糖修饰的心房钠尿肽
阅读：813发布：2020-05-11
专利汇可以提供糖修饰的心房钠尿肽专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供显示在血液中延长的持续时间和维持cGMP提高活性的修饰的 心房 钠尿肽。本发明提供修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中至少一个糖物质通过糖苷键或经由接头结构与至少一个hANP肽直接连接；包含所述修饰的肽或其盐作为活性成分的药物，等。，下面是糖修饰的心房钠尿肽专利的具体信息内容。
1.一种修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由以下化合物2-1、2-
3、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15、2-16、2-25、2-26、2-27、2-29或2-30中的一个的式表示的结构：
[式10]
(化合物2-1)
[式11]
(化合物2-3)
[式12]
(化合物2-10)
[式13]
(化合物2-11)
[式14]
(化合物2-12)
[式15]
(化合物2-13)
[式16]
(化合物2-14)
[式17]
(化合物2-15)
[式18]
(化合物2-16)
[式19]
(化合物2-25)
[式20]
(化合物2-26)
[式21]
(化合物2-27)
[式22]
(化合物2-29)
[式23]
(化合物2-30)
其中hANP是hANP(1-28)，其由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成，和在所述氨基酸序列的N端上与接头结构通过酰胺键键合；
AG(5)是由下式表示的糖物质
[式1]
其中Gxx是GlcNAc并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键与接头结构结合；
AG(7)是由下式表示的糖物质
[式2]
其中Gxx是GlcNAc并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键与接头结构结合；
AG(9)是由下式表示的糖物质
[式3]
其中Gxx是GlcNAc并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键与接头结构结合；和
SG是由下式表示的糖物质
[式4]
其中Gxx是GlcNAc并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键与接头结构结合。
2.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式10]
(化合物2-1)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
3.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式11]
(化合物2-3)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
4.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式13]
(化合物2-11)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
5.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式15]
(化合物2-13)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
6.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式19]
(化合物2-25)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
7.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式22]
(化合物2-29)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
8.权利要求1的修饰的肽或药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由下式表示的结构，
[式23]
(化合物2-30)
并且，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
9.包含权利要求1-8中任一项的修饰的肽或药学上可接受的盐的药物。
10.权利要求9的药物，其中所述药物是用于治疗或减轻心血管疾病的药剂。
11.权利要求10的药物，其中所述药物是用于处理急性心力衰竭发作后的医学病况的药剂。
12.权利要求1-8中任一项的修饰的肽或药学上可接受的盐，其用于治疗或减轻心血管疾病。
13.权利要求1-8中任一项的修饰的肽或药学上可接受的盐，其用于处理急性心力衰竭发作后的医学病况。
糖修饰的心房钠尿肽
技术领域
[0001] 本发明涉及具有糖链键和显示在血液中增加的持续时间的糖-修饰的心房钠尿肽，包含所述修饰的肽作为活性成分的药物等。
背景技术
[0002] 心房钠尿肽是生物活性肽，其具有血管扩张作用、利尿作用、细胞生长抑制作用、降低静脉回流作用和交感神经活性抑制作用。在被血液中的中性内肽酶(NEP)裂解时，天然的hANP丢失其活性，因此在血液中其具有短的半寿期。因为这样的原因，在当前的临床实践中天然的hANP需要通过点滴输注等连续给予。
[0003] 延长这样的在血液中具有短的半寿期的生物活性肽在血液中的半寿期的尝试实例包括多种方法，例如利用持续释放制剂；氨基酸置换或修饰；含有结合的白蛋白、免疫球蛋白Fc部分等的融合肽；和含有加入的聚合物(例如，PEG)的修饰的肽。当因为它们的生物活性的原因而将生物活性肽应用于药物时，需要延长它们在血液中的半寿期，同时以药理学必需的水平保持所述肽具有的生物活性。已经对许多肽进行尝试以将在血液中具有延长的半寿期的这样的生物活性肽应用于药物。
[0004] 非专利文献1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548)和非专利文献2 (Bioconjugate Chem. 2008, 19, 342-348)公开了其中PEG与心房钠尿肽(ANP)键合的修饰的肽。
[0005] 专利文献1 (WO2006/076471 A2)公开了其中PEG与脑钠尿肽(BNP)键合的修饰的肽。
[0006] 专利文献2 (WO2008/154226 A1)和非专利文献3 (Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526)描述了其中免疫球蛋白Fc片段与ANP键合的融合蛋白。
[0007] 专利文献3 (WO2004/047871 (A2,A3)和专利文献4 (WO2009/142307 A1)公开了具有改变的ANP氨基酸序列的突变体。
[0008] 然而，这些技术并非总是成功的。具体而言，不可能预测是否可同时获得在血液中足够的持续时间和药理学作用所必需活性的保持，除非实际上进行大量的测试。
[0009] 引文列表
[0010] 专利文献
[0011] 专利文献1：国际公开号WO2006/076471
[0012] 专利文献2：国际公开号WO2008/154226
[0013] 专利文献3：国际公开号WO2004/047871
[0014] 专利文献4：国际公开号WO2009/142307
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献1：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548
[0017] 非专利文献2：Bioconjugate Chem. 2008, 19, 342-348)
[0018] 非专利文献3：Bioconjugate Chem. 2012, 23, 518-526
[0019] 发明简述
[0020] 技术问题
[0021] 本发明的目的是找到显示与天然的人心房钠尿肽(hANP)相比在血液中延长的持续时间和维持cGMP提高活性的修饰的肽。
[0022] 对问题的解决方案
[0023] 本发明人已对hANP的修饰进行了努力研究以延长在血液中的持续时间和保持cGMP提高活性。结果，本发明人通过找到例如这样的修饰的肽完成本发明，其中糖链与hANP通过多种方法键合，所述肽提高表达GC-A受体的细胞的胞内cGMP浓度，当给予小鼠时显示在血液中延长的持续时间，和甚至在给予修饰的肽后60分钟或更迟仍持续提高血液中的cGMP浓度。
[0024] 本发明提供以下：
[0025] (1) 修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中至少一个糖物质通过糖苷键或经由接头结构与至少一个hANP肽直接连接。
[0026] (2) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质通过糖苷键或经由接头结构与hANP肽的N端、hANP肽的C端和构成所述肽的至少一个氨基酸的侧链中的至少一个直接连接。
[0027] (3) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述hANP肽是hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)。
[0028] (4) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质选自单糖、二糖、三糖和通过糖苷键键合的4个或更多个单糖的糖链中的至少一种类型，并且当多种糖物质包含在一个分子中时，所述糖物质可以彼此相同或不同。
[0029] (5) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是通过糖苷键键合的4个或更多个单糖的糖链。
[0030] (6) 根据(5)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是糖蛋白-衍生的N-连接的糖链或O-连接的糖链，或其改变的糖链。
[0031] (7) 根据(6)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是包含由下式表示的糖链结构的N-连接的糖链，或在其还原端上改变的糖链：
[0032] [式1]
[0033]
[0034] 其中Gxx是GlcNAc、Glc或Man (在下文中，根据Gxx的类型，具有上述结构的糖链分别被称为"AG(5)"、"AG(5-Glc)"和"AG(5-Man)")并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键或N-糖苷键与接头结构或hANP肽结合。
[0035] (8) 根据(7)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是包含由下式表示的糖链结构的糖链：
[0036] [式2]
[0037]
[0038] 其中Gxx是GlcNAc、Glc或Man (在下文中，根据Gxx的类型，具有上述结构的糖链分别被称为"AG(7)"、"AG(7-Glc)"和"AG(7-Man)")并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键或N-糖苷键与接头结构或hANP肽结合。
[0039] (9) 根据(8)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是包含由下式表示的糖链结构的糖链：
[0040] [式3]
[0041]
[0042] 其中Gxx是GlcNAc、Glc或Man (在下文中，根据Gxx的类型，具有上述结构的糖链分别被称为"AG(9)"、"AG(9-Glc)"和"AG(9-Man)")并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键或N-糖苷键与接头结构或hANP肽结合。
[0043] (10) 根据(9)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是包含由下式表示的糖链结构的糖链：
[0044] [式4]
[0045] 其中Gxx是GlcNAc、Glc或Man (在下文中，根据Gxx的类型，具有上述结构的糖链分别被称为"SG"、"SG(Glc)"和"SG(Man)")并且"O/N-L"表示通过O-糖苷键或N-糖苷键与接头结构或hANP肽结合。
[0046] (11) 根据(7)-(10)中任一项的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在所述糖物质中，Gxx是GlcNAc。
[0047] (12) 根据(11)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质是SG。
[0048] (13) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中10个或更少个糖物质与一个hANP肽连接。
[0049] (14) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中1、2或3个糖物质与一个hANP肽连接。
[0050] (15) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽的每个分子含有二价或更高价的hANP肽。
[0051] (16) 根据(3)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质经由接头结构与hANP肽连接，并且所述接头结构是这样的化学结构，其具有3个或更多个原子的连接链并且在至少一个位点上与糖物质的还原端通过糖苷键键合并且在至少一个位点上与hANP肽键合。
[0052] (17) 根据(16)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质与hANP肽的N端或C端或两端经由接头结构连接。
[0053] (18) 根据(17)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构是具有15个或更少个原子的连接链的结构。
[0054] (19) 根据(18)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是SG-hANP(1-28) (化合物2-1)、hANP(1-28)-SG (化合物2-2)、SG-hANP(1-28)-SG (化合物2-7)、AG(9)-hANP(1-28) (化合物2-10)、SG-三唑-hANP(1-28) (化合物2-12)、SG-硫代乙酰胺-hANP(1-28) (化合物2-25)或AG(5)-hANP(1-28) (化合物2-26)，或者
[0055] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
[0057] (21) 根据(20)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中包含在接头结构中的聚氧化烯链、氨基酸和/或寡肽链通过酰胺键与hANP肽的N端和/或C端键合。
[0058] (22) 根据(21)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述聚氧化烯链是PEG。
[0059] (23) 根据(21)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-16)、AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-21)、AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-22)、SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (化合物2-24)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-27)、SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-28)、SG-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物
2-29)、SG-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-30)、SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-31)、SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (化合物2-32)、SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (化合物2-36)或SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (化合物2-37)，或者[0060] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
2-29)、SG-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-30)、SG-*(SG-)Gln-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-31)、SG-(SG-)Gln-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (化合物2-32)、SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (化合物2-36)或SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (化合物2-37)，或者[0060] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
[0061] (24) 根据(20)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有官能团的至少一个氨基酸，其选自在侧链上具有氨基的氨基酸、在侧链上具有SH的氨基酸、在侧链上具有羧基的氨基酸、在侧链上具有羟基的氨基酸和在侧链上具有苯酚的氨基酸，并且所述接头结构在侧链上具有官能团的氨基酸的侧链处与糖物质或hANP肽连接。
[0062] (25) 根据(24)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有氨基的至少一个氨基酸和具有以下通式的结构(C)，其中所述糖物质与在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链连接：
[0063] [式5]
[0064]
[0065] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和N-(AA)表示来源于在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链氨基的氮原子。
[0066] (26) 根据(25)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链氨基和α氨基与其它氨基酸的α羧基形成酰胺键。
[0067] (27) 根据(25)或(26)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有氨基的氨基酸是Lys。
[0068] (28) 根据(27)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (化合物2-14)、[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (化合物2-15)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-19)、[SG2-Mal-(SG2-Mal-)Lys-[SG2-Mal-(SG2-Mal-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-20)、SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28) (化合物2-33)、SG-硫代乙酰胺-(SG-硫代乙酰胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (化合物2-34)或SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-35)，或者
[0069] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
[0070] (29) 根据(24)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有SH基团的至少一个氨基酸和具有以下通式的结构，其中所述糖物质与在侧链上具有SH基团的氨基酸的侧链连接：
[0071] [式6]
[0072]
[0073] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和S表示来源于在侧链上具有SH基团的氨基酸的侧链SH基团的硫原子。
[0074] (30) 根据(29)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有SH基团的氨基酸是Cys。
[0075] (31) 根据(30)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-17)、[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-18)或SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-23)，或者
[0076] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
[0077] (32) 根据(24)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有羧基的至少一个氨基酸和具有以下通式的结构，其中所述糖物质与在侧链上具有羧酸的氨基酸的侧链连接：
[0078] [式7]
[0079]
[0080] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和CO表示来源于在侧链上具有羧酸的氨基酸的侧链的CO。
[0081] (33) 根据(32)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质通过N-糖苷键与在侧链上具有羧基的氨基酸的侧链羧基和α羧基两者键合，并且经由α氨基与另一接头结构或hANP肽键合。
[0082] (34) 根据(32)或(33)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有羧酸基团的氨基酸是Glu、Gln、Asp或Asn。
[0083] (35) 根据(34)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-3)、(SG-)Asn-hANP(2-28) (化合物2-4)、(SG-)Asn-hANP(3-28) (化合物2-8)、SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-9)或SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-13)，或者
[0084] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自这些修饰的肽中的任一种。
[0085] (36) 根据(24)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有苯酚的至少一个氨基酸和具有以下通式的结构，其中所述糖物质与在侧链上具有苯酚的氨基酸的侧链连接：
[0086] [式8]
[0087]
[0088] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和苯酚基团表示来源于在侧链上具有苯酚基团的氨基酸的侧链的苯酚基团。
[0089] (37) 根据(36)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有苯酚基团的氨基酸是Tyr。
[0090] (38) 根据(37)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是hANP(1-27)-(SG-)Tyr (化合物2-6)，或者
[0091] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自所述修饰的肽。
[0092] (39) 根据(24)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述接头结构包含在侧链上具有羟基的至少一个氨基酸和具有以下通式的结构，其中所述糖物质通过O-糖苷键与在侧链上具有羟基的氨基酸的侧链键合：
[0093] [式9]
[0094]
[0095] 其中GLY表示糖物质；和O表示来源于在侧链上具有羟基的氨基酸的侧链羟基的氧原子。
[0096] (40) 根据(39)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中在侧链上具有羟基的氨基酸是Ser。
[0097] (41) 根据(40)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽是(SG-)Ser-hANP(2-28) (化合物2-5)，或者
[0098] 通过置换所述糖物质为SG、SG(Glc)、SG(Man)、AG(5)、AG(5-Glc)、AG(5-Man)、AG(7)、AG(7-Glc)、AG(7-Man)、AG(9)、AG(9-Glc)、AG(9-Man)或GlcNAc和/或置换所述hANP肽为hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)或hANP(3-27)而衍生自所述修饰的肽。
[0099] (42) 根据(16)-(41)中任一项的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有一个或两个SG分子作为糖物质和一个hANP(1-28) (SEQ ID NO: 1)作为hANP肽，并且所述SG经由具有10个或更少个原子的连接链的接头结构与hANP(1-28)的N端连接。在这种情况下，本发明的修饰的肽的药学上可接受的盐优选是三氟乙酸盐或乙酸盐。
[0100] (43) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽具有由以下化合物2-1、2-3、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、2-15、2-16、2-25、2-26、2-27、2-29或2-30中的一个的式表示的结构：
[0101] [式10]
[0102]
[0103] (化合物2-1)
[0104] [式11]
[0105]
[0106] (化合物2-3)
[0107] [式12]
[0108]
[0109] (化合物2-10)
[0110] [式13]
[0111]
[0112] (化合物2-11)
[0113] [式14]
[0114]
[0115] (化合物2-12)
[0116] [式15]
[0117]
[0118] (化合物2-13)
[0119] [式16]
[0120]
[0121] (化合物2-14)
[0122] [式17]
[0123]
[0124] (化合物2-15)
[0125] [式18]
[0126]
[0127] (化合物2-16)
[0128] [式19]
[0129]
[0130] (化合物2-25)
[0131] [式20]
[0132]
[0133] (化合物2-26)
[0134] [式21]
[0135]
[0136] (化合物2-27)
[0137] [式22]
[0138]
[0139] (化合物2-29)
[0140] [式23]
[0141]
[0142] (化合物2-30)
[0143] 其中hANP是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的hANP(1-28)和通过酰胺键在所述氨基酸序列的N端上与接头结构键合。
[0144] (44) 根据(1)-(43)中任一项、优选(42)或(43)的修饰的肽的盐，其中所述药学上可接受的盐是三氟乙酸盐或乙酸盐。
[0145] (45) 根据(3)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述糖物质与hANP肽的氨基酸的侧链连接，并且所连接的氨基酸是包含在hANP肽中的除了在SEQ ID NO: 1的氨基酸位置7-23上的氨基酸之外的氨基酸。
[0146] (46) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽或其药学上可接受的盐显示与未修饰的hANP(1-28)相比在血液中延长的持续时间和维持cGMP提高活性。
[0147] (47) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽或其药学上可接受的盐对通过中性内肽酶的hANP肽的降解具有抗性。
[0148] (48) 根据(1)的修饰的肽或其药学上可接受的盐，其中所述修饰的肽或其药学上可接受的盐显示未修饰的hANP(1-28)的3倍或更多倍的水溶解度。
[0149] (49) 包含根据(1)-(48)中任一项的修饰的肽或其药学上可接受的盐的药物。
[0151] (51) 用于治疗或减轻心血管疾病的方法，包括给予有效量的根据(1)-(48)中任一项的修饰的肽或其药学上可接受的盐。
[0152] (52) 用于制备根据(1)-(48)中任一项的修饰的肽或其药学上可接受的盐的方法，包括连接hANP肽、糖物质和如有必要，接头分子和接纳体化合物的步骤。
[0153] (53) 根据(52)的方法，进一步包括通过使用Endo-M或其突变体酶转移糖链至GlcNAc化合物、Glc化合物或Man化合物的步骤。
[0154] 本发明的有益效果
[0155] 本发明的修饰的肽显示与未修饰的hANP(1-28) (在下文中亦称为"天然的hANP")相比在血液中延长的持续时间和维持cGMP提高活性。因此在临床上本发明的修饰的肽能够通过非连续给予而显示功效并且可适用于天然的hANP对其没有治疗效果的疾病。此外，该修饰的肽的水溶解度优于天然的hANP，因此基于制剂的更高的剂量、更高的浓度等而易于各种给药。因此，该修饰的肽可满足通过天然的hANP不能获得的各种药物需求。
[0157] [图1] 图1显示SG-oxa/化合物1-12A的NMR图。
[0158] 实施方案的描述
[0159] 在下文中将详细描述本发明。
[0160] 本发明提供修饰的肽，其中至少一个糖物质通过糖苷键或经由接头结构与至少一个hANP肽直接连接。本发明的修饰的肽显示与未修饰的hANP(1-28)相比在血液中延长的持续时间和维持hANP(1-28)所具有的cGMP提高活性。本发明的修饰的肽是这样的修饰的肽，其已从自然界分离，并通过控制生产过程来人工生产和具有基本上均质的结构。本发明的修饰的肽不包括可存在于自然界和在体内或在培养的细胞中生物学生产的肽。这样的天然存在的物质本身被明确地从本发明的范围内排除。
[0161] 在本发明中，对多个结构单元(例如hANP肽、糖物质和接头结构)描述的术语"连接的"意指这些结构单元通过共价键直接键合或经由接头结构间接键合，使得所述结构单元存在于一个分子中。连接结构单元的化学结构不特别受到限制。在经由线性结构连接的情况下，一个分子中包含结构单元的每一个。在经由分支结构连接的情况下，一个分子中可包含结构单元的任一个或两个中的多个。接头结构和每个结构单元之间的结合模式不特别受到限制，并且根据待连接的结构单元的类型来选择。
[0162]
[0163] 在本发明中，"hANP肽"意指由至少包含人心房钠尿肽(SEQ ID NO: 1；在下文中亦称为hANP或hANP(1-28))的氨基酸序列的7-27位氨基酸的氨基酸序列组成的肽，所述人心房钠尿肽是由28个氨基酸组成的生物活性肽。hANP通过与在细胞表面上表达的GC-A受体结合而显示其生物活性(Chinkers M等, Nature 338; 78-83, 1989))，激活存在于受体的胞内结构域上的鸟苷酸环化酶，和提高胞内cGMP浓度。对于天然的hANP，描述于Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 118, p. 131, 1984的α-hANP在日本已获得批准用于以通用名称“卡培立肽”生产和销售，并且是市售可得的(商品名：HANP)。α-hANP亦通常称为人pro-ANP[99-126]。
[0164] hANP具有分子内的环结构，其通过SEQ ID NO: 1的第7位和23位上的Cys残基通过二硫键形成。已知该环结构和直至第27位的Arg残基的C-端氨基酸对于通过hANP激活GC-A受体是重要的(Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p. 14-21;和A. Calderone, Minerva Endocrinol. (2004), 29, p. 113-127)。因此，由该环结构组成的hANP(7-27)被认为是激活GC-A的最小单元。本发明的hANP肽是由可缺少连续来自SEQ ID NO: 1的N-端氨基酸的1-6个氨基酸和/或第28位的氨基酸的氨基酸序列组成的肽，并且优选是可缺少SEQ ID NO: 1的第1位、第1和2位、和第28位氨基酸中的至少一个的肽，更优选由可缺少SEQ ID NO: 1的第1位氨基酸或第1和2位氨基酸的氨基酸序列组成的肽(hANP(2-28)、hANP(3-28)等)，最优选由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的肽(hANP(1-
28))。
28))。
[0165] 其中hANP肽和糖物质没有中间的接头结构而直接键合的本发明的修饰的肽的实例可包括这样的修饰的肽，其中SEQ ID NO: 1的第1、5、6和25位的Ser和第28位的Tyr的侧链上的任何一个或两个或更多个羟基通过O-糖苷键与糖物质直接键合，和这样的修饰的肽，其中SEQ ID NO: 1的第26位的Asn的侧链上的酰胺基团通过N-糖苷键与糖物质直接键合(在生产中，酰胺键也可通过转化所述位置上的氨基酸为Asp并使糖物质与叠氮化的还原端反应而形成)。
[0166] 在其中hANP肽和糖物质经由接头结构连接的本发明的修饰的肽的情况下，如下文详细提及的，糖物质可与构成hANP肽的氨基酸的侧链上的官能团、N端和/或C端通过采用不同的接头结构连接。糖物质在hANP肽上所连接的位点优选是N端和/或C端，更优选是N端。
[0167] 本发明的修饰的肽可在一个分子中包括一个hANP肽，或可以是包含两个或更多个hANP肽的hANP的多价的修饰的肽。hANP的多价的修饰的肽可以通过选择具有多个官能团的接头分子而适当地产生，所述官能团能够结合hANP肽，使得多个hANP分子可与接头结构连接。
[0168] <糖物质>
[0169] 在本发明中，"糖物质"意指由一个单糖或通过糖苷键彼此键合的两个或更多个单糖的结构单元组成的结构单元。在本发明中，糖物质还被称为"GLY"。或者，具体的单糖或糖链也通过缩写表示，例如"GlcNAc-"或"SG-"。由带有这些缩写的结构式表示的糖物质在第1位(其为还原端)的碳原子上通过O-或N-糖苷键与接头结构或hANP肽键合，除非另外说明。属于糖苷键的氧原子或氮原子未包括在表示糖物质的缩写中，除非另外定义。
[0170] 在本说明书中，作为糖物质的基本单元的单糖以其环结构表示，其中为方便起见，与构成环的氧原子键合和直接与羟基(或属于糖苷键的氧原子)键合的碳原子被定义为第1位(仅对于唾液酸来说是第2位)，除非另外说明。实施例中描述的化合物根据其整个化学结构来命名，因此该规则不必然对其适用。
[0171] 包含在糖物质中的单糖不特别受到限制，只要所述单糖具有糖的基本结构。可使用各种单糖，例如6-元和5-元糖。单糖可以是天然存在的糖，或可以是人工合成的糖。天然存在的糖是优选的。单糖的实例可包括葡萄糖(Glu)、果糖(Flu)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡糖胺(Glc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、葡糖醛酸(GlucA)、神经氨酸(Neu)、唾液酸/N-乙酰基神经氨酸(NeuNAc/Neu5Ac)、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、木糖(Xyl)、艾杜糖醛酸(IdoA)、岩藻糖(Fuc)、丙醛糖、甘油醛、丁醛糖、赤藓糖、苏糖、戊醛糖、核糖、来苏糖、阿拉伯糖、己醛糖、阿洛糖、塔罗糖、古洛糖、醛糖、艾杜糖、酮丙糖、二羟基丙酮、酮丁糖、赤藓酮糖、戊酮糖、木酮糖、核酮糖、己酮糖、阿洛酮糖、山梨糖和塔格糖。
