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中药复方药物组合物的用途

阅读：620发布：2023-01-23

专利汇可以提供中药复方药物组合物的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了含有下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。本发明还公开了早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液及诱导分化方法。本发明诱导液可以诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞分化为累卵细胞，临床应用前景良好。，下面是中药复方药物组合物的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：川牛膝9份、龟板胶12份。
2.下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：川牛膝9份、龟板胶12份熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述原料药中，熟地为24份、山茱萸为9-12份、山药为12份、枸杞子为9-12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述原料药中，熟地为24份、山茱萸为12份、山药为12份、枸杞子为12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份。
5.一种诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、取早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞；
b、置于诱导液中培养，培养时间不低于5天，即得类卵母细胞；
所述诱导液是以MEME培养液为基础培养液，添加有40～60IU/ml青霉素、40～60mg/ml 链霉素和2～20％v/v的含药血清；所述含药血清按照如下方法制备：
(1)按照权利要求1～4任意一项所述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；
(2)给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即为含药血清。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤b中，培养时间为5～24天。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述青霉素的浓度为50IU/ml、所述链霉素的浓度为50mg/ml，所述含药血清的浓度为5～10％v/v。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，静置的时间为2h，离心转速为
3000rpm，离心时间为10min。

说明书全文

中药复方药物组合物的用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药复方药物组合物的新用途，具体地，是在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途。

背景技术

[0002] 近年来，由于环境污染严重、工作压力加大、饮食习惯改变、生殖系统疾病等因素对正常受孕造成不利影响，不孕症患者数量呈上升势头，发病率约为12.5％～15％，且有逐年增加趋势。因此世界卫生组织(WHO)宣布将不孕症与心血管病、肿瘤并列为当今影响人类生活和健康的三大主要疾病。自1978年全球首例试管婴儿诞生以来，以体外授精-胚胎移植(IVF-ET)为代表的辅助生殖技术(ART)的引入给不孕不育症的成功治疗提供了更大的可能。助孕的相关研究对于解决不孕不育患者的实际问题具有现实的意义。

[0003] 体外受精(IVF)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。目前，体外受精包括促排卵、卵泡检测与取卵、精子的优选与处理和体外受精步骤。诱发多个卵泡发育的促排卵是不孕治疗的重要基础，此环节早时使用自然周期排卵，但每一自然周期一般仅有一个卵泡成熟，提供卵子少，导致实施以后步骤困难，且妊娠率低，现已被超排卵技术所取代。超排卵技术是指应用人类促性腺激素促进更多卵泡成熟排卵的一种技术。但由于此过程多个同时发育，雌二醇增加，引起反馈性的黄体生成素(LH)峰出现，导致卵子早熟，质量差，妊娠率低，而且因药物过度使用引起的并发症，如卵巢过度刺激综合征(OHSS)、多胎妊娠、出生缺陷和表遗传学修饰异常等。

[0004] 补肾中药介入辅助生殖技术，具有调经、助孕、促卵泡发育及排卵、提高卵细胞质量以及提高卵子受精率、促进早期胚胎发育的作用，已得到证实。补肾中药的上述作用与激素、细胞因子等因素有关。目前在辅助生殖技术中与补肾中药联系较为紧密的环节主要是超促排卵和胚胎移植。研究主要以卵细胞质量、体外受精及胚胎发育、子宫内膜容受性为切入点。

[0005] 左归丸和右归丸出自明代温补名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》，为补益肾阴、肾阳的经典方。有研究表明左归丸可以促进胚胎干细胞增殖、维持其不分化状态，阻滞胚胎干细胞凋亡(胡兵,安红梅,史云峰等中国中医基础医学杂志2007年第13卷第5期365-367)。也有文献报道左归丸含药血清在间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)向软骨细胞定向分化过程中可促进MSCs增殖，并提高Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达(左归丸对间充质干细胞向软骨细胞分化过程中Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响徐凌霄王芳郭敦明等中国中西医结合杂志2011年12月第31卷第12期1662-1668)。左归丸水提液在一定浓度范围内可以提高大鼠骨髓间充质干细胞的体外增殖能力(左归丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响谭峰，樊巧玲，王明艳等中国实验方剂学杂志第17卷第13期2011年7月
145-148)。综上，补肾中药复方左归丸可以促进胚胎干细胞和间充质干细胞的增殖，并影响间充质肝细胞的胶原、蛋白多糖基因表达，未见关于其影响干细胞分化的报道。

