用于RHO激酶抑制和改善学习与记忆的化合物
阅读：261发布：2020-05-24
专利汇可以提供用于RHO激酶抑制和改善学习与记忆的化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供式(I)的化合物和通过给予 治疗 有效量的该化合物在患者中改善记忆、抑制rho激酶1或2、抑制PIM激酶或抑制IRAK1激酶的方法。，下面是用于RHO激酶抑制和改善学习与记忆的化合物专利的具体信息内容。
1.一种式I的化合物：
其中
1
R 为选自氢、C1-6烷基、羟基和卤素的成员；
2 4 4
R 为 选 自C1-6烷 基、卤素、-C(O)-R、C1-6烷 氧 基、C1-6卤 代烷 基、-C(O)N(R)
4 4 4 4 4 4
R、-N(R)-C(O)-R、-N(R)R 和-C(O)OR 的成员；
3
R 为选自氢和C1-6烷基的成员；
4
每一个R 独立地为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员；和
n为0、1或2。
2.依据权利要求1的化合物
其中
1
R 为选自氢、C1-3烷基和卤素的成员；
2 4 4 4 4 4 4 4 4
R 为选自C1-3烷氧基、-C(O)-R、-C(O)N(R)R、-N(R)-C(O)-R、-N(R)R 和-C(O)OR的成员；
3
R 为选自氢和C1-3烷基的成员；
4
每一个R 独立地为选自氢、C1-3烷基和C3-8环烷基的成员；和n为0、1或2。
2
3.权利要求1的化合物，其中R 为C1-6烷基。
2
4.权利要求1的化合物，其中R 为C1-6烷氧基。
5.权利要求1的化合物，其选自：
6.权利要求1的化合物，其选自：
1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(1-羟基-8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(1-甲基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(1-乙基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(8-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，
1-(8-氨基甲基-5-异喹啉-磺酰基)2-甲基-哌嗪，和
1-(1-甲基-8-三氟甲基-5-异喹啉-磺酰基)2-甲基-哌嗪。
7.一种用于改善患者的记忆的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的依据权利要求1的化合物。
8.一种用于在患者中治疗rho激酶1和/或2相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的依据权利要求1的化合物。
9.一种用于在患者中治疗PIM激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的依据权利要求1的化合物。
10.权利要求9的方法，其中所述病症选自ALL、CLL、AML或CML，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
11.一种用于在患者中治疗IRAK1激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的权利要求1的化合物。
12.权利要求11的方法，其中所述病症选自感染、动脉粥样硬化、脓毒病、自身免疫性疾病和癌症。
13.一种用于在患者中治疗与选自CSNK1E、CSNK1A1L、CSNK1D、MERTK、SLK、IRAK1、STK10、MAPK12、PHKG2、MAPK11、MET、AXL、STK32B、AURKC、CLK3、RPS6KA6、PDGFRB、KDR、CDK2的激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的下式化合物：
14.权利要求13的方法，其中所述病症选自焦虑症、抑郁症、双相性精神障碍、单相性精神障碍及创伤后紧张症。
15.权利要求13或14的方法，其中化合物为1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰
基)高哌嗪。
用于RHO激酶抑制和改善学习与记忆的化合物
[0001] 相关申请的信息
[0002] 本申请要求2008年5月12日递交的美国临时申请号61/052600的优先权益，其在此通过参照结合到本文中。
[0003] 背景
[0004] 人的记忆为多基因的认知特质。约50％的遗传力估算提示天然存在的遗传变异性对该基本脑功能具有重要影响。最新的候选基因相关研究已经鉴定了一些对人记忆容量具有显著影响的遗传变异。然而，这些研究的成功取决于先存的信息，其限制它们鉴定未识别的基因和分子途径的潜能。
[0005] 高密度基因分型(genotyping)平台发展中的最新进展已经能够鉴定某些基因，特别是担负事件记忆和长时记忆表现的KIBRA基因(Papassotiropoulos等，Science2006，314，475；WO 2007/120955)。然而，仍然没有可用于患有恶化的事件记忆或长时记忆的患者的治疗方法。基于KIBRA被鉴定为信号传导通路中刺激记忆的中枢蛋白，人们发现给予rho激酶2(ROCK)抑制剂，具体地说为法舒地尔，可增强学习和记忆能力(Huentelman等.Behavioral Neuroscience 2009，123，218；WO 2008/019395)。为了实现适用于患有恶化的事件记忆或长时记忆的患者的治疗，需要优选地具有改善的和/或对ROCK更具选择性抑制作用的新化合物。这样的化合物适用于增强学习和记忆力。
[0006] 概述
[0008]
[0009] 其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和卤素，优选地选自氢和C1-6烷基的成员；R2为选自C1-6烷基、卤素、-C(O)-R4、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-C(O)N(R4)R4、-N(R4)-C(O)-R4、-N(R4)R4和-C(O)OR4的成员，同时R2位于异喹啉部分的6、7或8位，优选地在8位；R3为选自氢和C1-6烷基的成员；每一个R4独立地为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员；并且n为0、1或2，优选地为1或2。
[0010] 另外，提供采用式I化合物抑制ROCK的方法。因此，式I化合物可用于治疗患有ROCK相关病症和疾病的患者，所述疾病为例如蛛网膜下腔出血后的血管痉挛、心绞痛(例如变异性心绞痛或血管痉挛性心绞痛)、脊髓损伤或脑损伤后的病症(例如中风、创伤性脑损伤)、心力衰竭相关疾病(例如由于血管阻力和收缩所致)、心肌梗塞、肺动脉高压原发性高血压、动脉粥样硬化和主动脉僵硬及周围血管疾病如雷诺氏现象以及需要ROCK抑制作用的勃起功能障碍。
[0011] 另外，提供用于改善患者的学习和记忆(包括改善精神疾病例如精神分裂症的认知缺陷、治疗痴呆例如阿尔茨海默氏病、皮克病、额颞叶痴呆(Fronto temporal dementia)、血管性痴呆、苦鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeld-Jakob disease)和由AIDS/HIV感染引起的痴呆)、改善神经可塑性、遗忘亚型轻度认知损伤、年龄相关的记忆损害和/或治疗阿尔茨海默氏病的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的式I化合物。
[0012] 在其它方面，提供通过给予有需要的患者治疗有效量的式1化合物改善记忆或治疗rho激酶1和/或2相关病症的方法。
[0013] 在另一方面，提供用于在患者中治疗PIM激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的式1化合物。在一些实施方案中，所述病症选自ALL、CLL、AML或CML，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
[0014] 在另一方面，提供用于在患者中治疗IRAK1激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的式1化合物。在一些实施方案中，病症选自感染、动脉粥样硬化、脓毒病、自身免疫性疾病和癌症。
[0015] 其它的目的、特征和有利条件将从以下详细描述中将变得显而易见。给出详细描述和具体实施例仅用于举例说明，因为本发明的精神和范围内的多种变化和改进，本领域技术人员可自该详细描述中明显发现。另外，实施例证明了本发明的原理，但不能期望对所有实施例具体阐明本发明的用途，其中对先前领域的技术人员而言，其显然是有用的。
[0017] 图1：用于合成1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。最后的步骤为通过加入亚硫酰氯和高哌嗪(homopiperacine)(SOCl2/高哌嗪)增加高哌嗪部分。
[0018] 图2：用于合成1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为用过氧化氢和乙酸(H2O2/AcOH)产生N-氧化物。下一步为用磷酰氯(POCl3)引入氯残基。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。最后一步为通过加入亚硫酰氯和高哌嗪(SOCl2/高哌嗪)增加高哌嗪(homopiperacive)部分。
[0019] 图3：用于合成1-(1-羟基-8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步为通过加入正丁基锂(BuLi)和乙醛(CH3CHO)产生羟乙基残基。下一步为用重铬酸钠(Na2Cr2O7)氧化。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和fmoc-高哌嗪(SOCl2/fmoc-高哌嗪)加入fmoc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。下一步为用过氧化氢和乙酸(H2O2/AcOH)产生N-氧化物。最后一步为用醋酸酐(acetanhydride)和氢氧化钠(Ac2O/NaOH)羟基化和裂解fmoc-基团。
[0020] 图4：用于合成1-(1-羟基-7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为通过加入正丁基锂(BuLi)和乙醛(CH3CHO)产生羟乙基残基。下一步为用重铬酸钠(Na2Cr2O7)氧化。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和fmoc-高哌嗪(SOCl2/fmoc-高哌嗪)加入fmoc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。下一步为用过氧化氢和乙酸(H2O2/AcOH)产生N-氧化物。最后一步为用醋酸酐和氢氧化钠(Ac2O/NaOH)羟基化和裂解fmoc-基团。
[0021] 图5：用于合成1-(1-甲基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步为用过氧化二苯甲酰和烷基碘((PhCOO)2/Alkyliodid)烷基化。下一步为用正丁基锂(BuLi)和二氧化碳(corbonoxide)(CO2)羧基化。下一步为通过加入在甲醇中的亚硫酰氯(SOCl2/MeOH)和在甲醇中的氨(NH3)产生甲酰胺。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。最后一步为通过加入亚硫酰氯和高哌嗪(SOCl2/高哌嗪)增加高哌嗪部分。
[0022] 图6：用于合成1-(1-甲基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为用过氧化二苯甲酰和烷基碘((PhCOO)2/Alkyliodid)烷基化。下一步为用正丁基锂(BuLi)和二氧化碳(CO2)羧基化。下一步为通过加入在甲醇中的亚硫酰氯(SOCl2/MeOH)和在甲醇中的氨(NH3)产生甲酰胺。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。最后一步为通过加入亚硫酰氯和高哌嗪(SOCl2/高哌嗪)增加高哌嗪部分。
[0023] 图7：用于合成1-(8-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步为通过加入硫氰酸钾(KSCN)和溴(Br2)引入硫氰酸基。下一步为用盐酸(HCl(水溶液))和乙醇(EtOH)皂化。下一步为用高锰酸钾(KMnO4)氧化。下一步为用醋酸酐(Ac2O)乙酰化。最后一步为通过加入亚硫酰氯和高哌嗪(SOCl2/高哌嗪)偶联高哌嗪部分。
[0024] 图8：用于合成1-(6-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为用醋酸酐(Ac2O)乙酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和Nboc-高哌嗪(SOCl2/Nboc-高哌嗪)加入Nboc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。最后一步为用盐酸和异丙醇(HCl/i-PrOH)裂解boc-基团。