[0172] 由通过糖苷键键合的多个单糖组成的寡糖或多糖可用作本发明的糖物质。所述寡糖不特别受到限制，只要所需数量的单糖通过糖苷键键合。其实例可包括：二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖；三糖，例如麦芽三糖、松三糖和蜜三糖；和四糖，例如霉菌赤藓醛糖、黑曲四糖和水苏四糖。多糖的实例可包括直链淀粉、糖原、纤维素、壳多糖、壳聚糖、软骨素、硫酸软骨素、透明质酸、葡聚糖和硫酸葡聚糖。
[0173] 本发明的糖物质可以是糖链。"糖链"可以是天然的糖链，其在体内产生或通过代谢产生和由通过糖苷键键合的两个或更多个单糖组成，或可以是改变的糖链，其具有参照天然的糖链的结构而添加的人工改变。天然的糖链作为糖链(碳水化合物)或以糖蛋白或糖脂的形式存在于动物、植物、微生物等中，并且可通过从其中分离和纯化而获得。改变的糖链是从天然糖链的糖链结构人工改变的糖链。改变的方法可以是通过合成化学或酶化学添加、置换和/或缺失天然来源的糖链中的一个或多个单糖，优选是通过使用适合于非还原端的糖的糖苷酶在非还原端上缺失糖的改变。包含在糖链中的单糖的数目不特别受到限制，只要所述数目是两个或更多个。可选择任意数目的单糖，例如选自大约50个或更少、大约40个或更少和大约30个或更少个单糖。包含在糖链中的单糖的数目优选是大约25个或更少、更优选大约20个或更少、甚至更优选大约15个或更少、还优选11个或更少。
[0174] 本发明的糖链可以是线性的或有分支的。线性的糖链是这样的糖链，其中除了在非还原端上的糖之外，包含在糖链中的所有单糖以线性的形式连接，使得每个单糖在并非其环结构的第1位的碳原子的一个碳原子上直接或经由取代基与另一单糖的第1位(对于唾液酸而言为第2位)的碳原子通过糖苷键键合。
[0175] 另一方面，有分支的糖链是这样的糖链，其中包含在糖链中的一个或多个单糖以分支的形式的连接，使得至少一个单糖在并非其环结构的第1位的碳原子的两个或更多个碳原子上直接或经由取代基与其它单糖的第1位(对于唾液酸而言为第2位)的碳原子通过糖苷键键合。对于线性的和有分支的糖链两者，环结构的第1位碳侧的末端(还原端)由一个单糖构成，并且在该还原端上的糖的第1位(对于唾液酸而言为第2位)的碳原子通过O-或N-糖苷键与接头结构或hANP肽键合。
[0176] 另一方面，在糖链的非还原端上的单糖不与另一个糖在并非第1位(对于唾液酸而言为第2位)的碳原子的位点上形成糖苷键。糖链具有与分支的数量相同数量的非还原端和主要在该非还原端上变化。
[0177] 包含在天然的糖蛋白中的糖链从广义上分为与糖蛋白的天冬酰胺连接的N-连接的糖链和与其丝氨酸或苏氨酸连接的O-连接的糖链，这两者都具有其特征性的基本结构。天然地，N-连接的糖链通过N-糖苷键与蛋白质的氨基酸侧链键合，而O-连接的糖链通过O-糖苷键与其键合。人工糖链可与其它化合物通过任一种糖苷键键合。因此，糖苷键的类型不受所述糖链的结构的限制。例如，糖物质在其还原端上叠氮化，并且该叠氮化的糖物质可与具有羧基的化合物在三苯基膦的存在下反应以将具有所需结构的化合物与糖物质通过N-糖苷键键合。或者，糖物质可与具有羟基的化合物(例如醇)反应以将糖物质与所需化合物通过O-糖苷键键合。
[0178] N-连接的糖链的基本结构由下式表示(结构式(I)和序列(II))。具有该糖链结构的糖链命名为AG(5)。
[0179] [式24]
[0180]
[0181] (I)
[0182] [式25]
[0183]
[0184] (II)
[0185] 在上式中，"O/N-L"表示与接头结构通过O-糖苷键或N-糖苷键结合。在上式中，在还原端上通过置换还原端的GlcNAc为Glc或Man而改变的糖链分别被称为AG(5-Glc)和AG(5-Man)。
[0186] 大多数N-连接的糖链具有该基本结构。其非还原端或有分支的糖可进一步与糖链键合。
[0187] 人糖链或人相容的糖链是已知在人体中不显示抗原性的糖链。例如，N-连接的糖链的高-甘露糖的、复合的和混合的形式是已知的。高-甘露糖形式是具有富含甘露糖结构的糖链，其由N-连接的基本结构的非还原端上的多个甘露糖分子组成。复合形式是在N-连接的基本结构的非还原端上具有Galβ1-4GlcNAc基序结构的糖链。混合糖链是在N-连接的基本结构的非还原端上具有Gal1β-4GlcNAc基序结构和还具有由多个甘露糖分子组成的富含甘露糖结构的糖链。
[0188]
[0189] N-连接的复合糖链典型地是包含在鸡蛋黄中的唾液酸糖肽(在下文中称为"SGP")中包含的糖链。其实例可包括唾液聚糖(在下文中称为"SG")，具有由以下结构式(III)和序列(IV)表示的结构：
[0190] [式26]
[0191]
[0192] (III)
[0193] [式27]
[0194]
[0195] (IV)
[0196] 在上式中，"O/N-L"表示与接头结构通过O-糖苷键或N-糖苷键结合。在上式中，在还原端上通过置换还原端的GlcNAc为Glc或Man而改变的糖链分别被称为SG(Glc)和SG(Man)。
[0197] 如后文所提及的，SG可通过本领域已知的方法使SGP与酶(Endo-M、其突变体等)反应，接着通过水解裂解或转移至需要的化合物而获得。SGP可根据常规的方法自鸡蛋黄分离和纯化，例如描述于WO2011/0278681中的方法。或者，SGP的纯化产物是可市售获得的(Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd.或Fushimi Pharmaceutical Co., Ltd.)和可购买得到。
[0198] 在还原端上通过置换SG的还原端的GlcNAc为另一种糖而改变的糖链可通过使用后文提及的转糖基反应而制得。在还原端上通过置换SG的还原端的GlcNAc为Glc而改变的糖链被称为SG(Glc)。在还原端上通过置换SG的还原端的GlcNAc为Man而改变的糖链被称为SG(Man)。
[0199] 可用作本发明的糖物质的改变的糖链的具体的实例可包括AG(9) (下文给出的结构式(V)和序列(VI))，其因为SG的神经氨酸酶处理而缺少两个非还原端Neu5Ac残基；AG(7) (下文给出的结构式(VII)和序列(VIII))，其因为AG(9)的半乳糖苷酶处理而缺少两个非还原端Gal残基；和AG(5) (具有前述N-连接的基本结构的糖链)，其因为用N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶进一步处理AG(7)而缺少两个非还原端GlcNAc残基。此外，在AG(9)、AG(7)和AG(5)的还原端上改变的糖链(例如AG(9)的还原端的GlcNAc置换为Glc的AG(9-Glc)和AG(9)的还原端的GlcNAc置换为Man的AG(9-Man))可按上文，使用在SG的还原端上改变的糖链(例如SG(Glc)或SG(Man))代替SG，通过相同的处理来获得，并且可用作本发明的糖物质。
[0200] [式28]
[0201]
[0202] (V)
[0203] [式29]
[0204]
[0205] (VI)
[0206] 在上式中，"O/N-L"表示与接头结构通过O-糖苷键或N-糖苷键结合。在上式中，在还原端上通过置换还原端的GlcNAc为Glc或Man而改变的糖链分别被称为AG(9-Glc)和AG(9-Man)。
[0207] [式30]
[0208]
[0209] (VII)
[0210] [式31]
[0211]
[0212] (VIII)
[0213] 在上式中，"O/N-L"表示与接头结构通过O-糖苷键或N-糖苷键结合。在上式中，在还原端上通过置换还原端的GlcNAc为Glc或Man而改变的糖链分别被称为AG(7-Glc)和AG(7-Man)。
[0214] 本发明的修饰的肽不受糖物质的最大数量的限制，只要在一个分子中，至少一个糖物质与hANP肽连接。糖物质的数量为例如20个或更少、更优选15个或更少、甚至更优选12个或更少、还优选10个或更少、还更优选5个或更少、还更优选1、2、3或4个、最优选1或2个。包含在一个分子中的糖物质可具有相同的结构或可以是结构上不同的糖物质的混合物。优选所有这些糖物质是相同的糖物质。
[0215] 在本发明中，在使用天然存在的糖蛋白-或糖脂-衍生的糖链作为糖物质的情况下，可在经裂解或分离或通过使用酶的转糖基作用而转移至所需化合物(接纳体化合物)之后使用糖链。根据所用的糖链的结构，用于这样的反应的酶可选自本领域已知的各种酶(Endo-A：Li, B.等J. Am. Chem. Soc. 127 (2005), pp. 9692-9693；Endo-F：Wei Huang.等ChemBioChem 12 (2011), pp. 932-941；Endo-D：Shu-Quan Fan等J. Biol. Chem. 287 (2012), pp. 11272-11281；和Endo-S：Wei Huang等J. Am. Chem. Soc. 134 (2012), pp. 12308-12318.)。作为这样的酶的实例，例如，endo-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶已知为一系列酶家族，其水解壳二糖结构中的β-糖苷键，根据其来源而称为Endo-A、Endo-D、Endo-F、Endo-M、Endo-S等。
[0216] 其中，来源于冬令毛霉(Mucor hiemalis)的Endo-M具有水解糖链的还原端侧的GlcNAc-GlcNAc之间的糖苷键的活性，所述糖链具有N-连接的基本结构。此外，该酶甚至还具有将含有通过自N-连接的糖链基本结构的该水解而裂解的第二还原端GlcNAc的非还原端侧的糖链转移和键合至具有GlcNAc位点的另一接纳体化合物的GlcNAc的第4位的活性(参见例如Y. Tomabechi等Bioorg. Med. Chem., 18 (2010), pp. 1259-1264)。此外，已知当使用Endo-M在类似的转糖基反应中，具有不同的糖单元(例如Glc或Man)代替GlcNAc的结构的化合物用作接纳体化合物时，类似的转移反应在糖单元对应于GlcNAc的第4位的位置上进行(内切糖苷酶-生物化学、生物技术、应用(Endoglycosidases - Biochemistry, Biotechnology, Application), Masahiko Endo等Kodansha, Tokyo (2006))。
[0217] 作为Endo-M的底物的糖链结构可以是具有N-连接的基本结构的任何糖链结构，并且各种糖链，例如高-甘露糖的、复合的和混合的形式可用作底物。AG(5)、AG(7)、AG(9)和SG也用作Endo-M的底物。Endo-M N175Q，其为Endo-M的突变体，是这样的突变体，其显示水解活性降低同时保持Endo-M的底物特异性和转糖基活性。Endo-M N175Q特别优选用于将糖链与所需的化合物通过转糖基反应而键合。在使用Endo-M N175Q的情况下，例如，切断的糖链部分例如SG-Oxa可用作糖链供体，或可使用糖肽或糖蛋白例如SGP (Midori Umekawa等JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 285, 2010, pp. 511-521 (其还描述了其它突变体的报告))。Endo-M和其突变体酶可通过本领域已知的方法通过遗传工程改造产生。或者，Endo-M和Endo-M N175Q可作为市售可得的试剂而购买获得(供应商：Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd.)。
[0218] 在使用通过使用水解酶切断的糖链的情况下，底物可与水解酶在合适的温度下反应合适的时间，并且糖链可自获得的反应溶液中分离。
[0219] 切断的糖链可原样使用或可在其还原端上经修饰而使用。例如在还原端具有GlcNAc的糖链的情况下，该糖链可用DMC处理和作为GLY(GlcNAc)-oxa分离(特别是，具有噁唑啉环的SG-Oxa，所述噁唑啉环在与GlcNAc的环结构的第1位的碳原子键合的羟基和与第2位的碳原子键合的N-乙酰基之间形成)。由此切断的糖链可用作转移反应至接头分子(GlcNAc化合物)的底物和由此与所需化合物键合。
[0220] 在通过使用糖基转移酶转移糖链至所需化合物的情况下，底物(糖链供体)、接纳体化合物和糖基转移酶在合适的温度下反应合适的时间，并且目的化合物通过分离通过将目的糖链转移并结合至接纳体化合物而制得的化合物，自得到的反应溶液中获得。例如，在使用SGP作为底物的情况下，GlcNAc化合物作为接纳体化合物，和Endo-M N175Q作为糖基转移酶，将适当量的GlcNAc化合物和适合于GlcNAc化合物的GlcNAc化合价的剂量的SGP在Endo-M-N175Q和(如果需要的话)合适量的DMSO的存在下在20-40℃ (优选20-30℃、更优选22-27℃、最优选25℃)摇动1-10小时(优选2-8小时、更优选3-6小时)，并且得到的反应产物可通过使用反相HPLC来纯化(ODS；其使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液)。
[0221] 官能团，例如氨基(SG-NH2等)、羧基(SG-A等)、叠氮基(SG-N3等)、马来酰亚胺基团(SG-M)或α-碘代乙酰基酰胺基团(SG-I)可与糖链的还原端使用后文提及的各种GlcNAc化合物通过所述转移反应而键合。由此制备的糖链可与所需的接头结构连接。
[0222] 由此获得的糖链-结合的化合物可与hANP肽直接键合，或可经由另一接头分子与hANP肽连接。
[0223] 在此情况下，"接纳体化合物"包括除了第1位碳上的糖苷键之外未经过修饰的糖，且其不特别受到限制，只要所述化合物在转糖基反应中起糖接纳体的作用。优选地，含有GlcNAc作为糖的"GlcNAc化合物" (其将在后文中详细提及)、含有Glc作为糖的"Glc化合物"、含有Man作为糖的"Man化合物"等可用作接纳体化合物。GlcNAc化合物是最优选的。
[0224] <接头结构>
[0225] 在本发明中，接头结构意指介导在本发明的修饰的肽的hANP肽和糖物质之间的连接的化学结构。接头结构通过糖苷键在至少一个位点上与hANP肽键合和在至少一个位点上与糖物质键合。
[0226] 对于hANP肽和接头结构之间的连接，接头结构可键合至选自hANP肽的N-端氨基、hANP肽的C-端羧基和hANP肽的组成氨基酸的至少一个侧链的任何位置。结合位置的数量可以是一个或两个或更多个。在结合氨基酸侧链的情况下，可提供具有适合于结合各个官能团(其为SEQ ID NO: 1的第1、5、6或25位的Ser或第28位的Tyr的侧链上的羟基，或其为第26位的Asn的侧链上的酰胺基团等)的官能团的所需化合物。
[0227] 在本发明的修饰的肽或其部分结构的表示上，氨基酸或肽的N端(氨基)和C端(羧基)分别表示在左边和右边，除非另外说明。在右边具有符号"*"的氨基酸或肽(例如Gln*)表示与该规则相反，C端和N端分别表示在左边和右边。
[0228] 在氨基酸的表示上，与中心碳原子(α碳)直接键合的氨基和羧基(其为氨基酸所必需的结构)分别被称为"α氨基"和"α羧基"。
[0229] 当糖物质与hANP肽的N端(氨基)和C端(羧基)的至少一个连接时，hANP肽和接头结构形成酰胺键。其中糖物质与hANP肽的N端经由接头结构而连接的修饰的肽表示如下：
[0230] GLY-L-hANP (A)
[0231] 其中GLY表示糖物质；L表示接头结构，其为线性的或具有两个或更多个分支；hANP表示hANP肽；L通过O-或N-糖苷键与GLY键合；当L具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和L通过酰胺键与hANP肽的N端键合。
[0232] 在本说明书中在修饰的肽或其部分结构的表示上，当氨基酸或肽在其N-端氨基上与另一接头连接时，表示所连接的结构单元的符号以连字符表示，并且在表示该肽或氨基酸的符号的左侧没有括号。在该情况下，连字符表示在肽或氨基酸的氨基和接头结构所携带的羧基之间形成的酰胺键。例如，其中SG与Asn的氨基连接的结构被称为"SG-Asn"。
[0233] 其中糖物质与hANP肽的C端经由接头结构连接的修饰的肽表示如下：
[0234] hANP-L-GLY (B)
[0235] 其中GLY表示糖物质；L表示接头结构，其为线性的或具有两个或更多个分支；hANP表示hANP肽；L通过O-或N-糖苷键与GLY键合；当L具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和L通过酰胺键与hANP肽的C端键合。
[0236] 具体地，在本说明书中在修饰的肽或其部分结构的表示上，当氨基酸或肽在其C-端羧基上与另一结构单元连接时，表示所连接的结构单元的符号以连字符表示并且在表示该肽或氨基酸的符号的右侧没有括号。在该情况下，连字符表示在肽或氨基酸的C-端羧基和接头结构所携带的氨基(或叠氮基)之间形成的酰胺键。例如，其中SG与Tyr的羧基连接的结构被称为"Tyr-SG"。
[0237] 在本发明中，其中糖物质与hANP肽的N端和C端两者连接的修饰的肽由下式C表示：
[0238] GLY-L1-hANP-L2-GLY (C)
[0239] 其中GLY表示糖物质；L1和L2可以相同或不同，各自表示接头结构，其为线性的或具有两个或更多个分支；hANP表示hANP肽；L1和L2各自通过O-或N-糖苷键与GLY键合；当L1或L2具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；和L1和L2分别通过酰胺键与hANP肽的N端和C端中的每一个键合。
[0240] 在本发明的修饰的肽或其部分结构中，其中糖物质与氨基酸侧链连接的部分结构由下式D表示：
[0241] (GLY-)AA (D)
[0242] 其中GLY表示糖物质；AA表示任意的氨基酸；和氨基酸的侧链通过O-或N-糖苷键直接或经由接头结构与GLY键合。
[0243] 具体地，在本说明书中在修饰的肽或其部分结构的表示上，当氨基酸或肽在其侧链官能团上与另一结构单元连接时，表示所连接的结构单元的符号以连字符表示，并且符号左侧的括号表示连接的氨基酸。在该情况下，连字符表示在糖物质的还原端上含有糖苷键的化学结构。当该连接由接头结构介导时，也可描述接头结构的结构特征(例如(SG-PEG(3)-)Asn)。然而，当接头结构不具有这样的特征结构或未定义时，其可省略(例如(SG-)Lys)。实施例中描述的化合物的名称表示由随其提供的结构式表示的具体化合物。
[0244] 与所述规则一致的是，其中SG与Lys的侧链氨基和α氨基两者连接的部分结构被称为"SG-(SG-)Lys"。同样地，其中SG与Glu的侧链羧基和α羧基两者连接的部分结构被称为"(SG-)Gln-SG"或"SG-(SG-)Gln*" (其中当侧链羧基形成酰胺键时，Asp和Glu具有与Asn/Gln相同的结构；和Gln*意指羧基位于左边和氨基位于右边)。
[0245] 当一个分子含有多个hANP肽时，采用个别的表示。例如，其中糖物质与Lys的α羧基连接和hANP肽的N端经由PEG接头分别与α氨基和侧链氨基连接的结构被称为"GLY-Lys*(-PEG-hANP)2"。
[0246] 糖物质和接头结构通过N-或O-糖苷键在糖物质的还原端的第1位的碳原子上键合。在该方面，糖苷键的构型可选择为α-位和β-位中的任一个。根据本领域已知的方法可选择性合成任何结合模式(Tomoya Ogawa等Agric. Biol. Chem. 47 (1983), pp. 281-285.；和Mamoru Mizuno等121 (1999), pp. 284-290.)。在使用来源于天然糖蛋白的糖链的情况下，期需选择与该糖链的天然存在的结合模式相同的模式。当糖物质是例如SG或其改变的糖链时，对于具有接头结构的糖苷键，期需选择β-位。
[0247] 在本说明书中，当糖物质用符号(例如GLY、SG或GlcNAc)表示时，该符号也包括还原端的碳，不包括属于N-或O-糖苷键的N或O，除非另外定义。同样地，当hANP肽用符号(例如hANP或hANP(1-28))表示时，按规则该符号也包括N-端-NH和C-端C=O。N端和C端分别表示在左边和右边，除非另外说明。具体地，未修饰的hANP肽被称为H-hANP-OH。
[0248] 包含在本发明的修饰的肽中的接头结构的化学结构具有通过糖苷键与至少一个糖物质键合的氧原子或氮原子和与至少一个hANP肽键合的部分结构(对于酰胺键而言为NH或C=O，或对于与hANP肽的侧链连接，适合于各个侧链的结构的结构(其将在后文提及))。其它结构不受限制，并且可来源于单个分子或可以是其中键合多个分子的多个部分结构。接头结构从其中来源的这样的分子被称为"接头分子"。当多个部分结构包含在接头结构中时，根据部分结构，这些部分结构可表示为"Lx"。例如，与糖物质直接键合的部分结构表示为"Lg"。该部分结构完全满足适用于接头结构的定义，除了与hANP肽直接键合的结构之外。此外，与hANP肽直接键合的部分结构表示为"Lp"。该部分结构完全满足适用于接头结构的定义，除了属于具有糖物质的糖苷键的结构之外。
[0249] 在本发明的接头结构中，连接属于糖苷键的N或O的原子和与hANP肽直接键合的原子的最短链(在酰胺键的情况下，N或C属于酰胺键)被称为"连接链"。连接链含有属于每个前述的键的原子。例如，由(GLY)-O-CH2-C(=O)-(N端hANP)表示的修饰的肽具有由3个原子的连接链组成的接头结构。此外，由(GLY)-NH-C(=O)-CH2-CH2-NH-(C端hANP)表示的修饰的肽具有由5个原子的连接链组成的接头结构。本发明的接头结构不特别受到限制，只要接头结构具有3个或更多个原子的连接链。连接链可以具有例如200个或更少个原子和优选具有大约150个或更少个原子、更优选具有100个或更少个原子、甚至更优选具有70个或更少个原子、50个或更少个原子、或30个或更少个原子、最优选具有20个或更少个原子、15个或更少个原子、或10个或更少个原子。对于形成这样的接头结构，多个接头分子可用于产生具有复杂的和长的连接链的接头结构。优选使用5个或更少个接头分子。含有来源于4、3、2或1个接头分子的接头结构的修饰的肽也是优选的。
[0250] 当本发明的接头结构来源于一个接头分子时，该接头分子是在一个分子中含有通过糖苷键与糖物质结合的官能团和与hANP肽结合的官能团两者的化合物，并且因为具有氨基和羧基而优选为例如氨基酸或肽，更优选在侧链上具有氨基、羧基、羟基等的氨基酸。这样的接头分子的具体实例可包括HO-CH2-COOH、HO-CH2-CH2-NH2、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸和赖氨酸。
[0251] 当本发明的接头结构衍生自多个接头分子时，含有能够通过糖苷键结合糖物质的官能团的至少一种化合物和具有能够结合hANP肽的官能团的化合物用作这些接头分子。这两种化合物还具有允许化合物彼此直接键合的官能团。或者，这两种化合物可经由另外的化合物彼此连接。本领域已知的方法可应用于在这样的接头分子之间结合。其实例可包括但不具体限于，氨基和羧基之间的酰胺键、SH基团和马来酰亚胺基团之间的键、SH基团和碘代乙酰基之间的键、苯酚基团和三唑二酮基团之间的键(Hitoshi Ban等, 132 (2010), 1523-1525)、醇和羧基之间的酯键、和通过Huisgen反应的叠氮基团和乙炔基团之间的键。
用于本发明中的接头分子可合适地选自具有适合用于这些结合模式的官能团并用于形成接头结构的那些。
用于本发明中的接头分子可合适地选自具有适合用于这些结合模式的官能团并用于形成接头结构的那些。
[0252] 本发明的修饰的肽需要作为整体显示一定程度的亲水性。因此，当接头结构的大小高于某一水平时，优选采用高度亲水的结构。这样的结构的实例包括聚氧化烯和聚酰胺或其它生物学可适用的重复结构。
[0253] 聚氧化烯的实例可包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚丁二醇和聚乙烯醇(PVA)。PEG是优选的。在本说明书的含有PEG的接头结构的表示法中，乙氧基重复的数量表示为例如PEG(3)或PEG(11)。具有这样的结构的修饰的肽的实例可包括工作实施例中制备的化合物2-13和2-27至2-34。
[0254] 或者，本发明的接头结构可含有氨基酸或两个或更多个氨基酸通过肽键键合的寡肽链。这样的氨基酸或寡肽链可呈这样的结构，其通过酰胺键直接键合至hANP肽的N端或C端以延伸hANP肽的肽链。或者，该结构可经由非-肽结构连接至hANP肽或可具有这两种结构。
[0255] 在本发明的接头结构中包含的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸具有这样的氨基酸结构，其中氢原子、氨基和羧基与相同的碳原子键合。所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸或可以是人工氨基酸。人工氨基酸可以是合成产生的氨基酸例如D氨基酸或可以是具有天然存在的氨基酸的人工修饰的侧链的改变的氨基酸。所述氨基酸优选是天然存在的氨基酸或改变的氨基酸，更优选天然存在的氨基酸。当本发明的修饰的肽用作药物的活性成分时，优选接头结构中包含的氨基酸不应具有其自身的生物活性，还优选采用Gly或其侧链与另一结构键合的氨基酸。包含这样的氨基酸的接头结构的实例可包括这样的接头结构，其含有Gly或由两个或更多个Gly残基组成的寡聚-Gly并在N端和C端与hANP肽和糖物质连接。这样的修饰的肽的具体实例可包括化合物2-40，其中SG(Glc)用作糖物质和包含Gly作为接头。
[0256] 例如，"在侧链上具有氨基的氨基酸"，例如Lys，其具有侧链氨基；“在侧链上具有SH基团的氨基酸”，例如Cys，其具有侧链SH基团；“在侧链上具有羧基的氨基酸”，例如天冬氨酸或谷氨酸，其具有侧链羧基；“在侧链上具有羟基的氨基酸”，例如丝氨酸，其具有侧链羟基；或“在侧链上具有苯酚的氨基酸”，例如酪氨酸，其具有侧链p-苯酚基团，可用作具有这样的侧链结构的氨基酸。具有侧链结构的该氨基酸可在三个位点获得连接，即与α碳键合的氨基和羧基和侧链官能团。因此，为形成有分支的接头结构，优选含有具有侧链结构的这些氨基酸中的至少一个。
[0257] 在侧链上具有氨基的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸在侧链上具有至少一个氨基(除了酰胺基团之外)。在侧链上具有氨基的天然氨基酸是Lys。在侧链上具有氨基的人工氨基酸的实例可包括通过二价胺例如1,2-二氨基乙烷与Glu或Asp的侧链羧基反应获得的改变的氨基酸。
[0258] 当接头结构含有在侧链上具有氨基的至少一个氨基酸并且糖物质与在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链连接时，可采用以下通式的部分结构：
[0259] [式32]
[0260]
[0261] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；N-(AA)表示源自在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链氨基的氮原子；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链氨基连接的结构部分。
[0262] 具有这样的部分结构的接头结构可通过以下产生：将保护基引入在侧链上具有氨基的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子中的羧基，随后与通过"GLY-Lg-COOH"表示的接头分子反应，使羧基脱保护，和使得到的化合物与hANP肽或Lp键合。在该反应中，当在侧链上具有氨基的氨基酸具有游离α氨基时，Lg可通过酰胺键与侧链氨基和α氨基两者形成具有分支结构的接头结构。由此构成的修饰的肽是，例如，具有部分结构例如SG-(SG-)Lys的修饰的肽。这样的化合物的具体实例可包括在工作实施例中制备的化合物2-14和2-35。
[0263] 在类似的制备中，具有其中hANP肽与在侧链上具有氨基的氨基酸的侧链连接的部分结构的修饰的肽可通过置换Lg(-糖物质)为Lp(-hANP肽)来产生。这样的部分结构可通过以下来产生：将保护基引入在侧链上具有氨基的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子中的羧基，随后与通过"Lp-COOH"表示的接头分子反应，使羧基脱保护，和使Lg或糖物质与羧基键合。在该反应中，当在侧链上具有氨基的氨基酸具有游离α氨基时，Lp可通过与侧链氨基和α氨基两者的酰胺键形成具有分支结构的接头结构。由此构成的修饰的肽是，例如，具有部分结构例如Lp-(Lp-)Lys-Lg的修饰的肽。这样的化合物的具体实例可包括化合物2-38和2-39。此外，在一个分子中含有多个糖物质和/或多个hANP肽的修饰的肽可通过与具有不同结构的其它接头分子组合使用而合适地产生。
[0264] 或者，具有大量氨基的结构可通过自在侧链上具有氨基的各个氨基酸的侧链氨基和α氨基与在侧链上具有氨基的相同氨基酸的α羧基重复形成各自的酰胺键来形成，并且该结构可与Lg键合以形成与氨基数目相同的数目的糖物质连接的接头结构。例如，在这样的分支的肽中的多个氨基可与具有羧基的糖链反应，例如通过使用缩合剂例如HATU以经由分支的肽引入多个糖链。由此产生的修饰的肽的实例包括接头结构例如"SG-[SG-(SG-)Lys-]Lys"和"SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys"。这样的修饰的肽的具体实例可包括化合物2-14和2-35。
[0265] 在侧链上具有SH基团的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸在侧链上具有至少一个SH基团。在侧链上具有SH基团的天然氨基酸是Cys。在侧链上具有SH基团的人工氨基酸的实例可包括通过具有例如HOOC-R-STr (三苯甲基硫化物)结构的化合物与Lys的侧链氨基反应或通过具有例如H2N-R-STr结构的化合物与Glu或Asp的侧链羧基反应获得的含有SH基团的改变的氨基酸。
[0266] 当接头结构含有在侧链上具有SH基团的至少一个氨基酸并且糖物质与在侧链上具有SH基团的氨基酸的侧链连接时，可采取以下通式的部分结构：
[0267] [式33]
[0268]
[0269] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；S表示来源于在侧链上具有SH基团的氨基酸的侧链SH基团的硫原子；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链SH基团连接的结构部分。
[0270] 具有这样的部分结构的接头结构可通过使在侧链上具有SH基团的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子与由(GLY)-Lg-N马来酰亚胺表示的接头分子反应而产生。在该反应中，在侧链上具有SH基团的氨基酸可在其α氨基和/或α羧基上与另一糖物质连接，从而形成具有分支结构的接头结构。例如，多个糖链可经由这样的分支肽通过以下引入：使在分支肽中的多个氨基与具有受保护的SH基团的3-巯基丙酸反应；将肽的C端脱保护；在与hANP肽结合后，使SH基团脱保护；和在0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.75)中与具有马来酰亚胺基团的糖链反应。这样的化合物的具体实例包括化合物2-19、2-20和2-23。
[0271] 在类似的制备中，具有其中hANP肽与在侧链上具有SH基团的氨基酸的侧链连接的部分结构的修饰的肽可通过置换Lg(-糖物质)为Lp(-hANP肽)来产生。此外，在一个分子中含有多个糖物质和/或多个hANP肽的修饰的肽可通过与具有不同结构的其它接头分子组合使用而合适地产生。
[0272] 在侧链上具有羧基的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸在侧链上具有至少一个羧基。在侧链上具有羧基的天然氨基酸是Asp或Glu。在侧链上具有羧基的人工氨基酸的实例可包括通过二价羧酸例如马来酸与Lys的侧链氨基反应获得的改变的氨基酸。
[0273] 当接头结构含有至少一个在侧链上具有羧酸基团的氨基酸并且糖物质与在侧链上具有羧酸基团的氨基酸的侧链连接时，可采取以下通式的部分结构：
[0274] [式34]
[0275]
[0276] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构并且可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；CO表示来源于在侧链上具有羧酸的氨基酸的侧链的CO；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链羧酸基团连接的结构部分。
[0277] 如果需要的话，具有这样的部分结构的接头结构可通过以下产生：引入保护基至在侧链上具有羧基的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子的氨基，随后与由"Lg-NH2"表示的接头分子反应，然后将氨基脱保护，和使得到的化合物与Lg或hANP肽的C端键合。在该反应中，当在侧链上具有羧基的氨基酸具有游离的α羧基时，Lg可通过与侧链羧基和α羧基两者的酰胺键形成具有分支结构的接头结构。例如，多个糖链可通过使用三氟乙酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺和与具有氨基的糖链(SG-NH2等)反应来活化具有多个羧基的分支肽的羧酸，经由这样的分支肽而引入。其中Glu用作在侧链上具有羧基的氨基酸和与SG连接的这样的部分结构表示为例如，"-(SG(Lg)-)Gln-(Lg) SG" (其中Glu和Asp具有与Gln/Asn相同的结构，因为它们的侧链形成酰胺键)。这样的修饰的肽的具体实例可包括化合物2-31和2-32。
[0278] 在类似的制备中，具有其中hANP肽与在侧链上具有羧基的氨基酸的侧链连接的部分结构的修饰的肽可通过置换Lg(糖物质)为Lp(hANP肽)来产生。如果需要的话，具有这样的部分结构的接头结构可通过以下产生：引入保护基至在侧链上具有羧基的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子的氨基，随后与由"(hANP)-Lp-NH2"表示的接头分子反应，然后使氨基脱保护，和使得到的化合物与具有合适的官能团的Lg键合。在该反应中，当在侧链上具有羧基的氨基酸具有游离的α羧基时，Lp可通过与侧链羧基和α羧基两者的酰胺键形成具有分支结构的接头结构。例如，其中多个hANP肽经由这样的分支肽引入的hANP的多价修饰的肽可通过使用三氟乙酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺并与具有氨基的Lp或hANP肽的N-端氨基反应，活化具有多个羧基的分支肽的羧酸来产生。其中Glu用作在侧链上具有羧基的氨基酸和与hANP连接的这样的部分结构表示为例如，"SG Gln-(Lp-hANP)2" (其中Glu和Asp具有与Gln/Asn相同的结构，因为它们的侧链形成酰胺键)。此外，在一个分子中含有多个糖物质和/或多个hANP肽的修饰的肽可通过与具有不同结构的其它接头分子组合使用而合适地产生。
[0279] 或者，具有大量羧基的结构可通过自在侧链上具有羧基的各个氨基酸的侧链羧基和α羧基与在侧链上具有羧基的其它氨基酸的α氨基(其可以具有相同的类型或具有不同的类型和优选具有相同的类型)重复形成各自的酰胺键来形成，并且该结构可通过前述的反应与Lg键合以形成与羧基数目相同的数目的Lg连接的接头结构。接头结构的这样的部分结构为例如，"H-[(SG-)Gln-SG]Gln-SG"。
[0280] 在侧链上具有羧基的氨基酸的羧基可进一步通过N-糖苷键与糖物质直接连接，以形成以下部分结构：
[0281] [式35]
[0282]
[0283] 其中GLY表示糖物质；NH-CO-(AA)表示源自在侧链上具有羧基的氨基酸的侧链的酰胺结构；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链羧酸基团连接的结构部分。
[0284] 这样的部分结构可通过以下产生：在三苯基膦的存在下使在侧链上具有羧酸的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子与在还原端叠氮化的糖物质反应，和通过N-糖苷键使糖物质的还原端与侧链键合。此外，具有其中糖物质与在侧链上具有羧基的氨基酸的α羧基连接的结构的化合物可通过根据实施例的方法合成。这样的糖-修饰的肽的具体实例包括化合物2-3、2-4、2-8、2-9、2-13、2-21、2-22、2-27、2-28、2-38和2-39。
[0285] 在侧链上具有苯酚基团的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸在侧链上具有至少一个对苯酚基团。在侧链上具有苯酚基团的天然氨基酸是Tyr。在侧链上具有苯酚基团的人工氨基酸的实例可包括通过对氨基苯酚与Glu或Asp的侧链羧基反应获得的改变的氨基酸。
[0286] 当接头结构含有至少一个在侧链上具有苯酚基团的氨基酸并且糖物质与该氨基酸的侧链连接时，可采取以下通式的部分结构：
[0287] [式36]
[0288]
[0289] 其中GLY表示糖物质；Lg表示接头结构的糖链侧上的结构和可以是线性的或具有两个或更多个分支；GLY和L通过O-或N-糖苷键键合；当Lg具有分支时，存在与分支端的数目相同数目的GLY，所述分支端能够与GLY连接；苯酚基团表示源自在侧链上具有苯酚的氨基酸的侧链的苯酚基团；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链苯酚基团连接的结构部分。
[0290] 具有这样的部分结构的接头结构可通过使在侧链上具有苯酚基团的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子与由(GLY)-Lg-N三唑二酮(*)表示的接头分子反应来产生。在该反应中，在侧链上具有苯酚基团的氨基酸可在其α氨基和/或α羧基上连接另一糖物质，从而形成具有分支结构的接头结构。例如，GlcNAc结构可通过使用N-溴琥珀酰亚胺和与hANP反应来活化具有三唑二酮结构的GlcNAc，选择性地引入至对应于hANP的28位的Tyr的苯酚侧链。可用该化合物作为原料进行转糖基反应。这样的化合物的具体实例包括化合物2-6。
