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抗肿瘤的药用原料药

阅读：227发布：2020-05-11

专利汇可以提供抗肿瘤的药用原料药专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及抗肿瘤的药用原料药。具体地，本发明涉及一种供药用的原料药，该原料药的活性成分为以下式I化合物：或其药用盐，其中各取代基如说明书所述。本发明还涉及包含式I化合物或其盐的药物组合物、其制备方法以及它们的制药用途。本发明原料药作为一种抗肿瘤药物具有良好的特点例如稳定性和安全性。，下面是抗肿瘤的药用原料药专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种供药用的原料药，该原料药的活性成分为以下式I化合物：
或其药用盐。
2.根据权利要求1的原料药，其中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Ix杂质，该Ix杂质的结构如下：
3.根据权利要求1的原料药，其中Ix杂质相对于式I化合物而言含量低于5%、低于
2.5%、或低于1.7%。
4.根据权利要求1的原料药，其中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Iy杂质，该Iy杂质的结构如下：
5.根据权利要求1的原料药，其中杂质Iy相对于式I化合物的含量低于10%、低于5%、或低于2.8%。
6.根据权利要求1的原料药，其照【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质即RRT1.07杂质相对于式I化合物而言含量低于5%、低于2.5%、或低于1.7%。
7.根据权利要求1的原料药，其照【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质即RRT1.29杂质相对于式I化合物而言含量低于10%、低于5%、或低于2.8%。
8.一种药物组合物，其中包含权利要求1～7任一项所述的原料药，以及任选的药学可接受的载体或辅料。
9.供药用的原料药的制备方法，该原料药的活性成分为以下式I化合物：
或其药用盐例如甲磺酸盐即式Ia化合物，该方法包括使用有机溶剂对包含式I化合物或其药用盐的原料药进行精制的步骤。
10.权利要求1～7任一项所述原料药、权利要求8所述药物组合物、或者权利要求9所述方法制备得到的原料药的制药用途，用于制备作为微管抑制剂的药物或者用于制备治疗肿瘤的药物。

说明书全文

抗肿瘤的药用原料药

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，涉及一种具有抗肿瘤活性的大环内酯类药物化合物。

背景技术

[0002] 软海绵素B是一种有效的抗癌剂，最初从海洋海绵Halichondria okadai中分离出，随后在种名待定的小轴海绵(Axinella sp.)、Phakellia carteri和种名待定的扁矛海绵(Lissondendryxsp.)中发现。1992年公布了软海绵素B的全合成(Aicher，T,D.等，J.Am.Chem.Soc.114:3162-3164)。已经证明软海绵素B在体外抑制微管蛋白聚合、微管的s装配、β-微管蛋白交联、GTP和长春花碱与微管蛋白的结合以及依赖于微管蛋白的GTP 水解，并已经显示出体外和体内抗癌特性。

[0003] 已知具有以下式I结构的软海绵素类似物或其药学可接受的盐例如以下式Ia所示的其甲磺酸盐：

[0004]

[0005] 具有明确的药用活性例如抗癌活性或抗有丝分裂(阻断有丝分裂)活性的。

[0006] 据信式I化合物或其药用盐可抑制微管的生长期而不会影响缩短期，并将微管蛋白分离为无生产活性的聚合物。式I化合物或其药用盐通过微管蛋白的抗有丝分裂机制阻滞G2/M细胞周期，裂解有丝分裂纺锤体，最终，细胞因有丝分裂受阻而凋亡。已用于临床的式I化合物或其药用盐可作为一种微管抑制剂，适用于转移性乳腺癌患者等。

[0007] 式I化合物的甲磺酸盐(即式Ia化合物)其分子式为C40H59NO11·CH4O3S，分子量为826.0(游离碱即式I化合物的分子量为729.9)。式Ia化合物是一种白色粉末状物质，易溶于水、乙醇等溶剂中。

[0008] 现有技术公开了制备式I化合物的示例性方法。例如CN1216051C公开了一种合成式I化合物(化合物B1939，说明书62页)的方法，其是以L-阿拉伯糖开始经多步反应制得化合物B2318(说明书36页)，接着经多步反应制得化合物B2304(说明书44页)，接着经多步反应制得具有双羟基基团的化合物B1793(说明书47页)。在最后阶段，该具有双游离羟基的化合物B1793与甲磺酰氯反应以与其中的一个羟基酯化得到单甲磺酸酯化合物B2294(说明书49页)，最后将化合物B2294叠氮化及氨基化得到化合物B1939(说明书62页)即式I化合物。接着任选地，可使式I化合物进一步成盐例如形成甲磺酸盐，这种成盐的方法是本领域技术人员根据已有经验容易实现的。在上述最后阶段B1793进行甲磺酸酯化反应的过程中，可能会与另外一个羟基进行酯化，接着该酯化产物以类似于B2294所进行的后续叠氮化和氨基化反应以及可能的构型翻转，最终形成具有本发明下文所述的作为杂质的式Ix化合物。

[0009] 众所周知，药物原料或其制剂中的单一杂质需要控制在一定水平以内，例如5%以下、2.5%以下、2.0%以下、1.5%以下、1.0%以下、0.5%以下、0.25%以下、0.2%以下或0.1%以下等。在规定了其限度以后，药品在其贮藏有效期内该杂质的量允许有微量的但不能超过限度的增长。已经发现，式I化合物或其药用盐的原料或其制剂在长期存放过程中，有某种特定的杂质显示随留样时间延长而有增加的趋势，这种现象对于严格要求“质量可控”的医药品而言是非常不利的。

[0010] 因此，本领域仍然期待有新的方法以获得具有良好药学性能的式I化合物或其药用盐。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于为临床提供一种新的方法以获得具有良好药学性能的式I化合物或其药用盐。本发明人发现，现有技术方法获得的式I化合物或其药用盐经本发明方法处理后可以有效地使杂质Ix降低到有意义的限度；而且降到该限度以下后，原料和由其制备的制剂中其它杂质例如杂质Iy随药物贮藏时间的延长而不致显著增加。还出人意料地发现，具有低含量杂质Iy的本发明式I化合物或其药用盐具有出人意料的生物学特征例如其引起中性粒细胞减少等副反应的几率降低。本发明基于此发现而得以完成。

[0012] 为此，本发明第一方面提供了一种供药用的原料药的制备方法，该原料药的活性成分为以下式I化合物：

[0013]

[0014] 或其药用盐，该方法包括使用有机溶剂对包含式I化合物或其药用盐的原料药进行精制的步骤。

[0015] 本发明所述式I化合物通常亦称为艾日布林(eribulin)，而式Ia化合物通常亦称为甲磺酸艾日布林(eribulin mesylate)。在本发明方法中，上述“对包含式I化合物或其药用盐的原料药进行精制的步骤”中，所述术语“包含式I化合物或其药用盐的原料药”其可以是粗制原料药或粗品，例如可以是按照现有技术方法制备得到的原料药，尽管现有技术方法制备得到的原料药同样可以用于制剂例如注射液的制备，但是通过本发明方法对该现有技术的原料药进一步加工，以使它和由它制备成的制剂赋予更优良的性能，例如更好的稳定性、更好的安全性。

[0016] 本发明所述“供药用的原料药”或“原料药”其可作为药物组合物例如药物制剂生产用的原料药，因此其亦可理解为式I化合物或其药用盐即艾日布林或其药用盐的原料药。众所周知的，作为制备药物制剂的供药用的原料药，它们中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，还可以包含符合规定限度的微量杂质。

[0017] 根据本发明第一方面的方法，其中所述原料药包含以下式Ia化合物(即式I化合物的甲磺酸盐，通常亦可称为甲磺酸艾日布林)：

[0018]

[0019] 根据本发明第一方面的方法，其包括对包含式I化合物或其药用盐的原料药进行重结晶以达到精制目的的步骤。

[0020] 根据本发明第一方面的方法，所述重结晶是将原料药溶解于第一溶剂中，接着向该溶液中添加第二溶剂，以使式I化合物或其药用盐从溶剂中沉淀出结晶。

[0021] 根据本发明第一方面的方法，所述第一溶剂选自：水、甲醇、乙醇、1-辛醇、苯甲醇、二甲亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、及其组合。在一个实施方案中，所述第一溶剂选自：乙醇、1-辛醇、二甲亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、及其组合。在一个实施方案中，所述第一溶剂是乙醇和乙酸乙酯的混合物。在一个实施方案中，所述第一溶剂是乙醇与乙酸乙酯体积比1：2～8的混合物，优选是乙醇与乙酸乙酯体积比1：3～7的混合物。

[0022] 根据本发明第一方面的方法，所述第二溶剂选自：叔丁基甲基醚、正庚烷、正己烷、正戊烷及其组合。在一个实施方案中，所述第二溶剂选自：正庚烷、正己烷、正戊烷及其组合。在一个实施方案中，所述第二溶剂是正己烷。

[0023] 根据本发明第一方面的方法，所述第一溶剂与第二溶剂的体积比为1：5～20，例如1：6～15，例如1：6～12。

[0024] 根据本发明第一方面的方法，所述重结晶是在20～50℃条件下进行，例如是在30～40℃条件下进行。

[0025] 根据本发明第一方面的方法，将原料药溶解于第一溶剂中时，本领域技术人员通常理解此时所用溶剂量越低越好，通常是只要达到稍高于溶解量的体积，例如达到2～4倍溶解量的溶剂体积，以便为后续结晶和后处理创造条件。因此在本发明中不必对该第一溶剂用量作特别规定。但是为了获得良好的分离效果，在本发明一个实施方案中，可以使原料药以0.1～0.2g/ml的浓度溶解于第一溶剂中的比例进行处理。

