[0084] 4结论
[0085] 变应性鼻炎是由IgE介导的I型变态
反应性疾病,其发病与免疫功能紊乱有关,并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与。其中,参与变应性鼻炎病理机制的细胞主要有肥+ +大细胞、嗜酸性粒细胞、CD4、T淋巴细胞和B淋巴细胞,T淋巴细胞有两个主要亚群CD4和+ +
CD8,CD4亚群具有辅助和诱导作用,被活化后可释放多种淋巴因子,
加速免疫反应的过程,+
而CD8亚群具有抑制和细胞毒作用,在正常情况下,两者处于动态平衡之中。当CD4+亚群功能增强时出现超敏反应,当CD8+亚群功能增强时表现为免疫
缺陷。
[0086] 变应性鼻炎属中医“鼻鼽”范畴,祖国医学认为肺气虚弱,卫表不固,鼻失温摄是其发病的基本环节,因肺为娇脏,主一身之皮毛,肺气虚,卫表不固,风寒或异气等外邪乘虚而入,犯及鼻窍,正邪相争而致以鼻痒、喷嚏、流清涕;肺气充实有赖于脾气的输布,肾气的温养,脾肾阳虚,摄纳无权,气不归元,耗散于上,则喷嚏频发,清涕涟涟,症状更加严重。正所谓经曰:“五脏化液……肺为涕”、“肾者,水脏,主津液”、“诸病水液,澄澈清冷,皆属于寒”,《医学发明》谓:“皮毛之元阳本虚弱,更以冬月助其令,故病者善嚏、鼻流清涕”。所以过敏性鼻炎症状往往遇寒则发,得温则解。
[0087] 本研究表明,本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂治疗前T细胞亚群CD3/CD4功能降低,而CD8有所升高,治疗后CD3、CD4等T细胞功能有所升高,CD8有所降低,CD4/CD8有增高趋势。患者总有效率达95.7%,而对照组治疗前后各免疫指标无明显变化,表明抗组胺等常规治疗对T细胞状态无明显影响。可以判定,本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂是一种有效的免疫调节剂,在变应 性鼻炎治疗中发挥有效作用。组方中黄芪益气固表止汗为君;辅以白术补气健脾、止涕,桂枝发汗解表,温通经脉,通阳化气,合黄芪、白术以益气祛邪。佐以鹅不食草祛风通窍,防风走表而祛风寒,且黄芪得防风,固表而不致留邪;防风得黄芪,祛邪而不伤正,有补中寓疏,散中寓补之意。全方共呈益气固表、温阳通窍摄涕之功,达提高机体对外界的抵病能力。
[0088] 试验结果说明,本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂可以治疗变应性鼻炎(过敏性鼻炎),也可以促进T细胞亚群CD3细胞、CD4细胞升高,降低T细胞亚群CD8细胞,改善机体免疫功能。
[0089] 实验例3本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂治疗肾阳虚型变应性鼻炎的动物实验[0090] 1试验目的
[0091] 选用正常动物和疾病动物模型,对本发明药物组合物(芪术鼻喷雾剂)的益气固表、温阳通窍、摄涕止嚏功效进行评价,以便确定本发明药物组合物(芪术鼻喷雾剂)的药效作用,为临床研究提供依据。
[0092] 2试验材料
[0093] 2.1实验动物
[0094] 6-8周SD大鼠72只(普通级),雌雄各半,体重200-220g。由四川省医学科学院实验动物研究所提供,批号SCXK(川)2010-002,并配给全价小鼠大鼠配合
饲料,批号GB14924.3-2001。
[0095] 2.2实验药品
[0096] 富
马酸
酮替芬片:江苏鹏鹞药业有限公司,产品批号:1006011,规格:1.38mg(相当于酮替芬1mg)。
[0097] 氢化可的松注射液:天津金耀
氨基酸有限公司,产品批号:0909071,规格:20ml/100mg。
[0098] 他巴唑片
[0099] 芪术鼻喷雾剂(本发明实施例3的药物组合物)
[0101] 卵清
白蛋白:上海金璐贸易有限公司,产品批号091218-45000。
[0102] 氢
氧化
铝:成都科龙化工试剂厂,产品批号20100124。
[0103] 伊文思蓝:中国医药(集团)上海化学试剂公司,产品批号:C.I.N.O23860(进口分装)。
[0104] 甲
醛溶液:成都化学试剂厂,产品批号:070821。
[0105] 大鼠嗜酸性粒细胞阳离子蛋白
试剂盒:购于德国IBL实验室,10-08-20。
[0106] 大鼠白介素-5试剂盒:上海森熊科技实业有限公司,产品批号:1010056。
[0107] 3实验方法
[0108] 3.1动物分组
[0109] 将未作任何处理的60只SD大鼠根据体重、性别随机分成6组,空白对照组10只,肾阳虚+变应性鼻炎复合模型组10只,芪术鼻喷雾剂高剂量组10只,芪术鼻喷雾剂中剂量组10只,芪术鼻喷雾剂低剂量组10只,西药酮替芬治疗组10只。
[0110] 3.2造模方法
[0111] ①按文献“苗明三.实验动物和动物实验技术[M].北京:中国中医药出版”的方法制造肾阳虚模型:除空白对照组外,其余大鼠皮下注射氢化可的松注射液(2mg/100g)14天。
