所有统计计算以平均±SEM呈现，并使用SAS9.2版(SASInstitute Inc.，Cary，NC，USA)进行。对于旷场数据，使用线性混合效应模型比较WT和突变组间随时间的越线次数。随机小鼠效应包含于所述模型中以说明在对同一只小鼠重复观察中的依赖性。使用独立样本t检验在WT和突变体之间比较来自高架十字杆的数据。对于水十字迷宫测试，使用Cox比例危害模型(Cox proportional hazards model)比较两个处理组间随时间变化的逃脱潜伏期。在所述模型中使用稳健方差估计(robust variance estimation)以调节由于对同一只小鼠重复测量造成的依赖性。在模型组(WT或KO)中，时间(1至6天)以及组和时间间相互作用作为预测变量进入。当小鼠未找到出口时，认为逃脱潜伏期在30秒正确的检查。在我们的研究中，有太多在30秒检查到逃脱潜伏期的动物能够以正常分布处理结果。因此，使用线性混合效应模型是不可行的。使用负二项式回归模型在WT和突变体组之间随时间比较不正确的进入。在模型组(WT或KO)中，时间(1至6天)以及组和时间间相互作用作为预测变量进入。使用广义估计方程说明由于对同一只小鼠重复测量造成的依赖性。使用双因素方法分析(ANOVA)将PPI测试的数据与重复测量比较(Systat，第9.0版，SPSS软件；SPSS Inc.，US)。对于此分析，组间因素为基因型，而组内，重复的测量因素为前脉冲强度和惊吓块(startle block)。在所有研究中，认为<0.05的p值是统计上显著的。
[0173] 免疫组织化学。于室温(RT)下在10％非免疫马血清的PBST(0.1MPBS，0.3％Triton X-100，1％BSA)中封闭切片1h，接下来与初级抗体在室温下孵育过夜。初级抗体和稀释：针对14-3-3ζ的兔多克隆(1：200)(Guthridge et al.Blood2004；103(3)：820-827)、针对0-微管蛋白的兔多克隆(1：250，Sigma)、针对钙结合蛋白-D28K的兔多克隆(1：1000，Chemicon)、针对NeuN的小鼠单克隆(1：500，Chemicon)、针对突触泡蛋白的兔多克隆(1：100，Cell Signaling)。第二天，切片与次级抗体在室温下孵育1h。在0.1M PBS洗涤3次后，切片用具有DAPI的 Gold抗衰减试剂封片(Molecular Probes)。
[0174] BrdU脉冲追逐分析和TUNEL加标签。在14.5dpc或者16.5dpc向怀孕的小鼠以每g体重100μg注射BrdU，且对幼畜在出生后第7天进行安乐死。通过在冷冻脑切片上的BrdU免疫组织化学揭示在所述时间点生成的增殖海马神经元的最终目的地。用2M HCl在37℃下变性组织20分钟，在0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)中中和10分钟，用有
10％马血清的PBST阻断并在4℃下与大鼠单克隆抗BrdU(1：250；Abcam)和小鼠单克隆抗NeuN(1：500；Chemicon)抗体以探针探测过夜。使用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)(TMR Red；Roche Applied Science)根据生产厂家的说明书在用DAPI(Molecular Probes)对比染色后通过TUNEL测定确定细胞凋亡。
10％马血清的PBST阻断并在4℃下与大鼠单克隆抗BrdU(1：250；Abcam)和小鼠单克隆抗NeuN(1：500；Chemicon)抗体以探针探测过夜。使用原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)(TMR Red；Roche Applied Science)根据生产厂家的说明书在用DAPI(Molecular Probes)对比染色后通过TUNEL测定确定细胞凋亡。
[0175] 免疫沉淀。所有的蛋白质提取物通过NP40裂解缓冲液中的裂解制备，所述缓冲液由150mM NaCL、10mM Tris-HCL(pH7.4)、10％甘油、1％乙基苯基聚乙二醇(NP40)以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂(每ml10mg牛胰蛋白酶抑制剂、每ml10mg抑蛋白酶醛肽、2mM苯甲基磺酰氟和2mM钒酸钠)构成。样品在4C下裂解60分钟，然后在10,000g下离心15分钟。上清液在4℃下与小鼠Ig-偶联的琼脂糖(Sepharose)珠预清除30分钟。预清除的裂解物在4C下与2μg/ml吸收至蛋白A-琼脂糖(Amersham Biosciences)的抗DISC1抗体(C末端)(Invitrogen)或者抗14-3-3抗体(3F7Abcam)孵育2h。在于SDS-PAGE样品缓冲液中蒸煮5分钟前，用裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠3次。通过SDS-PAGE将免疫沉淀的蛋白质和裂解物分离，并电泳转移至消化纤维膜通过免疫印迹分析。