[0026] 已经发现，使用本发明的结晶方法可以有效地除去杂质Ix(亦可称为Ix杂质、式Ix化合物等类似名称)，杂质Ix来源于式I化合物制备的最后阶段。该杂质Ix具有如下化学结构式：

[0027]

[0028] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的原料药中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Ix杂质，Ix杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0029] 在本发明的原料药(其中包含式I化合物或其药用盐)中，杂质Ix的含量是以其本身相对于呈游离形式而非药用盐形式的式I化合物的百分量计，即：对于某一批本发明原料药或以其为原料制成的药物组合物例如制剂的物料，计算其中杂质Ix的含量时，可以用下式计算：

[0030] 杂质Ix含量=(该物料中杂质Ix的质量÷该物料中式I化合物的质量)×100%[0031] 根据以上定义，上述物料既可以是以式I化合物或其药用盐为主要成组成的原料药，亦可以是以式I化合物或其药用盐为活性成分并添加有其它药用辅料的制剂例如注射液。由此，杂质Ix含量的计算不会因其它成分例如药用辅料的存在而受到影响。本发明涉及的其它杂质例如杂质Iy的计算时，亦具有类似情况。

[0032] 在本发明中，测定杂质Ix含量的方法可以有许多，例如根据本领域技术人员公知的方式确定的测定方法。一种典型的方法是高效液相色谱法。另外，可以通过制备型高效液相色谱法分离获得高纯度的例如色谱纯度达98%以上的杂质对照品(例如杂质Ix，以及例如下文提及的杂质Iy)，以该杂质对照品为对照，通过本领域技术人员已知可行的方法来测定本发明包含式I化合物或其药用盐的原料药以及由它们制备得到的药物制剂中该种杂质的相对含量。一种典型的高效液相色谱法是下文所述的高效液相色谱法A(在本发明中可简称【HPLC-A】)，其可用于测定本发明各种物料(包括原料药和制剂)中各种杂质例如杂质Ix(以及例如下文提及的杂质Iy)在该物料中相对于式I化合物的量。当然，本领域技术人员理解，分析方法是容易进行完善和改进的，任何可用的和潜在的测定本发明各种物料中的各种杂质的方法均可用于本发明；鉴于本发明各种物料中的各种杂质的含量不会因分析方法的完善和改进而发生变化，因此本发明各种物料中的杂质含量或相对含量的测定方法可以不受特别限制。当然，在本发明中，如未另外说明，测定各种物料(包括原料药和制剂)中各种杂质例如杂质Ix(以及例如但不限于下文提及的杂质Iy)的含量或相对含量的方法均是采用本文所述【HPLC-A】。

[0033] 已经发现，对于包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药或者由它们制成的药物制剂，随着贮藏时间的延长会出现一种特殊的降解杂质，其在本发明中称为杂质Iy(亦可称为Iy杂质、式Iy化合物等类似名称)，该杂质Iy具有如下化学结构式：

[0034]

[0035] 在本发明中，已经发现，通过纯化包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药，使得其中包含的源于工艺的杂质Ix降低到一定程度以后，该包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药或其制剂生成降解杂质Iy的速度得到显著抑制，这是完全出人意料的。

[0036] 尽管本发明通过多种手段确认了杂质Ix和杂质Iy的化学结构，但是本领域技术人员公知，这些杂质还可以通过规定的高效液相色谱法来定性或表征，例如通过规定的高效液相色谱法操作，通过测定杂质在该规定高效液相色谱法中的保留行为(即相对保留时间，RRT)来确定该杂质。特别是，本发明已经发现，在本发明所述【HPLC-A】系统中，相对于式I化合物而言，杂质Ix的相对保留时间在1.06～1.09范围内，从而本发明亦可将该杂质Ix称为RRT1.07杂质、杂质RRT1.07、或RRT1.07；相对于式I化合物而言，杂质Iy的相对保留时间在1.27～1.31范围内，从而本发明亦可将该杂质Iy称为RRT1.29杂质、杂质RRT1.29、或RRT1.29。即在本发明中，提及RRT1.07杂质时，均指在【HPLC-A】系统中，相对于式I化合物的保留时间而言，相对保留时间在1.06～1.09范围内出现杂质，该杂质为杂质Ix；同样地，在本发明中，提及RRT1.29杂质时，均指在【HPLC-A】系统中，相对于式I化合物的保留时间而言，相对保留时间在1.27～1.31范围内出现杂质，该杂质为杂质Iy。

[0037] 相对保留时间的含义在本领域是公知的，例如，杂质Ix的相对保留时间(缩写为RRT)是指在色谱图中，杂质Ix色谱峰的保留时间除以式I化合物色谱峰的保留时间所得的值，即Ix的RRT=杂质Ix保留时间÷式I化合物保护时间，这种算法是本领域技术人员公知的。

[0038] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药中，Ix杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。该限度的计算可以使用高效液相色谱法计算。

[0039] 在本发明中，【HPLC-A】的测定方法如下：

[0040] (1)照中国药典2010年版二部附录ⅤD所载高效液相色谱法进行；

[0041] (2)色谱条件与系统适用性试验：

[0042] 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，填料孔径填料粒径3μm，柱子尺寸：内径3.0mm×柱长100～250mm(可选择适宜长度的柱子以使流动相流速在0.5ml/min条件下式I化合物保留时间在26～32min范围内，例如可以使用150mm长的柱子)；

[0043] [在本发明下文的试验中，如未另外说明，使用购自英国Advanced Chromatography

[0044] Technologies Ltd公司的ACE-C18-300色谱柱进行测试，该色谱柱孔径填料粒径3μm，柱子尺寸：内径3.0mm×柱长150mm，产品货号ACE-211-1503]

[0045] 柱温：40℃；

[0046] 流动相A：将760mL水和240mL乙腈混合，加入7.0g三氟甲磺酸铵，再加入1.0M的磷酸二氢四丁基铵(tetrabutylammonium dihydrogenphosphate)水溶液3.0mL，混匀，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得流动相A；

[0047] 流动相B：将300mL水、700mL乙腈和20mL的2-丙醇混合，加入7.0g三氟甲磺酸铵，再加入1.0M的磷酸二氢四丁基铵水溶液3.0mL，混匀，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得流动相B；

[0048] 梯度洗脱程序：

[0049]时间(min) 流动相A比例(%) 流动相B比例(%)
0 100 0
55 100 0
75 0 100
85 0 100
86 100 0
115 100 0

[0050] 流速：在0～55min期间以第一流速进行洗脱，在55min时流速改为0.63ml/min并持续至115min，所述第一流速是在0.47～0.52ml/min范围内的一个恒定流速进行以使式I化合物保留时间在26～32min范围内；

[0051] 进样体积：5μL；紫外检测：波长200nm；运行时间和数据采集时间：115min和55min；

[0052] (3)测试液的配制：

[0053] 配液溶剂：将水650mL、乙腈350mL、85%磷酸溶液0.7mL混合，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得；

[0054] 杂质溶液1：称取2mg杂质Ix置于50mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(杂质Ix溶液，浓度约40μg/ml)；

[0055] 杂质溶液2：称取2mg杂质Iy置于5mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(杂质Iy溶液，浓度约400μg/ml)；

[0056] 系统适用性测试溶液：称取20mg式I化合物标准品(色谱纯度大于99.0%)置于5mL量瓶中，加入1mL杂质溶液1和0.5mL杂质溶液2，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(包含式I化合物约4000μg/ml、杂质Ix约8μg/ml、杂质Iy约40μg/ml)；

[0057] 供样品溶液：精密称取或量取含式I化合物约100mg供试品(其可以是包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药，也可以是包含辅料的药物制剂，所称取或量取的物料中包含游离碱形式的式I化合物约100mg)，置于25mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(含式I化合物浓度约4000μg/ml)；

[0058] 对照溶液：精密量取上述供试品溶液5ml置500ml量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得(含式I化合物约40μg/ml)；

[0059] (4)系统适用性测试，要求符合以下限度：系统适用性测试溶液所得色谱图中，式I化合物与杂质Ix峰的分离度不低于1.5，式I化合物峰的拖尾因子不低于0.5且不高于1.5，式I化合物峰的理论塔板数不低于13000，系统适用性测试溶液重复进样5次计算的式I化合物峰面积的相对标准偏差不超过1.0%；

[0060] (5)相对保留时间：式I化合物的RRT=1.00，杂质Ix的RRT在1.06～1.09范围内，杂质Iy的RRT在1.27～1.31范围内；

[0061] (6)测试：取对照溶液5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

[0062] (7)读取对照溶液色谱图中主成分(即式I化合物，在本发明其它处提及时亦具有相同含义)峰的峰面积；读取供试品溶液色谱图中主成分峰的峰面积，以及该色谱图中经面积归一化法计算峰面积百分数大于0.01%的杂质峰的峰面积，计算这些杂质峰相对于主成分峰的相对保留时间；

[0063] 用下式计算在该供试品中，任意一个单一杂质其相对于式I化合物的含量：

[0064]

[0065] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.07杂质或称为RRT1.07，其实质上为杂质Ix)相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0066] 本发明发现，使杂质Ix含量控制在低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)时，可以使得本发明原料药及其制备得到的药物组合物中杂质Iy随着贮藏时间的延长而不会有显著的增加。在本发明中有临床意义的发现是，杂质Iy是一种可以明显引起中性粒细胞减少的物质，而当本发明药物化合物及其制备得到的药物组合物中杂质Iy相对于式I化合物的含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)时，该原料药或其制备得到的药物组合物不会对受试动物引起明显的中性粒细胞减少，但是当该原料药或其制备得到的药物组合物中杂质Iy相对含量高于2.8%(特别是高于5%，特别是高于10%)时，该原料药或其制备得到的药物组合物仍然会引起受试动物明显的中性粒细胞减少这种副作用。