[0025] 图9：用于合成1-(7-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和Nboc-高哌嗪(SOCl2/Nboc-高哌嗪)加入Nboc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。下一步为用铜、溴化铜(I)和氨(Cu/Cu(I)Br/NH3)偶联氨基。下一步为用醋酸酐(Ac2O)乙酰化。最后一步为用盐酸和异丙醇(HCl/i-PrOH)裂解boc-基团。
[0026] 图10：用于合成1-(8-氨基甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪的流程。第一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和Nboc-高哌嗪(SOCl2/Nboc-高哌嗪)加入Nboc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。下一步为用三(二亚苄基丙酮)二钯(Pd(dba)2)、2，2’-双(二苯基膦基)-1，1’-联萘(BINAP)和甲胺(MeNH2)偶联氨基。最后一步为用盐酸和异丙醇(HCl/i-PrOH)裂解boc-基团。
[0027] 图11：用于合成1-(1-甲基-8-三氟甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪的流程。第一步表示通过加入氨基乙醛缩二甲醇(H2NCH2CH(OCH3)2)、氯甲酸乙酯(ClCO2Et)、磷酸三甲酯(P(OMe)3)和四氯化钛(TiCl4)产生异喹啉部分。下一步为采用苯甲酰氯(PhCOCl)和氰化三甲基硅烷(TMS-CN)合成赖塞尔特化合物。下一步为用氢化钠、碘甲烷和氢氧化钠(NaH、MeI、NaOH)甲基化。下一步为用硫酸和发烟硫酸(SO3/H2SO4)磺酰化。下一步为通过加入亚硫酰氯和Nboc-高哌嗪(SOCl2/Nboc-高哌嗪)加入Nboc保护的高哌嗪(homopiperacive)部分。最后一步为用盐酸和异丙醇(HCl/i-PrOH)裂解boc-基团。
[0028] 图12：ROCK-酶-抑制作用的图示。各条显示在增加的最终浓度(0,1-100μM)下，用试验化合物(x-轴)温育后剩余的rock-酶活性的量(y-轴)。白色条：媒介物(空白(sham))；黑色棒：法舒地尔；深灰色：1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，浅灰色棒：1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0029] 图13A：所选择的激酶与1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲基-法舒地尔”)及1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲氧基-法舒地”)之间以AMBIT KinomeScan测量的相互作用与用作对照的法舒地尔进行比较。与10μM浓度的化合物具有大于50％结合亲合力的激酶用黑色盒标记。与10μM浓度的化合物具有50％或更少结合亲合力的激酶用灰色盒标记。在该表中仅收集对或者法舒地尔、1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪或者1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪呈现大于50％结合亲合力的激酶。
[0030] 图13B：以AMBIT KinomeScan测量的对或者法舒地尔、1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪或者1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪具有低于50％结合亲合力的激酶一览表。
[0031] 图14：作为示例，法舒地尔、1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对AGC-家族激酶的亲合性。ROCK1和2以及PKA属于该家族。分层群聚表示那些激酶之间的关系。与对照组相比，大于50％的两种试验化合物中的任何一个的结合亲合力以黑色描绘，低于50％的以灰色描绘。
[0032] 图15：神经突生长试验的条图。神经突长度变化以对照组(空白，溶剂)的％显示。基于原代海马神经元，试验两种不同浓度的试验化合物(1.5和15μM)，其中法舒地尔用作对照和试验化合物为1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲基法舒地尔”)和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲氧基法舒地尔”)。误差条表示SEM。
[0033] 图16A：LTP经θ短阵快速脉冲刺激的诱导作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在对照组记录15分钟后诱导LTP(箭头)。数据点上的条表示SEM。
[0034] 图16B：10μM法舒地尔对LTP诱导的作用。将平均斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在对照组记录30分钟后诱导LTP(箭头)。黑线表示存在法舒地尔，棒表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0035] 图16C：1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP 30分钟(箭头)。黑线表示存在1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0036] 图16D：10μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP 30分钟(箭头)。黑线表示存在1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0037] 图16E：100μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP 30分钟(箭头)。黑线表示存在1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0038] 图16F：1μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP30分钟(箭头)。黑线表示存在1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0039] 图16G：10μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP30分钟(箭头)。黑线表示存在1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0040] 图16H：100μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪对LTP诱导的作用。将斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)对时间作图。在法舒地尔应用开始后诱导LTP30分钟(箭头)。黑线表示存在1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，数据点上的条表示SEM。剖面线表示对照组的平均LTP水平(130％，参见图16A)。
[0041] 图17：LTP数据图示。对空白对照组(黑色；A)；10μM法舒地尔(深灰色；B)；1、10 & 100μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(中度灰色；C、D、E)；和1、10 &
100μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(浅灰色；F、G、H)绘制平均斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)。条表示SD。
100μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(浅灰色；F、G、H)绘制平均斜率(最大fEPSP振幅的30-70％)。条表示SD。
[0042] 详细描述
[0043] 提供适合用作ROCK抑制剂，用于治疗ROCK相关病症和疾病，例如蛛网膜下腔出血后血管痉挛的方法，用于增强记忆和学习、用于改善神经可塑性和用于治疗阿尔茨海默氏病的方法的新化合物。
[0044] 在此描述的化合物不仅可用于治疗为阿尔茨海默氏病症状的记忆丧失，而且可用于治疗阿尔茨海默氏病的起因和延迟发作或者预防疾病发展。不受作用的具体理论的束缚，认为KIBRA基因路径(gene pathway)与神经原纤维缠结的发展有关。
[0045] 可能与记忆有关的两种最多被研究的蛋白为PKC和环状AMP应答元件(response element)结合蛋白(CREB)。PKC家族成员由于其在几个关键脑区域的过度表达、其与跨越几个物种的记忆过程的相关、其在与空间学习缺陷相关的人中年龄有关的活动性改变和PKC抑制损害学习与记忆的最终证据，据说在记忆力中起作用(Micheau，J.& Riedel，G.Cell Mol Life Sci 55，534-48(1999)；Pascale，A.等.Mol Neurobiol 16，49-62(1998)；Sun，M.K.& Alkon，D.L.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord(目前靶向中枢神经系统疾病的药物)4，541-52(2005)；Birnbaum，S.G.等.Science 306，882-4(2004)；
Etcheberrigaray，R.等.Proc Natl Acad Sci U S A 101，11141-6(2004)；Ruiz-Canada，C.等.Neuron 42，567-80(2004))。对于CREB作为记忆相关基因的支持体包括其在海参、海兔属(Aplysia)的长时程增强效应和在啮齿动物中增强方面确定的作用，表明CREB功能可诱导的破坏阻断小鼠的记忆，并研制改变CREB活性作为记忆增强剂的化合物(Josselyn，S.A.& Nguyen，P.V.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord(目前靶向中枢神经系统疾病的药物)4，481-97(2005)；Carlezon，W.A.等.Trends Neurosci 28，436-45(2005)；Cooke，S.F.& Bliss，T.V.Curr Opin Investig Drugs 6，25-34(2005)；Josselyn，S.A.，Kida，S.& Silva，A.J.Neurobiol Learn Mem 82，159-63(2004)；Martin，K.C.Neurobiol Learn Mem
78，489-97(2002)；Lonze，B.E.& Ginty，D.D.Neuron 35，605-23(2002)；Si，K.，Lindquist，S.& Kandel，E.R Cell 115，879-91(2003)；Chen，A. 等 .Neuron 39，655-69(2003))。
另外，存在封固(mounting)支持其它蛋白在记忆中的作用的遗传学证据，包括HTR2A、BDNF 和PKA(Alonso，M. 等 .Learn Mem 12，504-10(2005)；Bramham，C.R.& Messaoudi，E.Prog Neurobiol 76，99-125(2005)；Papassotiropoulos，A. 等 .Neuroreport 16，
839-42(2005)；de Quervain，D.J. 等 .Nat Neurosci 6，1141-2(2003)；Reynolds，C.A. 等 .Neurobiol Aging 27，150-4(2006)；Arnsten，A.F. 等 .Trends Mol Med 11，
121-8(2005)；Quevedo，J.等.Behav Brain Res 154，339-43(2004))。
Etcheberrigaray，R.等.Proc Natl Acad Sci U S A 101，11141-6(2004)；Ruiz-Canada，C.等.Neuron 42，567-80(2004))。对于CREB作为记忆相关基因的支持体包括其在海参、海兔属(Aplysia)的长时程增强效应和在啮齿动物中增强方面确定的作用，表明CREB功能可诱导的破坏阻断小鼠的记忆，并研制改变CREB活性作为记忆增强剂的化合物(Josselyn，S.A.& Nguyen，P.V.Curr Drug Targets CNS Neurol Disord(目前靶向中枢神经系统疾病的药物)4，481-97(2005)；Carlezon，W.A.等.Trends Neurosci 28，436-45(2005)；Cooke，S.F.& Bliss，T.V.Curr Opin Investig Drugs 6，25-34(2005)；Josselyn，S.A.，Kida，S.& Silva，A.J.Neurobiol Learn Mem 82，159-63(2004)；Martin，K.C.Neurobiol Learn Mem
78，489-97(2002)；Lonze，B.E.& Ginty，D.D.Neuron 35，605-23(2002)；Si，K.，Lindquist，S.& Kandel，E.R Cell 115，879-91(2003)；Chen，A. 等 .Neuron 39，655-69(2003))。
