技术领域
[0001] 本
发明涉及基因工程和
生物医药领域，更具体涉及精神分裂症的生物标志物及其应用。
背景技术
[0002] 精神分裂症是一种常见的重型精神
疾病，其终身患病率是0.16-1.21％，伴有年龄和性别的差异。多起病于青壮年，常有
感知、思维、情感和行为等多方面的障碍和精神活动与环境方面的不协调，病程多迁延，一般无智能障碍。精神分裂症患者约占我国住院
精神病人的一半左右。该病对患者的身心健康造成了严重影响，也带来严重的社会负担，造成巨大的经济社会压
力，所造成的医疗
费用也是巨大的。
[0003] 精神分裂症病因目前依然不清楚，但是有越来越多地证据认为其是
神经发育障碍，在中枢神经系统发展的关键时期遭受多重打击后导致了精神分裂症的发生。根据全基因组关联研究表明，单核苷酸多态性(SNP)与精神分裂症存在弱关联，而在GWAS研究中发现，免疫相关基因与精神分裂症之间的相关性是最强的。临床研究的结果也与之一致，精神分裂症患者免疫功能是增强的，且患者处于
炎症状态。有大量研究亦发现精神分裂症患者存在肠道炎症和肠道
微生物的紊乱。而在肠道微生物的研究中发现，肠道细菌可以影响各种神经营养因子的表达，这些神经营养因子均可影响脑部的神经发育及其可塑性，如：脑源性神经营养因子(BDNF)，突触素，PSD-95等。
[0004] 近年来，在精神疾病的研究中微生物肠脑轴已成为了一个重要的话题。肠脑轴可通过神经、
激素、免疫等途径将中枢神经系统与肠道微生物连接起来，构建出一个双向的通讯系统。肠道微生物可通过免疫系统，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，色
氨酸代谢，细菌代谢产物的产生以及通过迷走神经等途径发挥调节作用，这是目前较为公认的几种作用机制。有研究显示，在
自闭症、抑郁、阿尔兹海默、
进食障碍等精神疾病中肠脑轴在其发病过程中发挥着重要作用。
[0005] 精神分裂症的发生与肠道菌群之间也存在着某种联系。肠道微生物的结构成分可通过Toll-likereceptors(TLRs)的介导来促进神经免疫系统的发育。不同的TLRs可识别特定的细菌结构，被活化的TLRs可诱导促炎症反应的发生并产生抗炎性因子。这些炎性因子亦可从多种途径对大脑产生影响。在无菌的小鼠的海
马体及皮层中可发现BDNF和NMDA受体2A亚基表达的下降。拮抗NMDA受体功能可出现精神分裂症样症状，而激活NMDA受体可以改善精神分裂症患者
阴性症状和
认知症状。在Severanceetal.2012年的研究中发现，在急性和慢性精神分裂症患者中用于研究菌群移位的酿酒
酵母抗体水平是升高的。在2013年的研究中再次发现另一个用于研究菌群移位的标记物——可溶性CD14，也在精神分裂症患者中出现升高。这些研究证据的出现，让人们在关于精神分裂症的研究中不得不将目光聚焦到肠道菌群上。
[0006] 2012年美国国立卫生研究院(NIH)通过焦
磷酸测序16S核糖体RNA基因及宏基因组测序对成年期健康个体的肠道微生物进行测绘后发现，其肠道微生物主要包括4大种类：拟杆菌
门、厚壁菌门、放线菌门和疣微菌门。目前着眼于精神分裂症患者的研究较为有限。在EmanuelSchwarz等人的研究中发现，首发精神分裂症患者在菌群数量上与常人存在差异，且与精神症状的严重程度及
治疗反应存在一定的相关性。通过对口咽部微生物经行测绘，亦可发现在精神分裂症患者与对照组相比其口咽部微生物亦存在明显差异。但这些研究样本量较小，部分研究的纳入标准不仅仅包括精神分裂症，还包括分裂情感障碍等其他精神问题，这均有可能影响研究结果。故我们进一步将人群
锁定在精神分裂症的人群，并补充样本含量。通过分析精神分裂症患者
粪便标本初步探索其与正常人群之间肠道菌群的差异，我们找到了11种与精神分裂症高度相关的差异细菌。通过对这11种细菌的分析，可对精神分裂症和正常人作出判断，AUC可达80％以上。这对临床医生进行诊断精神分裂症和
鉴别诊断具有较强的参考价值。目前还没有生物标记或联合试验用来评估精神分裂症的诊断、
预后或对治疗反应的预测。我们提供的这一组精神分裂症标志物能用于高危人群及前驱期患者中进行积极的检测以尽早诊断治疗，有助于改善精神分裂症患者的生活治疗并降低全球卫生成本。
发明内容
[0007] 为了弥补
现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种精神分裂症的标志物，该标志物用于有效表征精神分裂症，AUC达0.81以上。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种该标志物在制备用于诊断精神分裂症的
试剂盒中的应用。
[0009] 本发明的目的还在于提供一种检测所述标志物的试剂盒。
[0010] 本发明提供了一种标志物，该标志物包括如下一组11种微生物中的至少5种：
[0011] 普雷沃菌属(Prevotella)、
琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、
柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.70；
