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用分离的分枝杆菌治疗 创伤后应激障碍

阅读：967发布：2020-05-13

专利汇可以提供用分离的分枝杆菌治疗创伤后应激障碍专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及创伤后应激障碍 (PTSD)的治疗或预防。具体而言，本发明涉及分离的分枝杆菌，其应用于预防PTSD和与所述PTSD相关的症状。还提供了通过给予治疗有效量的分离的分枝杆菌来改善对象的恢复力的方法。，下面是用分离的分枝杆菌治疗创伤后应激障碍专利的具体信息内容。

权利要求

1.分离的分枝杆菌(Mycobacterium)，其应用于预防创伤后应激障碍(PTSD)和与所述创伤后应激障碍相关的症状。
2.权利要求1所述应用的分枝杆菌，其包括全细胞分枝杆菌。
3.权利要求1或2所述应用的分枝杆菌，其包括非病原性热灭活的分枝杆菌。
4.权利要求3所述应用的分枝杆菌，其中所述非病原性热灭活的分枝杆菌选自：母牛分枝杆菌(M.vaccae)、奥布分枝杆菌(M.obuense)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、金色分枝杆菌(M.aurum)、M.indicus pranii，以及以上细菌的组合。
5.权利要求4所述应用的分枝杆菌，其为母牛分枝杆菌或奥布分枝杆菌。
6.权利要求1-5中任一项所述应用的分枝杆菌，其为粗糙型变体。
7.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其为任选地包含佐剂的疫苗组合物形式。
8.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其中将所述分枝杆菌给予至军事人员。
9.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌被以重复剂量给药。
10.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌以单位剂量提供，
7 9
所述单位剂量包含10-10个细胞的有效量的非病原性热灭活的分枝杆菌。
11.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌被用于通过肠胃外、经口、舌下、经鼻或经肺途径给药。
12.权利要求11所述应用的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌被用于通过经口途径给药。
13.权利要求11所述应用的分枝杆菌，其中所述肠胃外途径选自：皮下、皮内、真皮下、腹膜内、静脉内或囊内注射。
14.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其预防创伤后应激障碍的至少一种病征或症状，其中所述病征或症状选自：异常的或焦虑的行为、疼痛知觉和疼痛耐受问题、头痛、入睡或保持睡眠困难、表达创伤方面的重复演示、缺乏可辨认内容的噩梦，以及创伤特异性的重演。
15.前述权利要求中任一项所述应用的分枝杆菌，其预防创伤后应激障碍的至少一类症候群，其中所述症候群选自：重复体验/入侵、逃避/麻木和觉醒过度。
16.分离的分枝杆菌，其应用于向对象给药以防止在暴露于创伤事件后所述对象的IL-6水平出现上升。
17.权利要求16所述的分离的分枝杆菌，其中所述创伤事件选自：军事战斗、恐怖事件、身体攻击、性侵犯、机动车事故和自然灾害。
18.权利要求15或16所述应用的分枝杆菌，其中所述对象为雇佣军人。

说明书全文

用分离的分枝杆菌治疗 创伤后应激障碍

技术领域

[0001] 本发明涉及创伤后应激障碍(PTSD)的预防。具体而言，本发明涉及分离的分枝杆菌(Mycobacterium)，其被用于预防PTSD和与所述PTSD相关的症状。还提供了通过给予治疗有效量的分离的分枝杆菌来改善对象的恢复力的方法。

[0002] 发明背景

[0003] 焦虑症是最长出现的精神病病症，并造成了巨大的经济负担。除了广泛性焦虑症，它们还包括创伤后应激障碍(PTSD)、恐慌症、强迫症和社交及其他恐慌症。

[0004] PTSD可为急性的和慢性的，一些研究显示总人口中1.3％-7.8％的终身患病率。PTSD影响约770万美国成人，但其可发生于任何年龄，包括童年期。女性相比男性更可能发展PTSD，并且一些证据表明该病症可能易于在家族中流行。PTSD常常伴随有抑郁、物质滥用或者一种或多种其他焦虑症。PTSD通常发生于心理上让人痛苦的创伤事件之后。这些事件可包括，例如军事战斗、恐怖事件、身体攻击、性侵犯、机动车事故和自然灾害。对事件的反应可包括强烈的害怕、无助或惊恐。大多数人随时间推移可从创伤事件恢复，并回复至正常生活。相反，在PTSD患者中，症状会持续并可随时间推移而恶化，从而不能回复至正常生活。PTSD研究已报导了免疫系统中增加的炎症活性的证据，包括处于基线和抗原刺激后的较高水平的炎性细胞因子。这些较高水平的炎症活性已与HPA轴异常以及血清素激活的和去甲肾上腺素激活的代谢改变相关联。已表明慢性激活的炎症反应能对许多身体系统造成不良反应。具体而言，白介素-6(IL-6)的上升已与慢性疼痛、关节炎、糖尿病、心血管疾病和与PTSD相关的其他医学病况的报导相关联。的确，已表明患慢性PTSD的患者具有明显更高水平的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1，但是在一些情况下，具有较低的C-反应性蛋白和较低的可溶性CD-40。