发明内容

[0006] 本发明的技术方案是提供了一种中药复方药物组合物的新用途。具体地，是在制备用于诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞分化为类卵细胞中的用途。

[0007] 早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞，First Trimester-derived Perivascular Cells，简称FTM-PVCs，来源于早孕流产胚胎脐带，具有很强的自我增殖的能力，可诱导分化为多种类型的细胞。

[0008] 类卵细胞，是指具有卵细胞样结构，表达卵细胞标志物的细胞。

[0009] 本发明含有下述重量配比的原料药在制备早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液中的用途：川牛膝1-16份、龟板胶1-16份。

[0010] 优选地，所述的原料药的重量配比为：川牛膝9份、龟板胶12份。

[0011] 其中，所述的原料药中还含有熟地18-30份、山茱萸9-12份、山药8-16份、枸杞子9-12份、菟丝子8-16份、鹿角胶8-16份。

[0012] 优选地，熟地为24份、山茱萸为9-12份、山药为12份、枸杞子为9-12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份。

[0013] 进一步优选地，熟地为24份、山茱萸为12份、山药为12份、枸杞子为12份、菟丝子为12份、鹿角胶为12份。

[0014] 本发明早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的诱导液，它以MEME培养液为基础培养液，添加有50IU/ml青霉素、50mg/ml 链霉素和2～20％(v/v)的含药血清；所述含药血清按照如下方法制备：

[0015] (1)按照前述配比取原料药，制备成为超细粉，以5.0g/kg的剂量施用于鼠，施用方式为口服给药；

[0016] (2)给药30min、60min、90min后，眼底静脉丛取血，分别静置、离心得上清液，混匀，即为含药血清。

[0017] 所述青霉素的浓度为50IU/ml、所述链霉素的浓度为50mg/ml，所述含药血清的浓度为5～10％(v/v)。

[0018] 步骤(2)中，静置时间为2h，离心转速为3000rpm，离心时间为10min。

[0019] 本发明诱导早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞定向分化为类卵细胞的方法，包括如下步骤：

[0020] a、取早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞；

[0021] b、置于前述的诱导液中培养，培养时间不低于5天，即得类卵母细胞。

[0022] 步骤b中，培养时间为5～24天。

[0023] 本发明补肾中药复方左归丸及其拆方组份可以促进早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞(FTM-PVCs)分化为类卵细胞，具有重要意义，为试管婴儿领域开拓新思路、新途径。

[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

[0025] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明

[0026] 图1含3号药鼠血清可诱导人FTM-PVCs出现类卵丘-卵细胞结构，放大倍数10×10。A.培养5天后2％、5％、10％、20％含3号药鼠血清组细胞形态学变化；B.培养17天后2％、
5％、10％、20％含3号药鼠血清组细胞形态学变化；

[0027] 图2含3号药鼠血清可诱导人FTM-PVCs微弱表达卵细胞标志物，放大倍数20×10。A.Positive control组；B.5％含3号药鼠血清组表达卵细胞标志物；C.10％含3号药鼠血清组表达卵细胞标志物；D.5％空白鼠血清组不表达卵细胞标志物；

[0028] 图3含5号药鼠血清可诱导人FTM-PVCs出现类卵细胞样结构，放大倍数10×10。A.培养5天后5％含5号药鼠血清组细胞聚集并与周围边界明显；B.培养17天后5％含5号药鼠血清组细胞聚集成团，边缘有网状结构出现；

[0029] 图4 5％含5号药鼠血清可诱导人FTM-PVCs表达卵细胞标志物，放大倍数20×10。A.control组；B.5％含5号药鼠血清组表达卵细胞标志物；C.5％空白鼠血清组不表达卵细胞标志物。

具体实施方式

[0030] 实施例1本发明药物的制备

[0031] 取川牛膝9g、龟板胶12g，粉碎成细粉，过筛混匀，烘干密封保存，兑水服用，或每100g粉末加炼蜜10g与适量的水。

[0032] 实施例2本发明药物的制备

[0033] 取川牛膝1g、龟板胶1g，按实施例1方法制备。

[0034] 实施例3本发明药物的制备

[0035] 取川牛膝16g、龟板胶16g，按实施例1方法制备。

[0036] 实施例4本发明药物组合物1的制备(左归丸)