[0067] 因此，根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药中，杂质Iy相对于式I化合物的含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0068] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.29杂质或称为RRT1.29，其实质上为杂质Iy)相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0069] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)；相对保留时间在1.27～1.31处的杂质相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0070] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药在38℃条件下密封、避光放置6个月，计算在此条件下处置6个月后某杂质相对于0月时的含量增加百分数，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质含量增加百分数低于200%，例如低于150%，例如低于100%，例如低于75%，例如低于50%，例如低于40%。该试验方法在本发明中可简称为38℃-6月考察。所述的术语“杂质含量增加百分数”是照下式计算的：

[0071]

[0072] 以上计算式中，杂质0月含量或杂质6月含量是指该杂质在物料中相对于游离碱形式的式I化合物的相对含量。

[0073] 进一步地，本发明第二方面提供了一种供药用的原料药，该原料药的活性成分为以下式I化合物：

[0074]

[0075] 或其药用盐。

[0076] 根据本发明第二方面的原料药，其中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Ix杂质。

[0077] 根据本发明第二方面的原料药，其中Ix杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0078] 根据本发明第二方面的原料药，其中包括作为主要组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Iy杂质。

[0079] 根据本发明第二方面的原料药，其中杂质Iy相对于式I化合物的含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0080] 根据本发明第二方面的原料药，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.07杂质或称为RRT1.07，其实质上为杂质Ix)相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0081] 根据本发明第二方面的原料药，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.29杂质或称为RRT1.29，其实质上为杂质Iy)相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0082] 根据本发明第二方面的原料药，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)；
相对保留时间在1.27～1.31处的杂质相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0083] 根据本发明第二方面的原料药，其在38℃条件下密封、避光放置6个月，计算在此条件下处置6个月后某杂质相对于0月时的含量增加百分数，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质含量增加百分数低于200%，例如低于150%，例如低于100%，例如低于75%，例如低于50%，例如低于40%。

[0084] 根据本发明第二方面的原料药，其是通过对包含式I化合物或其药用盐的原料药进行重结晶以达到精制目的而得到的。

[0085] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述重结晶是将原料药溶解于第一溶剂中，接着向该溶液中添加第二溶剂，以使式I化合物或其药用盐从溶剂中沉淀出结晶。

[0086] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述第一溶剂选自：水、甲醇、乙醇、1-辛醇、苯甲醇、二甲亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、及其组合。在一个实施方案中，所述第一溶剂选自：乙醇、1-辛醇、二甲亚砜、二氯甲烷、乙酸乙酯、及其组合。在一个实施方案中，所述第一溶剂是乙醇和乙酸乙酯的混合物。在一个实施方案中，所述第一溶剂是乙醇与乙酸乙酯体积比
1：2～8的混合物，优选是乙醇与乙酸乙酯体积比1：3～7的混合物。

[0087] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述第二溶剂选自：叔丁基甲基醚、正庚烷、正己烷、正戊烷及其组合。在一个实施方案中，所述第二溶剂选自：正庚烷、正己烷、正戊烷及其组合。在一个实施方案中，所述第二溶剂是正己烷。

[0088] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述第一溶剂与第二溶剂的体积比为1：5～20，例如1：6～15，例如1：6～12。

[0089] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述重结晶是在20～50℃条件下进行，例如是在30～40℃条件下进行。

[0090] 根据本发明第二方面的原料药，其中所述重结晶中，使原料药以0.1～0.2g/ml的浓度溶解于第一溶剂中的比例进行处理。

[0091] 进一步地，本发明第三方面提供了一种药物组合物(例如药物制剂)，其中包含本发明第二方面任一项所述的原料药，以及任选的药学可接受的载体或辅料。在一个实施方案中，本发明所述药物组合物是使用本发明第二方面任一项所述的原料药经药物组合物(例如药物制剂)制备工艺制备得到。

[0092] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是口服制剂或者注射制剂。

[0093] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂(包括注射液和冷冻干燥粉针剂)、混悬剂、丸剂。

[0094] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是注射液。

[0095] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是注射液，该注射液每1ml中包含：0.25～0.75mg的式I化合物或其药用盐、无水乙醇0.025～0.075ml、和加至全量的注射用水。

[0096] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是注射液，该注射液每1ml中包含：0.25～0.75mg式I化合物或其药用盐、无水乙醇0.025～0.075ml、任选的pH调节剂适量以使注射液的最终pH值调节至6.5～7.5、和加至全量的注射用水。在一个实施方案中，所述pH调节剂是盐酸、氢氧化钠或其组合。

[0097] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是注射液，该注射液每1ml中包含：0.25～0.75mg的式Ia化合物(即式I化合物的甲磺酸盐)、无水乙醇0.025～0.075ml、任选的pH调节剂适量以使注射液的最终pH值调节至6.5～7.5、和加至全量的注射用水。

[0098] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是注射液，该注射液每1ml中包含：0.4～0.6mg的式Ia化合物(即式I化合物的甲磺酸盐)、无水乙醇0.04～0.06ml、任选的pH调节剂适量以使注射液的最终pH值调节至6.5～7.5、和加至全量的注射用水。

[0099] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是冷冻干燥粉针剂，该粉针剂中包含：1重量份的式I化合物或其药用盐、40～400重量份的冻干赋形剂。

[0100] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是冷冻干燥粉针剂，该粉针剂中包含：1重量份的式I化合物或其药用盐、40～400重量份的冻干赋形剂、任选的pH调节剂适量以使该粉针剂用注射用水稀释至式I化合物浓度为0.5mg/ml时溶液的pH值在6.5～7.5范围内。

[0101] 根据本发明第三方面的药物组合物，其是冷冻干燥粉针剂，该粉针剂中包含：1重量份的式I化合物或其药用盐、50～250重量份的冻干赋形剂、任选的pH调节剂适量以使该粉针剂用注射用水稀释至式I化合物浓度为0.5mg/ml时溶液的pH值在6.5～7.5范围内。

[0102] 在一个实施方案中，所述冻干赋形剂可选自甘露醇、乳糖、麦芽糖、蔗糖、氯化钠等。

[0103] 根据本发明第三方面的药物组合物，其中包括作为活性组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Ix杂质。

[0104] 根据本发明第三方面的药物组合物，其中Ix杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0105] 根据本发明第三方面的药物组合物，其中包括作为活性组分的式I化合物或其药用盐，以及任选的作为杂质的Iy杂质。

[0106] 根据本发明第三方面的药物组合物，其中杂质Iy相对于式I化合物的含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0107] 根据本发明第三方面的药物组合物，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.07杂质或称为RRT1.07，其实质上为杂质Ix)相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0108] 根据本发明第三方面的药物组合物，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质(在本发明中亦可称为RRT1.29杂质或称为RRT1.29，其实质上为杂质Iy)相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0109] 根据本发明第三方面的药物组合物，其照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)；相对保留时间在1.27～1.31处的杂质相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。

[0110] 根据本发明第三方面的药物组合物，其在38℃条件下密封、避光放置4个月，计算在此条件下处置4个月后某杂质相对于0月时的含量增加百分数，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质含量增加百分数低于200%，例如低于150%，例如低于100%，例如低于
75%，例如低于50%，例如低于40%。该试验方法在本发明中可简称为38℃-4月考察。

[0111] 进一步地，本发明第四方面提供了本发明第一方面所述方法制备得到的原料药、第二方面所述原料药或者第三方面所述药物组合物的用途，用于制备作为微管抑制剂的药物或者用于制备治疗肿瘤(例如良性或恶性肿瘤，例如癌症，例如乳腺癌)的药物。

[0112] 根据本发明第四方面的用途，其中所述药物在微管抑制或治疗肿瘤时不出现中性粒细胞减少的副反应。

[0113] 根据本发明第四方面的用途，其中所述药物在施用于受试者时，在该药物中相对于式I化合物而言RRT1.29杂质的含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。根据本发明第四方面的用途，其中所述药物照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.27～1.31处的杂质相对于式I化合物而言含量低于10%(例如低于5%，例如低于2.8%)。根据本发明第四方面的用途，其中所述药物在施用于受试者时，在该药物中相对于式I化合物而言RRT1.07杂质的含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。根据本发明第四方面的用途，其中所述药物照本发明【HPLC-A】测定，其中相对保留时间在1.06～1.09处的杂质相对于式I化合物而言含量低于5%(例如低于2.5%，例如低于1.7%)。

[0114] 根据本发明的任一方面，其中所述的药用原料药中式I化合物或式Ia化合物的含量大于95%，例如在在95.0%～105.0%范围内，例如在97.0%～102.0%范围内。

[0115] 根据本发明的任一方面，其中所述的药用原料药的色谱纯度在97.0%～99.9%范围内，例如在98.0%～99.9%范围内，例如在98.5%～99.9%范围内。

[0116] 根据本发明的任一方面，其中所述的药用原料药或者所述药物组合物中，相对于式I化合物而言，RRT1.07含量在0.10～1.70%范围内，例如在0.10～1.5%范围内，例如在0.10～1.0%范围内。

[0117] 根据本发明的任一方面，其中所述的药用原料药或者所述药物组合物中，相对于式I化合物而言，RRT1.29含量在0.05～2.80%范围内，例如在0.05～2.0%范围内，例如在0.5～1.5%范围内，例如在0.5～1.0%范围内。

