炎症性白细胞合成多种炎症介质，这些炎症介质在细胞内是分离的并储 存在细胞质膜结合型的颗粒中。此类介质的实例包括，但不限于，中性粒细 胞的髓过氧化物酶(MPO)(例如参见Borregaard N，Cowland JB.Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.Blood 1997；89：3503- 3521)、嗜酸性粒细胞的嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)和主要碱性蛋白 (major basic protein，MBP)(例如参见Gleich G J.Mechanisms of eosinophil- associated inflammation.J Allergy Clin Immunol 2000；105：651-663)、单核细胞 /巨噬细胞的溶菌酶(例如参见Hoff T，Spencker T，Emmendoerffer A.，Goppelt- Struebe M.Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992；52：173-182；和Balboa M A，Saez Y， Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes.J Immunol 2003；170：5276-5280)、和天然杀 伤(NK)细胞和细胞毒性淋巴细胞的粒酶(例如参见Bochan MR，Goebel WS， Brahmi Z.Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability.Cell Immunol 1995；164：234-239；Gong JH.， Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994；8：652-658；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK- 92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383；和Takayama H，Trenn G， Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-190)。此类介质在损失部位释放并促进例如肺部和其 他部位的炎症和组织修复。已知白细胞通过胞吐机制释放这些颗粒(例如参 见Burgoyne RD，Morgan A.Secretory granule exocytosis.Physiol Rev 2003； 83：581-632；和Logan MR，Odemuyiwa SO，Moqbel R.Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells：the molecular basis of mediator secretion.J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932)，但参与这一胞吐过程 的调节分子和具体途径尚未充分揭示。
一些外源性刺激可促进白细胞脱颗粒，这涉及通过蛋白激酶C活化并随 后磷酸化的事件的途径(例如参见Burgoyne RD，Morgan A.Secretory granule exocytosis.Physiol Rev 2003；83：581-632；Logan MR，Odemuyiwa SO，Moqbel R.Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells：the molecular basis of mediator secretion.J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932；Smolen JE，Sandborg RR.Ca2+-induced secretion by electropermeabilized human neutrophils：the roles of Ca2+，nucleotides and protein kinase C.Biochim Biophys Acta 1990；1052：133-142；Niessen HW，Verhoeven AJ.Role of protein phosphorylation in the degranulation of electropermeabilized human neutrophils. Biochim.Biophys.Acta 1994；1223：267-273；和Naucler C，Grinstein S，Sundler R.，Tapper H.Signaling to localized degranulation in neutrophils adherent to immune complexes.J Leukoc Biol 2002；71：701-710)。
MARCKS蛋白(其中MARCKS在这里指的是“豆蔻酰化富丙氨酸激酶C 底物”(Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate))是蛋白激酶C(PKC)的遍 在性磷酸化靶，并高度表达于白细胞(例如参见Aderem AA，Albert KA，Keum MM，Wang JK，Greengard P，Cohn ZA.Stimulus-dependent myristoylation of a major substrate for protein kinase C.Nature 1988；332：362-364；Thelen M， Rosen A，Naim AC，Aderem A.Regulation by phosphorylation of reversible association of a myristoylated protein kinase C substrate with the plasma membrane.Nature 1991；351：320-322；和Hartwig JH，Thelen M，Rosen A， Janmey PA，Naim AC，Aderem A.MARCKS is an actin filament crosslinking protein regulated by protein kinase C and calcium-calmodulin.Nature 1992； 356：618-622)。MARCKS蛋白机械性参与排列在呼吸道内的杯状细胞的粘蛋 白胞吐性分泌过程(例如参见Li et al.，J Biol Chem 2001；276：40982-40990； 和Singer et al.，Nat Med 2004；10：193-196)。MARCKS通过MARCKS蛋白氨 基酸序列的N-端氨基酸的酰胺键在位于氨基酸序列N端的甘氨酸(即，位置 1)的α-胺位置被豆蔻酰化。在气道上皮细胞中，MARCKS的豆蔻酰化N-端 区域似乎是分泌过程所必需的。所谓MARCKS蛋白的N-端指的是MANS 肽，其具有豆蔻酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)， 均为L-氨基酸。此外，在此公开的MANS肽的肽片段也优选地由L-氨基酸 组成。其机制似乎涉及MARCKS，一种豆蔻酰化的蛋白质，与细胞内颗粒 的膜结合。
已经发现来自MARCKS的N-端的N-端豆蔻酰化的肽阻断粘蛋白分泌以 及MARCKS与杯状细胞内粘蛋白颗粒膜的结合(例如参见Singer et al.，Nat Med 2004；10：193-196)。该肽含有MARCKS蛋白的24个氨基酸，始自 MARCKS蛋白的通过酰胺键而被豆蔻酰化的N-端甘氨酸，称为豆蔻酰化的 α-N-端序列(MANS)；即，豆蔻酰基-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA (SEQ ID NO：1)。此外，Vergeres et al.，J.Biochem.1998，330；5-11也公开了 MARCKS蛋白的N-端甘氨酸残基通过由豆蔻酰基CoA：蛋白质N-豆蔻酰基 转移酶(NMT)催化的反应而被豆蔻酰化。
在炎性疾病例如哮喘、COPD和慢性支气管炎中；在遗传性疾病例如囊 性纤维化中；在过敏性疾病(特应性、过敏性炎症)中；在支气管扩张症中； 以及在多种急性感染性呼吸道疾病例如肺炎、鼻炎、流感或普通感冒、关节 炎或自身免疫病中，炎性细胞通常见于或者迁移至与炎性疾病状态有关的损 伤或感染区域，特别是患有此类疾病的患者的呼吸道或者气道内。这些炎性 细胞可通过它们释放的炎症介质造成组织损伤，由此在疾病的病理学中起着 极大的作用。在囊性纤维化患者中可观察到通过这种慢性炎症造成的此类组 织损伤或破坏的一个实例，其中中性粒细胞所释放的介质(例如，髓过氧化 物酶(MPO))引起气道上皮组织脱落。
MARCKS是大约82kD的蛋白质，其具有3个进化保守性区域(Aderem et al.，Nature 1988；332：362-364；Thelen et al.，Nature 1991；351：320-322； Hartwig et al.，Nature 1992；356：618-622；Seykora et al.，J Biol Chem 1996； 271：18797-18802)：N-端、磷酸化位点结构域(或PSD)、和多重同源性2 (MH2)结构域。人MARCKS cDNA和蛋白质是已知的，参见Harlan et al.， J.Biol.Chem.1991，266：14399(GenBank Accession No.M68956)和Sakai et al.， Genomics 1992，14：175。WO 00/50062也给出这些序列，在此通过引用将其 全部内容并入本申请。该N-端是包含24个氨基酸残基的α-氨基酸序列，具 有通过酰胺键连接于N-端甘氨酸残基的豆蔻酸部分，该N-端参与MARCKS 与细胞内膜(Seykora et al.，J Biol Chem 1996；271：18797-18802)以及可能地与 钙调蛋白(Matsubara et al.，J Biol Chem 2003；278：48898-48902)的结合。该 24个氨基酸的序列称为MANS肽。

MARCKS蛋白参与从侵润性白细胞的颗粒释放炎症介质与所有组织和 器官的疾病的炎症相关，包括特征为气道炎症的肺部疾病，例如哮喘、 COPD和囊性纤维化。不过，气道的炎症和粘液分泌是两个分开且独立的过 程(Li et al.，J Biol Chem 2001；276：40982-40990；Singer et al.，Nat Med 2004；10：193-196)。尽管多种因素可促进粘液的产生和分泌，其中包括由炎 性细胞释放的介质，但目前没有过量粘液导致炎症的直接关联。
在本发明的一个方面，MANS肽可在降低炎症性白细胞释放炎症介质颗 粒或囊泡的速度和/或量上发挥作用。
在另一个方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特别是衍生自所述24个氨 基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置1的甘氨酸的MARCKS N-端1 至24位氨基酸的序列内的活性连续肽片段，以及此类片段的N-端酰胺例如 此类片段的N-端乙酸酰胺，和/或以及此类片段的C-端酰胺例如与氨形成的 C-端酰胺，可抑制或降低炎症介质自炎症性白细胞的释放的速度和/或量。对 释放的这种抑制或降低包括抑制MARCKS相关性炎症介质自炎症性白细胞 的释放。
在另一个方面，衍生自MARCKS N-端的肽，特别是衍生自1至24位氨 基酸的N-端序列的肽，即，衍生自具有位置1的甘氨酸的MARCKS N-端1 至24位氨基酸的序列内的活性连续肽片段，以及此类片段的N-端酰胺例如 此类片段的N-端乙酸酰胺，以及此类片段的C-端酰胺例如与氨形成的C-端 酰胺，可通过抑制炎症性白细胞内的脱颗粒过程而抑制炎症介质释放的速度 和/或量，例如抑制本发明所鉴定的那些炎症介质。
在另一个方面，MANS肽及其活性片段以及在此所述的此类片段的活性 酰胺，可在炎性细胞中与天然的MARCKS蛋白竞争结合膜，以减少(减弱或 降低)MARCKS-相关性炎症介质自此类炎性细胞中的含有此类炎症介质的颗 粒或囊泡的释放。
应答于佛波酯诱导的PKC活化而分泌特异性颗粒成分的白细胞细胞类型 和模型细胞类型可用于在体外证实本发明的肽和本发明的取代的肽(例如，α- N-酰胺、C-端酰胺和酯)的功效。
可使用人的白细胞细胞系来证实本发明的化合物和组合物减少膜结合型 炎症介质的释放。例如，自人血中分离的中性粒细胞可用于证实髓过氧化物 酶(MPO)释放的减少或抑制。人的早幼粒细胞细胞系HL-60克隆15可用于 证实本发明的化合物和组合物减少或抑制嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)的 释放或分泌(例如参见Fischkoff SA.Graded increase in probability of eosinophilic differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells induced by culture under alkaline conditions.Leuk Res 1988；12：679-686；Rosenberg HF， Ackerman S J，Tenen DG.Human eosinophil cationic protein：molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin with ribonuclease activity.J Exp Med 1989； 170：163-176；Tiffany HL，Li F，Rosenberg HF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemia cell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J Leukoc Biol 1995；58：49-54；和Badewa AP，Hudson CE，Heiman AS.Regulatory effects of eotaxin，eotaxin-2，and eotaxin-3on eosinophil degranulation and superoxide anion generation.Exp Biol Med 2002； 227：645-651)。单核细胞白血病细胞系U937可用于证实本发明的化合物和组 合物减少或抑制溶菌酶的释放或分泌(例如参见Hoff T，Spencker T， Emmendoerffer A.，Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoids on the TPA- induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992；52：173-182；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2is required for lysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol 2003；170：5276-5280；和 Sundstrom C，Nilsson K.Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line(U-937)。Int J Cancer 1976；17：565-577)。淋巴 细胞天然杀伤细胞系NK-92可用于证实本发明的化合物和组合物减少或抑制 粒酶的释放(例如参见Gong JH.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemia 1994；8：652-658；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK-92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383； 和Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-190)。在抑制或减少炎症 介质(例如在此所述的那些)释放的体外方法中，将各种细胞类型与多种浓度 范围的本发明的肽化合物或肽组合物预温育，随后将这些细胞与炎症介质释 放的刺激物例如佛波酯进行温育。确定与缺乏所述肽化合物或肽组合物的情 况下所述介质的释放相比，炎症介质释放被抑制的百分数，例如以所释放的 介质的浓度的分光光度读数的形式。
为了证实相对氨基酸序列位置在本发明的肽中的重要性，比较了如下两 类肽抑制或降低所释放的炎症介质的量的相对能力，其一为与MARCKS蛋 白N-端区域的24个氨基酸的序列(即，MANS-豆蔻酰化的α-N-端序列肽) 相同的肽，另一虽含有与MANS相同的24个氨基酸残基，但相对于MANS 中的序列顺序而言这些残基的顺序是随机的(即，RNS肽，或者称为“随机 N-端序列肽”)。在所检测的各种细胞类型中，MANS肽以浓度依赖型方式在 0.5-3.0小时期间减少了炎症介质的释放，而RNS肽则不能。这些结果提 示，与MARCKS蛋白、特别是与其N-端区域、且更加具体地是与其24个 氨基酸残基的N-端区域中的顺序相同的本发明的肽内的相对氨基酸序列位 置，参与了处理抑制白细胞脱颗粒的至少一种细胞内途径。
本发明涉及所述24个氨基酸的肽序列的新用途，并涉及所述α-N-端乙 酰化的肽序列、所述豆蔻酰化的多肽，也称为MANS肽，并涉及其活性片 段，所述活性片段可选自具有MANS肽氨基酸序列的4到23个连续氨基酸 残基的肽，且所述片段如果不以SEQ ID NO：1的位置1的N-端甘氨酸作为起 始，它们可以是N-端-豆蔻酰化的，或者它们的N-端可以被C2至C12的酰 基酰化，包括N-端乙酰化，和/或它们的C-端以NH2酰胺化。
本发明还涉及阻断MARCKS-相关性细胞分泌过程的新方法，特别是那 些涉及自炎性细胞的MARCKS-相关性炎症介质释放的过程，其刺激途径涉 及蛋白激酶C(PKC)底物MARCKS蛋白和自细胞内囊泡或颗粒释放成分。
本发明涉及抑制自至少一种炎性细胞胞吐释放至少一种炎症介质的方 法，包括将细胞与有效量的至少一种肽相接触，所述细胞包含位于所述细胞 内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述至少一种肽选自MANS肽及其在此所 述的活性片段，以使得所述炎症介质自所述炎性细胞的释放与在缺乏所述至 少一种肽的情况下可能自相同类型的炎性细胞释放的所述炎症介质相比被降 低。
本发明进一步涉及抑制自对象的组织或体液内的至少一种炎性细胞释放 至少一种炎症介质的方法，包括给所述对象的包含至少一种炎性细胞的组织 和/或体液施用治疗有效量的药物组合物，所述至少一种炎性细胞包含位于所 述细胞内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述组合物包含治疗有效量的选自 MANS肽及其活性片段的至少一种肽，以使得所述炎症介质自至少一种炎性 细胞的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下可能自至少一种相同类型的炎 性细胞释放的所述炎症介质相比被降低。更具体地，抑制炎症介质的释放包 含阻断或降低炎症介质自炎性细胞的释放。
更具体地，本发明包括降低对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的 药物组合物，所述组合物包含MANS肽(即，N-豆蔻酰基- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1))或其活性片段。活性片 段的长度为至少4个氨基酸且优选地至少6个氨基酸。在此，MARCKS蛋白 的“活性片段”指的是这样的片段，其影响(抑制或降低)MARCKS蛋白介导 的释放，例如MARCKS蛋白介导的炎症介质释放。活性片段可选自 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV(SEQ ID NO：2)； GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA(SEQ ID NO：4)； GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA(SEQ ID NO：7)； GAQFSKTAAKGEAAAERPGE(SEQ ID NO：11)； GAQFSKTAAKGEAAAERPG(SEQ ID NO：16)；GAQFSKTAAKGEAAAERP (SEQ ID NO：22)；GAQFSKTAAKGEAAAER(SEQ ID NO：29)； GAQFSKTAAKGEAAAE(SEQ ID NO：37)；GAQFSKTAAKGEAAA(SEQ ID NO：46)；GAQFSKTAAKGEAA(SEQ ID NO：56)；GAQFSKTAAKGEA(SEQ ID NO：67)；GAQFSKTAAKGE(SEQ ID NO：79)；GAQFSKTAAKG(SEQ ID NO：92)；GAQFSKTAAK(SEQ ID NO：106)；GAQFSKTAA(SEQ ID NO：121)；GAQFSKTA(SEQ ID NO：137)；GAQFSKT(SEQ ID NO：154)； GAQFSK(SEQ ID NO：172)；GAQFS(SEQ ID NO：191)和GAQF(SEQ ID NO：211)。这些肽在N-端氨基酸不含有豆蔻酰基部分，而是要么不含任何化 学部分，要么在N-端氨基酸含有非豆蔻酰基化学部分和/或在C-端氨基酸含 有化学部分，例如上述的N-端乙酰基和/或C-端酰胺基。MANS肽及其N-端 豆蔻酰化的片段中存在疏水性N-端豆蔻酰基部分可增强它们与质膜的相容性 并可能增强其对质膜的通透性，并可能使得所述肽被细胞摄取。豆蔻酰基疏 水性插入膜的脂双层可提供高达104M-1的脂质分配系数或表观缔合常数或大 约8kcal/mol的单一吉布斯自由结合能(例如参见Peitzsch，R.M.，and McLaughlin，S.1993，Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles：pertinence to myristoylated proteins.Biochemistry.32：10436-10443)， 这足以(至少部分地)允许MANS肽和豆蔻酰化的MANS肽片段分配入细胞的 质膜内，同时MANS肽(其是豆蔻酰化的)内部和豆蔻酰化的MANS肽片段内 部的额外的官能团及其相互作用可增强它们的相对膜通透性。所述片段可各 自展现代表其相应结构的分配系数和膜亲和力。可通过本领域已知的肽合成 方法制备所述片段，例如通过固相肽合成法(例如参见Chan，Weng C.and White，Peter D.Eds.，Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach， Oxford University Press，New York，New York(2000)；和Lloyd-Williams，P.et al.Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins(1997)所述的 方法)，并可通过本领域已知的方法纯化，例如通过高压液相色谱法。可通过 质谱分析确定各种肽的分子量，其中各种肽显示为具有适当分子质量的峰。 使用本文实施例中所公开的方法，无需过多的实验即可容易地确定这些单个 的肽或各种肽的组合(例如，2种所述肽的各种组合、3种所述肽的各种组 合、4种所述肽的各种组合)在本发明的方法中的功效。优选的组合可包括两 种所述的肽；所述肽的优选的摩尔比可以是从50∶50(即，1∶1)至99.99至 0.01，可使用本文实施例中所公开的方法容易地确定该比率。
优选地，将MANS肽或其活性片段置于用于阻断炎症的药物组合物中。 本发明还包括抑制对象的细胞分泌过程的方法，该方法包括施用治疗有效量 的化合物，所述化合物包括抑制对象的炎症介质的MANS肽或其活性片段。 所述施用通常选自局部施用、胃肠外施用、直肠施用、肺部施用、吸入和鼻 部或口服，其中肺部施用通常包括气溶胶、干粉喷雾吸入器、定量喷雾吸入 器、或喷雾器。
施用用于人或动物的包含脱颗粒抑制量的MANS肽或脱颗粒抑制量的 MANS肽活性片段的组合物，例如MANS肽或其活性片段的药物组合物， 可将MANS肽或其活性片段至少提供至炎性粒细胞所处的或者炎性粒细胞将 侵入的组织的内部或表面的部位处，或者提供至与所述组织的表面相接触的 含液体层中，由此使得MANS肽或其活性片段接触炎性粒细胞。在一个方 面，可在炎症刚发作或者刚检测到时、或在人或动物刚感觉到炎症时、或人 或动物的炎症水平刚出现可感知的变化时，施用该组合物以使得炎症的量低 于在缺乏MANS肽或其活性片段的情况下可能出现的炎症的量。在另一个方 面，可在人或动物的组织的炎症进展过程中进行施用，以降低在缺乏MANS 肽或其活性片段的情况下可能出现的额外的炎症的量。施用的剂量和频率可 通过临床评价而确定，并与疾病或炎症来源以及组织受累的程度和患者的年 龄和个头有关，而可预期的是，在首次施用所述药物组合物的3到8小时之 后、优选地6到8小时之后，可重复施用药物组合物。
本发明还包括减轻对象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的抑制 MARCKS-相关性炎症介质释放的化合物，从而对象的至少一种炎症介质的 释放与缺乏所述治疗时可能出现的情况相比是降低的。在本文中，″降低″通 常指的是炎症效应的减轻。优选地，通过在此公开的方法抑制或阻断炎症介 质的释放。
本发明的另一个实施方式包括减轻对象的炎症的方法，包括施用治疗有 效量的抑制MARCKS-相关性炎症介质释放的化合物，从而对象的炎症与缺 乏所述治疗时可能出现的情况相比是降低的。本发明还公开了减轻或抑制对 象的炎症的方法，包括施用治疗有效量的有效抑制炎症部位的炎症介质的 MANS肽或其活性片段。术语″抑制″指的是炎症介质分泌的量降低。术语“完 全抑制”指的是炎症介质分泌的量降低至零。同样，如上所述，活性片段的 长度为至少4个、且优选地至少6个氨基酸。术语“胞吐过程”是指胞吐作 用，即细胞分泌或排泄的过程，其中包含于位于细胞内部囊泡内的物质通过 囊泡的囊泡膜与细胞外膜的融合而被排出。“脱颗粒”指的是释放细胞颗粒成 分。术语“脱颗粒抑制”指的是降低炎性细胞颗粒内所含炎症介质的释放。因 此，脱颗粒抑制量的MANS肽和/或其活性片段是指这些肽的量足以使得颗 粒内所含炎症介质的释放与缺乏同样的肽的情况下的释放相比被降低。
在参照肽GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)中，在参 照肽的N-端位置处，G位于第1位；与1位的G相邻的是2位的A；与2位 的A相邻的是3位的Q；与3位的Q相邻的是4位的F；与4位的F相邻的 是5位的S；与5位的S相邻的是6位的K；与6位的K相邻的是7位的 T；与7位的T相邻的是8位的A；与8位的A相邻的是9位的A；与9位 的A相邻的是10位的K；与10位的K相邻的是11位的G；与11位的G相 邻的是12位的E；与11位的G相邻的是13位的A；与13位的A相邻的是 14位的A；与14位的A相邻的是15位的A；与15位的A相邻的是16位的 E；与16位的E相邻的是17位的R；与17位的R相邻的是18位的P；与 18位的P相邻的是19位的G；与19位的G相邻的是20位的E；与20位的 E相邻的是21位的A；与21位的A相邻的是22位的A；与22位的A相邻 的是23位的V；而与23位的V相邻的是24位的A，其中第24位是该参照 肽的C-端位置。
参照肽的“变体”或参照肽的4-23个氨基酸片段的变体是具有这样的氨 基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽的氨基酸序列或参照肽的片段的氨 基酸序列分别在参照肽或参照肽片段氨基酸序列中的至少一个氨基酸位置上 不同，但是仍保持粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分别是所述参照肽 或片段的活性的0.1-10倍，优选分别是参照肽或片段的活性的0.2-6倍，更 优选分别是参照肽或片段的活性的0.3-5倍。参照氨基酸序列的“变体”或 参照氨基酸序列的4-23个氨基酸片段的变体是这样的氨基酸序列，其与参照 氨基酸序列或参照氨基酸序列的片段有至少一个氨基酸不同，但具有这样的 肽的氨基酸序列，所述肽保持参照氨基酸序列编码的所述肽或片段的粘蛋白 或粘液抑制活性，所述活性通常分别是参照序列的肽或片段的活性的0.1-10 倍，优选分别是参照序列的肽或片段的活性的0.2-6倍，更优选分别是参照 序列的肽或片段的活性的0.3-5倍。取代变体肽或取代变体氨基酸序列通过 参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸取代而与参照肽或参照氨基酸序列不同 (即有差异)；缺失变体肽或缺失变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一 或多个氨基酸缺失而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)；而添加变 体肽或添加变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸添加而 与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)。变体肽或变体氨基酸序列可为 参照序列中一或多个氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个 氨基酸取代)的结果，或者可为参照序列中一或多个氨基酸的缺失(例如至少 1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸缺失)的结果，或者可为参照序列中一 或多个氨基酸的添加(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸添加)的 结果，或其以任何顺序的组合。取代变体4-23个氨基酸的肽片段或者取代变 体4-23个氨基酸的片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸 的取代而与参照4-23个氨基酸的肽片段或参照4-23个氨基酸的片段序列不 同(即有差异)；缺失变体4-23个氨基酸的肽片段或者4-22个氨基酸的缺失变 体氨基酸片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸的缺失而 与5-23个氨基酸的参照肽片段或5-23个氨基酸的参照氨基酸片段序列不同 (即有差异)；而4-23个氨基酸的添加变体肽或者4-23个氨基酸的添加变体氨 基酸序列可通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸的添加而与4-22个氨基 酸的参照肽序列或4-22个氨基酸的参照氨基酸序列不同(即有差异)。4-23个 氨基酸的变体肽或4-23个氨基酸的变体氨基酸序列可为参照氨基酸序列的4- 23个氨基酸的片段中一或多个氨基酸的取代(例如至少1、2、3、4、5、6、 7、8个氨基酸取代)的结果，或者可为相对较大的参照氨基酸序列中一或多 个氨基酸的缺失(例如至少1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸缺失)的结 果，或者可为相对较小的参照氨基酸序列中一或多个氨基酸的添加(例如至少 1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸添加)的结果，或其以任何顺序的组 合。优选地，变体肽或氨基酸序列与参照肽或参照肽的片段或参照氨基酸序 列或参照氨基酸序列的片段分别通过以下变化而不同：少于10个氨基酸取 代、缺失和/或添加；更优选少于8个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选 少于6个氨基酸取代、缺失和/或添加；更优选少于5个氨基酸取代、缺失和 /或添加；更优选少于4个氨基酸取代、缺失和/或添加。最优选所述变体氨 基酸序列与参照肽或片段氨基酸序列通过1个或2个或3个氨基酸而不同。
