一种胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法及其用途
阅读：988发布：2020-06-17
专利汇可以提供一种胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种胎源性躁郁症动物模型的构建方法及其应用。所述的胎源性躁郁症动物模型，为在啮齿类动物于孕9~20天每日给予0.1~2.0 mg/kg地塞米松皮下注射，出生后常规正常饲养至10周后给予两周 冰 水 游泳慢性刺激至12周时即出现与人类躁郁症类似的典型特征。本发明所建立的模型新颖、可靠、简便，对指导孕期临床合理用药、探讨胎源性躁郁症作用机制及分子靶标、筛选宫内环境干扰物和药物等都具有重要意义。，下面是一种胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法及其用途专利的具体信息内容。
1.一种胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1) 选取健康受孕的啮齿类动物，在孕9-20天的时间段，每日给予0.1 2.0 mg/kg地塞~
米松皮下注射，孕鼠自由饮食；
(2) 母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为
12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养；
(3) 仔鼠出生后4周断奶并雄、雌分笼，继续正常饮食饲养；所述的正常饮食是配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同；
(4) 饲养子代至出生后10周，再给予两周冰水游泳慢性刺激至12周，分别在10周和12周检测行为学相关指征来获得躁郁症模型，并在两次行为学检测完成时尾静脉取血检测相关血清学指标来综合判定躁郁症发生；所述的行为学检测相关指标是：旷场实验、十字高架迷宫、Morris水迷宫；血清学相关指标：促肾上腺皮质激素、皮质酮；
所述步骤（4）中得到的胎源性躁郁症大鼠模型中，与正常对照组相比，具有下列5个特征：
A、应激前血清促肾上腺皮质激素无明显变化，但在应激后显著升高；
B、应激前血清皮质酮无明显变化，但在应激后显著升高；
C、旷场实验：应激前雄性子代垂直运动得分、周边运动距离、中央运动距离显著减少，但水平运动距离、粪便粒数则无明显改变；应激前雌性子代垂直运动得分、水平运动得分、中央运动距离显著降低，但粪便粒数及周边运动距离则无明显改变；应激后雄性和雌性子代大鼠水平运动得分、垂直运动得分、周边运动距离及中央运动距离均显著降低，而粪便粒数则无明显变化；
D、十字高架迷宫：应激前雄性子代进入封闭臂的时间、进入中央次数、进入开放臂次数和进入封闭臂次数均显著增加，而进入开放臂的时间则无明显改变；雌性子代进入封闭臂时间、进入中央次数、进入封闭臂次数均显著增加，但进入开放臂时间及进入开放臂次数均无明显改变；应激后雄性和雌性子代进入开放臂时间、进入封闭臂时间、进入中央次数、进入开放臂次数及进入封闭臂次数均显著增加；
E、Morris水迷宫：应激前雄性和雌性子代在隐蔽平台测试中的逃避潜伏期及运动距离均显著增加，在探索测试中目标象限时间及跨越平台次数均显著减少；应激后雄性和雌性子代在隐蔽平台测试中的逃避潜伏期及运动距离均显著增加，在探索测试中目标象限时间及跨越平台次数均显著减少。
2.如权利要求1所述的胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法，其特征在于，所述啮齿类动物为SPF级Wistar、SD大鼠。
3.一种权利要求1构建的胎源性躁郁症大鼠模型的用途，其中，将该模型用于筛选或鉴定宫内环境干扰物或治疗胎源性躁郁症的药物，所述的用途是非诊断和非治疗目的的。
一种胎源性躁郁症大鼠模型的构建方法及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及动物模型构建技术领域，具体涉及一种胎源性躁郁症动物模型的构建方法。
背景技术