[0118] 本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

[0119] 在本发明中，“%”的含义可根据具体使用环境而定，特别是其具有如2010年版中国药典二部凡例中“计量”项下第二十八条(4)款所述含义。

[0120] 在本发明中，单独提及时，“乙醇”是指无水乙醇。

[0121] 在本发明涉及的式I化合物，以其甲磺酸盐为例，其示例性的英文化学名为：

[0122] 11,15:18,21:24,28-Triepoxy-7,9-ethano-12,15-methano-9H,15H-furo[3,2-i]furo[2',3':5,6]pyrano[4,3-b][1,4]dioxacyclopentacosin-5(4H)-one,2-[(2S)-3-amino-2-hydroxypropyl]hexacosahydro-3-methoxy-26-methyl-20,27bis(methylene)(2R,3R,3aS,7R,8aS,9S,10aR,11S,12R,13aR,13bS,15S,18S,21S,24S,26R,28R,29aS),methanesulfonate(salt)；

[0123] 分子式：C40H59NO11·CH3SO3H，

[0124] 分子量：826.0(游离碱即式I化合物的分子量为729.9)，

[0125] 以式I化合物的甲磺酸盐为例各碳原子可编号标示如下：

[0126]

[0127] 上述示例性的编号在本文中可延用。以上结构中的12-位碳虽然在绘法上与CN1216051C公开的化合物B1939(说明书62页)中相应碳绘法不同，但二者手性构型相同，均为R型。

[0128] 在本发明中，尽管本发明人已经清楚RRT1.07和RRT1.29两个特定杂质的具体化学结构，但是这些杂质还可通过其在本发明具体明确的【HPLC-A】中来定性表征，特别是使用在特定HPLC条件下呈现出的RRT参数来表征。本领域技术人员公知，可以完全独立使用RRT表征而完全不必考虑其具体化学结构，原因在于在规定HPLC条件下RRT是一个恒定的参数，即RRT表征与结构表征可以是相互独立或相互组合地使用的。而这种表征方法是药学领域对原料药或者制剂质量标准所允许的，完全具备产业实用性。

[0129] 在本发明中，确定各种物料(例如各种作为药物制剂用原料药、药物组合物例如药物制剂等)中式I化合物或其药用盐或者其它杂质的含量时，以及确定这些物料中的色谱纯度时，可以采用下面的【HPLC-A】方法进行测定。在本发明后文的实施例部分，如需要测定某些物料的含量、有关物质时，如未另外说明，均是照该【HPLC-A】方法进行。

[0130] 【HPLC-A】的测定方法如下：

[0131] (1)照中国药典2010年版二部附录ⅤD所载高效液相色谱法进行；

[0132] (2)色谱条件与系统适用性试验：

[0133] 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，填料孔径填料粒径3μm，柱子尺寸：内径3.0mm×柱长150mm[该色谱柱是购自英国Advanced ChromatographyTechnologies Ltd公司的ACE-C18-300色谱柱，产品货号ACE-211-1503]；

[0134] [该色谱柱是购自英国Advanced Chromatography Technologies Ltd公司的ACE-C18-300色谱柱，产品货号ACE-211-1503]

[0135] 柱温：40℃；

[0136] 流动相A：将760mL水和240mL乙腈混合，加入7.0g三氟甲磺酸铵，再加入1.0M的磷酸二氢四丁基铵(tetrabutylammonium dihydrogenphosphate)水溶液3.0mL，混匀，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得流动相A；

[0137] 流动相B：将300mL水、700mL乙腈和20mL的2-丙醇混合，加入7.0g三氟甲磺酸铵，再加入1.0M的磷酸二氢四丁基铵水溶液3.0mL，混匀，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得流动相B；

[0138] 梯度洗脱程序：

[0139]时间(min) 流动相A比例(%) 流动相B比例(%)
0 100 0
55 100 0
75 0 100
85 0 100
86 100 0
115 100 0

[0140] 流速：在0～55min期间以第一流速进行洗脱，在55min时流速改为0.63ml/min并持续至115min，所述第一流速是在0.47～0.52ml/min范围内的一个恒定流速进行以使式I化合物保留时间在26～32min范围内；

[0141] 进样体积：5μL；紫外检测：波长200nm；运行时间和数据采集时间：115min和55min；

[0142] (3)测试液的配制：

[0143] 配液溶剂：将水650mL、乙腈350mL、85%磷酸溶液0.7mL混合，测定溶液的pH值，必要时用5.6%氢氧化铵水溶液或者1mol/L盐酸调节溶液的pH值至7.0，即得；

[0144] 杂质溶液1：称取2mg杂质Ix置于50mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(杂质Ix溶液，浓度约40μg/ml)；

[0145] 杂质溶液2：称取2mg杂质Iy置于5mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(杂质Iy溶液，浓度约400μg/ml)；

[0146] 系统适用性测试溶液：称取20mg式I化合物标准品(色谱纯度大于99.0%)置于5mL量瓶中，加入1mL杂质溶液1和0.5mL杂质溶液2，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(包含式I化合物约4000μg/ml、杂质Ix约8μg/ml、杂质Iy约40μg/ml)；

[0147] 供样品溶液：精密称取或量取含式I化合物约100mg供试品(其可以是包含式I化合物或其药用盐的本发明原料药，也可以是包含辅料的药物制剂，所称取或量取的物料中包含游离碱形式的式I化合物约100mg)，置于25mL量瓶中，用配液溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(含式I化合物浓度约4000μg/ml)；

[0148] 对照溶液：精密量取上述供试品溶液5ml置500ml量瓶中，用配液溶剂稀释至刻度，摇匀，即得(含式I化合物约40μg/ml)；

[0149] (4)系统适用性测试，要求符合以下限度：系统适用性测试溶液所得色谱图中，式I化合物与杂质Ix峰的分离度不低于1.5，式I化合物峰的拖尾因子不低于0.5且不高于1.5，式I化合物峰的理论塔板数不低于13000，系统适用性测试溶液重复进样5次计算的式I化合物峰面积的相对标准偏差不超过1.0%；

[0150] (5)相对保留时间：式I化合物的RRT=1.00，杂质Ix的RRT在1.06～1.09范围内，杂质Iy的RRT在1.27～1.31范围内；

[0151] (6)测试：取对照溶液5μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%，再精密量取供试品溶液和对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

[0152] (7)读取对照溶液色谱图中主成分(即式I化合物，在本发明其它处提及时亦具有相同含义)峰的峰面积；读取供试品溶液色谱图中主成分峰的峰面积，以及该色谱图中经面积归一化法计算峰面积百分数大于0.01%的杂质峰的峰面积，计算这些杂质峰相对于主成分峰的相对保留时间；

[0153] 用下式计算在该供试品中，任意一个单一杂质其相对于式I化合物的含量：

[0154]

[0155] 以上【HPLC-A】可方便地用于测定各种物料中的有关物质。对于测定各种物料中的式I化合物或其药用盐的含量时，可以使用式I化合物或其药用盐的色谱纯度大于99.0%的对照品作为对照，以外标法进行定量。当需要测定这些物料中杂质的绝对量时，亦可使用该杂质的色谱纯度大于99.0%的对照品作为对照，以外标法进行定量；但通常而言表征杂质的量时以该杂质相对于式I化合物的相对百分含量来表示。

[0156] 本发明下文测试使用的以上【HPLC-A】中，第一流速为0.50ml/min，式I化合物保留时间在26～32min范围内，式I化合物峰拖尾因子0.97，理论塔板数19310，式I化合物与RRT1.07的分离度2.5。

[0157] 在本发明中提及的色谱纯度是指在本发明【HPLC-A】方法测定有关到的。本领域技术人员公知，该色谱纯度通常是在有关物质检查过程中测定，扣除溶剂峰、甲磺酸根、辅料等色谱峰，经面积归一化法计算而得。

[0158] 另外，在本发明的任一实施方案中，当相对于式I化合物来表征各杂质的相对百分含量时，不论是式I化合物游离碱形式的物料，还是其药用盐形式的物料，均折算成式I化合物游离碱形式计。原因在于本发游离碱形式或药用盐形式在注入高效液相色谱中时，在26～32min洗脱出来的主峰均是游离碱形式，而盐根例如甲磺酸根离子与该色谱峰不重叠。

[0159] 在本发明中，可按本领域技术人员公知的方法，通过各杂质峰的峰面积与对照溶液色谱图中主峰面积比较计算供试品中该杂质的含量；例如对照溶液色谱图中主峰面积为1000(其相当于供试品溶液浓度的1%)，如果在供试品溶液色谱图中某杂质的峰面积为5000则该杂质在供试品中的含量为5%，如果在供试品溶液色谱图中某杂质的峰面积为2000则该杂质在供试品中的含量为2%；这些计算可以得到该供试品中的最大单一杂质的含量、特定杂质例如RRT1.07和RRT1.29含量；全部杂质的含量加和可以得到总杂质含量。
以上在测定有关物质时，对于包含药用辅料的药物组合物，在计算时扣除色谱图中辅料的色谱峰。

[0160] 本发明药物组合物中使用的“药学可接受的载体”可以是药物制剂领域中任何常规的载体。特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。

[0161] 本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、注射乳剂(注射用无菌粉针)等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

