人肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体及其制备方法
阅读：744发布：2020-05-12
专利汇可以提供人肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 化学和医药技术领域，涉及一种能特异性靶向人 肺 组织肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米 抗体 、其制备方法及其应用。所述纳米抗体包括如Q(X)2LVESGG(X)2V(X)2G(X)SL(X)LS(X)24E(X)n2KG(X)4S(X)n3T(X)2Y(X)C(X)n4S(X)n5V(X)n6R所示的 氨 基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2～n6为正整数，1≤n2≤21，1≤n3≤19，1≤n4≤50，1≤n5≤22，1≤n6≤8。本发明中用人肺新鲜 冰 冻切片为 抗原 ，亲和淘筛前期构建好的SP-A纳米抗体库，并获得能与人肺SP-A具有高结合 力 的基因序列，再通过原核表达载体对这些基因序列进行蛋白诱导表达，即得到分子量小，亲和力强的纳米抗体。随后使用细胞 荧光 、免疫组化和裸鼠体内显像的方法检测出所获得的人肺组织纳米抗体存在高度特异性肺靶向性。，下面是人肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种靶向人肺组织的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如
Q(X)2LVESGG(X)2V(X)2G(X)SL(X)LS(X)24E(X)n2KG(X)4S(X)n3T(X)2Y(X)C(X)n4S(X)n5V(X)n6R所示的氨基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2～n6为正整数，1≤n2≤21，1≤n3≤19，
1≤n4≤50，1≤n5≤22，1≤n6≤8。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如Q(X1)LVESGG(X2)V(X3)G(X4)SL(X5)LS(X6)E(X7)KG(X8)S(X9)T(X10)Y(X11)C(X12)S(X13)V(X14)R所 示的氨基酸序列；其中，
X1是LQ或VK；
X2是GS、GL或DL；
X3是QS或QP；
X4是G；
X5是I、S、R或T；
X6是
CTASGSDYRWMYIARFRQCPGKER、
CAASEFTLDYYEIGWFRQAPGKDR、
CAASGFNLDDYADIGWFRQAPGKER、
CAVRGRDLDYYVIGWFRQAPGKER、
CTASKFHLDSYAVAWFRQTPGKER、
CAASGFTFNDYRMSWVRQAPGKGL或CTASGTFKIYSMGWYRRPQR；
X7是
GVAAIYTDDTDDSSPIYATSA、GLSCIGYSDRIAYYSESV、
RVLCITISDGTTYYEDSG、GVSCINNSDDTTYYSDSV、
AVSFINTSDDVTYFADSV、WVSDINSGGSSTYYADSV或
LVAEMLNGGDTQYSDSV；
X8是RFTIRFSIRFTV；
X9是
QDKDKNAVYLQMNSPKPED、RDDATSTVSLYMDMMIPED、
TDIAKNTVFLQMDSLKAED、RDHAKNTVYLQMNNLKPED、
RDNSKNTVYLQMNVLKPED、RDNAKNTLYLQMNSLKPED或
RTNNTMYLHMNNLKPED；
X10是AMGTALSIAIAV；
X11表示一个任意氨基酸残基或者空白；
X12是
AARAFGGTWSLSSPDDFSAWGQGTQVTVS、
AGSVVEPYELLPAAEYDYWGQGTRVTVS、
AGDPAPFCLYNTYVPRTWGQGTQVTVS、
AADFDRLDFTVKAMCVMKFFYYWGQGTQVTVS、
AAVRSPGPTGPSMQPMWSVPDLYDYWGQGTQVTVS、
VALLGRGCSGLVQGAFGPWGQGTQVTVS、
NLQDWYSEPAGDYWGPGTQVTVS；
X13是
GTNEVCKWPPRPCGRRCAGA、AHHSEDPGPRGLAAAGAP或
EPKTPKPQGPRGLAAAGAP；
X14是SGSAGTAC,PYPDPLEP。
3.根据权利要求2所述的纳米抗体，其特征在于，所述X11是Y或V。
4.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括如SEQ ID NO
16～SEQ ID NO 30中任意一种所示的氨基酸序列。
5.一种编码靶向人肺组织的纳米抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 15中任意一种所示。
7.如权利要求1所述的人肺组织纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述方法依次包括如下步骤：
步骤1：以新鲜冰冻人肺组织切片为抗原淘筛构建好的纳米抗体库；
步骤2：筛选获得能与人肺泡表面活性蛋白A具有高结合力的菌株并予以测序获取相关基因蛋白序列；
步骤3：对步骤2获得的基因序列进行蛋白构建诱导表达。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述淘筛的纳米抗体库为前期构建的抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体库，并采用亲和淘筛的方法。
9.如权利要求1所述的人肺组织纳米抗体在制备人肺的靶向配体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的人肺组织纳米抗体的特异性靶点为人肺泡表面活性蛋白A。
人肺靶向性抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体及其制备方
法
技术领域
背景技术
[0002] 20世纪初，诺贝尔奖获得者德国科学家Paul Ehrlich针对未来药物发展提出了“魔法子弹”这一想法，即理想的治疗药物能只选择性地破坏患病细胞而不影响健康细胞。在过去的几十年里，科学家们一直致力于探索这种理想药物的开发。
[0003] 20世纪70年代，靶向给药系统诞生，并在肿瘤治疗应用领域得到了迅速发展，随着研究的逐步深入，新型靶向给药载体的不断出现及给药途径的拓宽，靶向药物的研究扩展至肿瘤以外的其他系统疾病的治疗中。