[0037] 称取原料：熟地黄200g、菟丝子100g、牛膝75g、龟板胶100g、鹿角胶100g、山药100g、山茱萸100g、枸杞子100g；

[0038] 制备方法：以上八味，除鹿角胶、龟板胶外，其余熟地黄等六味粉碎成细粉，过筛混匀。取鹿角胶、龟板胶烊化，与上述细粉混匀。每100g粉末加炼蜜10g与适量的水，泛丸，干燥，即得；或不加蜜，仅为粉末散剂。

[0039] 实施例5本发明药物组合物1的制备

[0040] 称取原料：熟地黄18g、菟丝子8g、牛膝1g、龟板胶1g、鹿角胶8g、山药8g、山茱萸9g、枸杞子9g；

[0041] 按照实施例4的方法制备。

[0042] 实施例6本发明药物组合物1的制备

[0043] 称取原料：熟地黄30g、菟丝子12g、牛膝16g、龟板胶16g、鹿角胶16g、山药16g、山茱萸12g、枸杞子16g；

[0044] 按照实施例4的方法制备。

[0045] 上述原料可以用原生药，也可以用原生药的炮制品。

[0046] 以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。

[0047] 名词解释：

[0048] FTM-PVCs：First Trimester-derived Perivascular Cells早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞

[0049] FSH：follicle-stimulating hormone卵泡雌激素

[0050] LH：Luteinizing Hormone黄体生成素

[0051] E2：Estradiol雌二醇

[0052] FF:Follicular fluid卵泡液

[0053] GDF-9：Growth differentiation facter 9生长分化因子9

[0054] GDF-9B：Growth differentiation facter 9B生长分化因子9B

[0055] SCP1：Synaptonemal Complex Protein 1联会复合体蛋白质1

[0056] SCP2：Synaptonemal Complex Protein 2联会复合体蛋白质2

[0057] SCP3：Synaptonemal Complex Protein 3联会复合体蛋白质3

[0058] ZP-1：zona pellucida glycoprotein1透明带糖蛋白1

[0059] ZP-2：zona pellucida glycoprotein2透明带糖蛋白2

[0060] ZP-3：zona pellucida glycoprotein3透明带糖蛋白3

[0061] 实验例1本发明诱导液诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞

[0062] 1、实验材料

[0063] 1.1实验仪器

[0064] 早孕流产胚胎脐带血管周围干细胞，即妊娠第一周期脐带组织细胞(Human first trimester umbilical cord cells)，购自CReATe脐血库。

[0065] 超声波清洗器(Ultrasonic cleaner)：昆山市超声仪器有限公司，KQ5200B；

[0066] 电子天平(Electronic balance)：瑞士梅特勒-托利多公司，AB 265-5；

[0067] 纯水机(Ultra-Pure Water Processor)：中国优普公司，UPR-IV-10T；

[0068] 超纯水系统(Ultra-pure water system)：英国ELGA公司，UHQ2；

[0069] CO2细胞培养箱(CO2Cell Culture Incubator)：美国Thermo Scientific公司，3111；

[0070] 双人单面超净工作台(Double-person Single-face Super-clean Bench):中国苏州净化公司，SW-CJ-2FD；

[0071] 全波长紫外光/可见光分光光度计(Full Range Wavelength UV/Vis Spectrophotometer)：美国Beckman coulter公司，型号：DU730；

[0072] 普通PCR仪(General PCR System)：美国MJ Research公司，PTC-200；

[0073] CO2浓度检测仪(CO2Concentration Detector)：德国Labotect公司，InControl 1050；

[0074] 正置荧光显微镜(Upright Fluorescence Microscope)：德国Leica公司，DM4000B；

[0075] 倒置显微镜(Inverted Microscope):德国Leica公司，DMI3000B；

[0076] 倒置显微镜(Inverted Microscope):日本Olympus公司，CK-40；

[0077] 人工授精(IVF)工作站(IVF Working Station)：丹麦Labogene公司，F-1800；

[0078] -80℃超低温冰箱(-80℃Ultra-low Temperature Freezer):日本Sanyo公司，MDF-U73C；

[0079] -40℃低温冰箱(-40℃Low Temperature Freezer):日本Sanyo公司，MDF-U5412；

[0080] 4℃冰柜(4℃Refrigerator):日本Sanyo公司，MPR-1411R；

[0081] 大型台式冷冻离心机(Large-sized Desktop Centrifuge with Refrigerator)：美国Thermo Scientific公司，Sorvall Biofuge Stratos；