[0005] 当前认为心理疗法是PTSD治疗的主要部分。方法包括认知行为治疗、暴露治疗和眼动脱敏及再处理。药物可增加心理治疗的功效。选择性羟色胺再吸收抑制剂(SSRI)，如舍曲林和帕罗西汀是美国食品和药物管理局批准的用于治疗PTSD的仅有药物。许多不期望的副作用与SSRI使用相关。这包括以下担忧：药物相互作用、胃肠副作用、性别副作用、自杀意念、急性产生焦虑的效应和缓慢发生作用。一些三环抗抑郁药(TCA)和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)似乎具有一些效用，但由于副作用的高发生率而患者耐受性较低。MAOI具有饮食限制要求，且与高血压事件有关。TCA具有抗胆碱能副作用和心血管副作用。在小规模安慰剂对照研究中，拉莫三嗪(一种钠通道封阻剂)在治疗PTSD中具有一些效力。

[0006] 需要开发安全和有效的、针对PTSD的治疗或预防性治疗。

[0007] 发明概述

[0008] 在本发明的第一个方面，提供了用于预防PTSD和与所述PTSD相关的症状的分离的分枝杆菌。

[0009] 在本发明的第二个方面，提供了用于向对象给药的分离的分枝杆菌，以防止对象的炎症标志物(包括例如IL-6)水平在暴露于创伤事件后升高，或防止血清素激活的和去甲肾上腺素激活的新陈代谢改变。

[0010] 本发明通过提供安全、更好耐受和有效的用于预防PTSD的方法，克服了现有技术的缺陷。令人吃惊地，本发明引起平衡的免疫调节增强效应，而且不适炎症反应降低。该多方面的作用特性不能通过干预单个通路实现，并因此相比现有技术引起更可控和有效的反应。附图说明

[0011] 参照以下附图描述了本发明，其中：

[0012] 图1显示了在群体(colony)关养期间，以母牛分枝杆菌(M.vaccae)处理对前瞻性行为和总优势指数的影响。

[0013] 图2显示在SPAT测试中，以母牛分枝杆菌处理防止了CSC诱导的社交偏好的缺乏。图3显示在EPM测试中，以母牛分枝杆菌处理具有抗焦虑特性。

[0014] 图4显示了母牛分枝杆菌预免疫对CSC诱导的DSS诱导结肠炎的恶化的影响。

[0015] 图5显示了预免疫对CSC关养造成的组织损伤的影响，以及对炎症和调节细胞因子的比率的影响。

[0016] 发明详述

[0017] 本发明使用分枝杆菌治疗或预防PTSD。

[0018] 如本文所用，术语“患者”和/或“对象”可互换使用。为了避免歧义，本发明旨在优选用于人，然而非人的脊椎动物(兽用)也可接受治疗或预防性治疗。例如，马和狗常常被用于军事或警察行动以及其他情况，如在赛马场上，其中它们可能会被暴露于创伤性情况。因此，本发明的治疗可用于恢复这类动物的表现。

[0019] 如本文所用，术语“预防”是指任何方式，其中疾病或病症的至少一种病征(sign)、症状或症候群被有利地改变，以防止或延迟疾病或病症的发作、阻碍疾病或病症的进展、防止疾病或病症的复发，或者改善疾病或病症的症状或相关症状。例如，关于PTSD，在一些实施方案中，预防病症可防止PTSD的至少一种病征、症状和症候群的发生。

[0020] 本发明还涉及对象的PTSD或者PTSD的一种或多种症状的治疗。对于PTSD或者PTSD病症的一种或多种症状，治疗可阻碍其进展，防止其复发或进行改善。

[0021] 如本文所用，短语“诊断为创伤后应激障碍(PTSD)”是指具有指示PTSD(一种由创伤事件引起的精神病症)的病征、症状或症候群。这类创伤性事件的非限制性实例包括：军事战斗、恐怖事件、身体攻击、性侵犯、机动车事故和自然灾害。

[0022] 针对心理健康专业人士并列出了精神障碍类别和标准的手册——精神障碍诊断和统计手册-第IV版修订版(DSM-IV-TR)，将PTSD归类为焦虑性病症。根据DSM-IV-TR，在以下情况下可作出PTSD诊断：

[0023] (1)患者经历了、目击了或遭受了涉及真实死亡或或死亡威胁或重伤，或者对自身或他人身体完整性的威胁，以及涉及强烈的害怕、无助或恐惧反应的一个或多个事件；(2)由于创伤事件，患者经历了至少1次重复体验/侵入症状、3次逃避/麻木症状和2次觉醒过度症状，并且症状的持续时间超过1个月；以及(3)所述症状造成了临床上显著的苦恼或社交、职场或其他重要功能区域的损伤。

[0024] 在某些实施方案中，如果患者的病症符合DSM-IV-TR标准，该患者即被诊断为患有PTSD。在某些实施方案中，如果患者具有PTSD的至少一种病征、症状或症候群，该患者即被诊断为患有该病症。在某些实施方案中，使用了量表(scale)来测量PTSD的病征、症状或症候群，并且基于使用该量表的测量来诊断该病症。在某些实施方案中，基于量表的“分数”被用于诊断或评估PTSD的病征、症状或症候群。在某些实施方案中，“分数”可度量PTSD的病征、症状或症候群的频率、强度或严重性中的至少一种。