另外，存在封固(mounting)支持其它蛋白在记忆中的作用的遗传学证据，包括HTR2A、BDNF 和PKA(Alonso，M. 等 .Learn Mem 12，504-10(2005)；Bramham，C.R.& Messaoudi，E.Prog Neurobiol 76，99-125(2005)；Papassotiropoulos，A. 等 .Neuroreport 16，
839-42(2005)；de Quervain，D.J. 等 .Nat Neurosci 6，1141-2(2003)；Reynolds，C.A. 等 .Neurobiol Aging 27，150-4(2006)；Arnsten，A.F. 等 .Trends Mol Med 11，
121-8(2005)；Quevedo，J.等.Behav Brain Res 154，339-43(2004))。
[0046] KIBRA最近在酵母双杂交筛选中被鉴定为人同工型石斛因碱(dendrin)的结合配体，一种突触可塑性的推定调节剂(Kremerskothen，J.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.300，862(2003))。被表达于海马的一种截短形式缺乏第一个223aa并包含C2样结构域，一段富集谷氨酸的序列与蛋白激酶C(PKC)ζ-相互作用结构域(de Quervain，D.J.等，Nat.Neurosci.6，1141(2003))。PKC-ζ与记忆形成和长时程增强效应的固结有关(Bookheimer，S.Y.等，N.Engl.J.Med.343，450(2000)；Milner，B.Clin.Neurosurg.19，421(1972))。KIBRA的C2-样结构域与突触结合蛋白的C2结构域相似，确信其在突触囊
2+
泡胞吐作用作为主要Ca 传感器起作用(Freedman，M.L.等，Nat.Genet.36，388(2004)；
Schacter，D.L.& Tulving E.Memory systems(记忆系统)(MIT Press，Cambridge，1994))。
在WO 2008/019395中描述的与记忆有关的KIBRA单倍型区域(haplotype block)和SNP绘制在截短的KIBRA中，其包含C2-样与PKC-ζ-相互作用结构域两者。将这些研究结果一起考虑，KIBRA似乎在正常人的记忆行为表现(memory performance)中起作用。
2+
泡胞吐作用作为主要Ca 传感器起作用(Freedman，M.L.等，Nat.Genet.36，388(2004)；
Schacter，D.L.& Tulving E.Memory systems(记忆系统)(MIT Press，Cambridge，1994))。
在WO 2008/019395中描述的与记忆有关的KIBRA单倍型区域(haplotype block)和SNP绘制在截短的KIBRA中，其包含C2-样与PKC-ζ-相互作用结构域两者。将这些研究结果一起考虑，KIBRA似乎在正常人的记忆行为表现(memory performance)中起作用。
[0047] 另外，尽管KIBRA在脑中具有高表达并调节Ca2+且为PKC底物与突触蛋白，存在几种其它的遗传学研究结果，这些结果将RhoA/ROCK鉴定为记忆靶标和法舒地尔被鉴定为增强记忆、学习与认知的调节剂(Huentelman等.Behavioral Neuroscience 2009，123，218；2+
WO 2008/019395)。CLSTN2在脑中具有高表达，调节Ca 和为突触蛋白。CAMTA1在脑中具
2+
有高表达，调节Ca 和为转录因子。SEMA5A在发育的脑中具有高表达并与轴突导向有关。
TNR在脑中具有高表达，与ECM有关并协助突触维持。最后，NELL2在脑中也具有高表达，协助神经元生长和显示增强的LTP但是损害HPF-介导的学习。另外，每一个遗传靶标的就地杂交在小鼠海马中显示表达。
WO 2008/019395)。CLSTN2在脑中具有高表达，调节Ca 和为突触蛋白。CAMTA1在脑中具
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有高表达，调节Ca 和为转录因子。SEMA5A在发育的脑中具有高表达并与轴突导向有关。
TNR在脑中具有高表达，与ECM有关并协助突触维持。最后，NELL2在脑中也具有高表达，协助神经元生长和显示增强的LTP但是损害HPF-介导的学习。另外，每一个遗传靶标的就地杂交在小鼠海马中显示表达。
[0048] RhoA/ROCK通路在正常记忆功能以及阿尔茨海默氏病认知功能下降(和可能的其它遗忘性疾病)中的重要性不可言过其实。许多破坏性疾病包括记忆丧失作为主要临床特征，并且在这些疾病的病例中，RhoA/ROCK通路可在其总体严重性、进展或病理学方面起作用。甚至在记忆丧失发作之前最小的延长将对患有这些疾病的患者是有利的。
[0049] Rho激酶2(ROCK)为丝氨酸/苏氨酸-特异性蛋白激酶，其由GTP-结合的RhoA激活。其为多种信号转导通路中的主要参与者并且控制多种细胞功能，包括平滑肌收缩、肌动蛋白-细胞骨架重塑、细胞运动性和突触重建。ROCK介导Rho信号传导并通过几种底物的磷酸化作用改组肌动蛋白细胞骨架，这有助于装配肌动蛋白丝和收缩性。例如，ROCK通过肌凝蛋白磷酸酶靶标亚单位1(MYPT1)在Thr696的特异性磷酸化作用钝化肌凝蛋白磷酸酶，这导致20-kDa肌凝蛋白轻链(MLC20)的磷酸化含量增加。可通过与没有试验化合物的对照组相比较，在试验化合物存在下温育纯化的激酶及其底物，分析试验化合物的ROCK抑制作用。磷酸化的底物可用特异性抗体检测并且测量化合物的抑制作用的量。
[0050] 用数百种已知激酶平行可实施活性位点依赖性竞争结合试验(Fabian等，Nat Biotechnol.2005，23，329；Karaman等，Nat Biotechnol.2008，26，127)，以确定化合物如何结合于预定与非预定的激酶两者。这样的方法使得能够评价激酶抑制剂的特异性。通常，称为ROCK抑制剂的化合物，例如法舒地尔，不仅抑制ROCK，而且抑制其它激酶例如蛋白激酶A，后者在细胞和活体中起重要作用。因此，提示抑制蛋白激酶A活性可引起严重副作用。因此，从采用ROCK抑制剂作为治疗药物的观点来看，已迫切需要开发可更加选择性地抑制与疾病或病症有关的ROCK，但是基本上不影响其它激酶活性的化合物。因此，在一个实施方案中，本发明提供呈现更加特异性的ROCK抑制作用的化合物和采用那些化合物选择性地抑制ROCK的方法。
[0051] 为了测定体内给予化合物对记忆行为表现的影响，可采用多种已知的动物实验，例如Sacktor-盘(Sacktor-disc)实验，其为用快速海马依赖性获得与持续海马依赖性回忆的实验有利条件躲避活动区域的一种特殊形式(Pastalkova等，Science 2006，313，1141)。装置有对居室环境开放的缓慢旋转的平台组成。当动物跑入预定的扇形区时给工作台通电。旋转将动物带入电击区，并且动物迅速学习通过主动运动到周围的非电击区域躲避电击。
[0052] 在另一个实施例中，可采用Morris水迷宫。最初开发该体内记忆试验以测试大鼠的学习、记忆和去到相对于远端迷津外线索(extramaze cues)仅根据其位置确定的空间位置的能力(Morris等，J Neurosci Methods 1984，11，47)。
[0053] 或者，人们可采用径向臂迷宫测试动物的记忆力。该迷宫有例如八个围绕八边形中央平台的升臂组成。动物可采用迷津外视觉线索作为定向陆标通过迷宫。其中四个臂用小的食物颗粒随便地饵诱作为奖赏和四个臂为非饵诱的。允许动物探测迷宫并记住被饵诱臂的位置。在随后的试验中，在非饵诱臂中跑动被认为是基准记忆错误：再次进入相同的臂被认为是工作记忆错误以及再次进入先前访问的饵诱臂。有利地，径向臂迷宫可用于同时测试工作记忆及空间记忆。
[0054] 另外已知的行为动物试验例如T-迷宫、户外或物体识别可用于评价动物记忆。这样的体内实验可用于某些动物亚群(subpopulations)例如衰老动物、疾病模型动物等，以特别评价在这样的亚群中的记忆和记忆增强作用。
[0055] 一种经典条件反射(conditioning)为恐惧条件反射。其属于用于研究情感学习与记忆的模型。条件反射意指成对的条件刺激例如光或色调与无条件刺激例如轻度电击。仅用无条件刺激导致恐惧反应。在几次重复的成对试验后，动物也对单用条件刺激显示恐惧反应。这叫做条件反应。如以上描述的成对不同刺激也称为线索性恐惧条件反射，而情境性恐惧条件反射描述了对试验室本身的恐惧反应。线索性恐惧条件反射对称为杏仁核(amygdala)的脑结构敏感和事件前后关系应答(occurring contextual response)似乎对海马体更加敏感。在动物中，恐惧条件反射示例及主动与被动躲避示例两者可用于证明学习增强。可对某些动物亚群例如衰老动物、疾病模型动物等采用这样的体内试验，以特别评价在这样的亚群中的记忆和记忆增强作用。
[0056] 可体外测量长时程增强效应(LTP)的影响并且通常认为与记忆行为表现相关。刺激传入神经元或神经元细胞区域导致位于下游的神经元或神经元细胞区域的膜电位。这样的膜电位在例如用θ短阵快速脉冲模式(burst paradigm)刺激传入神经元后至少数小时被长时程增强。因此，LTP被看作是基于细胞水平的记忆。与空白的培养神经元相比较，对用试验化合物培养的神经元进行电生理学LTP测量可用于评价化合物增强记忆的潜力(参见例如Cooke和Bliss，Brain，2006，129(1659)，其在此通过参照结合到本文中)。
[0057] 存在加工处理基本记忆形成和学习的总协定，其包括神经元网络的结构塑性和树状突或脊刺的能动性(参见例如Tada & Sheng，Curr Opin Neurobiol.，2006，16，95)。已知神经突生长受Rho GTPases的影响，后者为具有其成员Rho、Rac和Cdc42的小GTPases家族。Rho GTPases对于其对肌动蛋白细胞骨架的作用是熟知的并因此为细胞运动性与突触可塑性的重要调节剂。Rho以其活性GTP-结合形式激活Rho激酶(ROCK)，其随后激活肌凝蛋白轻链，导致细胞骨架重新排列并抑制轴突生长。观察到ROCK抑制剂如法舒地尔在未分化的PC12细胞增加神经突生长(Zhang等，Cell Mol Biol Lett.，2006，11，12)。为了分析具有潜在ROCK抑制能力的试验化合物的作用，人们可在试验化合物存在下，与没有该化合物的对照试验相比较，测量细胞培养中原代海马神经元的神经突长度。或者测量长度增加，能够确定复杂性增加(Sholl分析)。显示刺激神经突生长能力的化合物可用于需要增强大脑可塑性(cerebral plasticity)与认知的病症。
[0058] 阿尔茨海默氏病(AD)和额颞叶痴呆(FTD)的遗传形式及引起基因突变原因的鉴定已经导致产生用于这些疾病的转基因动物模型。在AD中的主要参与者为淀粉样前体蛋白(APP)。过度表达突变的APP的小鼠为研究AD中记忆损伤最广泛采用的模型(Ashe，Learn Mem.2001，8，301；Chapman等，Trends Genet.2001，17，254；Goetz & Ittner，Nat Rev Neurosci.2008，9，532)。这些小鼠带有淀粉样前体蛋白(APP)的不同变体，并且当这些前体蛋白在AD患者(例如具有所谓瑞典型突变的动物，Tg2576(Hsiao等，Science 1996，274，99))中显著出现时，随着时间的推移出现记忆缺陷。这些动物模型可用于试验潜在的记忆增强的化合物对体内疾病模型的效力。
[0059] 其得益于本发明的治疗和诊断性应用的病变或神经病变包括如下：
[0060] 中枢运动系统疾病包括影响基底神经节的退化性疾病(亨廷顿氏舞蹈病、威尔逊氏病、纹状体黑质变性、皮质基底神经节变性)、图雷特综合征、帕金森病、进行性核上性麻痹、进行性延髓性麻痹、家族性痉挛性截瘫、脊髓肌萎缩、ALS及其变体、齿状核红核萎缩、橄榄-桥脑小脑萎缩、副肿瘤性(paraneoplastic)小脑变性和多巴胺毒性。
[0061] 影响感觉神经元的疾病例如弗里德赖希运动失调(Freiedreich’s ataxia)、糖尿病、周围神经病变和视网膜神经元变性；
[0062] 边缘和皮质系统疾病例如脑淀粉样变性、皮克氏萎缩和雷特氏综合征(Rett syndrome)；
[0063] 涉及到多神经元系统和/或脑干的神经变性病变包括阿尔茨海默氏病、AIDS相关痴呆、利氏病、弥漫性路易体病、癫痫、多系统萎缩、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、溶酶体贮积症例如脂褐质沉积症、唐氏综合征的退化后期、阿尔珀斯病(Alper’s disease)、由于CNS变性引起的眩晕；
[0064] 与发育迟缓和学习障碍及唐氏综合征以及氧化应激引起的神经元死亡有关的病变；
[0065] 由于老化和慢性酒精或药物滥用引起的病变包括例如蓝斑、小脑、基底前脑胆碱能神经元的酒精中毒变性；导致认知和运动损伤的小脑神经元和皮质神经元的老化变性；及导致运动损伤的基底核神经元的慢性安非他明滥用变性；
[0066] 由病灶创伤例如中风、病灶局部缺血、血管机能不全、缺氧缺血性脑病、高血糖、低血糖、闭合性头部损伤或直接性损伤引起的病理变化；
[0067] 作为治疗药物与治疗的阴性副作用出现的病变(例如应答于抗惊厥剂量的谷氨酸受体NMDA类拮抗剂、化学疗法、抗生素等的扣带回和内嗅皮质(entorhinal cortex)神经元变性)；和
[0068] 学习障碍例如ADD、ADHD、诵读困难、书写困难、计算困难、运动障碍和信息加工障碍。