“序列相同性”意指，就两条肽的氨基酸序列而言，具有相同氨基酸的 位置的数目除以两条序列中较短一条中的氨基酸的数目。
“基本相同”意指，就两条肽的氨基酸序列的比较或两条肽片段(例如参 照肽氨基酸序列的片段)的氨基酸序列的比较而言，肽或肽片段的氨基酸序列 具有至少75％序列相同性，优选至少80％序列相同性，更优选至少90％序列 相同性，且最优选至少95％序列相同性。
术语“肽”在本文中包括肽及其可药用的盐。
本文中的“分离的”肽意指天然存在的肽，其已经通过纯化、重组合成 或化学合成而与其天然伴随的细胞组分(例如核酸和其他肽)分离或基本分 离，并且也包括已经从细胞成分、生物物质、化学前体或其他化学物质中纯 化或基本纯化的非天然存在的重组或化学合成的肽。
以下三字母和单字母氨基酸简写在全文使用：丙氨酸：(Ala)A；精氨 酸：(Arg)R；天冬酰胺：(Asn)N；天冬氨酸：(Asp)D；半胱氨酸：(Cys) C；谷氨酰胺：(Gln)Q；谷氨酸：(Glu)E；甘氨酸：(Gly)G；组氨酸：(His) H；异亮氨酸：(Ile)I；亮氨酸：(Leu)L；赖氨酸：(Lys)K；甲硫氨酸：(Met) M；苯丙氨酸：(Phe)F；脯氨酸：(Pro)P；丝氨酸：(Ser)S；苏氨酸：(Thr) T；色氨酸：(Trp)W；酪氨酸：(Tyr)Y；缬氨酸：(Val)V。本文所用的其他 氨基酸三字母符号包括，见括号中，(Hyp)代表羟脯氨酸，(Nle)代表正亮氨 酸，(Om)代表鸟氨酸，(Pyr)代表焦谷氨酸，以及(Sar)代表肌氨酸。通常，肽 的氨基端(或N-端)出现在所示肽的氨基酸序列的左侧末端，而羧基端(或C- 端)出现在所示氨基酸序列的右侧末端。肽的氨基酸序列可以用单字母符号书 写来代表肽中通过肽酰胺键共价相连的氨基酸。
MANS肽的活性片段可用于预防或降低动物组织内由炎症介质引起的炎 症的量。MANS肽的活性片段还可用于预防或降低动物体内由炎症介质产生 或引起的组织损失的量。MANS肽的活性片段由MANS肽(SEQ ID NO：1)的 至少4个连续氨基酸且不超过23个连续氨基酸组成。术语“活性片段”在本发 明中旨在涵盖那些能够预防或降低炎症介质自炎性细胞释放的MANS肽片 段。与参照肽例如MANS肽相比，所述活性片段可使得炎症介质的释放降低 至少5％到至少99％。
表1中是单字母简写形式的氨基酸序列的列表以及相应的肽编号和SEQ ID NO。参照肽氨基酸序列(MANS肽)是肽1。肽2至231是本发明的肽的 氨基酸序列，它们具有参照氨基酸序列的4至23个连续氨基酸的氨基酸序 列，此外肽232是包含MANS肽的氨基酸的随机N-端序列(RNS)的氨基酸序 列。在此所述的本发明的肽的氨基酸序列的代表性变体氨基酸序列是肽233 至245和247至251。列出的这些变体肽无意于作为限制性的一组肽，而仅 仅是作为本发明变体肽的代表性实例而给出的。还给出了本发明的肽的代表 性反向氨基酸序列(肽246)和代表性随机氨基酸序列(肽232)。表中的反向和 随机氨基酸序列不是本发明的代表。
表1给出了本发明的肽及其相应的氨基酸序列的列表以及相应的SEQ ID NO。
表1：肽和氨基酸序列
  肽编号   序列  序列号   肽1   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：1   肽2   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：2   肽3   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：3   肽4   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：4   肽5   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：5   肽6   QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：6   肽7   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：7   肽8   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：8   肽9   QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：9   肽10   FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：10   肽11   GAQFSKTAAKGEAAAERPGE  SEQ ID NO：11   肽12   AQFSKTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：12   肽13   QFSKTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：13   肽14   FSKTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：14   肽15   SKTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：15   肽16   GAQFSKTAAKGEAAAERPG  SEQ ID NO：16   肽17   AQFSKTAAKGEAAAERPGE  SEQ ID NO：17   肽18   QFSKTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：18   肽19   FSKTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：19   肽20   SKTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：20   肽21   KTAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：21   肽22   GAQFSKTAAKGEAAAERP  SEQ ID NO：22   肽23   AQFSKTAAKGEAAAERPG  SEQ ID NO：23   肽24   QFSKTAAKGEAAAERPGE  SEQ ID NO：24   肽25   FSKTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：25   肽26   SKTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：26   肽27   KTAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：27   肽28   TAAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：28   肽29   GAQFSKTAAKGEAAAER  SEQ ID NO：29   肽30   AQFSKTAAKGEAAAERP  SEQ ID NO：30   肽31   QFSKTAAKGEAAAERPG  SEQ ID NO：31   肽32   FSKTAAKGEAAAERPGE  SEQ ID NO：32   肽33   SKTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：33   肽34   KTAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：34   肽35   TAAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：35   肽36   AAKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：36   肽37   GAQFSKTAAKGEAAAE  SEQ ID NO：37   肽38   AQFSKTAAKGEAAAER  SEQ ID NO：38   肽39   QFSKTAAKGEAAAERP  SEQ ID NO：39   肽40   FSKTAAKGEAAAERPG  SEQ ID NO：40   肽41   SKTAAKGEAAAERPGE  SEQ ID NO：41   肽42   KTAAKGEAAAERPGEA  SEQ ID NO：42   肽43   TAAKGEAAAERPGEAA  SEQ ID NO：43   肽44   AAKGEAAAERPGEAAV  SEQ ID NO：44   肽45   AKGEAAAERPGEAAVA  SEQ ID NO：45   肽46   GAQFSKTAAKGEAAA  SEQ ID NO：46   肽47   AQFSKTAAKGEAAAE  SEQ ID NO：47
 肽48   QFSKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO：48  肽49   FSKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO：49  肽50   SKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO：50  肽51   KTAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO：51  肽52   TAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO：52  肽53   AAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO：53  肽54   AKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO：54  肽55   KGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO：55  肽56   GAQFSKTAAKGEAA   SEQ ID NO：56  肽57   AQFSKTAAKGEAAA   SEQ ID NO：57  肽58   QFSKTAAKGEAAAE   SEQ ID NO：58  肽59   FSKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO：59  肽60   SKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO：60  肽61   KTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO：61  肽62   TAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO：62  肽63   AAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO：63  肽64   AKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO：64  肽65   KGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO：65  肽66   GEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO：66  肽67   GAQFSKTAAKGEA   SEQ ID NO：67  肽68   AQFSKTAAKGEAA   SEQ ID NO：68  肽69   QFSKTAAKGEAAA   SEQ ID NO：69  肽70   FSKTAAKGEAAAE   SEQ ID NO：70  肽71   SKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO：71  肽72   KTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO：72  肽73   TAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO：73  肽74   AAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO：74  肽75   AKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO：75  肽76   KGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO：76  肽77   GEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO：77  肽78   EAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO：78  肽79   GAQFSKTAAKGE   SEQ ID NO：79  肽80   AQFSKTAAKGEA   SEQ ID NO：80  肽81   QFSKTAAKGEAA   SEQ ID NO：81  肽82   FSKTAAKGEAAA   SEQ ID NO：82  肽83   SKTAAKGEAAAE   SEQ ID NO：83  肽84   KTAAKGEAAAER   SEQ ID NO：84  肽85   TAAKGEAAAERP   SEQ ID NO：85  肽86   AAKGEAAAERPG   SEQ ID NO：86  肽87   AKGEAAAERPGE   SEQ ID NO：87  肽88   KGEAAAERPGEA   SEQ ID NO：88  肽89   GEAAAERPGEAA   SEQ ID NO：89  肽90   EAAAERPGEAAV   SEQ ID NO：90  肽91   AAAERPGEAAVA   SEQ ID NO：91  肽92   GAQFSKTAAKG   SEQ ID NO：92  肽93   AQFSKTAAKGE   SEQ ID NO：93  肽94   QFSKTAAKGEA   SEQ ID NO：94  肽95   FSKTAAKGEAA   SEQ ID NO：95  肽96   SKTAAKGEAAA   SEQ ID NO：96  肽97   KTAAKGEAAAE   SEQ ID NO：97  肽98   TAAKGEAAAER   SEQ ID NO：98  肽99   AAKGEAAAERP   SEQ ID NO：99  肽100   AKGEAAAERPG   SEQ ID NO：100  肽101   KGEAAAERPGE   SEQ ID NO：101
  肽102   GEAAAERPGEA   SEQ ID NO：102   肽103   EAAAERPGEAA   SEQ ID NO：103   肽104   AAAERPGEAAV   SEQ ID NO：104   肽105   AAERPGEAAVA   SEQ ID NO：105   肽106   GAQFsKTAAK   SEQ ID NO：106   肽107   AQFSKTAAKG   SEQ ID NO：107   肽108   QFSKTAAKGE   SEQ ID NO：108   肽109   FSKTAAKGEA   SEQ ID NO：109   肽110   SKTAAKGEAA   SEQ ID NO：110   肽111   KTAAKGEAAA   SEQ ID NO：111   肽112   TAAKGEAAAE   SEQ ID NO：112   肽113   AAKGEAAAER   SEQ ID NO：113   肽114   AKGEAAAERP   SEQ ID NO：114   肽115   KGEAAAERPG   SEQ ID NO：115   肽116   GEAAAERPGE   SEQ ID NO：116   肽117   EAAAERPGEA   SEQ ID NO：117   肽118   AAAERPGEAA   SEQ ID NO：118   肽119   AAERPGEAAV   SEQ ID NO：119   肽120   AERPGEAAVA   SEQ ID NO：120   肽121   GAQFSKTAA   SEQ ID NO：121   肽122   AQFSKTAAK   SEQ ID NO：122   肽123   QFSKTAAKG   SEQ ID NO：123   肽124   FSKTAAKGE   SEQ ID NO：124   肽125   SKTAAKGEA   SEQ ID NO：125   肽126   KTAAKGEAA   SEQ ID NO：126   肽127   TAAKGEAAA   SEQ ID NO：127   肽128   AAKGEAAAE   SEQ ID NO：128   肽129   AKGEAAAER   SEQ ID NO：129   肽130   KGEAAAERP   SEQ ID NO：130   肽131   GEAAAERPG   SEQ ID NO：131   肽132   EAAAERPGE   SEQ ID NO：132   肽133   AAAERPGEA   SEQ ID NO：133   肽134   AAERPGEAA   SEQ ID NO：134   肽135   AERPGEAAV   SEQ ID NO：135   肽136   ERPGEAAVA   SEQ ID NO：136   肽137   GAQFSKTA   SEQ ID NO：137   肽138   AQFSKTAA   SEQ ID NO：138   肽139   QFSKTAAK   SEQ ID NO：139   肽140   FSKTAAKG   SEQ ID NO：140   肽141   SKTAAKGE   SEQ ID NO：141   肽142   KTAAKGEA   SEQ ID NO：142   肽143   TAAKGEAA   SEQ ID NO：143   肽144   AAKGEAAA   SEQ ID NO：144   肽145   AKGEAAAE   SEQ ID NO：145   肽146   KGEAAAER   SEQ ID NO：146   肽147   GEAAAERP   SEQ ID NO：147   肽148   EAAAERPG   SEQ ID NO：148   肽149   AAAERPGE   SEQ ID NO：149   肽150   AAERPGEA   SEQ ID NO：150   肽151   AERPGEAA   SEQ ID NO：151   肽152   ERPGEAAV   SEQ ID NO：152   肽153   RPGEAAVA   SEQ ID NO：153   肽154   GAQFSKT   SEQ ID NO：154   肽155   AQFSKTA   SEQ ID NO：155
  肽156   QFSKTAA   SEQ ID NO：156   肽157   FSKTAAK   SEQ ID NO：157   肽158   SKTAAKG   SEQ ID NO：158   肽159   KTAAKGE   SEQ ID NO：159   肽160   TAAKGEA   SEQ ID NO：160   肽161   AAKGEAA   SEQ ID NO：161   肽162   AKGEAAA   SEQ ID NO：162   肽163   KGEAAAE   SEQ ID NO：163   肽164   GEAAAER   SEQ ID NO：164   肽165   EAAAERP   SEQ ID NO：165   肽166   AAAERPG   SEQ ID NO：166   肽167   AAERPGE   SEQ ID NO：167   肽168   AERPGEA   SEQ ID NO：168   肽169   ERPGEAA   SEQ ID NO：169   肽170   RPGEAAV   SEQ ID NO：170   肽171   PGEAAVA   SEQ ID NO：171   肽172   GAQFSK   SEQ ID NO：172   肽173   AQFSKT   SEQ ID NO：173   肽174   QFSKTA   SEQ ID NO：174   肽175   FSKTAA   SEQ ID NO：175   肽176   SKTAAK   SEQ ID NO：176   肽177   KTAAKG   SEQ ID NO：177   肽178   TAAKGE   SEQ ID NO：178   肽179   AAKGEA   SEQ ID NO：179   肽180   AKGEAA   SEQ ID NO：180   肽181   KGEAAA   SEQ ID NO：181   肽182   GEAAAE   SEQ ID NO：182   肽183   EAAAER   SEQ ID NO：183   肽184   AAAERP   SEQ ID NO：184   肽185   AAERPG   SEQ ID NO：185   肽186   AERPGE   SEQ ID NO：186   肽187   ERPGEA   SEQ ID NO：187   肽188   RPGEAA   SEQ ID NO：188   肽189   PGEAAV   SEQ ID NO：189   肽190   GEAAVA   SEQ ID NO：190   肽191   GAQFS   SEQ ID NO：191   肽192   AQFSK   SEQ ID NO：192   肽193   QFSKT   SEQ ID NO：193   肽194   FSKTA   SEQ ID NO：194   肽195   SKTAA   SEQ ID NO：195   肽196   KTAAK   SEQ ID NO：196   肽197   TAAKG   SEQ ID NO：197   肽198   AAKGE   SEQ ID NO：198   肽199   AKGEA   SEQ ID NO：199   肽200   KGEAA   SEQ ID NO：200   肽201   GEAAA   SEQ ID NO：201   肽202   EAAAE   SEQ ID NO：202   肽203   AAAER   SEQ ID NO：203   肽204   AAERP   SEQ ID NO：204   肽205   AERPG   SEQ ID NO：205   肽206   ERPGE   SEQ ID NO：206   肽207   RPGEA   SEQ ID NO：207   肽208   PGEAA   SEQ ID NO：208   肽209   GEAAV   SEQ ID NO：209
 肽210   EAAVA   SEQ ID NO：210  肽211   GAQF   SEQ ID NO：211  肽212   AQFS   SEQ ID NO：212  肽213   QFSK   SEQ ID NO：213  肽214   FSKT   SEQ ID NO：214  肽215   SKTA   SEQ ID NO：215  肽216   KTAA   SEQ ID NO：216  肽217   TAAK   SEQ ID NO：217  肽218   AAKG   SEQ ID NO：218  肽219   AKGE   SEQ ID NO：219  肽220   KGEA   SEQ ID NO：220  肽221   GEAA   SEQ ID NO：221  肽222   EAAA   SEQ ID NO：222  肽223   AAAE   SEQ ID NO：223  肽224   AAER   SEQ ID NO：224  肽225   AERP   SEQ ID NO：225  肽226   ERPG   SEQ ID NO：226  肽227   RPGE   SEQ ID NO：227  肽228   PGEA   SEQ ID NO：228  肽229   GEAA   SEQ ID NO：229  肽230   EAAV   SEQ ID NO：230  肽231   AAVA   SEQ ID NO：231  肽232   GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF   SEQ ID NO：232  肽233   GKQFSKTAAKGE   SEQ ID NO：233  肽234   GAQFSKTKAKGE   SEQ ID NO：234  肽235   GKQFSKTKAKGE   SEQ ID NO：235  肽236   GAQASKTAAK   SEQ ID NO：236  肽237   GAQASKTAAKGE   SEQ ID NO：237  肽238   GAEFSKTAAKGE   SEQ ID NO：238  肽239   GAQFSKTAAAGE   SEQ ID NO：239  肽240   GAQFSKTAAKAE   SEQ ID NO：240  肽241   GAQFSKTAAKGA   SEQ ID NO：241  肽242   AAQFSKTAAK   SEQ ID NO：242  肽243   GAAFSKTAAK   SEQ ID NO：243  肽244   GAQFAKTAAK   SEQ ID NO：244  肽245   GAQFSATAAK   SEQ ID NO：245  肽246   KAATKSFQAG   SEQ ID NO：246  肽247   GAQFSKAAAK   SEQ ID NO：247  肽248   GAQFSKTAAA   SEQ ID NO：248  肽249   GAQFSATAAA   SEQ ID NO：249  肽250   GAQASKTA   SEQ ID NO：250  肽251   AAGE   SEQ ID NO：251  肽252   GKASQFAKTA   SEQ ID NO：252
表1中所列的肽的氨基酸序列可经化学方法修饰。例如，如果表1中所 列的肽的氨基酸序列在N-端胺进行化学修饰以便与羧酸形成酰胺化合物，产 生的肽在本发明中有时表示为羧酸的标识符作为前缀通过连字符与肽编号相 连的组合。例如，例如，以肽79为例，N-端豆蔻酰化的肽79有时在本文可 称为“豆蔻酰化的肽79”或“myr-肽79”；N-端乙酰化的肽79有时在本文 可称为“乙酰基-肽79”或“Ac-肽79”。环化形式的肽79可称为“环形-肽 79”或“cyc-肽79”。此外，例如如果表1中所列肽的氨基酸序列在C-端羧 基进行化学修饰，例如通过胺诸如氨以形成C-端酰胺，产生的肽有时在本文 通过胺残基的标识符作为后缀通过连字符与肽编号相连的组合来表示。因 此，例如，肽79的C-端酰胺有时可称为“肽-NH2”。如果肽(例如，肽79)的 N-端胺通过例如豆蔻酰基进行化学修饰，并且C-端羧基通过例如氨基团进行 化学修饰以形成上述的酰胺，利用前缀和后缀说明，产生的肽有时可称为 “myr-肽79-NH2”。
本发明涉及具有包含少于24个氨基酸的氨基酸序列的肽，其中所述氨 基酸序列与MANS肽的氨基酸序列相关(即，MANS肽是豆蔻酰-肽1，而 MANS肽的参照24个氨基酸的序列是肽1)。本发明的肽由含有少于24个氨 基酸的氨基酸序列组成，并且可由8-14个、10-12个、9-14个、9-13个、10- 13个、10-14个、至少9个、至少10个等等的氨基酸组成。所述肽通常为直 链的，但是也可为环状的。此外，所述肽可为分离的肽。