[0291] 在类似的制备中，具有其中hANP肽与在侧链上具有苯酚基团的氨基酸的侧链连接的部分结构的修饰的肽可通过置换Lg(糖物质)为Lp(hANP肽)产生。此外，在一个分子中含有多个糖物质和/或多个hANP肽的修饰的肽可通过与具有不同结构的其它接头分子组合使用而合适地产生。
[0292] 在侧链上具有羟基的氨基酸不特别受到限制，只要所述氨基酸在侧链上具有至少一个羟基。在侧链上具有羟基的天然氨基酸是Ser或Tyr。在侧链上具有羟基的人工氨基酸的实例可包括通过氨基醇例如2-氨基乙醇与Asp或Glu的侧链羧酸反应获得的改变的氨基酸。
[0293] 当接头结构含有至少一个在侧链上具有羟基的氨基酸并且糖物质与该氨基酸的侧链连接时，可采取以下通式的部分结构：
[0294] [式37]
[0295]
[0296] 其中GLY表示糖物质；O表示源自在侧链上具有羟基的氨基酸的侧链羟基的氧原子；和(AA)含有氨基酸的基本结构和与侧链羟基基团连接的结构部分。
[0297] 具有这样的部分结构的接头结构可通过使在侧链上具有羟基的氨基酸或含有该氨基酸的接头分子与糖物质在形成O-糖苷键的条件下反应来产生。在该反应中，在侧链上具有羟基的氨基酸可在其氨基和/或α羧基上与另一糖物质连接，从而形成具有分支结构的接头结构。例如，GlcNAc可在三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯的存在下经由O-糖苷键通过使具有三氯乙酰亚胺酸酯结构的葡糖胺衍生物与丝氨酸的侧链羟基反应，接着数个步骤而引入至丝氨酸的侧链。可用该化合物作为原料进行转糖基反应。这样的修饰的肽的具体实例包括化合物2-5。
[0298] 在类似的制备中，具有其中hANP肽与在侧链上具有羟基的氨基酸的侧链连接的部分结构的修饰的肽可通过置换Lg(糖物质)为Lp(hANP肽)产生。此外，在一个分子中含有多个糖物质和/或多个hANP肽的修饰的肽可通过与具有不同结构的其它接头分子组合使用而合适地产生。
[0299] 至少与这些含官能团的侧链的数目相同数目的糖物质可通过上文提及的各种反应使用含有具有多个这样的氨基酸(具有侧链结构)的寡肽的接头分子或各自含有这些氨基酸的一个或多个的多个接头分子进行连接。这样的寡肽不特别受到限制，只要寡肽包含前述具有侧链的氨基酸。寡肽可进一步含有一定数量的Gly和优选具有其中这些Gly残基规则排列的重复序列。当具有侧链的氨基酸定义为例如Xaa时，由(Xaa-Glym)n (其中m和n各自独立地表示自然数1或更大)表示的寡肽是优选的。尽管n和m没有具体的上限，但每个n和m优选是10或更小，更优选7或更小。甚至更优选m是3或更小。寡肽的具体实例可包括但不限于(Cys-Gly)3、(Cys-Gly)5、(Lys-Gly-Gly)3和(Tyr-Gly-Gly-Gly)3。具有这样的结构的修饰的肽的具体实例可包括化合物2-15、2-17和2-18。
[0300] 上文描述的各种接头分子和GlcNAc化合物可通过合适的组合键合以合成具有按需要设计的结构的接头结构。这样的接头结构可设计为极其不同的结构，并且还可控制所键合的糖物质的数量。通过这样的设计和合成可产生修饰的肽的许多变化。
[0301] <制备方法和GlcNAc化合物>
[0302] 在本发明中，其中糖物质通过O-糖苷键与接头结构键合的修饰的肽可通过GlcNAc-oxa (或其相关物质，例如其中在GlcNAc部分上包含的三个羟基通过乙酰化保护) (其是N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的噁唑啉衍生物)与具有羟基(例如，羟乙酸苯甲酯或在侧链上具有羟基的氨基酸，例如丝氨酸或酪氨酸)的接头分子反应产生。此外，其中糖物质通过N-糖苷键与接头结构键合的修饰的肽可通过具有叠氮基团的糖物质与具有羧基的接头分子在三苯基膦的存在下反应产生。
[0303] 在本发明中的修饰的肽中，在连接作为糖物质的具有糖链结构的糖物质的情况下，糖链的还原端可合适地经修饰和与接头分子键合。或者，可合成具有特定的糖单元和所需结构的接纳体化合物(例如，GlcNAc化合物)，修饰的肽还可通过使用糖合酶(例如Endo-M N175Q)转移糖链至糖单元(例如GlcNAc)而产生。
[0304] 在本发明中，"GlcNAc化合物"是含有GlcNAc的化合物(其未经过修饰，除了在1位碳上的糖苷键和能够结合至其它分子的官能团之外)或与hANP肽连接的化合物。GlcNAc化合物可以是例如，其中作为单糖的GlcNAc通过糖苷键与所需化合物、氨基酸等在一个分子中键合的化合物、在非还原端上具有GlcNAc的糖链(例如AG(5))、或与其键合的化合物。化合物和GlcNAc之间的糖苷键可具有α-位或β-位的任一种，这两者都促进转移反应(内切糖苷酶：Masahiko Endo等, Biochemistry, Biotechnology, Application)。对于天然糖链在转移后的糖链结构，优选具有与天然存在的糖链中的相同的结合模式。例如，当转移后的糖-结合的化合物具有SG时，对于GlcNAc化合物作为SG的接纳体，还优选是β-位。
[0305] GlcNAc化合物可根据本领域已知的各种方法产生。例如，葡糖胺或4,5-二氢-2-甲基噁唑并[5',4':1,2]-3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-吡喃葡萄糖(下式；见Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500)：
[0306] [式38]
[0307]
[0308] 可用作原料来合适地合成具有所需结构和官能团的化合物。这样的GlcNAc化合物的具体实例可包括具有羧基的化合物1-2C、具有氨基的化合物1-7A和具有三唑二酮基团的化合物1-6D。此外，其中氨基酸与GlcNAc连接的GlcNAc化合物可通过选择性添加保护基至氨基或羧基来合成。其具体实例可包括Boc-(GlcNAc-)Ser (化合物1-1D)、Boc-(GlcNAc-)Asn (J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290)和(GlcNAc-)Gln。
[0309] 上述的GlcNAc化合物可与另一接头分子键合或与肽键合，以合成具有不同结构和连接官能团的GlcNAc化合物。这样的不同的GlcNAc化合物可用于制备本发明的修饰的肽。例如，具有氨基(或羧基)的GlcNAc化合物可与具有羧基(或氨基)和所需结构和官能团的接头分子键合，以合成具有所需官能团的GlcNAc化合物(具体实例：具有马来酰亚胺基团的化合物1-7B)。
[0310] 例如，具有氨基(或羧基)的GlcNAc化合物可与具有羧基(或氨基)的PEG接头分子键合，以合成具有所需长度的PEG的GlcNAc化合物(具体实例：化合物1-3A、1-4B、1-5A和1-19)。或者，多聚酰胺例如多聚Gly或多聚(Ser-Gly)可代替PEG使用，以合成具有所需长度的多聚酰胺接头的GlcNAc化合物(具体实例：化合物1-21B)。在此情况下，在侧链上具有官能团的氨基酸可用作在多聚酰胺中包含的氨基酸，以将另外的GlcNAc化合物键合至官能团。
[0311] 用于本发明的GlcNAc化合物可以是在一个分子中含有多个单独的GlcNAc残基的化合物。这样的多价GlcNAc化合物的实例包括其中两个GlcNAc残基通过N-糖苷键与前述氨基酸键合的化合物，和其中多个前述GlcNAc化合物与接头分子键合的化合物。例如，在侧链上具有氨基的氨基酸，例如Lys，可作为接头分子与2当量的具有羧基的GlcNAc化合物反应，以合成具有两个GlcNAc残基和一个羧基的GlcNAc化合物，例如GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH。该GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-OH可进一步与赖氨酸(在侧链上具有氨基的氨基酸)反应，以合成四价GlcNAc化合物。该步骤可重复进行以合成含有大量GlcNAc残基的GlcNAc化合物。当GlcNAc化合物具有多个官能团时，多价GlcNAc化合物也可通过引入保护基至这些官能团的一部分，将GlcNAc与其连接，然后将官能团脱保护，和将另外的GlcNAc化合物与脱保护的官能团键合来合成(具体实例：化合物1-5B)。这些途径可根据常规的方法合适地重复和/或组合，以合成不同的GlcNAc化合物。
[0312] 通过置换如以上定义、形式等的GlcNAc为Glc或Man而衍生自GlcNAc化合物的化合物分别被定义为Glc化合物和Man化合物。这些化合物还优选用作接纳体化合物以制备本发明的修饰的肽。
[0313] 在本发明的修饰的肽的制备中，修饰的肽可通过中间体(hANP、糖物质、接头分子、接纳体化合物等)的合适结合、转移等产生。这些中间体产生的顺序不特别受到限制，并且中间体可根据常规过程通过各种方法产生。根据常规方法，将各中间体所带的官能团适当地进行活化、失活、加入保护基、脱保护等，这取决于制备过程。
[0314] 糖物质可通过采用各种方法连接。例如，糖链转移至具有GlcNAc、Glc等的接头分子，并且该糖链-结合的接头分子可与hANP肽连接。或者，在修饰的肽的制备中，其中Glc或GlcNAc与hANP肽连接的中间体可用作转移糖链的接纳体化合物。糖物质带有的羟基可合适地进行步骤例如乙酰化和脱乙酰化，由此防止引起不需要的副反应。
[0315] <功能和活性>
[0316] 与未修饰的hANP(1-28)相比，本发明的修饰的肽显示在血液中延长的持续时间和优良的水溶性，并维持cGMP提高活性。hANP(1-28)从血液中快速消失，因此在临床实践中需要持续给予。相比之下，本发明的修饰的肽可产生药理学作用，甚至通过不连续给予。此外，本发明的修饰的肽的水溶性优于天然hANP，因此适合于含有高浓度的活性成分的制剂。本发明的修饰的肽的这样的性质允许采用通过常规天然hANP不能获得的给药方法、给药途径和制剂技术，并且还能够使修饰的肽用于治疗急性心血管疾病以及慢性心血管疾病(高血压、慢性心脏疾病等)。此外，本发明的修饰的肽还可用作生物学研究工具。不清楚当长期位于血液中时天然hANP如何或是否迁移至组织。相比之下，hANP长期残留在血液中的这种局部化或对活体的影响可通过给予本发明的修饰的肽进行检查。本发明的修饰的肽在血液中的持续时间可根据试验实施例3的方法通过将修饰的肽给予动物，然后检测外周血中的cGMP浓度和/或外周血样品中含有的修饰的肽来检验。本发明的修饰的肽甚至在体内给予后大约15分钟维持升高外周血中的cGMP浓度的作用，更优选甚至给予后大约30分钟维持该作用，更优选甚至给予后大约45分钟维持该作用，和进一步优选甚至给予后大约60分钟维持该作用。关于给予修饰的肽后来自外周血的修饰的肽的检测，优选甚至大约30分钟后、更优选甚至大约45分钟后、甚至更优选大约60分钟后、还优选甚至大约90分钟后检出该肽。
[0317] 本发明的修饰的肽通过连接的糖物质显示优良的水溶性。该优良的水溶性也受接头结构的化学结构的影响。在肽胶化的点上，每ml水中溶解的天然hANP的量是32 mmol。相比之下，每ml水溶解60 mmol或更多、优选80 mmol或更多、更优选100 mmol (例如，特别是112 mmol)的本发明的修饰的肽。因此，本发明的修饰的肽的水溶性是天然hANP的大约2倍或更多倍、优选大约3倍或更多倍。
[0318] 本发明的修饰的肽在血液中的持续时间可通过将修饰的肽给予生物体，以一定的时间间隔采集血液和检测在血液样品中含有的修饰的肽来测量。各种方法，例如通过LC-MS和使用特异识别hANP的环结构的抗体的ELISA检测，可用作检测修饰的肽的方法。在以产生其cGMP提高活性的剂量给予本发明的修饰的肽的情况下，血液样品的cGMP水平通过使用市售可得的测量试剂盒来测量，并与在开始给予之前检测的在血液中的cGMP水平比较。以该方式，修饰的肽在血液中的持续时间可测量作为生物学活性。或者，修饰的肽可用放射性同位素标记，通过用SDS-PAGE等分离血液样品并检测放射性信号来检测。
[0319] 在本发明中，"在血液中延长的持续时间"是指修饰的肽在血液中显示比天然hANP更长的持续时间。皮下给予猴子的天然hANP在给予后30分钟在血液中不再被检出。因此，如果修饰的肽在给予后30分钟可被检出，则其在血液中的持续时间可被视为是延长的。此外，通过皮下给予猴子的天然hANP，在血液中的cGMP水平升高在给予后60分钟回到与给予前相同的水平。因此，如果修饰的肽在给予后60分钟显示比给予前更高的cGMP水平，则其在血液中的持续时间可被视为是延长的。
[0320] 本发明的修饰的肽还对hANP肽通过NEP的降解具有抗性。这可能部分地是延长的持续时间的原因。对NEP降解的这样的抵抗可通过本领域已知的方法测量。
[0321] 本发明的修饰的肽的cGMP提高活性可通过用以至多足以提供最大活性的量的浓度梯度制备的试验物质刺激表达GC-A受体的细胞，然后裂解所述细胞，测量细胞裂解物中的cGMP浓度和鉴别最大cGMP浓度(Emax)来测量。对本发明的修饰的肽所述的短语"维持cGMP提高活性"意指与天然hANP的最大cGMP浓度相比，修饰的肽显示的最大cGMP浓度为大约30%或更高。修饰的肽显示的最大cGMP浓度优选为大约50%或更高、更优选大约70%或更高。与天然hANP相比，本发明的修饰的肽可以高浓度配制，和显示在血液中延长的持续时间。在该方面，根据指数例如所谓的EC50值来定义本发明的修饰的肽的活性是不合适的。如果升高浓度的修饰的肽的最大活性可以是等于或大于天然hANP的一定水平的活性的活性，则当在临床实践中连续地和/或以高浓度给予时，修饰的肽可显示足够的功效。
[0322] 本发明提供包含本发明的修饰的肽作为活性成分的药物。
[0323] <药物>
[0324] 可用作本发明的药物的活性成分的物质可以是上述修饰的肽的药学上可接受的盐。具体而言，在本发明中，所述物质的酸(无机酸，例如盐酸、硫酸或磷酸，或有机酸，例如，甲酸、乙酸、丁酸、三氟乙酸(TFA)、琥珀酸或柠檬酸)-加成盐可用作活性成分。或者，在本发明中，所述物质的金属(例如钠、钾、锂或钙)盐或基于其有机碱的盐形式可用作活性成分。本发明的修饰的肽的这样的盐可以是基于hANP肽部分的盐或可以是在糖物质的结构上形成的盐。本发明的修饰的肽的盐优选是在hANP肽部分形成的药学上可接受的盐、更优选在hANP肽部分形成的三氟乙酸盐或乙酸盐。本发明的药物组合物可含有涉及活性成分或其药学上可接受的盐的所述物质的游离形式。
[0325] 可用作本发明的药物的活性成分的物质或其药学上可接受的盐优选与本领域已知的药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等混合，和通过通常用于药物的给药方法给予个体，即口服给药方法或胃肠外给药方法例如经粘膜给药、静脉内给药、肌内给药或皮下给药。
[0326] 可用作本发明的药物的活性成分的物质的剂量根据疾病类型、个体(患者)的年龄、体重和病况严重性和给药途径等而不同。一般而言，每日剂量的上限是例如，大约100 mg/kg或更低、优选大约50 mg/kg或更低、更优选1 mg/kg或更低。每日剂量的下限是例如，大约0.1 μg/kg或更高、优选0.5 μg/kg或更高、更优选1 μg/kg或更高。
[0327] 给予本发明的药物的频率根据所用的活性成分、给药途径和待治疗的具体疾病而改变。在口服给予例如肽性物质的情况下，该物质优选开处方使得每日剂量的数目是4或更少。在胃肠外给药(例如静脉内给药)的情况下，药物可使用常规注射器注射，或可使用输注泵、导管等持续给予。或者，还优选通过途径例如皮下注射或肌内注射给药。在该情况下，可采用通常使用的各种给药装置。
[0328] 当本发明的药物的活性成分在溶液中制备时，本发明的修饰的肽或其药学上可接受的盐可溶于水性溶剂，和如果需要，补充有稳定剂、pH调节剂、表面活性剂等以制备所述溶液。当活性成分以冻干制剂制备时，由此制备的溶液可经冻干，并在使用时溶于生理盐水、注射用水或葡萄糖溶液。
[0329] 将本发明的药物给予具有通过激活GC-A可治疗的疾病和产生升高的cGMP水平的患者，从而有效治疗这样的疾病。在此背景下，所述疾病或其症状的"治疗"意指通过预期激活GC-A而正常化的病理性病况的进展被延迟、缓解、减轻和/或抑制，从而使所述病况更接近正常状态。本发明的药物预期通过在疾病的早期阶段开始给药或给予高风险的疾病的个体来有效预防所述疾病的恶化或发作。尽管在过去已经发展所述疾病的患者具有复发或慢性的风险，但通过连续给予这样的患者，本发明的药物可预期降低复发或慢性的风险。这些作用也包括在所述治疗的范围内。
[0330] 这样的疾病的实例包括高血压、急性心力衰竭(包括急性心力衰竭发作后医学病况的处理)、慢性心力衰竭、缺血性心脏疾病、急性肾炎(包括急性肾炎发作后医学病况的处理)、慢性肾炎、急性肾衰竭(包括急性肾衰竭发作后医学病况的处理)、慢性肾衰竭、缺血性心脏疾病(心肌梗死等)、恶性肿瘤的转移、肝纤维化、肝硬变、由透析引起的组织粘附、和纤维化。实施例
[0331] 在下文中，本发明将参照实施例来具体描述。实施例中描述的本发明的实施方案仅为说明的目的而给出，并不意欲通过这些实施例对本发明进行限制。
[0332] 实施例1是接头分子、GlcNAc化合物、糖物质或其衍生物的制备实施例，其是制备本发明的修饰的肽的中间体。实施例2是使用这些中间体的修饰的肽的制备实施例。试验实施例是关于本发明的修饰的肽的特性或效果的试验的实施例。
[0333] [实施例1]
[0334] <实施例1-1>
[0335] (1-1A) [(2R,3S,4R,5R,6R)-3,4-二乙酰氧基-6-羟基-5-(2,2,2-三氯乙氧羰基氨基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1-1A：下式的化合物)的合成
[0336] [式39]
[0337]
[0338] 将葡糖胺盐酸盐(10.0 g, 46.38 mmol)和碳酸氢钠(11.7 g, 139 mmol)溶于水(100 mL)。在室温下向溶液中滴加2,2,2-三氯乙基氯甲酸酯(7.66 mL, 55.7 mmol)，和将混合物搅拌1小时。通过加入1 N盐酸将反应溶液中和，和通过过滤收集得到的沉淀物。固体用水洗涤，然后在真空泵中干燥。将得到的固体溶于吡啶(50 mL)。在室温下向溶液中加入乙酸酐(24.1 mL, 255 mmol)，和将混合物搅拌过夜。在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 80:20 - 33:67, v/v)，得到中间体的粗产物，为无色油状物(19.4 g)。
[0339] 将得到的中间体的粗产物(19.4 g)溶于N,N-二甲基甲酰胺(200 mL)。在室温下向溶液中加入乙酸肼(4.01 g, 44.5 mmol)，和将混合物搅拌1小时。反应溶液用乙酸乙酯稀释和用10%盐水洗涤两次和用饱和盐水洗涤一次。经无水硫酸钠干燥和过滤后，在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 80:20 - 25:75, v/v)得到标题化合物1-1A，为白色固体(11.6 g，通过2个步骤的收率：52%)。
[0340] 1H-NMR (CDCl3) δ: 5.42 (1H, d, J = 9.8 Hz), 5.37-5.32 (2H, m), 5.16-5.10 (1H, m), 4.80 (1H, d, J = 11.7 Hz), 4.64 (1H, d, J = 12.1 Hz), 4.26-4.22 (2H, m), 4.17-4.12 (1H, m), 4.09-4.03 (1H, m), 3.46-3.43 (1H, m), 2.10 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.02 (3H, s)。
[0341] (1-1B) [(2R,3S,4R,5R,6S)-3,4-二乙酰氧基-6-(2,2,2-三氯乙烷亚胺酰基)氧基-5-(2,2,2-三氯乙氧羰基氨基)四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1-1B：下式的化合物)的合成
[0342] [式40]
[0343]
[0344] 将化合物1-1A (5.00 g, 10.4 mmol)溶于二氯甲烷(35 mL)。在0℃向溶液中加入三氯乙腈(10.4 mL, 104 mmol)和二氮杂双环十一碳烯(0.467 mL, 3.12 mmol)。将反应溶液加热至室温和搅拌40分钟。在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 75:25 - 50:50, v/v)得到标题化合物1-1B，为无色油状物(3.70 g，收率：57%)。
[0345] 1H-NMR (CDCl3) δ: 8.81 (1H, s), 6.43 (1H, d, J = 3.9 Hz), 5.37-5.34 (1H, m), 5.27-5.22 (2H, m), 4.72 (2H, dd, J = 16.2, 11.9 Hz), 4.32-4.26 (2H, m), 4.16-4.10 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.06 (6H, s)。
[0346] (1-1C) (2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸苯甲酯(化合物1-1C：下式的化合物)的合成
[0347] [式41]
[0348]
[0349] 将化合物1-1B (2.77 g, 4.44 mmol)溶于二氯甲烷(50 mL)。在室温下向溶液中加入(2S)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-羟基丙酸苯甲酯(1.31 g, 4.44 mmol)和三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(8.0 μL, 0.0444 mmol)，和将混合物搅拌1小时。向其中加入三乙胺(0.1 mL)，和在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 75:25 - 33:67, v/v)得到中间体的粗产物，为白色固体(2.01 g)。
[0350] 将得到的中间体的粗产物(2.01 g)溶于乙酸酐(50 mL)。在室温下向溶液中加入锌(1.5 g, 22.9 mmol)，用0.1 N盐酸、甲醇和乙醚(以该顺序)洗涤和干燥，和将混合物搅拌6小时。反应溶液通过硅藻土过滤，和在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化两次(己烷:乙酸乙酯= 50:50 - 0:100, v/v)得到标题化合物1-1C，为无色固体(0.846 g，通过2个步骤的收率：31%)。
[0351] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.40-7.33 (5H, m), 5.52-5.43 (2H, m), 5.29-5.15 (3H, m), 5.04 (1H, t, J = 9.6 Hz), 4.70 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.49-4.46 (1H, m), 4.27-4.23 (2H, m), 4.11-4.07 (1H, m), 3.84 (1H, dd, J = 10.6, 3.5 Hz), 3.75-
3.73 (1H, m), 3.64-3.62 (1H, m), 2.07 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.02 (3H, s),
1.94 (3H, s), 1.46 (9H, s)。
3.73 (1H, m), 3.64-3.62 (1H, m), 2.07 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.02 (3H, s),
1.94 (3H, s), 1.46 (9H, s)。
[0352] (1-1D) (2S)-3-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸(化合物1-1D：下式的化合物)的合成[0353] [式42]
[0354]
[0355] 向化合物1-1C (846 mg, 1.35 mmol)中加入10%钯-碳(大约50%水浸湿的产物) (150 mg)、乙酸乙酯(5 mL)和乙醇(5 mL)，和在氢气氛下将混合物在室温下搅拌3小时。将反应溶液过滤，和在减压下将溶剂馏出得到中间体的粗产物，为无色油状物(740 mg)。
[0356] 将得到的中间体的粗产物(740 mg)溶于甲醇(10 mL)。向溶液中加入0.5 M甲醇钠的甲醇溶液(14 mL, 7.0 mmol)，和将混合物在室温下搅拌20小时。向反应溶液加入Dowex-50直到反应溶液变成弱酸性。然后，将混合物过滤，和在减压下将溶剂馏出得到标题化合物
1-1D，为浅棕色固体(543 mg，通过2个步骤的收率：98%)。
1-1D，为浅棕色固体(543 mg，通过2个步骤的收率：98%)。
[0357] 1H-NMR (CD3OD) δ: 4.44 (1H, d, J = 8.8 Hz), 4.28-4.25 (1H, m), 4.16 (1H, dd, J = 10.4, 4.4 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 12.0, 2.0 Hz), 3.80 (1H, dd, J = 10.4, 4.4 Hz), 3.68 (1H, dd, J = 12.0, 5.6 Hz), 3.62-3.58 (1H, m), 3.45 (1H, dd, J = 10.5, 8.5 Hz), 3.29-3.24 (2H, m), 2.00 (3H, s), 1.44 (9H, s)。
[0358] FAB-MS：对于C16H28N2O10: [M+H]+计算值409，实测值409。
[0359] <实施例1-2>
[0360] (1-2A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸苯甲酯(化合物1-2A：下式的化合物)的合成
[0361] [式43]
[0362]
[0363] 将根据Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500的描述制备的4',5'-二氢-2'-甲基噁唑并[5',4':1,2]-3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-吡喃葡萄糖(4.30 g,
13.1 mmol)溶于二氯乙烷(50 ml)。在室温下向溶液中加入羟乙酸苯甲酯(5.56 ml, 39.1 mmol)和对甲苯磺酸吡啶鎓(1.64 g, 6.53 mmol)，和将混合物加热回流3小时。将反应溶液冷却和然后在冰冷却下加入至碳酸氢钠的饱和水溶液，和有机物质用二氯甲烷萃取。有机层用1 N盐酸水溶液、碳酸氢钠的饱和水溶液和饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 60:
40 - 0:100, v/v)得到标题化合物1-2A，为无色固体(3.45 g，收率：53%)。
13.1 mmol)溶于二氯乙烷(50 ml)。在室温下向溶液中加入羟乙酸苯甲酯(5.56 ml, 39.1 mmol)和对甲苯磺酸吡啶鎓(1.64 g, 6.53 mmol)，和将混合物加热回流3小时。将反应溶液冷却和然后在冰冷却下加入至碳酸氢钠的饱和水溶液，和有机物质用二氯甲烷萃取。有机层用1 N盐酸水溶液、碳酸氢钠的饱和水溶液和饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 60:
40 - 0:100, v/v)得到标题化合物1-2A，为无色固体(3.45 g，收率：53%)。
[0364] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.37-7.34 (5H, m), 5.85 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.16-5.08 (4H, m), 4.66 (1H, d, J = 8.3 Hz), 4.33 (2H, s), 4.22 (1H, dd, J = 12.2,
4.4 Hz), 4.09 (1H, dd, J = 12.2, 2.4 Hz), 4.07-4.02 (1H, m), 3.64-3.62 (1H, m), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.91 (3H, s)。
4.4 Hz), 4.09 (1H, dd, J = 12.2, 2.4 Hz), 4.07-4.02 (1H, m), 3.64-3.62 (1H, m), 2.05 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.99 (3H, s), 1.91 (3H, s)。
[0365] (1-2B) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(化合物1-2B：下式的化合物)的合成
[0366] [式44]
[0367]
[0368] 将化合物1-2A (3.45 g, 6.96 mmol)溶于甲醇(54 ml)。向溶液中加入20%氢氧化钯-碳(690 mg)，和在氢气氛下将混合物在室温下搅拌3.0小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，和在减压下将溶剂馏出。通过过滤收集通过加入二异丙基醚得到的固体，得到标题化合物1-2B，为无色固体(2.72 g，收率：96%)。
[0369] 1H-NMR (CDCl3) δ: 6.36 (1H, d, J = 8.8 Hz), 5.21-5.10 (2H, m), 4.70 (1H, d, J = 8.8 Hz), 4.39 (1H, d, J = 16.9 Hz), 4.32 (1H, d, J = 16.9 Hz), 4.28 (1H, dd, J = 12.2, 4.9 Hz), 4.15 (1H, dd, J = 12.2, 2.4 Hz), 4.11-4.05(1H, m) 3.72-3.70 (1H, m), 2.10 (3H, s), 2.07 (3H, s), 2.04 (3H, s), 1.97 (3H, s)。
[0370] (1-2C) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(化合物1-2C：下式的化合物)的合成
[0371] [式45]
[0372]
[0373] 将化合物1-2B (2.72 g, 6.73 mmol)溶于甲醇(42 ml)。在室温下向溶液中加入5 mol/L甲醇钠的甲醇溶液(2 ml, 10 mmol)，和然后在室温下将混合物搅拌过夜。反应完成后，向其中加入蒸馏水(4 ml)，和然后向混合物中加入离子交换树脂(Dowex 50wx8)，以调整其pH至3。将反应溶液过滤，和在减压下将溶剂馏出。通过过滤收集通过加入二异丙基醚得到的固体，得到标题化合物1-2C，为无色固体(2.72 g，收率：96%)。
[0374] 1H-NMR (D2O,TMSP) δ: 4.57 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.17 (2H, s), 3.91 (1H, dd, J = 12.5, 1.6 Hz), 3.77-3.72 (2H, m), 3.56-3.41 (3H, m), 2.05 (3H, s)。
[0375] ESI-LC-MS：对于C10H17NO8: [M+H]+计算值280，实测值280。
[0376] <实施例1-3>
[0377] (1-3A) 3-[2[2[2[2[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-3A：下式的化合物)的合成
[0378] [式46]
[0379]
[0380] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(694 mg, 0.833 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(5 mL)，和将混合物振摇5分钟。过滤后，向其中加入3-[2[2[2[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(488 mg, 1 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(730 μL, 4.17 mmol)的二氯甲烷溶液(5 mL)，和将混合物在室温下搅拌2小时。过滤后，将树脂用二氯甲烷混合溶液洗涤(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)三次，用二氯甲烷洗涤三次，和用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。向其中加入
20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次，和用乙醚洗涤三次，和在真空泵中干燥。将得到的树脂(800 mg)的等分部分(200 mg)置于固相合成的柱中，和向其中加入N,N-二甲基甲酰胺(2.5 mL)、三乙胺(406 μL, 2.92 mmol)和水(0.5 mL)。向其中加入通过在室温下搅拌化合物1-2C (174 mg, 0.625 mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(3 mL)、三乙胺(174 μL, 1.25 mmol)和二甲基硫代膦酰基氯(80 mg, 0.625 mmol) 1小时得到的溶液。将混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次和用二氯甲烷洗涤三次。向其中加入1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2 mL)，和将混合物振摇2分钟，接着回收滤液。该操作进行10次。将回收的溶液中的溶剂在减压下馏出，得到粗产物。将粗产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-3A，为白色固体(25 mg)。
20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次，和用乙醚洗涤三次，和在真空泵中干燥。将得到的树脂(800 mg)的等分部分(200 mg)置于固相合成的柱中，和向其中加入N,N-二甲基甲酰胺(2.5 mL)、三乙胺(406 μL, 2.92 mmol)和水(0.5 mL)。向其中加入通过在室温下搅拌化合物1-2C (174 mg, 0.625 mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(3 mL)、三乙胺(174 μL, 1.25 mmol)和二甲基硫代膦酰基氯(80 mg, 0.625 mmol) 1小时得到的溶液。将混合物在室温下搅拌2小时，然后过滤，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次和用二氯甲烷洗涤三次。向其中加入1%三氟乙酸的二氯甲烷溶液(2 mL)，和将混合物振摇2分钟，接着回收滤液。该操作进行10次。将回收的溶液中的溶剂在减压下馏出，得到粗产物。将粗产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-3A，为白色固体(25 mg)。
[0381] ESI-LC-MS：对于C21H38N2O13: [M+H]+计算值526，实测值526。
[0382] <实施例1-4>
[0383] (1-4A) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-4A：下式的化合物)的合成
[0384] [式47]
[0385]
[0386] 将3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(320 mg, 0.38 mmol)溶于甲醇(2 ml)和蒸馏水(2 ml)。在0℃向溶液中加入1 N氢氧化钠水溶液(1 ml)，和将混合物在室温下搅拌1.5小时。在0℃向其中加入1 N盐酸(1 ml)，和在减压下将有机溶剂馏出。向残留物中加入蒸馏水(10 ml)，得到的产物用二氯甲烷洗涤，然后通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物1-4A，为无色油状物(233.5 mg, 99%)。
[0387] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.63 (2H, br s), 3.79 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.75 (2H, t, J = 5.9 Hz), 3.70-3.68 (2H, m), 3.65-3.61 (42H, m), 3.21-3.17 (2H, m), 2.58 (2H, t, J = 5.9 Hz)。
[0388] (1-4B) 3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-4B：下式的化合物)的合成
[0389] [式48]
[0390]
[0391] 将化合物1-2C (36.6 mg, 0.13 mmol)溶于二甲基甲酰胺(500 μl)。在室温下向溶液中加入三乙胺(45.7 μl, 0.33 mmol)，然后在0℃加入二甲基硫代膦酰氯(16.9 mg, 0.13 mmol)的二甲基甲酰胺溶液(500 μl)，和将混合物在0℃搅拌0.5小时。
[0392] 将化合物1-4A (67.5 mg, 0.11 mmol)溶于二甲基甲酰胺(500 μl)。在0℃向溶液中加入制备的活性酯，和将混合物在室温下搅拌6小时。向其中加入蒸馏水(3 ml)和乙酸(100 μl)，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物1-4B，为无色油状物(31.0 mg, 32%)。