[0176] 免疫印迹。膜与抗14-3-3ζEBI pAb以1：1000(Guthridge et al.2004supra)或者抗DISC1(C末端)(Invitrogen)以1μg/ml进行探针探测。对于来自脑组织14-3-3ζ的分析，使用兔抗3-肌动蛋白(1：5000，Millipore)多克隆作为加样对照。用HRP缀合的次级抗体检测结合抗体(1：20,000，Pierce-Thermo Scientific)。免疫反应的蛋白质可通过ECL可视化(发光图像分析仪Luminescent Image Analyzer LAS-4000，Fuj ifilm，Japan)。使用Multi Gauge3.0版分析图像(Fujifilm，Japan)。
[0177] 神经元细胞培养。如(Kaech et al.Nat Protoc2006，1(5)：2406-2415)所述制备P7海马神经元-神经胶质共培养物。37℃下，使用100μg/ml的多L-溶素/PLL(Sigma)在硼酸盐缓冲液中过夜包被硝酸处理的盖玻片(直径13mm)，然后用无菌水洗涤3×1h。在Hank's5
平衡盐溶液(HBSS)中解剖和分离齿状回和CA样品，并将神经元以每个培养皿1×10 个细胞的密度涂布(用4-PPL包被的盖玻片)。培养物在体外孵育7天和14天进行神经突长出测定。细胞在4％PFA中固定1h，在室温(RT)下于10％非免疫马血清的PBST(0.1M PBS，0.1％Triton X-100，1％BSA)中预孵育1h，并在4℃下与针对小鼠单克隆MAP2(1：200，Millipore)和14-3-3ζ(1：1000)的初级抗体孵育过夜。然后，盖玻片与相应的次级抗体在室温下孵育1h。用抗衰减DAPI(Molecular Probes)对盖玻片封片。
平衡盐溶液(HBSS)中解剖和分离齿状回和CA样品，并将神经元以每个培养皿1×10 个细胞的密度涂布(用4-PPL包被的盖玻片)。培养物在体外孵育7天和14天进行神经突长出测定。细胞在4％PFA中固定1h，在室温(RT)下于10％非免疫马血清的PBST(0.1M PBS，0.1％Triton X-100，1％BSA)中预孵育1h，并在4℃下与针对小鼠单克隆MAP2(1：200，Millipore)和14-3-3ζ(1：1000)的初级抗体孵育过夜。然后，盖玻片与相应的次级抗体在室温下孵育1h。用抗衰减DAPI(Molecular Probes)对盖玻片封片。
[0178] 结果
[0179] 14-3-3ζ突变体小鼠显示行为和认知缺陷
[0180] 14-3-3蛋白在发育中的和成体脑中大量的表达(Berg et al.Nat Rev Neurosci2003；4(9)：752-762；Baxter et al.Neuroscience2002；109(1)：5-14)。 为 了确定14-3-3ζ在神经发育和脑功能中的作用，产生两个敲除小鼠品系，所述品系从在内含子1或2中含有的逆转录病毒基因陷阱插入物的胚胎干细胞克隆形成(图8；Lexicon Gt(OST390)LexGenetics)，其分别称为14-3-3和14-3-3ζ 。对来自杂合杂交(heterozygous intercross)的胚胎和成体脑组织的定量RT-PCR和蛋白质印迹确认基因陷阱载体破
062+/-
坏了基因转录并造成无效等位基因(图9)。这些突变体品系称为14-3-3ζ 和
390+/-
14-3-3ζ 。不同于其他14-3-3同工型的缺陷(Su et al.Proc Natl Acad Sci U SA2011；
108(4)：1555-1560)，表达分析进一步确定了14-3-3C的移除没有被突变体小鼠中其他
14-3-3家族成员表达的增加所补偿(图10)。来自两个品系14-3-3ζ杂合小鼠的互交导致预计的孟德尔式比例的纯合突变体(WT23％，Het56％，Mut21％；n＝494，p<0.001)，表明基因的移除不是胚胎致死的。突变体胚胎和新生小鼠的初步检查表明发育正常进行，因为从其同窝幼畜形态上不能区别。然而，通过来自两个品系的P14突变体小鼠，显示了生长迟缓而通过P21大约20％的突变体小鼠已死亡(WT29％，Het54％，Mut17％；n＝1619)。
剩余的突变体小鼠小与WT同窝幼畜，但是具有相似的寿命期望(P100；WT24.55±1.7g，Mut19.73g±2.5g)。突变体小鼠显示表面上的正常和健康，在嗅觉测试、视觉测试和电线悬挂测试(wire-hang test)中没有差异。
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坏了基因转录并造成无效等位基因(图9)。这些突变体品系称为14-3-3ζ 和
390+/-
14-3-3ζ 。不同于其他14-3-3同工型的缺陷(Su et al.Proc Natl Acad Sci U SA2011；
108(4)：1555-1560)，表达分析进一步确定了14-3-3C的移除没有被突变体小鼠中其他
14-3-3家族成员表达的增加所补偿(图10)。来自两个品系14-3-3ζ杂合小鼠的互交导致预计的孟德尔式比例的纯合突变体(WT23％，Het56％，Mut21％；n＝494，p<0.001)，表明基因的移除不是胚胎致死的。突变体胚胎和新生小鼠的初步检查表明发育正常进行，因为从其同窝幼畜形态上不能区别。然而，通过来自两个品系的P14突变体小鼠，显示了生长迟缓而通过P21大约20％的突变体小鼠已死亡(WT29％，Het54％，Mut17％；n＝1619)。
剩余的突变体小鼠小与WT同窝幼畜，但是具有相似的寿命期望(P100；WT24.55±1.7g，Mut19.73g±2.5g)。突变体小鼠显示表面上的正常和健康，在嗅觉测试、视觉测试和电线悬挂测试(wire-hang test)中没有差异。