[0162] 中性粒细胞(Neutrophil或Neutrophil granulocyte，在本发明中可缩写为NG)是血液白细胞的一种，也是哺乳动物血液中最主要的一种白细胞。中性粒细胞在血液的非特异性细胞免疫系统中起着十分重要的作用，它处于机体抵御微生物病原体，特别是在化脓性细菌入侵的第一线，当炎症发生时，它们被趋化性物质吸引到炎症部位。由于它们是借糖酵解获得能量，因此在肿胀并血流不畅的缺氧情况下仍能够生存，它们在这里形成细胞毒存在破坏细菌和附近组织的细胞膜。由于中性粒细胞内含有大量溶酶体酶，因此能将吞噬入细胞内的细菌和组织碎片分解，这样，入侵的细菌被包围在一个局部，并消灭，防止病原微生物在体内扩散。当中性粒细胞本身解体时，释出各溶酶体酶类能溶解周围组织而形成脓肿。中性粒细胞的细胞膜能释放出一种不饱和脂肪酸——花生四烯酸，在酶的作用下，由它再进一步生成一组旁分泌激素物质，如血栓素和前列腺素等，这类物质对调节血管口径和通透性有明显的作用，还能引起炎症反应和疼痛，并影响血液凝固。中性粒细胞内含许多弥散分布的细小的浅红或浅紫色的特有颗粒，颗粒中含有髓过氧化物酶、酸性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶等。髓过氧化物酶是中性粒细胞所特有，即使在有强吞噬作用的巨噬细胞中也极少或完全没有这种酶。在细胞化学上，一般将这种髓过氧化物酶作为中性粒细胞的标志。中性粒细胞具有很强的趋化作用。所谓趋化作用，就是细胞向着某一化学物质刺激的方向移动。对中性粒细胞起趋化作用的物质，称为中性粒细胞趋化因子。中性粗细胞膜上有趋化因子受体，受体与趋化因子结合，激活胞膜上的钙泵，细胞向前方伸出片足，使细胞移向产生趋化因子的部位。中性粒细胞的片足与产生趋化因子的异物接触后，接触处周围的胞质形成隆起即伪足，接触部位的细胞膜下凹，将异物包围，形成含有异物的吞噬体或吞噬泡。
中性粒细胞膜表面有IgGFc受体和补体C3受体，可加速吞噬作用。被吞噬的异物裹有抗体和补体时，与中性粒细胞膜上的相应受体结合，而加强了细胞对它的吞噬作用，称为调理作用。细胞随着吞噬作用的开始，导致细胞膜紊乱而引起呼吸爆发，细胞耗氧量增加，产生大量的过氧化物及超氧化物等细胞毒性效应分子，对寄生虫具有杀伤活性。在IFN-γ和TNF刺激下，则可产生更多的过氧代谢阴离子，杀死胞外寄生虫。中性粒细胞在杀死吞噬的细菌等异物后，本身也死亡，死亡的中性粒细胞称为脓细胞。中性粒细胞受细菌产物、抗原抗体复合物等作用时，细胞的颗粒内容物向细胞外释放。释出的酸性蛋白酶和中性蛋白酶，可以分解血管基膜、肾小球基膜、结缔组织的胶原蛋白与弹性蛋白以及血浆中的补体C5、C15和激肽原等。其分解产物有的又是中性粒细跑趋化因子，能吸引更多的中性粒细胞。中性粒细胞释放的物质中，还有嗜酸性粒细胞趋化因子、中性粒细胞不动因子(NIF)、激肽酶原、血纤维蛋白溶酶原、凝血因子、白三烯等。除了在抗感染中起重要的防御作用外，中性粒细胞可引起感染部位的炎症反应并参与寄生虫感染引发的变态反应，从而引起免疫病理损害。抗体直接作用于组织或细胞上的抗原，中性粒细胞通过其Fc受体与靶细胞表面的IgGFc段结合，发挥ADCC作用，从而导致细胞毒型变态反应损害；当抗原抗体比例适合而形成19S大小的免疫复合物，不易被吞噬，沉积于毛细血管壁，激活补体，吸引中性粒细胞至局部。中性粒细胞通过Fc受体和C3b受体与免疫复合物结合并吞噬之。吞噬过程中脱颗粒，释放出一系列溶酶体酶类，造成血管和周围组织的损伤；在IgE介导的速发型变态反应的部位，也有中性粒细胞的聚集，说明中性粒细胞也参与了速发型变态反应导致的病理损害。由此，人体血液中中性粒细胞减少对于人体的正常生理机能的发挥是不利的。

[0163] 现已上市销售的艾日布林药剂(例如注射液等)，其作为一种微管抑制剂用于治疗转移性乳腺癌患者等。本发明提供一种新的艾日布林原料药，其在稳定性能方面具有优良的特点，并且显示出良好的生物安全性，因此本发明原料药物同样可用于治疗转移性乳腺癌并且具有低的副反应发生率，例如低的中性粒细胞减少这种副反应发生率。附图说明

[0164] 图1：本发明一种原料药测定有关物质的HPLC图。

[0165] 图2：本发明一种药物组合物测定有关物质的HPLC图。

具体实施方式

[0166] 通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

[0167] 实施例1：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0168] 步骤(1)——合成式I化合物：照CN1216051C(中国专利ZL99809658.X)说明书28页11行从L-阿拉伯糖合成三醇1开始，至说明书62页7行得到化合物B1939即本发明式I化合物(游离碱形式)的方法，制得产物为式I化合物(粗品)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=4.17%，RRT1.29含量=0.73%。

[0169] 步骤(2)——成盐：在20～25℃的温度下，向1400ml水和1300ml乙腈的混合溶液中加入步骤(1)所得产物50克和70mmol的甲磺酸，搅拌使反应，将反应物减压浓缩；将所得残余物溶于400ml二氯甲烷中，过滤，向滤液中添加3000ml正戊烷；滤出沉淀，用正戊烷洗涤，在真空干燥，制得产物为式Ia化合物。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=3.36%，RRT1.29含量=0.61%。

[0170] 步骤(3)——重结晶精制：在33～36℃的温度下，将步骤(2)所得产物1.5g溶解于无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂(1：5，v/v)10ml中，缓缓向其中滴加正己烷90ml，静置使充分沉淀(约24小时)，滤出沉淀，用正己烷洗涤，真空干燥，即得(重结晶收率93.3%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.83%，RRT1.29含量=0.37%。经过一次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了75.3%【即(3.36-0.83)÷3.36×100%】。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。图1显示了该甲磺酸艾日布林原料药测定有关物质时的典型HPLC图，图中显示式Ix化合物在27.684min处出峰(此峰为式I化合物即游离碱峰，式Ia盐在流动相中解离，甲磺酸根不在此处出峰)，在29.717min处显示有Ix杂质(RRT的具体值为1.073)，在35.552min处显示有Iy杂质(RRT的具体值为1.284)。

[0171] 实施例2：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0172] 取实施例1步骤(2)所得到产物，参考实施例1步骤(3)操作方式进行重结晶精制。

[0173] 在30～35℃的温度下，将实施例1步骤(2)所得产物1.0g溶解于无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂(1：3，v/v)10ml中，缓缓向其中滴加正己烷60ml，静置使充分沉淀(约6小时)，滤出沉淀，用正己烷洗涤，真空干燥，即得(重结晶收率91.4%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.76%，RRT1.29含量=0.33%。经过一次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了77.4%。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。

[0174] 实施例3：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0175] 取实施例1步骤(2)所得到产物，参考实施例1步骤(3)操作方式进行重结晶精制。

[0176] 在35～40℃的温度下，将实施例1步骤(2)所得产物2.0g溶解于无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂(1：7，v/v)10ml中，缓缓向其中滴加正己烷120ml，静置使充分沉淀(约36小时)，滤出沉淀，用正己烷洗涤，真空干燥，即得(重结晶收率95.2%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.91%，RRT1.29含量=0.44%。经过一次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了72.9%。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。

[0177] 实施例4：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0178] 取实施例1步骤(3)所得到产物，参考实施例1步骤(3)操作方式再次进行重结晶精制。此次重结晶收率93.3%。此产物经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.24%，RRT1.29含量=0.14%。此次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了71.1%。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。

[0179] 实施例5：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0180] 步骤(1)——同实施例1步骤(1)。

[0181] 步骤(2)——成盐：在20～25℃的温度下，向1400ml水和1300ml乙腈的混合溶液中加入步骤(1)所得产物60克和80mmol的甲磺酸，搅拌使反应，加入4ml氢氧化铵，将反应物减压浓缩；将所得残余物溶于400ml二氯甲烷中，过滤，向滤液中添加3000ml正戊烷；滤出沉淀，用正戊烷洗涤，在真空干燥，制得产物为式Ia化合物。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=3.52%，RRT1.29含量=0.69%。

[0182] 步骤(3)——重结晶精制：在30～40℃的温度下，将步骤(2)所得产物1.5g溶解于无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂(1：6，v/v)10ml中，缓缓向其中滴加正己烷100ml，静置使充分沉淀(约24小时)，滤出沉淀，用正己烷洗涤，真空干燥，即得(重结晶收率91.6%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.87%，RRT1.29含量=0.43%。此次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了75.3%。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。

[0183] 实施例6：制备艾日布林/甲磺酸艾日布林原料药

[0184] 步骤(1)——制备式I化合物：

[0185] 以CN1216051C所得包括两个羟基的化合物B1793(说明书47页，C40H58O12，Mr730.88)为起始物质。在低于-10℃的温度下，在30ml二氯甲烷中，加入731mg(1mmol)B1793以及1.05mmol的对甲苯磺酸酐、4mmol的2,4,6-三甲基吡啶、和0.05mmol的吡啶形成下式的对甲苯磺酸盐：

[0186]

[0187] 将反应物适当浓缩，加入100ml异丙醇、120ml氢氧化铵，的20～25℃的温度下搅拌使反应，在反应过程中形成以下作为反应中间体的环氧化物：

[0188]