[0393] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.62 (1H, d, J = 6.8 Hz), 7.40 (1H, t, J = 5.4 Hz), 4.47 (1H, d, J = 8.3 Hz), 4.27 (1H, d, J = 16.1 Hz), 4.22 (1H, d, J = 16.1 Hz), 3.90 (1H, dd, J = 12.0, 3.2 Hz), 3.81 (1H, dd, J = 12.2, 4.9 Hz), 3.77 (2H, t, J = 6.1 Hz), 3.74-3.52 (54H, m), 3.39-3.34 (2H, m), 2.59 (2H, t, J =
6.1 Hz), 2.08 (3H, s)。
6.1 Hz), 2.08 (3H, s)。
[0394] MALDI-TOF-MS：对于C37H70N2O21: [M+Na]+计算值901，实测值901。
[0395] <实施例1-5>
[0396] (1-5A) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-5A：下式的化合物)的合成
[0397] [式49]
[0398]
[0399] 将3-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(200 mg, 0.547 mmol)溶于4 N盐酸的二噁烷溶液(2 mL)，和将溶液在室温下搅拌1小时。在减压下将溶剂馏出，和将残留物在真空泵中干燥，得到中间体的粗产物，为浅棕色油状物(165 mg)。
[0400] 将根据J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290的方法制备的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(158 mg, 0.364 mmol)和HATU (138 mg, 0.364 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3 mL)。向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(128 μL, 0.728 mmol)，和将混合物在室温下搅拌1分钟。将该溶液加入得到的中间体的粗产物(54.9 mg)中，进一步加入N,N-二异丙基乙胺(128 μL, 0.728 mmol)，和将混合物在室温下搅拌0.5小时。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-5A，为白色固体(53 mg，通过2个步骤的收率：43%)。
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-5A，为白色固体(53 mg，通过2个步骤的收率：43%)。
[0401] ESI-LC-MS：对于C28H50N4O15: [M+H]+计算值683，实测值683。
[0402] (1-5B) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酰基]氨基]-4-氧代丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-5B：下式的化合物)的合成
[0403] [式50]
[0404]
[0405] 向化合物1-5A (53 mg, 0.0777 mmol)中加入30%三氟乙酸水溶液，和将混合物在室温下搅拌7小时。反应溶液用水稀释和冻干，得到中间体的粗产物，为浅棕色油状物(45 mg)。
[0406] 将化合物1-2C (65.1 mg, 0.233 mmol)和三乙胺(65 μL, 0.466 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(0.5 mL)。在0℃向溶液中加入二甲基硫代膦酰氯(30 mg, 0.233 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(0.5 mL)。将混合物加热至室温和搅拌1小时。将该溶液冷却至0℃，和向其中加入得到的中间体的粗产物(45 mg)、三乙胺(152 μL, 1.088 mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(2.5 mL)和水(0.5 mL)的混合溶液。将混合物加热至室温和搅拌8小时。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-5B，为白色固体(9.25 mg，通过2个步骤的收率：14%)。
[0407] MALDI-TOF-MS：对于C33H57N5O20: [M+H]+计算值844，实测值844。
[0408] <实施例1-6>
[0409] (1-6A) [(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(4-硝基苯基)乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1-6A：下式的化合物)的合成
[0410] [式51]
[0411]
[0412] 将根据Bull. Chem. Soc. Jpn., 2003, 76, 485-500的描述制备的4,5-二氢-2-甲基噁唑并[5',4':1,2]-3,4,6-三-O-乙酰基-1,2-二脱氧-α-吡喃葡萄糖(1.00 g, 3.04 mmol)溶于二氯乙烷(10 ml)。在室温下向溶液中加入分子筛4A (312 mg)、2-(4-硝基苯基)-乙醇(2.54 g, 15.2 mmol)和(+)-樟脑磺酸(0.78 g, 3.34 mmol)，和将混合物在60℃搅拌3小时。将反应溶液加入碳酸氢钠的饱和水溶液，和有机物质用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和盐水稀释，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 67:33 - 0:100, v/v)得到标题化合物1-6A，为无色固体(1.51 g，收率：65%)。
[0413] 1H-NMR (CDCl3) δ: 8.14 (2H, d, J = 8.9 Hz), 7.38 (2H, d, J = 9.0 Hz), 5.32 (1H, d, J = 8.6 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 10.6, 9.4 Hz), 5.07 (1H, t, J =
9.6 Hz), 4.63 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.25 (1H, dd, J = 12.1, 4.7 Hz), 4.20-4.12 (2H, m), 3.88 (1H, dt, J = 10.6, 8.6 Hz), 3.72-3.64 (2H, m), 3.06-2.93 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.03 (3H, s), 1.84 (3H, s)。
9.6 Hz), 4.63 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.25 (1H, dd, J = 12.1, 4.7 Hz), 4.20-4.12 (2H, m), 3.88 (1H, dt, J = 10.6, 8.6 Hz), 3.72-3.64 (2H, m), 3.06-2.93 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.03 (3H, s), 1.84 (3H, s)。
[0414] (1-6B) [(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-(4-氨基苯基)乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1-6B：下式的化合物)的合成
[0415] [式52]
[0416]
[0417] 将化合物1-6A (982.0 mg, 1.98 mmol)溶于乙酸乙酯(12 ml)和乙醇(12 ml)。向溶液中加入10%钯-碳(250 mg)，和在氢气氛下将混合物在室温下搅拌1.5小时。反应混合物通过硅藻土过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到标题化合物1-6B，为无色固体(758 mg，收率：82%)。
[0418] 1H-NMR (CDCl3) δ: 6.99 (2H, d, J = 8.6 Hz), 6.61 (2H, d, J = 8.6 Hz), 5.32 (1H, d, J = 9.0 Hz), 5.24 (1H, dd, J = 10.6, 9.4 Hz), 5.06 (1H, t, J =
9.6 Hz), 4.60 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.26 (1H, dd, J = 12.1, 4.7 Hz), 4.15-4.04 (3H, m), 3.84 (1H, dt, J = 10.6, 8.4 Hz), 3.68-3.58 (4H, m), 2.78-2.77 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.88 (3H, s)。
9.6 Hz), 4.60 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.26 (1H, dd, J = 12.1, 4.7 Hz), 4.15-4.04 (3H, m), 3.84 (1H, dt, J = 10.6, 8.4 Hz), 3.68-3.58 (4H, m), 2.78-2.77 (2H, m), 2.09 (3H, s), 2.02 (3H, s), 2.02 (3H, s), 1.88 (3H, s)。
[0419] (1-6C) [(2R,3S,4R,5R,6R)-5-乙酰胺基-3,4-二乙酰氧基-6-[2-[4-[(乙氧羰基氨基)氨基甲酰基氨基]苯基]乙氧基]四氢吡喃-2-基]甲基乙酸酯(化合物1-6C：下式的化合物)的合成
[0420] [式53]
[0421]
[0422] 将化合物1-6B (568.0 mg, 1.22 mmol)溶于四氢呋喃(22 ml)。在室温下向溶液中加入三乙胺(424 μl, 3.04 mmol)，然后在-10℃加入4-硝基苯基氯甲酸酯(441.8 mg, 2.19 mmol)，和将混合物在室温下搅拌1.5小时。在室温下向其中加入三乙胺(424 μl,
3.04 mmol)，然后加入肼基甲酸乙酯(228.2 mg, 2.19 mmol)，和将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应溶液加入水中，和有机物质用乙酸乙酯萃取两次。有机层用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇= 100:0 - 90:10, v/v)得到标题化合物1-6C，为无色泡沫(650.4 mg，收率：90%)。
3.04 mmol)，然后加入肼基甲酸乙酯(228.2 mg, 2.19 mmol)，和将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应溶液加入水中，和有机物质用乙酸乙酯萃取两次。有机层用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇= 100:0 - 90:10, v/v)得到标题化合物1-6C，为无色泡沫(650.4 mg，收率：90%)。
[0423] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.88 (1H, br s), 7.24 (2H, s), 7.02 (2H, d, J = 8.2 Hz), 6.58 (1H, br s), 5.27 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.04 (1H, t, J = 10.0 Hz), 4.64 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.27-4.05 (5H, m), 3.90-3.81 (1H, m), 3.73-3.68 (1H, m), 3.61-3.55 (1H, m), 3.49 (2H, d, J = 4.3 Hz), 2.85-2.70 (2H, m), 2.07 (3H, s), 2.00 (6H, s), 1.82 (3H, s), 1.27 (3H, t, J = 9.4 Hz)。
[0424] (1-6D) N-[(2R,3S,4R,5R,6R)-3-乙酰胺基-2-[2-[4-(3,5-二氧代-1,2,4-三唑烷-4-基)苯基]乙氧基]-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3-基]乙酰胺(化合物1-6D：下式的化合物)的合成
[0425] [式54]
[0426]
[0427] 将化合物1-6C (650.0 mg, 1.09 mmol)溶于甲醇(30 ml)。在室温下向溶液中加入碳酸钾(451.8 mg, 3.27 mmol)，和将混合物在60℃搅拌9.5小时。在冷却至室温后，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物1-6D，为无色固体(462.4 mg, 85%)。
[0428] 1H-NMR (CD3OD) δ: 7.35 (4H, dd, J = 13.1, 8.8 Hz), 4.36 (1H, d, J = 8.2 Hz), 4.17 (1H, dt, J = 11.0, 4.8 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 11.9, 2.2 Hz),
3.70-3.62 (3H, m), 3.39 (1H, dd, J = 10.2, 8.6 Hz), 3.28-3.22 (2H, m), 2.90 (2H, t, J = 6.3 Hz)。
3.70-3.62 (3H, m), 3.39 (1H, dd, J = 10.2, 8.6 Hz), 3.28-3.22 (2H, m), 2.90 (2H, t, J = 6.3 Hz)。
[0429] ESI-TOF-MS：对于C18H24N4O8: [M+H]+计算值425，实测值425。
[0430] <实施例1-7>
[0431] (1-7A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙胺(化合物1-7A：下式的化合物)的合成
[0432] [式55]
[0433]
[0434] 将N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基叠氮化物(500 mg, 1.72 mmol)溶于乙醇(20 ml)。向溶液中加入10%钯-碳(200 mg)，和在氢气氛下将混合物在室温下搅拌3小时。反应混合物通过硅藻土过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到标题化合物1-7A，为无色固体(460 mg，收率：quant)。
[0435] 1H-NMR (CD3OD) δ: 4.38 (1H, d, J = 8.3 Hz), 3.90-3.82 (2H, m), 3.69-3.55 (2H, m), 3.46-3.40 (1H, m), 2.80-2.73 (2H, m), 1.98 (3H, s)。
[0436] (1-7B) N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基]-3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺(化合物1-7B：下式的化合物)的合成
[0437] [式56]
[0438]
[0439] 将化合物1-7A (100 mg, 0.378 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺。向溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酸酯(0.126 mg, 0.473 mmol)，和将混合物在室温下搅拌3小时。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-7B，为白色固体(93 mg，收率：59%)。
[0440] 1H-NMR (CD3OD) δ: 6.82 (2H, s), 4.38 (1H, d, J = 8.6 Hz), 3.89-3.87 (1H, m), 3.78-3.75 (3H, m), 3.66-3.62 (3H, m), 3.44-3.38 (1H, m), 2.67 (4H, s), 2.46 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.98 (3H, s)。
[0441] ESI-LC-MS：对于C17H25N3O9: [M+H]+计算值416，实测值416。
[0442] <实施例1-8>
[0443] (1-8A) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙酰胺基-3-三苯甲基硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-三苯甲基硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-三苯甲基硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-三苯甲基硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-三苯甲基硫烷基丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-8A：下式的化合物)的合成
[0444] [式57]
[0445]
[0446] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(833 mg, 1.00 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(7.5 mL)，和将混合物振摇10分钟。过滤后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(594 mg, 2 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.86 mL, 5 mmol)的二氯甲烷溶液(7.5 mL)，和将混合物在室温下搅拌2小时。过滤后，树脂用二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)洗涤三次、用二氯甲烷洗涤三次，和用乙醚洗涤三次。将树脂在真空泵中干燥和回收(1.83 g)。将回收的树脂的等分试样(1.37 g)置于固相合成的柱中。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇
5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。
向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg,
2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入
20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。
该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。
树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次，和用乙醚洗涤4次。将树脂在真空泵中干燥和回收(1.83 g)。将回收的树脂的等分试样(360 mg)置于固相合成的柱中。向其中加入乙酸(27 mg, 0.45 mmol)、HATU (171 mg, 0.45 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(154 μL, 0.90 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次。向其中加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(1 mL)和二氯甲烷(3 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇1.5小时。滤出树脂，将滤液在减压下浓缩。浓缩物与二氯甲烷一起共沸三次，和在真空泵中干燥，得到标题化合物1-8A，为棕色固体(176 mg)。
5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。
向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(669 mg, 2.25 mmol)、HATU (856 mg,
2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入
20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。
该操作进行4次。在用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次后，向其中加入(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸(1.32 g, 2,25 mmol)、HATU (856 mg, 2.25 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(582 μL, 4.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(15 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液(20 mL)，和将混合物振摇5分钟，接着将反应溶液过滤。该操作进行4次。
树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次，和用乙醚洗涤4次。将树脂在真空泵中干燥和回收(1.83 g)。将回收的树脂的等分试样(360 mg)置于固相合成的柱中。向其中加入乙酸(27 mg, 0.45 mmol)、HATU (171 mg, 0.45 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(154 μL, 0.90 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(5 mL)，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次。向其中加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(1 mL)和二氯甲烷(3 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇1.5小时。滤出树脂，将滤液在减压下浓缩。浓缩物与二氯甲烷一起共沸三次，和在真空泵中干燥，得到标题化合物1-8A，为棕色固体(176 mg)。
[0447] MALDI-TOF-MS：对于C122H114N10O12S5: [M+Na]+计算值2094，实测值2094。
[0448] <实施例1-9>
[0449] (1-9A) 2-[[(2S)-2,6-双(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]乙酸苯甲酯(化合物1-9A：下式的化合物)的合成
[0450] [式58]
[0451]
[0452] 向(2S)-2,6-双(叔丁氧羰基氨基)己酸(1.70 g, 5.00 mmol)、2-氨基乙酸苯甲酯(1.00 g, 5.00 mmol)和HATU (2.90 g, 7.50 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(25 mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(2.60 mL, 15.0 mmol)，和将混合物在室温下搅拌20小时。将反应溶液加入水中，和有机物质用乙酸乙酯萃取。有机层用饱和盐水洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 90:10 - 0:100, v/v)得到标题化合物1-9A，为浅黄色油状物(2.30 g，收率：93%)。
[0453] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.40-7.33 (5H, m), 6.63 (1H, s), 5.18 (2H, s), 5.11 (1H, s), 4.63 (1H, s), 4.15-4.03 (3H, m), 3.16-3.06 (2H, m), 1.91-1.81 (1H, m), 1.70-1.59 (1H, m), 1.53-1.24 (22H, m)。
[0454] MS (ESI)：对于C25H40N3O7: [M+H]+计算值494，实测值494。
[0455] (1-9B) 2-[[(2S)-2,6-双(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]乙酸苯甲酯(化合物1-9B：下式的化合物)的合成
[0456] [式59]
[0457]
[0458] 将化合物1-9A (250 mg, 0.507 mmol)溶于二氯甲烷(3.0 ml)。向溶液中加入三氟乙酸(1.0 mL)，和将混合物在室温下搅拌1小时。在减压下将溶剂馏出，得到标题化合物1-9B，为浅黄色油状物(247 mg，收率：100%)。
[0459] 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.95 (1H, t, J = 5.9 Hz), 8.18 (2H, s), 7.71 (2H, s), 7.42-7.34 (5H, m), 5.16 (2H, d, J = 12.5 Hz), 4.12-3.96 (2H, m), 3.87-3.78 (1H, m), 2.78-2.66 (2H, m), 1.76-1.66 (2H, m), 1.54-1.47 (2H, m), 1.40-
1.31 (2H, m)。
1.31 (2H, m)。
[0460] (1-9C) 2-[[(2S)-2,6-双[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酰基]氨基]己酰基]氨基]乙酸苯甲酯(化合物1-9C：下式的化合物)的合成
[0461] [式60]
[0462]
[0463] 根据与(1-5B)相同的方法，使用化合物1-9B (93.0 mg, 0.190 mmol)和1-2C (160 mg, 0.573 mmol)，标题化合物1-9C作为无色泡沫获得(180 mg，收率：88%)。
[0464] 1H-NMR (CD3OD) δ: 7.39-7.29 (5H, m), 5.16 (2H, s), 4.94-4.84 (2H, m), 4.46-4.39 (3H, m), 4.33-4.27 (2H, m), 4.13-4.00 (3H, m), 3.94 (1H, d, J =
17.6 Hz), 3.91-3.84 (2H, m), 3.78-3.66 (4H, m), 3.50-3.42 (2H, m), 3.38-3.28 (2H, m), 3.22 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.03 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.88-1.81 (1H, m), 1.78-1.67 (1H, m), 1.58-1.50 (2H, m), 1.48-1.35 (2H, m)。
17.6 Hz), 3.91-3.84 (2H, m), 3.78-3.66 (4H, m), 3.50-3.42 (2H, m), 3.38-3.28 (2H, m), 3.22 (2H, t, J = 6.6 Hz), 2.03 (3H, s), 2.01 (3H, s), 1.88-1.81 (1H, m), 1.78-1.67 (1H, m), 1.58-1.50 (2H, m), 1.48-1.35 (2H, m)。
[0465] (1-9D) 2-[[(2S)-2,6-双[[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酰基]氨基]己酰基]氨基]乙酸(化合物1-9D：下式的化合物)的合成
[0466] [式61]
[0467]
[0468] 将化合物1-9C (180 mg, 0.221 mmol)溶于甲醇(50 ml)。向溶液中加入10%钯-碳(180 mg)，和在氢气氛下将混合物在室温下搅拌2小时。反应混合物通过硅藻土过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到标题化合物1-9D，为浅黄色泡沫(160 mg，收率：100%)。
[0469] MS (ESI)：对于C28H48N5O17: [M+H]+计算值726，实测值726。
[0470] <实施例1-10>
[0471] (1-10A) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙酰胺基-3-硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-硫烷基丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-10A：下式的化合物)的合成
[0472] [式62]
[0473]
[0474] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(208 mg, 0.25 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(2.5 mL)，和将混合物振摇10分钟。过滤后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(149 mg, 0.5 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(219 μL, 1.25 mmol)的二氯甲烷溶液(2.5 mL)，和将混合物在室温下搅拌2小时。过滤后，树脂用二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次，和用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。将得到的树脂装载到肽合成仪(433A肽合成仪，由Applied Biosystems, Inc.制造)上，和在合成仪中进行脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护和缩合以延伸肽链。对于脱保护，使用哌啶和N-甲基吡咯烷酮。对于缩合反应，使用HATU、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷酮和各种羧酸。在各个缩合反应中以(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸、2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸、(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸、2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸、(2R)-2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)-3-三苯甲基硫烷基]丙酸和乙酸的顺序使用羧酸。将得到的树脂(900 mg)的量的一半(450 mg)置于固相合成的柱中，和向其中加入三氟乙酸(2.64 mL)、水(0.27 mL)、苯酚(0.06 g)和三异丙基硅烷(0.03 mL)的混合溶液。将混合物在室温下振摇2小时，和馏出三氟乙酸。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-10A，为白色固体(11 mg，收率：16%)。
[0475] ESI-LC-MS：对于C17H28N6O8S3: [M+H]+计算值541，实测值541。
[0476] (1-10B) 2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-[[2-[[(2R)-2-乙酰胺基-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基氨基]-3-氧代丙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基氨基]-3-氧代丙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]硫烷基丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-[1-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基氨基]-3-氧代丙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]硫烷基丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-10B：下式的化合物)的合成
[0477] [式63]
[0478]
[0479] 将化合物1-10B (11 mg, 0.0203 mmol)和1-7B (33 mg, 0.0794 mmol)溶于乙腈(1 mL)和0.2 M pH 6.75的磷酸盐缓冲液(1 mL)的混合溶液中，和将溶液在室温下搅拌2小时。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-10B，为白色固体(27 mg，收率：74%)。
[0480] MALDI-TOF-MS：对于C68H103N15O35S3: [M-H]+计算值1784，实测值1784。
[0481] <实施例1-11>
[0482] (1-11A) N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙胺三氟乙酸盐(化合物1-11A：下式的化合物)的合成
[0483] [式64]
[0484]
[0485] 将化合物1-7A (120 mg)溶于蒸馏水(6 ml)。然后向溶液中加入三氟乙酸(48 μl)，和将混合物冻干。将得到的无定形固体1-11A无需纯化而使用。
[0486] (1-11B) SG-NH2 (化合物1-11B：下式的化合物)的合成
[0487] [式65]
[0488] 将唾液酸糖肽(60 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.25) (260 μl)。然后向溶液中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml)的水溶液(100 μl)。进一步向其中加入含化合物1-11A (28 mg)的0.2 M磷酸盐缓冲液溶液(pH 6.25) (160 μl)，和将混合物在28℃反应72小时。通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(2480 μl)至反应溶液中终止反应，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物SG-NH2 (28.5 mg)。
[0489] ESI-TOF-MS：对于C86H143N7O62: [M-H]-计算值2264.8，实测值2264.8。
[0490] (1-11C) SG-I (化合物1-11C：下式的化合物)的合成
[0491] [式66]
[0492] 将在(1-11B)中制备的化合物SG-NH2 (15.0 mg)溶于43 mM碳酸氢钠水溶液(750 μl)中。在冰冷却下向溶液中加入30 mM碘乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的丙酮溶液(250 μl)，和将混合物在室温下搅拌1小时。通过加入乙酸(1.8 μl)至反应溶液终止反应，和在减压下除去有机溶剂。得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物SG-I (13.4 mg)。
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物SG-I (13.4 mg)。
