技术领域

本发明是关于铃蟾肽受体拮抗物对新适应症用的药物制造中的应用。也 关于利用铃蟾肽受体拮抗物进行诊断、治疗或预防的方法。

技术背景

两栖的四十肽铃蟾肽(BB)属于新一类的肽，在它们的C-端顺序中共享结 构均匀性(Dutta A.S.(1993)in  Small Peptides：Chemistry，Biology，&Clinical Studies，第2章，pp66-82，Elsevier)。

十肽神经介素B(NMB)、神经介素C(NMC)和27残基氨基酸，释放胃泌 激素的肽(GRP)是已被证明的三种哺乳类动物的类铃蟾肽的肽(Battey J.等人 (1991)， Trends Neurosa.14：524)。认为NMB和GRP通过作用于相应的优选 的NMB(BB1)受体和优选GRP(BP2)受体，可传递各种周边和中心传递的生物 作用(Lebacq Verheyden A.等人(1990) Handbook of Experimental Pharmacology 95(part II)：71)。国际专利申请WO 98/07718中描述了非肽铃蟾 肽受体拮抗物。

发明简要

现已发现描述于WO 98/07718中的化合物和相关的化合物可用于以下 疾病的诊断、预防和治疗，例如焦虑和恐慌紊乱症、肺动脉高压、肺修补和 肺发育失调、前列腺癌、胰腺癌、肝卟啉症、内脏疼痛、胃肠分泌紊乱、呕 吐或厌食。在国际专利申请WO 98/07718中所描述的在本发明中所使用的铃 蟾肽受体拮抗物，公开在本文中作为参考。

因此，本发明提供了一种利用铃蟾肽受体拮抗物可改善治疗的各种疾病 的预防或治疗方法，包括焦虑恐慌失调症、社会恐怖、肺动脉高压、肺修补 和肺发育失调症、前列腺癌、胰腺癌、肝卟啉症、内脏疼痛、胃肠分泌失调、 呕吐或厌食，炎症疼痛、神经病的疼痛、癌疼痛、手术后疼痛、三叉神经疼 痛、急性疱疹性和后疱疹性疼痛，所述方法包括对需要这种治疗的病人施用 有效量的式I的铃蟾肽受体拮抗物或其药学上可接受的盐。

其中：i为0或1，k为0或1，l为0，1，2，或3，m为0或1，n 为0，1或2，

Ar是苯基、吡啶基或嘧啶基，各为未取代的，或可由选自烷基、卤素、 烷氧基、乙酰基、硝基、氨基、-CH2NR10R11，氰基、-CF3，-NHCONH2，和 -CO2R12中的1～3个取代基取代的：

R1是氢或1～7个碳原子的直链、支链或环状烷基，

R8是氢或和有3～7个碳原子的R1形成的环，

R2是氢或1～8个碳原子的直链、支链，或环状烷基，它也可以含有1～ 2个氧或氮原子，

R9是氢或由3～7个碳原子与R2形成的环，它可含有氧或氮原子；或 者R2和R9可一起是羰基，

Ar1可以是单独选自Ar并也可包括吡啶基-N-氧化物、吲哚基、咪唑基， 和吡啶基，

R4、R5、R6和R7每一个都是单独地选自氢和低级烷基，R4也可与R5 形成2～3个原子的共价键，其可以包括氧或氮原子，

R3可单独地选自Ar，或者是氢、羟基、-NMe2，N-甲基-吡咯基、咪唑 基、N-甲基-咪唑基、四唑基、N-甲基-四唑基、噻唑基、-CONR13R14、烷 氧基， ，或

其中：p为0，1或2，Ar2是苯基或吡啶基，

R10，R11，R12，R13和R14各单独地选自氢或者1-7个碳原子的直链、支链 或环状烷基。

本发明还关于利用式I化合物制备一种通过上述铃蟾肽受体拮抗物而用 于可改善治疗的诊断、预防或治疗的疾病。

本发明还关于提供治疗哺乳动物肿瘤的方法，包括向哺乳动物施用一种 组合物，该组合物含有抑制肿瘤量的式I化合物，或者式I化合物和细胞毒 素剂的共轭物。

本发明进而提供一种对哺乳动物具有细胞表面铃蟾肽受体的组织的体 内诊断成象的方法，该方法包括向哺乳动物施用诊断成象量的本发明放射性 标记化合物，由于所说的化合物与有许多有这种受体细胞的组织的铃蟾肽受 体相结合，所以能进一步检测放射图像。尤其是本发明关于对哺乳动物诊断 哺乳动物肿瘤的存在方法，该方法包括向哺乳动物施用诊断成象量的式I化 合物，并可选择地检测具有许多有铃蟾肽受体的细胞的组织的图像。

本发明的再一个方面，是提供一种体外检测哺乳动物组织中的癌细胞的 方法，该方法包括将哺乳动物的组织样品，与体外诊断成象量的式I化合物 接触一定时间，并在足以使化合物与癌细胞结合的条件下，检测这种结合。

附图描述

图1示出化合物1(以10mg/kg，试验前1h腹膜注射)对放置在提高的正 迷宫上的大鼠行为的作用([A]：是开臂的％时间；[B]：进入开臂的％数；[C]： 开臂结束时间；Veh：载体)。