[0189] TLC监测反应进程以使反应物中上述环氧化物消失，形成本发明式I化合物；在<30℃的温度下将反应物浓缩，加入二氯甲烷30ml，依次用5%碳酸氢钠和5%碳酸钠溶液萃取，分取有机层，在<30℃的温度下浓缩，得到残余物；将所得残余物加载到硅胶柱上，依次用乙腈/水/0.25M醋酸铵梯度洗脱：先用20柱体积的乙腈/水/0.25M醋酸铵(100/0/0，v/v)洗脱，接着用30柱体积的乙腈/水/0.25M醋酸铵(90/7/3，v/v)洗脱，接着用30柱体积的乙腈/水/0.25M醋酸铵(85/12/3，v/v)洗脱，接着用20柱体积的乙腈/水/0.25M醋酸铵(80/18/3，v/v)洗脱；将洗脱液在<40℃的温度下浓缩，得到残余物，加入二氯甲烷20ml，依次用5%碳酸氢钠和5%碳酸钠溶液萃取，分取有机层，在<30℃的温度下浓缩，得到残余物；将以上残余物溶解于二氯甲烷和正戊烷的混合液(1：3，v/v)中，过滤，在<30℃的温度下添加乙腈，静置使析出沉淀，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥，得到呈游离碱形式的本发明式I化合物。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=2.74%，RRT1.29含量=0.42%。

[0190] 步骤(2)——成盐：照本发明实施例1步骤(2)进行，得到式Ia化合物。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=2.13%，RRT1.29含量=0.34%。

[0191] 步骤(3)——重结晶精制：照本发明实施例1步骤(3)进行纯化，得到可作为本发明原料药的式Ia产物(重结晶收率92.4%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.51%，RRT1.29含量=0.18%。此次重结晶纯化，RRT1.07的含量降低了76.6%。其可作为本发明的甲磺酸艾日布林原料药。

[0192] 步骤(4)——游离碱精制：将步骤(1)所得式I游离碱溶解于二氯甲烷和正戊烷的混合液(1：3，v/v)中，过滤，在<30℃的温度下添加乙腈，静置使析出沉淀，过滤，用乙腈洗涤，真空干燥；再重复此沉淀析晶操作3次，得到呈游离碱形式的本发明式I化合物。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.94%，RRT1.29含量=0.31%。

[0193] 比较实施例1：参照本文实施例1步骤(3)的操作，不同的仅是将其中第一溶剂即无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂替换为乙醇与乙酸乙酯体积比1：3～7水、甲醇、乙醇、1-辛醇、二氯甲烷、乙酸乙酯，制得6批产物。计算这6批产物经过一次重结晶纯化后RRT1.07的含量降低程度，结果RRT1.07的含量降低均在14.2～32.3%范围内，远比使用本发明无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂时含量降低高达70%的低。

[0194] 比较实施例2：参照本文实施例1步骤(3)的操作，不同的仅是将其中第一溶剂即无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂1：5体积比改为1：1、1：10、或1：15，制得3批产物。计算这3批产物经过一次重结晶纯化后RRT1.07的含量降低程度，结果RRT1.07的含量降低均在
26.5～42.8%范围内，远比使用本发明特定比例的无水乙醇-乙酸乙酯混合溶剂低。

[0195] 比较实施例3：参照本文实施例1步骤(3)的操作，不同的仅是将其中第二溶剂即正己烷替换为叔丁基甲基醚、正庚烷、或正戊烷，制得3批产物。计算这3批产物经过一次重结晶纯化后RRT1.07的含量降低程度，结果RRT1.07的含量降低均在19.6～30.5%范围内，远比使用本发明用正己烷低。

[0196] 制备例1：制备甲磺酸艾日布林对照品

[0197] 在33～36℃的温度下，将以上实施例4所得甲磺酸艾日布林原料药1.5g溶解于二氯甲烷10ml中，缓缓向其中滴加正戊烷100ml，静置使充分沉淀(约24小时)，滤出沉淀，用正戊烷洗涤，真空干燥，即得(重结晶收率65.4%)。其经【HPLC-A】测定，RRT1.07含量=0.11%，RRT1.29含量=0.06%，HPLC纯度99.73%。其可作为本发明试验用的甲磺酸艾日布林对照品。

[0198] 制备例2：制备RRT1.07杂质和RRT1.29杂质

[0199] 取上文实施例1步骤(1)所得式I化合物(粗品)，以制备型的C18柱(Pinnacle II C18HPLC制备柱，柱子尺寸：内径50mm×柱长250mm，货号9214570，购自明尼克公司)，以本发明【HPLC-A】中流动相A为洗脱溶剂，分别收集RRT1.07杂质和RRT1.29杂质的洗脱峰，两份洗脱液分别减压除溶剂；将得到的残余物分别参照上文制备例1的方式进行结晶沉淀以纯化，纯化2次，分别得到RRT1.07杂质和RRT1.29杂质。两种杂质照本发明【HPLC-A】测定，色谱纯度分别为98.2%和98.5%。它们可作为本发明试验用的RRT1.07杂质和RRT1.29杂质。

[0200] 试验例1：本发明原料药的性能测试

[0201] 测试实施例1步骤(3)、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5步骤(3)、实施例6步骤(3)、和制备例1所得甲磺酸艾日布林T等的理化数据，结果如下：

[0202] (1)外观性状：均为白色粉末。

[0203] (2)TG-DTA：均在193～208℃范围内分解。

[0204] (3)X-射线粉末衍射：在2θ角0～40度之间扫描，均显示为典型的无定形衍射谱。

[0205] (4)比旋度：在20℃下测定，浓度5mg/mL，溶剂DMSO，制备例1产物的比旋度为-192.1°。

[0206] (5)单晶X-射线衍射：测试实施例1步骤(1)所得式I化合物(参照制备例1方法进行重结晶纯化以使色谱纯度达到98.0%以上)的单晶X-射线衍射，显示其构型与下式相符：

[0207]

[0208] (6)NMR谱：制备例1制备的甲磺酸艾日布林对照品的1H NMR谱和13C NMR谱显示与式Ia结构相符，具体数据如下：

[0209]位置 1H(J=Hz) 13C 位置 1H(J=Hz) 13C
0a 2.46(m) 48.5 19’a 5.01(brd) 105.1
0b 2.66(m) 48.5 19’b 5.11(brd,2) 105.1
1 - 208.0 20 4.47(brd,11) 75.4
2a 2.30(brd,17) 49.5 21a 1.42(m) 31.1
2b 2.73(dd,17,10) 49.5 21b 2.02(m) 31.1
3 3.97(m) 74.3 22a 1.46(m) 32.8
4ax 1.34(m) 32.2 22b 1.77(m) 32.8
4eq 1.60(m) 32.2 23 3.83(brdd,11,11) 74.5
5ax 1.38(m) 31.2 24ax 1.02(ddd,12,12,11) 45.1
5eq 2.01(m) 31.2 24eq 1.76(m) 45.1
6 4.28(m) 69.9 25 2.35(m) 36.7
7 2.93(dd,10,2) 78.5 25’ 1.12(3H,d,6) 18.5
8 4.29(m) 75.4 26 - 153.3
9 4.12(dd,7,4) 74.5 26’a 4.82(brs) 105.1
10 4.16(dd,7,4) 77.7 26’b 4.85(brs) 105.1
11 4.61(dd,5,4) 84.0 27 3.74(brd,11) 76.1
12 4.71(dd,5,5) 82.6 28a 1.86(m) 39.5
13a 1.96(dd,13,5) 49.4 28b 2.07(m) 39.5
13b 2.09(d,13) 49.4 29 3.86(m) 82.3
14 - 111.0 30 2.46(m) 44.6
15a 1.55(m) 36.4 31 3.37(d,3) 88.5
15b 2.19(m) 36.4 31’ 3.42(3H,s) 57.4
16a 1.45(m) 29.8 32 3.89(m) 78.4
16b 2.18(m) 29.8 33a 1.84(m) 34.7
17 4.10(m) 78.1 33b 1.92(m) 34.7
18a 2.36(m) 40.1 34 3.96(m) 66.8
18b 2.86(m) 40.1 35a 2.89(dd,13,9) 45.8
19 - 154.3 35b 3.06(dd,13,3) 45.8
甲磺酸根 2.68(3H,s) 39.5

[0210] 试验例2：RRT1.07杂质和RRT1.29杂质的理化性能测试

[0211] 在本试验例中测试了制备例2所得RRT1.07杂质和RRT1.29杂质的理化数据，结果如下：

[0212] (1)经质谱、元素分析等方法测定，确定RRT1.07杂质的分子式为C40H59NO11，分子量为729.90。

[0213] 综合本文测试结果，根据化学合成原理可合理地推测到该杂质是在CN1216051C中的最后阶段，B1793进行甲磺酸酯化反应的过程中，可能会与另外一个羟基进行酯化，接着该酯化产物以类似于B2294所进行的后续叠氮化和氨基化反应以及可能的构型翻转，最终形成具有本发明所述的作为杂质的式Ix化合物。另外，本发明实施例6中不是经叠氮化而是形成环氧化物中间体，同样根据化学合成原理可合理地推测到在该环氧化物C34位碳可与氨反应并发生构型翻转而形成作为杂质的式Ix化合物。本发明上下文的测试结果证实了上述推测与RRT1.07杂质化学结构的一致性。