[0025] 如本文所用，术语“症状(symptom/symptoms)”是指定征病症的主观性标志(indications)。PTSD的症状可涉及，例如，但不限于：创伤记忆再现和侵入、创伤事件的再现和让人痛苦的梦、表现得或感觉就像创伤性事件在再现、在暴露于创伤提醒物时感到痛苦、在暴露于创伤提醒物时出现生理反应、努力避免与创伤有关的想法或感觉、努力避开活动或情景、不能回想起创伤或创伤方面、对重要活动的兴趣明显减少、脱离的感觉或与其他人疏远、影响范围有限、感觉未来缩短、社交焦虑、对不熟悉的环境焦虑、难以入睡或保持睡眠、易怒或突然发怒、难以集中精神、觉醒过度、有痛知觉、耐痛力问题和夸张的吃惊反应。在某些实施方案中，潜在的威胁刺激可造成觉醒过度或焦虑。在某些实施方案中，生理反应体现为以下的至少一种：异常呼吸、异常心律、异常血压、特定感觉的功能异常和感觉器官的功能异常。在某些实施方案中，可发生其特征为感觉或感觉表现的范围或强度减少或受限的影响范围受限，并且感觉未来缩短可体现在认为其不会拥有事业、婚姻、小孩或正常寿命。在某些实施方案中，儿童和青少年可能具有PTSD症状，诸如但不限于：异常的(disorganized)或焦虑的行为、表达创伤方面的重复演示、缺少可识别的内容的噩梦，以及创伤特异性的重演。在某些实施方案中，症状可为回忆相关的压力。

[0026] 如本文所用，术语“症候群”是指一系列病征、症状或一系列病征和症状，其被归类在一起是因为它们彼此之间的联系或它们同时发生。例如，在某些实施方案中，PTSD特征为3类症候群：重复体验/侵入、逃避/麻木和觉醒过度。

[0027] 如本文所用，术语“重复体验/侵入”是指以下的至少一种：创伤回忆的再现和侵入、创伤事件的再现和让人痛苦的梦、表现得或感觉就像创伤事件在再现、在暴露于创伤提醒物时感到痛苦，以及在暴露于创伤事件提醒物时出现生理反应。在某些实施方案中，所述生理反应体现为以下的至少一种：异常呼吸、异常心律、异常血压、特定感觉的功能异常和感觉器官的功能异常。

[0028] 如本文所用，术语“逃避/麻木”是指以下中的至少一种：试图逃避与创伤相关的想法或感觉、试图逃避活动或情景、不能回想创伤或创伤方面、对重要活动的兴趣明显减少、脱离的感觉或与其他人疏远、影响范围有限和感觉未来缩短。可发生影响范围的受限，其特征在于感觉或感觉表现的范围或强度减少或受限。感觉未来缩短可体现在认为其不会拥有事业、婚姻、小孩或正常寿命。逃避/麻木也可体现在社交焦虑和对不熟悉的环境焦虑。

[0029] 如本文所用，术语“觉醒过度”是指以下中的至少一种：难以入睡或保持睡眠、易怒或突然发怒、难以集中精神、高度警惕和夸张的吃惊反应。潜在威胁的刺激可造成觉醒过度或焦虑。

[0030] 如本文所用，术语“显著地”是指太过紧密相关而不能将其归因于几率的一组观察或事件。例如，在某些实施方案中，“显著改变”、“显著降低”和“显著增加”是指不可能将其归因于几率的改变或影响。在某些实施方案中，可将统计方法用于确定是否能够将观察称为“显著”变化、降低、增加或改变。

[0031] 诊断为患有PTSD的患者可能感觉“警惕”、不安和强烈不安。抑郁、焦虑、惊恐发作和躁郁症常常与PTSD有关。酒精和药物滥用也很常见。在某些实施方案中，与PTSD并发的病症可包括，例如但不限于：抑郁、酒精和药物滥用。

[0032] 如本文所用，短语“改善恢复力”是指增加患者经历创伤事件而不遭受PTSD或具有较少的事后症候或破坏日常生活的正常活动的能力。在某些实施方案中，改善恢复力可减少PTSD的至少一种病征、症状或症候群。

[0033] 在某些实施方案中，重复体验/侵入包括以下中的至少一种：创伤回忆的再现和侵入、创伤事件的再现和令人痛苦的梦、表现得或感觉就像创伤事件在再现、在暴露于创伤提醒物时感到痛苦和在暴露于创伤事件时出现生理反应。

[0034] 在某些实施方案中，生理反应包括以下中的至少一种：异常呼吸、异常心律、异常血压、至少一种特定感觉的功能异常和至少一种感觉器官的功能异常。

[0035] 在某些实施方案中，所述至少一种特定的感觉选自：看、听、摸、闻、尝和感觉。在某些实施方案中，所述至少一种感觉器官选自：眼睛、耳朵、皮肤、鼻子、舌头和咽。

[0036] 在某些实施方案中，所述逃避/麻木包括以下中的至少一种：试图逃避与创伤相关的想法或感觉、试图逃避活动或情景、不能回想起创伤或创伤方面、对重要活动的兴趣明显减少、脱离的感觉或与其他人疏远、影响范围受限、感觉未来缩短、社交焦虑和与不熟悉的环境相关的焦虑。

[0037] 在某些实施方案中，所述觉醒过度包括以下中的至少一种：难以入睡或保持睡眠、易怒或突然发怒、难以集中精神、高度警惕、夸张的吃惊反应和来自潜在的威胁性刺激的焦虑。

[0038] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌不降低患者恰当地和迅速地响应潜在的威胁性刺激的身体能力。