[0002] 躁郁症，又称双向情感障碍(bipolar disorder,BD)，是一种以情感的异常狂躁或抑郁为特征的心理障碍疾病。躁狂发作时，表现为情绪高涨、睡眠缺失、性行为增强、活动增多；而抑郁发作时，则表现为情绪低落、思维迟缓、活动减少等。病情严重时，在发作急性期可出现幻觉、妄想或紧张症状群等精神病症状。临床上，可通过疾病这些特有表现来鉴[1,2]别 。按照疾病诊断和统计手册第5章(DSM-5)的分类标准，BD共分为三型：1)双相障碍I型，有一次或多次躁狂发作，又有重度抑郁发作，是临床最常见的类型；2)双向障碍II型，有重度抑郁发作，同时有一次或多次轻度躁狂发作，但无躁狂发作；3)快速循环型，躁狂、轻度躁狂、抑郁的频繁发作或混合发作。美国国立心理卫生研究所(National Institute of Mental Health,NIMH)提出，可直接根据患者的躁狂和抑郁发作的时间间隔和持续状态来确诊疾病的具体类型[3]。据统计，BD在全球约有2％的患病率，其中，约50％的躁郁症患者具有多种精神病症状，如妄想和/或幻觉，9％-15％的患者有明确自杀倾向，部分患者具有认知功能损伤，主要包括注意力不集中及执行能力降低。且患者常伴随有下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴异常带来的多种代谢性疾病如糖尿病、肥胖、高脂血症以及高血压等[4,5]。Miriam Weiner通过对2129例BD患者死亡原因进行分析发现，死于血管病变的比例为32.9％，其中包括死于脑血管病的108人和死于心血管病的592人，是最主要的致死原因[6]。由此可见，BD严重影响了人们的生活质量，已成为迫切需要解决的公共卫生问题。
[0003] 随着健康与疾病发育起源(Developmental Origins of Health Disease，DOHaD)概念的提出，近年来，越来越多流行病学调查数据提示，BD作为常见的神经精神性疾病亦存在发育起源。Ardesheer Talati针对79位BD患者进行问卷调查发现，孕期烟草暴露可导致子代患病风险增加2倍[7]；2016年，Roshan Chudal针对724位生活在芬兰的被诊断为BD的青少年进行了研究，结果发现孕期吸烟能导致BD的患病率增加1.41倍[8]。针对丹麦2299名BD患者进行问卷调查发现，其在15岁前经历过亲情缺失，会导致患BD的风险增加4.05倍[9]。类似的，针对丹麦2040万1956-1986年出生的人群筛查得出，15岁以前居住于省会城市的儿童，患BD的风险增加了1.23倍。其中，最为显著的案例为丹麦的三大省会城市之一的奥尔胡斯(Aarhus)，其居民患BD的风险增加1.83倍。然而，未城市化的地区则没有出现这种状况[10]。而丹麦的另一项关于情绪障碍性疾病的调查则选取了1955年-1987年出生的200万人群为样本，调查周期为1973年-2005年。结果提示，小于胎龄儿是导致包括BD在内的多种情绪障碍性疾病的风险因素[11]。以上均提示，发育早期不良环境是导致子代BD易感的重要危险因素。因此，探究孕期不良环境因素对BD发生的作用，合理规避不良孕期环境暴露，对指导优生优育，提高人口质量具有重要的现实指导意义。
[0004] 然而，现有的BD动物模型均为成年时期给予不同的干预因素处理，如给予精神欣快类药物阿片肽类处理后撤除药物，导致小鼠对微小刺激敏感，即易怒性增强；给予精神振奋类药物苯丙胺处理，使小鼠睡眠缺失；将小鼠隔离饲养，使小鼠攻击性增强等[12]。这些造模方法虽能模拟BD发生的疾病表型，但反应的情绪异常均为单向，且给药的时间为出生后而非孕期，因而只能反映出生后的环境或药物的“第二次打击”造成的部分情绪异常，与胎源性BD发病机制方面存在较大的差异。因此，现有研究迫切需要建立与人类神经精神疾病高度相似的胎源性BD大鼠模型，筛选出致子代神经发育毒性的外源物，探究其安全范围，进一步造福人类。
[0005] 【参考文献】
[0006] 1.Tohen M,Gold AK,Sylvia LG,Montana RE,McElroy SL,Thase ME,et al.Bipolar mixed features-Results from the comparative effectiveness for bipolar disorder(Bipolar CHOICE)study.Journal of affective disorders 2017；217:183-89.