[0493] ESI-TOF-MS：对于C88H144IN7O63: [M+2H]2+计算值1218.5(ave.)，实测值1218.3。
[0494] <实施例1-12>
[0495] (1-12A) SG-Oxa (化合物1-12A：下式的化合物)的合成
[0496] [式67]
[0497]
[0498] 将二唾液酸八糖(Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 26.0 mg, 12.8 μmol)溶于蒸馏水(210 μl)。在室温下向溶液中加入三乙胺(80.7 μl, 579 μmol)。在0℃向其中加入2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑 (32.6 mg, 192 μmol)的水溶液(52 l)，和将混合物在0℃搅拌2小时。得到的产物用Sephadex G15 (0.03% NH3水溶液)纯化。向其中加入0.1 N氢氧化钠水溶液(100 μl)，和混合物经冻干得到标题化合物SG-Oxa，为无色固体(24.6 mg, 95%)。
[0499] NMR (在D2O中) (图1的图)。
[0500] <实施例1-13>
[0501] (1-13A) SG-M (化合物1-13A：下式的化合物)的合成
[0502] [式68]
[0503]
[0504] 将(1-11B)中产生的化合物SG-NH2 (30.0 mg)溶于43 mM碳酸氢钠水溶液(1500 ul)中。在冰冷却下向溶液中加入13.9 mM 3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的丙酮(500 ul)溶液，和将混合物在室温下搅拌1小时。通过加入乙酸(3.6 ul)至反应溶液终止反应，和在减压下除去有机溶剂。得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物SG-M (29 mg)。
[0505] ESI-TOF-MS：对于C93H148N8O65: [M+2H]2+计算值1209.4，实测值1209.4。
[0506] <实施例1-14>
[0507] (1-14A) 2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸铵盐(化合物1-14A：下式的化合物)的合成
[0508] [式69]
[0509]
[0510] 将化合物1-2C (200 mg)溶于蒸馏水(2 ml)。然后向溶液中加入28-30%氨水(100 μl)，和将混合物冻干。得到的无定形固体1-14A不经纯化而使用。
[0511] (1-14B) SG-A (化合物1-14B：下式的化合物)的合成
[0512] [式70]
[0513] 将唾液酸糖肽(58 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (254 μl)。然后向溶液中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml)的水溶液(100 μl)。向其中进一步加入化合物1-14A (24 mg)的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (152 μl)，和将混合物在28℃反应72小时。通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(3000 μl)至反应溶液来终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (Shiseido Co., Ltd., Proteonavi)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，和冻干，得到标题化合物SG-A (19.5 mg)。
[0514] ESI-TOF-MS：对于C86H140N6O64: [M+2H]2+计算值1142.0(ave.)，实测值1141.4。
[0515] <实施例1-15>
[0516] (1-15A) (2S)-2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]戊二酸二叔丁酯(化合物1-15A：下式的化合物)的合成
[0517] [式71]
[0518]
[0519] 将(2S)-2-氨基戊二酸二叔丁酯盐酸盐(295 mg, 1.00 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(5.0 mL)溶液冷却至0℃。向其中按顺序加入N,N-二异丙基乙胺(0.510 mL, 3.00 mmol)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酸酯(293 mg, 1.10 mmol)，和将混合物在0℃搅拌1小时，进一步加热至室温，和在室温下搅拌18小时。加入乙酸乙酯至反应溶液。按顺序用1 M盐酸和饱和盐水洗涤有机层，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 95:5 - 0:100, v/v)，得到标题化合物1-15A，为浅黄色油状物(400 mg，收率：98%)。
[0520] 1H-NMR (CDCl3) δ: 6.70 (2H, s), 6.22 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.48-4.42 (1H, m), 3.91-3.79 (2H, m), 2.60-2.52 (2H, m), 2.35-2.18 (2H, m), 2.13-2.04 (1H, m), 1.93-1.84 (1H, m), 1.46 (9H, s), 1.44 (9H, s)。
[0521] (1-15B) (2S)-2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]戊二酸(化合物1-15B：下式的化合物)的合成
[0522] [式72]
[0523]
[0524] 根据与(1-9B)相同的方法，使用化合物1-15A (400 mg, 0.976 mmol)得到标题化合物1-15B (260 mg，收率：89%)。
[0525] MS (ESI)：对于C12H15N2O7: [M+H]+计算值299，实测值299。
[0526] (1-15C) SG-(SG-Gln*)-Mal (化合物1-15C：下式的化合物)的合成
[0527] [式73]
[0528]
[0529] 将化合物1-15B (30.0 mg, 0.101 mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(58.0 mg, 0.504 mmol)的二氯甲烷(0.400 mL)溶液冷却至0℃。按顺序向其中加入吡啶(0.200 mL, 2.48 mmol)和三氟乙酸酐(70.0 μL, 0.500 mmol)，和将混合物在0℃搅拌10分钟。将反应混合物加热至室温和进一步在室温下搅拌30分钟。将二氯甲烷加入至反应溶液。有机层用1 M盐酸洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷:乙酸乙酯= 25:75 - 0:100, v/v)，得到浅黄色泡沫(25 mg)。
[0530] 随后，将等份的(2.00 mg)所得产物溶于N,N-二甲基甲酰胺(200 μL)。将溶液加入至(1-11B)中产生的化合物SG-NH2 (20.0 mg, 8.41 μmol)和N,N-二异丙基乙胺(15 μL, 88.0 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(600 μL)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。将0.2%三氟乙酸水溶液(2.0 mL)加入至反应溶液，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-(SG-Gln*)-Mal (15.0 mg，收率：76%)。
[0531] ESI-TOF-MS：对于C184H299N16O129: [M+3H]3+计算值1599.7 (ave.)，实测值1599.6。
[0532] <实施例1-16>
[0533] (1-16A) (2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]戊二酸二叔丁酯(化合物1-16A：下式的化合物)的合成
[0534] [式74]
[0535]
[0536] 将(2S)-2-氨基戊二酸二叔丁酯盐酸盐(58.0 mg, 0.196 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0 mL)溶液冷却至0℃。按顺序向其中加入N,N-二异丙基乙胺(0.100 mL, 0.588 mmol)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(100 mg, 0.195 mmol)，和将混合物0℃搅拌1小时，进一步加热至室温，和在室温下搅拌20小时。将乙酸乙酯加入至反应溶液。按顺序用1 M盐酸和饱和盐水洗涤有机层，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(二氯甲烷:甲醇= 98:2 - 90:10, v/v)，得到标题化合物1-16A，为浅黄色油状物(100 mg，收率：78%)。
[0537] 1H-NMR (CDCl3) δ: 6.84 (1H, br s), 6.70 (2H, s), 6.46 (1H, br s), 4.53-4.45 (1H, m), 3.85 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.80-3.71 (2H, m), 3.68-3.60 (12H, m), 3.54 (2H, t, J = 5.1 Hz), 3.42 (2H, q, J = 5.1 Hz), 2.54-2.49 (4H, m), 2.37-2.21 (2H, m), 2.16-2.07 (1H, m), 1.92-1.83 (1H, m), 1.46 (9H, s),
1.43 (9H, s)。
1.43 (9H, s)。
[0538] MS (ESI)：对于C31H52N3O12: [M+H]+计算值658，实测值658。
[0539] (1-16B) (2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]戊二酸(化合物1-16B：下式的化合物)的合成[0540] [式75]
[0541]
[0542] 使用化合物1-16 (100 mg, 0.152 mmol) ，根据与(1-9B)相同的方法得到标题化合物1-16B (83 mg，收率：100%)。
[0543] MS (ESI)：对于C23H36N3O12: [M+H]+计算值546，实测值546。
[0544] (1-16C) SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal (化合物1-16C：下式的化合物)的合成[0545] [式76]
[0546]
[0547] 将化合物1-16B (32.0 mg, 58.7 μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(34.0 mg, 0.295 mmol)的二氯甲烷(0.400 mL)溶液冷却至0℃。按顺序向其中加入吡啶(0.200 mL, 2.48 mmol)和三氟乙酸酐(42.0 μL, 0.300 mmol)，和将混合物在0℃搅拌30分钟。将反应混合物加热至室温和进一步在室温下搅拌2小时。将二氯甲烷加入至反应溶液。有机层用1 M盐酸洗涤，然后经无水硫酸钠干燥和过滤，和在减压下将溶剂馏出，得到粗产物 (35 mg)。
[0548] 随后，将等份的(0.31 mg)所得粗产物溶于N,N-二甲基甲酰胺(20 μL)。将溶液加入至(1-11B)中产生的化合物SG-NH2 (2.0 mg, 0.88 μmol)和N,N-二异丙基乙胺(1.5 μL, 8.8 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(30 μL)溶液中，和将混合物在室温下搅拌18小时。将0.2%三氟乙酸水溶液(2.0 mL)加入至反应溶液，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-(SG-Gln*)-PEG(3)-Mal (0.60 mg，收率：28%)。
[0549] ESI-TOF-MS：对于C195H320N17O134: [M+3H]3+计算值1682.2 (ave.)，实测值1682.2。
[0550] <实施例1-17>
[0551] (1-17A) AG(9)-P (化合物1-17A：下式的化合物1)的合成
[0552] [式77]
[0553]
[0554] 将唾液酸糖肽(200 mg)溶于0.2 M乙酸盐缓冲溶液(pH 5.0) (1000 μl)。然后向溶液中加入神经氨酸酶([E.C.3.2.1.18], Nacalai Tesque, Inc., 1 U/ml)的水溶液(1000 μl)，和将混合物在37℃反应17小时。反应完成后，向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(2000 μl)。将两个批次的该反应物合并，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(9)-P (307 mg)。
[0555] ESI-TOF-MS：对于C90H155N13O54: [M+2H]2+计算值1142.6(ave.)，实测值1142.0。
[0556] (1-17B) AG(7)-P (化合物1-17B：下式的化合物)的合成
[0557] [式78]
[0558]
[0559] 将(1-17A)中产生的化合物AG(9)-P (100 mg)、硫酸镁(0.48 mg)和β-D-半乳糖苷酶(Wako Pure Chemistry Industries, Ltd., 600 U/mg) (2 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0) (2000 μl)，和将溶液在37℃反应24小时。向其中加入β-D-半乳糖苷酶(Wako Pure Chemistry Industries, Ltd., 600 U/mg) (1 mg)，和将混合物进一步反应24小时。反应完成后，向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(2000 μl)。将两个批次的该反应物合并，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(7)-P (158 mg)。
[0560] ESI-TOF-MS：对于[M+H]+ C78H135N13O44计算值1959.0(ave.)，实测值1958.9。
[0561] (1-17C) AG(5)-P (化合物1-17C：下式的化合物)的合成
[0562] [式79]
[0563]
[0564] 将(1-17B)中产生的化合物AG(7)-P (100 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (3150 μl)。向溶液中加入100 × BSA (New England BioLabs Japan Inc.) (43 μl)和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶(New England BioLabs Japan Inc., 4000 U/ml) (100 μl)，和将混合物在37℃反应20小时。反应完成后，向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(1000 μl)。得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(5)-P (73.8 mg)。
0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(5)-P (73.8 mg)。
[0565] ESI-TOF-MS：对于[M+2H]2+ C62H109N11O34计算值777.3(ave.)，实测值777.3。
[0566] <实施例1-18>
[0567] (1-18A) SG-N3 (化合物1-18A：下式的化合物)的合成
[0568] [式80]
[0569]
[0570] 将唾液酸糖肽(76 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (330 μl)。然后向溶液中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml)的水溶液(100 μl)。进一步向其中加入N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基叠氮化物(23 mg)的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (230 μl)，和将混合物在28℃反应96小时。通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(3000 μl)至反应溶液终止反应，得到的产物通过反相HPLC (Shiseido Co., Ltd., Proteonavi)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到主要包含标题化合物的固体。随后，将得到的固体溶于蒸馏水(3000 μl)，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-N3 (34.4 mg)。
[0571] ESI-TOF-MS：对于C86H141N9O62: [M+2H]2+计算值1147.5，实测值1147.4。
[0572] <实施例1-19>
[0573] (1-19A) N-[2-[2-[2-[2-[3-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基氨基]-3-氧代-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基甲酸叔丁酯(化合物1-19A：下式的化合物)的合成
[0574] [式81]
[0575]
[0576] 使用3-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(100 mg, 0.274 mmol)和化合物1-7A (110 mg, 0.291 mmol) ， 根据与(1-9A)中相同的方法获得标题化合物1-19A，为浅黄色泡沫(150 mg，收率：90%)。
[0577] MS (ESI)：对于C26H49N3O13: [M+H]+计算值612，实测值612。
[0578] (1-19B) N-[2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙基]-3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰胺(化合物1-19B：下式的化合物)的合成
[0579] [式82]
[0580]
[0581] 将化合物1-19A (150 mg, 0.245 mmol)溶于二氯甲烷(2.0 ml)。向溶液中加入三氟乙酸(2.0 mL)，和将混合物在室温下搅拌2小时。将溶剂在减压下馏出，得到的残余物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物1-19B (70 mg, 55%)，为无色油状物。
[0582] MS (ESI)：对于C21H41N3O11: [M+H]+计算值512，实测值512。
[0583] <实施例1-20>
[0584] (1-20A) 3-[2-[2-[2-[2-[[(2S)-2,6-双(叔丁氧羰基氨基)己酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(化合物1-20A：下式的化合物)的合成
[0585] [式83]
[0586]
[0587] 向(2S)-2,6-双(叔丁氧羰基氨基)己酸(210 mg, 607 μmol)和HATU (220 mg, 579 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2.0 mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(0.410 mL, 2.41 mmol)，和将混合物在室温下搅拌2分钟。将得到的反应溶液加入至根据(1-5A)的方法产生的3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(150 mg, 497 μmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.260 mL, 1.53 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.50 mL)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。将溶剂在减压下馏出，和得到的残余物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物1-20A (240 mg, 80%)，为浅黄色油状物。
[0588] MS (ESI)：对于C27H52N3O11: [M+H]+计算值594，实测值594。
[0589] <实施例1-21>
[0590] (1-21A) 2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-氨基-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-21A：下式的化合物)的合成
[0591] [式84]
[0592]
[0593] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(166 mg, 0.200 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(3 mL)，和将混合物振摇10分钟。过滤后，向其中加入2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸(119 mg, 0.400 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(171 μL, 1.00 mmol)的二氯甲烷(3 mL)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。过滤后，将树脂用二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次和用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。得到的树脂负载于肽合成仪(由Applied Biosystems, Inc.制造的433A肽合成仪)上和在合成仪中进行脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合、脱保护、缩合和脱保护，以延长肽链。对于脱保护，使用哌啶和N-甲基吡咯烷酮。对于缩合反应，使用HATU、N,N-二异丙基乙胺、N-甲基吡咯烷酮和各种羧酸。将羧酸用于各缩合反应，顺序为(2S)-3-叔丁氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸、2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸、(2S)-3-叔丁氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸、2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙酸和(2S)-3-叔丁氧基-2-(叔丁氧羰基氨基)丙酸。将得到的树脂置于固相合成的柱中。向其中加入六氟异丙醇(1 mL)和二氯甲烷(3 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇2小时。将树脂滤出，将得到的滤液在减压下浓缩。将浓缩物与二氯甲烷一起共沸6次，和在真空泵中干燥，得到标题化合物1-21A，为白色固体(120 mg，收率：97%)。
[0594] MALDI-TOF-MS：对于C27H50N6O10: [M+H]+计算值619.4，实测值619.4。
[0595] (1-21B) 2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-[[2-[[(2R,3R,4R,
5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]乙酰基]氨基]-4-氧代丁酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-21B：下式的化合物)的合成[0596] [式85]
5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]乙酰基]氨基]-4-氧代丁酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-3-叔丁氧基-丙酰基]氨基]乙酸(化合物1-21B：下式的化合物)的合成[0596] [式85]
[0597] 将 根据J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290的方法产生的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-
3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(84.5 mg, 0.194 mmol)和HATU (73.8 mg, 0.194 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5 mL)。向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(66 μL, 0.388 mmol)，和将混合物在室温下搅拌3分钟。将该溶液加入至化合物1-21A (100 mg, 0.162 mmol)中，和将混合物在室温下搅拌0.5小时。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-
3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液。向得到的化合物中加入三氟乙酸(0.1 mL)和水(0.9 mL)的混合溶液，将混合物搅拌过夜。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到中间体为白色固体(14.7 mg, 10%)。
3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(84.5 mg, 0.194 mmol)和HATU (73.8 mg, 0.194 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(5 mL)。向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(66 μL, 0.388 mmol)，和将混合物在室温下搅拌3分钟。将该溶液加入至化合物1-21A (100 mg, 0.162 mmol)中，和将混合物在室温下搅拌0.5小时。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-
3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液。向得到的化合物中加入三氟乙酸(0.1 mL)和水(0.9 mL)的混合溶液，将混合物搅拌过夜。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到中间体为白色固体(14.7 mg, 10%)。
[0598] 将化合物1-2C (5.91 mg, 0.0212 mmol)和HATU (8.04 mg, 0.0212 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1 mL)。向溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(9.05 μL, 0.0529 mmol)，和将混合物在室温下搅拌3分钟。将该溶液加入至得到的中间体(16.5 mg, 0.0176 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1 mL)溶液中，和将混合物在室温下搅拌0.5小时。反应溶液用水稀释，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物1-21B，为白色固体(14.0 mg，收率：66%)。
[0599] MALDI-TOF-MS：对于C49H85N11O23: [M+H]+计算值1197.6，实测值1197.5。
[0600] <实施例1-22>
[0601] (1-22A) (2S)-2,6-双[3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]己酸(化合物1-22A：下式的化合物)的合成[0602] [式86]
[0603]
[0604] 将赖氨酸(26.0 mg, 0.178 mmol)溶于0.10 M磷酸盐缓冲液(pH 7.0) (0.40 ml)。向溶液中加入(2,5-二氧代吡咯烷-1-基) 3-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(200 mg, 0.390 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.40 mL)溶液，和将混合物在室温下搅拌3小时。将0.2%三氟乙酸水溶液(2.0 mL)加入至反应溶液，得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物1-22A (106 mg，收率：63%)。
[0605] MS (ESI)：对于C42H65N6O18: [M-H]-计算值941，实测值941。
[0606] (1-22B) SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2 (化合物1-22B：下式的化合物)的合成[0607] [式87]
[0608]
[0609] 向由此产生的化合物1-22A (10.0 mg, 10.6 μmol)、(1-11B)中产生的化合物SG-NH2 (19.4 mg, 8.13 μmol)和HATU (4.00 mg, 10.6 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0 mL)的溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(8.80 μL, 51.7 μmol)，和将混合物在室温下搅拌1小时。将反应溶液加入至0.5%三氟乙酸水溶液(6.0 mL)，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-Lys*-[PEG(3)-Mal]2 (10.0 mg，收率：
25%)。
25%)。
[0610] ESI-TOF-MS：对于C128H205N13O79: [M-2H]2-计算值1595.0 (ave.)，实测值1595.0。
[0611] <实施例1-23>
[0612] (1-23A) (2S)-2,6-双[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基氨基]己酸(化合物1-23A：下式的化合物)的合成
[0613] [式88]
[0614]
[0615] 根据与(1-22A)中相同的方法，使用赖氨酸(7.70 mg, 52.7 μmol)和(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸酯(100 mg, 115 μmol)，获得标题化合物1-23A，为无色油状物(36.0 mg，收率：41%)。
[0616] MS (ESI)：对于C74H129N6O34: [M-H]-计算值1645，实测值1645。
[0617] (1-23B) SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2 (化合物1-23B：下式的化合物)的合成[0618] [式89]
[0619]
[0620] 根据与(1-22B)中相同的方法，使用化合物1-23A (19.0 mg, 11.5 μmol)和(1-11B)中产生的化合物SG-NH2 (25.0 mg, 10.5 μmol)，获得标题化合物SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2，为无色油状物(14.0 mg，收率：34%)。
[0621] ESI-TOF-MS：对于C180H269N13O95: [M-2H]2-计算值1947.4 (ave.)，实测值1947.3。
[0622] <实施例1-24>
[0623] (1-24A) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸]氨基]乙酸苯甲酯(化合物1-24A：下式的反应产物)的合成[0624] [式90]
[0625]
[0626] 将已知化合物2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(Tetrahedron Asymmetry, 2008, 19, 1919-1933) (670 mg)溶于DMF (6 ml)。向溶液中加入HATU (630 mg)和DIPEA (0.57 ml)，和将混合物在室温下搅拌4分钟。然后向其中加入甘氨酸苯甲酯盐酸盐(370 mg)，和将混合物在室温下搅拌1小时。反应溶液用乙酸乙酯稀释和用10%盐水洗涤两次和用1 N盐酸洗涤一次。在经无水硫酸钠干燥和过滤后，在减压下将溶剂馏出，得到粗产物。该产物通过硅胶柱色谱纯化(己烷:乙酸乙酯= 60:40-20:80, v/v)，得到标题化合物1-24A (840 mg，收率：62%)，呈无定形形式。
[0627] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.35 (5H, m), 6.99-6.98 (1H, br m), 5.23-5.21 (3H, m), 5.11-5.04 (2H, m), 4.56 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.34 (1H, d, J = 15.1 Hz), 4.20-4.09 (5H, m), 3.73-3.71 (1H, m), 2.08 (3H, s), 2.07(3H,s),2.04(3H,s), 2.03(3H,s)。
[0628] ESI-LC-MS：对于C25H31NO13: [M+H]+计算值554，实测值554。
[0629] (1-24B) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸]氨基]乙酸(化合物1-24B：下式的反应产物)的合成
[0630] [式91]
[0631]
[0632] 根据与(1-2B)中相同的方法使用化合物1-24A (840 mg)，获得呈无定形形式的标题化合物1-24B (700 mg，收率：定量)。
[0633] ESI-LC-MS：对于C18H25NO13: [M-H]-计算值462，实测值462。
[0634] 1H-NMR (CDCl3) δ: 7.05-7.04 (1H, br m), 5.24 (1H, t, J = 9.5 Hz), 5.12-5.05 (2H, m), 4.58 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.35 (1H, d, J = 15.6 Hz), 4.27-
4.05 (6H, m), 3.76-3.75 (1H, m), 2.08-2.04 (12H, m)。
4.05 (6H, m), 3.76-3.75 (1H, m), 2.08-2.04 (12H, m)。
[0635] (1-24C) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸]氨基]乙酸(化合物1-24C：下式的反应产物)的合成
[0636] [式92]
[0637]
[0638] 根据与(1-2C)中相同的方法使用化合物1-24B (450 mg)获得呈无定形形式的标题化合物1-24C (286 mg，收率：定量)。该化合物直接用于下一反应。
[0639] 1H-NMR (D2O,TMSP) δ:4.54 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.43 (1H, d, J = 15.6 Hz), 4.31 (1H, d, J = 15.6 Hz), 3.91-3.89 (3H, m), 3.73 (1H, dd, J = 12.2, 5.4 Hz), 3.53-3.37 (4H, m)。