图2示出了通过大鼠在强光、生疏的条件下，化合物1对社会相互作用 所用时间的作用。

图3示出了通过大鼠在敞开田野试验的沙地中央时化合物1对所用时间 的作用(Veh：载体)。

图4示出了豚鼠幼畜中化合物1在隔离-诱导发声恐惧模式中的作用。

图5示出了豚鼠幼畜中在隔离-诱导发声恐惧模式中苯甲二氮(a)或氟 苯氧丙胺(b)的作用。

优选实施方案的详细描述

本发明中使用的化合物是上述式I的化合物。优选化合物是式II的化合 物。

其中：

Ar是未取代苯基，或由选自异丙基、卤素、硝基、和氰基中的1或2 个取代基取代的苯基，

R4、R5和R6是氢，

R7是甲基或氢，

R3是2-吡啶基或羟基，和

Ar1是吲哚基、吡啶基、吡啶基-N-氧化物或咪唑基。

另一种优选化合物是式I的化合物。

其中：Ar是未取代的苯基，

R1是环戊基或叔丁基，

R4和R5是氢，

R7是甲基，

R6是氢，

R3是具有2个异丙基取代基的苯基，未取代苯基，或式

Ar1是吲哚基。

另一种优选化合物是式I的化合物，

其中：Ar是2，6-二异丙基-苯基，4-硝基-苯基，和4-氰基-苯基，

R4、R5和R6是氢，

R7是甲基，

R2是氢或环己基，和

R3是羟基，吡啶基。 ，或

本发明中使用的化合物的烷基基团，除了专门指定的形式外，包括1-8 个碳原子的直链、支链，或环状碳链。代表性的基团是甲基、乙基、丙基、 异丙基、正-丙基、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、2-甲基己基、正- 戊基、1-甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丙基、正- 己基和其他。

本发明中所用化合物的低级烷基基团包括具有1-6个碳原子的基团。

本发明中所用化合物的环烷基基团是具有3-7个碳原子的基团。它们可 以用选自卤素、硝基、烷基、和烷氧基中的1-3个基团取代。

本发明中所用化合物的烷氧基团，除了另有说明外，包括1-6个碳原子 的直链和支链的两种碳链。代表性的基团是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异- 丙氧基、仲-丁氧基、和己氧基。

术语“卤素”是指氟、氯、溴、碘和砹，包括他们的放射性核素。

术语“Ar”是指包括取代的或未取代的苯基。取代基包括以下的一种 或多种取代基，诸如卤素、硝基、烷基、烷氧基、和其他基，如所说明的或 本技术人员所熟知的。

术语“胺”是游离氨基、烷基化胺、和酰化胺。

更优选的化合物是选自以下：

(S)N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲 基-丙酰胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-N-甲基 -丙酰胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-1-甲基-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)- 丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-2-甲基-3-(1-氧-吡啶-2-基)-N-(1-吡啶-2- 基-环己基甲基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-2-甲基-3-吡啶-2-基-N-(1-吡啶-2-基-环 己基甲基)-丙酰胺，

2-[3-(2-叔-丁基-苯基)-脲基]-N-环己基甲基-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙 酰胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二氯-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙酰 胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二甲氧-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙 酰胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二甲基氨基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲 基-丙酰胺，

(S)N-环己基甲基-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-2-[3-(4-硝基-苯基)-脲基]-丙 酰胺，

N-环己基甲基-2-[3-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2- 甲基-丙酰胺，

[S-(R*，R*)]3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-2-{3-[1-(4-硝基-苯基)-乙基]-脲基}- N-(1-吡啶-2-基-环己基甲基)-丙酰胺，

N-(2，2-二甲基-4-苯基-[1，3]二噁烷-5-基)-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-2-[3- (1-苯基-环戊基甲基)-脲基]-丙酰胺，

(S)-N-(2，6-二异丙基-苯基)-2-[3-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-脲基]-3-(1H- 吲哚-3-基)-丙酰胺，

(R)-N-(2，6-二异丙基-苯基)-2-[3-(2，2-二甲基-1-苯基-丙基)-脲基]-3-(1H- 吲哚-3-基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-N-(2，2-二甲基-4-苯基-[1，3]二噁烷-5- 基)-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙酰胺，

N-环己基-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙酰 胺，

N-(2-环己基-乙基)-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2- 甲基-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(3-甲基-丁 基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(3-苯基-丙 基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(1，2，3，4-四 氢-萘-1-基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(2-苯基-环 己基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-N-二氢化茚-1-基-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲 基-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-N-(1-羟基-环己基甲基)-3-(1H-吲哚-3- 基)-2-甲基-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(1-吡啶-2- 基-环己基甲基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(6，7，8，9-四 氢-5H-苯并环庚-5-基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-苯基-丙酰 胺，

N-(1-羟基-环己基甲基)-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-2-[3-(4-硝基-苯基)-脲 基]-丙酰胺，

2-[3-(4-氰基-苯基)-脲基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(1-吡啶-2-基-环己 基甲基)-丙酰胺，

(S)3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-2-[3-(4-硝基-苯基)-脲基]-N-(1-吡啶-2-基-环 己基甲基)-丙酰胺，

(S)3-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基-N-(1-吡啶-2-基-环己基甲基)-2-[3-(4-三氟甲 基-苯基)-脲基]-丙酰胺，

(S)4-(3-{2-(1H-吲哚-3-基)-1-甲基-1-[(1-吡啶-2-基-环己基甲基)-氨基甲 酰基]-乙基}-脲基)-苯甲酸乙基酯，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-3-(1H-咪唑-4-基)-N-(1-吡啶-2-基-环己 基甲基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-2-甲基-N-(1-吡啶-2-基-环己基甲基)-3- (2-三氟甲基-苯基)-丙酰胺，