[0181] 为了确定的分析14-3-3ζ与神经障碍和脑功能的关联，完成了一系列对突变体062-/-
和对照小鼠的行为测试。首先评价14-3-3ζ 小鼠对旷场环境的反应。突变体显示了在整个测试期行进距离(distance travelled)的显著增加，所述增加在所有测试年龄(5、10、
20和30周)保持，表明突变体小鼠极度活跃(图1A)。所述效应在雄性和雌性二者中相似没有性别偏差(p>0.05)。
和对照小鼠的行为测试。首先评价14-3-3ζ 小鼠对旷场环境的反应。突变体显示了在整个测试期行进距离(distance travelled)的显著增加，所述增加在所有测试年龄(5、10、
20和30周)保持，表明突变体小鼠极度活跃(图1A)。所述效应在雄性和雌性二者中相似没有性别偏差(p>0.05)。
[0182] 利用小鼠天然地对新物体而非熟悉物体的探索偏好以测试识别记忆。中叶(medial lobe)中鼻周皮层的正确功能对于所述任务是关键的(Dere et al.2006supra；Sik et al.2003supra；Forwood et al.Hippocampus2005；15(3)：347-355；Winters et al.J Neurosci2005；25(17)：4243-4251)。在样品阶段，小鼠花费同样的时间探索每个
062+/+ 062-/-
相同的物体(14-3-3ζ ，50.82±1.2％；14-3-3ζ 49.18+1.2％)。当呈现熟悉
062-/-
的和新物体时，与对照相比，在整个测试期14-3-3ζ 小鼠展现出显著受损的新事物
062-/-
识别。与在熟悉和新物体间偏好的缺乏相一致，14-3-3ζ 小鼠具有减少的辨别指数(探索新物体时间-探索熟悉物体时间/探索新物体时间+探索熟悉物体时间)，表明
062+/+ 062-/-
其没能保留新信息(14-3-3ζ ，0.1667±0.086s；14-3-3ζ ，-0.0569±0.047s；
062-/-
p<0.05)。再一次，在测试的任一阶段无性别差异(p>0.5)。尤其，14-3-3ζ 突变体还证明了在尝试的两个阶段中都有更长探索时间之物体识别测试中的极度活跃(样
062+/+ 062-/-
品阶 段，14-3-3ζ ，27.33±2.7s；14-3-3ζ ，38.62±4.1s；p<0.05：测 试 阶 段，
062+/+ 062-/-
14-3-3ζ ，24.58±3.1s；14-3-3ζ ，50.77±4.7s；p<0.0001)。
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相同的物体(14-3-3ζ ，50.82±1.2％；14-3-3ζ 49.18+1.2％)。当呈现熟悉
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的和新物体时，与对照相比，在整个测试期14-3-3ζ 小鼠展现出显著受损的新事物
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识别。与在熟悉和新物体间偏好的缺乏相一致，14-3-3ζ 小鼠具有减少的辨别指数(探索新物体时间-探索熟悉物体时间/探索新物体时间+探索熟悉物体时间)，表明
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其没能保留新信息(14-3-3ζ ，0.1667±0.086s；14-3-3ζ ，-0.0569±0.047s；
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p<0.05)。再一次，在测试的任一阶段无性别差异(p>0.5)。尤其，14-3-3ζ 突变体还证明了在尝试的两个阶段中都有更长探索时间之物体识别测试中的极度活跃(样
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品阶 段，14-3-3ζ ，27.33±2.7s；14-3-3ζ ，38.62±4.1s；p<0.05：测 试 阶 段，
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[0183] 广泛使用高架十字迷宫来测试啮齿类的焦虑行为(Komada et al.2008supra；Walf et al.2007supra；Lister RG，Psych oph armacology(Berl)1987；92(2)：180-185)。
062-/-
当放置于所述测试中时，14-3-3ζ 小鼠还证明了相比野生型对照增加的活动。
062-/-
14-3-3ζ 小鼠在5分钟的测试期中于交叉臂间有25.23±1.76的转移(transition)，
062+/+ 062+/+
而14-3-3ζ 有12.29±1.21(p<0.0001)。此外，相比14-3-3ζ 小鼠(31.4±6.0s，
062-/-
p<0.0001)，14-3-3ζ 小鼠显著地花费更多时间在开放臂中(图1B：114.8±11.5s)，更
062+/+ 062-/-
经常的进入其中(14-3-3ζ ，4.6±0，6；14-3-3ζ ，15.5±1.7，p<0.0001)并更多的
062+/+ 062-/-
探头(14-3-3ζ 19.6±1.5；14-3-3ζ ，33.4±2.4p＝0.0041)，表明其具有更低水平的焦虑。