对于肽1(SEQ ID NO：1)，即24个氨基酸的参照序列，参照氨基酸序列 的23个连续氨基酸的片段有时在本文称为23-聚体。类似地，参照序列的22 个连续氨基酸的片段有时在本文称为22-聚体；21个氨基酸的序列称为21-聚 体；20个氨基酸的序列称为20-聚体；19个氨基酸的序列称为19-聚体；18 个氨基酸的序列称为18-聚体；17个氨基酸的序列称为17-聚体；16个氨基 酸的序列称为16-聚体；15个氨基酸的序列称为15-聚体；14个氨基酸的序 列称为14-聚体；13个氨基酸的序列称为13-聚体；12个氨基酸的序列称为 12-聚体；11个氨基酸的序列称为11-聚体；10个氨基酸的序列称为10-聚 体；9个氨基酸的序列称为9-聚体；8个氨基酸的序列称为8-聚体；7个氨基 酸的序列称为7-聚体；6个氨基酸的序列称为6-聚体；5个氨基酸的序列称 为5-聚体；而4个氨基酸的序列称为4-聚体。在一个方面，这些“4-到23-聚 体”的氨基酸序列其本身是肽(有时在本文记为H2N-肽-COOH)，其中的任何 一种，可独立地被化学方法修饰，例如通过化学修饰，其中所述化学修饰可 选自下组：(i)在N-端胺基(H2N-肽-)形成酰胺，诸如与例如C1或优选地与 C2(乙酸)至C22羧酸；(ii)在C-端羧基(-肽-COOH)形成酰胺，诸如与例如氨或 与C1至C22的伯胺或仲胺；和(iii)其组合。
所述肽具有的氨基酸序列选自如下一组：(a)具有参照序列(肽1)的4至 23个连续氨基酸的氨基酸序列；(b)与(a)中所定义的氨基酸序列基本上相似 的序列；和(c)(a)中所定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代 变体、缺失变体、添加变体、及其组合。在一些实施方式中，所述肽具有的 氨基酸序列选自如下一组：(a)具有参照序列(肽1)的8至14个连续氨基酸的 氨基酸序列；(b)与(a)中所定义的序列基本上相同的氨基酸序列；和(c)(a)中 所定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自取代变体、缺失变体、添加变 体、及其组合。在其他实施方式中，所述肽具有的氨基酸序列选自如下一 组：(a)具有参照序列(肽1)的10至12个连续氨基酸的氨基酸序列；(b)与(a) 中所定义的序列基本上相同的氨基酸序列；和(c)(a)中所定义的氨基酸序列 的变体，所述变体选自取代变体、缺失变体、添加变体、及其组合。在进一 步的实施方式中，所述肽具有的氨基酸序列具有参照序列(肽1)的至少9个、 至少10个、9-14个、9-13个、10-13个、10-14个等等的连续氨基酸；与其 基本相同的氨基酸序列；或其变体，所述变体选自下组：取代变体、缺失变 体、添加变体、及其组合。如下文进一步解释的那样，肽的一或多个氨基酸 (例如N-端和/或C-端氨基酸)任选地可独立地进行化学修饰；在一些实施方 案中，肽的一或多个氨基酸可经过化学修饰，而在其他实施方案中，肽的氨 基酸无一被修饰。在一个方面，优选的修饰可出现在肽或肽片段的N-端氨基 酸的胺基(H2N-)(该胺基假如是位于肽序列的内部而不是N-端位置则形成肽 酰胺键)。在另一个方面，优选的修饰可出现在所述肽或肽片段的C-端氨基 酸的羧基(-COOH)(该羧基假如是位于肽序列的内部而不是C-端位置则形成 肽酰胺键)。在另一个方面，优选的修饰可同时出现在N-端胺基(H2N-)和C- 端羧基(-COOH)。
在一些实施方式中，肽的氨基酸序列始自参照序列肽1的N-端氨基酸。 例如，肽可具有选自如下一组的氨基酸序列：(a)具有参照序列肽1的4至 23个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列始自参照序列的N-端 氨基酸(即，肽2、肽4、肽7、肽11、肽16、肽22、肽29、肽37、肽46、 肽56、肽67、肽79、肽92、肽106、肽121、肽137、肽154、肽172、肽 191、或肽211)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a) 中定义的氨基酸序列的变体。这些肽不含有化学部分或者其N-端甘氨酸上的 化学部分不是豆蔻酰基。优选地，化学部分是形式为酰胺键的酰基，例如乙 酰基，或烷基。
在其他实施方式中，肽的氨基酸序列终止于参照序列肽1的C-端氨基 酸。例如，肽可具有选自如下一组的氨基酸序列(a)具有参照序列肽1的4 至23个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列终止于参照序列的 C-端氨基酸(即，肽3、肽6、肽10、肽15、肽21、肽28、肽36、肽45、肽 55、肽66、肽78、肽91、肽105、肽120、肽136、肽153、肽171、肽 190、肽210、或肽231)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列； 和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。
在其他实施方式中，肽的氨基酸序列不是始自参照序列肽1(SEQ ID NO：1)的N-端氨基酸，而是始自参照序列肽1的位置2的氨基酸至位置21的 氨基酸。例如，肽可具有选自如下一组的氨基酸序列(a)具有参照序列肽1 的4至23个连续氨基酸的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列始自参照序列的 位置2至位置21之间的任一氨基酸。这些肽的长度可在4至23个连续氨基 酸之间，且可代表参照序列肽1中间的肽；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基 本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。这些肽公开于表1 或2。这些肽可不含有共价结合的化学部分，或在N-端氨基酸含有化学部 分，该化学部分不是来自氨基酸序列SEQ ID NO：1的N-端甘氨酸或与之等 价的N-端甘氨酸。优选地，该化学部分是酰基，例如乙酰基或豆蔻酰基，其 形式为酰胺键，或者是烷基。
肽氨基酸序列可用于本发明中以抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多，并 用于降低哺乳动物中的粘蛋白分泌过多，并用于抑制粘蛋白分泌过多的方法 中以及减少粘蛋白分泌过多的方法中，所述肽氨基酸序列包括本发明的分离 的肽的氨基酸序列以及任选地含有N-端和/或C-端化学修饰的基团的肽的氨 基酸序列，所述肽氨基酸序列选自如下一组：23-聚体(即具有23个氨基酸的 序列的肽)：肽2；和肽3；22-聚体(即具有22个氨基酸的序列的肽)：肽4； 肽5；和肽6；21-聚体(即具有21个氨基酸的序列的肽)：肽7；肽8；肽9； 和肽10；20-聚体(即具有20个氨基酸的序列的肽)：肽11；肽12；肽13； 肽14；和肽15；19-聚体(即具有19个氨基酸的序列的肽)：肽16；肽17； 肽18；肽19；肽20；和肽21；18-聚体(即具有18个氨基酸的序列的肽)： 肽22；肽23；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-聚体(即具有17个氨基酸 的序列的肽)：肽29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36； 16-聚体(即具有16个氨基酸的序列的肽)：肽37；肽38；肽39；肽40；肽 41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-聚体(即具有15个氨基酸的序列的 肽)：肽46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；肽54；和 肽55；14-聚体(即具有14个氨基酸的序列的肽)：肽56；肽57；肽58；肽 59；肽60；肽61；肽62；肽63；肽64；肽65；和肽66；13-聚体(即具有 13个氨基酸的序列的肽)：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽 73；肽74；肽75；肽76；肽77；和肽78；12-聚体(即具有12个氨基酸的序 列的肽)：肽79；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；肽 87；肽88；肽89；肽90；和肽91；11-聚体(即具有11个氨基酸的序列的 肽)：肽92；肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；肽100；肽 101；肽102；肽103；肽104；和肽105；10-聚体(即具有10个氨基酸的序 列的肽)：肽106；肽107；肽108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽 113；肽114；肽115；肽116；肽117；肽118；肽119；和肽120；9-聚体 (即具有9个氨基酸的序列的肽)：肽121；肽122；肽123；肽124；肽125； 肽126；肽127；肽128；肽129；肽130；肽131；肽132；肽133；肽 134；肽135；和肽136；8-聚体(即具有8个氨基酸的序列的肽)：肽137；肽 138；肽139；肽140；肽141；肽142；肽143；肽144；肽145；肽146； 肽147；肽148；肽149；肽150；肽151；肽152；和肽153；7-聚体(即具 有7个氨基酸的序列的肽)：肽154；肽155；肽156；肽157；肽158；肽 159；肽160；肽161；肽162；肽163；肽164；肽165；肽166；肽167； 肽168；肽169；肽170；和肽171；6-聚体(即具有6个氨基酸的序列的 肽)：肽172；肽173；肽174；肽175；肽176；肽177；肽178；肽179；肽 180；肽181；肽182；肽183；肽184；肽185；肽186；肽187；肽188； 肽189；和肽190；5-聚体(即具有5个氨基酸的序列的肽)：肽191；肽 192；肽193；肽194；肽195；肽196；肽197；肽198；肽199；肽200； 肽201；肽202；肽203；肽204；肽205；肽206；肽207；肽208；肽 209；和肽210；和4-聚体(即具有4个氨基酸的序列的肽)：肽211；肽 212；肽213；肽214；肽215；肽216；肽217；肽218；肽219；肽220； 肽221；肽222；肽223；肽224；肽225；肽226；肽227；肽228；肽 229；肽230；和肽231。
本发明的分离的肽和N-端-和/或C-端-化学修饰的肽的优选的氨基酸序 列选自如下一组：23-聚体：肽2；和肽3；22-聚体：肽4；肽5；和肽6； 21-聚体：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-聚体：肽11；肽12；肽13；肽 14；和肽15；19-聚体：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18- 聚体：肽22；肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-聚体：肽 29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-聚体：肽37； 肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-聚体：肽 46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-聚体： 肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-聚 体：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；和肽75； 12-聚体：肽79；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽 87；11-聚体：肽92；肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和 肽100；10-聚体：肽106；肽107；肽108；肽109；肽110；肽111；肽 112；肽113；和肽114；9-聚体：肽122；肽123；肽124；肽125；肽 126；肽127；肽128；和肽129；8-聚体：肽139；肽140；肽141；肽 142；肽143；肽144；和肽145；7-聚体：肽157；肽158；肽159；肽 160；肽161；和肽162；6-聚体：肽176；肽177；肽178；肽179；和肽 180；5-聚体：肽196；肽197；肽198；和肽199；和4-聚体：肽217；和肽 219。
本发明的分离的肽和N-端和/或C-端化学修饰的肽的更优选的氨基酸序 列选自如下一组：23-聚体：肽2；和肽3；22-聚体：肽4；肽5；和肽6； 21-聚体：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-聚体：肽11；肽12；肽13；肽 14；和肽15；19-聚体：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18- 聚体：肽22；肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-聚体：肽 29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-聚体：肽37； 肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-聚体：肽 46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-聚体： 肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-聚 体：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；肽80；肽 81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽87；11-聚体：肽92；肽93； 肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和肽100；10-聚体：肽106；肽 108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；和肽114：9-聚体：肽 124；肽125；肽126；肽127；肽128；和肽129；8-聚体：肽141；肽 142；肽143；肽144；和肽145；7-聚体：肽159；肽160；肽161；和肽 162；6-聚体：肽178；肽179；和肽180；5-聚体：肽198；和肽199；和4- 聚体：肽219。
在其他实施方式中，肽的氨基酸序列包括连续残基A、K、G、E，如参 照序列肽1的肽219中那样。例如，肽可具有选自如下一组的氨基酸序列： (a)具有参照序列肽1的4至23个连续氨基酸的氨基酸序列，其中肽的氨基 酸序列如参照肽1的肽219中那样包括连续残基A、K、G、和E(例如，肽 219、肽45、肽79、肽67、肽80等)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上 相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。
含有参照肽氨基酸序列(肽1)的氨基酸序列AKGE的肽片段的实例包 括：(a)23-聚体：肽2；和肽3；22-聚体：肽4；肽5；和肽6；11-聚体：肽 7；肽8；肽9；和肽10；20-聚体：肽11；肽12；肽13；肽14；和肽15； 19-聚体：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18-聚体：肽22； 肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-聚体：肽29；肽30；肽 31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-聚体：肽37；肽38；肽39； 肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-聚体：肽46；肽47；肽 48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-聚体：肽56；肽57； 肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-聚体：肽67；肽 68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；和肽75；12-聚体：肽79； 肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽87；11-聚体：肽 93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和肽100；10-聚体：肽 108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；和肽114；9-聚体：肽 124；肽125；肽126；肽127；肽128；和肽129；8-聚体：肽141；肽 142；肽143；肽144；和肽145；7-聚体：肽159；肽160；肽161；和肽 162；6-聚体：肽178；肽179；和肽180；5-聚体：肽198；和肽199；和4- 聚体：肽219、(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中 所定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自取代变体、缺失变体、添加变 体、及其组合，其中所述片段包含4至23个连续氨基酸或由4至23个连续 氨基酸组成。
在另一个实施方式中，优选的肽序列具有选自如下一组的氨基酸序列： (a)具有参照序列(肽1)的10至23个连续氨基酸的氨基酸序列；(b)与(a)中定 义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中所定义的氨基酸序列的变 体，所述变体选自取代变体、缺失变体、添加变体、及其组合，其中优选的 氨基酸序列包含23-聚体：肽2；22-聚体：肽4；21-聚体：肽7；20-聚体： 肽11；19-聚体：肽16；18-聚体：肽22；17-聚体：肽29；16-聚体：肽 37；15-聚体：肽46；14-聚体：肽56；13-聚体：肽67；12-聚体：肽79； 11-聚体：肽92；和10-聚体：肽106。
在进一步的实施方式中，肽的氨基酸序列始自参照序列肽1的N-端氨基 酸并如参照序列肽1的肽219那样包括连续残基A、K、G、和E，而在其他 实施方式中，肽的氨基酸序列终止于参照序列肽1的C-端氨基酸并如参照序 列肽1的肽219那样包括连续残基A、K、G、和E。
所述肽相对于参照氨基酸序列而言可包含一或多个氨基酸缺失、取代和/ 或添加。优选地，所述取代可为保守氨基酸取代，或所述取代可为非保守氨 基酸取代。在一些实施方式中，所述肽，包括具有的氨基酸序列与参照氨基 酸序列基本相同或为其变体的肽，与参照氨基酸序列的相应连续氨基酸相比 不具有缺失或添加，但可具有保守性或非保守性取代。可在本发明的肽中对 参照氨基酸序列进行的氨基酸取代包括，但不限于，以下取代：丙氨酸(A) 可被取代为赖氨酸(K)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、或异亮氨酸(I)；谷氨酸(E) 可被取代为天冬氨酸(D)；甘氨酸(G)可被取代为脯氨酸(P)；赖氨酸(K)可 被取代为精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、或天冬酰胺(N)；苯丙氨酸(F)可被取 代为亮氨酸(L)、缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、或丙氨酸(A)；脯氨酸(P)可被 取代为甘氨酸(G)；谷氨酰胺(Q)可被取代为谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)；精 氨酸(R)可被取代为赖氨酸(K)、谷氨酰胺(Q)、或天冬酰胺(N)；丝氨酸(S) 可被取代为苏氨酸；苏氨酸(T)可被取代为丝氨酸(S)；和缬氨酸(V)可被取 代为亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、丙氨酸(A)、 或正亮氨酸(Nle)。例如，可在本发明的肽中对参照氨基酸序列进行的取代包 括：用丙氨酸(A)取代苯丙氨酸(F)(例如，在参照氨基酸序列的氨基酸位置 4)、谷氨酸(E)取代谷氨酰胺(Q)(例如，在参照氨基酸序列的氨基酸位置 3)、赖氨酸(K)取代丙氨酸(A)(例如，在参照氨基酸序列的氨基酸位置2和/ 或8)、和/或丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)(例如，在参照氨基酸序列的氨基酸位 置7)。
如果相对于参照氨基酸序列而言在本发明的肽(所述肽包含未经修饰的肽 以及通过化学方法修饰的肽例如通过N-端和/或C-端修饰诸如通过酰胺形成 而修饰的肽)的氨基酸序列中引入取代，优选所述肽的氨基酸序列与参照氨基 酸序列具有至少80％序列相同性。具有5至23个氨基酸并且相对于参照氨 基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与所述参照氨基酸序列具有大约80％ 至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具有10至23个氨基酸并且相对于 参照氨基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与所述参照氨基酸序列具有大 约90％至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具有20至23个氨基酸并且 相对于参照氨基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与所述参照氨基酸序列 具有大约95％至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具有10至23个氨基 酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括2处氨基酸取代的肽与所述参照氨基 酸序列具有大约80％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同性。具有16至23 个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括2处氨基酸取代的肽与所述参 照氨基酸序列具有大约87.5％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同性。具有 20至23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括2处氨基酸取代的肽 与所述参照氨基酸序列具有大约90％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同 性。具有15至23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括3处氨基酸 取代的肽与所述参照氨基酸序列具有大约大约80％至大约87％的序列相同 性。具有20至23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括3处氨基酸 取代的肽与所述参照氨基酸序列具有大约85％至大约87％的序列相同性。具 有20至23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括4处氨基酸取代的 肽与所述参照氨基酸序列具有大约80％至大约83％(即，～82.6％)的序列相同 性。
在本发明的肽中，就参照肽(其为24-聚体)的连续氨基酸序列而言，在选 自该24个氨基酸的参照序列中的连续23个氨基酸的序列(23-聚体)中，一个 氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽中同所述23-聚体具有 相同性的氨基酸片段具有95.65％(或～96％)的序列相同性。类似地，在所述 23-聚体中的2、3、4、和5个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述 参照肽氨基酸序列分别具有91.30％(或～91％)、86.96％(或～87％)、82.61％ (或～83％)、和78.27％(或～78％)的序列相同性。类似地，在22-聚体中的1、 2、3、4、和5个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基 酸序列分别具有95.45％(或～95％)、90.91％(或～91％)、86.36％(或～86％)、 81.82％(或～82％)、和77.27％(或～77％)的序列相同性。类似地，在21-聚体 中的1、2、3、4、和5个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照 肽氨基酸序列分别具有95.24％(～95％)、90.48(～91％)、85.71％(～86％)、 80.95(～81％)、和76.19％(～76％)的序列相同性。类似地，在20-聚体中的 1、2、3、4、和5个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨 基酸序列分别具有95.00％(95％)、90.00％(90％)、85.00％(85％)、80.00％ (80％)、和75.00％(75％)的序列相同性。类似地，在19-聚体中的1、2、3、 和4个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别 具有94.74％(～95％)、89.47％(～89％)、84.21％(～84％)、和78.95％(～79％)的 序列相同性。类似地，在18-聚体中的1、2、3、和4个氨基酸的取代所提供 的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别具有94.44％(～94％)、 88.89％(～89％)、83.33％(～83％)、和77.78％(～78％)的序列相同性。类似地， 在17-聚体中的1、2、3、和4个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所 述参照肽氨基酸序列分别具有94.12％(～94％)、88.23％(～88％)、82.35％ (～82％)、和76.47％(～76％)的序列相同性。类似地，在16-聚体中的1、2、 3、和4个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列 分别具有93.75％(～94％)、87.50％(～88％)、81.25％(～81％)、和75.00％(75％) 的序列相同性。类似地，在15-聚体中的1、2、和3个氨基酸的取代所提供 的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别具有93.33％(～93％)、 86.67％(～87％)、和80.00％(80％)的序列相同性。类似地，在14-聚体中的 1、2、和3个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序 列分别具有92.86％(～93％)、85.71％(～86％)、和78.57％(79％)的序列相同 性。类似地，在13-聚体中的1、2、和3个氨基酸的取代所提供的肽的氨基 酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别具有92.31％(～92％)、84.62％(～85％)、 和76.92％(～77％)的序列相同性。类似地，在12-聚体中的1、2、和3个氨基 酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别具有91.67％ (～92％)、83.33％(～83％)、和75.00％(75％)的序列相同性。类似地，在11-聚 体中的1和2个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸 序列分别具有90.91％(～91％)和81.82％(～82％)的序列相同性。类似地，在 10-聚体中的1和2个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨 基酸序列分别具有90.00％(90％)和80.00％(80％)的序列相同性。类似地，在 9-聚体中的1和2个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽氨 基酸序列分别具有88.89％(～89％)和77.78％(～78％)的序列相同性。类似地， 在8-聚体中的1和2个氨基酸的取代所提供的肽的氨基酸序列与所述参照肽 氨基酸序列分别具有87.50％(～88％)和75.00％(75％)的序列相同性。类似 地，在7-聚体、6-聚体、5-聚体、和4-聚体中的1个氨基酸的取代所提供的 肽的氨基酸序列与所述参照肽氨基酸序列分别具有85.71％(～86％)、83.33％ (～83.3％)、80.00％(80％)、和75.00％(75％)的序列相同性。本发明优选的氨 基酸序列与参照序列中的氨基酸序列具有超过80％的序列相同性，更优选地 与参照序列中的氨基酸序列具有81％至96％的序列相同性，且更优选地与参 照序列中的氨基酸序列具有80％至96％的序列相同性。优选的氨基酸序列任 选地可在末端肽氨基处与C2至C22线性脂肪族羧酸部分、更优选C2至C16 线性脂肪族羧酸部分、更优选C2或C16线性脂肪族羧酸部分通过酰胺键而 发生N-端化学健合，并且任选地可在末端肽羧基处与胺通过酰胺键而发生 C-端化学键合，所述胺诸如氨或伯胺或仲胺，诸如C1至C16线性脂肪族伯 胺。
肽79是12-聚体，其取代变体的实例包括，例如，肽238，其中肽79中 位置3的Q被序列238中的E取代；肽233，其中肽79中位置2的A被肽 233中的K取代；肽234，其中肽79中位置8的A被肽234中的K取代；肽 235，其中肽79中位置2和8的A被肽235中的K取代；肽237，其中肽79 中位置4的F被肽237中的A取代；肽239，其中肽79中位置10的K被肽 239中的A取代；肽240，其中肽79中位置11的G被肽240中的A取代； 和肽241，其中肽79中位置12的E被肽241中的A取代。