[0082] 台式冷冻离心机(Desktop Centrifuge with Refrigerator)：美国Thermo Scientific，Legend Micro 17R；

[0083] 台式离心机(Desktop Centrifuge)：美国Thermo Scientific公司，Micromax；

[0084] 体视显微镜(Stereo Microscope):日本Olympus公司，SZX10；

[0085] 电泳系统(Electrophoresis System)：美国Bio-Rad公司，MP4；

[0086] 洗板机(Microplate Washer)：美国Bio-Tek公司，ELx-50；

[0087] 培养摇床(Culturing shaking incubator)：中国上海智成公司，ZHWY-111B；

[0088] 大容量液氮罐(Large Volume Liquid Nitrogen Canister)：中国成都金凤公司，YDS-47-127；

[0089] 大容量液氮罐(Large volume liquid nitrogen canister)：美国MVE公司，XC47/11-10；

[0090] 高压灭菌锅(Autoclaver)：日本SANYO公司，MLS-3020；

[0091] 全波长酶标仪(Full Wavelength Microplate Reader)：美国Thermo Scientific公司，Multiskan；

[0092] 可见/紫外凝胶成像系统(Vis/UV Gel-Imaging System)：美国Bio-Rad公司，XR；

[0093] 精密pH计(pH Meter)：德国Sartorius公司，PP-15；

[0094] 恒温烤箱：上海精宏实验设备有限公司，DHG-9053A；

[0095] 恒温水浴锅：四川成都赛可隆机械设备有限公司，esun-0048；

[0096] 恒温磁力搅拌器：上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，H01-1A；

[0097] 0.1-2.5ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0098] 0.5-10ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0099] 10-100ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0100] 20-200ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0101] 100-1000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0102] 50-5000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0103] 100-10000ul手动单道可调式移液器：eppendorf；

[0104] 30-300ul 8道可调式移液器：eppendorf；

[0105] 10-100ul 8道可调式移液器：eppendorf。

[0106] 1.2实验材料

[0107] 无菌生理盐水：四川科伦药业股份有限公司

[0108] I型胶原蛋白酶：Sigma-Aldrich,St.Louis,USA

[0109] 胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)：Gibco-BRL,MD，USA

[0110] MEME培养基(Minimum Essential Medium Eagle)：Alpha Modification，Sigma-Aldrich，M4526

[0111] EB培养基(SCM018Embryoid Body Formation Medium)：millipore，MD,USA[0112] PBS：成都哈里生物

[0113] 抗生素(Penicillin-Streptomycin)：Gibco-BRL,MD，USA

[0114] 0.05％胰蛋白酶-0.01％EDTA：Gibco-BRL，MD，USA

[0115] 低粘附培养板：STEMCELL Technologies,BC,Canada

[0116] 六孔细胞培养板(6well cell culture plate)、十二孔细胞培养板(12well cell culture plate)：Labserv

[0117] 培养皿(60mm、100mm)：Corning costar

[0118] 通气盖75cm2、25cm2培养瓶：Corning costar、NUNC

[0119] 15ml锥形离心管：Corning costar

[0120] 50ml锥形离心管：Corning costar

[0121] 2ml一次性冻存管：Corning costar、NUNC

[0122] 盖玻片：24×24mm，江苏世泰实验器材有限公司

[0123] 一次性刻度塑料吸管2ml：Corning costar、Axygen

[0124] 一次性刻度塑料吸管5ml、10ml、25ml：Corning costar、Axygen

[0125] 一次性刻度塑料吸管50ml：KIMBLE

[0126] 八孔、四孔、二孔细胞小室(8well glass slide，4well glass slide,2well glass slide)：Lab-Tek