062-/-
当放置于所述测试中时，14-3-3ζ 小鼠还证明了相比野生型对照增加的活动。
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14-3-3ζ 小鼠在5分钟的测试期中于交叉臂间有25.23±1.76的转移(transition)，
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而14-3-3ζ 有12.29±1.21(p<0.0001)。此外，相比14-3-3ζ 小鼠(31.4±6.0s，
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p<0.0001)，14-3-3ζ 小鼠显著地花费更多时间在开放臂中(图1B：114.8±11.5s)，更
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经常的进入其中(14-3-3ζ ，4.6±0，6；14-3-3ζ ，15.5±1.7，p<0.0001)并更多的
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探头(14-3-3ζ 19.6±1.5；14-3-3ζ ，33.4±2.4p＝0.0041)，表明其具有更低水平的焦虑。
[0184] 使用十字迷宫逃脱任务检验空间工作记忆依赖性学习(Summers etal.2006supra)。海马和前额皮质间合适的信号发出是所述任务获得的先决条件。训练小鼠6天以识别十字迷宫含有淹没之逃脱平台的正确臂。在整个实验中，通过新的可视提示
062-/-
表示十字迷宫的每个臂。虽然一些14-3-3ζ 小鼠学会识别正确臂，但是其显示出在整
2
个获得期的过程中到达平台潜伏期的增加(图11；χ(5)＝29.8808；p<0.0001)以及臂选择准确性显著的降低(图1C：IRR＝0.52；p<0.0001)。然后通过在获得后测试所述小鼠
14天或者28天，随后在逃脱平台水迷宫中再测试其记忆正确交叉臂的能力(分别为M1和
062+/+
M2)。与学习阶段相比，14-3-3ζ 小鼠没有显示出逃脱潜伏期的变化(HR＝1.18，p＝
062-/-
0.383)，而14-3-3ζ 证明了逃脱潜伏期显著的增加(HR＝2.98，p<0.0001)。与海马依赖性记忆的功能紊乱相一致，突变体小鼠还在臂选择的准确性上有显著的降低(图1C：IRR＝0.231；p<0.0001)。所有的识别缺陷不依赖于性别。
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表示十字迷宫的每个臂。虽然一些14-3-3ζ 小鼠学会识别正确臂，但是其显示出在整
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个获得期的过程中到达平台潜伏期的增加(图11；χ(5)＝29.8808；p<0.0001)以及臂选择准确性显著的降低(图1C：IRR＝0.52；p<0.0001)。然后通过在获得后测试所述小鼠
14天或者28天，随后在逃脱平台水迷宫中再测试其记忆正确交叉臂的能力(分别为M1和
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M2)。与学习阶段相比，14-3-3ζ 小鼠没有显示出逃脱潜伏期的变化(HR＝1.18，p＝
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0.383)，而14-3-3ζ 证明了逃脱潜伏期显著的增加(HR＝2.98，p<0.0001)。与海马依赖性记忆的功能紊乱相一致，突变体小鼠还在臂选择的准确性上有显著的降低(图1C：IRR＝0.231；p<0.0001)。所有的识别缺陷不依赖于性别。
[0185] 感觉运动门控中的缺陷为神经精神病(如精神分裂症和相关病症)的内表型。在海马和其他脑区域的合适信号发出对于此过滤机制(filtering mechanism)是必不可少的。为了确定14-3-3ζ突变体小鼠是否具有异常的感觉运动门控，评估声音惊吓反射的前脉
062+/+ 062-/-
冲抑制(PPI)。发现相比于14-3-3ζ 小鼠，14-3-3ζ 小鼠具有显著较低的PPI(图
1D：基因型的主要效应F(1，20)＝5.89，p＝0.025)和惊吓(图12：F(1，20)＝5.87，p＝
0.023)。前脉冲强度水平的增加引起在WT和突变体小鼠中PPI相似的增加(图1D)。总的来说，在突变体小鼠中惊吓幅度减少了而惊吓适应正常(图12)。
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冲抑制(PPI)。发现相比于14-3-3ζ 小鼠，14-3-3ζ 小鼠具有显著较低的PPI(图
1D：基因型的主要效应F(1，20)＝5.89，p＝0.025)和惊吓(图12：F(1，20)＝5.87，p＝
0.023)。前脉冲强度水平的增加引起在WT和突变体小鼠中PPI相似的增加(图1D)。总的来说，在突变体小鼠中惊吓幅度减少了而惊吓适应正常(图12)。
[0186] 14-3-3ζ在海马神经元中表达以控制分层
