富集肺癌细胞复合纳米微球的制备
专利汇可以提供富集肺癌细胞复合纳米微球的制备专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种结合 肺 癌细胞的复合Fe3O4 磁性 纳米颗粒及其制备方法。其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能 力 的复合蛋白的Fe3O4磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44 抗体 和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。本发明还公开了一种富集和检测痰液中肺癌细胞的方法，包括：a)采集痰液，充分 液化 痰液；b)加入所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；c)将反应液离心富集其中的细胞。将所得细胞重新悬浮，采用液基薄层细胞学检测系统(TCT)将该悬浮液制片、 染色 、封片、镜检。该方法检测痰液中肺癌细胞的阳性率比常规方法提高30％以上，检测效率明显提高，检测成本有所下降。，下面是富集肺癌细胞复合纳米微球的制备专利的具体信息内容。
1.一种结合肺癌细胞的复合Fe3O4磁性纳米颗粒，其特征在于，其是在表面修饰着聚乙酰亚胺，并标记有对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白的Fe3O4磁性纳米颗粒，其中，所述的对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。
2.一种如权利要求1所述的结合肺癌细胞的复合Fe3O4磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备Fe3O4磁性纳米颗粒；
2)在步骤1)所得的Fe3O4磁性纳米颗粒表面修饰聚乙酰亚胺；
3)在步骤2)所得的聚乙酰亚胺修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒表面标记对肺癌细胞具有结合能力的复合蛋白，该复合蛋白是由蛋白SPA和选自抗CD44抗体和抗CK7抗体中的一种或两种组成的复合蛋白。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的Fe3O4磁性纳米颗粒的平均粒径范围是15～50nm。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)包括：将硝酸铁和硝酸亚铁以摩尔质量比为4∶1的比例于乙醇中形成分散均匀的乙醇溶液，其中铁离子浓度为0.5～
1.0mol/L；在制得的乙醇溶液中加入摩尔质量10倍于铁离子的环氧氯丙烷形成溶胶，静置后形成凝胶；制得的凝胶经陈化后用去离子水清洗并干燥；清洗并干燥后的凝胶进行
400℃下退火处理即制得Fe3O4沉淀；将制得的Fe3O4沉淀依次用去离子水和乙醇交替清洗，至pH值为中性，真空干燥，即得Fe3O4磁性纳米颗粒；
步骤2)包括：
将Fe3O4磁性纳米颗粒置于PBS缓冲溶液中，超声分散，缓慢加入聚乙酰亚胺(PEI)，慢速充分搅拌均匀后，移至恒温水浴上继续慢速搅拌24小时，水浴温度保持30℃；
用磁分离法将固体从溶液中分离，将固体依次用蒸馏水和甲醇交替清洗至pH值为中性，真空干燥，即得PEI修饰的Fe3O4纳米粒子；
步骤3)包括：
将聚乙酰亚胺修饰的Fe3O4纳米粒子悬浮于0.01M pH7.2TBS之中，得纳米粒子溶液，其
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中聚乙酰亚胺修饰的Fe3O4纳米粒子的浓度约为3×10 个/ml；
用0.01M pH7.2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B，混匀，4℃反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为1mg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗CD44抗体和/或抗CK7抗体；
将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均匀混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。
5.一种富集痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)采集痰液，充分液化痰液；
b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；
c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞。
6.一种检测痰液中肺癌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)采集痰液，充分液化痰液；
b)在步骤a)所得的液化痰液中加入如权利要求1所述的复合纳米磁性颗粒的溶液进行反应；
c)将步骤b)的反应液离心富集其中的细胞，将所得细胞重新悬浮，然后采用液基薄层细胞学检测系统将该悬浮液制片、染色、封片、镜检。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤a)所述的痰液中加入碱性裂解液以充分液化痰液，所述的碱性裂解液：1％蛋白酶K，10％NaOH的水溶液。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤b)所述的反应是室温静置15分钟。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤c)所述的离心是500rpm，5分钟；
离心所得的细胞悬浮在保存液中，保存液是：10％甲醇水溶液。
富集肺癌细胞复合纳米微球的制备
技术领域
背景技术
痰液制片手工操作而导致细胞丢失(标本不能全部取用)、涂片的质量太差(不均匀、过厚，过多的黏液、血液或炎细胞遮盖了不正常的细胞、细胞形态保存不佳)，细胞成分复杂(大量脱落上皮细胞、炎症细胞)，脱落肺癌细胞散在，分布不均。
发明内容
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3×10 个/ml；用0.01M pH7.2TBS分别溶解蛋白A和蛋白B，混匀，4℃反应30分钟，即得复合蛋白溶液，其中，蛋白A浓度为10mg/ml，蛋白B浓度为1mg/ml，蛋白A是蛋白SPA，蛋白B是抗CD44抗体和/或抗CK7抗体，优选兔抗人CD44和/或兔抗人CK7；将上述复合蛋白溶液与上述纳米粒子溶液均匀混合，室温60分钟，即得复合纳米磁性颗粒溶液。
附图说明
具体实施方式
米粒子溶液，其中PEI修饰的Fe3O4纳米粒子的浓度约为3×10 个/ml。
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