[0004] 呼吸系统疾病的靶向药物开发也是研究热点之一，目前主要集中在以下方面：
[0005] 1、通过吸入给药实现部分气道疾病的靶向治疗。
[0006] 例如，从20世纪50年代始，吸入激素逐渐用于哮喘和COPD的治疗。此后，随着吸入药物和装置的不断改进，目前吸入激素已成为哮喘和COPD治疗的主要措施。但吸入药物主要适用于气道疾病的局部治疗，而对于气道之外的肺实质和肺间质性疾病，吸入激素因生物利用度过低而疗效较差。
[0007] 2、通过药物载体实现药物的被动肺靶向。
[0008] 目前已有多种药物载体如脂质体、微粒、微球等用于肺靶向药物的研究。然而，这种被动靶向对组织器官的选择性差，无法避免肝脾等其他器官的大量截留，因此，仍未获得理想的靶向效果。
[0009] 由于配体-受体或抗原-抗体结合是人体内的一种特殊识别机制，据文献报道，利用该识别机制可实现药物的主动靶向，增强药物疗效，减少副作用。比如 用紫杉醇脂质体与针对表皮生长因子的单克隆抗体制成的复合物，抗肿瘤效果较无单抗组增强25倍。因此，要实现理想的肺主动靶向，寻找具有高度特异性的肺组织靶向分子和制备高亲和力的靶向配体是最关键的因素。现有研究表明，在肺组织中，Ⅱ型肺泡上皮细胞是肺组织所特有的具有增殖和分泌功能的细胞，约占肺实质细胞总数的16％。Ⅱ型细胞能合成和分泌肺泡表面活性物质。肺泡表面活性物质的主要成份为脂质(90％)和蛋白(10％)，其中蛋白成份为特异性肺泡表面活性蛋白(surfactant protein，SP)。目前按SP被发现的先后命名为SP-A、SP-B、SP-C、SP-D，其中SP-A是最早发现且在Ⅱ型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白，而在肺外表达量极少，表现为高度肺特异性，是一种理想的特异性肺组织靶向分子。
[0010] 理想的靶向配体除具有高亲和力外，还应具备分子量小、穿透力强、免疫原性弱的特点。抗原-抗体结合是最强的识别机制，因此，抗体是配体制备的首选。然而，完整的抗体分子虽亲和力高，但分子量大(相对分子量为150000)，组织穿透能力弱，免疫原性强，并不是理想的配体。随着抗体工程、基因工程等技术的发展，对抗体进行工程化改造而成的抗体片段(Fab、ScFv)现已具备了分子量小、免疫原性弱的优势，但相对完整抗体分子，其稳定性、亲和力均降低。
[0011] 1993年比利时科学家首次报道在骆驼类动物血中存在没有轻链的重链抗体(HCAbs)。该重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chains of HCAbs，VHH)具有完整、独立的抗原结合能力，若克隆该可变区，即可得到一个大小尺寸在纳米级别的单域抗体，又称纳米抗体( Nbs)。纳米抗体作为配体具有许多优势：1)分子量小，组织穿透力强，亲和力高。它是目前已知分子量最小的抗体分子，其相对分子量仅为
15000；穿透能力明显优于完整抗体分子，与特异抗原的亲和力达nmol级。2)结构稳定，即使在37℃放置一周或在高温条件(90℃)下保存，或在离液剂、蛋白酶和极性PH值等强变性条件下，均能保持高度稳定性。3)免疫原性小，其基因与人源VH基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性，对人体的免疫原性弱，生物相容性好。由于纳米抗体的这些优势，现作为一种新型的抗体药物正在广泛研究。但其作为SP-A靶向配体及是否可实现人肺组织靶向性的研究在国内外尚未见报导。
15000；穿透能力明显优于完整抗体分子，与特异抗原的亲和力达nmol级。2)结构稳定，即使在37℃放置一周或在高温条件(90℃)下保存，或在离液剂、蛋白酶和极性PH值等强变性条件下，均能保持高度稳定性。3)免疫原性小，其基因与人源VH基因Ⅲ家族序列具有较高的同源性，对人体的免疫原性弱，生物相容性好。由于纳米抗体的这些优势，现作为一种新型的抗体药物正在广泛研究。但其作为SP-A靶向配体及是否可实现人肺组织靶向性的研究在国内外尚未见报导。
发明内容
[0012] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的。本发明的发明人在先申请的发明专利CN104109207A公开了一种针对大鼠肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体，发明人在该专利申请的基础上继续研究了在人肺组织的表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体。
[0013] 本发明提供了一种靶向人肺组织的纳米抗体、其制备方法及其应用。
[0014] 本发明还提供了一种编码靶向人肺组织的纳米抗体的核酸分子。
[0015] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0016] 本发明的第一个方面是提供一种靶向人肺组织的纳米抗体，所述纳米抗体包括如Q(X)2LVESGG(X)2V(X)2G(X)SL(X)LS(X)24E(X)n2KG(X)4S(X)n3T(X)2Y(X)C(X)n4S(X)n5V(X)n6R所示的氨基酸序列；其中，X表示任意氨基酸，n2～n6为正整数，1≤n2≤21，1≤n3≤19，1≤n4≤50，1≤n5≤22，1≤n6≤8；优选地，17≤n2≤21，n3为18或19，16≤n4≤50，
17≤n5≤22，n6为7或8。
17≤n5≤22，n6为7或8。
[0017] 在本发明所述纳米抗体的一个优选实施例中，所述纳米抗体包括如Q(X1)LVESGG(X2)V(X3)G(X4)SL(X5)LS(X6)E(X7)KG(X8)S(X9)T(X10)Y(X11)C(X12)S(X13)V(X14)R所 示的氨基酸序列；其中，
[0018] X1是LQ或VK；
[0019] X2是GS、GL或DL；
[0020] X3是QS或QP；
[0021] X4是G；
[0022] X5是I、S、R或T；
[0023] X6是
[0024] CTASGSDYRWMYIARFRQCPGKER、
[0025] CAASEFTLDYYEIGWFRQAPGKDR、
[0026] CAASGFNLDDYADIGWFRQAPGKER、
[0027] CAVRGRDLDYYVIGWFRQAPGKER、
[0028] CTASKFHLDSYAVAWFRQTPGKER、
[0029] CAASGFTFNDYRMSWVRQAPGKGL或CTASGTFKIYSMGWYRRPQR；
[0030] X7是