[0640] ESI-LC-MS：对于C10H17NO9: [M-H]-计算值294，实测值294。
[0641] (1-24D) 2-[[2-[(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸]氨基]乙酸铵盐(化合物1-24D：下式的化合物)的合成
[0642] [式93]
[0643]
[0644] 根据与(1-14A)中相同的方法使用化合物1-24C (286 mg)获得呈无定形形式的标题化合物1-24D (325 mg)。该化合物无需纯化而使用。
[0645] (1-24E) SG(Glc)-Gly-A (化合物1-24E：下式的化合物)的合成
[0646] [式94]
[0647]
[0648] 将唾液酸糖肽(191 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (1000 μl)。然后向溶液中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml)的水溶液(300 μl)。进一步向其中加入化合物1-24D (125 mg)的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (370 μl)，和将混合物在28℃反应72小时。通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(3000 μl)至反应溶液来终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (Inertsil ODS-3, GL Sciences Inc.)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG(Glc)-Gly-A (88 mg)。
[0649] ESI-TOF-MS：对于C86H140N6O65: [M+4H]4+计算值1149.4(ave.)，实测值1149.4。
[0650] 此外，通过置换糖结构为非Glc的其它糖(例如Man或Gal)而衍生自化合物1-24D的化合物可参照实施例1-24的反应合成。在SG(Man)-Gly、SG(Gal)-Gly等的还原端改变的糖链可通过与(1-24E)中相同的转糖基反应，通过使用由此合成的化合物作为接纳体化合物来合成。
[0651] 此外，在实施例1-11、1-12、1-13和1-14的方法中，参照实施例1-24的反应，在SG-NH2、SG-I、SG-oxa、SG-A等的还原端改变的糖链可合适地通过合适转变原料(接纳体化合物)的糖结构为需要的糖结构合成。
[0652] [实施例2]
[0653] 在下文中，结构式中的简写术语"hANP"表示修饰的肽中的hANP肽是hANP(1-28)。
[0654] <实施例2-1> SG-hANP(1-28) (化合物2-1)的合成
[0655] (2-1A) hANP-TFA盐(三氟乙酸盐)的制备
[0656] 用于下文反应中的hANP-TFA盐根据以下程序制备：
[0657] 制备方法1
[0658] 将卡培立肽乙酸盐(hANP(1-28)乙酸盐) (100 mg)溶于蒸馏水(4000 μl)，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物(89.6 mg)。
[0659] 制备方法2
[0660] 将卡培立肽乙酸盐(hANP(1-28)乙酸盐) (250 mg)溶于蒸馏水(30 ml)。向溶液中加入三氟乙酸(600 μl)，和将混合物冻干。该化合物无需进一步纯化直接使用。
[0661] (2-1B) SG-hANP (1-28) (化合物2-1：下式的化合物)的合成
[0662] [式95]
[0663]
[0664] (2-1B-1) SG-hANP(1-28) (化合物2-1) TFA盐的合成
[0665] 向(1-14B)中合成的化合物SG-A (97.7 mg)的N,N-二甲基甲酰胺(1000 μl)的溶液中加入HATU (16.3 mg)的N,N-二甲基甲酰胺(1000 μl)溶液，然后加入二异丙基乙胺(30 μl)，和将混合物在室温下搅拌5分钟和立即用于下一反应。
[0666] 将根据(2-1A)的程序制备的hANP-TFA盐(100 mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1200 μl)和蒸馏水(320 μl)。向溶液中加入二异丙基乙胺(22.5 μl)。向该溶液中加入含有预先制备的活性酯的N,N-二甲基甲酰胺(2000 μl)溶液，和将混合物搅拌1小时。反应完成后，在冰冷却下向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(20 ml)。通过加入乙酸(2 ml)将不溶物质溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-hANP(1-28) (化合物2-1)-TFA盐(91.0 mg)。
[0667] MALDI-TOF-MS：对于C213H341N51O102S3: [M+H]+计算值5342.2，实测值5342.2。
[0668] (2-1B-2) SG-hANP(1-28)(化合物2-1)乙酸盐的合成
[0669] 向(1-14B)中合成的化合物SG-A (790 mg)的N,N-二甲基甲酰胺(18 ml)溶液中加入TSTU (O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲 ) (104 mg)的N,N-二甲基甲酰胺(2 ml)溶液，然后加入二异丙基乙胺(241 μl)，和将混合物在室温下搅拌60分钟并用于下一反应。
[0670] 将卡培立肽乙酸盐(hANP(1-28)乙酸盐) (1000 mg)溶于N,N-二甲基甲酰胺(12 ml)和蒸馏水(3.2 ml)。向溶液中加入二异丙基乙胺(241 μl)。向该溶液中加入含有预先制备的活性酯的N,N-二甲基甲酰胺(20 ml)溶液，和将混合物搅拌1小时。反应完成后，向其中加入乙腈(32 ml)，和通过过滤收集沉淀。用N,N-二甲基甲酰胺/乙腈(1/1) (30 ml)和乙腈(100 ml)洗涤后，得到的固体物质在减压下干燥。将该固体物质溶于蒸馏水，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-hANP(1-28)(化合物2-1)乙酸盐(1056 mg)。
[0671] ESI-TOF-MS：对于C213H341N51O102S3: [M+4H]4+计算值1337.1(ave.)，实测值1337.0。
[0672] 如上所述，涉及的修饰的肽还作为对应于用作原料的hANP肽的盐的类型的盐合成。在下文的实施例中，使用hANP肽的TFA盐，和涉及的修饰的肽作为TFA盐获得，除非另外说明。在这些情况下，盐的类型不特别进行描述。所有标题化合物可通过根据(2-1B-2)的程序的合成法作为乙酸盐合成。
[0673] <实施例2-2> hANP(1-28)-SG (化合物2-2)的合成
[0674] (2-2A) Boc-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0675] [式96]
[0676]
[0677] 将hANP(1-28)乙酸盐(62.5 mg)溶于蒸馏水(1.3 ml)。在室温下向溶液中加入二碳酸二叔丁酯(0.9 mg, 324.6 μmol)的叔丁醇(400 μl)溶液，然后加入三乙胺(13.6 μl)的水溶液(200 μl)，和将混合物在室温下搅拌3小时。不溶物通过加入蒸馏水(6 ml)、乙腈(2 ml)和乙酸(1 ml)而溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物Boc-hANP(1-28) (59.9 mg)。
[0678] MALDI-TOF-MS：对于C132H211N45O41S3: [M+H]+计算值3179.5，实测值3179.7。
[0679] (2-2B) Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (下式的化合物)的合成
[0680] [式97]
[0681]
[0682] 将(2-2A)中产生的Boc-hANP(1-28) (59.9 mg)和化合物1-7A (59.7 mg)溶于蒸馏水(0.2 ml)。在室温下向溶液中加入HATU (35.8 mg)的二甲基甲酰胺(2.0 ml)和三乙胺(15.8 μl)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。将反应溶液加入至三氟乙酸(8.7 μl)的冰冷的水溶液(5 ml)中，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (38.7 mg)。
[0683] MALDI-TOF-MS：对于C142H229N47O46S3: [M+H]+计算值3425.6，实测值3426.0。
[0684] (2-2C) hANP(1-28)-GlcNAc (下式的化合物)的合成
[0685] [式98]
[0686]
[0687] 将(2-2B)中产生的Boc-hANP(1-28)-GlcNAc (38.7 mg)溶于20%三氟乙酸水溶液(5 ml)和乙酸(1 ml)，和将溶液在室温下静置7小时。向其中加入蒸馏水(10 ml)，和将混合物冻干。得到的粗产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物hANP(1-28)-GlcNAc (21.8 mg)。
[0688] MALDI-TOF-MS：对于C137H221N47O44S3: [M+H]+计算值3325.6，实测值3425.5。
[0689] (2-2D) hANP(1-28)-SG (化合物2-2：下式的化合物)的合成
[0690] [式99]
[0691]
[0692] 在室温下向(1-12A)中制备的化合物SG-Oxa的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(60 mM, 120 μl)中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml, 48 μl)，然后分两批间隔15分钟在室温下，加入(2-2C)中产生的hANP(1-28)-GlcNAc (6.0 mg, 1.8 μmol)的二甲基亚砜(72 μl)溶液，和将混合物在25℃振摇2小时。在室温下通过加入
0.2%三氟乙酸水溶液(1.5 ml)终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物hANP(1-28)-SG (化合物2-2) (6.2 mg)。
0.2%三氟乙酸水溶液(1.5 ml)终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物hANP(1-28)-SG (化合物2-2) (6.2 mg)。
[0693] MALDI-TOF-MS：对于C213H334N52O100S3: [M+H]+计算值5327.3，实测值5326.7。
[0694] <实施例2-3> (SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-3)的合成
[0695] (2-3A) Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0696] [式100]
[0697]
[0698] 根据与(2-1B)中相同的方法，使用根据J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290的描述合成的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(42.4 mg, 0.0976 mmol)和通过(2-1A)的制备方法2自hANP(1-28)乙酸盐制备的hANP(1-28)-TFA盐(31.3 mg)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (13.0 mg)。
[0699] MALDI-TOF-MS：对于C144H230N48O48S3: [M+H]+计算值3495.6，实测值3496.5。
[0700] (2-3B) (GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0701] [式101]
[0702]
[0703] 根据与(2-2C)中相同的方法自(2-3A)中产生的Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (13.0 mg)，获得标题化合物(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (5.83 mg)。
[0704] MALDI-TOF-MS：对于C139H222N48O46S3: [M+H]+计算值3396.6，实测值3396.6。
[0705] (2-3C) (SG-)Asn-hANP(1-28) (下式的化合物：化合物2-3)的合成
[0706] [式102]
[0707]
[0708] 根据与(2-2D)中相同的方法自(2-3B)中产生的(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (4.90 mg)，获得标题化合物(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-3) (2.17 mg)。
[0709] MALDI-TOF-MS：对于C215H345N53O102S3: [M+H]+计算值5398.3，实测值5398.4。
[0710] <实施例2-4> (SG-)Asn-hANP(2-28) (化合物2-4)的合成
[0711] (2-4A) hANP(2-28)的制备
[0712] 将hANP(1-28)-乙酸盐(100 mg)溶于1.5%二甲基丙烯胺、60%吡啶和38.5%水(10.4 mL)的混合溶液。在室温下向溶液中加入异硫氰酸苯酯(1.04 mL)，和将混合物在50℃搅拌30分钟。将反应混合物冷却至室温，和向其中加入水和乙酸。用苯洗涤三次后，将水层冻干。
向其中加入三氟乙酸(2.6 mL)，和将混合物在50℃搅拌30分钟。然后将三氟乙酸馏出。向残余物中加入水和乙酸。用苯洗涤三次后，将水层冻干。将干燥产物溶于水和乙酸，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物ANP(2-28)，为白色固体(50 mg)。
向其中加入三氟乙酸(2.6 mL)，和将混合物在50℃搅拌30分钟。然后将三氟乙酸馏出。向残余物中加入水和乙酸。用苯洗涤三次后，将水层冻干。将干燥产物溶于水和乙酸，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物ANP(2-28)，为白色固体(50 mg)。
[0713] MALDI-TOF-MS：对于C124H198N44O37S3: [M+H]+计算值2992.4，实测值2992.0。
[0714] (2-4B) Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (下式的化合物)的合成
[0715] [式103]
[0716]
[0717] 根据与(2-3A)中相同的方法使用(2-4A)中产生的hANP(2-28) (25.0 mg)代替hANP(1-28)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (13.0 mg)。
[0718] MALDI-TOF-MS：对于C141H225N47O46S3: [M+H]+计算值3409.6，实测值3409.5。
[0719] (2-4C) (GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (下式的化合物)的合成
[0720] [式104]
[0721]
[0722] 根据与(2-2C)中相同的方法自(2-4B)中产生的Boc-(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (13.0 mg)，获得标题化合物(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (6.86 mg)。
[0723] MALDI-TOF-MS：对于C136H217N47O44S3: [M+H]+计算值3309.5，实测值3309.5。
[0724] (2-4D) (SG-)Asn-hANP(2-28) (化合物2-4：下式的化合物)的合成
[0725] [式105]
[0726]
[0727] 根据与(2-2D)中相同的方法自(2-4C)中产生的(GlcNAc-)Asn-hANP(2-28) (5.75 mg)，获得标题化合物(SG-)Asn-hANP(2-28) (化合物2-4) (3.80 mg)。
[0728] MALDI-TOF-MS：对于C212H340N52O100S3: [M+H]+计算值5313.4(ave.)，实测值5314.7。
[0729] <实施例2-5> (SG-)Ser-hANP(2-28) (化合物2-5)的合成
[0730] (2-5A) Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (下式的化合物)的合成
[0731] [式106]
[0732]
[0733] 根据与(2-3A)中相同的方法使用化合物1-1D (40.8 mg)和(2-4A)中产生的hANP(2-28) (25.0 mg)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (13.0 mg)。
[0734] MALDI-TOF-MS：对于C140H224N46O46S3: [M+H]+计算值3382.6，实测值3382.7。
[0735] (2-5B) (GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (下式的化合物)的合成
[0736] [式107]
[0737]
[0738] 根据与(2-2C)中相同的方法使用(2-5A)中产生的Boc-(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (13.0 mg)，通过除去Boc获得标题化合物(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (6.36 mg)。
[0739] MALDI-TOF-MS：对于C135H216N46O44S3: [M+H]+计算值3282.5，实测值3282.6。
[0740] (2-5C) (SG-Ser)-hANP(2-28) (化合物2-5：下式的化合物)的合成
[0741] [式108]
[0742]
[0743] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-5B)中产生的(GlcNAc-)Ser-hANP(2-28) (5.47 mg)，获得标题化合物(SG-)Ser-hANP(2-28) (化合物2-5) (4.40 mg)。
[0744] MALDI-TOF-MS：对于C211H339N51O100S3: [M+H]+计算值5284.2，实测值5284.4。
[0745] <实施例2-6> hANP(1-27)-(SG-)Tyr (化合物2-6)的合成
[0746] (2-6A) hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (下式的化合物)的合成
[0747] [式109]
[0748]
[0749] 将化合物1-6D (30.6 mg)溶于二甲基甲酰胺(200 μl)。在0℃向溶液中加入N-溴琥珀酰亚胺(11.5 mg)和吡啶(5.2 μl)的二甲基甲酰胺(125 μl)溶液，和将混合物搅拌5分钟。
[0750] 将hANP(1-28)-乙酸盐(50.0 mg)溶于0.1 M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0, 1 ml)。在0℃向溶液中加入提前制备的三唑二酮衍生物的二甲基甲酰胺(325 μl)溶液。将混合物在室温下静置5小时，和然后得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (9.8 mg)。
[0751] MALDI-TOF-MS：对于C145H225N49O47S3: [M+H]+计算值3501.6，实测值3501.6。
[0752] (2-6B) hANP(1-27)-(SG-)Tyr (化合物2-6：下式的化合物)的合成
[0753] [式110]
[0754]
[0755] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-6A)中产生的hANP(1-27)-(GlcNAc-)Tyr (8.3 mg)，获得标题化合物hANP(1-27)-(SG-)Tyr (化合物2-6) (6.3 mg)。
[0756] MALDI-TOF-MS：对于C221H348N54O103S3: [M+H]+计算值5503.3，实测值5502.8。
[0757] <实施例2-7> SG-hANP(1-28)-SG (化合物2-7)的合成
[0758] (2-7A) GlcNAc-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0759] [式111]
[0760]
[0761] 将化合物1-2C (25.0 mg)溶于二甲基甲酰胺(0.5 ml)。在室温下向溶液中加入三乙胺(34 ml)，然后在冰冷却下加入二甲基硫代膦酰氯(12.0 mg)的二甲基甲酰胺(0.5 ml)溶液，和然后将混合物在室温下搅拌1小时。同时，将hANP(1-28)-乙酸盐(25 mg)溶于二甲基甲酰胺(1 ml)和蒸馏水(0.32 ml)。在室温下向溶液中加入三乙胺(25.3 μl)，然后在冰冷却下加入提前制备的活化酯的二甲基甲酰胺(433 μl)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。将反应溶液加入至冰冷的0.5%三氟乙酸水溶液(5 ml)，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物GlcNAc-hANP(1-28) (17.8 mg)。
[0762] MALDI-TOF-MS：对于C137H218N46O46S3: [M+H]+计算值3340.5，实测值3340.5。
[0763] (2-7B) GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (下式的化合物)的合成
[0764] [式112]
[0765]
[0766] 根据与(2-2B)中相同的方法使用(2-7A)中产生的GlcNAc-hANP(1-28) (30.0 mg)和化合物1-7A，通过将GlcNAc与hANP的C端连接，获得标题化合物GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (10.0 mg)。
[0767] MALDI-TOF-MS：对于C147H236N48O51S3: [M+H]+计算值3586.7，实测值3586.7。
[0768] (2-7C) SG-hANP(1-28)-SG (化合物2-7：下式的化合物)的合成
[0769] [式113]
[0770]
[0771] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-7B)中产生的GlcNAc-hANP(1-28)-GlcNAc (6.0 mg)，获得标题化合物SG-hANP(1-28)-SG (化合物2-7) (13.0 mg)。
[0772] MALDI-TOF-MS：对于C299H482N58O163S3: [M+H]+计算值7590.0，实测值7589.0。
[0773] <实施例2-8> (SG-)Asn-hANP(3-28) (化合物2-8)的合成
[0774] (2-8A) (GlcNAc-)Asn-hANP(3-28) (下式的化合物)的合成
[0775] [式114]
[0776]
[0777] 将(2-4A)中产生的hANP(2-28) (32.0 mg)的N-端氨基酸通过(2-4A)的方法除去，再次获得hANP(3-28)。根据与实施例2-4中相同的方法使用得到的hANP(3-28)代替hANP(2-28)，获得标题化合物(GlcNAc-)Asn-hANP(3-28) (3.5 mg)。
[0778] MALDI-TOF-MS：对于C130H206N46O43S3: [M+H]+计算值3196.5，实测值3196.7。
[0779] (2-8B) (SG-)Asn-hANP(3-28) (下式的化合物：化合物2-8)的合成
[0780] [式115]
[0781]
[0782] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-8A)中产生的GlcNAc-Asn-hANP(3-28) (3.5 mg)，获得标题化合物(SG-)Asn-hANP(3-28) (化合物2-8) (2.5 mg)。
[0783] MALDI-TOF-MS：对于C206H329N51O99S3: [M+H]+计算值5198.1，实测值5198.3。
[0784] <实施例2-9> SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-9)的合成
[0785] (2-9A) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0786] [式116]
[0787]
[0788] 根据与(1-5B)中相同的方法使用(2-3B)中产生的(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (16.0 mg)，通过将GlcNAc与Asp的氨基连接，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (6.15 mg)。
[0789] MALDI-TOF-MS：对于C149H237N49O53S3: [M+H]+计算值3657.7，实测值3658.1。
[0790] (2-9B) SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-9：下式的化合物)的合成
[0791] [式117]
[0792]
[0793] 通过与2-2D中相同的方法使用(1-12A)中产生的化合物SG-Oxa的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(60 mM, 168 μl)、糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml, 67 μl)和(2-9A)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (6.15 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-9) (6.7 mg)。
[0794] MALDI-TOF-MS：对于C301H483N59O165S3: [M+H]+计算值7661.0，实测值7660.7。
[0795] <实施例2-10> AG(9)-hANP(1-28) (化合物2-10)的合成
[0796] (2-10A) AG(9)-hANP(1-28) (化合物2-10：下式的化合物)的合成
[0797] [式118]
[0798]
[0799] 将(2-1B)中合成的SG-hANP(1-28) (21 mg)溶于0.2 M乙酸盐缓冲溶液(pH 5.0) (1000 μl)。然后向溶液中加入神经氨酸酶([E.C.3.2.1.18], Nacalai Tesque, Inc., 1 U/ml)的水溶液(1000 μl)，和将混合物在37℃反应17小时。反应完成后，向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(2000 μl)。不溶物通过加入乙酸(200 μl)溶解。将两个批次的该反应溶液合并，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(9)-hANP(1-28) (化合物2-10) (33.8 mg)。
[0800] MALDI-TOF-MS：对于C191H307N49O86S3: [M+H]+计算值4760.0，实测值4760.4。
[0801] <实施例2-11> AG(7)-hANP(1-28)的合成
[0802] (2-11A) AG(7)-hANP(1-28) (化合物2-11：下式的化合物)的合成
[0803] [式119]
[0804]
[0805] 将(2-10A)中合成的AG(9)-hANP(1-28) (16 mg)溶于蒸馏水(1425 μl)。然后向溶液中加入0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25) (1500 μl)和β1-4半乳糖苷酶(New England BioLabs Japan Inc., 8000 U/ml)的水溶液(75 μl)，和将混合物在37℃反应24小时。反应完成后，向其中加入0.2%三氟乙酸水溶液(3000 ul)。不溶物通过加入乙酸(300 μl)溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(7)-hANP(1-28) (化合物2-11) (11.7 mg)。
[0806] MALDI-TOF-MS：对于C179H287N49O76S3: [M+H]+计算值4435.9，实测值4435.8。
[0807] <实施例2-12> SG-三唑-hANP(1-28) (化合物2-12)的合成
[0808] (2-12A) 戊炔酰基-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0809] [式120]
[0810]
[0811] 根据与(2-7A)中相同的方法使用hANP(1-28)-乙酸盐(50.0 mg)和4-戊炔酸(10.0 mg, 101 μmol)，获得标题化合物戊炔酰基-hANP(1-28) (26.0 mg)。
[0812] MALDI-TOF-MS：对于C132H207N45O40S3: [M]+计算值3158.4，实测值3158.0。
[0813] (2-12B) GlcNAC-三唑-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0814] [式121]
[0815]
[0816] 向(2-12A)中产生的戊炔酰基-hANP(1-28) (22.0 mg)中按顺序加入30 mM N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2-(2-叠氮基乙氧基)-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-3-基]乙酰胺水溶液(0.37 mL, 11.1 μmol)、30 mM抗坏血酸钠水溶液(0.26 mL, 7.8 μmol)、10 mM硫酸铜水溶液(0.15 mL, 1.5 μmol)和0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，和将混合物在室温下搅拌4小时。将0.2%三氟乙酸水溶液(12 mL)加入至反应溶液，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物GlcNAc-三唑-hANP(1-28) (15.0 mg)。
[0817] MALDI-TOF-MS：对于C142H225N49O46S3: [M+H]+计算值3449.6，实测值3449.6。
[0818] (2-12C) SG-三唑-hANP(1-28) (化合物2-12：下式的化合物)的合成
[0819] [式122]
[0820]
[0821] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-12B)中产生的GlcNAc-三唑-hANP(1-28) (8.0 mg)，获得标题化合物SG-三唑-hANP(1-28) (化合物2-12) (9.3 mg)。
[0822] MALDI-TOF-MS：对于C218H348N54O102S3: [M+H]+计算值5451.3，实测值5451.1。
[0823] <实施例2-13> SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-13)的合成
[0824] (2-13A) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[0825] [式123]
[0826]
[0827] 根据与(2-1B)中相同的方法自化合物1-5B (9 mg)和通过(2-1A)的制备方法2制备的hANP-TFA盐(16.6 mg)，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg)。
[0828] MALDI-TOF-MS：对于C160H258N50O58S3: [M+H]+计算值3904.8，实测值3904.5。
[0829] (2-13B) SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-13：下式的化合物)的合成[0830] [式124]
[0831]
[0832] 根据与(2-9B)中相同的方法使用(2-13A)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (6.00 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-13) (6.40 mg)。
[0833] ESI-TOF-MS：对于C312H504N60O170S3: [M+4H]4+计算值1979.0(ave.)，实测值1978.5。
[0834] <实施例2-14> SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (化合物2-14)的合成
[0835] (2-14A) GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[0836] [式125]
[0837]
[0838] 根据与(2-7A)中相同的方法使用hANP(1-28)-乙酸盐(50.0 mg)和化合物1-9D (29.0 mg, 40.0 μmol)，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28) (14.9 mg)。
[0839] MALDI-TOF-MS：对于C155H249N50O55S3: [M+H]+计算值3786.7，实测值3786.8。
[0840] (2-14B) SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (化合物2-14：下式的化合物)的合成[0841] [式126]
[0842]
[0843] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-14A)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-)Lys-Gly-hANP(1-28) (6.0 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Lys-Gly-hANP(1-28) (化合物2-14) (7.6 mg)。
[0844] ESI-TOF-MS：对于C307H498N60O167S3: [M+4H]4+计算值1949.4 (ave.)，实测值1949.2。
[0845] <实施例2-15> [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (化合物2-15)的合成
[0846] (2-15A) [(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0847] [式127]
[0848]
[0849] 根据与(2-1B)中相同的方法使用化合物1-10B (27 mg)，获得标题化合物[(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (18.4 mg)。
[0850] MALDI-TOF-MS：对于C195H304N60O73S6: [M+H]+计算值4847.0，实测值4847.2。
[0851] (2-15B) [(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (化合物2-15：下式的化合物)的合成[0852] [式128]
[0853]
[0854] 通过与2-2D中相同的方法使用(1-12A)中产生的化合物SG-Oxa 的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(60 mM, 118 μl)、糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml, 47 μl)和(2-15A)中产生的[(GlcNAc-)Cys-Gly]3-hANP(1-28)，获得标题化合物[(SG-)Cys-Gly]3-hANP(1-28) (化合物2-15) (5.23 mg)。
[0855] ESI-TOF-MS：对于C423H673N75O241S6: [M+5H]5+计算值2172.5(ave.)，实测值2172.4。