[0012] 优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物中的至少6种：普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.72；
[0013] 优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物中的至少7种：普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.74；
[0014] 优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物中的至少8种：
[0015] 普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.75；
[0016] 优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物中的至少9种：普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.77；
[0017] 优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物中的至少10种：普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.79；
[0018] 更优选地，所述标志物包括如下一组11种微生物：普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)；利用该标志物作为特征量，对精神分裂症作出判断，AUC＞0.81；
[0019] 本发明还提供了所述标志物在制备用于诊断精神分裂症的试剂盒中的应用。
[0020] 本发明还提供了一种检测所述标志物的试剂盒，该试剂盒包含用于检测所述标志物的丰度的至少一种试剂；其中，该试剂盒的检测对象为人类粪便；
[0021] 优选地，该试剂盒包括通过质谱检测的方法检测所述标志物丰度所需要的试剂；
[0022] 优选地，该试剂盒包括通过
抗原抗体反应的方法检测所述标志物丰度所需要的试剂；
[0023] 优选地，所述试剂盒包括用于检测所述标志物丰度的特异性引物；
[0024] 优选地，所述试剂盒包括通过基因测序的方法检测所述标志物丰度所需要的试剂；其中，所述的基因测序包括但不限于全基因组测序、16srRNA基因测序、RNASeq、EST测序以及SAGE测序。
[0025] 本发明还提供了上述试剂盒的应用方法，该方法包括下述步骤：
[0026] A采集样本粪便；B利用上述试剂盒提供的试剂检测样本粪便中所述标志物的丰度；C将所述丰度进行
随机森林分类，与ROC曲线的cutoff值进行比较。
[0027] 本发明的有益效果在于，本发明提供的标志物，可对精神分裂症与正常人做出判断，AUC达0.81以上，具有很好的诊断效能，可以用于制备有效诊断精神分裂症的试剂盒。本发明提供的标志物还可用于评估精神分裂症的预后或对治疗反应的预测，用于精神分裂症高危人群及前驱期患者的积极检测以及时发现精神分裂症患者，有助于改善精神分裂症患者的生活治疗并降低全球卫生成本。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0028] 图1 PCOA分析，比较两组间样本的分布，红色点代表正常样本，绿色点代表患者。
[0029] 图2 LEfSe预测的biomarkers。
[0030] 图3 14个特征量构建随机森林分类器对精神分裂症分类的ROC曲线。
具体实施方式
[0032] 1、入组健康组和精神分裂症患者组：
[0033] 参照NIH对“健康人”执行的标准，对个别条目稍加补充，对中国东北辽宁葫芦岛地区的本地居民进行筛选，标准如后：1)中国汉族，葫芦岛当地居民，无特殊宗教信仰；2)年龄介于18-65岁之间；3)体重指数在18-35之间；4)无慢性疾病及可能影响肠道菌群稳定的疾病，例如：
高血压、糖尿病、免疫
缺陷病、
自身免疫性疾病、癌症，炎症性肠病(IBD)、近3个月腹泻等；5)近6个月没有特殊的用药史，包括：抗生素、糖皮质激素、细胞因子，大剂量的
益生菌及生物制剂；6)无
胃镜、肠镜检查、消化道钡餐等检查；7)5年内无胃肠道大手术或肠道
切除手术史，如：胆囊切除术和阑尾切除术。8)无因重大躯体疾病或精神症状导致的活动受限；9)无明显饮食习惯变化及中高剂量的酒精滥用或依赖。
[0034] 精神分裂症患者筛选：1)根据ICD-10诊断为精神分裂症，于住院或门诊接受抗精神病药物治疗，2)非首发精神分裂症，且总病程持续不超过10年，3)反复发作史，且目前症状平稳3个月以上，经连续阳性与阴性症状量表(PANSS量表)评估分值变化率不高于20％，PANNS总分不高于60分；4)根据《中国精神分裂症防治指南》推荐
治疗方案，规律口服抗精神病药物治疗，合并或不合并长效针剂治疗。
[0035] 对全部受试者进行问卷调查，采集基本信息，包括：年龄、性别、民族、职业、身高、体重、既往病史、服药史、烟酒史等内容。所有受试者均需签署知情同意书。根据赫尔辛基宣言，经辽宁省复员军人康宁医院伦理委员会批准了样本采集和分析的议定书。
[0036] 共收集患者64人，其中男性36人，女性28人。纳入健康对照53人，其中男性35人，女性18人。经过均衡性检验，两组在年龄，性别及身体