[0127] 10ul袋装吸头：Axygen

[0128] 200ul袋装吸头：Axygen

[0129] 200ul无菌盒装吸头：Axygen

[0130] 10ul无菌盒装吸头：Axygen

[0131] 1000ul袋装吸头：Axygen

[0132] 1000ul无菌盒装吸头：Axygen

[0133] 0.5ml离心管：Axygen

[0134] 1.5ml离心管：Axygen

[0135] 0.5ml薄壁管[平盖]：Axygen

[0136] 一抗：rabbit anti-OCT-4(1:200,Abcam)、rabbit anti-Nanog(1:100，Santa Cruz Biotechnology)、mouse anti-Fragilis/IFITM3(1:100，Santa Cruz Biotechnology)、rabbit anti-SCP1(1:200，Cell Signaling Technology)、rabbit anti-VASA(1:100，Santa Cruz Biotechnology)、rabbit anti-DAZL(1:100，Santa Cruz Biotechnology)、rabbit anti-STELLAR(1:200，Abcam)、rabbit anti-SCP3(1:200，Cell Signaling Technology)、rabbit anti-GDF-9(1:100，Abcam)、rabbit anti-GDF-9B(1:200，Santa Cruz Biotechnology)、rabbit anti-ZP1(1:200，Santa Cruz Biotechnology)、rabbit anti-ZP2(1:100，Sigma)、rabbit anti-ZP3(1:200，Santa Cruz Biotechnology)

[0137] 二抗：山羊抗兔(HRP，碧云天)，山羊抗小鼠(HRP，碧云天)，蓝色DyLight抗兔(Santa Cruz Biotechnology)、绿色FITC抗兔(Santa Cruz Biotechnology)[0138] Hoechst 33258:碧云天

[0139] 多聚甲醛：上海铭睿生物科技有限公司

[0140] Txiton X-100：Amresco

[0141] H2O2：成都科龙化工试剂厂

[0142] HRP-DAB底物显色试剂盒：碧云天

[0143] 苏木素：碧云天

[0144] DMSO分析纯：天津市瑞金特化学药品有限公司

[0145] 插入式细胞培养皿：millipore，0.4μm

[0146] 0.22μm滤膜：millipore

[0147] 注射用高纯度尿促性素(HMG):Ferring GmbH

[0148] 雌二醇(E2，Estradiol)：Cayman Chemical Company

[0149] 叶酸(Folic acid)：Sigma

[0150] 无水乙醇：成都科龙化工试剂厂

[0151] 异丙醇：成都科龙化工试剂厂

[0152] 三氯甲烷：成都科龙化工试剂厂

[0153] 抗荧光淬灭封片液：碧云天

[0154] 引物：上海捷瑞生物工程有限公司、英潍捷基(上海)贸易有限公司[0155] reagents：Macherey-Nagel

[0156] 人雌二醇(E2)酶联免疫试剂盒：San Antonio,TX,USA

[0157] 矿物油(oil for tissue culture)：In Vitro Fertilization,Inc,Trumbull[0158] HTF(Quinns’s Advantage Fertilization):In-Vitro Fertilization，SAGE[0159] 人白蛋白代用品(Quinns’s Advantage TM Sps Serum Protein Substitute)：In-Vitro Fertilization，SAGE，USA

[0160] 六孔板共培养小室(6well millicell Hanging Cell Culture Inserts)：Millipore

[0161] 5ml、10ml一次性注射器：双鸽

[0162] cDNA试剂盒(Revert Aid TMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit)：Fermentas Life Sciences

[0163] 一步法RT-PCR试剂盒：Fermentas Life Sciences

[0164] 琼脂糖凝胶：Biowest Agarose

[0165] goldview：赛百盛

[0166] reagents：Macherey-Nagel

[0167] TAE缓冲液：Tris、Na2EDTA.2H2O、冰乙酸

[0168] 眼科剪、眼科摄、手术剪、无菌棉球、75％酒精等

[0169] 左归丸复方、右归丸复方、左右归丸共有中药、左归丸独有中药超细粉：绿叶制药集团。

[0170] 2、实验方法

[0171] 2.1各类含补肾中药鼠血清的制备

[0172] SD大鼠，清洁级，6～8周龄，体重220～250g，♀♂兼用，各15只，许可证号：SCXK(川)2004-15；四川省医学科学院实验动物研究所提供。动物饲养于清洁级动物室，温度22±2℃，湿度40～70％，10h/14h明暗交替，每3min自动换气一次，常规全价颗粒饲料喂养，自由饮水，♀♂分开饲养于不锈钢饲养笼内。

[0173] 依据前期实验结果，在体重均一的情况下随机将30只大鼠分成3组：分别为空白组、3号药组、5号药组，每组10只，雌雄各半。空白组大鼠灌服蒸馏水，左归丸组方中药混合超细粉(按照实施例4的方法制备，简称3号药，含熟地、山药、山茱萸、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、川牛膝、龟胶)、左归丸组方独有中药混合超细粉(按照实施例1的方法制备，简称5号药，含川牛膝、龟胶)，给药剂量均为5.0g/kg，给药容量为20ml/kg。分别于给药后30min、60min、90min眼底静脉丛取血，血液静置2小时后，3000rpm离心10min，分离各组各不同时间段血清，将每组三个时间段的血清混匀备用。