2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-2-甲基-3-(2-硝基-苯基)-N-(1-吡啶-2-基- 环己基甲基)-丙酰胺，

(S)3-(1H-吲哚-3-基)-N-[1-(5-甲氧-吡啶-2-基)-环己基甲基]-2-甲基-2-[3- (4-硝基-苯基)-脲基]-丙酰胺，和

N-环己基甲基-2-[3-(2，6-二异丙基-苯基)-脲基]-2-甲基-3-吡啶-2-基-丙酰 胺。

以后，(S)3-(1H-吲哚-3-基)-N-[1-(5-甲氧-吡啶-2-基)-环己基甲基]-2-甲基 -2-[3-(4-硝基-苯基)-脲基]-丙酰胺也称作化合物1。

本发明中所用的化合物，在上述式I中，根据它们的结构，可具有多个 手性中心。尤其是本发明中使用的化合物可以以非对映体，非对映体的混合 物，或者以混合的或单独的光学对映体而存在。本发明认为可使用所有这些 形式的化合物。

本发明中使用的化合物包括式I化合物的溶剂化物、水合物、药物可接 受的盐，和多晶型物(不同晶格描述物)。

最适宜是形成盐，药物可接受的盐包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、 碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、乙酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、 柠檬酸盐、二氢氯化物、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫 酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰 对氨苯基胂酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明盐(hydrabamine)、氢溴化物、氢 氯化物、羟基萘酸盐、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹 果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基 硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐(4，4′-亚甲基双(3-羟基-2- 萘酸盐))，泛酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸 盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、q-氯茶碱、三 乙基碘盐、苄星、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、亚乙基二胺、葡甲胺、普 鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、和锌(也可参看“pharmaceutical salts”， Bergs S.M.等人(1997) J.P ham.Sci.66：1-19，本文中引入作参考)。

术语“病人”或“对象”是指哺乳动物，特别是指人类。

进行本发明的方法是通过向哺乳动物施用有效量的式I化合物，在化学 治疗适应症中，施用式I化合物与细胞毒素剂的共轭物，或其药物可接受的 盐以诊断、预防和治疗上述的任何疾病。这种有效量一般是每公斤对象体重 为约1-300mg。对于一个70kg的成年人，一般剂量为每天约1mg到5g。此 外，所用放射性标记化合物的剂量取决于放射性核素的比放射性。

本发明的再一个方面，是提供一种对上述所列适应症的治疗或预防用的 药物组合物，所述组合物含有式I的铃蟾肽受体拮抗物，至少与一种药物上 可接受的载体或赋形剂一起。为由本发明所用化合物制备药物组合物，惰性 的，药物上可接受的载体可以是固体也可以是液体。固体形式的制剂包括粉 末、片剂、分散性颗粒、胶囊、药包、子宫托和包括阴道栓的栓剂。固体载 体可以是能用作稀释剂、香剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、或片剂 崩解剂中的一种或多种物质，它也可以是一种密封材料。在粉末中，载体是 一种磨得很细的固体，并与很好磨碎的活性组分形成混合物。在片剂中，活 性组分以适当的比率与具有需要粘合性质的载体进行混合，并压制成所要形 状和大小。

为了制备阴道栓或栓剂，首先将低熔蜡，诸如脂肪酸甘油酯和可可脂的 混合物熔融，并例如通过搅拌使活性组成分散在其中。然后将熔融均匀的混 合物倒入适宜大小的模具中，并使其冷却和固化。软膏也是优选的药物组合 物，同样可以由本发明所用的化合物进行制备。

粉末和片剂优选含有5％～约70％的活性组分，适宜的载体是碳酸镁、 硬脂酸镁、滑石、乳糖、蔗糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、 羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂，等等。

术语“制剂”是包括将活性组分与作为载体的密封材料进行配制，提供 一种胶囊，其中活性组成(具有或不具有其他载体)由载体包围，因此载体与 它结合在一起，同样也能制备药包。

片剂、粉剂、药包和胶囊可以作为适于口服的固体剂形。

液体形式制剂包括溶液、悬浊液、和乳浊液。作为适于肠胃服用的液体 制剂的实例，可以提出活性化合物的无菌水或水-丙二醇溶液。液体制剂也可 以是在聚乙二醇水溶液中的溶液。口服的水溶液可通过将活性组分溶解在水 中而制备。如果需要，可添加适宜的色剂、香剂、稳定剂和增稠剂。通过将 磨细的活性组分与粘性材料如天然合成胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维 素钠、和药物配制技术中公知的其他悬浮剂一起分散在水中，可制成水悬浮 液。

优选的药物制剂是以单位剂量形式。这种形式中，将制剂分成含有适宜 量的活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是一种包装制剂，包装含有离 散量的制剂，例如，包装片剂、胶囊、和装在小瓶或安瓿瓶中的粉末。单位 剂量形式也可以是胶囊、药包、或片剂本身，或者可以是任意适宜数量的这 种包装形式。