[0187] 为了确定认知和行为缺陷是否起因于海马的神经发育缺陷，分析14-3-3ζ在神经元发育中的作用。海马神经元来源于沿着脑室区(NEv)神经上皮和邻近伞部(NEf)神经上皮的限制区(Nakahira et al.J Comp Neurol2005；483(3)：329-340)(图2A)。在14.5dpc，在中间区迁移海马神经元中检测到14-3-3ζ免疫染色，而并不在其神经上皮前体中(图2Bi)。至P0，还在海马本部/海马角(CA)的锥体细胞中检测到14-3-3ζ免疫染色(图
2Biii)。利用14-3-3ζ小鼠品系之基因陷阱载体中的β-geo转基因，用B半乳糖苷酶染色监测14-3-3ζ内源表达。与免疫染色一致，鉴定到在迁移CA神经元中14-3-3ζ的转录水平表达。此外，检测到在CA和DG神经元中的表达进入成年晚期(图2C)。然而，意外地，出生后早期阶段之后，在脑的其他区域(如小脑)未检测到14-3-3ζ(图13)。通过从显微解剖的成体海马提取的蛋白质的蛋白质印迹确认了CA和DG神经元中的表达(图2D)。其还
062-/-
确认了蛋白质从14-3-3ζ 小鼠的这些脑区域完全被去除。最后，体外10天(DIV)后，海马MAP2阳性神经元培养物也显示在细胞体和轴突/树突中14-3-3ζ的点状(punctate)免疫细胞染色(图2E)。
2Biii)。利用14-3-3ζ小鼠品系之基因陷阱载体中的β-geo转基因，用B半乳糖苷酶染色监测14-3-3ζ内源表达。与免疫染色一致，鉴定到在迁移CA神经元中14-3-3ζ的转录水平表达。此外，检测到在CA和DG神经元中的表达进入成年晚期(图2C)。然而，意外地，出生后早期阶段之后，在脑的其他区域(如小脑)未检测到14-3-3ζ(图13)。通过从显微解剖的成体海马提取的蛋白质的蛋白质印迹确认了CA和DG神经元中的表达(图2D)。其还
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确认了蛋白质从14-3-3ζ 小鼠的这些脑区域完全被去除。最后，体外10天(DIV)后，海马MAP2阳性神经元培养物也显示在细胞体和轴突/树突中14-3-3ζ的点状(punctate)免疫细胞染色(图2E)。
[0188] 由于14-3-3ζ在海马神经元中表达，我们接着检验了CA和DG神经元来确定是否062-/-
其在成体和胚胎突变体中正确定位。14-3-3ζ 小鼠的尼氏染色揭示了在海马成熟前首次明显的发育缺陷(5/5在P0、4/4在P7、2/2在P28和2/2在P56；图3A和图14)。特别地，除了锥体层的通常停留处，锥体神经元异位定位于辐射层和始层。在CA3亚区中，锥体
062+/+
神经元分裂成两层而不是单个细胞层。与14-3-3ζ 同窝幼畜相比，齿状回神经元也在
062-/-
14-3-3ζ 小鼠中呈弥散型包装。与尼氏染色一致，在thy1-YEP小鼠中海马结构的分析也揭示了被破坏的分层(图3B)。
其在成体和胚胎突变体中正确定位。14-3-3ζ 小鼠的尼氏染色揭示了在海马成熟前首次明显的发育缺陷(5/5在P0、4/4在P7、2/2在P28和2/2在P56；图3A和图14)。特别地，除了锥体层的通常停留处，锥体神经元异位定位于辐射层和始层。在CA3亚区中，锥体
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神经元分裂成两层而不是单个细胞层。与14-3-3ζ 同窝幼畜相比，齿状回神经元也在
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14-3-3ζ 小鼠中呈弥散型包装。与尼氏染色一致，在thy1-YEP小鼠中海马结构的分析也揭示了被破坏的分层(图3B)。
[0189] 然后考虑涉及异位定位的锥体细胞是否发育成成熟神经元。在所有的062-/-
14-3-3ζ 海马(4/4幼兽)中，异位细胞对于神经元标记物NeuN为阳性(图3C)。与自身定位在深分子层不同，神经元也在CA3的浅层中成熟。同时，所述数据推断海马体中误定位的细胞形成功能性锥体和颗粒神经元。此外，对来自胚胎、出生后早期和成体小鼠的海马体的TUNEL染色未显示基因型间明显的不同(图15)，表明14-3-3ζ的缺乏不影响神经元生存。
14-3-3ζ 海马(4/4幼兽)中，异位细胞对于神经元标记物NeuN为阳性(图3C)。与自身定位在深分子层不同，神经元也在CA3的浅层中成熟。同时，所述数据推断海马体中误定位的细胞形成功能性锥体和颗粒神经元。此外，对来自胚胎、出生后早期和成体小鼠的海马体的TUNEL染色未显示基因型间明显的不同(图15)，表明14-3-3ζ的缺乏不影响神经元生存。
[0190] 14-3-3ζ缺陷小鼠表现海马神经元迁移缺陷
[0191] 在14.5dpc，14-3-3ζ在中间区的表达和在P0浅层中成熟神经元的存在升高了异常分层可起因于错误迁移的可能性。为了可视化海马神经元迁移，通过向14.5dpc和062
16.5dpc的杂合14-3-3ζ 杂交怀孕母兽注射BrdU来完成出生日期确定(birthdating)。
062+/+ 062-/-
在P7收集14-3-3ζ 和14-3-3ζ 幼兽，在冠状切面中鉴定保留BrdU的细胞。用DAPI复染色切片以鉴定海马分开的层。使用每个基因型的5只小鼠从10μm切片计数保留BrdU的细胞并定量每层中相对的百分比。两个注射时间点都显示在对照小鼠中几乎所有在脑室区于14.5dpc或16.5dpc生成的神经元迁移至CA的锥体层(图4)。然而，引入注
062-/-
目地，在14-3-3ζ 小鼠锥体层的外面鉴定到保留BrdU细胞显著的百分比。神经元未能