[0039] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌通过降低与回忆和做梦相关的压力来降低保持睡眠的难度。

[0040] 在某些实施方案中，所述患者为儿童或青少年。

[0041] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌预防患者的PTSD的至少一种病征或症状，其中所述病征或症状选自：异常的或焦虑的行为、疼痛感知和疼痛耐受力问题、头痛、入睡或保持睡眠困难、表达创伤方面的重复演示、缺少可识别的内容的噩梦和创伤特异性的重演。

[0042] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌减少与PTSD并发的至少一种病症的发生，所述病症选自：患者的药物滥用、酒精滥用和抑郁。

[0043] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌在创伤事件之前或之后即刻被给予至患者。

[0044] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌减少按下述中至少一种进行诊断或评估的PTSD的至少一种病征、症状或症候群的发生：临床医生专用PTSD量表(CAPS)、临床医生专用PTSD量表第2部分(CAPS-2)、针对儿童和青少年的临床医生专用PTSD量表(CAPS-CA)、事件影响量表(IES)、事件影响量表-修订版(IES-R)、临床总体印象量表(CGI)、临床总体印象-疾病严重程度(CGI-S)、临床总体印象-改善(CGI-I)、PTSD量表的杜克总体评级(Duke Global Rating for PTSD scale,DGRP)、PTSD量表的杜克总体评级-改善版(DGRP-I)、汉密尔顿焦虑量表(HAM-A)、PTSD结构式会谈(SI-PTSD)、PTSD会谈(PTSD-I)、PTSD症状量表(PSS-I)、简明国际神经精神访谈(MINI)、蒙哥马利-艾森贝格抑郁量表(MADRS)、贝克抑郁库(BDI)、汉密尔顿抑郁量表(HAM-D)、汉密尔顿抑郁量表修订版(RHRSD)、重度抑郁库(MDI)、老年抑郁量表(GDS-30)和儿童抑郁指数(CDI)。

[0045] 在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌显著改变或降低基于以下至少一种的评分：CAPS、CAPS-2、CAPS-CA、IES、IES-R、CGI、CGI-S、CGI-I、DGRP、DGRP-I、HAM-A、SI-PTSD、PTSD-I、PSS-I、MADRS、BDI、HAM-D、RHRSD、MDI、GDS-30和CDI。

[0046] 在某些实施方案中，相比基线分数，所分离的分枝杆菌显著降低基于CAPS、CAPS-2、IES、IES-R和HAMA中至少一种的终点分数。在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌基于CGI-I显著增加响应者的比例，所述CGI-I具有1(非常大的改善)和2(大的改善)中至少一种CGI-I评分。在某些实施方案中，所分离的分枝杆菌基于DGRP-I增加响应者比例，所述DGRP-I具有1(非常大的改善)和2(大的改善)中至少一种DGRP-I评分。

[0047] 在某些实施方案中，基于CAPS和CAP-2中至少一种的最多65的总体评分指示预防PTSD。

[0048] 在某些实施方案中，基于HAM-A的最多18的总体评分指示预防焦虑症。

[0049] 在某些实施方案中，基于CGI-I和DGRP-I中至少一种的最多3的评分指示预防PTSD。

[0050] 在其他的实施方案中，所分离的分枝杆菌预防和/或降低伴随PTSD的低级炎症。此类低级炎症可由升高的C-反应性蛋白的血清水平，如大于3mg/l来指示。

[0051] 在其他实施方案中，所分离的分枝杆菌预防和/或降低与PTSD和/或并发炎症相关的组织如结肠或胃肠道的其他部分损伤的发生。

[0052] 在一个实施方案中，如本文所定义，给药包括以多个小份和/或剂量和/或在分开的时机给予所分离的分枝杆菌。优选地，所分离的分枝杆菌在创伤事件发生之前给予，并在创伤事件发生后继续给予至患者。更优选地，在创伤事件发生后继续给予所分离的分枝杆菌至患者。

[0053] 在本发明的一个方面，所分离的分枝杆菌包括热灭活的分枝杆菌。用于本发明的优选的分枝杆菌物种包括：母牛分枝杆菌、耐高温分枝杆菌(M.thermoresistibile)、微黄分枝杆菌(M.flavescens)、杜氏分枝杆菌(M.duvalii)、草分枝杆菌(M.phlei)、奥布分枝杆菌(M.obuense)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、泥炭藓分枝杆菌(M.sphagni)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、罗得西亚分枝杆菌(M.rhodesiae)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、楚布分枝杆菌(M.chubuense)、东海分枝杆菌(M.tokaiense)、科莫斯分枝杆菌(M.komossense)、金色分枝杆菌(M.aurum)、M.indicus pranii、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)；非洲分枝杆菌(M.africanum)；堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、海洋分枝杆菌(M.marinum)；猿猴分枝杆菌(M.simiae)；胃分枝杆菌(M.gastri)；不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)；土壤分枝杆菌(M.terrae)；次要分枝杆菌(M.triviale)；戈氏分枝杆菌(M.gordonae)；瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)；石蜡分枝杆菌(M.paraffinicum)；胞内分枝杆菌(M.intracellulare)；鸟分枝杆菌(M.avium)；蟾分枝杆菌(M.xenopi)；溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)；迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)；耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；蛇分枝杆菌(M.thamnopheos)；微黄分枝杆菌(M.flavescens)；偶发分枝杆菌(M.fortuitum)；罕见分枝杆菌(M.peregrinum)；
龟型分枝杆菌(M.chelonei)；副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)；麻风分枝杆菌(M.leprae)；鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)和以上细菌的组合。