[0112] ②按文献“沈雁.“恐伤肾”的实验研究[J],中国医药学报,1991,6(1):13”制造肾阳虚模型:除空白对照组外,其余大鼠每天24h将猫直接敞放在鼠笼旁,并经常用死鼠喂猫,让大鼠闻其声,见其形,处于有被捕食危险的惊恐状态之中,同时在试验期间,用人工方法(用木棍敲击
铁盆子等物制造震慑氛围)恐吓大鼠,每天上午、下午各一小时,直到造模结束。给药期间,只用人工方法恐吓。
[0113] ③按文献“赵长青,陶正德,肖健
云,等.大鼠变应性鼻炎模型鼻粘膜三种肽能神经末梢免疫组化研究.中华耳鼻咽喉科杂志,1996,31:224-226”制造大鼠变应性鼻炎模型:除空白对照组外其余大鼠用卵清蛋白0.3mg作为致敏原,氢氧化铝30mg作为佐剂,加生理盐水0.5ml,溶解制备为1ml混悬液,
腹腔注射基础致敏,隔日1次,连续7次。次日做被动
皮肤过敏原试验(PCA)。成功后用2%的卵清蛋白的生理盐水溶液做鼻腔内激发,50μl/侧,每日1次,共7次。
[0114] 在造肾阳虚模型过程中共死亡2只,考虑其中一只是因皮下注射颈部大鼠
疼痛而挣扎时,操作者用力过大导致大鼠窒息死亡,另一只则是造肾阳虚模型结束后大鼠肾阳虚症状过重不能耐受而死亡。
[0115] 3.3给药方法
[0116] 模型组致敏结束造模成功后,开始灌胃10天。
[0117] 芪术鼻喷雾剂高剂量组:2.5ml灌胃(成人10倍剂量),每日一次,按成人每次剂量÷60×10计算出动物每公斤每次给药量。即82g(生药)÷60×10=13.67g/kg。
[0118] 芪术鼻喷雾剂中剂量组::2.5ml灌胃(成人5倍剂量),每日一次,按成人每次剂量÷60×5计算出动物每公斤每次给药量,即82g(生药)÷60×5=6.83g/kg。
[0119] 芪术鼻喷雾剂低剂量组:2.5ml灌胃(成人2.5倍剂量),每日一次,按成人每次剂量÷60×2.5计算出动物每公斤每次给药量,即82g(生药)÷60×2.5=3.41g/kg。
[0120] 西药组:酮替芬溶液::2.5ml灌胃(成人5倍剂量),每日一次,按成人每次剂量÷60×5计算出动物每公斤给药量,即0.001g÷60×5=0.000084g/kg。
[0121] 空白对照组、模型组:用与用药组同等量的0.9%生理盐水(2.5ml)灌胃,造模时间同用药组。
[0122] 以上各组灌胃20分钟后以2%的卵清蛋白的生理盐水溶液25μl/侧进行鼻局部半量激发。
[0123] 4试验内容
[0124] 4.1大鼠一般状态的变化
[0125] 4.1.1肾阳虚症状体征
[0126] 实验前,各组动物活动、饮食、大小便正常,无明显打喷嚏、流清涕、抓挠鼻部等变应性鼻炎症状。在饮用含有0.4%他巴唑水及皮下注射氢化可的松注射液的第10天,大鼠开始出现饮食减少、体毛松散不荣、体重增长缓慢、小便量多等症状,停止皮下注射一周后,上述症状逐渐加重,并出现了反应迟钝、精神萎靡、畏寒肢冷、毛发易脱落、蜷缩懒动、喜扎堆、四肢无力等症状,证明肾阳虚造模成功。模型组大鼠体温下降不明显。
[0127] 在造肾阳虚模型过程中共死亡2只,考虑其中一只是因皮下注射颈部大鼠疼痛而挣扎时,操作者用力过大导致大鼠窒息死亡,另一只则是造肾阳虚模型结束后大鼠肾阳虚症状过重不能耐受而死亡。
[0128] 体重变化:各组实验动物在实验开始前和造模结束后及试验结束后各测一次体重,体重测量时间为早晨9:00至10:00,观察试验前后试验各组的体重的差别,测量时用
电子天平,结果如图1:
[0129] 从图1可以看出,空白组体重增长较快,模型组、用药各组体重增长缓慢。实验前各组大鼠的体重无显著性差异(P>0.05)。肾阳虚造模后和实验结束前各组大鼠体重与实验前比较,均有增长,但肾阳虚变应性鼻炎模型组、西药组、高、中、低剂量组与空白组比较,体重均有显著性差异(P<0.05),说明以上组大鼠生长缓慢。高、中剂量组体重增长有快于肾阳虚变应性鼻炎模型组的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。
[0130] 4.1.2 PCA试验
[0131] 腹腔注射基础致敏结束后,模型组随机选取10只大鼠进行PCA试验,结果见下表。
[0132] 表3 2组大鼠PCA试验结果比较
[0133]
[0134] 从上表可以看出,空白组PCA试验全部为阴性,模型组选出的10只大鼠PCA试验有9只为阳性,可以证明基础致敏已经成功。
[0135] 4.1.3 AR症状体征
[0136] 在造变应性鼻炎的模型时,其中有3只大鼠行为学计分<5分,故淘汰,剩余的都给药治疗,纳入治疗组。在给药过程中,其中有2只大鼠死亡,它们分别为中药高剂量组与西药组各死亡一只。
[0137] 每次鼻部局部用OVA激发后,对大鼠观察30min,给药2周得分结果如下表示:
[0138] 表4各组大鼠灌药一周后的症状积分比较
[0139]
[0140] 注:与空白组比较:*P<0.01;与模型组比较:■P<0.01;与西药组比较:▲P>△0.05, P<0.01。