[0031] GVAAIYTDDTDDSSPIYATSA、GLSCIGYSDRIAYYSESV、
[0032] RVLCITISDGTTYYEDSG、GVSCINNSDDTTYYSDSV、
[0033] AVSFINTSDDVTYFADSV、WVSDINSGGSSTYYADSV或
[0034] LVAEMLNGGDTQYSDSV；
[0035] X8是RFTIRFSIRFTV；
[0036] X9是
[0037] QDKDKNAVYLQMNSPKPED、RDDATSTVSLYMDMMIPED、
[0038] TDIAKNTVFLQMDSLKAED、RDHAKNTVYLQMNNLKPED、
[0039] RDNSKNTVYLQMNVLKPED、RDNAKNTLYLQMNSLKPED或
[0040] RTNNTMYLHMNNLKPED；
[0041] X10是AMGTALSIAIAV；
[0042] X11表示一个任意氨基酸残基或者空白；
[0043] X12是
[0044] AARAFGGTWSLSSPDDFSAWGQGTQVTVS、
[0045] AGSVVEPYELLPAAEYDYWGQGTRVTVS、
[0046] AGDPAPFCLYNTYVPRTWGQGTQVTVS、
[0047] AADFDRLDFTVKAMCVMKFFYYWGQGTQVTVS、
[0048] AAVRSPGPTGPSMQPMWSVPDLYDYWGQGTQVTVS、
[0049] VALLGRGCSGLVQGAFGPWGQGTQVTVS、
[0050] NLQDWYSEPAGDYWGPGTQVTVS；
[0051] X13是
[0052] GTNEVCKWPPRPCGRRCAGA、AHHSEDPGPRGLAAAGAP或
[0053] EPKTPKPQGPRGLAAAGAP；
[0054] X14是SGSAGTAC,PYPDPLEP。
[0055] 上述纳米抗体中，优选地，所述X11是Y或V。
[0056] 在本发明所述纳米抗体的另一优选实施例中，所述纳米抗体包括如SEQ ID NO16～SEQ ID NO 30中任意一种所示的氨基酸序列。
[0058] 在上述核酸分子的一个优选实施例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO1～SEQ ID NO 15中任意一种所示。
[0059] 本发明的第三个方面是提供一种如上所述的人肺组织纳米抗体的制备方法，所述方法依次包括如下步骤：
[0061] 步骤2：筛选获得能与人肺泡表面活性蛋白A具有高结合力的菌株并予以测序获取相关基因蛋白序列；
[0062] 步骤3：对步骤2获得的基因序列进行蛋白构建诱导表达。
[0063] 在上述制备方法中，优选地，步骤1所述淘筛的纳米抗体库为前期构建的抗肺泡表面活性蛋白A的纳米抗体库，并采用亲和淘筛的方法。
[0064] 在上述制备方法中，所用的技术路线参见图9。
[0065] 本发明的第四个方面是提供一种如上所述的人肺组织纳米抗体在制备人肺的靶向配体中的应用。
[0066] 在上述应用的一个优选实施方案中，所述的人肺组织纳米抗体的特异性靶点为人肺泡表面活性蛋白A，即SP-A。
[0067] SP-A是最早发现且在Ⅱ型肺泡上皮细胞中强烈表达、信号最为丰富的蛋白，而在肺外表达量极少，表现为高度肺特异性，是一种理想的特异性肺组织靶向分子。本发明首次用SP-A作为抗原免疫羊驼，通过构建免疫抗体库，利用亲和淘筛对海量的抗体进行筛选确定具有特异性肺靶向的基因，然后采用原核表达的方法获得与SP-A具有高亲和力的人肺纳米抗体。并通过动物体内、外实验验证了其可实现高度特异性肺组织靶向分布。
[0068] 氨基酸的简写详见表1。
[0069] 表1 氨基酸的简写符号
[0070]
[0071]
[0072] 具体地，在本发明中，先将构建好的抗肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的纳米抗体库孵育于新鲜人肺的冰冻切片中，经多轮亲和淘筛获取针对人肺组织SP-A的纳米抗体库，并经间接Phage-Elisa初步筛选出与人肺SP-A高结合的15个纳米抗体菌株，经测序分析表面，其中15个为VHH序列(即纳米抗体序列)。
[0073] 从中选出结合力最好的人肺组织Nb4作为优选例，首先进行原核蛋白表达，得到分子量在190000左右、大小为纳米级别的人肺组织纳米抗体。在体外Western blot和Elisa实验中，人肺组织Nb4与hSP-A显示出良好的结合活性，进一步的细胞荧光、免疫组化和动物体内显像结果表明其能通过靶向肺组织中天然的SP-A而实现特异性肺靶向。
[0074] 作为本发明的另一优选实施例中，还可以采用人工合成的方法获得本发明的人肺组织纳米抗体的多肽。
[0075] 为了进一步优化本发明的人肺组织纳米抗体，对筛选获得的克隆株的多肽序列活性部分进行了分段试验。其中，采用人工合成的方法获得人肺组织Nb4的功能多肽(缺少MQAQKAG部分)，结果显示，切除MQAQKAG后所得的多肽与人肺组织仍有较好的特异性肺靶向分布特质。
[0076] 本发明提供了针对人肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的人肺组织纳米抗体(hSPA-Nb)。并经过多种方法验证，证明本发明所制备的人肺组织SPA-Nb具有高度特异性肺靶向分布特质。本发明内容实施操作流程如图8所示。
[0077] 在本发明中，人肺组织SPA-Nb编码序列指编码具有SPA-Nb蛋白的肺靶向活性的多肽的核苷酸序列，如序列号为SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.30的氨基酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.30序列的编码框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。
[0078] 与氨基酸相对应的密码子详见图10。
[0079] SPA-Nb编码序列还包括能编码具有与SPA-Nb相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.30序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
[0080] 一旦获得了SPA-Nb的编码序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0081] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，因为本发明的抑制因子的长度较短。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0082] 在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