肽106是10-聚体，其取代变体的实例包括，例如，肽236，其中肽106 中位置4的F被肽236中的A取代；肽242，其中肽106中位置1的G被肽 242中的A取代；肽243，其中肽106中位置3的Q被肽243中的A取代； 肽244，其中肽106中位置5的S被肽244中的A取代；肽245，其中肽106 中位置6的K被肽245中的A取代；肽247，其中肽106中位置7的T被肽 247中的A取代；肽248，其中肽106中位置10的K被肽248中的A取代； 和肽249，其中肽106中位置16和10的K均被肽249中的A取代。
8-聚体的肽137的取代变体的实例包括，例如，肽250，其中肽137中 位置4的F被肽250中的A取代。
4-聚体的肽219的取代变体的实例包括，例如，肽251，其中肽219中 位置2的K被肽251中的A取代。
本文描述的取代变体肽可以为分离的肽的形式或者化学修饰的肽的形 式，例如N-端酰胺如本文所述的豆蔻酰基酰胺、乙酰基酰胺等，以及例如 C-端酰胺如与氨形成的酰胺，以及例如既有N-端酰胺也有C-端酰胺。
如果相对于参照氨基酸序列而言本发明的肽的氨基酸序列中引入了缺 失，则优选地，所述肽的氨基酸序列与参照氨基酸序列具有至少80％的序列 相同性。具有5至23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽 与所述参照氨基酸序列具有80％至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具 有10至23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽与所述参 照氨基酸序列具有大约90％至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具有 20至23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽与所述参照 氨基酸序列具有95％至大约96％(即，～95.7％)的序列相同性。具有10至23 个氨基酸并相对于参照肽而言包括2个氨基酸缺失的肽与所述参照氨基酸序 列具有大约80％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同性。具有16至23个氨 基酸并相对于参照肽而言包括2个氨基酸缺失的肽与所述参照氨基酸序列具 有大约87.5％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同性。具有20至23个氨基 酸并相对于参照肽而言包括2个氨基酸缺失的肽与所述参照氨基酸序列具有 大约90％至大约92％(即，～91.3％)的序列相同性。具有15至23个氨基酸并 相对于参照肽而言包括3个氨基酸缺失的肽与所述参照氨基酸序列具有大约 80％至大约87％的序列相同性。具有20至23个氨基酸并相对于参照肽而言 包括3个氨基酸缺失的肽与所述参照氨基酸序列具有大约85％至大约87％的 序列相同性。具有20至23个氨基酸并相对于参照肽而言包括4个氨基酸缺 失的肽与所述参照氨基酸序列具有大约80％至大约83％(即，～82.6％)的序列 相同性。
如上所述，所述肽的一或多个氨基酸也可经过化学修饰。可利用本领域 已知的任何方法对所述肽的氨基酸序列进行本领域已知的任何氨基酸修饰。
在一些实施方式中，N-端和/或C-端氨基酸可被修饰。例如，肽的N-端 α-氨基酸可在α-N-端(N-端)氨基(α-H2N-)处烷基化、酰胺化、或酰化，以及 例如，肽的C-端氨基酸可在C-端羧基(-COOH)酰胺化或酯化。例如，N-端氨 基可通过酰化进行修饰，以引入任何酰基或脂肪酰基以形成酰胺，包括乙酰 基(即，CH3-C(＝O)-或豆蔻酰基，两者目前均为优选的基团)。在一些实施方 式中，N-端氨基可经修饰以引入化学式为-C(O)R的酰基，其中R是具有1至 15个碳原子线性或分支烷基，或可经过修饰以引入化学式为-C(O)R1的酰 基，其中R1是具有1至15个碳原子的线性烷基。N-酰胺也可以是甲酰胺 (R＝H)。肽的C-端氨基酸也可通过化学方法修饰。例如，C-端氨基酸的C-端 羧基可通过转化为甲酰胺(carboxamide group)以替代羧基而被化学修饰(即， 酰胺化)。在一些实施方式中，N-端和/或C-端氨基酸不被化学修饰。在一些 实施方式中，N-端基团被修饰而C-端基团不被修饰。在一些实施方式中，N- 端和C-端基团均被修饰。
所述肽可在N-端氨基酸的氨基处酰化以与选自下组的酸形成N-端酰 胺：
(i-a)C2(乙酰)至C13脂肪族(饱和的或任选地不饱和的)羧酸(例如，与乙 酸(其是优选的基团)、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸形成的N-端 酰胺)，所述羧酸可以是线性的、分支的(大于C3)、或含有环(大于C3)；
(i-b)饱和的C14脂肪族羧酸，其可以是线性的、分支的、或含有环；
(i-c)不饱和的C14脂肪族羧酸，其可以是线性的、分支的、或含有环；
(i-d)C15至C24脂肪族(饱和的或任选地不饱和的)羧酸，其可以是线性 的、分支的、或含有环(例如，十四烷酸(豆蔻酸，其是优选的基团)、十六烷 酸、9-十六碳烯酸、十八烷酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9，12-十八碳 二烯酸、9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12-十八碳三烯酸、二十烷酸、9-二十碳 烯酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、二十二烷酸、 13-二十二碳烯酸、4，7，10，13，16，19-二十二碳己烯酸、二十四烷酸等等)；
(ii)三氟乙酸；
(iii)苯甲酸；和
(iv-a)C1至C12脂肪族烷基磺酸，其形成脂肪族烷基磺酰胺，其中所述 磺酸的C1至C12脂肪族烷基碳链结构类似于上述脂肪族烷基羧酸的脂肪族 烷基羧酸链。例如，可利用表示为(C1-C11)-烷基-C(O)OH的羧酸基团通过活 化该羧酸基团进行脱水偶联对所述肽进行酰化而形成表示为(C1-C11)-烷基- C(O)-NH-肽的酰胺。类似地，可通过使磺酸种类(表示为(C1-C12)-烷基- S(O2)-X，例如，其中X为卤素或OCH3或其他相容的离去基团)与N-端氨基 反应形成(C 1-C 12)-烷基-S(O2)-NH-肽所表示的磺酰胺来形成磺酰胺。
(iv-b)C14至C24脂肪族烷基磺酸，其形成脂肪族烷基磺酰胺，其中所 述磺酸的C14至C24脂肪族烷基碳链结构类似于上述脂肪族烷基羧酸的脂肪 族烷基羧酸链。例如，可利用表示为(C13-C23)-烷基-C(O)OH的羧酸基团通 过活化该羧酸基团进行脱水偶联对所述肽进行酰化而形成表示为(C13-C23)- 烷基-C(O)-NH--肽的酰胺。类似地，可通过使磺酸种类(表示为(C14-C24)-烷 基-S(O2)-X，例如，其中X为卤素或OCH3或其他相容的离去基团)与N-端 氨基反应形成(C14-C24)-烷基-S(O2)-NH-肽所表示的磺酰胺来形成磺酰胺。
作为另一实例，N-端氨基酸的N-端氨基可用C1至C12脂肪族烷基烷基 化，所述脂肪族烷基的结构如上所述。烷基化可例如通过利用脂肪族烷基卤 化物或脂肪族烷基磺酸酯(甲磺酸酯、甲苯磺酸酯等)来实现，优选利用伯烷 基卤化物或伯烷基磺酸酯。可在末端氨基修饰N-端氨基酸以引入任何酰基或 脂肪族酰基脂肪酰基作为酰胺，包括乙酰基(即，-C(O)CH3，其是优选的基 团)、豆蔻酰基(其是优选的基团)、丁酰基、己酰基、辛酰基、癸酰基、十二 烷酰基、十四烷酰基、十六烷酰基、9-十六碳烯酰基、十八烷酰基、9-十八 碳烯酰基、11-十八碳烯酰基、9，12-十八碳二烯酰基、9，12，15-十八碳三烯酰 基、6，9，12-十八碳三烯酰基、二十烷酰基、9-二十碳烯酰基、5，8，11，14-二十 碳四烯酰基、5，8，11，14，17-二十碳五烯酰基、二十二烷酰基、13-二十二碳烯 酰基、4，7，10，13，16，19-二十二碳己烯酰基、二十四烷酰基，这些基团通过酰 胺键与肽上的末端氨基共价相连。
本发明的肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基团也可被化学修饰。例如可通 过将所述肽的C-端羧酸基团与胺反应形成酰胺基团来修饰C-端氨基酸，所 述酰胺基团例如为，氨(其是优选的基团)的酰胺；C1至C12脂肪族烷基胺的 酰胺，优选地为线性脂肪族烷基胺的酰胺；羟基取代的C2至C12脂肪族烷 基胺的酰胺；线性2-(C1至C12脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺；和ω-甲氧 基-聚(乙烯氧)n-乙基胺基(也称为ω-甲氧基-PEG-α-胺基或ω-甲氧基-(聚乙二 醇)胺基)的酰胺，其中n为0-10。肽的C-端氨基酸的C-端羧酸可为选自如下 一组的酯的形式：C1至C12脂肪族烷基醇的酯、2-(ω-甲氧基-聚(乙烯氧)n)- 乙醇基团的酯，其中n为0-10。在一个方面，优选地，诸如PEG酯、MPEG 酯、PEG酰胺、MPEG酰胺等等中的聚乙二醇组分的分子量为大约500至 40,000道尔顿，更优选地为1000至25,000道尔顿，且最优选地为大约1000 至大约10,000道尔顿。
肽的C-端羧酸基团可表示为化学式肽-C(O)OH，其也可通过转化成活性 形式而得以酰胺化，所述活性形式诸如羧酸卤化物、羧酸酸酐、N-羟基琥珀 酰亚胺酯、五氟苯基(OPfp)酯、3-羟基-2，3-二氢-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt) 酯等，以促进与氨或伯或仲胺的反应，优选氨或伯胺，且优选地，肽中的任 何其他活性基团通过肽合成领域已知的合成的化学相容性保护基团也得以保 护，尤其是肽固相合成的合成的化学相容性保护基团，诸如苯甲基酯、叔丁 基酯、苯基酯等。产生的肽酰胺可表示为化学式肽-C(O)-NR3R4(胺在肽的C 末端)，其中R3和R4独立选自：氢；C1至C12烷基例如甲基、乙基、丁 基、异丁基、环丙甲基、己基、十二基；和任选地更高的烷基例如C14至 C24烷基，如十四基等如上所述的那些。
C-端氨基酸的C-端羧酸也可转化为羟基取代的C2至C12脂肪族烷基胺 (羟基附着于胺的碳原子而不是胺的氮原子)的酰胺，例如2-羟基乙基胺、4- 羟基丁基胺、和12-羟基十二基胺等。
C-端羧酸也可转化为羟基-取代的C2至C12脂肪族烷基胺的酰胺，其中 羟基可被酰化与上述C2至C12脂肪族羧酸形成酯。优选地，在所述肽中， 肽的C-端酰胺表示为化学式肽-C(O)NR5R6，R5是氢，R6选自氢、C1至 C12烷基和羟基-取代的C1至C12烷基。
C-端氨基酸的C-端羧酸可转化为线性2-(C1至C12脂肪族烷基)氧乙基 胺的酰胺。制备所述酰胺可例如通过使线性C1至C12脂肪族醇与钾的氢化 物在含有2-氯乙醇的二甘醇二甲醚中反应提供线性C1至C12脂肪族烷基乙 醇，其可通过氧化成醛转化成胺，然后还原胺化成胺(例如利用氨)，或通过 转化成烷基卤化物(例如利用亚硫酰氯化物)然后利用胺诸如氨进行处理。
C-端氨基酸的C-端羧酸也可转化成线性PEG-胺(例如，ω-羟基-PEG-α- 胺；ω-(C1至C12)-PEG-α-胺例如ω-甲氧基-PEG-α-胺，即MPEG-胺)的酰 胺。在一个方面，优选地，聚乙二醇或PEG组分的分子量为大约500至 40,000道尔顿，更优选地为1000至25,000道尔顿，且最优选地为大约1000 至大约10,000道尔顿。
C-端氨基酸的C-端羧酸也可转化成ω-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙胺的酰胺， 其中n为0-10，其可从相应的ω-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙醇制备，例如通过如 上所述将醇转化为胺。
在另一个实施方式中，C-端羧基可转化为化学式为肽-C(O)-NR7R8的酰 胺，其中R7是氢，R8是线性2-(C1至C12脂肪族烷基)氧乙基，其中C1至 C12脂肪族烷基部分如上所述并包括基团如甲氧乙基(即，CH3O-CH2CH2- )、2-十二基氧乙基等；或R7是氢，R8是ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其 中聚(氧化乙烯)部分的n为0-10，诸如2-甲氧基乙基(即，CH3O-CH2CH2- )、ω-甲氧基乙氧基乙基(即，CH3O-CH2CH2O-CH2CH2-)直到CH3O- (CH2CH2O)10-CH2CH2-。
所述肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基团也可为C1至C12脂肪族烷基醇的 酯的形式，醇的脂肪族烷基部分如上所述。肽的C-端氨基酸的C-端羧酸基 团也可为2-(ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基团的酯的形式，其中n为0- 10，其可从作为2-甲氧基脱氢乙酸钠(sodium 2-methoxyethanolate)形式的2- 甲氧基醇与化学量(stoichiometric amount)的环氧乙烯反应来制备，其中所述 化学量取决于n的大小。
肽中氨基酸的侧链也可被化学修饰。例如，苯丙氨酸或酪氨酸中的苯基 可被选自如下一组的取代基替代：
C1至C24脂肪族烷基(即，线性或分支的，和/或饱和的或不饱和的，和/ 或含有环状基团)，如甲基(优选的)、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、 环丙基、2-甲基环丙基、环己基、辛基、癸基、十二基、十六基、十八基、 二十基、二十二基、二十四基、9-十六碳烯基、9-十八碳烯基、11-十八碳烯 基、9，12-十八碳二烯基、9，12，15-十八碳三烯基、6，9，12-十八碳三烯基、9-二 十碳烯基、5，8，11，14-二十碳四烯基、5，8，11，14，17-二十碳五烯基、13-二十二 碳烯基、和4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯基；
在不饱和位置以外的至少一个碳原子上被羟基取代的C1至C12脂肪族 烷基，所述羟基烷基的实例包括羟基甲基、羟基乙基、羟基十二基等；
羟基取代的C1至C12烷基，该羟基被酸的C2至C25脂肪族羧基酯 化，所述酸例如为：乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十二酸、十四酸、十 六酸、9-十六烯酸、十八酸、9-十八烯酸、11-十八烯酸、9，12-十八二烯酸、 9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12-十八碳三烯酸、二十酸、9-二十烯酸、 5，8，11，14-二十碳四烯酸、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、二十二酸、13-二十二 碳烯酸、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸、二十四酸等；二羧酸如琥珀酸； 或羟基酸诸如乳酸，其中酯取代基的碳原子的总数为3至25；
卤素例如氟-、氯-、溴-、和碘-；硝基-；
氨基-例如NH2、甲基氨基、二甲基氨基；三氟甲基-；
羧基(-COOH)；
C1至C24烷氧基(例如可通过酪氨酸的烷基化形成)，例如甲氧基、乙氧 基、丙氧基、异丙基氧基、丁氧基、异丁基氧基、环丙氧基、2-甲氧基环丙 氧基、环己氧基、辛基氧基、癸基氧基、十二基氧基、十六基氧基、十八基 氧基、二十基氧基、二十二基氧基、二十四基氧基、9-十六碳烯基氧基、9- 十八碳烯基氧基、11-十八碳烯基氧基、9，12-十八碳二烯基氧基、9，12，15-十 八碳三烯基氧基、6，9，12-十八碳三烯基氧基、9-二十碳烯基氧基、5，8，11，14- 二十碳四烯基氧基、5，8，11，14，17-二十碳五烯基氧基、13-二十二碳烯基氧 基、和4，7，10，13，16，19-二十二碳己烯基氧基；
C2至C12羟基烷氧基，例如2-羟基乙基氧基及其与上述羧酸或三氟乙 酸形成的酯。
丝氨酸羟基可被选自如下一组的取代基酯化：
如上所述的C2至C12脂肪族羧酸基团；
三氟乙酸基团；和
苯甲酸基团。
赖氨酸中的ε氨基可通过化学方法修饰，例如通过与以下物质形成酰 胺：如上所述的C2至C12脂肪族羧酸基团(例如，通过胺与羧酸的化学活性 形式反应，所述羧酸例如酸的氯化物、酸酐、N羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯 基(OPfp)酯、3-羟基-2，3-二氢-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt)酯等)，或苯甲酸基 团，或氨基酸基团。此外，赖氨酸中的ε氨基可通过用一或两个C1至C4脂 肪族烷基烷化来进行化学修饰。
谷氨酸中的羧酸基团可通过与胺形成酰胺来修饰，所述胺例如：氨；C1 至C12伯脂肪族烷基胺(其烷基部分如上所述)，包括甲基胺；或者氨基酸的 氨基。
谷氨酸中的羧酸基团可通过与如上所述的C1至C12脂肪族羟基烷基基 团形成酯来修饰，优选与C1至C12脂肪族烷基的伯醇形成的酯，所述醇例 如甲醇、乙醇、1-丙醇、正十二醇等如上所述。
在优选的实施方式中，本发明包括抑制至少一种炎症介质自对象的组织 和/或体液中的至少一种炎性细胞内的颗粒中释放的方法，所述方法包括给所 述组织和/或体液施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含至少一种 肽，所述肽具有选自如下一组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1) 的4至23个连续氨基酸的氨基酸序列；
(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的氨 基酸序列；和
(c)与(a)中所定义的序列基本上相同的氨基酸序列，
其中所述肽的C-端氨基酸任选地独立地被化学修饰，且所述肽的N-端 氨基酸独立地通过使用羧酸进行酰化而被化学修饰或者不被化学修饰，所述 羧酸选自如下一组：C2至C13饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、C14饱和的 (豆蔻酸)或不饱和的脂肪族羧酸、C15至C24饱和的或不饱和的脂肪族羧 酸、和三氟乙酸，条件是当所述肽的氨基酸序列以所述参照序列的序列 GAQF为起始时，所述肽通过仅使用选自如下一组的羧酸进行酰化而被酰化 修饰或者不被化学修饰：C2至C13饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、C14不饱 和的脂肪族羧酸、C15至C24饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸， 其中所述肽，任选地与药用可接受的载体相组合，并以降低炎症介质释放的 治疗有效量，使得所述炎症介质自至少一种炎性细胞中的释放与在缺乏所述 至少一种肽的情况下所述炎症介质自至少一种相同类型的炎性细胞中的释放 相比被降低。
优选地使用可在N-端α氨基酸被乙酰化的肽进行所述方法。所述肽可由 至少10个连续氨基酸残基组成且优选地为乙酰基-肽106(SEQ ID NO：106)。
该方法也可使用由至少4个连续氨基酸残基且更优选地由至少6个连续 氨基酸残基组成的肽。此外，肽的N-端α氨基酸可以是豆蔻酰化的。该方法 还可使用可用氨在C-端α氨基酸进行酰胺化的肽。
在进一步的实施方式中，该方法使用的肽包含如下氨基酸序列：(a)具有 参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的4至23个 连续氨基酸的氨基酸序列，其中(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸选自参照序 列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的第2至21位氨基 酸。此外，这些肽的N-端α氨基酸可以是豆蔻酰化的，且其C-端α氨基酸 还可用氨进行酰胺化。
本发明的施用方法将降低炎症介质的释放定义为阻断或抑制自所述对象 内的炎性细胞释放炎症介质的机制。
所述施用方法包括将所述的肽与药用可接受的载体合并或混合以形成药 物组合物。
本发明的施用方法以释放抑制量抑制至少一种炎症介质的释放，使得所 述炎症介质自至少一种炎性细胞中的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下 所述炎症介质自至少一种相同类型的炎性细胞中的释放相比被降低。所述对 象的炎性细胞可以是白细胞、粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核 细胞、巨噬细胞或其组合。
自至少一种炎性细胞的至少一种颗粒中释放的炎症介质选自髓过氧化物 酶(MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)、主要碱性蛋白(MBP)、溶菌 酶、粒酶、组胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趋化因子、细胞因子、花生四烯酸代 谢物、防卫素、杀菌性通透性增强蛋白(BPI)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶 G、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、α-甘露糖苷酶、磷 脂酶A2、4-硫酸软骨素、蛋白酶3、乳铁蛋白、胶原酶、补体激活物、补体 受体、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体、层粘连蛋白受体、 细胞色素b558、单核细胞-趋化因子、组胺酶、维生素B12结合蛋白、明胶 酶、纤溶酶原激活物、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、及其组合。优选地所述炎症介 质选自髓过氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)、主要碱性蛋 白(MBP)、溶菌酶、粒酶及其组合。
权利要求13的方法，其中所述降低炎症介质释放的有效量的所述肽包 含脱颗粒抑制量的肽，其使得自至少一种炎性细胞释放的炎症介质的量与缺 乏所述肽的情况下自至少一种炎性细胞释放的量相比降低大约1％至大约 99％，或优选地降低大约5-50％至大约99％。
本发明的方法可用于治疗患有呼吸道疾病的对象。所述呼吸道疾病可以 是哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和囊性纤维化。可通过本 发明而治疗的对象优选地是哺乳动物例如人、犬、马和猫科动物。
本发明的肽的施用方法可以是局部施用、胃肠外施用、直肠施用、肺部 施用、鼻部施用和口服。更优选地，肺部施用包括气溶胶，其可由干粉喷雾 吸入器、定量喷雾吸入器或喷雾器产生。此外，给对象施用还可包括施用选 自如下一组的第二分子：抗生素、抗病毒化合物、抗寄生虫化合物、抗炎化 合物、和免疫调节剂。
该方法还可用于治疗患有选自如下一组的疾病的对象：肠病、皮肤病、 自身免疫病、疼痛综合征、及其组合。更具体地，肠病选自溃疡性结肠炎、 克罗恩病和肠激惹综合征。本方法可治疗的皮肤病包括红斑痤疮、湿疹、银 屑病和重度痤疮。本发明还可治疗患有关节炎的对象。
本发明的一个实施方式涵盖施用包含如下氨基酸序列的肽，所述氨基酸 序列与具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的 4至23个连续氨基酸的氨基酸序列(a)基本上相同。优选地，这些肽选自如下 一组：SEQ ID NO：233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、 243、244、245、247、248、249、250、251和252。这些肽还可以是N-端α 氨基酸乙酰化的或N-端α氨基酸豆蔻酰化的，且任选地其C-端α氨基酸被 氨进行酰胺化。
通过施用如上所述的本发明的肽，本发明的方法还可用于降低对象的粘 液分泌过多，并可用于降低对象的粘液分泌细胞或组织的MARCKS-相关性 粘液分泌过多，由此与缺乏施用所述肽时可能出现的情况相比，对象的粘液 分泌过多被降低。
本发明涉及分离的肽，其具有选自如下一组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1) 的4至23个连续氨基酸的氨基酸序列；
(b)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的氨 基酸序列；和
(c)与(a)中所定义的序列基本上相同的氨基酸序列，
其中所述肽的C-端氨基酸任选地独立地被化学修饰，且所述肽的N-端 氨基酸独立地通过使用羧酸进行酰化而被化学修饰或者不被化学修饰，所述 羧酸选自如下一组：C2至C13饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、C14饱和的或 不饱和的脂肪族羧酸、C15至C24饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、和三氟乙 酸，条件是当所述肽的氨基酸序列以所述参照序列的序列GAQF为起始时， 所述肽通过仅使用选自如下一组的羧酸进行酰化而被酰化修饰或者不被化学 修饰：C2至C13饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、C14不饱和的脂肪族羧酸、 C15至C24饱和的或不饱和的脂肪族羧酸、和三氟乙酸，其中所述肽，任选 地与药用可接受的载体相组合，并以降低炎症介质释放的治疗有效量，使得 所述炎症介质自至少一种炎性细胞中的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况 下所述炎症介质自至少一种相同类型的炎性细胞中的释放相比被降低。
所述分离的肽的N-端α氨基酸可以被乙酰化。所述分离的肽由至少10 个连续氨基酸残基组成，且优选地是由乙酰基-肽106(SEQ ID NO：106)组成 的分离的肽。
在另一个实施方式中，所述肽由至少4个连续氨基酸残基组成或者所述 肽由至少6个连续氨基酸残基组成。
所述肽的N-端α氨基酸可以是豆蔻酰化的和/或所述肽的C-端α氨基酸 可以用氨进行酰胺化。
所述分离的肽还可包含上述(a)的氨基酸序列，(a)具有参照序列 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的4至23个连续氨基酸 的氨基酸序列；其中所述(a)的氨基酸序列的N-端氨基酸选自参照序列 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的第2至21位氨基酸。 所述肽的N-端α氨基酸还可以是豆蔻酰化的或乙酰化的，或任选地用氨使 C-端α氨基酸酰胺化。
在另一个实施方式中，所述分离的肽的氨基酸序列与(a)的氨基酸序列基 本上相同，所述(a)的氨基酸序列具有参照序列 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)的4至23个连续氨基 酸。这些肽优选地选自如下一组：SEQ ID NO：233、234、235、236、237、 238、239、240、241、242、243、244、245、247、248、249、250、251和 252。这些肽可进一步在N-端α氨基酸被乙酰化或在N-端α氨基酸被豆蔻酰 化，且任选地用氨使C-端α氨基酸酰胺化。(c)的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、 245、247、248、249、250、251和252的(a)的氨基酸序列基本上相同。
本发明还涵盖包含以上数段以及本文中所公开的分离的肽和赋形剂的组 合物。本发明还涵盖以上数段以及本文中所公开的分离的肽和药用可接受的 载体的药物组合物。所述药物组合物进一步优选地可以是无菌的、可消毒的 或灭菌的。这些肽可与用于施用的试剂一起置于试剂盒中。
附图说明
图1A-1B显示了PKC-依赖性磷酸化将MARCKS从质膜释放至细胞质。
图2A-2C显示PKG通过活化PP2A而诱导MARCKS去磷酸化。
图3给出的条线图证实PP2A是粘蛋白分泌途径的必需组分。
图4的凝胶显示MARCKS与细胞质中的肌动蛋白和肌球蛋白相结合。
图5描绘了控制中性粒细胞中的MPO分泌的信号机制。
图6的条线图描绘了MANS肽能够阻断分离的犬中性粒细胞分泌髓过氧 化物酶。
图7的条线图描绘了MANS肽能够阻断分离的人中性粒细胞分泌髓过氧 化物酶。
图8的条线图显示PMA刺激可小量增加从LPS-刺激的人中性粒细胞分 泌的MPO，以8-Br-cGMP进行共刺激使之以浓度依赖性方式被增强。
图9的条线图显示8-Br-cGMP刺激对LPS-刺激的人中性粒细胞分泌 MPO几乎没有作用，直至用PMA以浓度依赖性方式进行共刺激。
图10的条线图显示PMA刺激可小量增加从LPS-刺激的犬中性粒细胞分 泌的MPO，以8-Br-cGMP进行共刺激使之以浓度依赖性方式被增强。
图11的条线图显示8-Br-cGMP刺激对LPS-刺激的犬中性粒细胞分泌 MPO几乎没有作用，直至用PMA以浓度依赖性方式进行共刺激。
图12的条线图显示PMA+8-Br-cGMP的共刺激对于LPS-刺激的犬中性 粒细胞的MPO分泌最大化是必需的。
发明详述
以下结合描述本发明优选实施方式的附图更加充分地描述本发明。不 过，本发明可以不同的形式来实施，而不应被理解为局限于在此给出的具体 实施方式。相反，给出这些具体实施方式是为了使得公开充分而完整，以便 使得本领域人员充分了解本发明的范围。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科技术语均具有本发明所属 技术领域的普通技术人员通常所了解的含义。所有的出版物、专利申请、专 利以及本文提及的其它参考文献均通过引用以其全部内容并入本文。文中的 “一”(“a”或“an”)在用于描述本发明的任何方面是要理解成指的是一个或多 个。