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[0008] 3.Dickstein D.The Diagnostic Dilemma:Why We Need to Change How We Diagnose Bipolar Disorder in Children.Cerebrum the Dana Forum on Brain Science,2010,2010:23.
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[0017] 12.Einat H.Different behaviors and different strains:potential new ways to model bipolar disorder.Neuroscience&Biobehavioral Reviews,2007,31(6):850.
发明内容
[0018] 本发明要解决的技术问题是提供一种成功率高、有效可靠，可重复性强、简便易行的胎源性躁郁症动物模型的构建方法。
[0019] 为解决上述技术问题，本发明胎源性躁郁症动物模型的构建方法包括下列步骤：
[0020] (1)选取健康受孕的啮齿类动物，在孕9～20天时间段，每日给予0.1～2.0mg/kg地塞米松皮下注射，孕鼠自由饮食；
[0021] (2)母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天，出生后1天时选取窝仔数为12～14只的窝仔，调整每窝雄雌各为6只进行哺乳喂养；
[0022] (3)仔鼠出生后4周断奶并雄雌分笼，继续正常饮食饲养；
[0024] 优选的，所述啮齿类动物为SPF级Wistar大鼠、SD大鼠或昆明种小鼠。
[0025] 优选的，上述步骤(3)所述的正常饮食配方与《中华人名共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠、大鼠配方饲料相同。
[0026] 优选的，上述步骤(4)所述的行为学检测指标包括旷场实验、十字高架迷宫、Morris水迷宫，血清学指标包括促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)和皮质酮。这5项指标全部达到，即可诊断为躁郁症。
[0027] 本发明的另一方面提供上述构建的胎源性躁郁症动物模型在指导孕期合理用药中的应用。
[0028] 本发明的另一方面提供上述构建的胎源性躁郁症动物模型在筛选宫内环境干扰物或药物中的应用。
[0029] 本发明的另一方面提供上述构建的胎源性躁郁症动物模型在胎源性躁郁症作用机制或分子靶标研究中的应用。
[0030] 本发明胎源性躁郁症动物模型的构建方法的有益效果在于：
[0031] (1)本发明的造模方法简单，模型旷场实验、十字高架、Morris水迷宫、ACTH、皮质酮等指标稳定性好，可重复性强，为胎源性躁郁症的构建，提供了一种可靠的方法。
[0033] 图1孕期地塞米松暴露(PDE,0.2mg/kg.d)对子代应激前、后血清下丘脑-垂体-肾上腺轴活性变化。
[0034] A：雄性应激前后血促肾上腺皮质激素(ACTH)；B：雌性应激前后血促肾上腺皮质激素C：雄性应激前后血皮质酮；D：雌性应激前后血皮质酮
具体实施方式
[0035] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0036] 【实施例1】本发明胎源性躁郁症动物模型的构建
[0037] 1、实验动物：
[0038] SPF级健康Wistar大鼠，购自湖北省疾病预防控制中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-2010。本研究获武汉大学医学部伦理委员会批准，并严格按照国际实验动物保护认证评估机构相关处理准则执行。
[0039] 实验动物饲养于屏障环境内，温度22～25℃，湿度50％，12小时昼夜交替。