[0069] 多种疾病将得益于其病理生理学与ROCK1和/或ROCK2激酶有关的本发明。ROCK在CNS的活性与多种神经元功能，例如神经突生长和收缩有关，而且还与神经元细胞凋亡有关。成人CNS轴突在损伤后再生长受髓磷脂相关信号(例如Nogo，MAG)的抑制。ROCK与该现象有关。因此，抑制ROCK活性有助于克服这些抑制信号，因此对于脊髓损伤、脑损伤或中风后恢复中的轴突重新接线(axonal rewiring)是有益的。另外，ROCK与细胞凋亡途径有关。因此抑制ROCK应有益于与CNS或PNS(外周神经系统)中(细胞凋亡)细胞死亡有关的疾病。典型疾病为中风、脑损伤、脑出血和神经退行性疾病(例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森病、遗传性共济失调、CNS的遗传性新陈代谢紊乱)。
[0070] 在心血管系统中，ROCK对调节血管紧张度具有显著活性。另外，已经注意到平滑肌或心肌凋亡途径中的复杂情况。因此，ROCK抑制作用应用于具有解除血管紧张度或抗性或顺应性的疾病。这样的疾病包括例如：蛛网膜下腔出血后血管痉挛、心绞痛(优选地为变异型心绞痛或血管痉挛性心绞痛)、心力衰竭相关疾病(例如由于血管阻力和收缩)、心肌梗塞、肺动脉高压原发性高血压、动脉粥样硬化和主动脉僵硬及周围血管疾病如雷诺氏现象以及勃起功能障碍。癌细胞转移依赖于细胞迁移，一种由Rho家族成员GTPases Rho、Rac和Cdc42空间和暂时调控的复杂过程。尤其是，Rho效应子ROCK I和II与这些过程有关。例如，已经显示细胞膜起泡(membrane blebbing)由ROCK诱导并且变形虫样运动完全依赖于Rho与ROCK之间的相互作用。因此，抑制ROCK对治疗(转移)癌症(其中包括例如前列腺、乳腺、肺、结肠癌、成胶质细胞瘤、肉瘤性肿瘤、黑色素瘤)可以是有益的。
[0071] I.定义
[0072] 记忆系统可被广泛地分为四种主要类型：事件的、语义的、工作的和程序的(Hwang，D.Y.& Golby，A.J.Epilepsy Behav(2005)；Yancey，S.W.& Phelps，E.A.J Clin Exp Neuropsychol 23，32-48(2001))。事件记忆指记录和回忆关于在具体地点和时间所发生经历的自传性信息的系统。语义记忆系统贮存与地点和时间无关的普遍事实性知识(例如亚利桑那州的首府)。工作记忆包括暂时保持和使用信息，而程序记忆为自动并且通常为无意识地起作用的学习技能的作用。事件的、语义的和工作记忆在本质上为明确(绝对)的和陈述(解释)性的，而程序记忆可为或者明确的或者含蓄的，但总是非陈述性的(Tulving，E.Oxford University Press，New York，1983)；Budson，A.E.，Price，B.H.Encyclopedia of Life Sciences(生命科学百科全书)(Macmillan，Nature Publishing Group，London，2001)；Budson，A.E.& Price，B.H.N Engl J Med 352，692-9(2005)；Hwang，D.Y.& Golby，A.JEpilepsy Behav 8，115-26(2006))。
[0073] 损伤记忆的正常老化状态与疾病状态包括(但不限于)例如神经变性疾病、头和脑部创伤、遗传病、传染性疾病、炎性疾病、药物、毒品和酗酒过度、癌症、代谢紊乱、智力缺陷和学习与记忆障碍，例如年龄相关的记忆丧失和年龄相关的记忆损伤(AAMI)、阿尔茨海默氏病、tau蛋白病(tauopathies)、PTSD(创伤后应激综合征)、轻度认知损伤、ALS、亨廷顿氏舞蹈病、健忘症、B1缺乏、精神分裂症、抑郁和双相性精神障碍、中风、脑水肿、蛛网膜下腔出血、血管机能不全、脑肿瘤、癫痫、帕金森病、脑微血管病(Meyer，R.C.等.Ann N Y Acad Sci 854，307-17(1998)；Barrett，A.M.Postgrad Med 117，47-53(2005)；Petersen，R.C.J Intern Med 256，183-94(2004)；Calkins，M.E.等.Am J Psychiatry 162，1963-6(2005))、疼痛药物治疗、化学疗法(“化疗脑(chemobrain)”)；例如由人工心肺机、麻醉或几乎淹溺引起的缺氧；痴呆(血管、额颞叶、路易体、语义性、原发性进行性失语症、皮克病)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticobasal degeneration)、桥本氏脑病(Hashimoto encephalopathy)、ADD、ADHD、诵读困难及其它学习障碍、唐氏综合征、脆性X综合征、特纳氏综合征和胎儿醇中毒综合征。记忆缺乏(Memory deficits)也可作为外科手术，尤其是心脏外科和大血管手术的后遗症出现。除了疾病以外，进行性记忆丧失为老化过程的正常副产物。
[0074] 术语轻度认知损伤(MCI)用于指正常认知功能与发展临床上很可能发生的AD之间的过渡带(Winblad，B.等.J Intern Med 256，240-6(2004))。多种标准已经用于定义MIC，然而它们基本上具有两个主要思想：(1)MIC指具有一些形式可测量的认知缺陷的非痴呆患者和(2)这些患者呈现伴随发展为临床痴呆的高风险的临床综合征。
[0075] 短语“改善学习和/或记忆”指改善或增强至少一种表示学习和记忆的参数。改善或增强为参数变化达至少10％，任选地至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％，至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约100％，至少约150％，至少约200％等。学习和记忆的改善可通过本领域已知的任何方法测量。例如，在此描述的改善学习和记忆的化合物可采用Morris水迷宫筛选(参见例如材料和方法部分)。也参见Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：427-432(1996)、径向臂迷宫、物体识别、户外或Sacktor-盘等。记忆和学习也可采用在此描述的任何方法或本领域技术人员熟知的其它方法例如Randt记忆测验(Randt Memory Test)、韦氏记忆量表(Wechsler Memory Scale)、向前数字距离测验(Forward Digital Span test)或加利福尼亚语言学习测试(California Verbal Learning Test)筛选。
[0076] 术语“空间学习”指学习关于人的环境并要求什么物体在那里的认识。其也涉及学习和采用关于环境中多重线索之间关系的信息。通过使动物获悉奖赏的位置并采用用于回忆起这些位置的空间线索可试验动物的空间学习能力。例如，空间学习能力可采用径向臂迷宫(即记住哪一个臂具有食物)或Morris水迷宫(即记住平台在哪里)进行试验。为了实施这些工作，动物采用来自实验室的线索(物体的位置、气味等)。在人类中，也可测试空间学习能力。例如，患者可被要求画一幅图画，然后取走图画。然后要求患者根据记忆画一幅相同的图画。由患者画的后一幅图画反映了患者空间学习的程度。
[0077] 学习障碍为通用术语，指由获得和采用倾听、谈话、阅读、写作、推理或数学能力的显著困难显示的异种疾病组。学习障碍包括ADD、ADHD、诵读困难、书写困难、计算困难、运动障碍和信息加工障碍。
[0079] 如在此使用的术语“烷基”指具有所指示碳原子数的直形或分支的、饱和脂肪族基团。例如，C1-C6烷基包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基等。
[0080] 如在此使用的术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。
[0081] 如在此使用的术语“杂环”指具有5-8个环成员和2个氮杂原子的环系统。例如，用于本发明的杂环包括(但不限于)吡唑烷、咪唑烷、哌嗪和高哌嗪。本发明的杂环为N-连接的，意指通过其中一个环杂原子连接。
[0082] 如在此使用的术语“水合物”指与至少一个水分子结合的化合物。本发明的化合物可与1-10个水分子结合。
[0083] 某些本发明化合物可以非溶剂化形式及溶剂化形式，包括水合形式存在。通常，溶剂化形式与非溶剂化形式是等效的并且打算包括在本发明的范围内。某些本发明化合物可以多晶形或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本发明预期的用途是等效的并且打算处于本发明的范围内。
[0084] 如在此使用的术语“盐”指用于本发明方法的化合物的酸性盐或碱性盐。药学上可接受盐的示例性实例为无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、枸橼酸等)盐、季铵(碘甲烷、碘乙烷等)盐。应该理解药学上可接受的盐为非毒性的。关于合适的药学上可接受盐的另外信息可得自于雷明顿氏药剂学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第17版，Mack出版公司，Easton，Pa.，1985，其在此通过参照结合到本文中。
[0085] 本发明酸性化合物的药学上可接受的盐为用碱形成的盐，即阳离子盐例如碱和碱土金属盐，如钠、锂、钾、钙、镁，以及铵盐如铵、三甲铵、二乙铵和三-(羟甲基)-甲基铵盐。
[0087] 通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物可再生化合物的中性形式。化合物的母体形式在某些物理性能，例如于极性溶剂中的溶解度方面不同于各种盐形式，但是除此以外对于本发明的目的而言，盐等效于化合物的母体形式。
[0089] 如在此使用的术语“治疗有效量”或“治疗有效量或剂量”或“治疗足够量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”指对于所给予的对象产生治疗作用的剂量。精确剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员采用已知的技术确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms( 第 1-3 卷，1992)；Lloyd，The Art，Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams & Wilkins)。在敏化细胞中，治疗有效剂量通常可低于用于非敏化细胞的常规治疗有效剂量。
[0090] II.使用方法
[0091] 提供通过给予式I化合物、其盐、水合物和溶剂合物改善记忆和学习的方法。如在以下实施例中指明的那样，本发明的化合物用于增强记忆、改善神经可塑性和/或治疗阿尔茨海默氏病。化合物可例如口服、非肠道或鼻给药。对于长期给药，可采用较低剂量。本发明的化合物可与治疗疾病状态或改善学习与记忆的其它药物联合使用。另外，本发明化合物可用作特异性和有效的ROCK抑制剂。因此，它们适于治疗ROCK相关疾病，例如蛛网膜下腔出血后的血管痉挛。
[0092] 在一个方面，本发明化合物是尤其有效和高度特异性的ROCK抑制剂。化合物尤其对PIM激酶和对IRAK1激酶也显示抑制作用。
[0093] PIM激酶具有高的医学相关性。PIM激酶(Pim-1、-2和-3)为高度保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，属于CAMK(钙调蛋白依赖型蛋白激酶相关)族，其为与癌症有关的许多信号转导通路中的重要调节剂。Pim-1首先用c-myc鉴定为莫洛尼氏鼠(Moloney murine)白血病病毒诱导的T-细胞淋巴瘤中惯常的前病毒插入位点。当表达时，PIM激酶为强的生存因子(survival factors)并可诱导细胞周期发展，抑制细胞凋亡和调控其它信号转导通路。用于所有3种pim基因的敲除小鼠发育正常，但是由于实质上在所有组织中细胞数目减少而呈现减小的身体大小。Pim激酶有助于细胞增殖与存活两者，因此在肿瘤发生中提供选择性的有利条件。多种蛋白由Pim激酶，例如转录抑制因子(HP1)、激活剂如NFATc1和c-Myb、共激活因子(p100)以及细胞周期调节剂，如p21WAF1/CIP1、Cdc25A磷酸酶和激酶C-TAK1/MARK3/Par1A磷酸化。因此，PIM抑制剂可在表达PIM激酶的癌细胞中诱导细胞死亡并增进用其它靶向和化疗药物所治疗的癌细胞的敏感性。本发明化合物除了对ROCK的抑制作用以外，还对PIM激酶显示尤其特异性的抑制作用，因此本发明化合物作为单一药物以及与其它药物(例如本领域任何技术人员已知的化疗药物和方案，如甲磺酸伊马替尼、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硫唑嘌呤、巯嘌呤、多柔比星、表柔比星、博来霉素、更生霉素、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、鬼臼毒素、紫杉醇、伊立替康、拓扑替康、美法仑、白消安、卡培他滨及其组合)联合而具有广泛的治疗潜力。
[0094] 因为PIM激酶促进许多恶性肿瘤包括前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肝癌、胃腺癌、弥漫性大细胞淋巴瘤以及几种类型的白血病和其它血液恶性肿瘤，PIM激酶抑制用于治疗大多数恶性肿瘤。尤其是，抑制PIM激酶用于治疗白血病ALL、CLL、AML或CML，及霍奇金-和非霍奇金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和骨髓增生性疾病(Amaravadi等，J Clin Invest 2005，115，2618；Chiang等，Int J Oral Maxillofac Surg.2006，35，740；Dai 等 .Acta Pharmacol Sin.2005，26，364；Hu 等，J Clin Invest.2009，119，362；Popivanova等，Cancer Sci.2007，98，321；Reiser-Erkan等，Cancer Biol Ther.2008，7，1352；Shah等，Eu J Cancer 2008，44，2144；Tong等，Bioorg Med Chem Lett.2008，18，5206；Wang等，J Vet Sci.2001，2，167；Xia等，J Med Chem.2009，52，74；Zemskova等，J Biol Chem.2008，283，20635)。确实多项临床试验用靶向PIM激酶的化合物，例如SGI-1776引发。因此，对PIM激酶呈现尤其特异性抑制作用的本发明化合物为新的、具有高度吸引力和合乎需要的候选药物。特别的优点为所指定化合物的Pan-PIM活性和高度特异性。