正如已提到的，式I化合物可以用于诊断、预防和治疗各种状况的疾病， 关于这种应用的更详细情况提供如下。

1)焦虑、恐慌发作和社交恐怖症

焦虑症是一种常见的症状，苯并二氮杂是对此症的主要治疗剂。在美 国为此目的最常用的是氯二氮杂氧化物、苯甲二氮，去甲羟基安定、氯 羟去甲安定、环丙安定和三唑安定。然而，治焦虑症的苯并二氮杂也可引 起镇静状态，它们具有肌肉-松驰、镇静-催眠性和遗忘的副作用，它们也可 增强醇的作用，对它们的作用的偏差都可能发展，在长期频繁地使用后，一 旦停止使用就会导致焦虑反弹，长期使用苯并二氮杂，尤其是随着剂量的 增加，都会导致依赖性。因此，需要降低对焦虑治疗的这种依赖趋势。

最近发现，建议类铃蟾肽的肽在紧张和焦虑中会发挥作用(Plamondon H. 等人(1996) Soc.Neurosci.22：Abstract 181.13)：将用于GRP受体和NMB受体 的对mRNA抗过敏的寡核苷酸输注老鼠脑室(i.c.v)，超过2天通过受体自体 放射照相术测量，结果降低脑中铃蟾肽结合位点的密度。当与对照动物比较 时，用抗过敏的寡核苷酸处理的老鼠，在高位加迷宫的焦虑场(anxiogenic fields of an elevated plus maze)或在槽形隧道的卵形迷宫(trough-tunnel oval maze)的焦虑场上，明显消耗更多的时间。这就反映出处理的焦虑作用。通过 药物学方法证明本发明的化合物有用于治疗焦虑恐慌症，以下列举一些实 例。

动物和药剂服用

以6组圈养的雄性Hooded Lister大鼠(200-250g)或雄性TO小鼠(20- 25g)。以成对圈养称重280-380g的普通狨猴(callithrix jacchus)。所有的动物 都在12小时明/暗循环下，用食物和水随意圈养。

除了另有说明，一般都是在试验前40分钟，通过腹腔注射(i.p)或皮下注 射(s.c)给药药剂，对于大鼠和狨为1ml/kg的容积量，对于小鼠为10ml/kg的 容积量。

a)小鼠的明/暗箱试验

装置是一个顶部敞开的箱子，长45cm，宽27cm，和高27cm，由隔板 分成大(3/5)，小(2/5)区，隔板比四壁延高20cm(costall B.等人(1989)Pharmacol. Biochem.Behav.32：777-785)。沿地板水平，在隔板的中心处开有7.5×7.5cm 的开口。小的箱室涂成黑色，大的箱室涂成白色。白箱室用60W的钨灯照明， 用红光照明实验室，将每个小鼠通过放在白区的中心而进行试验，并使它习 惯新环境5分钟，测定在照明位点中度过的时间(Kilfoil T.等人 (1989) Neuropharmacol.28：901-905)。

b)鼠的高位X迷宫试验

方法A：标准的高位X迷宫(Handley S.L.等人(1984) Naunyn- Schiedeberg的 Arch.Pharmacol.327：1-5)，如Field等人(1991) Br.J. Pharmacol.102 Suppl：304P中所述是自动化的。将动物放在面向开臂之一的X 迷宫中心处。为了确定焦虑效应，在5分钟的试验期内，测定在开臂的进入 和在结束的一半所度过的时间(Costall等人(1989) Br.J.Phamacol.96 Suppl.：312P)。

结果：(图1)在试验前60分钟以10mg/kg剂量腹膜给药化合物1的鼠群 中，与只接收载体的鼠群比较，在迷宫开臂处度过时间的％显著增加，探查 开臂结束度过的时间量也明显增加。

c)狨猴的人恐吓试验

在2分钟的试验时间内，记录通过动物因恐吓刺激而出现的体态变化的 总数(人站在离狨猴箱约0.5m处，并凝视进狨猴的眼睛)。记录体态的变化是 凝视狭缝、尾部姿态，在箱内/高位处作气味标识，立毛，后退，和背部成拱 形状。每个动物在药物处理前和处理后的试验日期经受两次恐吓刺激。在首 次(控制)恐吓后，至少2小时，进行皮下药物处理。对每种化合物的预处理 时间是40分钟。用Dunnett′试验后的单向方差分析来分析两次记录间的不 同。

d)大鼠的冲突试验

在工作室内培训大鼠群压杆以获得食物。计划程序包括：交替进行如下 操作，通过打开室光而发信号，间隔30s变化，进行4次4分钟未惩罚周期， 和通过关闭室光而发信号以恒比5的三次3分钟处罚(通过伴随输送食物对脚 的冲击)。对每只鼠调整脚的冲击的程度，与未惩罚的应答相比，获得大约 80～90％的应答抑制，在培训的日期内鼠群接收含盐载体。

f)大鼠的社会相互作用试验

方法：社会相互作用活动场是环形的(直径70cm)，由白色有机玻璃制 成，壁高30cm。活动场通过位于活动场上方的强光源(350lux)直接照射。在 活动场的正上方还安装一台照相机，与相邻室内的视频记录仪连接，为以后 分析进行试验期间记录。

将大鼠按体重进行配对，以保证一对的成员重量差小于10g。在将鼠放 入活动场的前60分钟，对每对中的两个鼠进行载体(n＝10)或各种剂量试验化 合物(n＝10/组)的腹膜注射5分钟。由对药物处理不明的观察者记录在活跃的 社会调查(鼠对用鼻子闻，追踪和整理)中度过的时间。对于药物处理的，以 随意的顺序在10：00～14：00之间进行试验，在每次试验后要擦试整个活动 场。利用单向ANOVA分析数据，随后对各种差异进行Post-hoc Duncan′s试 验。