[0856] <实施例2-16> SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-16)的合成
[0857] (2-16A) GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[0858] [式129]
[0859]
[0860] 根据与(2-7A)中相同的方法自(2-3B)中产生的(GlcNAc-)Asn-hANP (19.0 mg)和化合物1-3A (8.8 mg)，获得标题化合物GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (9.10 mg)。
[0861] MALDI-TOF-MS：对于C160H258N50O58S3: [M+H]+计算值3904.8，实测值3904.4。
[0862] (2-16B) SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-16：下式的化合物)的合成[0863] [式130]
[0864]
[0865] 根据与(2-9B)中相同的方法使用(2-16A)中产生的GlcNAc-PEG(3)-(GlcNAc-)Asn-hANP(1-28) (3.50 mg)，在室温下获得标题化合物SG-PEG(3)-(SG-)Asn-hANP(1-28) (化合物2-16) (3.10 mg)。
[0866] ESI-TOF-MS：对于C312H504N60O170S3: [M+4H]4+计算值1978.1(ave.)，实测值1978.8。
[0867] <实施例2-17> [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-17)的合成
[0868] (2-17A) [Cys-Gly]5-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0869] [式131]
[0870]
[0871] 根据与(2-1B)中相同的方法自化合物1-8A (50.6 mg)和通过(2-1A)的制备方法2从hANP-乙酸盐(47.0 mg)制备的hANP-TFA盐，获得中间体(13.0 mg)。
[0872] 向得到的中间体(13.0 mg)中加入三氟乙酸(1.9 mL)、水(0.05 mL)和三异丙基硅烷(0.05 mL)的混合溶液。将混合物在室温下振摇1小时。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物[Cys-Gly]5-hANP(1-28)，为白色固体(3.2 mg)。
[0873] MALDI-TOF-MS：对于C154H245N55O50S8: [M+H]+计算值3921.6，实测值3921.9。
[0874] (2-17B) [(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-17：下式的化合物)的合成[0875] [式132]
[0876]
[0877] 将(2-17A)中产生的[Cys-Gly]5-hANP(1-28) (3.00 mg)和(1-13A)中产生的化合物SG-M (9.94 mg)溶于乙腈(0.25 mL)和pH 6.75的0.2 M磷酸盐缓冲液(0.25 mL)的混合溶液，和将溶液在室温下搅拌2小时。反应溶液用水稀释，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液，得到标题化合物[(SG-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-17) (8.19 mg)。
[0878] ESI-TOF-MS：对于C619H985N95O375S8: [M+6H]6+计算值2670.1(ave.)，实测值2670.1。
[0879] <实施例2-18> [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-18)的合成
[0880] (2-18A) N-[(1R)-1-(丙-2-炔基氨基甲酰基)丁-3-炔基]氨基甲酸叔丁酯(下式的化合物)的合成
[0881] [式133]
[0882]
[0883] 根据与(1-9A)中相同的方法使用(2R)-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-戊炔酸(430 mg, 2.02 mmol)和炔丙基胺(140 mg, 2.54 mmol)，获得标题化合物，为浅黄色固体(480 mg，收率：96%)。
[0884] MS (ESI)：对于C13H19N2O3: [M+H]+计算值251，实测值251。
[0885] (2-18B) (2R)-2-氨基-N-丙-2-炔基-戊-4-烯酰胺三氟乙酸盐(下式的化合物)的合成
[0886] [式134]
[0887]
[0888] 根据与(1-9B)中相同的方法使用(2-18A)中获得的标题化合物(250 mg, 1.00 mmol)，获得标题化合物，为浅黄色油状物(270 mg，收率：100%)。
[0889] 1H-NMR (CD3OD) δ: 4.11-3.96 (3H, m), 2.87-2.74 (2H, m), 2.68-2.65 (2H, m)。
[0890] (2-18C) (2R)-2-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰基氨基]-N-丙-2-炔基-戊-4-烯酰胺(下式的化合物)的合成
[0891] [式135]
[0892]
[0893] 根据与(1-15A)中相同的方法使用(2-18B)中获得的标题化合物(270 mg, 1.00 mmol)，获得标题化合物，为浅黄色固体(220 mg，收率：73%)。
[0894] MS (ESI)：对于C15H14N3O4: [M-H]-计算值300，实测值300。
[0895] (2-18D) [(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-18：下式的化合物)的合成[0896] [式136]
[0897]
[0898] 将(1-18A)中产生的化合物SG-N3 (20.0 mg, 8.73 μmol)溶于0.10 M磷酸盐缓冲液(pH 8.0) (0.840 ml)。向溶液中按顺序加入3.3 mM (2-18C)中获得的标题化合物的叔丁醇(1.06 mL, 3.50 μmol)溶液、50 mM抗坏血酸钠水溶液(0.420 mL, 21.0 μmol)和10 mM硫酸铜水溶液(0.420 mL, 4.20 μmol)，和将混合物在室温下搅拌1.5小时。加入0.2%三氟乙酸水溶液(12 mL)至反应溶液，和得到的产物通过反相HPLC (Shiseido Co., Ltd., Proteonavi)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到中间体(6.20 mg, 36%)。
[0899] 根据与(2-17B)中相同的方法自(2-17A)中产生的(Cys-Gly)5-hANP(1-28) (1.76 mg)和合成的中间体(10.3 mg)，获得标题化合物[(SG2-)Cys-Gly]5-hANP(1-28) (化合物2-18) (8.42 mg)。
[0900] ESI-TOF-MS：对于C1089H1730N160O690S8: [M-10H]10-计算值2835.1(ave.)，实测值2834.9。
[0901] <实施例2-19> SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-19)的合成
[0902] (2-19A) TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3) (下式的化合物)的合成[0903] [式137]
[0904]
[0905] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(250 mg, 0.300 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(5 mL)，和将混合物振摇10分钟。过滤后，向其中加入3-[2[2[2[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(175 mg, 0.360 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(257 μL, 1.50 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，和将混合物在室温下搅拌2小时。过滤后，树脂用二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次和用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向树脂中加入(2S)-2,6-双(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)己酸(532 mg, 0.900 mmol)、HATU (342 mg, 0.900 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(308 μL, 1.80 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向树脂中加入(2S)-2,6-双(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)己酸(1060 mg, 1.80 mmol)、HATU (684 mg, 1.80 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(616 μL, 3.60 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇1小时。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行5次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。将1/3量(对应于0.100 mmol)的所得树脂置于固相合成的柱中。向其中加入3-三苯甲基硫烷基丙酸(418 mg, 1.20 mmol)、HATU (456 mg, 1.20 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(411 μL, 2.40 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇1小时。过滤后，再次向树脂中加入3-三苯甲基硫烷基丙酸(418 mg, 1.20 mmol)、HATU (456 mg, 1.20 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(411 μL, 2.40 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10 mL)的溶液，和将混合物在室温下振摇1小时。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤3次。向其中加入1,1,1,3,
3,3-六氟-2-丙醇(2.5 mL)和二氯甲烷(7.5 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇1.5小时。将树脂滤出，和滤液在减压下浓缩。将浓缩物与二氯甲烷共沸6次，和在真空泵中干燥，得到标题化合物TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3)，为棕色固体(170 mg)。
3,3-六氟-2-丙醇(2.5 mL)和二氯甲烷(7.5 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇1.5小时。将树脂滤出，和滤液在减压下浓缩。将浓缩物与二氯甲烷共沸6次，和在真空泵中干燥，得到标题化合物TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(3)，为棕色固体(170 mg)。
[0906] (2-19B) HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0907] [式138]
[0908]
[0909] 根据与(2-17A)中相同的方法自(2-19A)中产生的化合物(66.1 mg)，获得中间体(40 mg)。
[0910] 根据与(2-17A)中相同的方法自得到的中间体(7.0 mg)，获得标题化合物HS-(HS-)Lys[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (2.3 mg)。
[0911] MALDI-TOF-MS：对于C168H276N52O51S7: [M+H]+计算值4062.9，实测值4062.8。
[0912] (2-19C) SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物：化合物2-19)的合成
[0913] [式139]
[0914]
[0915] 根据与(2-17B)中相同的方法自通过(2-19B)的方法产生的HS(HS-)-Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (2.90 mg)，获得标题化合物[SG-(SG-)Lys-[SG-(SG-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-19) (5.31 mg)。
[0916] ESI-TOF-MS：对于C540H868N84O311S7: [M+7H]7+计算值1963.4(ave.)，实测值1963.4。
[0917] <实施例2-20> [SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-20)的合成
[0918] (2-20A) SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-20：下式的化合物)的合成
[0919] [式140]
[0920]
[0921] 根据与(2-17B)中相同的方法自(2-19B)中产生的HS(HS-)-Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (2.20 mg)和(1-15C)中产生的化合物SG-(SG-)Gln*-Mal (12.1 mg)，获得标题化合物SG2-(SG2-)Lys-[SG2-(SG2-)-Lys-]Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-20) (4.79 mg)。
[0922] ESI-TOF-MS：对于C904H1460N116O567S7: [M+8H]8+计算值2907.3(ave.)，实测值2907。
[0923] <实施例2-21> AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-21)的合成[0924] (2-21A) AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-21：下式的化合物)的合成
[0925] [式141]
[0926]
[0927] 根据与(2-10A)中相同的方法使用(2-13B)中合成的SG-(SG-Asn)-PEG-hANP(1-28) (16 mg)，获得标题化合物AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-21) (8.2 mg)。
[0928] ESI-TOF-MS：对于C268H436N56O138S3: [M+4H]4+计算值1687.7，实测值1687.4。
[0929] <实施例2-22> AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-22)的合成[0930] (2-22A) AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-22：下式的化合物)的合成
[0931] [式142]
[0932]
[0933] 根据与(2-11A)中相同的方法使用(2-21A)中合成的AG(9)-(AG(9)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (8 mg)，获得标题化合物AG(7)-(AG(7)-)Asn-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-22) (6.6 mg)。
[0934] ESI-TOF-MS：对于C244H396N56O118S3: [M+4H]4+计算值1525.6，实测值1525.4。
[0935] <实施例2-23> SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-23)的合成
[0936] (2-23A) TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (下式的化合物)的合成
[0937] [式143]
[0938]
[0939] 根据与(2-19A)中相同的方法自3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(202 mg)，获得标题化合物TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (135 mg)。
[0940] (2-23B) HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0941] [式144]
[0942]
[0943] 根据与(2-17A)中相同的方法自(2-23A)中产生的TrS-(TrS-)Lys-[TrS-(TrS-)Lys-]Lys-PEG(11)-CO2H (45.3 mg)，获得标题化合物HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (12.0 mg)。
[0944] MALDI-TOF-MS：对于C184H308N52O59S7: [M+H]+计算值4415.1，实测值4416.1。
[0945] (2-23C) SG4-Lys3-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-23：下式的化合物)的合成[0946] [式145]
[0947]
[0948] 根据与(2-17B)中相同的方法自(2-23B)中产生的HS-(HS-)Lys-[HS-(HS-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (3.16 mg)，获得标题化合物SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-[SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-]Lys-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-23) (4.40 mg)。
[0949] ESI-TOF-MS：对于C556H900N84O319S7: [M+6H]6+计算值2349.3(ave.)，实测值2349.2。
[0950] <实施例2-24> SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (化合物2-24)的合成[0951] (2-24A) GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0952] [式146]
[0953]
[0954] 根据与(2-7A)中相同的方法使用(2-1A)中产生的hANP(1-28)-TFA盐(33.0 mg)和化合物1-3A(13.0 mg, 24.7 μmol)，获得标题化合物GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (25.0 mg)。
[0955] MALDI-TOF-MS：对于C148H240N47O51S3: [M+H]+计算值3587.7，实测值3587.6。
[0956] (2-24B) GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (下式的化合物)的合成[0957] [式147]
[0958] 根据与(2-2B)中相同的方法使用(2-24A)中产生的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (21.0 mg)和化合物1-19B (46 mg, 73.6 μmol)，获得标题化合物GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (3.0 mg)。
[0959] MALDI-TOF-MS：对于C169H278N50O61S3: [M+H]+计算值4080.9，实测值4080.9。
[0960] (2-24C) SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (化合物2-24：下式的化合物)的合成
[0961] [式148]
[0962]
[0963] 根据与(2-2D)中相同的方法使用(2-24B)中产生的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-GlcNAc (4.0 mg)，获得标题化合物SG-PEG(3)-hANP(1-28)-PEG(3)-SG (化合物2-24) (5.5 mg)。
[0964] ESI-TOF-MS：对于C321H528N60O173S3: [M+4H]4+计算值2023.0 (ave.)，实测值2022.8。
[0965] <实施例2-25> SG-硫代乙酰胺-hANP(1-28) (化合物2-25)的合成
[0966] (2-25A) TrS-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0967] [式149]
[0968]
[0969] 将3-三苯甲基硫烷基丙酸(2.24 mg, 6.43 μmol)溶于二甲基甲酰胺(100 μl)。在室温下向溶液中加入三乙胺(1.79 μl, 12.8 μmol)，然后在冰冷却下加入二甲基硫代膦酰氯(0.83 mg, 6.46 μmol)的二甲基甲酰胺(60 μl)溶液，和然后将混合物在室温下搅拌1小时。同时，将hANP(1-28)-TFA盐(10 mg)溶于二甲基甲酰胺(200 μl)和蒸馏水(60 μl)。在室温下向溶液中加入三乙胺(4.2 μl)，然后在冰冷却下加入预先制备的活性酯的二甲基甲酰胺(160 μl)溶液，和将混合物在室温下搅拌5小时。将反应溶液加入至冰冷的0.5%三氟乙酸水溶液(2 ml)中，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物TrS-hANP(1-28) (5.77 mg)。
[0970] ESI-TOF-MS：对于C149H221N45O40S4: [M+3H]3+计算值1138.0(ave.)，实测值1137.8。
[0971] (2-25B) HS-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[0972] [式150]
[0973]
[0974] 将(2-25A)中合成的TrS-hANP(1-28) (5.77 mg)溶于三氟乙酸/蒸馏水/三异丙基硅烷(90/5/5)溶液，和溶液在室温下搅拌1小时。反应完成后，不溶物通过加入蒸馏水/乙酸(10/1)溶液(3 ml)溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物HS-hANP(1-28) (2.88 mg)。
[0975] MALDI-TOF-MS：对于C130H207N45O40S4: [M+H]+计算值3167.4，实测值3167.7。
[0976] (2-25C) SG-硫代乙酰胺-hANP(1-28) (化合物2-25：下式的化合物)的合成[0977] [式151]
[0978]
[0979] 将(2-25B)中合成的HS-hANP(1-28) (2.88 mg)和(1-11C)中合成的化合物SG-I (2.66 mg)溶于二甲基甲酰胺(300 μl)。向溶液中加入二异丙基乙胺(0.77 μl)，和将混合物在室温下搅拌1小时。反应完成后，不溶物通过加入蒸馏水/乙酸(10/1)溶液(3 ml)溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-硫代乙酰胺-hANP(1-28) (化合物2-25) (2.90 mg)。
[0980] ESI-TOF-MS：对于C218H350N52O103S4: [M+4H]4+计算值1369.9(ave.)，实测值1369.6。
[0981] <实施例2-26> AG(5)-hANP(1-28) (化合物2-26)的合成
[0982] (2-26A) AG(5)-hANP(1-28) (化合物2-26：下式的化合物)的合成
[0983] [式152]
[0984]
[0985] 通过使用离子交换树脂(Dowex 1x8)，将(2-7A)中合成的GlcNAc-hANP的三氟乙酸盐用另一种盐置换，和得到的GlcNAc-hANP乙酸盐用于下一反应。
[0986] 将(1-17C)中合成的化合物AG(5)-P (18 mg)溶于0.2 M磷酸盐缓冲溶液(pH 6.75, 160 μl)。然后向溶液中加入糖合酶(Endo-M-N175Q, Tokyo Chemistry Industry Co., Ltd., 1 U/ml, 64 μl)和(2-7A)中合成的hANP-GlcNAc的乙酸盐(8.0 mg)的二甲基亚砜(96 μl)溶液，和混合物在25℃反应3小时。在室温下通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(1.5 ml)终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物AG(5)-hANP(1-28) (化合物2-26) (5.6 mg)。
[0987] ESI-TOF-MS：对于C163H261N47O66S3: [M+3H]3+计算值1345.1(ave.)，实测值1344.6。
[0988] <实施例2-27> SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-27)的合成[0989] (2-27A) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H (下式的化合物)的合成
[0990] [式153]
[0991]
[0992] 将根据J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290的描述制备的(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(187 mg, 0.43 mmol)和HATU (163 mg, 0.43 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3.0 ml)。在室温下向溶液中加入二异丙基乙胺(150 μl, 0.86 mmol)，和将混合物搅拌3分钟。该反应溶液加入至(1-4A)中产生的3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(0.22 g, 0.36 mmol)，和将混合物在室温下搅拌3小时。将该反应混合物滴加至蒸馏水(3 ml)和乙酸(100 μl)的冰冷的混合溶剂中，和在其中溶解，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-CO2H (210 mg)。
[0993] MALDI-TOF-MS：对于C44H82N4O23: [M+K]+计算值1073.6，实测值1073.5。
[0994] (2-27B) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[0995] [式154]
[0996]
[0997] 将(2-27A)中产生的Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H (7.3 mg, 7.1 μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(150 μl)。在冰冷却下向溶液中加入三乙胺(5.9 μl, 43 μmol)和二甲基硫代膦酰氯(1.7 mg, 21 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(50 μl)溶液。该反应溶液加热至室温，同时搅拌1.5小时。在冰冷却下将该反应溶液加入至根据(2-1A)的程序制备的hANP-TFA盐(36 mg, 60 w/w%, 7.1 μmol)和三乙胺(14 μl, 99 μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1500 μl)和蒸馏水(300 μl)的混合溶剂中的溶液，和混合物加热至室温，同时搅拌1天。该反应溶液加入至冰冷的0.2 v/v%三氟乙酸水溶液(8.3 ml)，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-CO2H (14.8 mg)。
[0998] ESI-TOF-MS：对于C171H283N49O61S3: [M+2H]2+计算值2049.8(ave.)，实测值2049.5。
[0999] (2-27C) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[1000] [式155]
[1001]
[1002] 将(2-27B)中产生的Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (14.8 mg)溶于33 v/v%三氟乙酸水溶液(1.0 ml)，和将溶液在室温下静置3小时。该反应溶液加入至蒸馏水(9.5 ml)和乙酸(0.5 ml)的冰冷的混合溶剂中，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到中间体(10.2 mg)。
[1003] 将(1-2C)中产生的2-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氧基乙酸(1.4 mg, 5.1 μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(150 μl)。在冰冷却下向溶液中加入三乙胺(2.1 μl, 15 μmol)和二甲基硫代膦酰氯(0.98 mg, 7.7 μmol)。该反应溶液加热至室温，同时搅拌1.5小时。在冰冷却下将该反应溶液加入至得到的中间体(10 mg, 2.6 μmol)和三乙胺(5.0 μl, 36 μmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(1500 μl)和蒸馏水(3 00 μl)的混合溶剂中的溶液，和混合物加热至室温同时搅拌3天。将该反应溶液加入至冰冷的0.2 v/v%三氟乙酸水溶液(8.5 ml)，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (9.0 mg)。
[1004] ESI-TOF-MS：对于C176H290N50O66S3: [M-2H]2-计算值2128.3(ave.)，实测值2128.0。
[1005] (2-27D) SG-(SG-Asn)-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-27：下式的化合物)的合成
[1006] [式156]
[1007]
[1008] 在室温下向(1-12A)中产生的化合物SG-Oxa的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(60 mM, 188 μl)中加入Endo-M-N175Q (1 U/ml, 100 μl)，然后分两批以15分钟的间隔在室温下，加入(2-27D)中产生的hANP-GlcNAc (8.0 mg, 1.9 μmol)的二甲基亚砜(120 μl)溶液，和将混合物在25℃振摇1天。在室温下通过加入0.2%三氟乙酸水溶液(4.5 ml)和乙酸(0.5 ml)的混合溶剂终止反应，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-(SG-)Asn-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-27) (3.4 mg)。
[1009] ESI-TOF-MS：对于C328H536N60O178S3: [M+5H]5+计算值1653.8(ave.)，实测值1653.7。
[1010] <实施例2-28> SG-(SG-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-28)的合成
[1011] (2-28A) Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (下式的化合物)的合成
[1012] [式157]
[1013]
[1014] 将3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(350 mg, 0.42 mmol)和HATU (192 mg, 0.50 mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(3.0 ml)。在室温下向溶液中加入二异丙基乙胺(176 μl, 1.01 mmol)，和将混合物搅拌3分钟。该反应溶液加入至(1-4A)中产生的3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(259 mg, 0.42 mmol)中，和将混合物在室温下搅拌3小时。将该反应混合物滴加至蒸馏水(3 ml)和乙酸(117 μl)的冰冷的混合溶剂中，和在其中溶解，和溶液进一步用N,N-二甲基甲酰胺(3.0 ml)和蒸馏水(15 ml)的混合溶剂稀释。得到的产物从溶液中通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和
0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (399 mg)。
0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (399 mg)。
[1015] ESI-TOF-MS：对于C69H118N2O29: [M-H]-计算值1437.8，实测值1437.8。
[1016] (2-28B) H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (下式的化合物)的合成
[1017] [式158]
[1018]
[1019] 根据与(1-4A)中相同的方法自(2-28A)中产生的Fmoc-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (250 mg)，获得标题化合物H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (77 mg)。
[1020] MALDI-TOF-MS：对于C54H108N2O27: [M+H]+计算值1217.7，实测值1217.9。
[1021] (2-28C) Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (下式的化合物)的合成[1022] [式159]
[1023]
[1024] 根据与(2-27A)中相同的方法自根据J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 284-290的描述产生(2S)-4-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-乙酰胺基-4,5-二羟基-6-(羟基甲基)四氢吡喃-2-基]氨基]-2-(叔丁氧羰基氨基)-4-氧代丁酸(32 mg, 74 μmol)的和(2-28B)中产生的H2N-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (76 mg)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-CO2H (58 mg)。
[1025] MALDI-TOF-MS：对于C71H135N5O36: [M+K]+计算值1673.0，实测值1672.9。
[1026] (2-28D) Boc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1027] [式160]
[1028]
[1029] 根据与(2-27B)中相同的方法使用(2-28C)中产生的Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-COOH (29 mg, 18 μmol)和(2-1A)中产生的hANP(1-28)-TFA盐(50 mg, 60 w/w%, 9.7 μmol)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (35 mg)。
