本发明涉及精神分裂症的诊断方法。更具体讲，涉及一种检测TH 基因中存在的一种DNA重复序列中的变异的方法，精神分裂症患者中特 异地存在某些形式的变异。本发明还涉及可用于检测与精神分裂症相关 的该重复序列的特异等位基因的引物。

在所有类型的DNA重复序列中存在突变是一种已知现象。但这些 突变的功能含义没有确定。例如，微卫星代表一大类DNA重复序列，它 们具有与重复基元数目变异(文献1)和/或这些基元中的变异相关的广 泛多态性。因此这些微卫星已用作构建基因图谱和识别病理相关基因座 的患传标志(文献2)。微卫星不同等位基因的长度取决于重复基元数 目的变异。重复二聚体的测序试验已表明重复基元数目和其序列的变 异。这些变异特别可相当于“完全”重复，即在碱基序列中无中断，或 相当于“不完全”重复，即在基元序列中含有一个或多个中断，这涉及 缺失或插入(文献3)。同样，也在三聚或四聚重复基元中观察到了长 度和/或序列的变异。例如，已在微卫星HUMHPRTB(文献4)和 HUMTH01(文献5)中观察到了此类变异。

本申请人对与精神分裂症相关的遗传变异研究特别感兴趣。因此进 行了酪氨酸羟化酶(TH)基因与精神分裂症之间的关系研究，更特别 致力于微卫星HUMTH01。TH是儿茶酚胺生物合成途径的限制酶。已 利用位于TH基因中的标志进行了许多精神病和神经病的遗传研究(文 献6和7)。但迄今在文献中仍无任何与精神分裂症的遗传关联的论证。

微卫星HUMTH01位于酪氨酸羟化酶基因的第一个内含子中。该微 卫星由TCAT四聚重复基元构成。它显示一定的多态性，即已描述的具 有可变重复基元数目的不同等位基因。最常遇到的等位基因包含10个重 复基元，且在第5个重复基元中有一碱基对缺失，即含有CAT序列。

因此，本申请人通过研究微卫星HUMTH01中序列和长度的变异检 查了TH基因在精神分裂症中的作用。所得结果已证明完全等位基因是 非常罕见的，只出现在精神分裂症患者中。已在不同人种的患者群中重 现了这些结果。例如在239人的法国人群中(其中有94位精神分裂症患 者)检测到6种不同的等位基因，称为A、B、C、D、Ei和Ep。这 些不同的等位基因相互间差4个碱基对(1个完整基元)，只是最长的 两个等位基因间只差一个碱基对。这些等位基因的测序表明微卫星 HUMTH01的重复基元(TCAT序列)在等位基因A、B、C和D中 完全重复，分别含有6、7、8和9个重复基元。但含10个重复基元的 等位基因E在大多数情况下表现出第5个重复基元中胸苷的相同缺失。 这种缺失导致一种序列为(TCAT)4(CAT)(TCAT)5的不完全 等位基因，称为Ei(表示不完全)。Ei等位基因是高加索人中最常见的 等位基因(文献5)。而序列为(TCAT)10的完全等位基因E(称为 Ep)是非常少见的。例如，在测试的整个精神分裂症人群中，只有5位 患者具有该完全等位基因。所得结果意外地表明所有带Ep等位基因的主 体都是精神分裂症患者，而在145位健康对照人体中没有该等位基因(参 见表1)。这些结果证明了Ep等位基因的存在和精神分裂症之间高度显 著的关联。另外，这5名携带Ep等位基因的精神分裂症患者是精神分裂 症的散发性病例，其中1例的临床类型是类偏狂型精神分裂症，3例为 未分类精神分裂症，1例为衰败型精神分裂症。

本申请人随后将该研究扩展到不同人种的其他人群中。对88名突尼 斯人进行了相似的关联性研究。所得结果表明在受试突尼斯人群中遇到 的A-E各种等位基因的频率明显不同于在法国人群中所观察到的(参 见表1)。但只有4名被证明为Ep完全等位基因的携带者，他们都是精 神分裂症患者，其形式也是散发性的(1例类偏狂型，3例未分类的精 神分裂症)。

这些结果构成了TH和精神分裂症之间关联性的第一个论证。它们 清楚地表明微卫星HUMTH01的序列为(TCAT)10的完全等位基因 Ep可与精神分裂症显著关联，从而构成普查检出此类疾病的遗传工具。