本发明涉及抑制自至少一种炎性细胞胞吐释放至少一种炎症介质的方 法，包括将所述至少一种炎性细胞与有效量的至少一种肽相接触，所述至少 一种炎性细胞包含位于所述细胞内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述至少 一种肽选自MANS肽及其在此所述的活性片段，以使得所述炎症介质自所述 炎性细胞的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下可能自相同类型的炎性细 胞释放的所述炎症介质相比被降低。
本发明进一步涉及抑制自对象的组织或体液内的至少一种炎性细胞释放 至少一种炎症介质的方法，包括给所述对象的包含至少一种炎性细胞的组织 和/或体液施用治疗有效量的药物组合物，所述至少一种炎性细胞包含位于所 述细胞内的囊泡内的至少一种炎症介质，所述组合物包含治疗有效量的选自 MANS肽及其活性片段的至少一种肽，以使得所述炎症介质自至少一种炎性 细胞的释放与在缺乏所述至少一种肽的情况下可能自至少一种相同类型的炎 性细胞释放的所述炎症介质相比被降低。更具体地，降低炎症介质的释放包 含阻断或抑制炎症介质自炎性细胞释放的机制。
本发明涉及将前述以及整个说明书所述的肽接触和/或施用给可能位于对 象的组织或体液内的任何已知的炎性细胞，所述细胞含有位于所述细胞内的 囊泡内的至少一种炎症介质。炎性细胞优选地是白细胞，更优选地是粒细 胞，后者可进一步分为中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其组 合。本发明的方法中所接触的炎性细胞也可以是单核细胞/巨噬细胞。
本发明旨在减少炎性细胞的囊泡中所含的炎症介质的释放，这些炎症介 质选自如下一组：髓过氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)、 主要碱性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶、组胺、蛋白聚糖、蛋白酶、趋化因 子、细胞因子、花生四烯酸代谢物、防卫素、杀菌性通透性增强蛋白 (BPI)、弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、β-D-葡 糖醛酸糖苷酶、α-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸软骨素、蛋白酶3、乳铁 蛋白、胶原酶、补体激活物、补体受体、N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (FMLP)受体、层粘连蛋白受体、细胞色素b558、单核细胞-趋化因子、组胺 酶、维生素B12结合蛋白、明胶酶、纤溶酶原激活物、β-D-葡糖醛酸糖苷 酶、及其组合。优选地，这些炎症介质选自髓过氧化物酶(MPO)、嗜酸性粒 细胞过氧化物酶(EPO)、主要碱性蛋白(MBP)、溶菌酶、粒酶及其组合。
本发明将有效量的所述肽与炎性细胞相接触，其中所述有效量被定义为 脱颗粒抑制量的MANS肽或其活性片段，其使得与缺乏MANS肽或其活性 片段的情况下自至少一种炎性细胞释放的量相比，自至少一种炎性细胞释放 的炎症介质的量降低大约1％至大约99％。该量也称为有效的炎症介质释放 降低量。更优选地，所述有效量的用于接触的肽包括脱颗粒抑制量的MANS 肽或其活性片段，其使得与缺乏MANS肽或其活性片段的情况下自至少一种 炎性细胞释放的量相比，自至少一种炎性细胞释放的炎症介质的量降低大约 5-50％至大约99％。
在一个实施方式中，本发明旨在将治疗有效量的至少一种包含MANS肽 及其活性片段的肽施用至对象的组织或体液中，其中所述对象患有呼吸道疾 病，优选地是哮喘、慢性支气管炎或COPD。在另一个实施方式中，所述对 象患有肠病、皮肤病、自身免疫病、疼痛综合征、及其组合。肠病可以是溃 疡性结肠炎、克罗恩病或肠激惹综合征。对象可以是患有皮肤病，例如红斑 痤疮、湿疹、银屑病或重度痤疮。对象也可以是患有关节炎，例如类风湿性 关节炎、牛皮癣关节炎、系统性红斑狼疮。患有囊性纤维化的对象也可用本 发明的方法和肽来治疗。本发明的方法优选地用于治疗对象，例如哺乳动 物，优选地为人、犬、马和猫科动物。
通过给对象施用包括在此所述的MANS肽或活性片段的一或多种肽的本 发明的治疗方法包括局部施用、胃肠外施用、直肠施用、肺部施用、鼻部施 用或口服。更具体地，肺部施用选自气溶胶、干粉喷雾吸入器、定量喷雾吸 入器、和喷雾器。此外，本发明的方法还可包括给对象施用选自如下一组的 第二分子：抗生素、抗病毒化合物、抗寄生虫化合物、抗炎化合物、和免疫 调节剂。
在一个方面，本发明涉及施用药物组合物的方法。所述药物组合物包含 治疗有效量的已知化合物和药用可接受的载体。″治疗有效″量在本文中是足 以减轻对象所表现出的症状的化合物的量。治疗有效量可随着患者的年龄和 身体条件、被治疗患者的基本严重程度、治疗的持续时间、任何同时的治疗 的性质、所用的药用可接受的载体以及本领域人员所知的其他类似因素而变 化。药用可接受的载体优选地是固体剂型例如片剂和胶囊。也可使用口服的 液体制剂，其可制备为糖浆和悬液的形式，例如，含有活性成分、糖以及乙 醇、水、甘油和丙二醇的混合物的溶液。需要的话，此类液体制剂可包括一 或多种以下组分：着色剂、调味剂和糖精。此外，还可使用增稠剂例如羧甲 基纤维素以及其他可接受的载体，本领域人员知道如何对其进行选择。
如上所述，本发明涉及用于调节细胞分泌过程的方法，特别是涉及用于 调节炎症介质自炎性细胞释放的细胞分泌过程的方法。在本文中，术语″调节 ″指的是阻断、抑制、减少、降低、增加、增强或者刺激。一些细胞分泌过程 涉及细胞内的膜结合型囊泡或颗粒释放成分。膜结合型囊泡或颗粒被定义为 细胞内颗粒，其主要是泡状的(或细胞内的囊泡)，并含有可被分泌的储存物 质。以及国内发现，这些囊泡的一些成分，例如炎性细胞中所含的那些，造 成大量哺乳动物组织中的各种病理学。这些分泌的一些效应似乎包括在炎症 过程中损伤以往健康的组织。本发明提供阻断从膜结合型囊泡、包括从炎性 细胞中的那些膜结合型囊泡的分泌的手段，这是通过用合成的肽靶向细胞内 分泌途径中的特定重要分子而实现的。该方法对于治疗人和动物的多种分泌 过度和炎症疾病具有治疗意义。
更具体地，本发明靶向炎性细胞，这些炎症细胞在细胞质内的一或多种 颗粒或囊泡中含有炎症介质。将细胞与选自MANS肽或其活性片段的一或多 种肽相接触，说明书对这些肽进行了详细描述。优选地，通过给患有疾病的 对象施用肽而使得肽与炎性细胞接触，在所述疾病中，这些炎性细胞出现在 特定的组织或组织的体液中。经施用后或者所述肽与细胞接触后，所述肽竞 争性竞争并竞争性抑制天然的MARCKS蛋白与含有炎症介质的细胞内颗粒 或囊泡的膜的结合。由此阻断MARCKS蛋白与炎性细胞内的囊泡的结合， 因此这些细胞内的这些囊泡不会象它们受到向细胞外胞吐释放其炎症介质成 分的刺激时通常所做的那样移向细胞的质膜。因此，本发明的方法抑制囊泡 向细胞质膜的移动，由此减少了炎性细胞的炎症介质释放。由于介质自炎症 细胞释放的速度和释放的量均取决于所施用的且与炎性细胞相接触的肽的浓 度，因此随时间而从细胞释放的炎症介质的量得以降低。
本发明的一个优势在于其可组合包括直接阻断粘液分泌的治疗和独特的 抗炎治疗。本发明优于目前的影响免疫系统的广泛抑制的抗炎治疗的一个优 势在于所述的肽被认为仅阻断从炎性细胞分泌的细胞内成分的分泌。因此， 尽管炎症介质被抑制，但免疫系统的许多方面仍将起作用。
本发明的化合物可调节，即阻断，炎症介质自细胞的释放。对于预防和 治疗多种疾病，例如，涉及炎症的疾病和病理情况，抑制炎症介质释放是一 种有吸引力的手段。因此，本发明的化合物可用于治疗此类病症。这些疾病 包括气道疾病和慢性炎性疾病，后者包括，但不限于，骨关节炎、多发性硬 化、Guillain-Barre综合征、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、移植物抗宿 主病和系统性红斑狼疮。本发明的化合物还可用于治疗与促炎症介质和酶的 活性水平升高相关的其他疾病如对各种感染物的反应，以及多种自身免疫疾 病例如类风湿性关节炎、中毒休克综合征、糖尿病和炎性肠病。
本发明的肽和方法的用途包括对抗炎症的治疗以及将所述肽的抗炎活性 与其阻断粘液分泌的能力相结合的治疗。可通过所述肽的同时阻断炎症和粘 液分泌的能力而治疗的疾病包括，但不限于，炎性肠病、消化系统疾病(即， 胆囊炎、Menetier病)和炎性气道疾病。
已经发现其他促炎症介质与多种与中性粒细胞侵入炎症或损伤部位相关 的疾病状态相关。已经证实阻断抗体可用于治疗急性炎症中的中性粒细胞相 关性组织损伤(Harada et al.，1996，Molecular Medicine Today 2，482)。除中性 粒细胞以外的其他可释放炎症介质的细胞包括其他白细胞，例如嗜碱性粒细 胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，并可以针对这些细胞的分泌进行 治疗。中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞均为粒细胞的类型，即， 它们是细胞质内具有颗粒的白细胞。白细胞合成多种炎症介质，它们被包装 并储存于细胞浆的颗粒内。这些介质例如为中性粒细胞内的髓过氧化物酶 (MPO)(Borregaard N，Cowland JB.Granules of the neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.Blood 1997；89：3503-3521)、嗜酸性粒细胞内的 嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)和主要碱性蛋白(MBP)(Gleich G J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation.J Allergy Clin Immunol 2000；105：651-663)、单核细胞/巨噬细胞内的溶菌酶(Hoff T，Spencker T， Emmendoerffer A.，Goppelt-Struebe M.Effects of glucocorticoids on the TPA- induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992；52：173-182；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2is required for lysozyme secretion in U937 promonocytes.J Immunol 2003；170：5276-5280)、 和天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性淋巴细胞内的粒酶(Bochan MR，Goebel WS， Brahmi Z.Stably transfected antisense granzyme B and perforin constructs inhibit human granule-mediated lytic ability.Cell Immunol 1995；164：234-239；Gong J H.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia 1994；8：652-658；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK. Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK- 92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383；和Takayama H，Trenn G， Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-1907-10)。作为这些细胞侵润至损伤或疾病的组织部 位的结果，这些介质和释放于损伤部位并可促成炎症和修复，例如在肺部和 其他部位。白细胞通过胞吐机制释放这些颗粒(Burgoyne RD，Morgan A. Secretory granule exocytosis.Physiol Rev 2003；83：581-632；Logan MR， Odemuyiwa SO，Moqbel R.Understanding exocytosis in immune and inflammatory cells：the molecular basis of mediator secretion.J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932)。
肥大细胞通常不在血流中循环，其和嗜碱性粒细胞含有分泌型细胞质颗 粒，这些颗粒储存并(当细胞被活化后)释放炎症(过敏)介质，例如组胺；蛋白 聚糖，例如肝素和硫酸软骨素；蛋白酶，例如类胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽 酶、和组织蛋白酶G-样蛋白酶；趋化因子、细胞因子和花生四烯酸代谢物， 它们作用于血管、平滑肌、结缔组织、粘液腺和炎性细胞。
中性粒细胞也称为多形核白细胞(PMN)，其占循环白细胞总数的50至 60％。中性粒细胞对抗那些穿透感染或损伤部位的肌体物理屏障的感染物， 例如细菌、真菌、原虫、病毒、感染病毒的细胞、以及肿瘤细胞。中性粒细 胞的成熟经历6个形态学阶段：原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼 粒细胞、非分叶核(杆状核)中性粒细胞、和分叶核(具有功能活性的)中性粒细 胞。
在中性粒细胞中，炎症介质储存于初级(嗜天青)、次级(特异性)和三级 (明胶酶)颗粒以及分泌性囊泡中。在多种炎症介质中，初级(嗜天青)颗粒含有 髓过氧化物酶(MPO)、溶菌酶、防卫素、杀菌性通透性增强蛋白(BPI)、弹 性蛋白酶、组织蛋白酶G、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、β-D-葡糖醛酸糖 苷酶、α-甘露糖苷酶、磷脂酶A2、4-硫酸软骨素、和蛋白酶3(例如参见 Hartwig JH，Thelen M，Rosen A，Janmey PA，Naim AC，Aderem A.MARCKS is an actin filament crosslinking protein regulated by protein kinase C and calcium- calmodulin.Nature 1992；356：618-622)；次级(特异性)颗粒含有溶菌酶、乳铁 蛋白、胶原酶、补体激活物、磷脂酶A2、补体受体例如CR3、CR4、N-甲酰 甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(FMLP)受体、层粘连蛋白受体、细胞色素b558、 单核细胞-趋化因子、组胺酶、和维生素B12结合蛋白；而小储存颗粒含有 明胶酶、纤溶酶原激活物、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、β-D-葡糖醛酸糖 苷酶、α-甘露糖苷酶和细胞色素b558。
中性粒细胞颗粒含有抗微生物或细胞毒性物质、中性蛋白酶、酸性水解 酶和大量细胞质膜受体。在嗜天青颗粒成分中，髓过氧化物酶(MPO)是将过 氧化氢转化为次氯酸的关键酶。其与过氧化氢和卤化物辅因子共同形成白细 胞的有效杀微生物和细胞毒性机制——髓过氧化物酶系统。
防卫素占嗜天青颗粒蛋白质的30至50％，它们是小分子的(分子量＜ 4000)强抗微生物肽，对大量细菌、真菌和某些病毒具有细胞毒性。其毒性可 能在于对靶细胞的膜通透作用，这类似于其他的通道形成蛋白(穿孔蛋白)。
细菌通透性增加(BPI)蛋白是穿孔蛋白成员。其对革兰氏阴性菌具有高度 毒性，但对革兰氏阳性菌或真菌则不具有，其也可中和内毒素，即革兰氏阴 性菌细胞被膜的毒性脂多糖成分。
乳铁蛋白螯合游离铁，由此防止没有被杀死的摄入的微生物的生长并增 加细菌对溶菌酶的通透性。
丝氨酸蛋白酶例如弹性蛋白酶和组织蛋白酶G水解细菌细胞被膜中的蛋 白质。粒细胞弹性蛋白酶的底物包括胶原蛋白交联物和蛋白聚糖，以及血 管、韧带和软骨的弹性蛋白成分。组织蛋白酶D裂解软骨蛋白聚糖，而粒细 胞胶原酶可活跃裂解来自骨、软骨和肌腱的I型胶原蛋白以及(程度稍低地) 裂解III型胶原蛋白。胶原蛋白断裂产物对中性粒细胞、单核细胞和成纤维 细胞具有趋化活性。
蛋白酶抑制剂例如α2-巨球蛋白和α1-抗蛋白酶介导了溶酶体蛋白酶的组 织破坏能力的调节。这些抗蛋白酶存在于血清和滑膜液中。它们通过结合并 覆盖蛋白酶的活性位点而起作用。蛋白酶-抗蛋白酶失衡在肺气肿的发病机理 中具有重要作用。
嗜天青颗粒主要在细胞内环境中(在吞噬溶酶体空泡内)起作用，其中它 们参与杀死并降解微生物。中性粒细胞特异性颗粒易于释放其成分至细胞 外，并在炎症的起始方面发挥重要作用。特异性颗粒代表了细胞内储备的各 种质膜成分，包括细胞色素b(NADPH氧化酶的成分，该酶负责产生过氧化 物)、补体片段iC3b(CR3、CR4)的受体、层粘连蛋白的受体、和甲酰甲硫氨 酰-肽趋化因子。除其他之外，还有与组胺降解有关的组胺酶、维生素结合蛋 白、以及负责形成纤溶酶并从C5裂解出C5a的纤溶酶原激活物。
从对这些颗粒具有先天异常的一些患者的研究中抗清楚地看出中性粒细 胞颗粒在炎症中的重要性。患有Chédiak-Higashi综合征的患者在建立炎症应 答的速度方面具有严重异常并具有异常巨大的溶酶体颗粒。这种先天性特异 性颗粒缺陷综合征是极其罕见的疾病，其特征为炎症应答减低和皮肤和深部 组织严重的细菌感染。
尽管对调节这些颗粒的胞吐性分泌的机制仅有部分了解，但已经鉴定了 该过程中的一些关键性分子，包括细胞内Ca2+瞬变(Ca2+transients)(Richter et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；87：9472-9476；Blackwood et al.，Biochem J 1990；266：195-200)、G蛋白、酪氨酸和蛋白激酶(PK，特别是PKC) (Srnolen et al.，Biochim Biophys Acta 1990；1052：133-142；Niessen et al.， Biochim.Biophys.Acta 1994；1223：267-273；Naucler et al.，Pettersen et al.， Chest 2002；121；142-150)、Rac2(Abdel-Latif et al.，Blood 2004；104：832- 839；Lacy et al.，J Immunol 2003；170：2670-2679)和各种SNARE、SNAP和 VAMP(Sollner et al.，Nature 1993；362：318-324；Lacy，Pharmacol Ther 2005；107：358-376)。
SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺附着蛋白受体)蛋白是一族膜相关性 蛋白质，其特征为被称为SNARE基序的α-螺旋卷曲螺旋结构域(Li et al.， Cell.Mol.Life Sci.60：942-960(2003))。基于它们在囊泡上的位置和靶膜，这 些蛋白质被分类为v-SNARE类和t-SNARE类；基于SNARE基序中心的保 守性精氨酸或谷氨酰胺残基的另一种分类方案将其分为R-SNARE类和Q- SNARE类。SNARE位于分泌和内吞交通途径的分离的膜性腔室中，并促成 细胞内膜融合过程的特异性。t-SNARE结构域由4个具有卷曲螺旋扭曲的螺 旋束组成。SNARE基序促成两个膜的融合。SNARE基序分为4类：突触融 合蛋白1a(t-SNARE)同源物、VAMP-2(v-SNARE)、以及SNAP-25的N-端和 C-端SNARE基序。来自各类的一个成员可相互作用形成SNARE复合体。 SNARE基序见于某些突触融合蛋白家族成员例如突触融合蛋白1a的N-端结 构域，其是神经递质释放所必需的(Lerman et al.，Biochemistry 39：8470-8479 (2000))，and syntaxin 6，which is found in endosomal transport vesicles(Misura et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：9184-9189(2002))。
SNAP-25(突触小体相关蛋白25kDa)蛋白是SNARE复合体的成分，其 可造成膜融合的特异性并通过形成紧密复合体(SNARE复合体或轴心复合体 (core complex))而直接实现融合，所述复合体将突触囊泡与质膜带到一起。 SNARE构成一个大蛋白家族，这些蛋白质以称为SNARE基序的60个残基 的序列为特征，所述基序高度倾向于形成卷曲螺旋且通常位于羧基端跨膜区 域之前。突触轴心复合体由4个SNARE基序形成(2个来自SNAP-25，来自 突触泡蛋白和突触融合蛋白1的各一个)，它们在分离的情况下是松散的，但 组装后形成平行的4螺旋束。轴心复合体的晶体结构揭示所述螺旋束高度扭 曲且表面含有若干盐桥，并具有内部疏水性残基层。复合体中心的极性层由 3个谷氨酰胺(2个来自SNAP-25，一个来自突触融合蛋白1)和一个精氨酸 (来自突触泡蛋白)形成(Rizo et al.，Nat Rev Neurosci 3：641-653(2002))。 SNAP-25家族的膜含有一簇半胱氨酸残基，它们可被十六酰化，用于膜附着 (Risinger et al.，J.Biol.Chem.268：24408-24414(1993))。
中性粒细胞的主要作用是吞噬并破坏感染物。它们还可在获得性(特异性) 免疫应答出现之前限制某些微生物的生长。尽管中性粒细胞对于宿主防御是 必需的，但也认为它们参与了多种慢性炎症疾病的病理和缺血再灌注损伤。 在从炎症部位分离的液体中可检测到来自中性粒细胞的水解性酶和氧化灭活 的蛋白酶抑制剂。正常情况下，中性粒细胞可迁移至感染部位而不破坏宿主 组织。不过，有时可出现有害的宿主组织损伤。这种损伤可通过多种独立的 机制发生。这些包括迁移过程中的提前活化，杀伤某些微生物的过程中毒性 产物释放至细胞外，作为组织重建的第一步将感染的或损伤的宿主细胞和碎 片移除，或未能终止急性炎症反应。缺血再灌注损伤与中性粒细胞进入受累 组织并随后活化有关。这可由被破坏的宿主细胞释放的物质引发或者是通过 黄嘌呤氧化酶产生的过氧化物所引起。
在正常情况下，血液可含有正常的、初步活化的(primed)、活化的和衰 竭的(spent)中性粒细胞。在炎症部位主要是活化的和衰竭的中性粒细胞。活 化的中性粒细胞旺盛产生活性氧中间体(ROI)。在急性细菌感染患者和成人呼 吸窘迫综合征(ARDS)患者的血液中检测到了具有旺盛呼吸爆发的中性粒细 胞亚群。这是中性粒细胞矛盾现象的一个实例。中性粒细胞被认为参与了这 一病症的病理学，原因在于这些细胞大量进入肺部，且活化中性粒细胞所释 放的氧化剂和水解酶引起了相关的组织破坏。当ARDS加重时，由炎症产物 在局部诱导的中性粒细胞杀微生物活性的损害，可能是宿主方面的一种保护 性反应。
热损伤的急性期也与中性粒细胞活化相关，随后出现各种中性粒细胞功 能的广泛损害。滑膜液中的免疫复合物引起的中性粒细胞活化造成类风湿性 关节炎的病理。中性粒细胞的慢性活化还可触发肿瘤的发生，因为中性粒细 胞产生的某些ROI破坏DNA，而蛋白酶促进肿瘤细胞迁移。在重度烧伤患 者中，发现细菌感染的发生与抗体和补体受体阳性中性粒细胞的比例和绝对 数降低之间的关联性。还发现来自中性粒细胞的氧化剂氧化低密度脂蛋白 (LDL)，使得后者更加有效地通过特异性清道夫受体而结合于巨噬细胞的质 膜。这些氧化的LDL被巨噬细胞摄取后可引起动脉硬化。此外，在患有原发 性高血压、霍奇金病、炎性肠病、银屑病、结节病和败血病的患者中发现存 在初步活化的中性粒细胞，其中的初步活化与高浓度的循环TNF-α(恶病质 素)有关。
抗氧化剂和抗蛋白酶的防护作用失效后，可出现宿主组织的水解破坏和 慢性炎症疾病。抗蛋白酶缺陷被认为可造成肺气肿的病理学。多种抗蛋白酶 是丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)家族的成员。尽管血液循环中富含抗蛋白 酶，但由于中性粒细胞粘附于其靶上，使得这些大分子蛋白质可能被选择性 排除在炎症部位之外。氧化应激可通过将细胞外的抗蛋白酶浓度降低至低于 抑制被释放出的蛋白酶所需水平以下而起始组织破坏。含氯氧化剂和过氧化 氢可灭活抗蛋白酶例如α1-蛋白酶抑制剂和α2-巨球蛋白(它们是弹性蛋白酶 的内源性抑制剂)，但同时激活潜伏的金属蛋白酶例如胶原酶和明胶酶，它们 则进一步造成抗蛋白酶的失活。
中性粒细胞的细胞质组分还可能是产生特异性抗中性粒细胞胞浆抗体 (ANCA)的一个原因，ANCA与系统性血管炎和肾小球肾炎的发生密切相 关。ANCA是针对主要位于中性粒细胞的嗜天青颗粒或初级颗粒内部的酶的 抗体。ANCA有三种类型，通过在常规乙醇固定的中性粒细胞上进行间接免 疫荧光检测时它们所产生的模式可对其加以区分。弥漫性细颗粒状细胞质荧 光(cANCA)典型地见于韦格纳肉芽肿、某些显微镜下多动脉炎和Churg Strauss综合征病例、以及新月体性和节段环死性肾小球肾炎的某些病例。靶 抗原通常是蛋白酶3。核周型荧光(pANCA)见于显微镜下多动脉炎和肾小球 肾炎的许多病例。这些抗体通常针对的是髓过氧化物酶，但其它的靶包括弹 性蛋白酶、组织蛋白酶G、乳铁蛋白、溶菌酶和β-D-葡糖醛酸糖苷酶。称为 “不典型”ANCA的第三组包括中性粒细胞核荧光和一些少见的细胞质模 式，而且尽管少数靶抗原与pANCA相同，但其它的抗原还未得到鉴定。三 分之一的克罗恩病也出现pANCA。有关ANCA在类风湿性关节炎和SLE中 的阳性率的报道差异性很大，但其模式主要是pANCA和不典型ANCA。
嗜酸性粒细胞是终末分化的终末期白细胞，主要位于粘膜下组织并募集 于特异性免疫应答(包括过敏性疾病)部位。嗜酸性粒细胞的细胞质含有大椭 圆形颗粒，其具有电子致密性结晶核和部分通透性基质。除了这些大的初级 晶体状颗粒，还有另一种较小的(小颗粒)且缺乏晶体核的颗粒类型。嗜酸性 粒细胞的大特异性颗粒含有至少四种不同的阳离子蛋白质：主要碱性蛋白 (MBP)、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素 (EDN)、和嗜酸性粒细胞过氧化物酶(EPO)，它们对宿主细胞和微生物靶具 有一系列生物学作用。嗜碱性粒细胞所含的主要碱性蛋白相对于嗜酸性粒细 胞的四分之一，其还含有可检测量的EDN、ECP和EPO。中性粒细胞中也 有少量的EDN和ECP(Gleich G J.Mechanisms of eosinophil-associated inflammation.J Allergy Clin Immunol 2000；105：651-663)。MBP似乎是缺乏 酶活性但具有高度阳离子性的多肽，其可通过与脂质膜相互作用使之紊乱而 施加其毒性活性。MBP和EPO均可作为结合M2毒蕈碱受体的激动剂的选 择性别构抑制剂。这些蛋白质可造成M2受体功能紊乱并在哮喘中加重迷走 介导的支气管收缩。EDN可特异性破坏神经元的髓磷脂鞘。嗜酸性粒细胞的 大特异性颗粒还具有组胺酶和多种水解性溶酶体酶。嗜酸性粒细胞小颗粒内 的酶包括芳基硫酸酯酶、酸性磷酸酶、和一种92kDa的金属蛋白酶，即明胶 酶。嗜酸性粒细胞可产生细胞因子，包括那些对嗜酸性粒细胞具有潜在自分 泌生长因子活性的细胞因子以及那些在急性和慢性炎症反应中具有潜在作用 的细胞因子。三种细胞因子对嗜酸性粒细胞具有生长因子活性：粒细胞-巨噬 细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-3和IL-5。由人嗜酸性粒细胞产生的在急 性和慢性炎症反应中可能具有活性的其它细胞因子包括：IL-1-α、IL-6、IL- 8、TNF-α和两种转化生长因子TGF-α和TGF-β。
嗜酸细胞含有晶体状颗粒，其含有MBP、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、 EPO、和嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素(Gleich，J Allergy Clin Immunol 2000；105：651-663)。人早幼粒细胞细胞系HL-60克隆15可由于检测EPO的 分泌。该细胞系是这样建立的，先将一株HL-60在高pH下生长2个月 (Fischkoff，Leuk Res 1988；12：679-686)，然后以丁酸处理使细胞分化，以便 其展现出外周血嗜酸性粒细胞的特征，包括表达嗜酸性粒细胞特异性颗粒蛋 白(Rosenberg et al.，J Exp Med 1989；170：163-176；Tiffany et al.，J Leukoc Biol 1995；58：49-54；Badewa et al.，Exp Biol Med 2002；227：645-651)。
嗜酸细胞可参与超敏反应，特别是通过两种脂质炎症介质，即白三烯C4 (LTC4)和血小板活化因子(PAF)。这两种介质均收缩气道平滑肌、促进粘液分 泌、改变血管通透性并引起嗜酸性粒细胞和中性粒细胞侵润。除了这些嗜酸 性粒细胞衍生的介质的直接活性，MBP还可刺激嗜碱性粒细胞和肥大细胞释 放组胺，而MBP可刺激肥大细胞释放EPO。嗜酸性粒细胞可作为特异性脂 质介质的局部来源并诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质。在类似于中性 粒细胞颗粒的刺激物的刺激下嗜酸性粒细胞颗粒成分可被释放，例如在吞噬 被调理的颗粒过程中或者由趋化因子刺激。中性粒细胞溶酶体酶主要作用于 吞噬溶酶体中所吞入的物质，而嗜酸性粒细胞颗粒成分主要作用于细胞外靶 结构例如寄生虫和炎症介质。
单核细胞和巨噬细胞在骨髓中发育并经历如下阶段：干细胞；定向干细 胞；原单核细胞；幼单核细胞；骨髓中的单核细胞；外周血中的单核细胞； 和组织中的巨噬细胞。单核细胞在骨髓中快速分化(1.5至3天)。分化过程中 在单核细胞细胞质中形成颗粒，可按照中性粒细胞那样将其分为至少两类。 不过，它们要少于和小于其中性粒细胞的对应物(嗜天青颗粒和特异性颗 粒)。它们的酶成分相似。
单核细胞/巨噬细胞的颗粒结合型酶包括溶菌酶、酸性磷酸酶和β-葡糖醛 酸糖苷酶。作为体内研究模型，使用的是来自U937细胞的溶菌酶分泌。该 细胞系衍生自人组织细胞型淋巴瘤，并已经用作单核细胞细胞系，其可被多 种激动剂活化，例如PMA(Hoff et al.，J Leukoc Biol 1992；52：173-182； Balboa et al.，J Immunol 2003；170：5276-5280；Sundstrom et al.，Int J Cancer 1976；17：565-577)。