[0141] 经统计学分析,纵向结果示:肾阳虚AR模型组症状积分均>5分,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01),说明模型组造模成功。
[0142] 用药各组与模型组比较有显著性差异(P<0.01),说明用药各组都对肾阳虚型AR有一定作用。
[0143] 中药高剂量组与中药中剂量组、低剂量组比较有显著性差异(P<0.01),症状积分依次递增,说明芪术鼻喷雾剂随着浓度的增加,对肾阳虚型AR的疗效也在增加。中药高剂量组与西药酮替芬组无显著性差异(P>0.05),症状积分不相上下,说明芪术鼻喷雾剂高剂量与西药酮替芬组对肾阳虚型AR的疗效差不多。
[0144] 中药中剂量组、中药低剂量组与西药酮替芬组比较有显著性差异(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂浓度较低时,治疗效果不如西药酮替芬组。
[0145] 横向结果示:随着灌胃天数的增加,空白对照组、模型组的症状没有发生明显的变化;
[0146] 各用药组的积分随着灌胃天数的增加,都有不同程度的下降,尤其是中药高剂量组和西药组,说明芪术鼻喷雾剂高剂量组与西药酮替芬组疗效差不多,都能明显缓解肾阳虚型AR症状
[0147] 4.2给药结束后,各组大鼠鼻中隔粘膜组织HE染色情况
[0148] 通过对各组动物鼻中隔粘膜HE染色的形态学观察,并得出如下结论:
[0149] 空白组:鼻粘膜上皮及间质结构正常,无特殊病变。
[0150] 模型组:鼻中隔假复层柱状上皮局限性或弥漫性增生、肿胀。个别细胞
变形改变,杯状细胞增多,粘膜下腺体增生,间质充血、水肿,可见淋巴细胞、浆细胞及嗜酸性粒细胞成局灶性或弥漫性浸润,鼻中隔软骨无特殊病变。其余各组织无特殊病变。
[0151] 芪术鼻喷雾剂中药组(低、中、高剂量组):粘膜上皮完整,粘膜下层粘、
浆液腺无增多,仅见小灶性炎症,充血水肿减轻。其中高剂量组的
组织学改变最轻,中、小剂量组次之。
[0152] 西药酮替芬组:病变与中药高剂量组相似,但病变程度还要减轻。
[0153] 从以上结论可以看出,模型组造模成功,给药7天后,中药芪术鼻喷雾剂高剂量组与西药酮替芬组在治疗肾阳虚型AR上疗效最好,并且无明显差异。芪术鼻喷雾剂中剂量组与低剂量组对肾阳虚型AR都有疗效,中剂量效果较低剂量好些,但无明显差别。
[0154] 4.3光镜下大鼠鼻中隔常规组织学观察
[0155] 4.3.1空白组
[0156] 鼻中隔粘膜假复层柱状纤毛上皮形态及结构完整,未见变性
坏死、增生及萎缩,粘膜下层除少数有充血外,未见炎症及其他病变。粘液及浆液腺分布正常,中隔软骨正常。
[0157] 4.3.2肾阳虚+变应性鼻炎复合模型组
[0158] 假复层柱状纤毛上皮明显增厚,杯状细胞增多,粘膜下腺体增生,间质有较多嗜酸性细胞及少量淋巴细胞浸润,血管扩张充血。
[0159] 4.3.3西药组
[0160] 病变与模型组相似,但病变程度有所减轻。
[0161] 4.3.4中药组(低、中、高剂量组)
[0162] 粘膜上皮完整,粘膜下层粘、浆液腺无增多,仅见小灶性炎症,充血水肿减轻。其中高剂量组的组织学改变最轻,中、小剂量组次之。
[0163] 4.4给药结束后,各组大鼠血清IL-5、ECP的表达情况
[0164] 表5各组大鼠血清IL-5水平比较
[0165]* ■ △
[0166] 注:与空白组比较:P<0.01;与模型组比较:P<0.01;与西药组比较:P>▲0.05,P<0.01。
[0167] 经统计学分析,结果示:模型组与空白对照组比较有显著性差异(P<0.01),说明模型组造模成功。
[0168] 用药各组与模型组比较有显著性差异(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂高剂量组、中剂量组、低剂量组与西药酮替芬组都能不同程度的降低肾阳虚型AR大鼠的血清中IL-5的含量。
[0169] 中药高剂量组与中药中剂量组、低剂量组比较有显著性差异(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂的疗效有浓度上的差别,芪术鼻喷雾剂高剂量组能显著降低肾阳虚型AR大鼠的血清中IL-5的含量,其次为中剂量与低剂量。中药高剂量组与西药酮替芬组无显著性差异(P>0.05),说明芪术鼻喷雾剂高剂量组与西药酮替芬组疗效相当,都能显著降低肾阳虚型AR大鼠的血清中IL-5的含量。
[0170] 表6各组大鼠血清ECP水平比较
[0171]
[0172] 注:与空白组比较:*P<0.01;与模型组比较:■P<0.01与西药组比较:△P>0.05, ▲P<0.01。
[0173] 经统计学分析,ECP的结果示:模型组与空白对照组与有显著性差异(P<0.01),模型组造模成功。
[0174] 用药各组与模型组比较有显著性差异(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂高剂量组、中剂量组、低剂量组与西药酮替芬组都能不同程度的降低肾阳虚型AR大鼠的血清中ECP的含量。