[0083] 如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0084] 在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS 细胞等。
[0085] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，新鲜人肺组织中提取总蛋白，作为抗体靶向性及特异性验证的抗原。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人肺SPA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
[0086] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0087] 本发明提供了一种能特异性靶向人肺泡表面活性蛋白A(hSP-A)的纳米抗体。本发明中用人肺新鲜冰冻切片为抗原，亲和淘筛前期构建好的SP-A纳米抗体库，并获得能与人肺SP-A具有高结合力的基因序列，再通过原核表达载体对这些基因序列进行蛋白诱导表达，即得到分子量小，亲和力强的纳米抗体。随后使用细胞荧光、免疫组化和裸鼠体内显像的方法检测出所获得的人肺组织纳米抗体存在高度特异性肺靶向性。因此，本发明在技术上涉及到特异性人肺靶向纳米抗体的制备，为肺靶向配体的研究提供了新的思路，也为人类肺部疾病的靶向治疗提供重要工具。附图说明
[0088] 图1为新鲜人肺组织匀浆中肺泡表面活性蛋白A(hSP-A)的Western blot和Elisa检测；其中，1A为人肺SP-A蛋白Western blot(1：Mark，2：hSP-A)；1B为Elisa检测(1：hSP-A，2：阴性蛋白)。
[0089] 图2A为PHAGE-ELISA的淘筛图；图2B为15个克隆蛋白编码序列对比。
[0090] 图3为人肺组织纳米抗体Nb4的SDS-PAGE(1：Mark，2：Nb4)。
[0091] 图4为人肺组织纳米抗体Nb4电镜图谱。
[0092] 图5为纯化人肺组织SPA-Nb的Western blot和Elisa检测；其中，5A为Western blot(阳：SP-A-mono-ant，17：Nb4，阴：H1N1纳米抗体)；5B为Elisa检测(1：SP-A-mono-ant，2：Nb4，3：无关纳米抗体)；★代表P<0.001，▲代表P>0.05。
[0093] 图6为人肺组织纳米抗体Nb4与人肺、肝、脾、肾快速冰冻切片的免疫组化。
[0094] 图7为人肺组织纳米抗体Nb4与细胞A549、L-02、293T的细胞荧光免疫。
[0095] 图8为FITC标记的人肺组织纳米抗体Nb4在裸鼠体内不同时间点的全身显像(分别为：尾静脉注射后5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h)。
[0096] 图9为人肺组织hSPA-Nb的制备过程。
[0097] 图10为氨基酸相对于的密码子。
具体实施方式
[0098] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0099] 实施例1.人肺泡表面活性蛋白A(hSP-A)的获取：
[0100] 1.1人肺组织表面活性蛋白A(hSP-A)的获取：
[0102] 1.2 hSP-A的鉴定：
[0103] 1.2.1 Western blot检测：
[0104] 提取的hSP-A经SDS-PAGE分离并电转移至硝酸纤维素膜。以20％的山羊血清封闭2h，依次滴加鼠抗hSP-A单克隆抗体免疫血清(室温2h、PBS洗3次)，及抗鼠IgG荧光血清染色(室温反应1h、PBS洗涤3次)，最后在荧光扫描仪扫描并拍照显示目标条带为35Kd、70Kd、120Kd左右，为多条带(图1A)。
[0105] 1.2.2 Elisa检测：
[0106] Elisa检测提纯后蛋白质的免疫活性。分别用提纯的hSP-A蛋白、无关蛋白包被96孔酶联吸附板，于4℃过夜。次日以3％脱脂奶粉37℃封闭1h，依次滴加hSP-A单克隆抗体(室温2h、PBS洗3次)及羊抗鼠IgG-HRP血清染色(室温反应1h、PBS洗涤3次)，最后加底物TMB显色，硫酸终止反应，以酶标仪测量显色后各孔的OD值，结果显示：与对照组比较，提纯hSP-A蛋 白与SP-A单抗体存在明显的结合活性(图1B)。
[0107] 实施例2.人肺组织SPA特异性纳米抗体(hSPA-Nb)的筛选：
[0108] 采用亲和淘洗技术，用丙酮固定新鲜人肺冰冻切片对VHH抗体库进行特异性筛选。
[0109] 2.1亲和淘洗的简化步骤：
[0110] (1)用冷丙酮固定新鲜冰冻人肺切片30min；
[0111] (2)灭菌PBS洗正反面10次，甩干；
[0112] (3)20％山羊血清(1ml血清加入4ml PBS中)封闭，37℃孵育2h，倾去封闭液，用PBS洗片3次，吹干；
[0113] (4)向封闭好的新鲜人肺切片加入制备的噬菌体文库，200μl/片，4℃过夜孵育；
[0114] (5)弃片上多余的噬菌体文库，用灭菌PBS正反面洗涤10次，吹干；
[0115] (6)取OD600为0.8的宿主菌TG1200μl/片于切片上，37℃ 1h，对结合噬菌体文库进行洗脱；PBS正反面洗涤10次，吹干，将片上的组织刮下放于2YTAG，30℃至浑浊，此即完成第一轮淘筛，获得一级筛选抗体库；计算一级筛选抗体库输出量；
[0116] (7)重复上述淘筛步骤，进行循环淘筛，最终经过3轮淘筛，即获得三级筛选抗体库。
[0117] 2.2间接Phage Elisa初步筛选抗原阳性纳米抗体：
[0118] (1)挑取3轮淘筛后涂布在2YTAG平板上长出的单个菌落，接种至96孔培养板中，30℃，振荡培养过夜；
[0119] (2)次日，另取96孔培养板，取300ul含辅助M13K07至每孔，此板标为P1 Plate；
[0120] (3)从过夜培养的Master Plate上每孔取40μl培养液至P1Plate，37℃振荡培养过夜；150rpm离心20min，小心留上清待用，即为重组表达抗体；
[0121] (4)用hSP-A包被96孔酶标板4℃，过夜；
[0122] (5)提前将上述重组抗体160μL与40μL MPBS混匀，室温孵育20min；加入封闭好的酶标孔中，4℃过夜；