062-/-
从其出生地迁移或者停在其正确的层，因此造成在14-3-3ζ 海马中重复的锥体层。
16.5dpc的杂合14-3-3ζ 杂交怀孕母兽注射BrdU来完成出生日期确定(birthdating)。
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在P7收集14-3-3ζ 和14-3-3ζ 幼兽，在冠状切面中鉴定保留BrdU的细胞。用DAPI复染色切片以鉴定海马分开的层。使用每个基因型的5只小鼠从10μm切片计数保留BrdU的细胞并定量每层中相对的百分比。两个注射时间点都显示在对照小鼠中几乎所有在脑室区于14.5dpc或16.5dpc生成的神经元迁移至CA的锥体层(图4)。然而，引入注
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目地，在14-3-3ζ 小鼠锥体层的外面鉴定到保留BrdU细胞显著的百分比。神经元未能
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从其出生地迁移或者停在其正确的层，因此造成在14-3-3ζ 海马中重复的锥体层。
[0192] 在14-3-3ζ062-/-缺陷小鼠锥体细胞中功能性破坏的苔藓纤维环路和异常突触末梢
[0193] CA3锥体神经元和DG颗粒细胞间的联系通过精确的轴突导向和突触靶向达到。通过在P0、P7和P56海马用抗钙结合蛋白进行免疫组织化学染色评估错排的锥体神经元是否影响海马环路(hippocampal circuit)的问题。在对照小鼠中，苔藓纤维发芽自颗粒细胞胞体并分支为下锥体苔藓纤维(IPMF)和上锥体苔藓纤维(SPMF)神经束跨越CA3的锥体层062-/-
(图5)。在14-3-3ζ 小鼠中，所述IPMF神经束沿着CA3锥体神经元的顶表面导向，然而，所述SPMF神经束在CA3神经元当中为错误路线。
(图5)。在14-3-3ζ 小鼠中，所述IPMF神经束沿着CA3锥体神经元的顶表面导向，然而，所述SPMF神经束在CA3神经元当中为错误路线。
[0194] 为确定DG颗粒细胞是否突触连接其CA靶细胞，使用抗突触泡蛋白以鉴定在对照062-/-
动物CA3亚区的IPMF和SPMF二者中的前突触(presynapse)。在14-3-3ζ 小鼠中，错误路线的轴突也在锥体层形成异常突触(图6)。通过高尔基染色的突触结可视化进一步揭示了CA3中突触形成的明显差异。在对照动物中，顶端树突(apical dendrite)近端区上的
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大棘突跟随着细径树突分支(fine-calibre dendritic branches)。在14-3-3ζ 小鼠的锥体神经元中，树突树似乎具有相似数量的分支点但是具有来自所有检测小鼠近端和远端顶端树突二者上错误路线之苔藓纤维神经束的刺样膨大。
动物CA3亚区的IPMF和SPMF二者中的前突触(presynapse)。在14-3-3ζ 小鼠中，错误路线的轴突也在锥体层形成异常突触(图6)。通过高尔基染色的突触结可视化进一步揭示了CA3中突触形成的明显差异。在对照动物中，顶端树突(apical dendrite)近端区上的
062-/-
大棘突跟随着细径树突分支(fine-calibre dendritic branches)。在14-3-3ζ 小鼠的锥体神经元中，树突树似乎具有相似数量的分支点但是具有来自所有检测小鼠近端和远端顶端树突二者上错误路线之苔藓纤维神经束的刺样膨大。
[0195] 为了鉴定14-3-3ζ协调神经元迁移和轴突寻找通路使用的分子通路，对来自P7小鼠全脑提取物进行免疫共沉淀实验。发现14-3-3ζ可以与针对DISC1C末端产生的抗体发生免疫共沉淀。反之亦然，还发现DISC1可以与识别14-3-3ζ的抗体免疫共沉淀(图7)。出人意料地，所述数据表明14-3-3ζ与DISC1的75kDa形式而非100kDa全长蛋白质特异地相互作用，表明DISC1功能在神经发育中以同工型特异方式。
[0196] 实施例2
[0197] 合并的临床和实验证据表明精神分裂症和相关病症起因于多巴胺能和谷氨酸能神经递质通路中的互相连接缺陷。海马已被确定为该模型中的关键结构，因为海马锥体神-/-经元整合了谷氨酸能和多巴胺能系统。为确定任一神经递质通路是否是14-3-3ζ 小鼠中神经精神病样行为缺陷的支撑，进行了特异性拮抗每个通路的精神药物诱导行为的研究-/-
(图16)。发现NMDA受体拮抗物MK801破坏了野生型对照而非14-3-3ζ 小鼠中的PPI。
-/-
相反地，多巴胺释放物阿扑吗啡在14-3-3ζ 小鼠和野生型对照中对PPI具有相似的效-/-
应。这表明14-3-3ζ 小鼠的基线PPI缺陷由谷氨酸能通路中的缺陷造成。还在运动功能测试中使用另一个多巴胺释放物安非他明研究了超多巴胺能假说(hyperdopaminergic -/-
hypothesis)。发现与野生型对照相比，在14-3-3ζ 小鼠中发生增强效应(即，时间减-/-
少以变得极度活跃且行进距离的增加)，表明14-3-3ζ 小鼠基线极度活跃由多巴胺能-/-
通路中的缺陷造成(图17)。因此，14-3-3ζ 小鼠在多巴胺能和谷氨酸能神经递质通路中具有缺陷。考虑到所述药物在精神分裂症患者中引起相似效应的能力，所述发现对-/-
14-3-3ζ 小鼠作为精神分裂症和相关病症的模型提供了坚实的支持。