[0054] 优选地，热灭活的分枝杆菌为非病原性的。所述非病原性热灭活的分枝杆菌优选选自：母牛分枝杆菌、奥布分枝杆菌、副偶发分枝杆菌、金色分枝杆菌、M.indicus pranii、草分枝杆菌和以上细菌的组合。更优选地，所述非病原性热灭活的分枝杆菌为粗糙型(rough)变体。给予至患者的分离的分枝杆菌的量足以引发患者中的保护性免疫反应，使得其能防止患者的PTSD的至少一种病征或症状，其中所述病征或症状选自：异常的或焦虑的行为、疼痛感知和疼痛耐受问题、头痛、难以入睡或保持睡眠、表达创伤方面的重复演示、缺少可识别内容的噩梦和创伤特异性的重演。优选地，给予有效量的分离的分枝杆菌(其能预防患者的PTSD的至少一类症候群)，其中所述症候群选自：重复体验/侵入、逃避/麻木和觉醒过度。

[0055] 在本发明的某些实施方案中，优选的是将特定剂量的分离的分枝杆菌给予至对象。因此，在本发明的某些实施方案中，提供了包含用于本发明的有效量的、热灭活的分枝3 11 4 10
杆菌的容纳器具，其通常可为每单位剂量10-10 个生物体，优选10 -10 个生物体，更优
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选10-10 个生物体，并且甚至更优选10 -10个生物体。用于本发明的有效量的热灭活的
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分枝杆菌可为10-10 个生物体，优选10 -10 个生物体，更优选10 -10 个生物体，并且甚
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至更优选10-10个生物体。最优选地，用于本发明的热灭活的分枝杆菌的量为10 -10个
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细胞或生物体。通常，对于人和动物应用，可按10-10个细胞的剂量给予本发明的组合物。
可选地，作为悬液或干燥制剂提供的所述剂量为0.01mg-1mg，或者0.1mg-1mg生物体。

[0056] 在一个实施方案中，提供了分离的分枝杆菌，其用于给予至患者以降低在暴露于创伤事件后，患者的炎性细胞因子如IL-6水平的升高。

[0057] 在另一实施方案中，提供了分离的分枝杆菌，其用于给予至患者以防止在暴露于创伤事件后，患者的炎性细胞因子如IL-6、或IL-1β、或IL-8、或TNF-α、或MCP-1水平升高。所述分枝杆菌降低在暴露于创伤事件后，患者的IL-6、或IL-1β、或IL-8、TNF-α或MCP-1水平的升高。

[0058] 在另一实施方案中，提供了分离的分枝杆菌，其用于给予至患者以防止在暴露于创伤事件后，患者的C-反应性蛋白或可溶性CD-40水平降低。

[0059] 在其他的实施方案中，所分离的分枝杆菌能产生免疫调节效应，其中对象血浆中存在的炎性细胞因子与调节细胞因子的比率分别维持在小于约1。此类炎性细胞因子包括，例如IL-6、TNF和干扰素-γ，然而调节细胞因子包括，例如IL-10和TGF-β。

[0060] 如整个本说明书中使用的术语“组合物”，意在包括以相同的或分开的药物制剂并且在相同时间或不同时间给予治疗剂。因此，分离的分枝杆菌和药物制剂可提供为用于在相同时间或不同时间给药的分开的药物制剂。优选地，分离的分枝杆菌和药物制剂提供为用于在不同时间给药的分开的药物制剂。当分开且在不同时间给药时，可首先给予分离的分枝杆菌或药物制剂；然而，优选的是给予分离的分枝杆菌，然后给予药物制剂。另外，可在同一天或在不同的日子给予两种药物，并且它们可使用相同的时间安排或在治疗循环期间的不同时间点给药。

[0061] 优选地，在任何预期的创伤事件之前，将所分离的分枝杆菌给予至患者。

[0062] 可根据个别患者对治疗的耐受性，视需要进行给药延迟和/或给药减少，以及时间安排调整。

[0063] 在任何预期的创伤事件前，可按多个(重复)剂量，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个或者20个或更多个重复剂量，以约2周或约4周或约8周的间隔，给予有效量的分枝杆菌。

[0064] 可通过肠胃外、经口、舌下腺、经鼻或经肺途径，将所分离的分枝杆菌给与至患者。在优选的实施方案中，可通过选自皮下、真皮内、真皮下、腹膜内、静脉内和囊内注射的肠胃外途径给予所分离的分枝杆菌。更优选地，通过肠胃外途径给药不包括注射分枝杆菌细胞壁提取物。

[0065] 在另一优选的实施方案中，包括通过悬液、片剂等，经口给予所分离的分枝杆菌。可通过吸入冻干的或雾化的微囊给予液体制剂。其他的药物媒介物可用于控制制剂的作用时间长度。在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中，可将它们包封在通过凝聚技术或通过界面聚合(羟甲基纤维素或明胶微囊)制备的微囊中。赋形剂，例如，盐、各种填充剂、其他缓冲剂、螯合剂、抗氧化剂、助溶剂等可被包含在最终的制剂中。