天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性淋巴细胞含有强效细胞毒颗粒，包括穿孔 素(一种孔道形成蛋白)和粒酶(淋巴细胞特异性丝氨酸蛋白酶)。例如，NK-92 细胞系是IL-2-依赖性人细胞系，其建立自一名快速进展型非霍奇金淋巴瘤患 者(Gong JH.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line (NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemia 1994；8：652-658)。NK-92细胞表达高水平的参与针对多种恶 性细胞的穿孔素-粒酶细胞毒途径的分子(Gong et al，vide infra，and Maki G， Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic actiVity of the human natural killer cell line，NK-92.J Hematother Stem Cell Res 2001； 10：369-383)。
粒酶是由细胞毒T细胞和天然杀伤细胞内的细胞质颗粒释放的外源性丝 氨酸蛋白酶。粒酶可诱导感染病毒的细胞发生凋亡，由此将其破坏。
粒细胞(或白细胞)向细胞外释放炎症介质(炎性介质)以及粒细胞(或白细 胞)向细胞外释放多于一种的炎症介质(炎性介质)在本文中有时被称为脱颗 粒。在优选的实施方式中，释放炎症介质包括从位于粒细胞或白细胞内部的 颗粒中释放所述介质。释放炎症介质优选地是从这些颗粒释放炎症介质。
经促炎因子(炎症刺激物)例如TNFα初步刺激后，嗜中性粒细胞和巨噬 细胞显著增加其MARCKS蛋白的合成：中性粒细胞应答于TNFα或脂多糖 (LPS)而合成的新的蛋白质中有多达90％是MARCKS(Thelen M，Rosen A， Nairn AC，Aderem A.Tumor necrosis factor alpha modifies agonist-dependent responses in human neutrophils by inducing the synthesis and myristoylation of a specific protein kinase C substrate.Proc Natl Acad Sci USA 1990；87：5603- 5607)。因此，当含颗粒细胞(例如中性粒细胞和巨噬细胞)受到激动剂(特别是 那些通过活化PKC而起作用的激动剂)刺激时，MARCKS可能在随后的炎症 介质释放过程中发挥重要的作用(Burgoyne et al.，Physiol Rev 2003；83：581- 632；Logan et al.J Allergy Clin Immunol 2003；111：923-932；Smolen et al.， Biochim Biophys Acta 1990；1052：133-142；Niessen et al.，Biochim.Biophys. Acta 1994；1223：267-273；Naucler et al.，J Leukoc Biol 2002；71：701-710)。
在本发明的一个方面，将在此所述的脱颗粒抑制量的MANS肽或其活性 片段施用至对象的炎症部位(所述炎症部位是对象的所述炎症部位出现疾病、 病症、创伤、外来物侵入及其组合而造成的)，所述施用可降低炎症部位侵润 性白细胞释放的炎症介质的量，其中自细胞优选地是粒细胞。施用MANS肽 和/或其至少一种活性片段可降低侵润至炎症部位内的白细胞如粒细胞所释放 的炎症介质的量。脱颗粒抑制量的MANS肽或脱颗粒抑制量的其活性片段足 以降低或抑制从侵润至所述部位的炎性细胞内所含的颗粒中胞吐释放炎症介 质。在施用MANS肽或其活性片段之后的某一时间测定脱颗粒抑制功效，这 可通过比较所述细胞(白细胞或粒细胞或其它炎性细胞)释放的炎症介质相对 于在缺乏所述MANS肽和/或缺乏其活性片段的情况下在大致相同的时间所 释放或产生的所述炎症介质的水平或量或浓度的抑制百分数(即，降低的百分 数)而进行测定。此外，本领域人员可通过测定已知可作为该疾病的指征的症 状或炎症参数而确定该组织部位的炎症是否已经降低，以便确定是否已经施 用了足够的或治疗有效量的MANS肽和/或其活性片段。足够的脱颗粒抑制 量是指，与在缺乏所述MANS肽或其活性片段的情况下在相同条件下测定到 的从所述粒细胞释放的所述炎症介质的量相比，该脱颗粒抑制量使得炎症部 位处的粒细胞所释放的炎症介质减少的百分数为大约1％至大约99％，优选 地5％至大约99％，更优选地大约10％至大约99％，甚至更优选地大约25％ 至99％，以及甚至更优选地大约50％至大约99％。
在本发明的一个方面，将脱颗粒抑制量的MANS肽施用至动物的炎症刺 激部位(该炎症刺激部位是通过将炎症刺激量的炎症刺激物施用至所述部位而 产生的)，所述施用可使得由位于所述炎症刺激部位处的经所述炎症刺激物刺 激的粒细胞所释放的炎症介质的量，与在存在相同的炎症刺激量的所述炎症 刺激物但缺乏MANS肽的情况下从所述粒细胞释放的所述炎症介质的量相 比，减少大约1％至大约99％，优选地5％至大约99％，更优选地大约10％ 至大约99％，甚至更优选地大约25％至99％，以及甚至更优选地大约50％至 大约99％。
在本发明的另一个方面，将脱颗粒抑制量的MANS肽施用至动物的炎症 刺激部位(所述炎症刺激部位是通过给所述部位施用炎症刺激量的炎症刺激物 而产生的)，使得位于所述炎症刺激部位处的经所述炎症刺激物刺激的粒细胞 释放的炎症介质的量，与在存在相同的炎症刺激量的炎症刺激物但缺乏 MANS肽的情况下从所述粒细胞释放的所述炎症介质的量相比，减少 100％。
本文体外实施例所使用的炎症刺激物的实例是(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙 酸盐(PMA)。在嗜碱性粒细胞脱颗粒释放组胺方面，单核细胞化学引诱蛋白 (MCP-1)几乎与C5a同样有效，且大大强于IL-8。以趋化因子(即，化学引诱 细胞因子)、RANTES和MIP-1刺激后可引起组胺释放。
在优选的实施方式中，相对于炎症刺激部位处的MARCKS肽的基础浓 度，施用于动物炎症刺激部位处的脱颗粒抑制量的MANS肽是所述炎症刺激 部位处MARCKS肽浓度的大约1倍至大约1,000,000倍，优选地是所述炎症 刺激部位处MARCKS肽浓度的大约1倍至大约100,000倍，更优选地是所述 炎症刺激部位处MARCKS肽浓度的大约1倍至大约10,000倍，甚至更优选 地是所述炎症刺激部位处MARCKS肽浓度的大约1倍至大约1,000倍，甚至 更优选地是所述炎症刺激部位处MARCKS肽浓度的大约1倍至大约100 倍，以及甚至更优选地是所述炎症刺激部位处MARCKS肽浓度的大约1倍 至大约10倍。
在优选的实施方式中，粒细胞位于动物(优选地是人)的气道上或气道 内，且通过吸入施用MANS肽，例如吸入包含MANS肽的药物组合物，例 如包含MANS肽和水性溶液的药物组合物，所述组合物以气溶胶的形式施 用，或是包含干粉形式的MANS肽的药物组合物，所述组合物通过干粉喷雾 吸入器施用。也可使用本领域已知的用于通过吸入而施用溶液或干粉的其它 方法和装置，例如小滴、喷雾剂和喷雾器。
在一些实施方式中，有可能本发明的肽可阻断具有生理学重要性的分泌 过程，包括基础分泌功能。尽管无意于受到本发明的任何具体理论的限制， 但认为调节基础分泌的机制不同于调节刺激型分泌的机制。或者，基础分泌 机制需要的MARCKS蛋白可能少于刺激型分泌。由于所有阻断MARCKS介 导的分泌的治疗均不会使得MARCKS功能完全消失，因此基础分泌得以保 留。
在本文中，术语″MARCKS核苷酸序列″指的是衍生自编码MARCKS蛋 白的基因的任何核苷酸序列，包括，例如，DNA或RNA序列、所述基因的 DNA序列、任何转录的RNA序列、前体mRNA或mRNA转录本的RNA序 列和结合于蛋白质的DNA或RNA。
精确输送MARCKS-阻断肽也可克服任何阻断重要分泌过程的潜在局限 性。采用吸入型配制品可容易地将此类药物输送至呼吸道。由于这些药物可 用于治疗炎性肠病，因此可以预期通过灌肠或栓剂将这些阻断剂输送至直肠/ 结肠/小肠内。关节内注射或经皮输送至发炎的关节内可通过减少局部炎性细 胞的分泌而使得关节炎或自身免疫病患者缓解。注射至神经末梢周围区域可 抑制某些类型的神经递质的分泌，阻断严重疼痛的传递或顽固性肌肉痉挛。 采用本领域已知的各种表面用配制品可容易地输送所述肽用于治疗炎性皮肤 病。
认为MARCKS与细胞质内的肌动蛋白和肌球蛋白相互作用，因此有可 能将所述颗粒束缚(tether)于细胞收缩机制上，由此介导随后的颗粒运动和胞 吐作用。通过活化PKC和PKG可使得炎症介导性MPO自中性粒细胞的分 泌被最大化。MARCKS有可能充当了这两种控制自炎性细胞的膜结合型腔 室的分泌(即，自中性粒细胞分泌MPO)的蛋白激酶之间协调作用的交汇点。
本发明证实，同时活化PKC和PKG使得犬或人的中性粒细胞炎症介质 MPO的分泌被增强，而任何一种激酶独自活化均不足以诱导最大的分泌应 答。文献报道在NHBE细胞中以及如本申请在中性粒细胞中所证实的，PMA 单独即可增强分泌应答，不过应答的幅度远低于他人在大鼠杯状细胞系中所 观测到的程度。见Abdullah et al，见上。此外，尽管以前报道了cGMP类似 物可诱导培养的豚鼠气管上皮细胞显著分泌粘蛋白(Fischer et al.，见上)，但要 注意到这一应答直到暴露8小时才达到显著水平。具有如此之长的滞后期的 分泌应答不太可能是一种直接的结果，而很可能是涉及了蛋白质的从头合 成，而非事先合成并储存的细胞质颗粒的释放。
如上所述，本发明可用于药物配制品中。在特定的实施方式中，药物产 品存在于适合于口服的固体药物组合物中。可形成本发明的固体物质组合物 并与赋形剂混合和/或以其稀释。固体物质组合物还可置于载体中，例如其可 以是胶囊、药囊、片剂、纸或者其它容器。如果赋形剂用作稀释剂，其可以 是固体、半固态或者液体物质，充当物质组合物的载具、载体、或基质。
各种合适的赋形剂是本领域人员已知的并可参见National Formulary，19： 2404-2406(2000)，将其中的2404至2406页的全部内容并入本文。合适的赋 形剂的实例包括，但不限于，淀粉、阿拉伯树胶、硅酸钙、微晶纤维素、甲 基丙烯酸盐、虫胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、和甲基纤维素。 药物产品配制品可额外含有润滑剂例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；湿润 剂；乳化剂和混悬剂；防腐剂例如羟苯甲酯和羟苯丙酯；甜味剂；或调味 剂。还可使用多元醇、缓冲剂和惰性填料。多元醇的实例包括，但不限于， 甘露醇、山梨醇、木糖醇、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、右旋糖等等。合 适的缓冲剂包括，但不限于，磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐等 等。可使用的其它惰性填料包括本领域已知的且可用于制备各种剂型的那些 惰性填料。如果需要，固体配制品可包括其它成分例如填充剂和/或粒化剂等 等。通过本领域已知的方法，本发明的药物产品可被配制为使其在施用于患 者后能够活性成分的迅速释放、缓释或控释。
为了形成口服片剂，可通过直接压片法制备本发明的物质组合物。该方 法中，活性药物成分可与以下物质混合：固体粉状载体，例如乳糖、蔗糖、 山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物或明胶、及其组合；以及 抗磨剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、和聚乙二醇蜡类。然后可使用具有合适 的冲床和模具的机械将混合物压制为片剂以获得所需的片剂大小。本领域人 员可选择机械的操作参数。或者，可通过湿化造粒方法形成口服片剂。活性 药物成分可与赋形剂和/或稀释剂混合。固体物质经研磨或过筛得到所需的粒 径。将粘合剂加至药物中A粘合剂。粘合剂可在合适的溶剂中悬浮并均质 化。活性成分和辅料也可与粘合剂溶液混合。用溶液将所得干混合物均匀湿 化。湿化通常导致颗粒轻度聚集，然后将所得物质通过具有所需孔径的不锈 钢筛。然后将混合物在控制型干燥单元内干燥预定长度的时间，以便达到所 需的粒径和稠度。干燥混合物的颗粒过筛以除去粉末。可向混合物中加入崩 解剂、抗磨剂、和/或抗粘附剂。最后，使用具有合适的冲床和模具的机械将 混合物压制为片剂以获得所需的片剂大小。本领域人员可选择机械的操作参 数。
如果需要包衣片剂，可对上述制备的片心进行包衣，这可使用糖或者纤 维素聚合物的浓缩溶液，其可含有阿拉伯树胶、明胶、滑石粉、二氧化钛、 或使用溶解于挥发性有机溶剂或溶剂混合物中的漆。对此包衣，可加入各种 染料以便区分具有不同活性化合物或者具有不同量的活性化合物的片剂。在 一个具体实施方式中，活性成分存在于片心中，其外面包有一或多个层次， 包括肠溶包衣层。
可制备软明胶胶囊，其中含有活性成分和植物油的混合物。硬明胶胶囊 可含有活性成分颗粒以及固体粉状载体，例如，乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露 醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物、和/或明胶。
可制备糖浆或混悬液形式的口服液体制剂，例如，含有活性成分、糖、 和乙醇、水、甘油、和丙二醇的混合物的溶液。如果需要，此类液体制剂可 包括一或多种以下成分：着色剂、调味剂、和糖精。还可使用增稠剂例如羧 甲基纤维素。
如果上述药物用于胃肠外施用，所述配制品可包括无菌水性注射液、非 水性注射液、或者两者，它们包含本发明的物质组合物。如果制备水性注射 液，物质组合物可以是水溶性药用可接受的盐的形式。胃肠外制剂可含有抗 氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，后者使得制剂与使用对象的血液等渗。水 性和非水性无菌混悬液可包含混悬剂和增稠剂。所述配制品可置于单位剂量 或多剂量容器内，例如密封安瓿和小管内。可使用上述各种无菌粉剂、颗粒 和片剂制备当场使用的注射液和混悬液。
物质组合物也可被配制为适合用于局部施用(例如，皮肤霜剂)。这些配 制品可含有各种本领域人员已知的赋形剂。合适的赋形剂可包括，但不限 于，十六烷基酯蜡、鲸蜡醇、白蜡、单硬脂酸甘油酯、丙二醇、单硬脂酸 盐、硬脂酸甲酯、苯甲醇、十二烷基硫酸钠、丙三醇、矿物油、水、卡波 姆、乙醇、丙烯酸酯粘合剂、聚异氰酸酯粘合剂、和硅酮类粘合剂。
在优选的实施方式中，肽片段公开于表2，它们的长度为至少4至23 个氨基酸残基并具有与MANS肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列，其中肽的 N-端氨基酸选自MANS肽序列(SEQ ID NO：1)的位置2至21。更加优选的肽 片段长度为至少6个氨基酸至23个氨基酸。优选地，这些肽的N-端α氨基 酸被酰化，更优选地，这些肽的α-N-端氨基酸位置是豆蔻酰化的。
表2
肽编号      序列                       序列号
肽3         AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA    SEQ ID NO：3
肽5          AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV    SEQ ID NO：5
肽8           AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA    SEQ ID NO：8
肽12           AQFSKTAAKGEAAAERPGEA    SEQ ID NO：12
肽17            AQFSKTAAKGEAAAERPGE    SEQ ID NO：17
肽23             AQFSKTAAKGEAAAERPG    SEQ ID NO：23
肽30              AQFSKTAAKGEAAAERP    SEQ ID NO：30
肽38               AQFSKTAAKGEAAAER    SEQ ID NO：38
肽47                AQFSKTAAKGEAAAE    SEQ ID NO：47
肽57                 AQFSKTAAKGEAAA    SEQ ID NO：57
肽68                  AQFSKTAAKGEAA    SEQ ID NO：68
肽80                   AQFSKTAAKGEA    SEQ ID NO：80
肽93                    AQFSKTAAKGE    SEQ ID NO：93
肽107                    AQFSKTAAKG    SEQ ID NO：107
肽122                     AQFSKTAAK    SEQ ID NO：122
肽138                      AQFSKTAA    SEQ ID NO：138
肽155                       AQFSKTA    SEQ ID NO：155
肽173                        AQFSKT    SEQ ID NO：173
肽192                         AQFSK    SEQ ID NO：192
肽212                          AQFS    SEQ ID NO：212
肽6          QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA    SEQ ID NO：6
肽9           QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV    SEQ ID NO：9
肽13           QFSKTAAKGEAAAERPGEAA    SEQ ID NO：13
肽18            QFSKTAAKGEAAAERPGEA    SEQ ID NO：18
肽24             QFSKTAAKGEAAAERPGE    SEQ ID NO：24
肽31        QFSKTAAKGEAAAERPG    SEQ ID NO：31
肽39         QFSKTAAKGEAAAERP    SEQ ID NO：39
肽48          QFSKTAAKGEAAAER    SEQ ID NO：48
肽58           QFSKTAAKGEAAAE    SEQ ID NO：58
肽69            QFSKTAAKGEAAA    SEQ ID NO：69
肽81             QFSKTAAKGEAA    SEQ ID NO：81
肽94              QFSKTAAKGEA    SEQ ID NO：94
肽108              QFSKTAAKGE    SEQ ID NO：108
肽123               QFSKTAAKG    SEQ ID NO：123
肽139                QFSKTAAK    SEQ ID NO：139
肽156                 QFSKTAA    SEQ ID NO：156
肽174                  QFSKTA    SEQ ID NO：174
肽193                   QFSKT    SEQ ID NO：193
肽213                    QFSK    SEQ ID NO：213
肽10    FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA    SEQ ID NO：10
肽14     FSKTAAKGEAAAERPGEAAV    SEQ ID NO：14
肽19      FSKTAAKGEAAAERPGEAA    SEQ ID NO：19
肽25       FSKTAAKGEAAAERPGEA    SEQ ID NO：25
肽32        FSKTAAKGEAAAERPGE    SEQ ID NO：32
肽40         FSKTAAKGEAAAERPG    SEQ ID NO：40
肽49          FSKTAAKGEAAAERP    SEQ ID NO：49
肽59           FSKTAAKGEAAAER    SEQ ID NO：59
肽70            FSKTAAKGEAAAE    SEQ ID NO：70
肽82             FSKTAAKGEAAA    SEQ ID NO：82
肽95              FSKTAAKGEAA    SEQ ID NO：95
肽109              FSKTAAKGEA    SEQ ID NO：109
肽124               FSKTAAKGE    SEQ ID NO：124
肽140                FSKTAAKG    SEQ ID NO：140
肽157                 FSKTAAK    SEQ ID NO：157
肽175                  FSKTAA    SEQ ID NO：175
肽194                   FSKTA    SEQ ID NO：194
肽214                    FSKT    SEQ ID NO：214
肽15     SKTAAKGEAAAERPGEAAVA    SEQ ID NO：15
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参见图5，MARCKS被PKC磷酸化并随后从膜转移至细胞质。在此， PKG似乎诱导MARCKS去磷酸化(图2A，泳道4，和图2B)。这一去磷酸 化作用被PKG抑制剂Rp-8-Br-PET-cGMP逆转(图2A，泳道5)，提示去磷酸 化是特异性地PKG-依赖性的。参见图2，用[32P]正磷酸盐标记NHBE细胞然 后暴露于指定试剂。通过免疫沉淀测定法分析MARCKS应答于上述处理的 磷酸化情况。参见图2A，8-Br-cGMP逆转了PMA诱导的MARCKS磷酸 化，而8-Br-cGMP的这种效应可被Rp-8-Br-PET-cGMP(PKG抑制剂)或岗田 酸(PP1/2A抑制剂)阻断。参见图2B，PMA-诱导的MARCKS磷酸化因细胞 随后暴露于8-Br-cGMP而逆转。泳道1，单独培养基处理8分钟；泳道2， 100nM PMA处理3分钟；泳道3，100nM PMA处理3分钟随后1μM 8-Br- cGMP处理5分钟；泳道4，100nM PMA处理8分钟；泳道5，单独培养基 处理3分钟随后100nM PMA+1μM 8-Br-cGMP处理5分钟。参见图2C，福 司曲星(fostriecin)以浓度依赖性方式减弱了8-Br-cGMP-诱导的MARCKS去 磷酸化。
认为PKG通过活化蛋白磷酸酶而去磷酸化MARCKS。参见图2A(泳道 6)，500nM的岗田酸(该浓度可同时抑制PP1和PP2A)阻断了PKG-诱导的 MARCKS去磷酸化，提示PKG通过活化PP1和/或PP2A引起去磷酸化。使 用福司曲星和直接测定磷酸酶活性的进一步研究指出，仅PP2A被PKG活化 并造成MARCKS的磷酸基团被移除(图2C)。很可能是岗田酸或者福司曲星 (以抑制PKG-诱导的MARCKS去磷酸化的浓度)减弱了PMA+8-Br-cGMP或 UTP诱导的粘蛋白分泌(图3)。图3有助于证实PP2A是粘蛋白分泌途径的必 需成分。NHBE细胞与指定浓度的福司曲星、岗田酸(500nM)或仅培养基预 温育15分钟随后用PMA(100nM)+8-Br-cGMP(1μM)刺激15分钟或用UTP (100μM)刺激2h。ELISA测定分泌的粘蛋白。数据表示为平均值.+/-.S.E. (各点n＝6)，其中*代表显著区别于培养基对照(p＜0.05)；代表显著区别于 PMA+8-Br-cGMP刺激(p＜0.05)；而代表显著区别于UTP刺激(p＜0.05)。因 此，PKG-活化的PP2A对MARCKS的去磷酸化似乎是导致粘蛋白颗粒胞吐 作用的信号途径的必需成分。
为了揭示MARCKS通过哪些分子事件将激酶活化与粘蛋白分泌联系在 一起，对应答于PKC/PKG活化的MARCKS磷酸化进行了深入研究。参见图 1A，PMA(100nM)可在NHBE细胞中引起MARCKS磷酸化显著增加(3至4 倍)，而这一磷酸化作用被PKC抑制剂抑激酶素C(500nM)减弱。一旦被磷 酸化，MARCKS即从质膜转移至细胞质(图1B)。更具体地，图1A显示 PKC的活化导致NHBE细胞内的MARCKS磷酸化。用[32P]正磷酸盐标记细 胞2h随后暴露于刺激性和/或抑制性试剂。通过如上所述的免疫沉淀分析应 答于处理的MARCKS磷酸化情况。泳道1，培养基对照；泳道2，载体， 0.1％Me.sub.2SO；泳道3，100nM 4α-PMA；泳道4，100nM PMA；泳道 5，100nM PMA+500nM抑激酶素C；泳道6，500nM抑激酶素C。图1B 证实磷酸化的MARCKS从质膜转移至细胞质。32P-标记的细胞被暴露于 PMA(100nM)或仅培养基5分钟，随后分离膜和细胞质级份。8-Br-cGMP(1 μM)造成的PKG活化(这是促使粘蛋白分泌所需的另一激酶活化事件)，没有 导致MARCKS磷酸化，事实上却观察到了相反的作用：PMA诱导的 MARCKS磷酸化被8-Br-cGMP逆转(图2A)。8-Br-cGMP的这种作用并非是 由于抑制了PKC的活性，因为PMA-诱导的磷酸化能够被随后添加给细胞的 8-Br-cGMP逆转(图2B)。因此，PKG活化很可能导致MARCKS去磷酸化。
进一步的研究证实了PKG-诱导的MARCKS去磷酸化被500nM岗田酸 阻断，后者是蛋白磷酸酶(1和/或2A型(PP1/2A))抑制剂(图2A，泳道6)。 因此，似乎这一去磷酸化作用是PP1和/或PP2A介导的。为了确定所涉及的 蛋白磷酸酶的亚型，除了磷酸化研究以外，还使用了一种新的特异性更高的 PP2A抑制剂，即福司曲星(IC50＝3.2nM)。参见图2C，福司曲星以浓度依赖 性方式(1-500nM)抑制PKG-诱导的MARCKS去磷酸化，提示PKG通过活 化PP2A诱导去磷酸化。为了进一步证实PKG在NHBE细胞内活化PP2A， 将细胞暴露于8-Br-cGMP，之后测定了胞浆的PP1和PP2A活性。在8-Br- cGMP的浓度低达0.1μM的情况下，PP2A活性仍升高近3倍(从0.1到0.3 nmol/min/mg蛋白质，p＜0.01)，而PP1活性保持不变。这些数据说明，PP2A 可被PKG活化并造成MARCKS去磷酸化。因此，该PP2A活性对于粘蛋白 分泌似乎是至关重要的；当PKG-诱导的MARCKS去磷酸化被岗田酸或福司 曲星阻断，应答于PKC/PKG活化或UTP刺激的分泌得以改善(图3)。
MARCKS与细胞质中的肌动蛋白和肌球蛋白相结合
图4所示为放射性标记的免疫沉淀测定法，其揭示MARCKS可与细胞 质内的其他两种蛋白质(约200和约40kDa)相结合。参见图4，NHBE细胞 用[3H]亮氨酸和[3H]脯氨酸标记过夜，按照“实验方法”所述制备膜和细胞 质级份。用非免疫对照抗体(6F6)对分离的级份进行预清理(preclear)。细胞质 被等分为两份用于免疫沉淀，在存在10μM松胞菌素D(Biomol，Plymouth Meeting，Pa.)的条件下进行，分别使用抗-MARCKS抗体2F12(泳道2)和非免 疫对照抗体6F6(泳道3)。还使用抗体2F12通过免疫沉淀评价了膜级份内的 MARCKS蛋白(泳道1)。通过8％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离沉淀的蛋白 质复合物并通过增强的放射自显影来观察。MARCKS似乎与分子量分别为 大约200kDa和大约40kDa的两种细胞浆蛋白相结合。将这两种MARCKS- 结合型蛋白质从凝胶上切下并通过基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱/ 内部测序(matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry/internal sequencing)(Protein/DNA Technology Center of Rockefeller University，N.Y.)进行分析。利用所获得的肽质量和序列数据，通 过Internet programs ProFound和MS-Fit来搜索蛋白质数据库。结果表明它们 分别是肌球蛋白(重链，非肌型A(heavy chain，non-muscle type A))和肌动蛋 白。基质辅助激光解吸离子化/飞行时间质谱/内部序列分析法(Matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry/internal sequence analysis)表明这两种MARCKS-结合型蛋白质分别是肌球蛋白(重链，非肌型 A)和肌动蛋白。
这些研究提示，这是控制气道粘蛋白颗粒胞吐性分泌的信号机制的一种 新的范例，同时这也给出了被认为能够证实MARCKS在生理学过程中具有 特异性生物学功能的第一个直接证据。MARCKS充当了调节人类气道上皮 细胞内粘蛋白颗粒释放的关键介质分子。可以认为，引发气道粘蛋白分泌需 要PKC和PKG双双活化并协同作用。活化的PKC磷酸化MARCKS，导致 MARCKS从质膜的内侧面转移至细胞质内。PKG活化转而激活PP2A，后者 去磷酸化细胞质内的MARCKS。由于MARCKS的膜结合能力依赖于其磷酸 化状态，因此该去磷酸化抗使其MARCKS恢复其膜结合能力并可能促使 MARCKS附着于细胞质粘蛋白颗粒的膜。此外通过与细胞质内的肌动蛋白 和肌球蛋白相互作用(图4)，MARCKS随后便能够将颗粒束缚于细胞收缩机 制上，介导颗粒向细胞周边运动并随后胞吐释放。MARCKS分布广泛，这 提示此种或者类似的机制可能在正常或者病理条件下调节各种细胞类型中膜 结合型颗粒的释放。