[0174] 经预试验比较水浴法、L-L萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法，选取蛋白沉淀法进行血清样品前处理，即取大鼠血清150μl，加入高氯酸-甲醇液(15μl 50％高氯酸+5μl甲醇)，漩涡振荡2min，然后20000rpm离心10min，取上清液作为供试液做高效液相色谱分析，按分析结果，按成分峰制备含药大鼠血清。所有分离所得血清均用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存待用。

[0175] 2.2不同浓度含3号、5号药鼠血清体外诱导人FTM-PVCs分化

[0176] 根据上述实验结果，调整实验方案：将人FTM-PVCs接种于8孔细胞小室，接种密度为2～3×103cells/cm2，MEME培养液含10％FBS、50IU/ml青霉素、50mg/ml链霉素。

[0177] 待细胞贴壁后，用如下表1中的培养液培养，每3天更换培养液一次，将每次更换的各组培养液以无菌1.5ml一次性塑料离心管保存于-20℃待测，镜下观察每组细胞形态学变化并拍照。各组人FTM-PVCs在不同条件下培养24天后，免疫荧光法检测卵细胞标志物GDF-9的表达。

[0178] 表1分组及培养液成分

[0179]

[0180] 不同时间段收集的各组细胞培养液以3000×g离心，以酶联免疫试剂盒检测培养液中E2的含量。严格按照酶联免疫试剂盒说明操作，于酶标仪450nm吸光度，读取OD值，根据标准品的浓度和OD值做出标准曲线，计算得出

[0181] 3、实验结果

[0182] 3.1 3号药诱导人FTM-PVCs的结果

[0183] 3.1.1 形态学变化

[0184] 如表2和图1所示：

[0185] 表2 3号药鼠血清诱导FTM-PVCs出现形态学变化

[0186]

[0187] 可以看出，不同浓度的3号药用于培养FTM-PVCs，5天后均会出现卵细胞样结构——成团聚集，17天出现颗粒细胞样结构，其中，浓度为20％时现象最为明显。

[0188] 3.1.2卵细胞标志物GDF-9的表达

[0189] 如表3和图2所示：

[0190] 表3 3号药鼠血清诱导FTM-PVCs表达GDF-9

[0191]组别 GDF-9的表达情况对应图片
空白鼠血清组(5％) 不表达图2D(5％blank)
阳性对照组表达图2A(positive control)
3号药组(5％) 表达图2B(5％3#)
3号药组(10％) 表达图2C(10％3#)

[0192] 可以看出，培养FTM-PVCs时，本发明不同浓度3号药与阳性对照组相同，细胞表达卵细胞标志物GDF-9，而空白鼠血清组则不会表达GDF-9。

[0193] 3.2 5号药诱导人FTM-PVCs的结果

[0194] 3.2.1形态学变化

[0195] 如表4和图3所示：

[0196] 表4 5号药鼠血清诱导FTM-PVCs出现形态学变化

[0197]

[0198] 可以看出，不同浓度的5号药培养FTM-PVCs5天后，细胞均会出现卵细胞样结构——成团聚集，17天出现网状结构，其中，浓度为5％时现象最为明显。

[0199] 3.2.2卵细胞标志物GDF-9的表达

[0200] 如表5和图4所示：

[0201] 表5 5号药鼠血清诱导FTM-PVCs表达GDF-9

[0202]组别 GDF-9的表达情况对应图片
空白鼠血清组(5％) 不表达图4C(5％blank)
阴性对照组不表达图4A(control)
5号药组(5％) 表达图4B(5％5#)

[0203] 可以看出，5号药用于培养FTM-PVCs，细胞表达卵细胞标志物GDF-9，而空白鼠血清组和阴性对照组则不表达GDF-9。

[0204] 综上，本发明3号药和5号药诱导培养人FTM-PVCs 3天后，细胞均出现了类卵细胞样结构，同时还表达卵细胞标志物GDF-9，说明本发明诱导液可以诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞，其中，含有5号药的诱导液使用的原料药较少，成本较低。

[0205] 本发明药物可以诱导FTM-PVCs分化为类卵细胞，可以为体外受精技术提供原材料，克服超排卵技术的种种缺陷，应用前景非常优良。

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