[0123] (6)洗涤及加酶标二抗：将酶标抗M13K07抗体用PBS做1：1000稀释， 200ul/孔，37℃孵育反应1小时；
[0124] (7)加入200ul/孔TMB显色液，37℃孵育显色45min左右显色及用100ul/孔终止液，终止显色，在450nm处读值；初步筛选出与hSP-A特异性结合的阳性克隆株，读数大于阴性对照3倍视为阳性克隆株。
[0125] 经间接Phage Elisa初筛，与阴性对照比较，其中15个序列与抗原表现出3倍以上的结合力，视为初筛阳性克隆(图2)。
[0126] 实施例3.特异性(hSPA-Nb)的表达与纯化：
[0127] 3.1构建hSPA-Nb原核表达载体：
[0128] 将经Phage Elisa初筛阳性的15个克隆株送测序分析(图3)。挑选出结合值较高的17号(Nb17)及4号(Nb4)两个克隆株质粒，以携带BamHⅠ，XhoⅠ限制性酶切位点的上下游引物进行PCR扩增，经酶切后克隆至PET-26b(+)质粒，送测序。
[0129] 3.2纳米抗体的表达及纯化：
[0130] 选定测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，优化表达条件，选定25℃，以0.8mmol/L IPTG诱导表达蛋白，表达产物用镍柱亲和层析及分子筛进行纯化，其SDS-PAGE电泳显示所表达纳米抗体分子量为19kDa(图4),纯化蛋白经BCA法测定其浓度分别为10mg/L、12mg/L。电镜下观察两个抗体的大小在纳米范围(图5)。
[0131] 本发明中所获得的15个克隆株的核苷酸序列和氨基酸序列因能特异性靶向肺泡表面活性蛋白A，可作为有效的肺靶向配体。其核苷酸序列及氨基酸序列如下：
[0133] NO.1，即Nb4(SEQ ID NO 1)：
[0134] TTGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAATTCACTTTGGATTATTATGAAATAGGCTGGTTCCGGCAGGCCCCGGGGAAGGACCGTGAGGGGCTCTCATGTATTGGTTATAGTGACAGAATCGCGTATTATTCAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCGTCAGAGACGACGCCACGAGCACGGTCTCTCTTTATATGGATATGATGATTCCAGAGGAC ACAGGCACTTATTATTGTGCGGGGTCGGTTGTGGAGCCTTACGAGTTACTGCCAGCGGCTGAATATGACTACTGGGGACAGGGGACCCGGGTCACTGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0135] NO.2，即Nb6(SEQ ID NO 2)：
[0136] TGGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGACTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCTCTGACACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAACGTTCAAGATCTATTCCATGGGCTGGTACCGCCGCCCTCAGCGCGAGTTGGTCGCGGAAATGCTTAATGGTGGTGACACACAATATTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCAACAACACGATGTATCTCCACATGAACAACCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTCTATTATTGTAATCTACAGGATTGGTATAGCGAACCTGCGGGCGACTATTGGGGCCCGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0137] NO.3，即Nb11(SEQ ID NO 3)：
[0138] ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTAAATTCCATTTGGATTCTTATGCCGTAGCCTGGTTCCGCCAGACCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGCGGTCTCATTTATAAATACTAGTGATGATGTCACATACTTTGCTGACTCCGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACGGTATATCTGCAAATGAACGTCCTGAAACCAGAAGACACTTCTATTTATGTGTGTGCAGCGGTAAGAAGTCCCGGCCCTACCGGCCCTAGTATGCAGCCTATGTGGTCGGTGCCTGACCTGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0139] NO.4，即Nb15(SEQ ID NO 4)：
[0140] ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGCGTCTCCTGCGCAGTCCGAGGACGCGATTTGGATTATTATGTCATCGGTTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAGGGTGTTTCATGCATTAATAATAGTGATGATACCACATACTATTCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTTACCATCTCGAGAGATCACGCCAAGAACACGGTATATCTCCAAATGAACAACCTGAAACCTGAGGACACCGCCCTTTATTACTGTGCAGCGGATTTCGATCGCCTCGATTTTACTGTTAAGGCTATGTGTGTTATGAAGTTCTTTTACTACTGGGGCCAGGGGACGCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAAGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0141] NO.5，即Nb17(SEQ ID NO 5)：