[0175] 中药高剂量组与中药中剂量组、低剂量组比较有显著性差异(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂的疗效有浓度上的差别,芪术鼻喷雾剂高剂量组能显著降低肾阳虚型AR大鼠的血清中ECP的含量,其次为中剂量组与低剂量组。中药高剂量组与西药酮替芬组无显著性差异(P>0.05),说明芪术鼻喷雾剂高剂量组与西药酮替芬组疗效相当。
[0176] 4.5芪术鼻喷雾剂对肾阳虚型AR大鼠血清IL-12水平的影响(见表7)
[0177] 表7各组大鼠血清IL-12水平的比较
[0178]
[0179] 注:与空白组相比:△P<0.01与模型组相比:*P<0.05**P<0.01
[0180] 表7示:模型组大鼠血清中IL-12水平明显低于空白组(P<0.01);用药治疗后各组均使降低了的IL-12水平明显升高,与模型组相比有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
[0181] 4.6芪术鼻喷雾剂对肾阳虚型AR大鼠血清GM-CSF水平的影响(见表8)
[0182] 表8各组大鼠血清GM-CSF水平的比较
[0183]
[0184] 注:与空白组相比:△P<0.01
[0185] 与模型组相比:*P<0.05**P<0.01
[0186] 表8示:模型组大鼠血清中GM-CSF水平明显高于空白组(P<0.01);用药治疗后各组均使升高了的GM-CSF水平明显下降,与空白组相比无统计学意义,与模型组相比有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。
[0187] 5试验结论
[0188] 上述主要药效学试验的结果证明:本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂治疗肾阳虚型变应性鼻炎确有疗效,具有很好的抗炎、抗过敏以及改善肾阳虚症 状,增强机体免疫力的作用,高剂量组的效果与阳性药物酮替芬相当。它不仅能缓解动物喷嚏、流涕等AR症状;还能缓解动物体重增长缓慢、饮食减少、精神萎靡、畏寒肢冷、小便量多、蜷缩懒动、喜扎堆等类似肾阳虚症状;还能改善鼻中隔粘膜EOS增多的病理状态;而且还可以降低模型动物血清ECP、IL-5、GM-CSF的含量,升高IL-12水平,从而得出芪术鼻喷雾剂可以降低EOS在鼻粘膜浸润及EOS在循环血液中分化、成熟、增殖、活化的情况,调节细胞因子IL-12、GM-CSF的水平,这也可能是其对肾阳虚型AR大鼠发挥治疗作用的机理。
[0189] 试验结果说明,本发明药物组合物对肾阳虚型变应性鼻炎确有疗效,具有很好的抗炎、抗过敏以及改善肾阳虚症状,增强机体免疫力的作用,其疗效与西药酮替芬相当,可以替代酮替芬使用,为临床治疗鼻炎提供了一种新的药物。
[0190] 实验例4本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂治疗肺气虚型变应性鼻炎的动物实验[0191] 1、试验方法
[0192] 将60只SD大鼠,随机分为6组,每组10只,即:空白对照组;模型组;芪术鼻喷雾剂高剂量组;芪术鼻喷雾剂中剂量组;芪术鼻喷雾剂低剂量组;阳性对照组(曲安奈德鼻喷雾剂)。复制肺气虚变应性鼻炎大鼠模型,评价模型成功后,治疗组分别予以芪术鼻喷雾剂高、中、低剂量治疗,阳性对照组予以曲安奈德鼻喷剂治疗,空白组和模型组予以生理盐水,干预2周,观察动物的形态学及鼻部症状,处死大鼠,观察血清IL-4、IL-5、IFN-γ的表达及鼻粘膜病理改变情况。
[0193] 造模方法:采用改良的杨氏烟熏法复制肺气虚证动物模型,将造模各组大鼠置于特制的l m×l m×l m的烟室中,用刨花、锯末、烟叶各50g点燃熏烟,每日1次,每次30分钟,持续20天,每天时间固定,适度
通风,空白对照组则置于正常无烟环境中饲养(实验室
温度22-25℃、湿度70);再将除空白对照组外的五组大鼠致敏,第一阶段:基础致敏,卵清蛋白(OVA)20mg+氢氧化铝Al(OH)3粉剂30mg+生理盐水1ml,混匀,形成混悬液,行腹腔注射,隔日一次,共7次;第二阶段:激发:5%OVA20ul双侧鼻腔滴入,每日一次,共7次。
[0194] 给药方法:肺气虚变应性鼻炎模型复制成功后,从第2天开始,本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂(实施例3制备的药物组合物)的高、中、低剂量治疗组分别予以-1 -1 -1 -1 -1 -14g·kg ·d 、3g·kg ·d 、2g·kg ·d (原液30μL,一侧鼻孔15μL) 滴鼻,阳性对照-1
组用曲安奈德鼻喷雾剂滴鼻30μL·d (根据阳性对照药的选取原则:应用剂型,外型,功能主治相一致药物,但目前此类中药制剂较少,故选取临床运用广泛的曲安奈德鼻喷雾剂-1