结果：(图2)以3.75和7.5mg/kg[F(2，27)＝7.2，p＜0.01]注射的化合物1 明显增加了大鼠的社会相互作用能力。就百分比增加而言，两种剂量是相近 的。对于运动活性没有作用，这就证明对于社会相互作用的能力的作用是有 选择的。

g)大鼠敞开场地的试验

方法：敞开活动场是环形的(直径70cm)，由白色有机玻璃制成，壁高 30cm。通过位于活动场的正上方的强光源(350lux)照射活动场。与相邻室的 视频记录仪连接的照相机也安装在活动场的正上方，为后来分析进行试验期 间记录。底板用线分成内环和外环。剂量给药后60分钟，将每个鼠放置在 活动场中心5分钟，并留下以进行探查。由对药物处理不明观察者记录在活 动场周边附近度过的时间，和在活动场内区度过的时间，当动物的4个爪都 在区域时，才认为在内活动场内，同样，当4个爪都在外环中时，才认为在 周边处。在内区域度过的时间，是以在内外区域内总时间的百分比表示，并 通过单向ANOVA分析，随后对各种差异进行Post-hoc Duncan′s试验。

结果：(图3)与对照动物比较，以3.75mg/kg进行腹膜注射化合物1的鼠， 在活动场的内区域中度过时间的百分比明显增加，这反应处理焦虑的作用。

h)隔离豚鼠幼畜导致焦虑的发音模式

动物的精神病模式通常用大鼠或小鼠作为试验动物。然而，就这一点 讲，豚鼠是最适合的实验动物，因为它们具有与人类相类似的中心5HT1D受 体，通过暂时隔离母体引起豚鼠发声是对影响行为的试验模式。还知道，在 这种豚鼠的焦虑模式中能够抑制隔离叫声的化合物是临床效应的征兆。

方法：以5分钟隔离时间定量测定豚鼠幼畜(2-14天龄)的悲痛叫声，在 这之后使他们与他们的母亲和小伙伴重新相聚。试验箱由白色内壁、白色照 明的声音减弱盒构成。借助于微型扩音器和DAT记录器，在DAT磁带上记 录发出的声音。在连续3天进行3次预试验后，首先利用最少发射500次声 响的标准选择幼畜。作为正控制，包括苯甲二氮杂和摄取5-羟色胺的抑制 剂氟苯氧丙胺。每只幼畜接受试验化合物(化合物1，1-30mg/kg，腹膜内(i.p.) 注射，在50％环糊精中、苯甲二氮0.1-1mg/kg，皮下注射(s.c.)在羟甲基 纤维素(CMC)中，或者氟苯氧丙胺1-10mg/kg，皮下注射，在水载体中)，并 在与母体隔离前，返回家笼30分钟。作为正控制，每天平行试验苯甲二氮 (1mg/kg)。对每组，通过一对t试验而进行，计算分析处理前和处理后所 发出叫声数的差异。使用Kruskall-Wallis试验分析叫声数减少的百分比，随 后在载体和不同剂量之间进行Mann-Whitney试验。

结果：在所有的研究剂量下，化合物1显著地减少了隔离引发的叫声。 在试验前30分钟，只注射化合物1，随着剂量(1-30mg/kg，i.p.)增加叫声减少 的百分比，以10mg/kg的MED(图4：以平均减少±SEM的百分比表示结果。 对载体组*P＜0.05，Kruskull-Wallis试验，随后Mann-Whitney试验)。这 种效果优于苯甲二氮所观察到的效果(MED＝1mg/kg；图5)。因为镇静作 用，所以研究中不包括这种化合物的较高剂量。氟苯氧丙胺以10mg/kg的最 低有效剂量(MED)也能明显降低叫声数(图5)。很明显抗焦虑和抗抑郁药物都 能减少由豚鼠发出的隔离叫声。铃蟾肽拮抗物化合物1如这些化合物一样有 效，表明这类化合物作为新型的抗焦虑/抗抑郁药剂存在一定潜力。

2)肺动脉高血压

Hurel S.J.等人(Lancet(1996)348：1243)指出GRP受体拮抗物注入到遭受 肺动脉高血压痛苦的病人中，随后就能减小肺收缩压力。本发明的化合物通 过标准药物方法证实可用于治疗肺动脉高血压症。

3)肺修补和肺发育的紊乱症

几种研究都强调GRP和GRP受体在肺损伤后的肺修补和在肺发育中的 作用(Spurzem J.R.等人(1997) Am J.Respir.Cell.Mol.Biol.16：209-211，WangD. 等人(1996) Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.14：409-416；Spindel E.R.，同上14：407- 408)。肺损伤包括因吸烟诱发而导致增加肺的类铃蟾肽的肽量。由Cutz E.等 人的发现( Pediatrics(1996)98：668-72)，提出母体吸烟可能使婴儿肺神经内分 泌细胞的增殖而使婴儿突然死亡的综合症(SIDS)(正如根据气管上皮对铃蟾 肽免疫反应的百分比所测定的)，并提出这些细胞的机能障碍可对SIDS的病 理生理学作出贡献。通过标准药物学方法证明本发明的化合物可用于治疗肺 修补和肺发育的紊乱症。