[0095] 白细胞介素-1受体相关的激酶1(IRAK1)为在刺激时与白细胞介素-1受体(IL1R)结合的推定丝氨酸/苏氨酸激酶。该基因部分地负责IL1-诱导的转录因子NK-κB的上调。IRAK基因与多种疾病例如感染、动脉粥样硬化、脓毒病、自身免疫性疾病和癌症相联系。IRAKs涉及多重信号传导网络和各种组织与细胞例如脂肪细胞、肝细胞、肌细胞、内皮细胞和上皮细胞。可以理解，这些分子形成了用于设计各种人炎性疾病(如MS、炎性肠疾病、莱特尔氏病和类风湿性关节炎)的新的治疗策略的特定靶标。证据提示白细胞介素-1受体相关激酶-1(IRAK1)在toll样受体通路(TLR)和调节转录因子NK-κB中起十分重要的作用。已经发现人IRAK基因的变异与各种人炎性疾病相联系。在小鼠中缺失IRAK-1基因降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的风险(Deng等，J Immunol.2003，170，2833)。
另外，IRAK-1蛋白已经显示被结构性(constitutively)激活/sumoylated并位于人动脉粥样硬化患者白细胞的细胞核中(Huang等，J Biol Chem.2004，279，51697)。另外，基于人口的研究表明IRAK-1基因的基因变异与动脉粥样硬化的严重性和血清C反应性蛋白水平相关(Lakoski等，Exp Mol Pathol.2007，82，280)。
另外，IRAK-1蛋白已经显示被结构性(constitutively)激活/sumoylated并位于人动脉粥样硬化患者白细胞的细胞核中(Huang等，J Biol Chem.2004，279，51697)。另外，基于人口的研究表明IRAK-1基因的基因变异与动脉粥样硬化的严重性和血清C反应性蛋白水平相关(Lakoski等，Exp Mol Pathol.2007，82，280)。
[0096] 存在两种IRAK-1单倍体型，和罕见变异的单倍体型(～10％的人口)包含3种外显子单核苷酸多态性(SNPs)。含有变异IRAK-1基因的人往往具有更高的血清CRP水平并且对于糖尿病和高血压处于高风险中。IRAK-1基因变异也与脓毒病风险相联系。Arcaroli等证明了具有罕见变异IRAK-1单倍体型的脓毒病患者具有增加的中风发病率、对机械通气支持的延长需求和更大的60天死亡率(Arcaroli等，Am J Respir Crit Care Med.2006，173，1335)。
[0097] 白细胞介素受体相关激酶-M(IRAK-M)为NK-κB介导的Toll样受体(TLR)信号传导的负调节剂。负调节剂的功能突变可引起内毒素耐受性损害和炎性应答增加。TLR信号传导通路的负调节损伤可部分地作为炎性肠疾病(IBD)发展的原因。其中抑制IRAK可为有益的重要的其它疾病包括中风、脊髓损伤、脑创伤、格林-巴利综合征。尤其重要的是自身免疫性疾病以及与感染相联系的炎性病症。
[0099]
[0100] 在一个实施例中，化合物为1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0101] 在其它方面，提供用于在患者中治疗与选自CSNK1E、CSNK1A1L、CSNK1D、MERTK、SLK、IRAK1、STK10、MAPK12、PHKG2、MAPK11、MET、AXL、STK32B、AURKC、CLK3、RPS6KA6、PDGFRB、KDR、CDK2的激酶相关病症的方法，该方法包括给予有需要的患者治疗有效量的下式化合物：
[0102]
[0103] III.化合物
[0104] 本发明提供式I的化合物：
[0105]
[0106] 其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和卤素的成员。在一个实施方案中，R1选自氢和C1-6烷基。
[0107] R2为选自C1-6烷基、卤素、-C(O)-R4、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-C(O)N(R4)4 4 4 4 4 4 2
R、-N(R)-C(O)-R、-N(R)R 和-C(O)OR 的成员，同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位。
R、-N(R)-C(O)-R、-N(R)R 和-C(O)OR 的成员，同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位。
[0108] R3为选自氢和C1-6烷基的成员。
[0109] 每一个R4独立地为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员。
[0110] 下标n为0、1或2，优选地为1或2。
[0111] 在其中R1、R2、R3或R4为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，基团分别选自C1-3烷基、C1-3烷氧基和C1-3卤代烷基。
[0112] 式I化合物也可为其盐、水合物和溶剂合物。
[0113] 通常，式I化合物及其盐和水合物可采用很好建立的方法学并基于本领域技术人员的常识制备。这些例如在美国专利第4678783和5942505号及欧洲专利第187371号中有描述，其在此通过参照以其全部结合到本文中。用于本发明代表性化合物的更加特别的方法在下文详细描述。
[0114] 在一些实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和2
卤素的成员，例如为氢、卤素和C1-6烷基，并且在一些实施方案中为氢和C1-6烷基；R 为C1-6
2 3
烷基同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并
1 2 3 4
且n为0、1或2，例如为1或2。在这些实施方案中，当R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
卤素的成员，例如为氢、卤素和C1-6烷基，并且在一些实施方案中为氢和C1-6烷基；R 为C1-6
2 3
烷基同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并
1 2 3 4
且n为0、1或2，例如为1或2。在这些实施方案中，当R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0115] 在一个实施方案中，化合物具有下式：
[0116]
[0117] 一种示例性化合物为1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。用于合成化合物的一种图解说明的方法描绘于图1中。可类似地制备相关化合物。
[0118] 在其它的实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基2 2
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如为氢和C1-6烷基；R 为C1-6烷氧基同时R
3
位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1
1 2 3 4
或2，例如1或2。在其中R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。这样的化合物为尤其有效和高度特异性的ROCK抑制剂。因此，采用化合物作为ROCK抑制剂的方法也是本发明的实施方案。除了ROCK抑制作用外，该组化合物尤其是仅对PIM激酶和对IRAK1激酶显示抑制作用。因此，采用化合物作为PIM激酶和/或IRAK1激酶抑制剂的方法是本发明的另一个实施方案。
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如为氢和C1-6烷基；R 为C1-6烷氧基同时R
3
位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1
1 2 3 4
或2，例如1或2。在其中R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。这样的化合物为尤其有效和高度特异性的ROCK抑制剂。因此，采用化合物作为ROCK抑制剂的方法也是本发明的实施方案。除了ROCK抑制作用外，该组化合物尤其是仅对PIM激酶和对IRAK1激酶显示抑制作用。因此，采用化合物作为PIM激酶和/或IRAK1激酶抑制剂的方法是本发明的另一个实施方案。
[0119] 在一个实施方案中，化合物具有下式：
[0120]
[0121] 或具有下式：
[0122]
[0123] 本发明化合物尤其为有效的ROCK抑制剂。另外，本发明化合物具体地讲可抑制PIM和IRAK1激酶。因此，在一些实施方案中，本发明化合物可用于抑制ROCK或PIM激酶或IRAK1激酶。
[0124] 另一种示例性化合物为1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。一种合成化合物的方法描绘于图2中。可类似地制备相关化合物。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪为尤其有效和高度特异性的ROCK抑制剂。因此，采用该化合物作为ROCK抑制剂的方法也是本发明的实施方案。除了ROCK抑制作用外，该化合物尤其是对PIM激酶和对IRAK1激酶显示选择性的抑制作用。因此，采用该化合物作为PIM激酶和/或IRAK1激酶抑制剂的方法是本发明的另一个实施方案。1
[0125] 在一些实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R 为选自氢、C1-6烷基、羟基和2 4 4
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)-R，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 3 4
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。在其中R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)-R，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 3 4
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。在其中R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0126] 在一个实施方案中，化合物具有下式：
[0127]
[0128] 或具有下式：
[0129]
[0130] 另一种示例性化合物为1-(1-羟基-8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪或1-(8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。一种化合物的示例性合成描述于图3中。可类似地制备相关化合物。
[0131] 在其它的实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基2 4 4
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)-N(R)R，其中
4 2
R 为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例
3 1 3
如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。在其中R、R
4
或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)-N(R)R，其中
4 2
R 为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例
3 1 3
如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。在其中R、R
4
或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基的一些实施方案中，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0132] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0133]
[0134] 另一种示例性化合物为1-(1-甲基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪或1-(1-乙基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。一种示例性的合成描述于图5中。
可类似地制备相关化合物。
可类似地制备相关化合物。
[0135] 在其它的实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基2 4 4