作为阳性对照药),模型组和空白对照组均以30μL·d 生理盐水滴鼻,连续2周。注:除空白组外,其他各组均在滴鼻治疗半小时后,以2%OVA生理盐水滴鼻维持致敏直至实验结束。
[0195] 标本的采集
[0196] 分别于给药的第7天和第14天,作鼻腔分泌物涂片,在光镜下观察嗜酸性粒细胞的浸润程度(采用HE染色)。在第14天取分泌物涂片后,以10%的水合氯醛麻醉大鼠,取股动脉血约6毫升,立即注入抗凝管中,静置2小时,在离心机中以3000r/min离心15min,取上清液分装,在-20℃
冰箱保存备用。再将大鼠
上颌骨从颅骨中分离出来,沿着鼻中隔剪开鼻腔,暴露鼻中隔和双侧鼻腔,分离鼻中隔,剥离双侧鼻中隔粘膜组织并置于10%多聚甲醛溶液中固定,做病理切片,观察鼻粘膜的病理结构(采用HE染色),一部分做免疫组化染色(S-P法)。
[0197] 观察指标及检测方法
[0198] 大鼠行为学观察:从造模第一天开始,每天观察1次。观察动物行为,精神状态、活动情况、咳嗽、喷嚏及饮食、饮水、体重、毛发等情况。
[0199] 大鼠鼻腔分泌物的嗜酸性(EOS)计数:模型建立成功后,分别于滴鼻治疗第7天及第14天后,用自制的小
棉棒,进入鼻腔擦鼻腔三次,制作涂片,进行HE染色,在光镜下观察,以分类计数法计数嗜酸性粒细胞,在光镜下观察嗜酸性粒细胞的浸润程度。
[0200] 血清干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)的检测:
[0201] 应用双抗体夹心法测定血清标本中大鼠干扰素-γ,白介素-4,白介素-5(IFN-γ,IL-4,IL-5)的水平。用纯化的大鼠IFN-γ,IL-4,IL-5抗体包被微孔板,制成固相抗体后,再往包被单抗的微孔中依次滴加IFN-γ,IL-4,IL-5与HRP标记的相应的抗体结合,形成抗体-
抗原-酶标抗体复合物,经彻底洗涤后加底物TMB显色,TMB在HRP酶的催化下转成蓝色,并在酸的作用下转
化成最终的黄色。
颜色的深浅与样品中的IFN-γ,IL-4,IL-5呈正相关。最后再用酶标仪在450nm
波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠IFN-γ,IL-4,IL-5浓度。具体实验步骤与方法如下:
[0202] ①标准品的稀释与加样 在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加50μl标准品,然后在二孔中加50μl标准品稀释液,混匀;再从第一孔、第二孔中各取50μl分别加到第三孔和第四孔,再从第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;遵照此法依次操作,直至在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取
50μl弃掉。
[0203] ②加样 空白孔:空白对照孔不加样,
生物素标记的抗IFN-γ,IL-4,IL-5抗体,链霉亲和素-HRP,只滴加
显色剂A,B和终止液,余步骤相同;标准品孔:加标准品50μl,
链霉素-HRP50μl;待测样品孔:加样本品40μl,再各加入抗IFN-γ,IL-4,IL-5抗体10μl、链霉亲和素-HRP50μl,盖上封板膜,轻振荡混匀,于37℃温育60min。
[0204] ③配液 将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
[0205] ④洗涤 小心揭掉封板膜,除去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,重复5次,拍干。
[0206] ⑤显色 每孔先加显色剂A 50μl,再加显色剂B 50μl,轻震荡混匀,于37℃避光显色10min。
[0207] ⑥终止 每孔加终止液50μl,终止反应。
[0208] ⑦测定 以空白
空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。
[0209] 检测结果表示:纵坐标是标准物的浓度,横坐标为OD值,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值在标准曲线查出对应的浓度,再乘稀释的倍数,或者用标准物的浓度和OD值算出标准曲线的直线回归方程式,再将样品的OD值代入方程式,算出样品浓度,再乘稀释倍数,即为样品的实际浓度。
[0210] 鼻腔黏膜病理组织学及超微结构变化:大鼠
采血完毕后,断头处死大鼠,迅速剥离上颌骨皮肤,将上颌骨从颅骨中分离出来,打开鼻背后,再沿鼻中线切开,暴露鼻中隔和双侧鼻腔,分离中隔与鼻黏膜组织,取双侧鼻黏膜在10%甲醛溶液中固定,经脱水、包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色、脱水、透明、封固等操作之后,在光镜下观察大鼠鼻黏膜的病理组织结构。