[0066] 根据该实施方案的合适的剂量时间安排包括，给予所分离的分枝杆菌，然后在2周后进一步给予所述分离的分枝杆菌的剂量，并在接下来的3次给药按每2周继续，然后的4周不进行处理。此后，在给予初次剂量后，患者可每4周接受所分离的分枝杆菌，为期多达
12周或更长时间。可选地，给药可包括在引发或初始剂量之后按每周给予。

[0067] 被暴露于根据本发明的预期的创伤事件的患者，给予分离的分枝杆菌可同时、分开或顺序地进行。优选地，在预期的创伤事件之前，将所分离的分枝杆菌给予至患者。更具体而言，可在任何预期的创伤事件前约4周至1周将所分离的分枝杆菌给予至患者。优选地，所分离的分枝杆菌可作为一个或多个小份给药，其每个小份包含有效量的所分离的分枝杆菌，且可在任何预期的创伤事件前4周至1周的一个或多个时间间隔进行给予。甚至更优选地，所分离的分枝杆菌可作为一个或多个小份给药，其每个小份包含有效量的所分离的分枝杆菌，且可在任何预期的创伤事件之前4周至1周的一个或多个时间间隔进行给予，和/或在任何预期的创伤事件之前和/或之后的至少约2、4、6、8、10、12、15、20或更多个时机重复给予所分离的分枝杆菌。

[0068] 在本发明的一个实施方案中，所分离的分枝杆菌可为按实施例中示出的剂量形式和/或时间表给予至患者的药物形式。

[0069] 在本发明的一个方面，有效量的分离的分枝杆菌可作为单一剂量给药。可选地，有效量的分离的分枝杆菌可以多个(重复)剂量给药，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、或者20或更多个重复剂量。优选地，所分离的分枝杆菌在预期的创伤事件前约4周至1天给药，更优选地，在预期的创伤事件前约4周至1周，或者约3周至1周，或者约3周至2周给药。给药可提供为单个或多个剂量。

[0070] 在某些实施方案中，根据本发明的容器可为小瓶、安瓿瓶、注射器、胶囊、片剂或管子。在一些情况下，所分离的分枝杆菌可为冻干的，并且在给药前经配制用于重悬。然而，在其他情况下，分枝杆菌被悬浮在药学上可接受的液体体积中。在一些最优选的实施方案中，提供了包含悬浮在药学上可接受的载体中的单一单位剂量分枝杆菌的容器，其中所述单位6 10
剂量包含约1x 10至约1x 10 个分枝杆菌。在一些非常具体的实施方案中，包含悬浮的分枝杆菌的液体以约0.1ml至10ml，或约0.5ml至2ml的体积提供。还应理解，在某些情况下，在容纳器具中包含分枝杆菌的组合物为冷冻的(即，维持在小于约0℃)。前述组合物提供了用于本文中描述的应用的理想单元。

[0071] 在本发明的方法和/或组合物上下文中论述的实施方案，可用于关于本文描述的任何其他方法或组合物。因此，适合一种方法或组合物的实施方案也可被应用于本发明的其他方法和组合物。

[0072] 在一些情况下，减毒的分枝杆菌被给予至对象上或对象中的特定位点。例如，根据本发明的分枝杆菌组合物可邻近淋巴结进行给予。因此，在某些情况下，给予分枝杆菌组合物的位点可靠近宫颈后、扁桃体、腋窝、腹股沟、宫颈前、下颌下、颌下或锁骨上的淋巴结。此类给药位点为位于身体的右侧、左侧或两侧。在某些非常具体的实施方案中，分枝杆菌组合物在靠近腋窝、宫颈和/或腹股沟的淋巴结处进行递送。例如，分枝杆菌剂量被分配至邻近右侧和左侧腋窝的淋巴结以及右侧和左侧腹股沟的淋巴结的组织中。

[0073] 在一个非常具体的实施方案中，通过真皮内注射向对象给予分枝杆菌剂量，其中所述剂量被分配至身体两侧的腋窝和腹股沟，并且其中在每个位点进行两次注射(即，两轮)。

[0074] 在本发明的一些其他实施方案中，本发明的方法包括给予2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量的分枝杆菌，间隔一天或更多天给药。在某些优选的实施方案中，此类分开的剂量间隔几天、一周、两周、一个月或更多时间。例如，根据本发明的方法可包括在3周或更多的时间内给予1-5个剂量的分枝杆菌。在其他实施方案中，本发明的方法包括在约3周时间内给予1-5、1-4、1-3、1-2或2个剂量的分枝杆菌。相对于先前的或随后的剂量，给予的每个剂量可为相同的或不同的剂量。例如，在某些情况下，优选分枝杆菌的剂量低于先前给予的任何剂量。因此，在一些具体的情况下，以任何先前的治疗中给予的剂量的约一半给予分枝杆菌的剂量。在某些情况下，其中对象对分枝杆菌的免疫反应在随后的治疗中更大，此类方法可能是优选的。因此，在某些情况下，可按最小次数给予所分离的分枝杆菌，例如，少于10、9、8、7、6、5、4、3次或更少次的分开剂量给予。在一些情况下，给予了两次分枝杆菌组合物。

[0075] 本发明的分枝杆菌组合物将包含通常分散于药学上可接受的载体中的有效量的分枝杆菌。短语“药学或药学上可接受的”是指在需要时当给予至动物如人不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开，包含分枝杆菌的药物组合物的制剂为本领域技术人员所已知，如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990所例示。此外，对于动物(例如，人)给药，应理解肠胃外制剂应符合无菌、产热源性、总体安全和纯度标准。如本文所述，药学上可接受的载体的具体实例为硼酸盐缓冲液或无菌盐水溶液(0.9％NaCl)。