参见图5，通过以其N-端结构域与颗粒膜相互作用并以其PSD部位结合 于肌动蛋白纤丝，MARCKS可发挥分子接头的功能，由此将颗粒束缚于负 责运动和胞吐作用的收缩骨架。图5给出了一种可能的机制，其描绘了粘蛋 白促分泌素(secretagogue)与气道上皮(杯状)细胞相互作用并活化两种不同的 蛋白激酶，PKC和PKG。活化的PKC磷酸化MARCKS，引起MARCKS从 质膜转移至细胞质，而通过一氧化氮(NO)→GC-S→cGMP→PKG途径被 活化的PKG反过来活化细胞质PP2A，后者去磷酸化MARCKS。这一去磷 酸化作用使得MARCKS与颗粒膜的附着稳定化。此外，MARCKS还与肌动 蛋白和肌球蛋白相互作用，由此将颗粒连接至细胞收缩机构，由用于随后的 运动和胞吐释放炎症介质，例如MPO。MARCKS被释放至细胞质后，还可 被特异性靶向蛋白或者是其中涉及MARCKS的N-端结构域的某些其他形式 的蛋白-蛋白相互作用引导，使得MARCKS与颗粒附着。无论是何种情况， MANS肽或其包含至少4个氨基酸的活性片段，均可竞争性抑制MARCKS 对粘蛋白颗粒膜的靶向，由此抑制分泌。
本发明还涉及阻断任何细胞的胞吐分泌过程的新方法，特别是那些由炎 性细胞内所含的颗粒释放炎症介质的过程，其中的刺激途径涉及蛋白激酶C (PKC)底物MARCKS蛋白以及从膜结合型囊泡释放成分。具体而言，本发 明人已经证实，MANS肽可以浓度依赖性方式阻断炎症介质髓过氧化物酶从 人(图6)或犬(图7)的中性粒细胞的刺激型释放。具体而言，图6显示分离的 中性粒细胞被100nM PMA和10μM 8-Br-cGMP刺激后分泌髓过氧化物酶 (MPO)。100μM MANS肽将MPO的分泌降低至对照水平(*＝p＜0.05)。10μM MANS导致MPO的分泌轻度降低。10或100μM的对照肽(RNS)不影响 MPO分泌。参见图7，分离的中性粒细胞被100nM PMA和10μM 8-Br- cGMP刺激后分泌髓过氧化物酶(MPO)。100μM MANS肽将MPO的分泌降 低至对照水平(*＝p＜0.05)。10μM MANS导致MPO的分泌轻度降低。10或 100μM的对照肽(RNS)不影响MPO分泌。因此，所述肽可治疗性地用于阻 断侵润至任何组织内的炎性细胞释放分泌的炎症介质。释放的这些介质有多 种是导致在各种慢性炎性疾病(即，呼吸道疾病例如哮喘、慢性支气管炎和 COPD；炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病；自身免疫病；皮肤病如红 斑痤疮、湿疹；和重度痤疮、关节炎和疼痛综合征如类风湿性关节炎和纤维 性多肌痛)中所观察到的广泛组织损伤的介质。本发明可用于治疗疾病例如关 节炎、慢性支气管炎、COPD和囊性纤维化。因此，本发明可用于治疗人类 和动物的疾病，特别是那些累及马、犬、猫科动物以及其他家庭宠物的疾 病。
图8-12显示了人和犬的MPO分泌。在所有这些实验中，用LPS(浓度 为1x10-6M)刺激分离的中性粒细胞10分钟，37℃，然后按照图中所示假 如刺激物。LPS初步活化这些细胞，因此它们能够应答于促分泌素。
在一个实施方式中，本发明公开了调节对象的炎症的方法，包括施用治 疗有效量的药物组合物，所述组合物包含MANS肽或其活性片段。在这种实 施方式的一个方面中，MANS蛋白的所述活性片段包括至少4个且优选地6 个氨基酸。在另一个方面，所述炎症的原因为呼吸道疾病、肠道疾病、皮肤 病、自身免疫病和疼痛综合征。在另一个方面，所述呼吸道疾病选自哮喘、 慢性支气管炎和COPD。在另一个方面，所述肠道疾病选自溃疡性结肠炎、 克罗恩病和肠激惹综合征。在另一个方面，所述皮肤病选自红斑痤疮、湿 疹、银屑病和重度痤疮。在另一个方面，所述炎症由关节炎或囊性纤维化引 起。在另一个方面，所述对象是哺乳动物。此外，在另一个方面，所述哺乳 动物选自人、犬、马和猫科动物。在另一个方面，所述施用步骤选自局部施 用、胃肠外施用、直肠施用、肺部施用、鼻部施用、吸入和口服。在另一个 方面，所述肺部施用选自气溶胶、干粉喷雾吸入器、定量喷雾吸入器和喷雾 器。
在另一个实施方式中，本发明公开了用于调节对象的细胞分泌过程的方 法，包括施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含至少一种包含 MANS肽或其活性片段的化合物，所述化合物调节对象的炎症介质。在这种 实施方式的一个方面中，MANS蛋白的所述活性片段包括至少4个、且优选 地6个氨基酸。在另一个方面，所述调节细胞的分泌过程是阻断或降低细胞 分泌过程。在另一个方面，所述炎症的原因为呼吸道疾病、肠道疾病、皮肤 病、自身免疫病和疼痛综合征。在另一个方面，所述呼吸道疾病选自哮喘、 慢性支气管炎和COPD。在另一个方面，所述肠道疾病选自溃疡性结肠炎、 克罗恩病和肠激惹综合征。在另一个方面，所述皮肤病选自红斑痤疮、湿 疹、银屑病和重度痤疮。在另一个方面，所述炎症由关节炎或囊性纤维化引 起。在另一个方面，所述对象是哺乳动物。在另一个方面，所述哺乳动物选 自人、犬、马和猫科动物。在另一个方面，所述施用步骤选自局部施用、胃 肠外施用、直肠施用、肺部施用、鼻部施用、吸入和口服。在另一个方面， 所述肺部施用选自气溶胶、干粉喷雾吸入器、定量喷雾吸入器和喷雾器。
在另一个实施方式中，本发明公开了降低对象的炎症的方法，包括施用 治疗有效量的抑制MARCKS-相关性炎症介质释放的化合物，由此使得对象 的炎症介质的释放与缺乏所述治疗时可能出现的情况相比是降低的。在这种 实施方式的一个方面中，所述化合物是MARCKS蛋白的至少一种活性片 段。在另一个方面，所述活性片段的长度为至少4个且优选地6个氨基酸。 在另一个方面，所述化合物是MANS肽或其活性片段。在另一个方面，所述 化合物是针对MARCKS蛋白或其活性片段的编码序列的反义寡核苷酸。在 另一个方面，所述活性片段的长度为至少4个且优选地6个氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明公开了减轻对象的炎症的方法，包括施用 治疗有效量的药用活性组合物，该组合物包含抑制MARCKS-相关性炎症介 质释放的化合物，由此使得所述对象的炎症与缺乏所述治疗时可能出现的情 况相比是减轻的。在这种实施方式的一个方面中，所述化合物是MARCKS 蛋白的活性片段。在另一个方面，所述活性片段的长度为至少4个且优选地 6个氨基酸。在另一个方面，所述化合物是MANS肽或其活性片段。在另一 个方面，所述化合物是针对MARCKS蛋白或其活性片段的编码序列的反义 寡核苷酸。在另一个方面，所述活性片段的长度为至少4个且优选地6个氨 基酸。本发明意欲涵盖含有一或多种所述MANS肽或其活性片段的组合物及 其在抑制炎性细胞的颗粒或囊泡释放炎症介质的治疗中的用途。
在另一个实施方式中，本发明还公开了减轻或抑制对象的炎症的方法， 包括施用治疗有效量的至少一种包含MANS肽或其活性片段的肽，所述肽有 效抑制炎症部位处炎症介质的释放。在这种实施方式的一个方面中，所述活 性片段的长度为至少4个且优选地至少6个氨基酸。在另一个方面，产生所 述炎症介质的细胞选自中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细 胞和白细胞。优选地，所述细胞是白细胞，更优选地是粒细胞，且甚至更优 选地是中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其组合。在另一个方 面，所述药物通过口服、胃肠外、腔内或通过气道而施用。在另一个方面， 所述组合物还包括第二分子，所述第二分子选自抗生素、抗病毒化合物、抗 寄生虫化合物、抗炎化合物和免疫抑制剂。
MANS肽的活性片段选自表1中的肽。如本文所述，这些肽在其N-端和 /或C-端氨基酸抗含有任选的化学部分。
在本发明的另一个方面，本发明的方法可以通过使用或者施用表1中公 开的本发明的肽的组合而实施，即，可使用或施用这些肽的一或多种。优选 地，在本发明的方法中使用或者施用单一的肽。
应答于炎症刺激物引起的蛋白激酶C(PKC)活化，通过与MARCKS蛋 白的N-端区域相同的肽预温育或者共温育，可减少选自中性粒细胞、嗜酸性 粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞的细胞的脱颗粒，其中所述肽选自表 1所公开的MANS肽片段。尽管时间过程和浓度方面在不同细胞类型之间可 有所不同，但在所有的情况中，MANS肽均减少PKC-诱导的脱颗粒。
在描述了本发明之后，将结合特定的实施例来阐述本发明，在此引入的 这些实施例仅用于举例说明之目的，它们无意于限制本发明的范围。
实施例
材料和方法
放射性标记的免疫沉淀测定法-当标记[32P]磷酸盐时，将细胞与含0.2％ 牛血清白蛋白的无磷酸DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)预 温育2h，随后用0.1mCi/mi[32P]正磷酸盐(9000Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)标记2h。为了标记[3H]豆蔻酸或3H-氨基酸，将细胞与培养基温育 过夜，所述培养基含有50μCi/ml[3H]豆蔻酸(49Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)或0.2mCi/ml[3H]亮氨酸(159Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)以 及0.4mCi/ml[3H]脯氨酸(100Ci/mmol，PerkinElmer Life Sciences)。标记后， 将细胞暴露于刺激试剂5分钟。如果使用了抑制剂，则刺激之前将细胞与抑 制剂预温育15分钟。处理结束后用缓冲液裂解细胞，该缓冲液含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油，1％Nonidet P-40，1 mM苯甲基磺酰氟，1mM苄脒，10μg/ml胃酶抑素A和10μg/ml亮抑酶肽。 三氯乙酸沉淀和闪烁计数可确定各培养物内的放射性标记效率。按照Spizz 和Blackshear的方法使用细胞裂解物(具有相同的计数/分钟)进行MARCKS 蛋白的免疫沉淀。Spizz et al.，J.Biol.Chem.271，553-562(1996)。用8％SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离沉淀的蛋白质，并通过放射自显影观察。检测中 使用的是抗人MARCKS抗体(2F12)和非免疫对照抗体(6F6)。
为了分析不同亚细胞级份中的MARCKS或MARCKS-相关性蛋白质复 合物，将放射性标记和处理后的细胞刮入匀浆缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，10mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1mM苄脒，10μg/ml胃 酶抑素A，10μg/ml亮抑酶肽)，随后用氮空穴法(nitrogen cavitation)(800磅/ 平方英寸，20分钟，4℃)破坏。细胞裂解物在600x g离心10分钟，4℃以 便除去核和未破裂细胞。通过在4℃以400,000x g超速离心30分钟将去核 上清液分离为膜和胞质级份。通过超声处理将膜沉淀溶于裂解缓冲液。然后 如上所述进行免疫沉淀。
MARCKS-相关肽-在Genemed Synthesis，Inc.(San Francisco，Calif.)合成 豆蔻酰化的N-端序列(MANS)和随机N-端序列(RNS)肽，随后用高压液相色 谱法纯化(＞95％纯)，经质谱分析确认，其分别显示具有合适分子质量的一个 单峰。组成MANS肽的序列等同于MARCKS的前24个氨基酸，即介导 MARCKS插入膜内的豆蔻酰化的N-端区域，MA- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1(其中MA是N-端豆蔻 酰基链)。相应的对照肽(RNS)的氨基酸组成与MANS相同，但随机排列， MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF(SEQ ID NO：232)。这些合成肽中 所含的疏水性豆蔻酸盐部分增强了它们的质膜通透性，使得肽能够容易地被 细胞摄取。为了确定这些肽对粘蛋白分泌的影响，先将细胞与肽预温育15 分钟，然后添加促分泌素，然后通过ELISA测定粘蛋白分泌。
反义寡核苷酸-在Biognostik GmbH(Gottingen，Germany)合成MARCKS 反义寡核苷酸及其相应的对照寡核苷酸。NHBE细胞用5μM的反义或对照 寡核苷酸顶部处理3天(最初的24h内存在2μg/ml阳离子脂质体 (lipofectin))。然后细胞与促分泌素温育，并用ELISA测定粘蛋白分泌。从处 理的细胞分离总RNA和蛋白质。使用人MARCKS cDNA为探针，按照常规 方法通过Northern杂交测定MARCKS mRNA。使用纯化的抗-MARCKS IgG1(克隆2F12)作为初级检测抗体通过免疫印迹确定MARCKS蛋白水平。
瞬时转染-MARCKS的磷酸化位点结构域(PSD)含有PKC-依赖性磷酸 化位点和肌动蛋白纤丝结合位点。为了构建PSD-缺失型MARCKS cDNA， 通过聚合酶链反应产生PSD序列侧翼的两个片段(编码25个氨基酸)，随后通 过XhoI位点连接，该位点连接于为聚合酶链反应设计的寡核苷酸引物的5′- 末端。所得突变体cDNA和野生型MARCKS cDNA分别插入哺乳动物表达 载体pcDNA4/TO(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。通过限制酶消化和DNA测序 确认分离的重组构建体。
HBE1是乳头状瘤病毒转化的人支气管上皮细胞系，当培养于气/液界面 中时气能够分泌粘蛋白。使用Effectene转染试剂(Qiagen，Valencia，Calif.)按 照生产商的说明转染HBE1细胞。简言之，通过胰蛋白酶/EDTA使得生长于 气/液界面中的分化的HBE1细胞游离，并以1x105个细胞/cm2重新接种于 12-孔培养板。培养过夜后使用野生型MARCKS cDNA、PSD-截短型 MARCKS cDNA、或载体DNA转染细胞。培养细胞48h以便基因表达，随 后暴露于促分泌素，并通过ELISA测定粘蛋白分泌。所有的转染均在存在 pcDNA4/TO/lacZ质粒(Invitrogen)(DNA比率6∶1，总共1μg DNA，DNA与 Effectene试剂之比＝1∶25)的情况下进行，以便监测转染效率的变化。结果显 示分离自转染细胞的细胞裂解物中的β-半乳糖苷酶活性没有显著差异，说明 不同DNA构建体之间具有相似的转染效率(结果未显示)。
蛋白磷酸酶活性测定-使用本领域已知的蛋白磷酸酶测定系统(Life Technologies，Inc.)测定PP1和PP2A活性，方法略有改动。Huang et al.，Adv. Exp.Med Biol.396，209-215(1996)。简言之，NHBE细胞用8-Br-cGMP或仅 培养基处理5分钟。然后将细胞刮至裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.4)， 0.1％.β.-巯基乙醇，0.1mM EDTA，1mM Benaamidine，10μg/ml胃酶抑素A， 10μg/ml亮抑酶肽)中并超声处理20秒使之破坏，4℃。离心细胞裂解物并 收集上清液用于磷酸酶活性测定。使用32P-标记的磷酸化酶A作为底物进行 测定。闪烁计数释放出的32Pi。通过Bradford测定法确定各个样品的蛋白质 浓度。PP2A活性表示为样品总磷酸酶活性减去存在1nM岗田酸时残留的活 性。PP1活性表示为分别存在1nM和1μM岗田酸时残留活性之间的差异。 通过每分钟每mg总蛋白释放出的Pi(nmol)来报告蛋白磷酸酶活性。
雨胞毒性测定-通过测定细胞释放的总乳酸脱氢酶来检测用于处理 NHBE细胞的各种试剂的细胞毒性。使用Promega Cytotox 96Kit按照生产商 的说明进行该测定。所有实验均采用非毒性浓度的试剂进行。
统计学分析-使用经Bonferroni检验后校正(Bonferroni post-test corrections)的单向方差分析法分析数据的显著性。p＜0.05时，认为不同处理 之间的差异具有显著性。
自犬血分离PMN-涉及分离PMN的步骤包括收集10ml ACD抗凝血。 然后将5ml层铺在3.5ml PMN分离介质之上，同时确保PMN分离介质(IM) 为室温(RI)。随后血液在室温离心30分钟，550X g，1700RPM。将较低的 白色带层转移至15ml锥形离心管(CCFT)。随后，加入2V含10％胎牛血清 (PBS)的HESS，室温离心10分钟，400X g，1400RPM。沉淀重悬于5ml 含PBS的HESS。将细胞悬液加至50ml含20ml冰冷的0.88％NH4Cl的 CCFT中，颠倒2至3次。所得产物离心10分钟，800X g，2000RPM，然 后吸出并重悬于5ml含FBS的HBSS中。通过计数和细胞离心涂片器检测 制备物，且优选地，对于全血而言，细胞数应该在109-1011个细胞之间，而 对于PMN，细胞数应该在2-4x 107个细胞之间。请参见Wang etal.，J. Immunol.，″Neutrophil-induced changes in the biomechanical properties of endothelial cells：roles of ICAM-1and reactive oxygen species，″6487-94(2000)。
MPO酶显色定量分析-使用ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis， Minn.)在96孔圆底微滴定板中测定样品的MPO活性。简言之，在各微孔内 将20微升样品与180微升底物混合物(含33mM磷酸钾，pH 6.0，0.56％Triton X-100，0.11mM过氧化氢和0.36mM O-Diannisidine Dihydrochloride)混合。 测定混合物中的终浓度为：30mM磷酸钾，pH 6.0，0.05％Triton X-100，0.1 mM过氧化氢和0.32mM O-Diannisidine Dihydrochloride。经过混合，将测定 混合物在室温温育5分钟，然后通过分光光度法在550nm确定MPO酶活 性。样品均一式两份进行测定。
实施例1：炎症介质分泌研究
使用了应答于佛波酯诱导的PKC活化分泌特异性颗粒成分的四种不同白 细胞类型或模型。中性粒细胞分离自人血并测定这些细胞体外释放MPO的 情况。还评价了商品化的人白细胞细胞系释放膜结合型炎症介质的情况。使 用人早幼粒细胞细胞系HL-60克隆15分析EPO的释放(FischkoffSA.Graded increase in probability of eosinophilic differentiation of HL-60promyelocytic leukemia cells induced by culture under alkaline conditions.Leuk Res 1988； 12：679-686；Rosenberg HF，Ackerman S J，Tenen DG.Human eosinophil cationic protein：molecular cloning of a cytotoxin and helminthotoxin with ribonuclease activity.J Exp Med 1989；170：163-176；Tiffany HL，Li F， Rosenberg HF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemia cell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J Leukoc Biol 1995；58：49-54；Badewa AP，Hudson CE，Heiman AS.Regulatory effects of eotaxin，eotaxin-2，and eotaxin-3on eosinophil degranulation and superoxide anion generation.Exp Biol Med 2002；227：645-651)。使用单核细胞白血病细 胞系U937分析溶菌酶的释放(Hoff T，Spencker T，Emmendoerffer A.，Goppelt- Struebe M.Effects of glucocorticoids on the TPA-induced monocytic differentiation.J Leukoc Biol 1992；52：173-182；Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol 2003；170：5276-5280；Sundstrom C，Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line(U- 937).Int J Cancer 1976；17：565-577)。使用淋巴细胞天然杀伤细胞系NK-92 分析粒酶的释放(Gong JH.，Maki G，Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemia 1994；8：652-658；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK-92.J Hematother Stem Cell Res 2001；10：369-383； Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-190)。在所有情况中，细胞均与一 定浓度范围的与24个氨基酸的MARCKS N-端相同的合成肽(MANS-豆蔻酰 化的N-端序列肽；MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO：1)，其中MA是通过酰胺键连接于所述肽的N-端胺的豆蔻酰基)或错义对 照肽(RNS：随机N-端序列肽；MA-GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF， SEQ ID NO：232)预温育，所述错义对照肽由与MANS肽序列相同的24个氨 基酸组成，但这些氨基酸以随机次序的序列排列，该序列与MANS肽序列的 序列相同性低于13％。或者，用以下表3所列的合成的截短型肽处理所述细 胞。
MANS以浓度依赖性方式减少了各种细胞类型的炎症介质释放，而RNS 则不能。可用的观察时间段是0.5-3.0小时。这些结果与MARCKS蛋白N-端 区域参与导致白细胞脱颗粒的细胞内途径的看法相一致。
人中性粒细胞分离-这些研究得到了人类研究Institutional Review Board (IRB)的批准。按照先前所述的方法分离人中性粒细胞(见Takashi S，OkuboY， Horie S.Contribution of CD54to human eosinophil and neutrophil superoxide production.J Appl Physiol 2001；91：613-622)，方法略有改动。简言之，从正 常健康志愿者获得肝素抗凝的静脉血，用RPMI-1640(Cellgro；Mediatech， Inc.，Hemdon，VA)以1∶1的比例稀释，层铺于Histopaque(密度1.077g/ml； Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO)之上并400g离心20分钟，4℃。仔细移除 上清液和界面处的单个核细胞，在冰冷的蒸馏水中裂解沉淀中的红细胞。分 离的粒细胞用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次，然后重悬于HBSS，置 于冰上。用于实验中的中性粒细胞的纯度＞98％，嗜酸性粒细胞的污染＜2％， 经台盼蓝染料排除法确定，细胞活力＞99％。
测定所释放的中性粒细胞MPO活性-为了测定MPO的释放，将悬浮于 HBSS内的纯化人中性粒细胞等分为4×106个细胞/ml，置于15ml管中，并 与50或100μM的MANS、RNS、或一种本发明的肽在37℃预温育10分 钟。然后用100nM(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)刺激所述细胞达3 小时。如下建立对照参照物(PMA对照参照物)：将悬浮于HBSS内的纯化人 中性粒细胞等分为4×106个细胞/ml，置于15ml管中，并在缺乏测试肽的情 况下用100nM(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)刺激相同的时间。通过 将管置于冰上并在4℃、400g离心5分钟而终止反应。
使用四甲基联苯胺(TMB)基于先前建立的技术(Abdel-Latif D，Steward M， Macdonald DL，Francis GA.，Dinauer MC，Lacy P.Rac2is critical for neutrophil primary granule exocytosis.Blood 2004；104：832-839)分析细胞上清液内的 MPO活性。简言之，将100μL的TMB底物溶液加至96-孔微孔板中的50 μL细胞上清液或人MPO标准品(EMD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)中， 然后室温温育15分钟。加入50μL的1M H2SO4终止反应，使用分光光度酶 标仪(VERSA max，Molecular Devices，Sunnyvale，CA)检测450nm的吸光度。
白细胞培养研究
三种人白细胞细胞系，具体地为早幼粒细胞细胞系HL-60克隆15、单核 细胞系U937、和淋巴细胞天然杀伤细胞系NK-92，均购自美国典型培养物 保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC；Rockville，MD)。HL-60 克隆15细胞(ATCC CRL-1964)培养于由含L-谷氨酰胺的RPMI 1640组成的 培养基中，其中补充了10％热灭活的胎牛血清(Gibco；Invitrogen Co.， Carlsbad，CA)、50IU/ml青霉素、50μg/mL链霉素和25mM HEPES缓冲 液，pH 7.8，培养在37℃，5％CO2的环境中。通过在含有0.5mM丁酸 (Sigma-Aldrich Co.)的上述培养基中将细胞以5x 105个细胞/ml培养5天而使 其终末分化为嗜酸性粒细胞样表型，方法如前所述(Tiffany HL，Li F， Rosenberg HF.Hyperglycosylation of eosinophil ribonucleases in a promyelocytic leukemia cell line and in differentiated peripheral blood progenitor cells.J Leukoc Biol 1995；58：49-54；Tiffany HL，Alkhatib G，Combadiere C，Berger EA， Murphy PM.CC chemokine receptors 1and 3are differentially regulated by IL-5 during maturation of eosinophilic HL-60cells.J Immunol 1998；160：1385- 1392)。U937细胞(ATCC CRL-1593.2)在37℃、含5％CO2的环境中培养于由 含L-谷氨酰胺的RPMI 1640组成的完全培养基中，其中补充了10％FBS、 50IU/ml青霉素和50μg/mL链霉素。NK-92细胞(ATCC CRL-2407)培养于α- MEM培养基(Sigma-Aldrich Co.)，其中补充了20％FBS、100U/ml的白细胞 介素-2(IL-2)(Chemicon International，Inc.，Temecula，CA)、5x10-5M的2-巯 基乙醇、50IU/mL青霉素、和50μg/ml链霉素，培养在37℃，含5％CO2的 环境中。通过Wright-Giemsa染色分析细胞以评判细胞形态学。通过台盼蓝 染料排除法确定所收集的用于实验的细胞的活力，并使用活力＞95％的细胞群 体。
温育细胞用于脱颗粒测定
HL-60克隆15、U937和NK-92细胞经洗涤后以2.5×106个细胞/ml的密 度重悬于无酚红的RPMI-1640(Cellgro；Mediatech，Inc.)中，用于全部的脱颗 粒测定中。将等份的细胞置于15ml管中，与指定浓度的MANS、RNS、或 测试肽在37℃预温育10分钟。随后用PMA刺激细胞达2小时。分别使用 HL-60克隆15、U937、和NK-92细胞为各细胞类型建立对照参照物(PMA 对照参照物)：洗涤所述细胞并以2.5×106个细胞/ml的密度重悬于无酚红的 RPMI-1640，并在缺乏MANS、RNS、或测试肽的情况下用PMA刺激相同 的时间。通过将管置于冰上并在4℃、400g离心5分钟而终止反应。
对于测定从中性粒细胞释放的MPO和从U937细胞释放的溶菌酶，我们 可通过分别用人MPO和卵清蛋白作为标准品来定量分泌。对于从HL-60克 隆15细胞释放的EPO和从NK-92细胞释放的粒酶，没有用于定量的标准 品。因此，同时测定了释放的和细胞内的(来自裂解的细胞)EPO和粒酶水 平，并将释放的EPO和粒酶表示为各自总量(细胞内加释放)的百分数。为了 测定HL-60克隆15细胞的细胞内EPO和NK-92细胞的细胞内粒酶，取适量 的等量0.1％triton X-100-裂解细胞用于定量细胞内颗粒蛋白质，方法如下文 所述。所有的处理均表示为对照的百分数，以便将培养物之间的差异性最小 化。
测定HL-60EPO释放