另外通过对100例散发性躁郁症精神病患者的研究，证实了该等位 基因与精神分裂症关联的特异性。在这些病人中完全没有检测到Ep等位 基因的存在。

阐明这种等位基因与精神分裂症间的关联性为诊断和治疗领域提供 了许多应用。因此，本发明现第一次提供了通过生物试验而不再只有通 过临床证据诊断精神分裂症的可能性。本发明的目的更具体在于一种诊 断精神分裂症的方法，该方法是检测TH基因中微卫星HUMTH01的Ep 等位基因的存在。这种方法还可用于诊断有精神分裂症迹像的疾病，如 特别是分裂型、类分裂个体等。本发明因而提炼了诊断这些疾病的标准， 迄今它们只是临床性质的。另外，通过在推带Ep等位基因患者家族中鉴 别遗传易损性，本发明还可证明倾向这类精神病的素质。从治疗观点看， 本发明有利地使得根据精神分裂症的类型确定更适合的医学治疗。通过 证实牵连儿茶酚胺途径的假说，本发明使得能使用更靶向的治疗方法。 另外，如果没有安全确定Ep等位基因存在的功能含义，则应注意到微卫 星HUMTH01位于TH基因的第一个内含子中，已证明该区域中不同的 绞接导致TH的4种异构体(文献8)。从而在该区域中的遗传变异可 能影响TH基因表达的调节，这可能与精神分裂症的出现有关。

因此，本发明的第一方面涉及一种精神分裂症的诊断方法，其特征 在于体外检测TH基因中微卫星HUMTH01的Ep等位基因的存在。显 示序列(TCAT)10的这种等位基因是某些精神分裂症的特征。缺乏这 种等位基因并不排除一种精神分裂症的存在，这种等位基因在约5％的 病例中见到。本发明的方法还可用于精神分裂症的遗传定性，用于精神 分裂症的亚分类。如上文所示，Ep等位基因似只出现在散发性精神分裂 症中。本发明的方法还可用于显示倾向精神分裂症的素质。

在本发明方法中，Ep等位基因的检测可通过许多不同技术实现。 在可用的技术中，可优选举出测序。凝胶分离或SSCP技术。

关于测序，可以使用本领域技术人员已知的所有方法。尤其有利的 是使用DNA自动测序仪。优选在双链模板上用荧光引物按链终止法进行 测序。适用于该目的的试剂盒是Applied Biosystem(Applied Biosystem， Foster City，CA)的Taq Dye Primer Kit测序试剂盒。微卫星HUMTH01 或更准确地讲带该微卫星的分离片段的测序，使得识别病人中的等位基 因，从而显示序列(TCAT)10的Ep等位基因的存在或否。测序所得 结果例如图2中所示。

显示Ep等位基因的一种优选技术是凝胶分离。该技术具有不必 DNA片段的测序按其长度分辨不同等位基因的优点。该技术基于在变性 条件下变性DNA片段在丙烯酰胺凝胶(优选6％)中的迁移。通过本领 域技术人员已知的任何技术可进行谱带的显示，例如使用标记引物(尤 其是磷的γ射线)，在受试片段中加入α-dCTP，使用冷α探针，用溴化 乙锭显色，或与放射标记探针杂交(印迹)。对凝胶分离的详细方案在 实施例中给出了示例。如图3中所示，该技术能够不经测序快速地区分 所述微卫星的A、B、C、D、Ei和Ep等位基因。