4)治疗癌症

本发明还关于治疗癌症的方法，它包括向病人或对象，特别是哺乳动 物，尤其是人类，施用有效量的式I化合物，最好是与细胞毒素剂共轭的式I 化合物。该方法特别适用于其肿瘤细胞具有细胞表面铃蟾肽受体的癌症，包 括某些前列腺癌或胰腺癌。

当使用直接标记的式I化合物于治疗目的时，最好使用卤素取代的Ar 作为放射性核素。用于治疗的卤素放射性核素最好是β-辐射或α-辐射的放 射性核素。对于治疗癌症的最佳的Ar卤素取代基包括131I、211At、76Br和 77Br，131I尤其好。

Ar由放射性核素卤素取代的式I化合物，通过相应非放射性化合物的亲 电子芳香取代而易于制备，其中Ar由卤素或活性基团取代。这种卤素优选 是Br或I，最好的活性基团包括三丁基锡、三甲基甲硅烷、叔-丁基二甲基 甲硅烷，等。

式I化合物与细胞毒素剂的共轭物，特别优选是当式I化合物中R3是羟 基或氨基。在这种情况下，本发明的化合物可方便地通过二官能部分，如谷 氨酸等，与细胞毒素剂连接，形成共轭物。适宜的细胞毒素剂，包括如阿霉 素(doxorubicin)、抗癌化学治疗的化合物，如Merck Index，第12版，1996， P，MISC-10中描述的。

本发明还提出使用式I化合物与放射性核素的共轭物，用于放射性治疗 法的优选放射性核素发射α或β粒子，包括188Re，131I，221At，212pb，212Bi，76Br， 77Br等等(例如， The Merck Index，第12版，1996，page MISC-93)。使用通 常方法可制备所说的共轭物。例如，可利用二官能的螯合剂，如三琥珀 (trisucein)(Safavy A.等人(1993) Bioconj.Chem.4：194-8)，根据SafavyA.等人在 Cancer(1997)80(Suppl)：2354-9中采用的方法，使放射性核素，如188Re，与 式I化合物连接。共轭物可采用其在进入肿瘤细胞内时破裂而释放出细胞毒 素剂的化合物形式，化合物在体内迅速转化，以产生上式的母体化合物，例 如，通过在进入靶细胞内时进行水解，这种化合物最为理想。

本发明治疗哺乳动物肿瘤的方法包括对哺乳动物施加抑制肿瘤量的本 发明的至少一种化合物的组合物。这种抑制肿瘤的量是对象化合物中至少一 种的量，该量足以使化合物定位于肿瘤处，以减小肿瘤的生长或大小。该剂 量为0.1～500mmol/kg体重。优选剂量为5～50mmol/kg体重。

根据放射性核素的型式可变化放射性计量。然而，考虑到放射性量时， 可使用从1毫居(mCi)到约800mCi。优选可使用10～600mCi。然而，当考 虑剂量时，放射性化合物的比放射性应考虑到。这种比放射性最好是很高 的，例如对123I-标记的化合物，比放射性至少为约1000～约50000Ci/mM。 对123I-标记的化合物的比放射性，优选为约10000～约22000Ci/mM。

a)前列腺癌

铃蟾肽在人类的前列腺癌细胞中，通过GRP受体专门诱发起细胞内的 钙流动(Aprikian A.G.et al.(1996) J.Mol.Endocrinol16：297～306)。这就提出 了神经肽的铃蟾肽族在前列腺癌的生物学中起到调节作用。使用抗体提高抗 铃蟾肽抑制前列腺癌细胞系的生长(Hoosein N.M.(1993) Cancer Bull.45：436- 411)。通过标准药物学方法证明，本发明的化合物可用于前列腺癌的诊断和 治疗。

b)胰腺癌

正常的和肿瘤的胰腺细胞含有特殊的GRP受体，它在恶性胰腺组织表 达更多(Hajri A.et al.(1996) Dancreas 12：25～35)。类铃蟾肽的肽可刺激人类 胰腺癌细胞的增殖(Wang Q.J.等人 Int.J.Caneer(1996)68：528-34)。因此，可以 使用铃蟾肽受体拮抗物治疗胰腺癌。而且，可以使用放射性标记的铃蟾肽受 体拮抗物治疗胰腺癌。通过标准药物学方法证明，本发明的化合物可用于治 疗胰腺癌。

5)肝的卟啉症

肝卟啉症的主要临床表现是神经性症状，包括腹部疼痛、神经病和精神 干扰。认为在疾病急性期间，系统循环中，通过一些肠胃的和神经传递质的 聚肽，包括GRP的增加，引起神经性症状(Medenica R.等人(1997) Cell mol. Biol.43：9-27)。因此，用铃蟾肽受体拮抗物治疗可降低这些结合到铃蟾肽受 体的聚肽的作用，并减轻急性卟啉症的症状。通过标准的药物学方法证明， 本发明的化合物可用于肝卟啉症的治疗。

6)内脏疼痛

通过以如下药物学方法证明，本发明中使用的化合物适用于内脏疼痛。

刺激大鼠的结肠

在麻醉下，对大鼠进行气管造口术，对颈动脉作套管插入术，以监测血 压。内结肠注射0.6％乙酸后45分钟，进行结肠膨胀(75mmHg，30s)。通过 测量这些结肠膨胀后的血压降低证明结肠疼痛。然后皮下注射试验化合物， 30分钟后，再进行6次结肠膨胀。通过在预处理周期间和事后处理期间血压 降低的比较，计算抗伤害性的百分比。使用这种方法，化合物1，以10mg/kg 产生57％的抗伤害性。