[0142] ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGTGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCGCCTGTGCAGCTTCTGGATTCAATTTGGATGATTATGCAGACATAGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGTGAACGAGTCCTTTGTATTACTATTAGTGATGGTACCACATACTATGAAGACTCCGGGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCACAGACATCGCCAAGAACACGGTGTTTCTTCAAATGGACAGCCTGAAAGCTGAGGACACAGCCGTTTATTATTGTGCAGGAGATCCCGCCCCTTTTTGTCTCTATAACACCTATGTACCGCGAACCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0143] NO.6，即Nb22(SEQ ID NO 6)：
[0144] CTCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCA TCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGT；
[0145] NO.7，即Nb23(SEQ ID NO 7)：
[0146] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0147] NO.8，即Nb25(SEQ ID NO 8)：
[0148] TGCTCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGAT CCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0149] NO.9，即Nb26(SEQ ID NO 9)：
[0150] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGT；
[0151] NO.10，即Nb27(SEQ ID NO 10)：
[0152] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGT；
[0153] NO.11，即Nb28(SEQ ID NO 11)：
[0154] ATGCAGGCCCAGCTGGCCGGTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAATTCACTTTGGATTATTATGAAATAGGCTGGTTCCGGCAGGCCCC GGGGAAGGACCGTGAGGGGCTCTCATGTATTGGTTATAGTGACAGAATCGCGTATTATTCAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCACCGTCAGAGACGACGCCACGAGCACGGTCTCTCTTTATATGGATATGATGATTCCAGAGGACACAGGCACTTATTATTGTGCGGGGTCGGTTGTGGAGCCTTACGAGTTACTGCCAGCGGCTGAATATGACTACTGGGGACAGGGGACCCGGGTCACTGTCTCCTCAGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0155] NO.12，即Nb29(SEQ ID NO 12)：
[0156] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0157] NO.13，即Nb38(SEQ ID NO 13)：
[0158] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGATACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGG ACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0159] NO.14，即Nb39(SEQ ID NO 14)：
[0160] TCTTCTACAAGGTGTCCAGGCTCAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATCAGACTACAGATGGATGTACATCGCCCGGTTTCGCCAATGTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAGCAATTTATACTGATGATACTGATGATAGTAGTCCGATCTATGCCACCTCCGCCAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGGACAAGAACGCGGTATATCTGCAAATGAACAGCCCGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCAAGAGCGTTCGGTGGTACCTGGAGCTTGAGCTCCCCGGACGACTTTAGTGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGAACGAATGAAGTATGCAAGTGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0161] NO.15，即Nb43(SEQ ID NO 15)：
[0162] ATGCAGGCCCAGCTGGCCGTTCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCGGGGGGAGGCTTGGTGCAATCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAATGACTATCGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAACAGTGGTGGTAGTAGTACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTACTACTGTGTGGCCCTACTTGGGCGCGGTTGTTCAGGCTTGGTTCAGGGGGCCTTTGGACCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGCGCACCACAGCGAAGACCCCGGCCCCCGAGGCCTTGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCA；