[0211] 鼻粘膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达:取双侧鼻中隔粘膜组织,用甲醛固定。具体实验步骤与方法如下:
[0212] ①
载玻片防脱片 先使用APES浸泡后,再置60℃
烤箱1h使切片粘附
[0213] ②切片 常规脱蜡至水;
[0214] ③洗涤 过氧化氢与蒸馏水1:10:混合,10min后再用蒸馏水洗3次;
[0215] ④热修复抗 将切片浸入0.01M
柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0),
微波炉中高火加热至
沸腾后断电,间隔5分钟后,反复1次,冷却后,PBS(pH 7.2-7.4)洗2次;⑤滴加山羊血清封闭液,20min;
[0216] ⑥滴加稀释的一抗(1:200),4℃过夜,PBS(pH 7.2-7.4)洗3次;
[0217] ⑦滴加生物素化山羊抗鼠/兔IgG二抗,37℃30min,PBS(pH7.2-7.4)洗3次;
[0218] ⑧滴加辣根过
氧化酶标记链霉素卵蛋白试剂 30min,PBS(pH7.2-7.4)洗4次;
[0219] ⑨DAB显色 使用DAB显色试剂盒,取1ml蒸馏水,加试剂盒A、B、C试剂各1滴,混匀后滴加至切片上,显色,镜下控制反映时间,2min再用蒸馏水洗涤;
[0220] ⑩苏木素轻度复染 脱水 透明 中性树胶封片。
[0221] 阳性表达:颜色为浅黄色或棕黄色,阴性表达为蓝色,底色为白色,主要表达在细胞浆、细胞膜,或间质等。
[0222] 检测结果表示:以标准物的浓度为纵坐标,OD值为横坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数。
[0223] 指标的剔除:在实验过程中,共有四只大鼠死亡。在肺气虚模型复制的第10天,Ⅱ组死亡1只大鼠,有咳喘和气短现象,推断死于呼吸衰竭。AR致敏的第9天,Ⅴ组1只动物死亡,解剖大鼠可见腹腔大量积液,未见血
凝块,肺部未见充血水肿,推测死亡原因是腹腔反复注射致腹膜感染。Ⅵ组于致敏的第13天,又有1只大鼠死亡,可见鼻腔有血凝块,尾部断裂发黑,疑为鼻出血或败血症感染致死。在治疗的第6天Ⅴ组死亡1只大鼠,原因不明,疑为个体差异导致的自然死亡。4只死亡动物不纳入统计。
[0224] 统计学方法:所有数据均采用SPSSl7.0统计软件进行分析。方差齐,采用单因素方差分析进行检验指标的差异性;方差不齐,则采用非参数Kruskal Wallis检验指标的差异性。
[0225] 2试验结果
[0226] 2.1大鼠行为学观察:包括肺气虚的行为学观察;变应性鼻炎症状学观察。
[0227] 2.1.1肺气虚的行为学观察
[0228] 在烟熏后20min内观察大鼠的精神行为,咳喘、毛发、行动等改变,参照《中医虚证诊断标准》及《实用中医证候模型学》的相关内容,筛选记录可观察大鼠的症状表现,有4项:1、咳喘;2、精神倦怠乏力(反应迟缓,活动减少);3、气短喘促;4、毛发枯槁无光泽。
[0229] 全身症状出现在烟熏7~10天后,Ⅱ-Ⅵ组大鼠普遍出现咳嗽、痰鸣气喘、口鼻分泌物增多、倦怠乏力,行动迟缓、精神萎靡、毛发悚立凌乱、枯槁无光泽等表现,至第16天,Ⅱ组死亡1只大鼠,有咳喘和气短现象,第16天,Ⅱ-Ⅵ组动物普遍出现典型的肺气虚证表现,证明肺气虚造模成功。各治疗组均在不同程度上改善鼻腔局部症状,精神症状,毛发的光泽度等肺气虚的症状。
[0230] 2.1.2变应性鼻炎症状学观察
[0231] 鼻部症状出现在第1次鼻腔滴药开始,致敏大鼠均在10min内出现不同 程度的鼻痒和喷嚏等症,但无明显清涕,上述症状随给药次数的增多而逐步加重,至第5天时症状明显,并出现流涕的症状,至第8天,出现了典型变应性鼻炎的症状,且症状
叠加记分>5分,造模成功,但各组部分大鼠流涕症状不明显,空白对照组鼻部症状不明显。以造模最后一次的鼻腔激发症状记分作为治疗前的结果,以治疗最后一次的鼻腔激发症状记分作为治疗后的结果。
[0232] 变应性鼻炎动物模型复制成功的标准:包括主观标准;客观标准。
[0233] ①主观标准:根据大鼠行为学评分标准,即末次激发后30min内观察大鼠的下述症状,采用量化叠加评分法计分,若计分>5分,则表示变应性鼻炎造模成功。分级标准及治疗前后的症状评分(见表9-10)。
[0234] 表9症状分级标准
[0235]计分 喷嚏 鼻痒 流涕
1分 喷嚏1~3个 单前肢偶有挠鼻 清涕流至前鼻孔
2分 喷嚏4~10个 双前肢挠鼻 清涕超过前鼻孔
3分 喷嚏≥l1个 到处不停擦鼻 清涕流至面部
[0236] 表10治疗前后大鼠症状学评分(x±s)
[0237]组别 数量 治疗前症状评分 治疗后2周症状评分
空白组 10 1.7±1.25 1.7±1.25
模型组 9 5.1±0.78 △
阳性对照组 10 5.2±0.63 △
芪术鼻高剂量组 10 5.0±0.67 △
芪术鼻中剂量组 8 5.1±0.64 △
芪术鼻低剂量组 9 5.1±0.64 △