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-N(R)-C(O)-R，其中
4 2
R 为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例
3 1 3
如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。当例如R、R
4
或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-N(R)-C(O)-R，其中
4 2
R 为选自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例
3 1 3
如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。当例如R、R
4
或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0136] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0137]
[0138] 或具有下式：
[0139]
[0140] 示例性的合成途径在图7、图8和图9中描述。可类似地制备相关化合物。另一种示例性化合物为1-(8-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0141] 在一些实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和2 4 4 4
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-N(R)-R，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 3 4
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。当例如R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-N(R)-R，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 3 4
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。当例如R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0142] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0143]
[0144] 或具有下式：
[0145]
[0146] 一种示例性化合物为1-(8-甲基氨基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪。一种合成途径在图10中描绘。可类似地制备相关化合物。
[0147] 在其它的实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R2为卤素，优选地为氯，同时R2位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R3为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，例如为1或2。当例如R1、R3或R4为烷基、烷氧基或卤代烷基时，基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0148] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0149]
[0150] 或具有下式：
[0151] 在其它的实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基2
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为C1-6卤代烷基，同时
2 3
R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、
1 2 3 4
1或2，例如为1或2。当例如R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
和卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为C1-6卤代烷基，同时
2 3
R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、
1 2 3 4
1或2，例如为1或2。当例如R、R、R 或R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0152] 在一些实施方案中，化合物具有下式：
[0153]
[0154] 另一种示例性化合物为1-(1-甲基-8-三氟甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪。一种示例性的合成流程在图11中描述。可类似地制备相关化合物。
[0155] 在一些实施方案中，本发明的化合物具有式I，其中R1为选自氢、C1-6烷基、羟基和2 4 4
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)OR，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 2 3
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，优选地为1或2。当例如R、R、R 或
4
R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
卤素的成员，例如选自氢、卤素和C1-6烷基，例如氢和C1-6烷基；R 为-C(O)OR，其中R 为选
2
自氢、C1-6烷基和C3-8环烷基的成员，并且同时R 位于异喹啉部分的6、7或8位，例如在8
3 1 2 3
位；R 为选自氢和C1-6烷基的成员；并且n为0、1或2，优选地为1或2。当例如R、R、R 或
4
R 为烷基、烷氧基或卤代烷基时，所述基团分别为C1-3烷基、C1-3烷氧基或C1-3卤代烷基。
[0156] IV.用于改善记忆和学习的制剂
[0157] 本发明化合物可以多种本领域技术人员已知的不同方式配制。药学上可接受的载体部分地根据所给予的具体化合物以及根据用于给予组合物的具体方法确定。因此，存在广泛种类的本发明药用组合物的合适制剂(参见例如雷明顿氏药物学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第20版，2003，前述)。有效的制剂包括口服和鼻制剂、用于非肠道给药的制剂和配制的具有持续释放的组合物。
[0158] 适合于口服给药的制剂可包括(a)液体溶液剂，例如悬浮于稀释剂如水、盐水或PEG 400中的有效量的本发明化合物；(b)胶囊剂、小药囊、贮库制剂或片剂，各自包含预定量的活性组分作为液体、固体、颗粒或明胶；(c)在合适液体中的混悬剂；(d)合适的乳剂；和(e)贴剂。药用形式可包含乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸及其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂、染料、崩解剂以及药学上适配载体中的一种或多种。锭剂形式可包含在矫味剂例如蔗糖中的活性组分，同样软锭剂包含在惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯乳剂、凝胶等中的活性组分，以及除活性组分外，还包含本领域已知的载体。
[0159] 药用制剂优选地为单位剂型。在这样的形式中制剂被细分为包含合适量活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂，包装包含离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和在小瓶或安瓿中的粉剂。而且，单位剂型可为胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者其可为以包装形式存在的合适数目的任何这些剂型。如果要求的话，组合物也可包含其它可适配的治疗药物。优选的药用制剂可以缓释制剂的形式传递本发明化合物。
[0160] 用于本发明的药用制剂也包括持续释放制剂。在一些实施方案中，用于本发明的持续释放制剂描述于美国专利第6699508号中，其可按照美国专利第7125567号制备，两专利在此通过参照结合到本文中。
[0161] 药用制剂一般地被传递给哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。采用本发明方法治疗的非人哺乳动物包括驯养动物(即犬、猫、鼠科动物、啮齿动物和兔类(lagomorpha))和农业动物(牛、马、羊、猪)。
[0162] 在实践本发明的方法中，药用组合物可单独使用或者与其它治疗剂或诊断剂联合使用。
[0163] V.用于改善记忆与学习的给药
[0164] 本发明的化合物可在必要时频繁给药，包括每小时一次、每天一次、每周一次或每月一次。在本发明给药方法中采用的化合物以约0.0001mg/kg-约1000mg/kg每天的起始剂量给药。可采用约0.01mg/kg-约500mg/kg，或约0.1mg/kg-约200mg/kg，或约1mg/kg-约100mg/kg，或约10mg/kg-约50mg/kg的每天剂量范围。然而，剂量可依患者的要求、所治疗病症的严重性和所采用的化合物而变化。例如，剂量可考虑到在具体患者中诊断的疾病类型和阶段凭经验确定。在本发明的情况下，所给予患者的剂量应随着时间的推移足以在患者中产生有益的治疗应答。剂量大小也应根据伴随在具体患者给予特定化合物发生的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。对于具体情况确定适当的剂量处于开业医生的技术范围内。通常，治疗用其小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。之后，剂量以小的增幅增加直到在这些情况下达到最佳效果。如果要求的话，为了方便起见，总每天剂量可被分割并在一天当中分批给药。剂量可如治疗医生确定的那样每天或间隔多天给予。剂量也可基于常规或连续的基准经较长的时间段(数周、数月或数年)，例如通过使用皮下胶囊、香囊或贮库制剂、埋置的微型泵或经贴剂给予。
[0165] 药用组合物可以多种方法，包括局部、非肠道、静脉内、皮内、皮下、肌内、结肠、直肠或腹膜内给予患者。优选地，药用组合物经非肠道、局部、静脉内、肌内、皮下、口服或鼻内例如经吸入给药。
[0166] 在实践本发明的方法中，药用组合物可单独使用，或者与其他治疗剂或诊断剂联合使用。用于本发明联合方法的另外药物可分开给药或者用于联合方法的一种或更多种药物可例如以混合物的形式一起给药。当一种或更多种药物分开给药时，每一种药物的给药时间安排和日程表可以变化。其它的治疗剂或诊断剂可与本发明化合物同时、分开或者在不同时间给予。VI.实施例
[0167] 实施例1：1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0168] 按照图1制备1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。使20g 2-甲基苯甲醛和17.5g氨基乙醛缩二甲醇溶于200ml甲苯中并采用回流冷凝器沸腾3小时。除去溶剂并使残余物溶于120ml干燥THF中。在0℃下滴加15.9ml氯甲酸乙酯并接着在0℃下搅拌5分钟。在温热至环境温度后，滴加19.6ml亚磷酸三甲酯，接着搅拌过夜。蒸除溶剂并用甲苯浓缩残余物两次以除去残余的磷酸三甲酯。使油状残余物在氩气氛下溶于200ml干燥的二氯甲烷中。接着，小心加入110ml四氯化钛。采用回流冷凝器使溶液沸腾过夜并随后小心地倾入到冰中。采用10％氢氧化钠溶液将pH值调节至8。用500ml二氯甲烷提取水相三次并用水和饱和氯化钠溶液洗涤合并的有机相，随后经硫酸钠干燥并浓缩，得到11.8g为黄色油的8-甲基-异喹啉。得量为11.8g为黄色油的8-甲基-5-异喹啉。
[0169] 使7.3g的8-甲基-5-异喹啉溶于50ml冰冷的硫酸中，随后在进一步冷却下加入50ml发烟硫酸。于80℃下搅拌3小时后，将溶液倾入到冰水上并过滤沉淀，使悬浮于乙醚中，再次过滤，用乙醚洗涤并真空干燥，得到7.4g为棕色固体的8-甲基-5-异喹啉-磺酸。
[0170] 使1g的8-甲基-5-异喹啉-磺酸悬浮于10ml亚硫酰氯中。在加入0.1ml DMF后，采用回流冷凝器加热溶液5小时。真空除去溶剂并用二氯甲烷浓缩油状残余物两次。使固体残余物悬浮于10ml二氯甲烷中，过滤并用二氯甲烷洗涤，得到354mg黄色固体。使固体物质悬浮于10ml冰水中并用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至pH 6-7。在用5ml二氯甲烷提取后，经硫酸镁干燥有机相并在0℃下滴加到352mg高哌嗪于5ml二氯甲烷的溶液中。在0℃下搅拌1小时和在环境温度下搅拌3小时后，用10ml水洗涤溶液两次，经硫酸镁干燥并浓缩。经层析法纯化生成的油并在水-丙酮混合物中分配。这样得到240mg为固体物质的1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0171] 实施例2：1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0172] 按照图1制备1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。使18.5g 2-甲氧基苯甲醛和14g氨基乙醛缩二甲醇溶于180ml甲苯中并采用分水器加热3小时。除去溶剂并使残余物溶于105ml干燥THF中。在-10℃下滴加10.3ml氯甲酸乙酯。在环境温度下加入20.6ml亚磷酸三甲酯。在搅拌20小时后，蒸除溶剂并用50ml甲苯浓缩残余物三次。使油状残余物在氩气氛下溶于180ml干燥的二氯甲烷中。小心地加入90ml四氯化钛并采用回流冷凝器加热溶液24小时。将溶液倾入到700g冰和340ml浓氨溶液中。过滤沉淀并用1升二氯甲烷提取。合并提取液和滤液并用1N盐酸提取三次。用100ml二氯甲烷洗涤合并的水相并用浓氨溶液将pH值调节至10。用350ml二氯甲烷提取水相三次。经硫酸钠干燥合并的有机相并除去溶剂，得到14.5g为棕色油的8-甲氧基-异喹啉。