7)肠胃的分泌干扰

已经证明GRP在检测肠胃分泌功能的干扰是一个很有价值的工具，包 括那些与十二指肠溃疡有关的疾病和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染 (McColl K.E.等人(1995) Aliment.Pharmacol.Ther.9：341-7)。结果是放射性标记 的铃蟾肽受体拮抗物可用于诊断这些病症。其他的肠胃功能，像胆囊收缩、 胰腺分泌，和胃-食道的活动性可由GRP调节控制，并且，放射性标记的铃 蟾肽受体拮抗物可用于诊断这些病症。通过标准的药物学方法证明本发明的 化合物可用于肠胃分泌干扰的治疗。

8)呕吐

铃蟾肽在青蛙皮肤内以高浓度存在。作为保护反应的一部分，当捕食者 吞下时，两栖动物会分泌催促物质，在哺乳动物中，铃蟾肽是广泛地分布在 GI道内，在那里它可引起胃活动性和分泌的变化。本发明的铃蟾肽受体拮抗 物可降低恶心呕吐，并因此，在治疗呕吐是有效的，尤其是对服用抗癌剂的 病人更有效。可以使用以下的药物学方法证明本发明化合物在治疗呕吐的功 效。

顺铂(cisplatin)诱发白鼬呕吐的拮抗作用

作为与对照动物比较，利用以下方法，通过体内顺铂(cisplatin)诱发白鼬 呕吐，证明本发明中所用化合物的止吐特性。使用静脉注射顺铂(30mg/kg)。 在注射顺铂前30分钟，再在注射催吐剂后45分钟，一般通过非肠胃道注射 研究的化合物。随着给药催吐物质，在5小时期间，连续观察各个笼中的白 鼬。在观察期间记录每只动物恶心呕吐的发作次数，对每个处理组的结果以 平均±S.E.M表示。利用单向差异分析(ANOVA)评估，用本发明化合物处理 和用载体(PEG200，0.5ml/kg)处理之间存在的差异显著，随后进行Student的 t-试验。

9)厌食症

铃蟾肽引起小鼠摄取葡萄糖的降低。在缺乏GRP受体的小鼠中，铃蟾 肽不再显示这种作用(Hampton L.等人 Proc.Natl.Acad.Soi.USA.95：3188-92， 1998)。本发明使用的铃蟾肽受体拮抗物可增加进食行为，因此，在治疗厌食 症中有效，诸如癌症病人的厌食症。当与对比动物比较，通过测量小鼠的食 物摄取和体重增加，证明体内施用本发明所用化合物的开胃作用。

10)疼痛

通过以下药物学方法证明本发明化合物在治疗疼痛中的应用。

a)鹿角菜胶诱发大鼠的痛觉过敏和异常性疼痛

将鹿角菜胶(20mg/ml的100μl)给药到后爪的足底面中，测量对外部热和 机械刺激的痛觉过敏和异常性疼痛。

b)外科疼痛的卵巢子宫切除术后的模式

在手术期间通过鼻锥保持用异荧烷(为诱导作用用5％，为保持麻醉用2 ％)和1∶4O2/NO2的混合物以麻醉雌大鼠。在手术期间将动物放在恒温毯上。 在finea alba中，通过中线腹部切口(2cm长)进行卵巢子宫切除术。用5.0丝 线使用单夹具技术将卵巢韧带和子宫颈进行缝合。在腹壁上作4个简单的中 断缝合(5.0丝)。用4个伤口夹封闭皮肤，用局部抗菌素处理伤口。

为内脏伤害的症状，对动物进行手术后的试验，手术后，立刻将动物放 在单独的有机玻璃笼内，并以30分钟一批记录腹部姿势。记录的姿势是弓 背的位置，与后肢向内移动有关的腹部肌肉的收缩，身体的拉伸，和较低腹 部对地板的挤压。对于有关在后爪的病觉过敏和异常性疼痛的症状，动物也 可试验。

c)糖尿病引发的神经性疼痛模式

如早期所述的，使用单一的腹膜注射链脲霉素(50mg/kg)诱发大鼠(250- 300g)产生糖尿病(Courteix等人，1993， Pain 53：81-88)。对照动物接受类似 的等渗盐水注射。

d)神经性疼痛的缓慢压缩伤害模式

由Bennett和Xie，在 Pain 33：87-107(1988)中早期描述，诱发缓慢压缩 伤害(CCI)。简单说，用戊巴比妥钠60mg/kg腹膜注射麻醉大鼠。通过biceps femoris，使用钝器解剖法使左侧坐骨神经暴露在大腿股中间水平，并接近坐 骨的三叉一侧，宽松地扎结4个结扎(4.0编织的丝线)，以相距1mm间隙松 松地环绕它而结扎，然后将肌肉以层状封闭。可按几种方法测量疼痛阈值。

1)热痛觉过敏

在给药前和后的不同的时间点，对大鼠使用Vgo Basile足底试验，接着 以Hargreaves等人(1998) Pain 32：77-78的改进方法评估热痛觉过敏。使动物 习惯于在高位玻璃台上由3个单独的有机玻璃盒构成的装置。在台子下面设 置可移动的热辐射源，并集中在所要求的爪上。记录爪子收回的等待时间。 有一个从22.5s到防止组织损伤的自动切断点。