[0238] 注:治疗前与空白对照组比较:△P<0.01;治疗后:与空白对照组比较:▲P<0.05,与模型组比较:*P<0.01。
[0239] ②客观标准:嗜酸性粒细胞(EOS)计数,若模型组EOS含量多于空白组则造模成功(见表11)。
[0240] 表11嗜酸性粒细胞计数(x±s)
[0241]组别 EOS计数
空白组 1.00±0.67
模型组 15.22±2.22▲
▲
[0242] 注:与空白对照组比较,P<0.01。
[0243] 结果:综合主观症状、客观评价标准,模型组与空白组相比,有显著差异(P<0.01)进一步验证造模成功。对实验大鼠行为学的影响:六组间比较,治疗前:与模型组比较,各治疗组间中差异无统计意义(P>0.05),说明各组间均有相似的鼻部症状。治疗后:各治疗组间鼻部症状记分均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05),说明芪术鼻喷雾剂各治疗组与曲安奈德鼻喷雾剂组均能改善鼻部症状。与模型组相比,Ⅲ组与Ⅳ组症状记分差异有统计学意义(P<0.01),说明芪术鼻喷雾剂高剂量组与曲安奈德鼻喷雾剂组能显著改善鼻部症状。
[0244] 2.2嗜酸性粒细胞的浸润情况
[0245] 分别于治疗的第7d和14d采用HE染色作大鼠鼻腔分泌物的嗜酸性粒细胞涂片,以观察各治疗组之间疗效的差异性(见表12)。
[0246] 表12嗜酸性粒细胞计数(x±s)
[0247]组别 数量 EOS计数(7d) EOS计数(14d)
空白组 10 1.00±0.67 0.90±0.57
模型组 9 15.22±2.22▲ 12.78±2.05▲
阳性对照组 10 11.00±1.63▲△ 9.30±1.57▲△
芪术鼻高剂量组 10 9.60±1.07▲△★ 8.30±1.06▲△
芪术鼻中剂量组 8 12.38±1.06▲△★☆ 11.00±0.76▲△☆
芪术鼻低剂量组 9 12.78±1.39▲△★☆ 11.67±1.22▲★☆
[0248] 注:方差不齐,故采用非参数Kruskal Wallis检验。与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型对照组比较,△P<0.05;与药物阳性组比较,★P<0.05;与高剂量组比较,☆P<0.05。
[0249] 结果分析:HE病理切片显示:模型组部分黏膜上皮脱落,腺体增生,固有层血管扩张,组织水肿,可见嗜酸性粒细胞的浸润。从嗜酸性粒细胞计数结果看:模型组嗜酸性粒细胞计数高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);经治疗后,各治疗组鼻粘膜组织中嗜酸性粒细胞计数减少,治疗组低于模型组,差异有统计学意义,(P<0.05);治疗1周后,芪术鼻喷雾剂高剂量组比曲安奈德鼻喷雾剂组嗜酸性粒细胞计数减少,差异有统计学意义(P<0.05),治疗2周后曲安奈德鼻喷雾剂组比芪术鼻喷雾剂高剂量组嗜酸性粒细胞计数减少,差异有统计学意义(P<0.05),说明芪术鼻喷雾剂短期的疗效较好。
[0250] 2.3血清IFN-γ、IL-4、IL-5的检测
[0251] 标准曲线图(详见图2-4);药物对大鼠血清中IL-4、IL-5、IFN-γ的浓度的影响(详见表13)
[0252] 表13药物对大鼠血清中IL-4、IL-5、IFN-γ的浓度的影响
[0253]组别 血清IL-4 血清IL-5 血清IFN-γ
空白组 52.37±6.7 101.91±10.92 112.07±12
模型组 71.48±12.13▲ 121.62±19.94▲ 99.6±10.49▲
阳性对照组 52.64±2.66△ 108.76±9.25△ 112.93±22.18△
治疗高剂量组 55.04±4.41△ 109.04±8.49△ 102.6±8.47
芪术鼻中剂量组 62.56±2.21▲△★☆ 110.5±11.44 97.78±8.45▲★
芪术鼻低剂量组 62.24±11.66▲△★ 115.27±8.97▲ 100.35±4.11▲★
F 8.553# 2.896 2.760
P 0.000* 0.023* 0.028*
[0254] 注:“*”表示P<0.05;“#”表示方差不齐。与空白对照组比较,▲P<0.05;与模型对照组比较,△P<0.05;与药物阳性组比较,★P<0.05;与高剂量组比较,☆P<0.05。
[0255] 对表13组间血清IL-4、血清IL-5、血清IFN-γ进行比较分析,对各组间总体进行方差齐性检验,结果显示血清IL-5和血清IFN-γ组间总体方差齐性,采用单因素方差分析进行分析,结果显示组间大鼠血清IL-5和血清IFN-γ含量组间有显著差异(P=0.023,P=0.028),进一步进行组间两两比较,结果显示曲安奈德鼻喷雾剂组及芪术鼻喷雾剂高治疗组,IL-5浓度均降低,差异有统计学意义(P<0.05);而血清IL-4组间方差不齐,故采用非参数Kruskal Wallis检验血清IL-4含量,结果显示组间大鼠血清IL-4含量组间有显著差异(P=0.000),进而进行组间两两比较,结果显示曲安奈德鼻喷雾剂组及芪术鼻喷雾剂高治疗组能降低IL-4的浓度,差异有统计学意义(P<0.05),依次是中、低剂量组。芪术鼻喷雾剂治疗组对血清IFN-γ浓度无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。