[0173] 使12g油溶于50ml乙酸中并滴加12ml 30％H2O2。于70℃下搅拌3小时后，加入另外12ml 30％H2O2溶液并于70℃下搅拌另外9小时。在环境温度下加入150ml饱和碳酸钠溶液。用250ml二氯甲烷提取水相三次并经硫酸镁干燥合并的有机相。除去溶剂并经层析法纯化残余物，得到8.5g为黄色固体的8-甲氧基-异喹啉-N-氧化物。
[0174] 使3.8g的8-甲氧基-异喹啉-N-氧化物在氩气氛下溶于57ml磷酰氯中并采用回流冷凝器加热3小时。真空蒸除溶剂并使残余物溶于冷的饱和碳酸钠溶液中。用100ml二氯甲烷提取水相三次并用50ml水洗涤合并的有机相，接着经硫酸钠干燥。除去溶剂并经层析法纯化残余物，得到1.1g 1-氯-8-甲氧基-异喹啉。
[0175] 使800mg的1-氯-8-甲氧基-异喹啉溶于5ml冰冷的硫酸中，随后在进一步冷却下滴加5ml发烟硫酸。于100℃下搅拌2小时后，将溶液倾入到冰水中并过滤沉淀，用冷水洗涤并真空干燥，得到1g为固体的1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酸。
[0176] 使1.35g的1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酸悬浮于10ml亚硫酰氯中。在加入0.1ml DMF后，采用回流冷凝器加热该溶液2小时并搅拌过夜。真空除去溶剂并用二氯甲烷浓缩油状残余物两次。使残余物悬浮于10ml二氯甲烷中，过滤并用二氯甲烷洗涤。使生成的黄色产物618mg悬浮于10ml冰水中并用饱和碳酸氢钠溶液将pH值调节至pH 7。在用
5ml二氯甲烷提取后，经硫酸镁干燥有机相并于0℃下滴加入到508mg高哌嗪在5ml二氯甲烷中的溶液中。于0℃下搅拌2小时和于环境温度下搅拌3小时后，用20ml水洗涤溶液，经硫酸镁干燥并浓缩。经层析法纯化残余物并再次悬浮于二氯甲烷与丙酮的1∶1的50ml混合物中。于4℃下温育过夜后，过滤沉淀并真空干燥。这样得到147mg 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪固体。
5ml二氯甲烷提取后，经硫酸镁干燥有机相并于0℃下滴加入到508mg高哌嗪在5ml二氯甲烷中的溶液中。于0℃下搅拌2小时和于环境温度下搅拌3小时后，用20ml水洗涤溶液，经硫酸镁干燥并浓缩。经层析法纯化残余物并再次悬浮于二氯甲烷与丙酮的1∶1的50ml混合物中。于4℃下温育过夜后，过滤沉淀并真空干燥。这样得到147mg 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪固体。
[0177] 实施例3：1-(1-羟基-8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0178] 按照在图3中显示的合成方法制备1-(1-羟基-8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(8-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0179] 实施例4：1-(1-羟基-7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0180] 按照在图4中显示的合成方法制备1-(1-羟基-7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(7-乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0181] 实施例5：1-(1-甲基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0182] 按照在图5中显示的合成方法制备1-(1-甲基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-8-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0183] 实施例6：1-(1-甲基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0184] 按照在图6中显示的合成方法制备1-(1-甲基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-乙基-7-甲酰胺-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0185] 实施例7：1-(8-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0186] 按照在图7中显示的合成方法制备1-(8-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0187] 实施例8：1-(6-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0188] 按照在图8中显示的合成方法制备1-(6-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0189] 实施例9：1-(7-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的制备
[0190] 按照在图9中显示的合成方法制备1-(7-氨基乙酰基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪。
[0191] 实施例10：1-(8-氨基甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪的制备
[0192] 按照在图10中显示的合成方法制备1-(8-氨基甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪。
[0193] 实施例11：1-(1-甲基-8-三氟甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪的制备[0194] 按照在图11中显示的合成方法制备1-(1-甲基-8-三氟甲基-5-异喹啉-磺酰基)-2-甲基-哌嗪。
[0195] 实施例12：法舒地尔衍生物的ROCK抑制作用
[0196] 采用重组活性rho激酶2(Upstate，Lake Placid，NY，USA)和ROCK检验试剂盒(Cell Biolabs公司，圣地亚哥，CA，USA)，按照制造商的说明书分析试验化合物对rho激酶2(ROCK)的抑制作用。使重组rho激酶2溶解于在试验化合物存在下的含有激酶底物的激酶反应缓冲液中。以最终浓度为0.1至100μM加入试验化合物。不含试验化合物的试验用作对照。法舒地尔用作ROCK抑制作用的阳性对照。在30℃下将试验液温育30-60分钟并随后通过加入50％反应体积的0.5MEDTA，pH 8.0终止。在冲洗步骤后，采用特异性抗磷酸化MYPT1(Thr696)抗体和HRP偶联的二次抗体(secondary antibody)定量磷酸化激酶底物。
[0197] 图12显示取决于法舒地尔(阳性对照)或者化合物1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲基-法舒地尔”)或1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲氧基-法舒地尔”)的存在下测量的rho激酶2活性。试验化合物，特别是1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，显示在相应浓度下与法舒地尔相比较可增强ROCK抑制作用。
[0198] 实施例13：激酶特异性分析
[0199] 基于定量测量试验化合物与固定化活性位点导向配体竞争能力的竞争性结合试验，可以观察试验化合物对平行的广谱激酶的竞争性作用(KinomeScan，Ambit，圣地亚哥，CA，USA；Fabian等，Nat Biotechnol.2005，23，329)。根据该分析可以评价试验化合物的抑制特异性。各自在10μM浓度下用化合物1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪与已知的ROCK抑制剂法舒地尔比较实施试验。作为试验结果，可以得到活性位点导向配体对试验中超过400种激酶中的每一种由于与试验化合物一同温育所致的竞争百分比。大于50％的竞争作用被视为明显，说明对特定激酶具有抑制作用。
[0200] 如同在图13A中显示的那样，1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪为比法舒地尔更具特异性的ROCK抑制剂。与之相比较，1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪与法舒地尔相比较具有更广泛的激酶相互作用谱，但对ROCK2比法舒地尔具有更强的亲和力。这与对该类型激酶具有相当高的抑制活性是等价的。图13B列出了既不受法舒地尔也不受1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪抑制的激酶，而在该分析中大于50％的竞争被看作是抑制的。
[0201] 该试验揭示了1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪作为非常特异性的ROCK抑制剂被期待呈现减少的副作用。除了其ROCK抑制作用以外，1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪主要仅对PIM激酶和IRAK1呈现抑制作用。图14显示法舒地尔、1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪针对ROCK相关激酶的激酶活性位点结合的比较。分层群聚法表示对多种激酶之间的关系的测量。
[0202] 实施例14：神经突生长分析
[0203] 试验化合物对神经突生长的作用可在体外评价。在富含B27、bFGF、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺的神经基础培养基(Neurobasal medium)(Invitrogen)中培养自胚胎(E18)大鼠制备的海马原代神经元。为了神经突生长试验，将培养液与条件培养基按1∶1比例混合。采用抗轴突标记物神经丝轻链的抗体对神经突进行免疫细胞化学染色。在40倍放大率(Olympus IX81)下获得图象并且组合成象，以分析全部各神经元。铺板1小时后，向培养基加入最终浓度为1.5μM或者15μM的试验化合物1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪，与加入水作为阴性对照进行比较。相应浓度下的法舒地尔作为阳性对照。2天后固定培养中的细胞。以双盲方式呈现图象和神经突示踪。图15显示1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲基-法舒地尔”)与阴性对照和与法舒地尔相比较的神经突生长促进活性。1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪呈现优良的神经突生长促进活性。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪(“甲氧基-法舒度尔”)不能显著促进神经突生长。
[0204] 实施例15：体外LTP分析