[0076] 如本文所用，“药学上可接受的载体”包括本领域技术人员已知的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，此类物质及以上物质的组合(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329)。

[0077] 在优选的实施方案中，所分离的分枝杆菌通过选自如下的肠胃外途径给药：皮下、真皮内、真皮下、腹膜内、静脉内、囊内注射或经口。真皮内注射使得能够将完整部分的分枝杆菌组合物递送至可接受免疫监测的真皮层，并因此能够在局部淋巴结处挑选出合适的免疫反应。

[0078] 参照以下非限制性实施例进一步描述了本发明。实施例

[0079] 概述

[0080] 在实验模型中，将小鼠暴露于引起PTSD中所见的一些行为症状的压力情形下，以母牛分枝杆菌预处理降低了反应性情绪应对行为。放在有一只具备优势攻击性的雄性小鼠的群落中的小鼠显示了反应所面对的压力的行为。这些小鼠显示，例如，增加的顺从性直立姿势和增加的躲避行为。以母牛分枝杆菌处理减少了这些行为，并事实上增加了在记录的任何时间点针对该优势的小鼠的前瞻行为的百分比。这些在面对压力源时改善的处理策略(如在PTSD中所见)，在焦虑相关的行为和社交焦虑的其他测试中也可见到。确实，以母牛分枝杆菌处理的小鼠显示减少的焦虑相关的行为，这显示为相比媒介物处理的小鼠，在迷宫的开放臂上所花的时间增加。在社交偏好/逃避测试中，母牛分枝杆菌处理还防止缺少社交偏好。有趣的是，母牛分枝杆菌预免疫的小鼠的头端(rostral)中缝背核的脑色氨酸羟化酶2mRNA表达显著增加。这与在面对压力源时的处理策略有关，因为脑的该区域中的多巴胺能神经元涉及到报偿通路。因此，母牛分枝杆菌处理的动物预期积极效应是可能的，并因此该偏倚减小了不良结果的压力。

[0081] 类似地，在进一步加剧与PTSD相关的炎症反应的小鼠模型中，以母牛分枝杆菌处理的小鼠显示炎症反应和抗炎反应之间改善的平衡，其分别显示为，相比在DSS诱导的结肠炎中媒介物处理的小鼠，IL-6水平的降低和IL-10水平的增加。

[0082] 材料和方法

[0083] 动物

[0084] 将以4-5只小鼠的组关养在聚碳酸酯笼子(W x L x D:27cm x 15cm x 42cm)中的C57BL/6雄性小鼠(19-22g)，用母牛分枝杆菌或媒介物(VEH)对照处理。简而言之，在第21、14和7天，经皮下以母牛分枝杆菌[n＝48；0.1mg全细胞热灭活的母牛分枝杆菌(NCTC11659)悬液，10mg/ml溶液于100μl无菌硼酸盐缓冲盐水(BBS)中稀释至1mg/ml]或VEH(n＝48；100μl BBS)注射入小鼠。在最后注射后，将小鼠单独关养在聚碳酸酯笼子(W x L x D:21cm x 14cm x 27cm)中一周，然后开始评估。所有的实验方案得到当地政府的动物健康和保护委员会的批准，并根据关于动物的伦理使用的国际指导进行。

[0085] 长期从属群体关养(Chronic subordinate colony housing,CSC)范例

[0086] 按先前所述1,2，连续19天将4只实验CSC小鼠与一只个体更大的优势雄性(30-35g；获自高焦虑相关行为雌性与C57BL/6雄性的交配)关养在一起，以诱导长期心理社交压力。为了避免长期压力暴露期间的适应，在第8天和15天于1000h，将每只较大的雄性更换为新的较大雄性。简而言之，将小鼠保持在标准实验室条件(12-h光照/黑暗循环，在0600h开灯,22℃,60％湿度)下，使用自来水和标准小鼠膳食，让其自由采食。在第1、8和15天的早上(1000h-1100h；在形成CSC群体后立即进行)，记录所有小鼠(CSC母牛分枝杆菌和VEH处理的以及优势雄性)的行为1h。根据前瞻性情绪应对行为(攻击、追逐和攀爬)以及反应性情绪行为(飞行、逃避、防御性直立行为、接受攻击和接受攀爬)，分析对抗行为。

[0087] 社交偏好/逃避测试(SPAT)

[0088] 在SPAT测试中测定母牛分枝杆菌处理对社交逃避/焦虑行为的影响。在第21天3,4
的0700h-1200h之间，按先前所述在SPAT测试中测试所有实验小鼠(VEH-SHC；VEH-CSC；
母牛分枝杆菌-SHC；母牛分枝杆菌-CSC)。简而言之，将单只小鼠放置在SPAT盒(W x L x D:27cm x 45cm x 27cm；光密度:10—40lux)中30秒以允许熟悉，然后引入小的空金属丝网笼(W x L x D:6.5cm x 10cm x 5cm)150秒。然后去除空的笼子，并进一步引入装有不熟悉的雄性小鼠的相同笼子150秒。记录了总迁移距离和在金属丝网笼周围8-cm宽的接触区中花费的时间。在暴露于新对象期间的行为给出了一般焦虑的指示。在暴露于不熟悉小鼠期间的行为给出了社交焦虑的指示。