(图16)。发现NMDA受体拮抗物MK801破坏了野生型对照而非14-3-3ζ 小鼠中的PPI。
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相反地，多巴胺释放物阿扑吗啡在14-3-3ζ 小鼠和野生型对照中对PPI具有相似的效-/-
应。这表明14-3-3ζ 小鼠的基线PPI缺陷由谷氨酸能通路中的缺陷造成。还在运动功能测试中使用另一个多巴胺释放物安非他明研究了超多巴胺能假说(hyperdopaminergic -/-
hypothesis)。发现与野生型对照相比，在14-3-3ζ 小鼠中发生增强效应(即，时间减-/-
少以变得极度活跃且行进距离的增加)，表明14-3-3ζ 小鼠基线极度活跃由多巴胺能-/-
通路中的缺陷造成(图17)。因此，14-3-3ζ 小鼠在多巴胺能和谷氨酸能神经递质通路中具有缺陷。考虑到所述药物在精神分裂症患者中引起相似效应的能力，所述发现对-/-
14-3-3ζ 小鼠作为精神分裂症和相关病症的模型提供了坚实的支持。
[0198] 实施例3
[0199] 减少的树突分枝和棘突触是精神分裂症和相关病症的解剖学特点。使用免费的技术(如高尔基浸渍、锥体神经元的体外培养和生物射弹加标签)，已经进行了海马颗粒和锥体神经元中树突棘数量和棘尺寸的分析(图18)。发现了海马中显著减少的棘，强烈支持了-/-14-3-3ζ 小鼠作为精神分裂症和相关病症的稳健模型。
[0200] 本领域技术人员将了解本文描述的本发明对除了那些特别描述的，对变化和修改也适合。应了解本发明包括所有所述的变化和修改。本发明还包括所有的步骤、特征、本发明中个别地或者全体地提到或表明的组合物和化合物、以及任何和所有任何两种或者更多种所述步骤和特征的组合。
[0201] 表1用于14-3-3同工型之定量RT-PCR以及用于对小鼠进行基因分型的引物[0202]
[0203] 书目
[0204] Aitken A.，Semin Cancer Biol2006；16(3)：162-172
[0205] Alon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA：96，6745-6750，June1999[0206] Baxter et al.Neuroscience2002；109(1)：5-14
[0207] Berg et al.Nat Rev Neurosci2003；4(9)：752-762
[0208] Bradshaw and Porteous(2010-12-31).“DISC1-binding proteins in neural development，
[0209] signalling and sch izophren ia.”.Neurop harmacology
[0210] Brcnner and Lerner.(1992)PNAS USA89：5381-3
[0211] Christian R.B et al.(1992)J.Mol.Biol.227：711-718
[0212] Clark et al.2006，Nature Protocols1：2353-2364
[0213] Coylc et al.Behav Brain Res2009，197(1)：210-218
[0214] dc Bruin et al.Pharmacol Biochem Behav2006；85(1)：253-260
[0215] Dcre et al.Neurosci Biobehav Rev2006；30(8)：1206-1224
[0216] Dcvlin et al.(1990)Science249：404-406
[0217] E ichlcr et al.，Med.Res.Rev.15：481-496(1995)
[0218] Erb et al.(1994)PNAS USA91：11422-11426
[0219] Fodor et al.，(1991)Science，Vol.251(4995)：767-773
[0220] Forwood et al.Hippocampus2005；15(3)：347-355
[0221] Francis et al.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：422-428(1998)
[0222] Fu et al.Annu Rev Pharmacol Toxicol2000；40：617-647
[0223] Gallop et al.(1994)J.Medicinal Chemistry37(9)：1233-1251
[0224] Germer et al.，Genome Res.10：258-266(2000)
[0225] Gordon et al.，Acc.Chem.Res.29：144-154(1996)
[0226] Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1233-1251(1994)
[0227] Gordon et al.，J.Med.Chem.37：1385-1401(1994)
[0228] Guo et al.，Nucleic Acids Res.22：5456-5465(1994)
[0229] Guthridge et al.Blood2004；103(3)：820-827