[0040] 2、实验方法：
[0041] 雄性Wistar大鼠10只(体重260-300g)，雌鼠Wistar大鼠20只(体重200-240g)。自由饮水进食，适应性喂养7天后，按照雄：雌＝1:2合笼，次晨阴道涂片，确定受孕大鼠，记为孕0天。
[0042] 受孕大鼠随即分为两组：对照组和地塞米松组，每组10只。自孕9～20天，地塞米松组每日经皮下给予地塞米松0.2mg/kg.d，对照组给予同等体积的蒸馏水，给药体积均为1ml/kg。各组孕鼠均自由正常饮食。饲料购自武汉市万千佳兴生物科技有限公司，许可证号：SCXK(鄂)2011-0011。饲料配方与《中华人民共和国国家标准GB14924.3-2001》规定的小鼠大鼠配方饲料相同。
[0043] 母鼠自然生产，获得F1代，以生产日作为出生后0天(postnatal day 0,PD0)，PD1时每组选取窝仔数为12-14只的窝仔，调整每窝雄、雌性仔鼠各为6只进行哺乳喂养，以保证仔鼠均衡营养。仔鼠出生后4周(postnatal week 4,PW4)断奶并雄、雌分笼，每组随机选取24只继续正常饮食饲养至PW10，其中一组给予两周冰水游泳慢性刺激，另一组自然饲养至PW12。
[0044] 喂养12周时进行旷场实验、十字高架迷宫、Morris水迷宫及血清学检测，上述实验完成后间隔2天，经麻醉处死动物，断头取血。收集血样，检测血清ACTH和皮质酮。
[0045] 3、检测指标及方法：
[0046] 3.1旷场实验
[0047] 实验装置为100cm×100cm×50cm的无盖木箱方盒，四周和底面全部涂黑。根据smart 3.0系统，自动将地面划分为16个方格。用酒精将方盒擦拭干净后，将大鼠置于木箱中心方格内，观察5min内大鼠的活性情况。观察指标：①周围运动距离(外周12个格子的运动距离)；②中央运动距离(中央4个格子的运动距离)；③周围运动时间；④外周运动时间。3.2十字高架迷宫
[0048] 实验开始前，用酒精将迷宫的四个臂擦拭干净。将大鼠放置于迷宫的两臂相交的中心，观察5min内大鼠的活动情况。观察指标：①开放臂运动时间；②封闭臂运动时间；③开放臂运动距离；④封闭臂运动距离。
[0049] 3.3 Morris水迷宫
[0050] 固定好水迷宫站台，保证站台没于水面2-3cm，水温维持在22℃，第1-5天，从四个象限依次将大鼠面朝迷宫壁放入水中，观察其在90s内的运动状态。第6天，从选定的一个象限将大鼠放入水中，观察其运动变化，随后撤去站台，继续观察其运动变化。
[0051] 3.4促肾上腺皮质激素释放激素和皮质酮测定
[0053] 4、实验结果
[0054] 4.1 HPA轴应激后活性变化。
[0055] 成年子代大鼠HPA轴活性改变结果如图1所示。与对照组相比，地塞米松处理子代在应激前血清ACTH无明显变化，但在应激后显著升高(P＜0.01，图1A,1B)。与对照组相比，地塞米松处理子代在应激前血清皮质酮无明显变化，但在应激后显著升高(P＜0.01，图1C,1D)。
[0056] 实验结果说明，地塞米松组血清HPA轴活性产物在应激后显著增加，即出现HPA轴高应激敏感性状态。
[0057] 4.2应激前、后子代抑郁样情绪变化
[0058] 成年子代大鼠抑郁样情绪改变结果如表1所示。应激前PW10时，与对照组相比，地塞米松组雄性子代垂直运动得分、周边运动距离、中央运动距离显著减少(P<0.05或P<0.01，表1)，但水平运动距离、粪便粒数等则无明显改变。与对照组相比，地塞米松组雌性子代水平运动得分、垂直运动得分、中央运动距离等显著降低(P<0.05或P<0.01，表1)，但粪便粒数及周边运动距离则无明显改变。应激后PW12时，与对照组相比，地塞米松组雄性和雌性子代大鼠水平运动得分、垂直运动得分、周边运动距离及中央运动距离均显著降低(P<0.05或P<0.01，表1)，而粪便粒数则无明显变化。
[0059] 实验结果说明，与对照组相比，地塞米松组PW10时，即出现了抑郁样情绪改变倾向，而在慢性应激后PW12时，则形成稳定的抑郁样情绪改变。