SSCP鉴别技术也涉及在丙烯酰胺凝胶上的分离，但是在非变性条 件下。该技术能够按其构型分辨不同的片段(参见实施例)。

在患者的DNA样品上进行本发明的方法。该样品应至少含有微卫 星HUMTH01。它优选含有TH基因第一内含子的全部或部分。更优选 含有这样的TH基因片段，其含有带侧翼序列的微卫星HUMTH01。待 测的DNA样品可以从取自病人的细胞得到。优选血细胞(例如单核细 胞)，这易于简单地从血样获得。也可以使用其他类型的细胞，如成纤 细胞、上皮细胞、角质细胞等。然后从细胞提取DNA，并用于检测Ep 等位基因。为此，所得基因组DNA用限制酶消化，克隆在适当载体中， 筛选TH或通过与相当于TH第一个内含子的探针杂交来筛选，然后如上 所述进行分析。最优选的方式是，将DNA提取物预先进行一次或多次扩 增反应，以获得大量相应于携带微卫星HUMTH01区域的物质。可以用 本领域技术人员已知的任何技术进行扩增，特别是用所谓的PCR技术〔聚 合酶催化链反应，Saiki R.K.等，科学230(1985)1350-1354；Mullis K.B. 和Faloona F.A.，酶学方法，155(1987)335-350〕。此时，可用“DNA 热循环仪”(Perkin Elmer Cetus)按制造商的说明进行扩增。扩增的 温度条件和所用介质是一般条件，如Maniatis等1989中所述。在实施 例中还给出了具体的条件。为实施本发明，使用带微卫星HUMTH01的 足够小的DNA片段是有利的。这有利地使得不必求助于测序而区别等位 基因。另外，如果进行测序对照实验，也只需对有限长度的片段测序。 最好，所用DNA片段是长度小于300pb的扩增片段。该片段带有微卫星 HUMTH01和TH基因的侧翼序列，如图1中所示。更优选扩增片段长 度小于200pb。用长度小于160pb、甚至100pb的扩增片段得到了特别 显著的结果。为此，本发明还描述允许扩增带微卫星HUMTH01的小 DNA片段的引物。因此，本发明特别描述分别允许扩增192pb、156pb 和77pb片段的3对引物。这些引物的序列、以及扩增片段的序列和在 TH基因中的位置都在实施例中给出。允许扩增至少带有微卫星 HUMTH01和一个侧翼区(衍生自图1所示序列)的小于300pb片段的 任何引物也构成本发明的一部分。最好，本发明引物的长度为10- 40mer，优选15-30mer。这些引物的序列可根据扩增片段的长度、其 在微卫星周围的位置和所选的引物长度从图1中所示的序列确定。

本发明中所用的引物可按本领域技术人员已知的任何技术合成，特 别是用诸如Applied Biosystem 394型合成仪(Applied Biosystem， Foster City CA)的DNA自动合成仪按制造商的说明用氨基亚磷酸酯化学 进行，其中在β位用氰乙基保护或不保护(Sinha等，1984，Giles 1985)。 这些引物还可以用本领域技术人员已知的任何技术标记。

待测DNA样品可以是基因组DNA、cDNA或RNA。优选是用如 上所述的特异引物扩增的基因组DNA扩增产物。

本发明的另一目的涉及Ep等位基因的检测试剂盒，其包括一对如 上所述的引物。这些试剂盒有利地是精神分裂症的诊断试剂盒。

如上文所示，本发明第一次提供了对精神分裂症类的疾病检测和遗 传定性的遗传方法。除上述诊断应用外，该方法还提供了很大的治疗潜 力，特别是根据相关的疾病提供更好的靶向治疗。

借助下列实施例更详细地描述本发明，这些实施例应视为说明性的 而非限制性的。

附图

图1：TH基因第一个内含子的含微卫星HUMTH01的部分序列。 标出了扩增引物的位置。

图2：通过测序显示微卫星HUMTHl01的Ep等位基因。

图3：通过凝胶分离显示微卫星HUMTH01的Ep等位基因。

表1：微卫星HUMTH01的等位基因在患或未患精神分裂症的受试 人群中的分布。

实施例

1.制备DNA

加肝素收集血样，用Ficoll hypaque梯度(Pharmacia，Upsala， suède)分离单核细胞。然后按标准技术提取DNA。为了直接提取DNA， 采用了下述方法：

将血样倒在50ml试管中，加入裂解缓冲液以使细胞破裂(裂解缓 冲液＝40ml 1N TrisHCl pH7.5+20ml 0.5M EDTA+milliQ H2O至2 升)，终体积为50ml。然后在4℃以2500rpm离心该悬液15分钟。弃 去上清，再向沉淀加入50ml裂解缓冲液。重复两次相同操作(离心，弃 上清，沉淀重悬于裂解缓冲液中)，三次离心结束后，回收沉淀。然后 加入：

5ml裂解缓冲液(对5ml起始血样)

125μl20％N-月桂酰肌氨酸钠

50μl蛋白激酶K(20ng/ml)

混合所得溶液，置于水浴中55℃搅拌过夜。

第二天早上，加上2倍体积的95％乙醇(如5ml→则终体积15ml)， 然后将溶液倒置沉淀，直到形成絮状物。随后用P1000吸管(用锥形头) 收集DNA于5ml试管中。然后加入80％乙醇，将混合物置于冰箱中。 第二天早上换乙醇，晚上除去乙醇，让絮状物干燥(将试管置于kleenex 的背面)。