[1030] MALDI-TOF-MS：对于C198H336N50O74S3: [M+H]+计算值4695.3，实测值4697.5。
[1031] (2-28E) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1032] [式161]
[1033]
[1034] 根据与(2-27C)中相同的方法自(2-28D)中产生的Boc-(GlcNAc-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (35 mg, 7.4 μmol)，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (16 mg)。
[1035] MALDI-TOF-MS：对于C203H343N51O79S3: [M+H]+计算值4859.4(ave.)，实测值4858.4。
[1036] -TOF-MS：对于C203H343N51O79S3: [M+H]+计算值4859.4(ave.)，实测值4858.4。
[1037] (2-28F) SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-28：下式的化合物)的合成
[1038] [式162]
[1039]
[1040] 根据与(2-27D)中相同的方法自(1-12A)中产生的化合物SG-Oxa的0.2 M磷酸盐缓冲溶液(60 mM, 190 μl)和(2-28F)中产生的GlcNAc-(GlcNAc)-Asn-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (16 mg, 3.2 μmol)，获得标题化合物SG-(SG-Asn)-PEG(11)-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-28) (13 mg)。
[1041] ESI-TOF-MS：对于C355H589N61O191S3: [M+4H]4+计算值2217.0(ave.)，实测值2216.9。
[1042] <实施例2-29> SG-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-29)的合成
[1043] (2-29A) SG-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-29：下式的化合物)的合成
[1044] [式163]
[1045]
[1046] 根据与(1-14B)中相同的方法自(2-24A)中产生的GlcNAc-PEG(3)-hANP(1-28) (15.0 mg)，获得标题化合物SG-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-29) (12.32 mg)。
[1047] ESI-TOF-MS：对于C224H362N52O107S3: [M+4H]4+计算值1399.0(ave.)，实测值1398.3。
[1048] <实施例2-30> SG-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-30)的合成
[1049] (2-30A) GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1050] [式164]
[1051]
[1052] 根据与(2-7A)中相同的方法使用hANP(1-28)-TFA盐(43.9 mg)和化合物1-4B (15.0 mg)，获得标题化合物GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (33.7 mg)。
[1053] MALDI-TOF-MS：对于C164H271N47O59S3: [M+H]+计算值3939.9，实测值3939.8。
[1054] (2-30B) SG-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-30；下式的化合物)的合成[1055] [式165]
[1056]
[1057] 根据与(1-14B)中相同的方法使用(2-30A)中产生的GlcNAc-PEG(11)-hANP(1-28) (15.0 mg)，获得标题化合物SG-PEG(11)-hANP(1-28) (化合物2-30) (11.52 mg)。
[1058] ESI-TOF-MS：对于C240H394N52O115S3: [M+5H]5+计算值1189.8(ave.)，实测值1189.3。
[1059] <实施例2-31> SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-31)的合成[1060] (2-31A) H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1061] [式166]
[1062]
[1063] 根据与(2-1B)中相同的方法使用3-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(11.7 mg)和通过(2-1A)的制备方法2自hANP(1-28)-乙酸盐(41.0 mg)制备的hANP(1-28)-TFA盐，获得Boc-PEG(3)-hANP(1-28) (12.7 mg)。
[1064] 根据与(2-2C)中相同的方法使用得到的Boc-PEG(3)-hANP(1-28) (12.7 mg)，获得标题化合物H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg)。
[1065] MALDI-TOF-MS：对于C138H224N46O44S3: [M+H]+计算值3326.6，实测值3326.6。
[1066] (2-31B) HS-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1067] [式167]
[1068]
[1069] 根据与(2-25A)和(2-25B)中相同的方法使用(2-31A)中产生的H2N-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg)，获得标题化合物HS-PEG(3)-hANP(1-28) (5.00 mg)。
[1070] MALDI-TOF-MS：对于C141H228N46O45S4: [M+H]+计算值3414.6，实测值3414.7。
[1071] (2-31C) SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物：化合物3-31)的合成
[1072] [式168]
[1073]
[1074] 根据与(2-17B)中相同的方法使用(2-31C)中产生的HS-PEG(3)-hANP(1-28) (4.00 mg)和(1-15C)中产生的SG-(SG-)Gln*-Mal (7.43 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Gln*-Mal-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-31) (2.09 mg)。
[1075] ESI-TOF-MS：对于C325H524N62O174S4: [M+5H]5+计算值1643.4(ave.)，实测值1643.2。
[1076] <实施例2-32> SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (化合物2-32：下式的化合物)的合成
[1077] [式169]
[1078]
[1079] 将(2-25B)中产生的HS-hANP(1-28) (2.3 mg)和(1-16C)中产生的SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal (4.0 mg)溶于0.2 M乙酸盐缓冲液(pH 5.0) (0.10 mL)和二甲基亚砜(0.10 mL)的混合溶剂，和溶液在室温下搅拌5小时。将0.2%三氟乙酸水溶液(2.0 mL)加入至反应溶液，和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到标题化合物SG-(SG-)Gln*-PEG(3)-Mal-hANP(1-28) (化合物2-32) (3.5 mg)。
[1080] ESI-TOF-MS：对于C325H528N62O174S4: [M+4H]4+计算值2054.0 (ave.)，实测值2053.8。
[1081] <实施例2-33> SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-hANP(1-28) (化合物2-33)的合成[1082] (2-33A) TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H (下式的化合物)的合成
[1083] [式170]
[1084]
[1085] 将1.20 mmol/g 2-氯三苯甲基氯化物树脂(83 mg, 0.100 mmol)置于固相合成的柱中。向其中加入二氯甲烷(2 mL)和将混合物振摇10分钟。过滤后，向其中加入3-[2[2[2[2-(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(97.5 mg, 0.200 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(85.6 μL, 0.500 mmol)的二氯甲烷(2 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇2小时。过滤后，树脂用二氯甲烷混合溶液(二氯甲烷:甲醇:N,N-二异丙基乙胺= 85:10:5, v/v)洗涤三次，用二氯甲烷洗涤三次和用N,N-二甲基甲酰胺洗涤三次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(2 mL)溶液和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向树脂中加入(2S)-2,6-双(9H-芴-9-基甲氧羰基氨基)己酸(177 mg, 0.300 mmol)、HATU (114 mg, 0.300 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(103 μL, 0.600 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇30分钟。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。向其中加入20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(2 mL)溶液，和将混合物振摇5分钟，接着过滤。该操作进行4次。树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次。
向其中加入3-三苯甲基硫烷基丙酸(209 mg, 0.600 mmol)、HATU (228 mg, 0.600 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(205 μL, 1.20 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇1小时。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次。向其中加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(0.5 mL)和二氯甲烷(1.5 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇2小时。将树脂滤出，和滤液在减压下浓缩。将浓缩物与二氯甲烷一起共沸6次和在真空泵中干燥得到标题化合物TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H，为棕色固体(105 mg)。
向其中加入3-三苯甲基硫烷基丙酸(209 mg, 0.600 mmol)、HATU (228 mg, 0.600 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(205 μL, 1.20 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(2 mL)溶液，和将混合物在室温下振摇1小时。过滤后，树脂用N,N-二甲基甲酰胺洗涤4次和用二氯甲烷洗涤4次。向其中加入1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(0.5 mL)和二氯甲烷(1.5 mL)的混合溶液，和将混合物在室温下振摇2小时。将树脂滤出，和滤液在减压下浓缩。将浓缩物与二氯甲烷一起共沸6次和在真空泵中干燥得到标题化合物TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H，为棕色固体(105 mg)。
[1086] (2-33B) TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1087] [式171]
[1088]
[1089] 根据与(2-17A)中相同的方法自(2-33A)中产生的TrS-(TrS-)Lys-PEG(3)-CO2H (27.4 mg)，获得标题化合物TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (30 mg)。
[1090] MALDI-TOF-MS：对于C188H272N48O47S5: [M+H]+计算值4114.9，实测值4115.1。
[1091] (2-33C) HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1092] [式172]
[1093]
[1094] 根据与(2-17B)中相同的方法自(2-33B)中产生的TrS-(TrS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (30.0 mg)，获得标题化合物HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (15.3 mg)。
[1095] MALDI-TOF-MS：对于C150H244N48O47S5: [M+H]+计算值3630.7，实测值3631.0。
[1096] (2-33D) SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (化合物2-33：下式的化合物)的合成
[1097] [式173]
[1098]
[1099] 根据与(2-17C)中相同的方法自通过(2-33C)的方法产生的HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (5.00 mg)，获得标题化合物SG-Mal-(SG-Mal-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (化合物2-33) (8.55 mg)。
[1100] ESI-TOF-MS：对于C336H540N64O177S5: [M+5H]5+计算值1694.7(ave.)，实测值1694.5。
[1101] <实施例2-34> SG-硫代乙酰胺-(SG-硫代乙酰胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (化合物2-34)的合成
[1102] (2-34A) SG-硫代乙酰胺-(SG-硫代乙酰胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1103] [式174]
[1104]
[1105] 根据与(2-25C)中相同的方法使用(2-33C)中产生的HS-(HS-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (4.14 mg)和(1-19D)中产生的化合物SG-I (7.40 mg)，获得标题化合物SG-硫代乙酰胺-(SG-硫代乙酰胺-)Lys-PEG-(3)-hANP(1-28) (化合物2-34) (4.74 mg)。
[1106] ESI-TOF-MS：对于C326H530N62O173S5: [M+5H]5+计算值1650.3(ave.)，实测值1650.2。
[1107] <实施例2-35> SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-35)的合成
[1108] (2-35A) Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1109] [式175]
[1110]
[1111] 向化合物1-20A (4.40 mg, 7.42 μmol)和HATU (2.6 mg, 6.84 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺(94 μL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(5.0 μL, 29.4 μmol)，和将混合物在室温下搅拌3分钟。将得到的反应溶液加入至hANP(1-28)-TFA盐(25 mg)和N,N-二异丙基乙胺(13 μL, 76.4 μmol)的N,N-二甲基甲酰胺/水(5:1, v/v) (0.60 mL)混合溶液中，和将混合物在室温下搅拌2小时。向反应溶液中加入0.2%三氟乙酸水溶液(3 mL)和得到的产物通过反相HPLC (GL Sciences Inc., Inertsil ODS-3)分离和纯化，使用0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液作为洗脱液和冻干，得到Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (18.0 mg)。
[1112] 根据与(2-2C)中相同的方法使用得到的Boc-(Boc-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (18.0 mg)，获得标题化合物Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (12.0 mg)。
[1113] MALDI-TOF-MS：对于C144H237N48O45S3: [M+H]+计算值3454.7，实测值3454.7。
[1114] (2-35C) SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-35：下式的化合物)的合成[1115] [式176]
[1116]
[1117] 根据与(2-1B)中相同的方法使用(2-35B)中产生的Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (6.0 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Lys-PEG(3)-hANP(1-28) (化合物2-35) (6.4 mg)。
[1118] ESI-TOF-MS：对于C316H507N60O171S3: [M-5H]5-计算值1595.7 (ave.)，实测值1595.6。
[1119] <实施例2-36> SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (化合物2-36)的合成[1120] (2-36A) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1121] [式177]
[1122]
[1123] 根据与(2-1B)中相同的方法使用化合物1-21B (13.8 mg)和通过(2-1A)的制备方法2自hANP-乙酸盐(37.1 mg)制备的hANP(1-28)-TFA盐，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (27.0 mg)。
[1124] MALDI-TOF-MS：对于C176H286N56O61S3: [M+H]+计算值4258.0，实测值4257.8。
[1125] (2-36B) GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1126] [式178]
[1127]
[1128] 根据与(2-17A)中相同的方法自(2-36A)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(tBuSer-Gly)3-hANP(1-28) (27.0 mg)，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (4.66 mg)。
[1129] MALDI-TOF-MS：对于C164H262N56O61S3: [M+H]+计算值4089.8，实测值4090.1。
[1130] (2-36C) SG-(SG-Asn)-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (化合物2-36：下式的化合物)的合成
[1131] [式179]
[1132]
[1133] 根据与(2-2D)中相同的方法自(2-36B)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (3.50 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Asn-(Ser-Gly)3-hANP(1-28) (化合物2-36) (3.24 mg)。
[1134] ESI-TOF-MS：对于C316H508N66O173S3: [M+4H]4+计算值2025.0(ave.)，实测值2025.0。
[1135] <实施例2-37> SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (化合物2-37)的合成
[1136] (2-37A) Gly3-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1137] [式180]
[1138]
[1139] 根据与(2-1B)中相同的方法使用2-[[2-[[2-(叔丁氧羰基氨基)乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酸(27.7 mg)和通过(2-1A)的制备方法2自hANP-乙酸盐制备的hANP-TFA盐(246 mg)，获得Boc-Gly3-hANP(1-28) (196 mg)。根据与(2-2C)中相同的方法自得到的Boc-Gly3-hANP(1-28) (196 mg)，获得标题化合物Gly3-hANP(1-28) (190 mg)。
[1140] MALDI-TOF-MS：对于C133H212N48O42S3: [M+H]+计算值3250.5，实测值3250.6。
[1141] (2-37B) Gly6-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1142] [式181]
[1143]
[1144] 根据与(2-1B)中相同的方法自(2-37A)中产生的Gly3-hANP(1-28) (190 mg)和2-[[2-[[2-(叔丁氧羰基氨基)乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]乙酸(13.4 mg)，获得Boc-Gly6-hANP(1-28) (115 mg)。
[1145] 根据与(2-2C)中相同的方法自得到的Boc-Gly6-hANP(1-28) (115 mg)，获得标题化合物Gly6-hANP(1-28) (115 mg)。
[1146] MALDI-TOF-MS：对于C139H221N51O45S3: [M+H]+计算值3421.6，实测值3421.5。
[1147] (2-37C) Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成
[1148] [式182]
[1149]
[1150] 根据与(1-5A)中相同的方法自(2-37B)中产生的Gly6-hANP(1-28) (60.0 mg)，获得标题化合物Boc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (23.0 mg)。
[1151] MALDI-TOF-MS：对于C156H248N54O54S3: [M+H]+计算值3838.7，实测值3839.0。
[1152] (2-37D) GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (下式的化合物)的合成[1153] [式183]
[1154]
[1155] 根据与(1-5B)中相同的方法自(2-37C)中产生的Boc-(GlcNAc-Asn)-Gly6-hANP(1-28) (23.0 mg)，获得标题化合物GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28)，为白色固体(6.77 mg)。
[1156] MALDI-TOF-MS：对于C161H255N55O59S3: [M+H]+计算值3999.8，实测值4000.1。
[1157] (2-37E) SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (化合物2-37：下式的化合物)的合成[1158] [式184]
[1159]
[1160] 根据与(2-2D)中相同的方法自(2-37D)中产生的GlcNAc-(GlcNAc-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (3.40 mg)，获得标题化合物SG-(SG-)Asn-Gly6-hANP(1-28) (化合物2-37) (4.32 mg)。
[1161] ESI-TOF-MS：对于C313H501N65O171S3: [M+4H]4+计算值2002.7(ave.)，实测值2002.5。
[1162] <实施例2-38> SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2 (化合物2-38：下式的化合物)的合成
[1163] [式185]
[1164]
[1165] 根据与(2-32A)中相同的方法使用(1-22B)中产生的SG-Lys-[PEG(3)-Mal]2 (3.0 mg, 0.94 μmol)，获得标题化合物SG-Lys*-[PEG(3)-Mal-hANP(1-28)]2 (化合物2-38) (7.0 mg)。
[1166] ESI-TOF-MS：对于C388H616N103O159S8: [M-5H]5-计算值1904.8 (ave.)，实测值1904.8。
[1167] <实施例2-39> SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2 (化合物2-39：下式的化合物)的合成
[1168] [式186]
[1169]
[1170] 根据与(2-32A)中相同的方法使用(1-23B)中产生的SG-Lys*-[PEG(11)-Mal]2 (3.7 mg, 0.95 μmol)，获得标题化合物SG-Lys*-[PEG(11)-Mal-hANP(1-28)]2 (化合物2-39) (7.0 mg)。
[1171] ESI-TOF-MS：对于C420H680N103O175S8: [M-5H]5-计算值2045.8 (ave.)，实测值2045.8。
[1172] <实施例2-40> SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28) (化合物2-40：下式的化合物)的合成[1173] [式187]
[1174]
[1175] 根据与(2-1B)中相同的方法使用(1-24E)中合成的SG(Glc)-Gly-A (30 mg)，获得标题化合物SG(Glc)-Gly-A-hANP(1-28) (化合物2-40) (34.2 mg)。
[1176] ESI-TOF-MS：对于C213H341N51O103S3: [M+4H]4+计算值1341.1 (ave.)，实测值1341.0。
[1177] 另外，在实施例2的各种修饰的hANP的制备中，含有在还原端改变的糖链作为糖链的修饰的hANP可通过使用根据实施例1-11、1-12、1-13或1-14和实施例1-24的方法合成的在还原端改变的各种糖链合适地制备。
[1178] [试验实施例]
[1179] <试验实施例1> 糖-修饰的肽的cGMP提高活性的试验
[1180] 实施例2中制备的各修饰的肽的cGMP提高活性通过以下方法测量：
[1181] CHO/人GC-A细胞，其为组成型表达人GC-A的CHO细胞，以2×105个细胞/ml重悬于α-MEM、10% FBS和1%青霉素-链霉素，以20 μl/孔(4 × 103个细胞/孔)接种在384-孔板(Corning, 3826)上，和在CO2孵育箱中培养过夜。第二天，从板上除去培养基和然后以10 μl/孔向其中加入1.6 mM IBMX/KRB缓冲液。将混合物在板振荡器上搅拌和然后在室温下孵育10分钟。接着，以5 μl/孔向其中加入通过溶于水以3倍终浓度的浓度制备的试验物质(各修饰的肽和天然hANP(1-28) (Peptide Institute, Inc.)；制备稀释系列使得终浓度范围包括0.01、0.1、1、10和100 nM)。将混合物在板振荡器上搅拌和然后在CO2孵育箱中孵育15分钟。之后以5 μl/孔向其中加入裂解缓冲液(50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0和1% Triton X-100)。通过在板振荡器上搅拌10分钟将细胞裂解。随后，通过使用cGMP试剂盒(由Cisbio Bioassays制造)测量细胞裂解液中的cGMP水平。具体地，向384-孔板(Greiner, 784076)加入5 μl/孔的试剂盒中附带的稀释液、5 μl/孔的细胞裂解液、5 μl/孔的cGMP-d2和5 μl/孔的抗cGMP-Cryptate。将混合物在板振荡器上搅拌和然后在4℃在暗室中孵育过夜，接着使用RubyStar (由BMG LABTECH JAPAN Ltd.制造)测量均质时间解析荧光。计算各浓度的试验物质的活性值(T/C)，其中仅添加溶剂的孔的活性值定义为0和添加1 nM ANP的孔的活性值定义为1。将各浓度的T/C作图，和测量浓度范围内的最大T/C值从得到的S形曲线确定为Emax，T/C的值 = 0.5定义为EC50 (表1)。
[1182] 从表1的结果可知，所有修饰的肽显示与hANP相比50%或更高的cGMP提高活性(Emax > 0.5)，并保持cGMP提高活性。化合物2-17、2-18和2-20倾向于具有大约0.6-0.7的低Emax，而其它修饰的肽具有0.95或更高的Emax，并保持等于天然hANP的cGMP提高作用。
[1183] 试验化合物的cGMP提高活性
[1184] [表1]
[1185]。
[1186] <试验实施例2> 修饰的肽的NEP降解的试验
[1187] 实施例2中制备的各修饰的肽对中性内肽酶(一般名称：中性溶酶(neprilysin))的降解的抵抗通过以下方法测定：
[1188] 将中性溶酶(R&D systems, Inc.)以1 μg/ml加入至试验物质(各糖-修饰的ANP和天然hANP(1-28))的溶液，接着在37℃预处理30分钟。中性溶酶-处理的溶液用于通过试验实施例1的方法测定试验物质的cGMP提高活性。
[1189] 结果，通过NEP处理，天然hANP丢失了其活性，而本发明的修饰的肽保持cGMP提高活性在与试验实施例1相同的水平下(甚至在NEP处理之后)，证实了修饰的肽不受NEP降解的影响。
[1190] 成为天然存在的ANP从动物血液中快速消失的原因的主要机制被认为是NEP降解。本发明的修饰的肽保持cGMP提高活性(甚至在NEP处理之后)，证实了修饰的肽不受NEP降解的影响(甚至在动物体内)，并且当以有效量给予时，在给予后长的时间内可产生cGMP提高活性。
[1191] <试验实施例3> 在大鼠血液中修饰的肽的持续时间的试验
[1192] 实施例2中制备的各修饰的肽在大鼠血液中的持续时间(持续提高血液中的cGMP的作用和试验物质在血液中可检出的时间)通过以下方法测定：
[1193] (1) 制备血浆样品
[1194] 异氟烷：日本药典异氟烷
[1195] 用于血液采集的针头和注射器：结核菌素用Terumo Syringe 25G x 1 SR[1196] 用于血液采集的管：CAPIJECT Micro Collection Tube EDTA-2Na 500 μL[1197] 用于样品贮存的管：MTARIX 4170 Sample Tracking Tube 0.75 mL
[1198] 各8周龄雄性Slc:SD大鼠进行异氟烷吸入麻醉((Escain吸入麻醉剂的吸入保持在1-2%的浓度)。通过溶于水以100 μM的浓度制备的试验物质(各修饰的肽和天然hANP(1-28) (Peptide Institute, Inc.))的溶液以100 nmol/kg (1 mL/kg)的剂量快速静脉内注射至大鼠的颈静脉。在给药前和给药后15、30、60、90、120、180和240分钟，随时间自颈静脉采集血样(200 μL/采样)。将血样立即置于冰上。
[1199] 通过使用离心机(Sigma 4K15, rotor: Nr12130-H)，采集的血样以5000 rpm在4℃离心5分钟。将分离的血浆样品分成两组(用于PK测量的样品和用于cGMP测量的样品)和贮存在-80℃直到测量。
[1200] (2) 血浆中cGMP浓度的测量
[1201] 血浆中的cGMP浓度使用Amersham cGMP Enzyme Immunoassay Biotrak(TM) (EIA) System (双范围)，根据其附加的方案进行测量。以cGMP浓度为纵坐标，相对于给药后经过的时间(分钟)为横坐标，对结果作图，以计算给药后0分钟至240分钟的AUC (AUC0-240)和60-240分钟的AUC (AUC60-240) (表2)。
[1202] (3) 血浆样品中的试验物质的检测
[1203] 将内部标准(20 μL (500 nM)的稳定同位素的hANP)和乙酸混合溶剂(AcOH/蒸馏水/DMSO = 5/3/2, v/v/v)加入至(1)中制备的50 μL的各大鼠血浆样品中，和然后与其混合。将混合物转移至Amicon Ultra-0.5 50K (Millipore Corp., MA)和以14000 rpm在15℃离心30分钟。将得到的滤液转移至Amicon Ultra-0.5 3K (Millipore Corp., MA)和在前述条件下再次离心。保留在滤器上的溶液经回收和转移至96-孔深孔板。试验物质的含量通过LC-MS/MS (LC: Shimadzu LC-10ADVP (Shimadzu Corp.), MS/MS: API 4000 QTrap (AB SCIEX))测量，以计算在血浆中的浓度。试验物质最终测出的时间显示在表2的最右列中。
[1204] 在大鼠血液中的持续时间的评价
[1205] [表2]
[1206]
[1207] *) 通过使用预置值(在0分钟的值)作为基线和积分曲线中所有点与基线的差异获得的AUC值。在基线下的曲线中的点作为负值计算。
[1208] **) 通过使用预置值(在0分钟的值)作为基线和积分曲线中仅在基线上方的点与基线的差异获得的AUC值。在基线下面的曲线中的点从计算中排除。
[1209] 尽管在天然hANP中观察到通过给药引起的cGMP暂时提高，但该cGMP水平在给药后30分钟降低至接近给药开始之前的水平。在60分钟或更后，cGMP的提高完全消失。因此，天然hANP具有0或更低的AUC60-240，和因此证实在血液中没有持续时间。在检测血浆中的该试验物质中，在血浆样品中天然hANP不再被检出，甚至在给药后15分钟。
[1210] 相反的是，实施例2的修饰的肽显示高值的AUC60-240。通过给予这些试验物质提高的血浆中的cGMP浓度保持的值高于给药开始之前的值，甚至在给药后60分钟或更后(对于化合物2-1和2-10为180分钟后，对于化合物2-12、2-13、2-14和2-16为120分钟后，和对于化合物2-11、2-15和2-19为60分钟后)。此外，在给药后1.5小时或更后，这些试验物质本身仍从血浆样品中检出，证实了在长的时间内修饰的肽保留在血液中而未被体内代谢。根据这些结果，本发明的修饰的肽显示具有在血液中延长的持续时间和在该持续时间内保持cGMP提高活性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种切孔式非植入心房分流装置 | 2020-05-14 | 41 |
| 治疗心房颤动的方法 | 2020-05-12 | 306 |
| 左心房压力测量方法以及左心房压力测量装置 | 2020-05-13 | 48 |
| 综合化的心房纤颤消融 | 2020-05-12 | 764 |
| 心房附件血液过滤系统 | 2020-05-13 | 952 |
| 心房颤动检测系统 | 2020-05-13 | 111 |
| 事后心房颤动检测 | 2020-05-12 | 473 |
| 一种户外健心房 | 2020-05-14 | 941 |
| 心房心室补片 | 2020-05-14 | 709 |
| 心房井生成器 | 2020-05-14 | 350 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