[0214] 经质谱、元素分析等方法测定，确定RRT1.29杂质的分子式为C40H61NO12，分子量为747.91。根据化学合成原理可合理地推测到该杂质是为原料药和制剂的降解产物，并且在反应的最后阶段特别是例如本文从包括两个羟基的化合物B1793开始后续合成步骤中也会产生该杂质，该物质是式I化合物在C14位经缩酮水解的产物。本发明上下文的测试结果证实了上述推测与RRT1.29杂质化学结构的一致性。

[0215] (2)NMR谱：RRT1.07杂质的1H NMR谱和13C NMR谱显示与式Ix结构相符，RRT1.291 13
杂质的 H NMR谱和 C NMR谱显示与式Iy结构相符。

[0216] RRT1.07杂质：在CD3OD中测试RRT1.07杂质，结果如下表(600MHz，30℃，质子和碳的位置标注参见下面的结构)：

[0217]

[0218]位置 1H(J=Hz) 13C 位置 1H(J=Hz) 13C
0a 2.44(m) 48.5 19’a 5.01(brd) 105.2
0b 2.68(m) 48.5 19’b 5.12(brd,2) 105.2
1 - 208.2 20 4.48(brd,11) 75.5
2a 2.32(brd,17) 49.3 21a 1.41(m) 31.1
2b 2.71(dd,17,10) 49.3 21b 2.01(m) 31.1
3 3.95(m) 74.6 22a 1.47(m) 32.6

[0219]4ax 1.31(m) 32.2 22b 1.78(m) 32.6
4eq 1.72(m) 32.1 23 3.84(brdd,11,11) 74.6
5ax 1.37(m) 31.3 24ax 1.03(ddd,12,12,11) 45.0
5eq 2.01(m) 31.3 24eq 1.77(m) 45.0
6 4.30(m) 69.7 25 2.34(m) 36.6
7 2.93(dd,10,2) 78.5 25’ 1.12(3H,d,6) 18.5
8 4.29(m) 75.5 26 - 153.1
9 4.12(dd,7,4) 74.5 26’a 4.83(brs) 105.1
10 4.18(dd,7,4) 77.6 26’b 4.84(brs) 105.1
11 4.61(dd,5,4) 84.1 27 3.74(brd,11) 76.2
12 4.70(dd,5,5) 82.4 28a 1.86(m) 39.5
13a 1.98(dd,13,5) 49.4 28b 2.08(m) 39.5
13b 2.08(d,13) 49.4 29 3.86(m) 82.4
14 - 111.0 30 2.47(m) 44.7
15a 1.55(m) 36.4 31 3.36(d,3) 88.4
15b 2.19(m) 36.4 31’ 3.43(3H,s) 57.5
16a 1.45(m) 29.7 32 3.88(m) 78.5
16b 2.18(m) 29.7 33a 1.89(m) 30.7
17 4.08(m) 78.1 33b 1.96(m) 30.7
18a 2.36(m) 40.1 34 2.97(m) 45.3
18b 2.88(m) 40.1 35a 3.98(m) 70.3
19 - 154.3 35b 4.02(m) 70.3

[0220] RRT1.29杂质：在CD3OD中测试RRT1.29杂质，结果如下表(600MHz，30℃，质子和碳的位置标注可类似于上面Ix的结构)：

[0221]位置 1H(J=Hz) 13C 位置 1H(J=Hz) 13C
0a 2.44(m) 48.5 19’b 5.11(brd,2) 105.2
0b 2.67(m) 48.5 20 4.48(brd,11) 75.5
1 - 208.2 21a 1.41(m) 31.1
2a 2.32(brd,17) 49.3 21b 2.01(m) 31.1
2b 2.71(dd,17,10) 49.3 22a 1.47(m) 32.6
3 3.94(m) 74.6 22b 1.78(m) 32.6
4ax 1.31(m) 32.2 23 3.84(brdd,11,11) 74.6
4eq 1.72(m) 32.1 24ax 1.03(ddd,12,12,11) 45.0
5ax 1.37(m) 31.3 24eq 1.77(m) 45.0

[0222]5eq 2.01(m) 31.3 25 2.34(m) 36.6
6 4.30(m) 69.7 25’ 1.12(3H,d,6) 18.5
7 2.93(dd,10,2) 78.5 26 - 153.1
8 4.26(m) 71.5 26’a 4.83(brs) 105.1
9 4.15(dd,7,4) 81.3 26’b 4.84(brs) 105.1
10 4.28(dd,7,4) 84.4 27 3.74(brd,11) 76.2
11 4.61(dd,5,4) 80.2 28a 1.86(m) 39.5
12 4.73(dd,5,5) 86.8 28b 2.08(m) 39.5
13 2.37(2H,d) 43.4 29 3.86(m) 82.4
14 - 201.2 30 2.47(m) 44.7
15 2.66(2H,m) 36.9 31 3.36(d,3) 88.4
16a 1.45(m) 29.7 31’ 3.43(3H,s) 57.5
16b 2.18(m) 29.7 32 3.88(m) 78.5
17 4.08(m) 78.1 33a 1.84(m) 34.7
18a 2.36(m) 40.1 33b 1.90(m) 34.7
18b 2.88(m) 40.1 34 3.95(m) 66.9
19 - 154.3 35a 2.88(dd,13,9) 45.8
19’a 5.02(brd) 105.2 35b 3.06(dd,13,3) 45.8

[0223] (3)单晶X-射线衍射：分别测试RRT1.07杂质和RRT1.29杂质的单晶X-射线衍射，显示其构型与上文式Ix和式Iy相符。

[0224] 试验例3：原料药的稳定性考察

[0225] 取以上制备的各种物料，以及由制备例1制得的甲磺酸艾日布林对照品与制备例2制得的RRT1.07杂质(和/或杂质RRT1.29)以一定比例混合(以少许无水乙醇溶解，随即真空干燥以使它们充分混合，测定其中Ix和/或Iy相对于式I的含量)制成组配物，将这些物料密封，在38℃条件下密封、避光放置6个月，计算在此条件下处置6个月后某杂质相对于0月时的含量增加百分数。结果见表1。

[0226] 表1：

[0227]

[0228]

[0229] 以上结果显示，不论是对于式I游离碱，还是其药用盐例如甲磺酸盐，当其中Ix含量低于/等于1.7%时，在6个月后，Iy这种杂质的含量增加百分数均低于75%，特别是均低于50%，而当其中Ix含量大于1.7%时，在6个月后，Iy这种杂质的含量增加百分数均高于75%，特别是均高于于100%，特别是均高于于130%，显著大于Ix含量低于/等于1.7%时的情形。

[0230] 组合物例1：以实施例1步骤(3)产物为原料制备注射液，配方为：原料药0.5mg、无水乙醇0.05ml、注射用水适量加至1ml。制备方法(以1000ml量配制)：将原料药用乙醇溶解，接着加水至全量，测定溶液的pH值，必要时用1M氢氧化钠或者1M盐酸调节溶液的pH值至7.0，过滤除菌，分装到玻璃瓶中，2ml/瓶，密封，即得。其有关物质测定的HPLC图见图2。经38℃-4月考察，结果Iy杂质的含量增加百分数为37.3%。

[0231] 组合物例2：以实施例1步骤(3)产物为原料制备粉针剂，配方为：原料药1mg、甘露醇150mg、注射用水适量加至2ml。制备方法(以1000ml量配制)：将原料药用适量注射用水溶解，加入甘露醇使溶解，接着加水至全量，测定溶液的pH值，必要时用1M氢氧化钠或者1M盐酸调节溶液的pH值至7.0，过滤除菌，分装到玻璃瓶中，2ml/瓶，冷冻干燥，密封，即得。经38℃-4月考察，结果Iy杂质的含量增加百分数为32.8%。

[0232] 组合物例3：以实施例6步骤(4)产物为原料制备片剂，配方为：原料药5mg、乳糖50mg、微晶纤维素60mg、羟丙基甲基纤维素2mg(用水制成5%溶液作为粘合剂使用)、微粉硅胶1mg，按常规的片剂制备方法压制成片剂，即得。经38℃-4月考察，结果Iy杂质的含量增加百分数为31.3%。图2显示了该片剂测定有关物质时的典型HPLC图，图中显示式I化合物在28.707min处出峰，在30.850min处显示有Ix杂质(RRT的具体值为1.075)，在
37.331min处显示有Iy杂质(RRT的具体值为1.300)。

[0233] 组合物例4：照组合物例1的配方和方法，分别以表1之No13至No29所用的试样为原料，制备得到17种注射液。经38℃-4月考察Iy杂质的含量增加百分数，结果：No13至No20、No26所用的试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数均在11～38%范围内；但是对于No21至No25、No27至No29所用的试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数均在136～364%范围内。

[0234] 组合物例5：照组合物例2的配方和方法，分别以表1之No13至No29所用的试样为原料，制备得到17种粉针剂。经38℃-4月考察Iy杂质的含量增加百分数，结果：No13至No20、No26所用的试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数均在9～36%范围内；但是对于No21至No25、No27至No29所用的试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数均在127～337%范围内。

[0235] 组合物例6：照组合物例3的配方和方法，分别以表1之No26至No29所述组配物13至组配物16的试样为原料，制备得到4种片剂。经38℃-4月考察Iy杂质的含量增加百分数，结果：No26试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数为36.3%；但是对于No27至No29试样为原料所得药物组合物的Iy杂质含量增加百分数均在143～365%范围内。

[0236] 以上各组合物例的结果显示，使用含有不同量的Ix杂质的式I化合物或式Ia化合物为原料药，制成的药物组合物(包括溶液型和固体型的制剂)，它们在Ix杂质相对于式I化合物的含量低于1.7%时均显示组合物具有良好的稳定性，杂质Iy增长量低，但是当Ix杂质含量高于1.7%时组合物中的杂质Iy增长量显著增加。