[0060] 表1：应激前、后旷场实验
[0061] 应激前旷场实验(mean±SD，n＝10)
[0062]
[0063] 应激后旷场实验(mean±SD，n＝10)
[0064]
[0065] 4.3应激前、后子代焦虑样情绪变化
[0066] 成年子代大鼠抑郁样情绪改变结果如表2所示。应激前PW10时，与对照组相比，地塞米松组雄性子代进入封闭臂的时间、进入中央次数、进入开放臂次数和进入封闭臂次数均显著增加(P<0.01，表2)，而进而开放臂的时间则无明显改变。与对照组相比，地塞米松组雌性子代进入封闭臂时间、进入中央次数、进入封闭臂次数近显著增加(P<0.01，表2)，但进入开放臂时间及进入开放臂次数均无明显改变。应激后PW12时，与对照组相比，地塞米松组雄性和雌性子代进入开放臂时间、进入封闭臂时间、进入中央次数、进入开放臂次数及进入封闭臂次数均显著增加(P<0.01，表2)。
[0067] 实验结果说明，应激前PW10时，与对照组相比，地塞米松组出现焦虑样情绪改变倾向，而在慢性应激后PW12时，则形成稳定的焦虑样情绪异常。
[0068] 表2：应激前后十字高架迷宫
[0069] 应激前十字高架迷宫(mean±SD，n＝10)
[0070]
[0071] 应激后十字高架迷宫(mean±SD，n＝10)
[0072]
[0073] 4.4应激前、后子代空间认知功能变化
[0074] 成年子代大鼠空间认知功能变化结果如表3所示。应激前PW10时，与对照组相比，地塞米松组雄性和雌性子代在隐蔽平台测试中的逃避潜伏期及运动距离均显著增加(P<0.01，表3)，在探索测试中目标象限时间及跨越平台次数均显著减少(P<0.05或P<0.01，表
3)。应激后PW12时，与对照组相比，地塞米松组雄性和雌性子代在隐蔽平台测试中的逃避潜伏期及运动距离均显著增加(P<0.01，表3)，在探索测试中目标象限时间及跨越平台次数均显著减少(P<0.01，表3)。
3)。应激后PW12时，与对照组相比，地塞米松组雄性和雌性子代在隐蔽平台测试中的逃避潜伏期及运动距离均显著增加(P<0.01，表3)，在探索测试中目标象限时间及跨越平台次数均显著减少(P<0.01，表3)。
[0075] 实验结果说明，与对照组相比，地塞米松组在应激前、后均出现了明显的空间认知功能损伤。
[0076] 表3：Morris水迷
[0077] 应激前：隐蔽平台测试(mean±SD，n＝10)
[0078]
[0079] 应激前：探索测试(mean±SD，n＝10)
[0080]
[0081] 应激后：隐蔽平台测试(mean±SD，n＝10)
[0082]
[0083] 应激后：探索测试(mean±SD，n＝10)
[0084]
[0085] 本发明方法通过孕9-20天给予0.1～2.0mg/kg地塞米松处理，出生后常规饲养子代至10周，并于10-12周给予冰水游泳慢性刺激，实验组出现HPA轴活性产物增加，且具有抑郁焦虑及认知障碍等人类躁郁症类似的典型特征，说明成功建立了胎源性躁郁症模型。本发明的造摸方法简单，模型中HPA轴活性产物、抑郁、焦虑以及空间认知功能等指标稳定性好，说明本发明造模方法稳定有效可靠，可重复性强。
[0086] 【实施例2】用本发明模型筛选胎源性代谢综合征的环境干扰物或药物[0087] 1、按照实施例1方法建立的胎源性躁郁症模型；
[0088] 2、将环境干扰物或药物施用于动物模型；
[0089] 3、观察候选的环境干扰物或药物对胎源性躁郁症的各种指标的影响情况，评价潜在的环境干扰物或治疗胎源性躁郁症的药物。
[0090] 综上，本发明的造模方法通过孕期地塞米松处理，出生后常规饲养子代至10周，在10-12周给予冰水游泳慢性刺激，实验组出现HPA轴异常激活，情绪出现焦虑抑郁样改变，且伴随有空间认知功能障碍的典型特征，是建立胎源性躁郁症的的有效方法，可用于指导孕期临床合理用药、探讨胎源性躁郁症作用机制靶标及筛选宫内环境干扰物及药物。
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