[0230] Heid et al.，Genome Res.6：986-994(1996)
[0231] Houghten et al.(1991)Nature，354：84-88
[0232] Houghten et al.(1992)B ioTechniques13(3)：412-421
[0233] Jayawickreme et al.(1994)PNAS USA91：1614-1618
[0234] Kaech et al.Nat Protoc2006，1(5)：2406-2415
[0235] Kay et al.(1993)Gene128：59-65
[0236] Komada et al.J Vis Exp2008；(22)
[0237] Lam et al.(1991)Nature354：82-84
[0238] Lenstra.(1992)J.Immun.Methods152：149-157
[0239] Lister RG，Psychopharmacology(Berl)1987；92(2)：1g0-185
[0240] Maskos and Southern，Nuc.Acids Res.20：1679-84，1992
[0241] Maskos and Southern，Nuc.Acids Res.20：1679-84，1992
[0242] Mattheakis et al.(1994)PNAS USA91：9022-9026
[0243] Medynski.(1994)Bio/Technology12：709-710
[0244] M iddleton et al.Neuropsychopharmacology2005；30(5)：974-983[0245] Millar et al.2000，Hum.Mol.Genet.9(0)：1415-23
[0246] Moore et al.，BBA，1402：239-249，1988
[0247] Nakahira et al.J Comp Neurol2005；483(3)：329-340
[0248] Nakata et al.(2009).Proc Natl Acad Sci U S A.106(37)：15873-8[0249] Ohlmeyer et al.(1993)PNAS USA90：10922-10926
[0250] Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(11)：5022-5026(1994)[0251] Rosner et al.Amino Acids2006；30(1)：105-109
[0252] Salmon etal.(1993)PNAS USA90：11708-11712
[0253] Schiffet al.Eur J Med Genet2010；53(5)：303-308
[0254] Scott and Smith.(1990)Science249：386-390
[0255] Sik et al.Behav Brain Res2003；147(1-2)：49-54
[0256] Smith et al.，Science258：1122-1126(1992)
[0257] Sofia，Molecule.Divers.，3：75-94(1998)
[0258] Su et al.Proc Natl AcadSci USA2011；108(4)：1555-1560
[0259] Summers et al.Pediatr Res2006；59(1)：66-71
[0260] Taylor et al.(2003)Genomics81(1)：67-77
[0261] Tietze et al.，Curr.Biol.，2：363-381(1998)
[0262] Toyo-oka et al.Nat Genet2003Jul；34(3)：274-285
[0263] Tzivion and Avruch2002，J.Biol.Chem.277：3061-64
[0264] van den Buuse et al.Int JNeuropsychopharmacol2009；12(10)：1383-1393[0265] Walf et al.Nat Protoc2007；2(2)：322-328
[0266] Wedemeyer et al.，Clinical Chemistry48：91398-1405，2002)
[0267] Weissleder et al.，Nature Medicine6：351-355，2000
[0268] Wilson and Czarnik，eds.，Combinatorial Chemistry：Synthesis and Application.John Wi ley&Sons，New York(1997).
[0269] Winters et al.J Neurosci2005；25(17)：4243-4251
[0270] Wong et al.Schizophr Res2005；78(2-3)：137-146
[0271] Xing et al.2000，EMBOJ.19：349-58
[0272] Yaffe2002，FEBS Letts.513：53-57
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