[0163] 2)氨基酸序列表：
[0164] NO.16，即Nb4(SEQ ID NO 16)：
[0165] 1 LQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASEFTLDYYE IGWFRQAPGK DREGLSCIGY[0166] 61 SDRIAYYSES VKGRFTTVRD DATSTVSLYM DMMIPEDTGT YYCAGSVVEP YELLPAAEYD[0167] 121 YWGQGTRVTV SSAHHSEDPG PRGLAAAGAP VPYPDPLEPR AA；
[0168] NO.17，即Nb6(SEQ ID NO 17)：
[0169] 1 WQAQLAVQLQ LVESGGDLAQ PGGSLTLSCT ASGTFKIYSM GWYRRPQREL VAEMLNGGDT[0170] 61 QYSDSVKGRF TISRTNNTMY LHMNNLKPED TAVYYCNLQD WYSEPAGDYW GPGTQVTVSS[0171] 121 AHHSEDPGPR GLAAAGAPVP YPDPLEPRAA；
[0172] NO.18，即Nb11(SEQ ID NO 18)：
[0173] 1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCT ASKFHLDSYA VAWFRQTPGK EREAVSFINT[0174] 61 SDDVTYFADS VKGRFTISRD NSKNTVYLQM NVLKPEDTSI YVCAAVRSPG PTGPSMQPMW[0175] 121 VPDLYDYWGQ GTQVTVSSAH HSEDPGPRGL AAAGAPVPYP DPLEPRAA
[0176] NO.19，即Nb15(SEQ ID NO 19)：
[0177] 1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLSVSCA VRGRDLDYYV IGWFRQAPGK EREGVSCINN[0178] 61 SDDTTYYSDS VKGRFTISRD HAKNTVYLQM NNLKPEDTAL YYCAADFDRL DFTVKAMCVM[0179] 121 KFFYYWGQGT QVTVSSEP KTPKPQGPRG LAAAGAPVPY PDLEPRAA；
[0180] NO.20，即Nb17(SEQ ID NO 20)：
[0181] 1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLACA ASGFNLDDYA DIGWFRQAPG KERERVLCIT[0182] 61 ISDGTTYYED SGKGRFSIST DIAKNTVFLQ MDSLKAEDTA VYYCAGDPAP FCLYNTYVPR[0183] 121 TWGQGTQVTV SSAHHSEDPG PRGLAAAGAP VPYPDPLEPRAA；
[0184] NO.21，即Nb22(SEQ ID NO 21)：
[0185] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIY[0186] 60 TDDTDDSSPI YATSAKGRFT ISQDKDKNAV YLQMNSPKPE DTAMYYCAAR AFGGTWSLSS[0187] 120 PDDFSAWGQG TQVTVSSGTN EVCKWPPRPC GRRCAGAVSG SAGTACRIDC[0188] NO.22，即Nb23(SEQ ID NO 22)：
[0189] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0190] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0191] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0192] NO.23，即Nb25(SEQ ID NO 23)：
[0193] 1 ALLQGVQAQV KLVESGGGSV QAGGSLRLSC TASGSDYRWM YIARFRQCPG KEREGVAAIY[0194] 61 TDDTDDSSPI YATSAKGRFT ISQDKDKNAV YLQMNSPKPE DTAMYYCAAR AFGGTWSLSS[0195] 121 PDDFSAWGQG TQVTVSSGTN EVCKWPPRPC GRRCAGAVSG SAGTACRIDC[0196] NO.24，即Nb26(SEQ ID NO 24)：
[0197] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0198] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0199] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0200] NO.25，即Nb27(SEQ ID NO 25)：
[0201] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0202] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0203] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0204] NO.26，即Nb28(SEQ ID NO 26)：
[0205] 1 MQAQLAGQLQ LVESGGGLVQ PGGSLRLSCA ASEFTLDYYE IGWFRQAPGK DREGLSCIGY[0206] 61 SDRIAYYSES VKGRFTTVRD DATSTVSLYM DMMIPEDTGT YYCAGSVVEP YELLPAAEYD[0207] 121 YWGQGTRVTV SSAHHSEDPG PRGLAAAGAP VPYPDPLEPR AA；
[0208] NO.27，即Nb29(SEQ ID NO 27)：