[0256] 2.4鼻腔黏膜病理组织学及超微结构变化
[0257] 光镜下观察各组大鼠鼻黏膜病理改变如下:空白组大鼠鼻粘膜的假复层纤毛未见倒伏,缺失,消失,粘膜下未见炎细胞浸润、水肿、坏死等病变。模型组:假复层纤毛倒伏,部分缺失,粘膜下伴有大量嗜酸性粒细胞,淋巴细胞浸润等,部分黏膜上皮脱落,固有层血管扩张,腺体增生。阳性对照组及芪术鼻喷雾剂高剂量组:均可见黏膜上皮基本完整,轻微血管扩张,炎性细胞浸润程度均比模型组轻。芪术鼻喷雾剂中剂量组、芪术鼻喷雾剂低剂量组:均可见部分黏膜上皮脱落,固有层血管轻微扩张,腺体增生,少许炎性细胞浸润。
[0258] 根据对大鼠AR鼻黏膜形态学的观察,可见治疗组均不同程度的改善了 鼻黏膜的病理形态,其中以阳性对照组及芪术鼻喷雾剂高剂量组对鼻黏膜病理形态修复最好,作用机制主要是通过抑制炎性细胞在鼻黏膜的聚集,减少炎性反应,进而促进了鼻黏膜的修复,这与症状积分的改善程度一致,提示了鼻黏膜组织形态学的改变与疗效相一致,因此鼻黏膜病理组织形态学可运用于AR的疗效评价。
[0259] 2.5鼻粘膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)的表达
[0260] 用免疫组化染色SP法、平均光
密度测定大鼠鼻粘膜组织。治疗后各组ICAM-1的变化如下表:
[0261] 表14药物对大鼠鼻粘膜ICAM-1平均光密度的影响
[0262]组别 数量 OD
Ⅰ组 10 0.2453±0.0121
Ⅱ组 9 0.3056±0.0127
Ⅲ组 10 0.2671±0.0150
Ⅳ组 10 0.2686±0.0201
Ⅴ组 8 0.2851±0.0181
Ⅵ组 9 0.3018±0.0171
[0263] 注:模型组与空白对照组相比,*P<0.05;**P<0.01,其余组与模型对照组相比, △P<0.05;△△P<0.01。
[0264] 结果分析:与模型对照组相比,除芪术鼻喷雾剂低剂量组外,各治疗组均能降低大鼠鼻粘膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)的含量,差异有统计学意义(P<0.05)。芪术鼻喷雾剂高、中剂量组能显著降低ICAM-1的含量,具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。芪术鼻喷雾剂低剂量组对大鼠鼻粘膜细胞间粘附分子1(ICAM-1)含量无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。
[0265] 4结论
[0266] 通过对、本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂动物实验的研究,采用烟熏法复制肺气虚动物模型,卵清蛋白腹腔注射配合局部激发致敏复制变应性鼻炎动物模型,在实验中观察记录动物行为学改变,及鼻部症状,观察各组大鼠粘膜的病理形态学改变及鼻腔黏膜ICAM-1的含量,检测芪术鼻喷雾剂对血清IL-4、IL-5、IFN-γ水平的影响的研究,可以得到以下几个结论:
[0267] 1、本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂能减少实验性大鼠喷嚏、抓鼻的次数,可以明显改善鼻部症状。
[0268] 2、本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂能减少实验性大鼠嗜酸性粒细胞对鼻腔的浸润程度,并在不同程度上改善鼻黏膜损伤。
[0269] 3、本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂能降低AR大鼠血清中IL-4、IL-5 的含量,尤其是能显著降低IL-4的含量,从而改善Th1/Th2平衡偏移的作用。
[0270] 4、本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂高、中剂量组能显著降低ICAM-1的含量。
[0271] 本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂能改善肺气虚变应性鼻炎大鼠鼻腔粘膜的病理形态变化,能抑制嗜酸性粒细胞在鼻粘膜中的浸润,减少鼻粘膜中ICAM-1与血清IL-4、IL-5的含量,从而减少了鼻腔分泌物,使变应性鼻炎的症状得到明显改善,说明本发明药物组合物芪术鼻喷雾剂能治疗肺气虚变应性鼻炎。
[0272] 综上,本发明药物组合物可以治疗鼻炎,增强机体免疫力的作用,特别是对变应性鼻炎(过敏性鼻炎)的疗效显著,为临床治疗鼻炎提供了一种新的药物。