2)静态异常性疼痛

使用Semmes-Weinstein Von Frey毛发测量机械过敏性。将动物放进底部 为线网的笼中，使接近它们的爪子的底部，在开始实验前使它们熟习该环 境。通过使动物的右后爪的趾面，按照力的增长顺序(0.7，1.2，1.5，2，3.6，5.5， 8.5，11.8，15.1和29g)，与Von Frey毛发接触达6s。一旦确立缩回应答，下 一个降下的Von Frey毛发开始，对爪子再次试验，直到没有应答发生为止。 以最高29g的力提起爪子，以及诱发应答，由此，表示切断点。记录诱发应 答所需要的最低力(以g计)作为爪子缩回的阈值(PWT)。

11)诊断症状

本发明提供一种用于具有细胞表面铃蟾肽受体的哺乳动物组织的体内 诊断成象的方法，包括向哺乳动物给药一种诊断成象量的本发明化合物，并 检测具有许多有铃蟾肽受体细胞的组织的成象。尤其是本发明提供用于检测 某些类型的癌症，例如前列腺癌和胰腺癌的方法。

本发明所用的化合物结合到细胞表面铃蟾肽受体上并对上述癌细胞和 对具有铃蟾肽受体的细胞，呈现强烈的细胞特异性和亲合性。在一个实施方 案中，本发明是指用于检测哺乳动物肿瘤的方法，包括向哺乳动物施用诊断 成象量的上述式I化合物，并观测在哺乳动物组织中的化合物的滞留量。本 发明还提供一种用于诊断癌症的方法，使用标记的，优选使用适于成象的放 射性核素标记的式I铃蟾肽受体拮抗物。由Michelot J.M.等人(1991)在 J.Nucl. Med.32：1573-80中描述了适于成象的放射性核素实例。用于诊断成象的优选 放射性核素不发射像α、β一类的粒子。当用于诊断成象时，可使用Ar的 卤素取代基作为放射性核素。而且，所述卤素放射性核素基团，优选用于诊 断成象的基团，主要是放射γ的放射性核素，它可使用放射性成象方法，例 如通过闪烁扫描成象术，而进行检测。这种放射γ的放射性核素发出的射 线，足以通过组织穿透要检测的。用于诊断成象的Ar基团的优选的卤素取 代基，包括123I，124I，125I，131I，18F，76Br和77Br。用于诊断成象的更好的基团包 括123I，125I和18F，123I特别优选用于诊断成象。

本发明的化合物一般在一些癌细胞类型上，结合到特异的细胞受体上， 这种癌细胞包括胰腺癌、前列腺癌和有关的细胞。本化合物结合的细胞受体 实例是细胞表面的铃蟾肽受体。在受体结合的检测中，已证明本发明中所用 化合物的结合特性，正如WO 98/07718中所描述的。

根据本发明，体内检测哺乳动物肿瘤或含有细胞表面铃蟾肽受体的方 法，包括向哺乳动物施加一种含有诊断成象量的至少一种本发明化合物的组 合物。这种诊断成象量是至少一种目的化合物的剂量，它可使化合物足以定 位于肿瘤或组织，以能检测肿瘤或组织。这种剂量为每升化合物1μg～1g， 它给药剂量为1ng～10μg/kg体重。对于诊断成象，本发明化合物的优选剂 量为约10ng～约2μg/kg。而且，对于诊断成象，应当考虑施用的放射性剂 量，优选施用约0.1mCi～约20mCi的放射性化合物。

正如本文中所描述的，使用放射性探测器，例如γ-放射性探测器可检测 以一种或多种本发明化合物标记的肿瘤或组织。一种这样的方法是使用闪烁 照相法。也可以利用X线体层照相术，例如单光子发射计算的X线体层照相 术(SPECT)或正电子发射X线体层照相术(PET)，以改进显像。

在另一种实施方案中，本发明提供了一种用于哺乳动物组织样品的癌细 胞的体外检测方法，包括将哺乳动物的组织样品与体外诊断成像量的式I或 式II中任一种化合物接触一段时间，在足以使化合物结合到癌细胞上的细胞 表面铃蟾肽受体，并检测这种结合。通过技术人员已知的方法收集样品，例 如收集组织的活体解剖或体液。例如样品可用切片刀进行切片，以易于用显 微镜检查并观测结合的化合物。样品也可用适宜的固定剂固定住，在培育之 前或之后，用一种本发明的化合物以改进样品组织的组织质量。足以使化合 物结合到癌细胞上细胞表面铃蟾肽受体的条件包括标准的组织培养条件， 即，样品可体外培养并在生理介质中用一种本发明的化合物培育。这种条件 对技术人员是公知的。另一种方法是样品可固定，然后在等渗或生理缓冲液 中，用本发明的化合物进行培育。至少一种用于体外检测癌细胞量的，本发 明化合物的量为1ng/l～1000μg/l。优选量为1μg/l～100μg/l。

当本发明的化合物用于体外诊断癌症时，可使用Ar的取代基作为放射 性核素。对于体外诊断癌症的优选的取代基放射性核素，包括125I，18F， -14COOH，-14CH3，3H等。对于结合一种本发明化合物的细胞的检测，可在所 选择化合物的存在下培育样品，然后洗涤，并用标准的闪烁计数器进行计 数。另一种方法是将样品浸渍在照相乳剂中，几天后，在光学显微镜下进行 信号检测，如曝光的银粒子。