[0209] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0210] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0211] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0212] NO.28，即Nb38(SEQ ID NO 28)：
[0213] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLILSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0214] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0215] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0216] NO.29，即Nb39(SEQ ID NO 29)：
[0217] 1 LLQGVQAQVK LVESGGGSVQ AGGSLRLSCT ASGSDYRWMY IARFRQCPGK EREGVAAIYT[0218] 61 DDTDDSSPIY ATSAKGRFTI SQDKDKNAVY LQMNSPKPED TAMYYCAARA FGGTWSLSSP[0219] 121 DDFSAWGQGT QVTVSSGTNE VCKWPPRPCG RRCAGAVSGS AGTACRIDC[0220] NO.30，即Nb43(SEQ ID NO 30)：
[0221] 1 MQAQLAVQLQ LVESGGGLVQ SGGSLRLSCA ASGFTFNDYR MSWVRQAPGK GLEWVSDINS[0222] 61 GGSSTYYADS VKGRFTVSRD NAKNTLYLQM NSLKPEDTAI YYCVALLGRG CSGLVQGAFG[0223] 121 PWGQGTQVTV SSAHHSEDPG PRGLAAAGAP VPYPDPLEPR AA。
[0224] 实施例4.人肺组织SPA-Nb的肺靶向性检测：
[0225] 为了进一步验证人肺组织SPA-Nb与天然人肺泡表面活性蛋白A结合性及是否可实现特异性肺靶向效应，选用Western blot及Elisa初步检测hSPA-Nb的抗原特异性，用免疫组化、细胞免疫荧光及活体内显影方法验证其体内外肺靶向效应。
[0226] 4.1 Western blot及Elisa分析：
[0227] 分别选用纯化的人肺组织SPA-Nb4、无关纳米抗体(H1N1纳米抗体)及商品化的抗人SP-A单抗与抗原hSPA结合能力进行Western blot及Elisa验证(方法同1.2)。结果表明所表达的Nb4与抗原hSPA存在明显结合特异性(图6)。
[0228] 4.2细胞免疫荧光：
[0229] 细胞A549(肺)、L-02(肝)，293T(肾)在皿中生长融合至95％-100％，PBS洗3次，固定液固定30min，PBS洗3次，0.2％Triton X-100透化5min，20％山羊血清封闭1h，滴加稀释的一抗(人肺组织Nb4-Fitc)为实验组，抗人 SPA单克隆抗体为阳性对照组，另-针对H1N1-Fitc的纳米抗体为阴性对照组)，二抗为抗鼠-IgG-APC。结果表明：Nb4，SPA单克隆抗体(SPA-monopoly-ant)与人肺组织存在明显的结合(绿色/红色部分)，其中人肺组织Nb4结合能力与SPA-monopoly-ant相似，但三者均未见与人肝、脾、肾组织存在明显结合，阴性对照也未见结合(图7)。
[0230] 4.3免疫组化：
[0231] 将人新鲜肺、肝、脾、肾等组织切片固定,滴加稀释的一抗(人肺组织Nb4为实验组，SPA单克隆抗体为阳性对照组，另-针对H1N1的纳米抗体为阴性对照组)，二抗为His-IgG-HRP或抗鼠-IgG-HRP。结果表明：人肺组织Nb4，SPA单克隆抗体(SPA-monopoly-ant)与人肺组织存在明显的结合(棕色部分)，其中Nb4结合能力与SPA-monopoly-ant相似，但三者均未见与人肝、脾、肾组织存在明显结合，阴性对照也未见结合(图8)。
[0232] 4.4 FITC标记的人肺组织纳米抗体裸鼠体内肺靶向性检测：
[0233] 同源序列分析表明，人和小鼠rSPA的氨基酸序列存在高度的同源性，由于选用裸鼠易于进行体内显像，故体内靶向性检测实验动物为裸鼠。选取5周龄裸鼠，经气泵持续吸入麻醉后，尾静脉注射200μl经FITC标记的纳米抗体蛋白剂量为1mg/Kg动物体重，分别于注射后5min，15min，30min，45min，1h，2h，3h显像观察其体内分布情况，同时，以尾静脉注射H1N1-Fitc纳米抗体入作为肺靶向的阴性对照(图9)。结果显示：在尾静脉注入后15min，FITC标记的纳米抗体即开始出现明显的肺部聚集，在注射后2h，仍可见肺部聚集影像，其肺靶向效果较无关纳米抗体H1N1所表现的肺靶向区域明显集聚。
[0234] 人工合成人肺组织Nb4、Nb17的功能多肽部分(缺少MQAQKAG部分)，重复上述实验，发现人工合成的多肽同样能与人肺组织特异性结合，在动物水平试验中能在肺部特异性聚集。
[0235] 实施例5.其它克隆株蛋白的表达及靶向性检测：
[0236] 对筛选获得的15个序列进行同源性对比分析，人肺组织Nb23、Nb25、Nb27、Nb29、Nb39序列相同，人肺组织Nb28、Nb4相似度较高，，其余序列均存在差异性。
[0237] 为了更进一步验证所获得的15个纳米抗体序列时候均存在与大鼠肺泡表 面活性蛋白A的结合活性剂肺靶向性，按照实例5、6所述的方法，分别表达和纯化了除与Nb4同一序列以外的其余8个克隆株蛋白，所有蛋白均可获得可溶性表达，表达量最少为人肺组织Nb1，表达量为3mg/L,其余蛋白表达浓度平均为8mg/L。
[0238] 在对6个表达蛋白进行的Western blot及Elisa检测中，均可见明显的结合活性，其中人肺组织Nb11、Nb15、Nb17、Nb6、Nb43等5个纳米抗体蛋白在Elisa检测中，OD450检测值达到阴性对照的2倍。组织免疫组化结果显示，这些克隆株具有较强结合性。所有的克隆均与阴性对照存在明显的差异性。
[0239] 小鼠体内靶向性检测显示，人肺组织Nb11、Nb15、Nb17、Nb6、Nb43等5个纳米抗体蛋白的靶向效果相似于Nb17，虽然聚集强度略有差异，但是都有明显的肺部聚集影像。
[0240] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
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