[0089] 高架十字迷宫(EPM)测试

[0090] 在完成SPAT测试后，在EPM测试中评估了母牛分枝杆菌处理对焦虑相关行为的影响。在第22天的0700h-1200h之间，按先前所述在迷宫的开放臂上使用130lux，并且在封闭臂上使用30lux，将所有实验小鼠(VEH-SHC；VEH-CSC；母牛分枝杆菌-SHC；母牛分枝杆菌-CSC)暴露于EPM测试，维持5分钟。升高至离地面130cm的迷宫，由从中央平台(6cm x6cm)伸展出的形成加号图形的两个开放臂和两个封闭臂(每个6cm x 30cm)组成。将每只单独的小鼠朝向封闭臂放置在中央平台上。记录在开放臂和封闭臂上所花的时间。进入迷宫的封闭臂的数目被认为是指示自发活动。

[0091] DSS结肠炎的诱导和严重性的评估

[0092] 在完成EPM测试后，从第22天开始，所有实验小鼠(VEH-SHC；VEH-CSC；母牛分枝杆菌-SHC；母牛分枝杆菌-CSC)均接受于其饮用水中的1％的葡聚糖硫酸钠(DSS)持续14，5
周，并在第29天的0800h-1100h之间处死，以按先前所述评估结肠炎严重程度。简而言之，将所有实验小鼠的结肠摘除、洗涤并测定组织损伤分数。收获肠系膜淋巴结细胞，并在培养物中刺激以用于细胞因子分泌测量。

[0093] 以母牛分枝杆菌处理改善了在面对压力源时的应对行为

[0094] 在CSC和SHC小鼠、母牛分枝杆菌和VEH处理的小鼠中，测定了母牛分枝杆菌处理对一般焦虑和社交焦虑的影响。以母牛分枝杆菌处理减少了顺从和逃避行为。具体而言，成对比较揭示出，在第1天，相比VEH处理的小鼠，母牛分枝杆菌处理的小鼠显示显著更少的顺从性直立姿势，接收明显更少的攻击，且显示更少的飞行行为(p<0.001；p<0.001；p＝0.005)。此外，成对比较显示，在第1天(p＝0.023)和在第15天(p＝0.011)，相比VEH处理的小鼠，母牛分枝杆菌处理的小鼠显示明显更少的逃避行为。成对比较揭示，在第15天(p＝0.019)，而非第1天或第8天，相比VEH处理的小鼠，母牛分枝杆菌处理的小鼠显示接收明显更少的攀爬。相比VEH处理的小鼠的百分比，母牛分枝杆菌处理的小鼠显示前瞻行为的百分比明显更高(83％vs 35％；p＝0.001；图1A)。此外，当计算了总优势指数时(减去来自反应性行为的前瞻性)，母牛分枝杆菌处理的小鼠显示明显增加的总优势指数(p＝0.005；图1B)。

[0095] 社交偏好/逃避测试(SPAT)

[0096] 在接触区中所花的时间显著取决于刺激的存在(小金属丝网笼中的小鼠)(p<0.001；图2)。事后分析揭示出，相比非社交(笼中无小鼠)接触区，在VEH-SHC(p＝0.004)和母牛分枝杆菌-CSC(p＝0.002)组中，在社交(笼内的小鼠)接触区中所花的时间显著增加，且接近母牛分枝杆菌-SHC组的显著性(p＝0.064)。VEH-CSC组中不存在该效应。这表明以母牛分枝杆菌处理防止CSC诱导的社交偏好的缺乏。重要的是，在所有处理组中迁移的总距离是相当的。

[0097] 高架十字迷宫(EPM)测试

[0098] 统计分析揭示，相比各自的SHC小鼠，母牛分枝杆菌处理的CSC小鼠在开放臂上所花的时间百分比显著增加(p＝0.002；图3)。这表明以母牛分枝杆菌处理具有抗焦虑特性。

[0099] 以母牛分枝杆菌预免疫改善了CSC诱导的DSS诱导结肠炎的恶化

[0100] 测定了母牛分枝杆菌预免疫对CSC诱导的DSS诱导结肠炎的恶化的影响(图4)。CSC相比SHC暴露加重了VEH处理小鼠中的组织损伤分数(p＝0.041)。母牛分枝杆菌处理防止损伤分数的增加(图4B)。此外，母牛分枝杆菌处理防止CSC诱导的促炎性细胞因子IFN-y(p＝0.014；图4D)和IL-6(p＝0.001；图4E)分泌的增加。此外，相比各自的SHC小鼠，母牛分枝杆菌处理的CSC小鼠分泌的IL-10浓度升高(p＝0.036；图4F)，这一效应在VEH处理的小鼠中不存在。

[0101] 参考文献

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[0104] 3.Haller J,Bakos N.Stress-induced social avoidance:A new model of stress-induced anxiety？Physiology & Behavior 2002；77:327-332.

[0105] 4.Reber SO,Obermeier F,Straub RH,Falk W,Neumann ID.Chronicintermittent psychosocial stress(social defeat/overcrowding)in mice increases the severity of an acute DSS-induced colitis and impairs regeneration.Endocrinology 2006；147:4968-4976.

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用分离的分枝杆菌治疗创伤后应激障碍

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