[0205] 长时程增强效应(LTP)为一种用于评价记忆功能的体外模型。因此，其使得能够分析试验化合物，例如本发明的化合物，如1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的记忆增强潜力。在得自3-4周龄的Wistar大鼠体内的海马切片上进行实验。未经预先麻醉经断头术处死大鼠。迅速摘除大脑并浸泡在冰冷的包含以下物质的人工脑脊液(ACSF)中：NaCl(124mM)、KCl(5mM)、Na2HPO4(1.2mM)、NaHCO3(26mM)、CaCl2(2mM)、MgSO4(2mM)和葡萄糖(10mM)，其用碳合氧(carbogen)(95％O2，5％CO2)持续鼓泡。然后采用振动切片机把切片切割成400μm厚度并在开始记录前于室温下在ACSF中温育至少1小时。在需要的浓度下，以ACSF稀释所有使用的化合物并在记录之日自100mM储备液新鲜制备。为了确保化合物的合适溶解度，用DMSO制备储备液。为了记录，把切片移至4通道切片槽(Synchroslice，Lohmann Research Equipment)中，使得可同时记录4片脑切片。把每一个切片放置在分开的潜水型切片槽中，使之用控制温度的(34℃)ACSF或者在2ml/分钟速率下的ACSF连续不断地泼液(superfused)于其上。在摄影机系统的直观观察控制下，把双极刺激电极(Rhoades)放入Schaffer侧枝(collaterals)并且单次双相电刺激持续200μs和在0.05Hz下应用200μA的振幅。然后在直观控制下把铂/钨电极放入到CA1树状层中，直到获得记录的fEPSP的稳定振幅。在记录至少10分钟期间后，分别获得每一个切片的刺激振幅和fEPSP振幅之间的输入-输出关系。为了记录，每一个切片的刺激振幅被各自选择，以使所产生的fEPSP自IO曲线显示最大振幅的50％。为了诱导LTP，应用10θ短阵快速脉冲。每一个短阵快速脉冲由200ms持续时间的4次双相刺激和10ms刺激间时距的600μA振幅组成。短阵快速脉冲间的间隔(interburst interval)为200ms。每一个记录周期开始15分钟期间，其中在0.05Hz下应用电刺激以确保fEPSP振幅的稳定性。然后，冲洗试验化合物30分钟的间期，在此期间刺激在0.05Hz下持续进行并连续记录fEPSPs。在冲洗30分钟后开始通过θ短阵快速脉冲刺激诱导LTP。在LTP诱导后连续记录至少60分钟，LTP诱导30分钟后，洗去化合物。用相同的时间表处理同时记录的所有切片。自所记录的数据，通过记录软件(Synchroslice数据采集与分析，LRE)自动计算相对于基线作为突触后信号传导负峰的激发的fEPSP振幅并且在线作图。所有记录的信号被数字化贮存用于以后的离线分析，特别是用于fEPSP负斜率计算。自所储存的单扫描，计算介于最大fEPSP振幅30％-70％之间的斜率。为了能够比较自不同切片获得的数据，fEPSP斜率被归一化为对照值(100％)。
[0206] 采用或者Student’s t检验或者曼-怀氏(Mann-Whitney)秩和检验，检验被所应用物质诱导的效应的统计学显著性，若p＜0.05即假定有显著性。对每一种实验条件的测量重复6次。作为n＝5薄片平均值和标准差(SD)给出结果。与空白温育薄片(作为阴性对照)和法舒地尔温育薄片(作为阳性对照)相比较，分析1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪的作用。在三种浓度下试验1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪和1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺
酰基)高哌嗪(1μM、10μM和100μM)并且与10μM法舒地尔相比较。在图16中显示记录的结果(A.阴性对照；B：10μM法舒地尔；C：1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；D：10μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；E：100μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；F：1μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)；G：
10μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)；H：100μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪在
1μM下显示比法舒地尔清晰优良的LTP刺激作用(图17)。在10μM浓度下，LTP诱导未改变但维持似乎被损害。这可能是由于在该浓度下激活了不合乎需要的激酶和/或途径。
在100μM下，LTP诱导被完全阻断。在移除物质后，存在突触活性的明显反弹。人们可以假设，LTP自身机制似乎是在低浓度下诱导的，但是通过未知的第二种效应，由于高浓度，使LTP被遮蔽。在移除后，膜电位迅速变化，这导致所观察到的补偿效应。在1μM浓度下
1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪阻断LTP，但在最高浓度(100μM)下LTP诱导能力被重新建立。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪显示显著增强LTP，因此为记忆增强的优良候选者。
酰基)高哌嗪(1μM、10μM和100μM)并且与10μM法舒地尔相比较。在图16中显示记录的结果(A.阴性对照；B：10μM法舒地尔；C：1μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；D：10μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；E：100μM 1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪；F：1μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)；G：
10μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)；H：100μM 1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪)。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪在
1μM下显示比法舒地尔清晰优良的LTP刺激作用(图17)。在10μM浓度下，LTP诱导未改变但维持似乎被损害。这可能是由于在该浓度下激活了不合乎需要的激酶和/或途径。
在100μM下，LTP诱导被完全阻断。在移除物质后，存在突触活性的明显反弹。人们可以假设，LTP自身机制似乎是在低浓度下诱导的，但是通过未知的第二种效应，由于高浓度，使LTP被遮蔽。在移除后，膜电位迅速变化，这导致所观察到的补偿效应。在1μM浓度下
1-(8-甲基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪阻断LTP，但在最高浓度(100μM)下LTP诱导能力被重新建立。1-(1-氯-8-甲氧基-5-异喹啉-磺酰基)高哌嗪显示显著增强LTP，因此为记忆增强的优良候选者。
[0207] 实施例16：体内记忆评价
[0208] 大鼠是临床前评价年龄相关认知损害的标准试验体系之一。通过微量渗透泵持续皮下给予试验化合物确保了稳定的血浆浓度，因此慢性应用是最佳的。为了具有一个研究年龄相关记忆损害的模型，采用17月龄大鼠。或者采用转基因痴呆建模动物(例如阿尔兹海默氏病)。按照它们的治疗把动物分组，一组仅接受媒介物作为对照。每组大小介于15-20只动物，依据所研究组的数量提供合适的统计功效(statistical power)。对于两组之间的比较，采用t检验统计学方法，对于两组以上之间的比较，应用多重检验校正的ANOVA。P值0.05被视为统计学上具有显著性。实验以双盲方式进行，包括计算机生成的探测随机化和探针标记，治疗组的所有实验双盲性完全相同直到实验结束，并且数据分析与实验实施相互隔离。开始实验前使动物适应环境1周。特别小心使动物在试验以及光暗期间可以获得足够的食物和水。在开始实验的前一天，植入含有试验化合物或媒介物的微量渗透泵。通过多种试验体内测试本发明化合物的记忆增强能力。特别合适的体内试验在下文详细描述。
[0209] 八臂迷宫：术后第一天使大鼠在径向臂迷宫(radial arm maze)中适应4天。适应期后在径向臂迷宫中采用四个以食物小球随机放饵的臂和四个未放饵的臂测试动物14天。跑向未放饵的臂的运动被认为参照记忆错误，重复进入相同的臂以及重复进入先前访问过的放饵的臂被认为工作记忆错误。当进入所有放饵的臂或者达到480秒的时间限制即结束运动。
[0210] Sacktor盘：该试验开始为适应环境试验，其中动物在没有电击下暴露于装置10分钟。随后开始连续训练试验，其中每次动物运动进入电击区时要接受电击。训练包括8个10分钟的训练试验，在其鼠笼中通过10分钟的休息间隔分开。然后在单次探测试验后测试动物24小时。探测试验通过增加动物放入装置与初次进入电击区之间的时间测量所长期储存空间信息的保留时间。另外，通过减少在电击区内消耗的时间测试短期和长期储存的信息两者的保留时间(单次训练一段时间后迅速表达)。
[0211] Morris水迷宫(MWM)：第一天首先进行可视平台试验。通过帘子隐藏迷宫外线索并把平台与可视标记放置在MWM的第一象限。把动物放置到相对的象限并游泳直到它在最大时间60秒内发现平台。若它到达平台，就把动物从水中移出，在每一次试验之间使它在自己的笼内休息30秒。用放置在4个象限中的每一个的可视平台进行四次试验。这提供了关于动物的感觉运动和动机(motivational)特征参数、到达平台的潜伏期、运动到达平台的速度和距离。
[0212] 第二天训练动物。在配备有可视迷宫外线索的池中，把它放置到靠近池壁的4个随机指定的开始位置之一。动物被假定游至在固定位置浸没的平台。如果在60秒内它没有找到平台，就把它在平台上放置60秒。如果在60秒内它找到平台，就让它在那里停留60秒。每一次试验后就变动开始位置。用每天至少四次试验训练动物找到隐藏的平台。训练动物多日直到动物可在15秒内达到平台。这提供了关于学习能力和运动行为表现、逃逸潜伏期、游泳速度和游泳距离的参数。训练几个时期后进行探测试验。撤除平台，把动物放入池中的对面象限，然后把平台正规地定位并使动物游泳60秒，然后从池中移出。这提供了MWM象限的时间百分比参数、穿越支撑平台位置的次数、游泳时间、游泳路途长度、与墙壁平行的游泳、触壁次数和游泳速度。
[0213] 实施例17：测试PIM抑制对癌症治疗的有效性
[0214] 采用本领域的标准方法可体外评价PIM激酶活性。体外试验例如为市场上可得到的(例如得自Cellsignal的HTScan Pim-1激酶试验试剂盒#7573或者得自Abnova的Pim-1激酶试验/抑制剂筛选试剂盒)。通常，用对应于含可被Pim-1有效
磷酸化的苏氨酸残基的蛋白激酶靶标的蛋白或者肽底物涂覆板。抗体检测器仅特异性检测苏氨酸的磷酸化形式，并且通过颜色反应检测。或者，可采用放射方法例如通过采
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用在γ位具有 P的ATP，并且通过暴露于敏感性筛选可监测靶肽的磷酸化(例如富士磷光影像分析仪(phosphoimager))。通过在结合试验中对大量激酶的筛选可测试激酶抑制的特异性(例如Fabian，M.A.等.对临床上激酶抑制剂的小分子-激酶相互作用谱(A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors).Nat.Biotechnol.23，329-336(2005)；Karaman，M.W.等.激酶抑制剂选择性的定量分析(A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity).Nat.Biotechnol.26，
127-132(2008)，其在此通过参照结合到本文中)。可试验细胞培养液中PIM抑制剂对未死亡的癌细胞系，例如HeLa细胞系和多种其他细胞系增殖的效力。通过在显微镜下计算随着时间推移的细胞密度或者通过多种生化试验可测量增殖。在软琼脂试验中，再次使用大量的癌细胞系可评价细胞的侵袭和扩散。通过试验胱天蛋白酶3表达可测试在所述癌细胞中的诱导细胞凋亡(例如通过Promega胱天蛋白酶发光试验)。通过例如在免疫抑制后把癌细胞系移植到动物体内，并且例如通过报告基因如荧光素酶监测这些肿瘤的生长，并且采用寿命单光子成像箱生物成像，或者采用象核磁共振成像(MRI)或者显微CT等放射学试验，可试验体内抗癌活性。这些动物死亡后也可评价肿瘤的体积。通常实验在两组动物体内进行，一组接受安慰剂，另一组接受药物。样本大小一般为每组20只。在这些动物也可监测预期生命期限和死亡率，并且提供有临床意义的终点。一般地，体内试验大范围的浓度和应用模式以发现最佳剂量范围。
磷酸化的苏氨酸残基的蛋白激酶靶标的蛋白或者肽底物涂覆板。抗体检测器仅特异性检测苏氨酸的磷酸化形式，并且通过颜色反应检测。或者，可采用放射方法例如通过采
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用在γ位具有 P的ATP，并且通过暴露于敏感性筛选可监测靶肽的磷酸化(例如富士磷光影像分析仪(phosphoimager))。通过在结合试验中对大量激酶的筛选可测试激酶抑制的特异性(例如Fabian，M.A.等.对临床上激酶抑制剂的小分子-激酶相互作用谱(A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors).Nat.Biotechnol.23，329-336(2005)；Karaman，M.W.等.激酶抑制剂选择性的定量分析(A quantitative analysis of kinase inhibitor selectivity).Nat.Biotechnol.26，
127-132(2008)，其在此通过参照结合到本文中)。可试验细胞培养液中PIM抑制剂对未死亡的癌细胞系，例如HeLa细胞系和多种其他细胞系增殖的效力。通过在显微镜下计算随着时间推移的细胞密度或者通过多种生化试验可测量增殖。在软琼脂试验中，再次使用大量的癌细胞系可评价细胞的侵袭和扩散。通过试验胱天蛋白酶3表达可测试在所述癌细胞中的诱导细胞凋亡(例如通过Promega胱天蛋白酶发光试验)。通过例如在免疫抑制后把癌细胞系移植到动物体内，并且例如通过报告基因如荧光素酶监测这些肿瘤的生长，并且采用寿命单光子成像箱生物成像，或者采用象核磁共振成像(MRI)或者显微CT等放射学试验，可试验体内抗癌活性。这些动物死亡后也可评价肿瘤的体积。通常实验在两组动物体内进行，一组接受安慰剂，另一组接受药物。样本大小一般为每组20只。在这些动物也可监测预期生命期限和死亡率，并且提供有临床意义的终点。一般地，体内试验大范围的浓度和应用模式以发现最佳剂量范围。
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