质量指数(BMI)方面没有统计学差异(P＞0.05)。(详见表1)
[0037] 表1
[0038]
[0039]
[0040] 2、样品采集：
[0041] 采集各入组人群粪便样品，放入灭菌的粪便收集管中，迅速冷冻保存于-80℃
冰箱中。
[0042] 3、提取肠道微生物总DNA：
[0043] 按照德国QIAGEN公司生产的QIAamp粪便DNA提取试剂盒的
说明书进行。
[0044] 4、测序数据：
[0045] 对117个样本的肠道微生物总DNA分别进行16s rRNA基因测序，获得了6975476条原始序列，范围从21189条到107167条。在质量过滤和移除嵌合体之后，我们获得了3863613条高质量的reads用于后续的分析，每个样本的平均reads数是33022.33(范围从11286到61443)。每条read的平均长度是453bp。Good’s coverage estimator的值是99.79％。
[0046] 5、菌群相似程度分析：
[0047] 为了评估样本的菌群相似程度，计算unweighted unifrac样本相似性矩阵并进行主坐标分析(PCoA分析)，发现在精神分裂症患者和正常人之间有着显著的差异(R＝0.044,p＝0.016；图1)。
[0048] 6、标志物的确定：
[0049] 组间差异显著性分析主要用于发现不同组间具有统计学差异的微生物物种(Biomarker)，采用线性判别分析的方法(LEfSe,Linear Discriminant Analysis Effect Size)寻找精神分裂症患者与健康人之间具有显著差异的微生物物种。分析结果发现，有42种菌在健康组和患者组间存在显著性差异，可以用作区分两组间差异的Biomarker(图2)，这42种菌分别为Prevotellaceae、Prevotella、Gammaproteobacteria、Fragilis、Proteobacteria、Aeromonadales、Succinivibrio、Enterobacteriaceae、Enterobacteriales、Succinivibrionaceae、Fusobacterila、Fusobacteria、Fusobacteriaceae、Fusobacterium、Fusobacteriales、Veillonellaceae、Megasphaera、Ruminis、Lactobacilllus、Lactobacillaceae、Stercorea、Mucosae、Citrobacter、Phascolarctobacterium、Acidaminococcus、Adolescentis、Desulfovibrio、Neonatale、Producta、Faecis、Streptococcaceae、Streptococcus、Eggerthii、Coprococcus、Roseburia、Blautia、Alcaligenaceae、Plebeius、Clostridiales、Clostridia、Flrmicutes、Lachnospiraceae。
[0050] 这42种菌分别属于13个属，这13个属分别为普雷沃菌属(Prevotella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、梭菌属(Fusobacterium)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、巨球型菌属(Megasphaera)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、粪球菌属(Coprococcus)、罗斯氏菌属(Roseburia)、布劳特氏菌属(Blautia)、
脱硫弧菌(Desulfovibrio)、链球菌(Streptococcus)。
[0051] 把属于这13属水平的42个Biomarker菌作为随机森林建模的特征量，首先用Boruta
算法进行特征量选取，发现Desulfovibrio和Streptococcus这两个属是无关的特征量，因此将这两个属剔除，将剩余的11个属作为随机森林的特征量作为后续分析。
[0052] 利用这11个属、性别、年龄以及身高，共计14个特征量进行构建
预测模型。用随机森林的方法构建分类器，三分之二的样本用于训练集，三分之一的样本作为测试集，采用ROC曲线下面积(AUC)指标来评价该随机森林分类器的分类效果。该分类器对精神分裂症预测效果的ROC曲线见图3，由图3可知，该分类器对精神分裂症的判别效果好，AUC＝0.815。
[0053] 实施例2应用实施例
[0054] 根据实施例1步骤1中的入组筛选标准，筛选入组健康组和精神分裂症患者组的候选人各30人；采用实施例1步骤2-4的方法制备候选人的总DNA样本及进行基因测序；分别随机从实施例1得到的11个属中选择5、6、7、8、9、10、11个属作为随机森林的特征量，采用实施例1步骤6的方法进行分析，结果显示AUC达0.752-0.874，确认了本发明提供的标志物可用于识别潜在患者。
[0055] 利用上述生物标记物以及随机森林分类模型来诊断精神分裂症，生产检测上述标记物的试剂盒以及装置等为本领域技术人员所知悉，皆在本发明的保护范围之内。