[0237] 试验例4：生物学试验

[0238] 本试验例考察相关物质对小鼠血液中的中性粒细胞的影响。

[0239] (1)动物：BALB/c小鼠，雌性6～8周龄，购自广东省动物实验中心。

[0240] (2)试药：使用本发明制备例1所得式Ia对照品、制备例2所得Ix杂质、Iy杂质、实施例6步骤(4)的式I化合物、它们的混配物进行测试，使用生理盐水配制成适宜浓度的无菌溶液。

[0241] (3)分组：小鼠随机分组，每组10只；具体组别如下：

[0242] a)对照组：注射与各给药组等体积的生理盐水；b)化合物Ia组：制备例1所得式Ia对照品；c)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=0.52%(由适量Iy和适量Ia混配，该0.52%是以【HPLC-A】测定的，IyIy相对于I的量计算的结果；下同)；d)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=1.51%；e)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=2.15%；f)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=2.75%；g)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=3.35%；h)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=4.25%；i)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=6.5%；j)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=10.5%；k)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=22.5%；l)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=45.3%；m)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=83.5%；n)杂质Iy组：制备例2所得Iy杂质；
o)杂质Ix组：制备例2所得Ix杂质；p)I/Iy混配组：I/Iy组配，含Iy=1.53%；q)I/Iy混配组：I/Iy组配，含Iy=2.72%；r)I/Iy混配组：I/Iy组配，含Iy=3.35%；s)I/Iy混配组：I/Iy组配，含Iy=6.55%；t)I/Iy混配组：I/Iy组配，含Iy=23.1%；u)组合物例1组。

[0243] (4)剂量、给药、方法：各动物在给药前至少饲养48小时，于-24小时、0小时时眼眶取血，按常规细胞计数法(使用美国Coulter公司生产的血常规自动分析仪测定)对中性粒细胞计数，计算每组动物在每个时间点的中性粒细胞数均值(该均值在以下可简写为PNG，0小时的该均值可简写为PNG0)，对于每组动物，-24小时与0小时两个时间点的PNG相差不超过3%。分别于0小时、24小时、48小时经腹腔注射给予各组试药3次，每次给予总化合物量(以式I化合物、式Ix化合物、式Iy化合物、或其总和计)50μmol/kg动物体重，例如对于j)Ia/Iy混配组，Ia(以I计)和Iy二者的总和计50μmol/kg动物体重的剂量。在第54小时(即末次给药后6小时)各动物眼眶取血，按常规细胞计数法对中性粒细胞计数，计算每组动物在第54小时时的中性粒细胞数均值(该均值简写为PNG56)。

[0244] (5)结果计算：按下式计算每组动物的中性粒细胞相对数：

[0245] 中性粒细胞相对数(%)=(PNG56÷PNG0)×100%

[0246] 以上中性粒细胞相对数反映外周血中中性粒细胞的变化情况，该参数越接近于100%表明血液中的中性粒细胞变化越小，该参数低于100%时，数值越低则表明中性粒细胞减少越多，该参数大于100%时表明中性粒细胞增加。结果见表2。

[0247] 表2

[0248]组别中性粒细胞相对数组别中性粒细胞相对数
a)对照组 102.2% l)Ia/Iy混配组 3.31%
b)化合物Ia组 99.8% m)Ia/Iy混配组 1.72%
c)Ia/Iy混配组 103.6% n)杂质Iy组 1.14%
d)Ia/Iy混配组 102.6% o)杂质Ix组 95.8%
e)Ia/Iy混配组 99.5% p)I/Iy混配组 100.8%
f)Ia/Iy混配组 96.7% q)I/Iy混配组 97.1%
g)Ia/Iy混配组 54.5% r)I/Iy混配组 51.3%
h)Ia/Iy混配组 45.2% s)I/Iy混配组 35.2%
i)Ia/Iy混配组 37.5% t)I/Iy混配组 13.1%
j)Ia/Iy混配组 23.2% u)组合物例1组 101.3%
k)Ia/Iy混配组 11.4%

[0249]

[0250] 对于n)组，中性粒细胞计数由第0小时时的4580个/μL，降低至第54小时时的52个/μL。对于Iy含量低于2.8%组配物，血液中的中性粒细胞数基本没有变化，但是当Iy含量大于3%，特别是大于5%，更特别是大于10%时，血液中的中性粒细胞数急剧降低，这对于受试者维持正常的机体功能特别是正常的免疫功能是极为不利的。式I化合物均显示与式Ia类似的组合结果。

[0251] 试验例5：生物学试验

[0252] 本试验例考察相关物质对大鼠血液中的中性粒细胞的影响。

[0253] (1)动物：6周雄性SD大鼠，雌雄兼用，体重180～220g，购于广东省动物实验中心。

[0254] (2)试药：使用本发明制备例1所得式Ia对照品、制备例2所得Ix杂质、Iy杂质、实施例6步骤(4)的式I化合物、它们的混配物进行测试，使用生理盐水配制成适宜浓度的无菌溶液。

[0255] (3)分组：小鼠随机分组，每组3只；具体组别如下：

[0256] a)对照组：注射与各给药组等体积的生理盐水；b)化合物Ia组：制备例1所得式Ia对照品；c)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=0.75%(混配方法同试验例4；下同)；d)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=1.70%；e)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=2.75%；f)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=3.75%；g)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=5.15%；h)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=8.55%；i)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=20.3%；j)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=45.3%；k)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=80.7%；l)杂质Iy组：制备例
2所得Iy杂质；m)组合物例2组。

[0257] (4)剂量、给药、方法：同试验例4。

[0258] (5)结果计算：计算每组动物在第54小时时的中性粒细胞相对数，结果见表3。

[0259] 表3

[0260]组别中性粒细胞相对数组别中性粒细胞相对数
a)对照组 101.5% h)Ia/Iy混配组 54.3%
b)化合物Ia组 99.3% i)Ia/Iy混配组 41.2%
c)Ia/Iy混配组 101.6% j)Ia/Iy混配组 33.7%
d)Ia/Iy混配组 100.5% k)Ia/Iy混配组 27.3%
e)Ia/Iy混配组 98.7% l)杂质Iy组 22.6%
f)Ia/Iy混配组 74.6% m)组合物例2组 98.7%
g)Ia/Iy混配组 62.2%

[0261] 对于l)组，中性粒细胞计数由第0小时时的3250个/μL，降低至第54小时时的735个/μL。

[0262] 试验例6：药物性质考察

[0263] 本试验例考察相关物质对人体血液中的中性粒细胞的影响。

[0264] (1)受试者：健康志愿者9人，随机分成3组，3人/组，男性，体重60～70kg。

[0265] (2)试药及组别：a)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=1.5%；b)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=5.1%；c)Ia/Iy混配组：Ia/Iy组配，含Iy=25.0%。

[0266] (3)剂量及给药：将混配物制成注射液，以受试者每1平方米体表面积给予Ia和Iy总和20μmol的剂量在第1天和第7天各给药一次，静脉注射。对于每名受试者，在首次给药前测定其血液中的中性粒细胞计数(N0)，接着在末次给药之后的48小时时测定其血液中的中性粒细胞计数(N1)。计算每名受试者在试验结束时血液中的中性粒细胞相对数，计算式为：

[0267] 中性粒细胞相对数(%)=(N1÷N0)×100%

[0268] 结果：a)组三名受试者的中性粒细胞相对数均在96.3～102.6%范围内，显示中性粒细胞数未见降低；b)组三名受试者的中性粒细胞相对数均在37.7～51.3%范围内，显示中性粒细胞数显著降低；c)组三名受试者的中性粒细胞相对数均在12.4～26.7%范围内，个别受试者在试验结束时血液中的中性粒细胞数降至450个/μL，显示中性粒细胞数显著降低。

[0269] 试验例7：药物性质考察

[0270] 取实施例1步骤(3)产物(Ia原料药)、实施例2产物(Ia原料药)、实施例3产物(Ia原料药)、实施例4产物(Ia原料药)、实施例5步骤(3)产物(Ia原料药)、实施例6步骤(3)产物(Ia原料药)、实施例6步骤(4)产物(I原料药)这7种原料药，制备例1产物(Ia对照品)，组合物例1注射液(Ia组合物)、组合物例2粉针剂(Ia组合物)、组合物例3片剂(I组合物)这3种组合物的各物料，测定它们在0月时、以及经40℃密封处理
6个月后的主成分色谱纯度(【HPLC-A】，面积归一化法计算，扣除溶剂、甲磺酸根、辅料等色谱峰)、RRT1.07含量、RRT1.29含量。

[0271] 结果：全部物料在0月时的色谱纯度均在98.5%～99.9%范围内，RRT1.07含量均在0.11～0.98%范围内，RRT1.29含量均在0.06～0.47%范围内，显示这些物料作为药物的原料药或者制剂具有良好的药学性能。在经40℃-6月后，全部物料的色谱纯度均在97.3%～99.2%范围内，RRT1.07含量均在0.16～1.43%范围内，RRT1.29含量均在0.18～
0.86%范围内，显示这些物料作为药物的原料药或者制剂具有良好的特定性。

[0272] 当以制备例1产物即Ia对照品作为对照，测定这7种原料药时，其中主成分(式I或式Ia化合物)的含量在97.0%～102.0%范围内。

[0273] 以上全部HPLC测试中，包括对照例和对照组合物例的样品，经多次测试(不同人员、不同仪器、不同实验室)，它们的RRT1.07杂质相对保留时间均在1.06～1.09范围内，RRT1.29杂质相对保留时间均在1.27～1.31范围内。

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