然后将DNA重悬于1×TE中，根据絮状物的大小，TE的量在 200μl到1ml间变化。然后置于37℃旋转仪上过夜，再用分光光度计测 定DNA浓度。

2.法国人群：

研究了94名不同来源患有慢性精神分裂症的病人(男62名，女32 名，平均年龄42+/-12.3)，其中包括21个家族病例。用来自医疗表 的资料或按《情感疾病和精神分裂性焦虑表》(SADS-LA，文献10) 的法语翻译直接采访得到的资料，按DSM III标准(文献9)进行了诊 断。按所述方法将每个病人归于一临床类型中。研究了145名非显性对 照个性(男84名，女61名，平均年龄48+/-8.3)，他们没有任何精神 疾病。

3.突尼斯人群：

研究了44名不同来源的患有慢性精神分裂症的病人(男33名，女 11名，平均年龄37+/-8.2)，其中包括13个家族病例。用来自医疗表 的资料按DSM IIIR标准(文献11)进行了诊断。已将这些病人与44 名不患任何精神疾病的对照病人(他们之间没有关系)(男37名，女7 名，平均年龄35+/-5.9)进行了比较。

4.用于扩增反应的引物

扩增反应的靶模板是微卫星HUMTH01的Ep等位基因，其序列为 (TCAT)4TCA(TCAT)5。如所公开的，该微卫星位于TH基因 序列的第1070位，并可在Genebank(No.D00269)中获得。

PCR扩增中使用了不同的引物对。这些引物对以及扩增片段的长度 如下所示。在图1中给出了这些引物在TH基因序列上的位置(也见序 列号1)。

A引物对：

1)5′GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3′(有义)(序列号1)和

2)5′TTA TCC AGC CTG GCC CAC 3′(反义)(序列号2)，

预计扩增长度为192pb。

B引物对：

3)5′GGC AAA TAG GGG GCA AAA 3′(有义)(序列号3)和

4)5′GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3′(反义)(序列号4)。

预计扩增长度为156pb。

C引物对：

5)5′GTT CCT CCC TTA TTT CCC 3′(有义)(序列号5)和

6)5′AGG GAA CAC AGA CTC CAT 3′(反义)(序列号6)。

预计扩增长度为77bp。

5.扩增反应的操作方法

用于PCR反应的混合物含有：40ng按实施例1制备的基因组 DNA，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200mM，18pmol (100ng)各引物，50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH8.5)、1.5mM MgCl2和1.0mCi(a.32P)dCTP(Amersham UK)，终体积15ml.

96℃下起始变性3分种后，92℃下向每个样品中(DNA+混合 物)加入0.75单位Taq聚合酶，随后进行56℃杂交30秒、72℃延伸 30秒和92℃变性30秒的30个循环。

6.凝胶分离

与3μl“终止溶液”(0.025的溴酚蓝和0.025的二甲苯cyanol，0.95 的去离子化甲酰胺)混合物的3μl PCR反应产物加载在变性凝胶(6％ 丙烯酰胺/二丙烯酰胺19∶1)上。电泳迁移(2500伏，55mA)后将凝 胶脱模并干燥。将其与XOMAT胶片( kodak)放在暗盒(无屏幕放大 器)中进行放射自显影，在室温下曝光过夜。

7.PCR-SSCP反应操作方法。

用下述操作方法按多步进行该反应：

1.通过PCR扩增带放射标记的双链(用α32P-ATP标记)或单链 (引物之一用γ32P-ATP)靶DNA序列(150-200pb)。

1ml PCR产物与2.5ml载样缓冲液(80％去离子化甲酰胺，50mM TBE，1mM EDTA，0.5％二甲苯-Cyanol，0.5％溴酚蓝)混合。

2. 96℃变性DNA 3-5分钟。

3.在熔冰中迅速冷却样品。

4.迅速加在未变性的聚丙烯酰胺凝胶上(6％丙烯酰/二丙烯酰胺 37.5∶1，0.5×TBE)。

5.4℃及50W下或室温及10W下(凝胶中加有10％甘油)电泳迁 移。

6.干燥的凝胶放射自显影。

                               表1

                法国**                            突尼斯 等位基因            对照a    精神分裂症患者b 对照a      精神分裂症患者 A(tcat)6            54(18.6％)  40(21.3％)     20(22.7％)  18(20.5％) B(tcat)7            54(18.6％)  43(22.9％)     20(22.7％)  20(22.7％) C(tcat)8            38(13.1％)  18(9.6％)      14(15.9％)  8(9.1％) D(tcat)9            52(17.9％)  23(12.2％)     21(23.9％)  26(29.5％) EI(tcat)4cat(tcat)5 92(31.8％)  58(30.8％)     13(14.8％)  12(13.6％) Ep(tcat)10          0(0％)      6**(03.2％)     0(0％)     4(4.6％)

              参考文献 1.Weber et al.，美国人类遗传学杂志44(1989)388 2.Hearne et al.，遗传学趋势8(1992)288 3.Weber et al.，基因组7(1990)524 4.Edwards et al.，基因组12(1992)241 5.Puers el al.，美国人类遗传学杂志53(1993)953 6.Craddock et al.医学年鉴25(1993)317 7.Leboyer et al.，Lancet 335(1990)1219 8.Grima et al.，自然236(1987)707 9.美国精神病学会，精神病诊断和统计手册(第3版)-华盛顿特区 ＝APA(1980). 10.Eyer et al.，临床焦虑症，纽约：纽约州精神病研究所(1985). 11.美国精神病学会，精神病诊断和统计手册(第3版)-华盛顿特区 ＝APA(1987).

                  序列表 (1)一般信息：   (i)申请人

    (A)名称：RHONE-POULENC RORER S.A.

    (B)街：20，avenue Raymond ARON

    (C)城市：ANTONY

    (E)国家：法国

    (F)邮编：92165   (ii)发明名称：精神分裂症的诊断方法   (iii)序列数：7   (iv)计算机可读形式：

    (A)载体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.30版(OEB) (2)序列号1的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号1 GGCAAATAGG GGGCAAAA (2)序列号2的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号2： TTATCCAGCC TGGCCCAC (2)序列号3的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号3： GGCAAATAGG GGGCAAAA (2)序列号4的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号4： GGCTTCCGAG TGCAGGTC (2)序列号5的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号5： GTTCCTCCCT TATTTCCC (2)序列号6的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：18个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号6： AGGGAACACA GACTCCAT (2)序列号7的信息：   (i)序列特征

    (A)长度：636个碱基对

    (B)类型：核苷酸

    (C)链数：双链

    (D)构型：线性   (ii)分子类型：cDNA   (iii)假拟：无   (iv)反义：无   (xi)序列描述：序列号7： CTTGAATCTT   AACGATCGGA   ATGTGGAAAC   AAATCCATCC   AAAAAATCCA   AGATGGCCAG    60 AGGTCCCCGG   CTGCTGCACC   CAGCCCCCAC   CCTACTCCCA   CCTGCCCCTG   CCTCCCTCTG   120 CCCCAGCTGC   CCTAGTCAGC   ACCCCAACCA   GCCTGCCTGC   TTGGGGAGGC   AGCCCCAAGG   180 CCCTTCCCAG   GCTCTAGCAG   CAGCTCATGG   TGGGGGGTCC   TGGGCAAATA   GGGGGCAAAA   240 TTCAAAGGGT   ATCTGGGCTC   TGGGGTGATT   CCCATTGGCC   TGTTCCTCCC   TTATTTCCCT   300 CATTCATTCA   TTCATTCATT   CATTCATTCA   TTCATTCACC   ATGGAGTCTG   TGTTCCCTGT   360 GACCTGCACT   CGGAAGCCCT   GTGTACAGGG   GACTGTGTGG   GCCAGGCTGG   ATAATCGGGA   420 GCTTTTCAGC   CCACAGGAGG   GGTCTTCGGT   GCCTCCTTGG   GCACTCAGAA   CCTTGGGCTC   480 CCTGGCACAT   TTAAAATGGG   TTTTTATTTA   TGGACCTTGA   TTGAAATGTG   GTGTGAGTTG   540 TAGCAGTGTC   ATTTCCAGGT   ACCTTCTCAG   GGACACAGGG   CGCCCTCCCC   CGTCCTCCCC   600 CGCCCTCCCC   TACCCTCCCC   CACCAGGCTC   CCCATC                                 636