根据先前建立的技术用TMB测定HL-60克隆15细胞释放的EPO活性 (Lacy P，Mahmudi-Azer S，Bablitz B，Hagen SC，Velazquez JR，Man SF，Moqbel R.Rapid mobilization of intracellularly stored RANTES in response to interferon- gamma in human eosinophils.Blood 1999；94：23-32)。因此，将100μL的 TMB底物溶液加至96-孔微孔板内的50μL(μL＝微升)样品中，室温温育15 分钟(min＝分钟)。加入50μL的1.0M H2SO4终止反应，并使用分光光度酶 标仪测定450nm(nm＝纳米)处的吸光度。分泌的EPO量表示为总含量(使用 在相同数量的triton X-100-裂解细胞中得到的量)的百分数。
测定单核细胞溶菌酶分泌
采用分光光度测定法测定U937细胞分泌的溶菌酶，方法如前所述，略 有改动(Balboa M A，Saez Y，Balsinde J.Calcium-independent phospholipase A2 is required for lysozyme secretion in U937promonocytes.J Immunol 2003； 170：5276-5280)。因此，100μL的样品与100μL的溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus)(Sigma-Aldrich Co.)悬液(0.3mg/ml溶于0.1M磷酸钠缓冲液， pH 7.0)在96-孔微孔板中混合。室温测定450nm处吸光度的下降。使用鸡蛋 清溶菌酶(EMD Biosciences，Inc.)作为标准品建立校准曲线。
测定NK细胞粒酶分泌
通过测定Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲醇酯(Nα-benzyloxycarbonyl-L- lysine thiobenzyl ester，BLT)的水解来测定NK-92细胞分泌的粒酶，方法基 本上如先前所述(Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J Immunol Methods 1987；104：183-190)。简言 之，将50μL上清液转移至96-孔板，将150μL溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS， pH 7.2)中的BLT溶液(0.2mM BLT；EMD Biosciences，Inc.，和0.22mM DTNB；Sigma-Aldrich Co.)(mM＝毫摩尔)加至所述上清液中。室温温育30 分钟后测定410nm处的吸光度。结果表示为总的细胞内酶含量(使用在相同 数量的triton X-100-裂解细胞中得到的量)的百分数。
统计学分析
采用单向方差分析评价不同处理组之间差异的统计学显著性。P值＜0.05 被认为具有显著性。
抑制人中性粒细胞释放MPO
发现100nM PMA(作为炎症介质释放的刺激物)在30分钟时使得PMA 对照参照物内的人中性粒细胞的MPO释放相对于对照水平升高了大约3 倍，3小时后MPO的释放升高至5-6倍。在30分钟时，相对于缺乏PMA和 缺乏PMA加MANS、RNS、或测试肽的对照MPO活性(100％)，PMA对照 参照物的MPO活性为大约275％，PMA加50μM MANS为大约275％，而 100μM MANS为大约305％。因此，MANS肽在30分钟时未检测到作用。 不过，到1小时时，更高浓度的MANS(100μM)产生了显著的抑制作用(是 对照的260％)或相对于PMA对照参照物水平(是对照的大约340％)MPO释 放降低大约25％。50μM MANS样品是对照的大约290％或者相对于PMA对 照参照物降低大约15％。在2小时并持续至3小时，MANS肽以浓度依赖性 方式显著减弱MPO活性。在2小时时，PMA对照参照物MPO活性为对照 的大约540％，50μM MANS(是对照的大约375％)导致MPO释放相对于 PMA对照参照物降低大约30％；而100μM MANS(是对照的大约295％)导 致MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约45％。在3小时，PMA对照 参照物MPO活性为对照的大约560％，50μM MANS(是对照的大约375％) 导致MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约33％；100μM MANS (是对 照的大约320％)导致MPO释放相对于PMA对照参照物降低大约40％。RNS 肽在任何时间点或测试浓度均不影响PMA-诱导的MPO释放。下表给出的数 据代表的是100μM浓度的测试肽并与100nM PMA温育2小时。
抑制HL-60细胞释放EPO
PMA刺激后1和2小时HL-60克隆15细胞上清液中的EPO活性显著增 强。在1小时，相对于对照的EPO活性(100％)，PMA对照参照物为大约 110％；含10μM MANS的样品为大约95％，导致EPO活性相对于PMA对 照参照物降低大约15％；含50μM MANS的样品为大约78％，导致EPO活 性相对于PMA对照参照物降低大约30％；而含100μM MANS的样品为大 约65％，导致EPO活性相对于PMA对照参照物降低大约40％。在2小时， 相对于对照的EPO活性(100％)，PMA对照参照物为大约145％；含10μM MANS的样品为大约130％，导致EPO活性相对于PMA对照参照物降低大 约10％；含50μM MANS的样品为大约70％，导致EPO活性相对于PMA对 照参照物降低大约50％；而含100μM MANS的样品为大约72％，导致EPO 活性相对于PMA对照参照物降低大约50％。因此，在1和2小时时，50或 100μM的MANS均显著减弱EPO释放。RNS肽在任何时间点或测试浓度均 不影响PMA-增强的EPO释放。下表给出的数据代表的是50μM浓度的测试 肽并与100nM PMA温育2小时。
抑制U937细胞释放溶菌酶
温育后1小时，PMA刺激增加了U937细胞的溶菌酶分泌，而且在2小 时时增加得更多。在1小时，相对于对照U937细胞的溶菌酶分泌(100％)， PMA对照参照物为大约210％；含10μM MANS的样品为大约170％，导致 U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约20％；含50μM MANS的样品为大约170％，导致U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照 参照物降低大约20％；而含100μM MANS的样品为大约115％，导致U937 细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约45％。在2小时，相对 于对照U937细胞的溶菌酶分泌(100％)，PMA对照参照物为大约240％；含 10μM MANS的样品为大约195％，导致U937细胞的溶菌酶分泌相对于 PMA对照参照物降低大约20％；含50μM MANS的样品为大约185％，导致 U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA对照参照物降低大约25％；而含100 μM MANS的样品为大约140％，导致U937细胞的溶菌酶分泌相对于PMA 对照参照物降低大约40％。因此，100μM的MANS显著减弱了刺激后1和 2小时的溶菌酶分泌，而50或10μM的MANS则没那么多。RNS肽在任何 时间点或测试浓度均不影响PMA-增强的溶菌酶分泌。下表给出的数据代表 的是50μM浓度的测试肽并与100nM PMA温育2小时。
抑制NK-92细胞释放粒酶
使用淋巴细胞天然杀伤细胞系NK-92评价粒酶释放(Gong JH，Maki G， Klingemann HG.Characterization of a human cell line(NK-92)with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells.Leukemia 8：652-658， 1994；Maki G，Klingemann HG，Martinson JA，Tam YK.Factors regulating the cytotoxic activity of the human natural killer cell line，NK-92.J.Hematother.Stem Cell Res.，10：369-383，2001；Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J.Immunol.Methods 104：183-190， 1987)。
测定NK细胞的粒酶分泌：通过测定Nα-苄氧羰基-L-赖氨酸硫代苯甲醇 酯(BLT，EMD Bioscience，Inc.)的水解而测定NK-92细胞分泌的粒酶，方法 基本上如前所述(Takayama H，Trenn G，Sitkovsky MV.A novel cytotoxic T lymphocyte activation assay.J.Immunol.Methods 104：183-190，1987)。将等量 50μL的上清液转移至96-孔板，向所述上清液内加入150μL溶于磷酸缓冲 盐溶液(PBS，pH 7.2)的0.2mM BLT溶液和0.22mM DTNB(Sigma-Aldrich Co.)。室温温育30分钟后测定410nm处的吸光度。结果表示为总的细胞内 酶含量(使用在相同数量的triton X-100-裂解细胞中得到的量)的百分数。
由于没有可用于定量的NK-92细胞粒酶标准品，我们同时测定了所释放 的和细胞内的(来自裂解的细胞)粒酶的水平，并将释放的粒酶表示为各自总 量(细胞内和释放)的百分数。为了测定NK-92细胞的细胞内粒酶，取适量的 等量0.1％triton X-100-裂解细胞用于定量所述酶，方法如上所述。所有的处 理均表示为对照的百分数，以便将培养物之间的差异性最小化。下表给出的 数据代表的是50μM浓度的测试肽并与100nM PMA温育2小时。
细胞毒性
通过检测LDH的保持/释放情况，发现上述处理均未在细胞中产生毒性 反应(结果未显示)(另见Park J-A，He F，Martin LD，Li Y，Adler KB.Human neutrophil elastase induces hypersecretion of mucin from human bronchial epithelial cells in vitro via a PKCδ-mediated mechanism.Am J Pathol 2005； 167：651-661)。
在初步的实验中，下表给出的这些肽对人中性粒细胞释放MPO、HL-60 克隆15细胞释放EPO、U937细胞释放溶菌酶、和NK-92细胞释放粒酶显示 出一定百分数的抑制作用，其中MA-表示在肽的α-N-端位置存在豆蔻酰基取 代基；Ac-表示在肽的α-N-端位置存在乙酰基取代基；H表示无基团连接于 肽；NH2表示C-端位置存在酰胺基。抑制数据是多次实验的平均值。肽在 0.5N盐水pH 6.5时的定性溶解度以mg/mL形式显示于以下表3。改变N-端 化学部分的豆蔻酰基可改变在此所公开的肽在水性介质中的溶解度。例如， 如表3所示，将豆蔻酰基改变为乙酰基导致水溶性增加。
表3：代表性肽和取代的肽的酶抑制测定结果及其溶解度

1N-＝N-端基团
2C-＝C-端基团
30.5N盐水，pH 6.5
  106   MA   GAQFSKTAAK   37.4   56.6   ＞10   11   MA   GAQFSKTAAKGEAAAERPGE   33.6   99   179   MA   AAKGEA   31.4   28.6   ＜1.0   37   MA   GAQFSKTAAKGEAAAE   30.3   99   ＞2.0   79   MA   GAQFSKTAAKGE   25.2   85.2   43.2   ＞2.0   91   MA   AAAERPGEAAVA   21.6   98   ＜20   45   MA   AKGEAAAERPGEAAVA   18.1   98   ＞80   153   MA   RPGEAAVA   0   99   15   MA   SKTAAKGEAAAERPGEAAVA   0   99   ＞80   143   MA   TAAKGEAA   0   80.2   ＜1.0   219   MA   AKGE   0   28.6   ＜1.0   232   MA   GTAPAAEGAGAEVKRASAEA   KQAF   0   0   0   29.5   ＞15   234   MA   GAQFSKTKAKGE   65.2   ＞3.0
实施例2：MANS和相关的肽体内抑制脂多糖(LPS)-诱导的肺部炎症
本实施例基本上按照以下文献所述的方法进行：Cox，G，Crossley，J.，and Xing，Z.；Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in ViVo；Am.J.Respir.Cell Mol. Biol.12：232-237，1995；Hirano S.，Quantitative time-course profiles of bronchoalveolar laVage cells following intratracheal instillation of lipopolysaccharide in mice，Ind.Health 35：353-358，1997；和Ulich TR，Watson LR，Yin SM，Guo KZ，Wang P，Thang H，and del Castillo，J.Am.J.Pathol. 138：1485-1496，1991。
因此，体重15-20g的6至7周龄CD1雌性小鼠得自Charles River Laboratories，每笼5只小鼠分组饲养。动物随意获得标准啮齿动物膳食和经 过滤的水。遵照NIH的指南规定将动物饲养在标准温度(64°至79°F)，相对 湿度30至70％条件下。
5组实验小鼠，每组5只，分别给予以下处理：PBS继以PBS；PBS继 以LPS；(豆蔻酰化的)MANS肽继以LPS；乙酰化的肽SEQ ID NO：1继以 LPS；或乙酰化的肽SEQ ID NO：106继以LPS。
鼻内滴入肽预处理：将待分析其体内抑制或降低LPS-诱导的肺部炎症的 能力的本发明的肽溶解于PBS，浓度为1mM。动物经吸入0.8％Isofluorane 被麻醉，向一侧鼻孔鼻内滴入2x 10μL团注量的肽溶液，30分钟后滴入 LPS。
鼻内滴入LPS：脂多糖(LPS)内毒素(大肠杆菌(Fscherichia coli)血清型 011:B4来源的内毒素；Sigma，St Louis，MO；参见Sigma产品信息页 L4130，标题为：Lipopolysaccharides from Escherichia coli 011:B4)溶解于磷酸 缓冲盐水(PBS)，浓度为2,500μg/mL。为了使动物暴露于内毒素，给通过吸 入0.8％Isofluorane而被麻醉的动物施用10μL鼻内团注量的2,500μg/ml的 内毒素溶液。将10μL的团注量施用于一侧鼻孔。滴入内毒素后监测动物的 用力呼吸、嗜睡以及水/食物摄入减少等情况。
支气管肺泡灌洗(BAL)：末次滴入后6小时，将动物麻醉(90mg/kg的戊 巴比妥钠)并通过放血处死。用1.0mL的等量PBS连续灌洗肺部2次。收集 的BAL液经离心取细胞用于随后计数和分类分析。回收的灌洗液用于分析 总蛋白、髓过氧化物酶(MPO)、LDH和血红蛋白。
分析：等量的BAL液立即用于测定LDH、总蛋白或血红蛋白水平，使 用的是COBAS Fara analyzer(COBAS FARA II automated analyzer；Roche Diagnostic Systems Inc.，Montclair，NJ)。一份等量BAL液冷冻于-80℃，用于 随后通过小鼠特异性ELISA测定法(Cell Sciences，Inc.，Canton，Mass)定量髓过 氧化物酶(MPO)。通过标准技术分析BAL数据以便检查对照组与处理组之 间的差异。以下诸表给出的结果证实测试肽可抑制或减轻炎症。
表4：存在MANS肽MA-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA，SEQ ID NO：1时炎症标 记物的平均值
  处理方案   细胞   总数   中性粒细   胞总数   嗜中性粒细胞占   细胞总数的％   MPO   (ng/mL)   总蛋白   (ug/ml)   LDH   (units/L)   Hb   (g/dl)   PBS/PBS   n＝5   157,020   29317   18.7   3.28   125.60   68.20   0.00   PBS/LPS   n＝5   264,200   110,061   41.7   28.98   272.40   60.40   0.19   MANS/LPS   n＝7   208,457   64,481   30.9   9.49   175.00   68.57   0.05
表5：存在MANS肽的N-端乙酰化类似物Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA， SEQ ID NO：1时炎症标记物的平均值
  处理方案   细胞   总数   中性粒细   胞总数   嗜中性粒细胞占   总计数的％   MPO   (ng/mL)   总蛋白   (μg/mL)   LDH   (units/L)   Hb   (g/dL)   PBS/PBS   n＝5   89,440   19,770   22.1   5.45   230.6   84.0   0.00   PBS/LPS   n＝5   251360   164,578   65.5   37.90   153.4   89.9   0.01   Ac-SEQ ID   NO：1/LPS   n＝5   254,400   105,499   41.47   30.79   182.75   74.5   0.01
表6：存在乙酰化肽Ac-GAQFSKTAAK，SEQ ID NO：106时炎症标记物的平均值
  处理方案   细胞   总数   中性粒细   胞总数   嗜中性粒细胞占   总计数的％   MPO   (ng/mL)   总蛋白   (μg/mL)   LDH   (units/L)   Hb   (g/dL)   PBS/PBS   n＝5   312,620   66,521   21.3   4.88   113.8   61.80   0.00   PBS/LPS   n＝5   327,680   80,077   24.4   7.19   116.4   78.20   0.00   Ac-SEQ ID   NO：106/LPS   n＝5   305,688   9,170   3.0   1.50   131.0   106.86   0.00
表7：MANS肽(Myr-SEQ ID NO：1)；测试肽(Ac-GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA)， SEQ ID NO：1；和Ac-GAQFSKTAAK，SEQ ID NO：106对炎症标记物的抑制作用，与 PBS/LPS处理相比
  处理方案   对中性粒细胞迁移的抑制   对MPO的抑制   MANS/LPS   41.4％   67.2％   SEQ IDNO：1/LPS   35.9％   18.75％   Ac-SEQ ID NO：106/LPS   88.5％   79.1％
PBS/PBS代表仅施用PBS对照，而没有添加LPS内毒素刺激趋化性中 性粒细胞迁移；PBS/LPS代表添加LPS(内毒素)刺激趋化性中性粒细胞迁 移；MANS/LPS代表用PBS中的MANS肽预处理继以LPS刺激以便诱导中 性粒细胞迁移。经MANS肽处理后，LPS处理组中的中性粒细胞占细胞总数 的百分数从41.7％降低至30.9％；肽Ac- GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA，SEQ ID NO：1处理使之从65.5％降低 至41.47％；肽Ac-GAQFSKTAAK，SEQ ID NO：106处理使之从24.4％降低至 3.0％。经MANS肽处理后，测定到LPS处理组中的MPO水平从28.98 ng/mL降低至9.49ng/mL；具有乙酰化的SEQ ID NO：1的肽处理使之从37.9 ng/mL降低至30.79ng/mL；而具有乙酰化的SEQ ID NO：106的肽处理使之从 7.19ng/mL降低至1.50ng/mL。
实施例3：臭氧诱导的COPD小鼠模型
化学刺激物如臭氧引起的氧化应激是慢性阻塞性呼吸道疾病(COPD)的一 个被广泛认知的特征。参见：Repine JE，Bast A，Lankhorst I，and the Oxidative Stress Study Group，Am.J.Respir.Crit.Care Med.156：341-357，1997；和also Harkema JR and Hotchkiss JA，Toxicology Letters，68：251-263，1993。
10周龄的Balb/C雌性小鼠得自Charles River Laboratories，遵照NIH的 指南规定将每笼5只小鼠分组饲养。动物随意获得标准啮齿动物膳食和经过 滤的水。3个处理组的小鼠，每组5只，分别通过腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和赛拉嗪(20mg/kg)麻醉，随后通过气管内施用25μL的以下处理进 行预处理：仅PBS；或溶于PBS的1.0mM MANS肽溶液；或溶于PBS的 1.0mM的乙酰化MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK(命名为乙酰化SEQ ID NO：106)溶液。30分钟后，将动物置于合适的定制室内暴露于臭氧或强制通 风。动物暴露于臭氧达2小时(臭氧浓度为1-10ppm)，采用Haddad et al， 1995的方法(Haddad E-B，Salmon M，Sun J，Liu S，Das A，Adcock I，Barnes PJ， and Chung KF，FEBS Letters，363：285-288，1995)，略加改动。使用臭氧产生装 置OL80F/B(OzoneLab，Burton，British Columbia，Canada)产生臭氧。臭氧浓 度通过Teledyne Photometric O3Analyzer(model 400E，Teledyne Instruments， City of Industry，CA)连续监测。额外两组小鼠均未做任何预处理，分别暴露 于相同条件下的臭氧或暴露于类似于臭氧处理组但缺乏臭氧条件下的强制通 风。暴露后放血处死动物，用1.0mL的等量PBS连续灌洗肺部2次。收集 的支气管肺泡灌洗(BAL)液经离心取细胞用于随后计数和分类分析。回收的 灌洗液用于分析蛋白质并通过ELISA测定法(试剂盒来自R&D Systems， Minneapolis，MN)额外分析IL-6、IFNγ、和KC(鼠的IL-8类似物)。
下表给出了与仅使用PBS处理的对照组相比，作为各处理组的函数的对 中性粒细胞迁移至BAL液的抑制百分数。
表8：MANS肽和乙酰化SEQ ID NO：106肽Ac-GAQFSKTAAK抑制臭氧诱导的中性粒细 胞迁移
  处理组   抑制中性粒细胞迁移至BAL液(％)   MANS+臭氧   93.0   Ac-SEQ ID NO：106+臭氧   81.2   PBS+臭氧   不适用   仅强制通风   不适用
得到了作为气管内注射预处理继以臭氧处理的函数的BAL液中的IL-6 浓度(pg/mL)，如下。IL-6水平为：在MANS肽预处理随后暴露于臭氧的小 鼠组中为大约364.5pg/mL；在乙酰化的MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO：106)预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约130.4pg/mL；在 PBS预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约1041.3pg/mL；在直接暴露于 强制通风而不做任何预处理的小鼠组中为大约43.2pg/mL。
得到了作为气管内注射预处理继以臭氧处理的函数的BAL液中的KC浓 度(pg/mL)，如下。KC水平为：在MANS肽预处理随后暴露于臭氧的小鼠组 中为大约183.6pg/mL；在乙酰化的MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK(SEQ ID NO：106)预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约159.7pg/mL；在PBS 预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约466.6pg/mL；在暴露于强制通风 而不做预处理的小鼠组中为大约36.3pg/ml。
得到了作为气管内注射预处理继以臭氧处理的函数的BAL液中的IFNγ 浓度(pg/mL)，如下。IFNγ水平为：在MANS肽预处理随后暴露于臭氧的小 鼠组中为大约7.4pg/mL；在乙酰化的MANS片段肽Ac-GAQFSKTAAK (SEQ ID NO：106)预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约3.6pg/ml；在 PBS预处理随后暴露于臭氧的小鼠组中为大约8.6pg/mL；而在暴露于强制通 风的小鼠组中为大约5.0pg/mL。
给小鼠施用臭氧显著增加BAL中的侵润中性粒细胞数量以及IL-6和KC 水平。与PBS预处理小鼠的对照组相比，MANS肽预处理组以及乙酰化的肽 Ac-GAQFSKTAAK即乙酰化SEQ ID NO：106预处理组分别显示出暴露于臭 氧后BAL液中的中性粒细胞侵润减少(例如，分别为93％±10％和81％± 10％，与PBS对照相比)。与此一致，MANS肽和乙酰化的肽乙酰化SEQ ID NO：106还显著降低暴露于臭氧后的KC浓度(例如，分别为65.8％±10％和 71.3％±10％，与PBS对照相比)和IL-6水平(例如，67.8％±15％(MANS)和 91.3％±15％(乙酰化SEQ ID NO：106)，相比于PBS对照)，但对干扰素-γ水 平几乎没有影响。总之，这些数据表明MANS肽和乙酰化SEQ ID NO：106 肽显著减少或抑制臭氧诱导的中性粒细胞向气道内的迁移，并选择性降低趋 化因子和细胞因子。相对于PBS预处理的动物，经MANS肽或乙酰化的肽 SEQ ID NO：106预处理的动物BAL液中的IL-6水平分别出现大约68％和 91％的抑制。此外，相对于PBS预处理的动物，经MANS肽或乙酰化的肽 SEQ ID NO：106预处理的动物BAL液中的KC水平也出现大约65％和71％的 抑制。
实施例4：慢性支气管炎模型
采用Voynow JA，Fischer BM，Malarkey DE，Burch LH，Wong T，Longphre M，Ho SB，Foster WM，Neutrophil Elastase induces mucus cell metaplasia in mouse lung，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.287：L1293-L1302，2004中 所述的方法建立小鼠慢性支气管炎模型。具体而言，杯状细胞增生是慢性支 气管炎的标志性病理学特征，通过长期给小鼠气道内滴入人中性粒细胞弹性 蛋白酶(NE)可诱导杯状细胞增生。
人NE被雄性Balb/c小鼠吸入支气管内。总共30只小鼠(体重约25-30g) 购自供货商如Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME。小鼠按照12小时白天周 期饲养，随意获得食物和水。动物在第1、4、和7天通过口咽吸入而接受 NE。动物经吸入Isofluorane(IsoFlo from Abbott Laboratories and Open-Circuit Gas Anesthesia System from Stoelting)麻醉后立即以其上切齿悬于60°倾斜板 上，将一液体体积的人NE[50ug(43.75单位)/40μL PBS](Elastin Products， Owensville，MO)顺着动物被牵拉的舌头输送至口咽的远端部分。由于舌头被 牵拉，动物无法吞咽，因此该液体体积被吸入呼吸道内。
末次暴露于NE之后第7天，此时杯状细胞增生最大程度模拟慢性支气 管炎的气道(见Voynow et al，2004)，给小鼠(每组5只动物)气管内滴入50μL 的PBS(作为对照)或100μM溶解于PBS的MANS肽溶液、RNS肽溶液、或 肽溶液例如乙酰化的肽SEQ ID NO：106。15分钟后，通过施用乙酰甲胆碱诱 发粘液分泌，使用Buxco系统喷雾器以提供细微的气溶胶，输送大约60mM 的乙酰甲胆碱达3分钟。施用乙酰甲胆碱后15分钟，通过吸入100％CO2气 体处死小鼠。
组织学-经上述暴露后，冲洗动物的肺以去除血液，然后充入用盐水对 半稀释的OCT(Optimum Cutting Temperature medium(Sakura Finetck， Torrance，CA)。将肺浸没于PBS中的10％甲醛中4℃过夜，然后石蜡包埋。 用高碘酸-希夫/苏木精处理5μm的切片以便染色气道内的粘蛋白，例如参见 Singer M，Vargaftig BB，Martin LD，Park JJ，Gruber AD，Li Y，Adler KB，A MARCKS-related peptide blocks mucus hypersecretion in a murine model of asthma.，Nature Medicine 10：193-196，2004。
组织学粘液指数-在AB/PAS染色的包括中央和外周气道的切片上进行 组织学粘液指数(Whittaker L，Niu N，Temann U-A，Stoddard A，Flavell RA，Ray A，Homer RJ，and Cohn L，Interleukin-13mediates a fundamental pathway for airway epithelial mucus induced by CD4T cells and interleukin-9，Am.J.Respir. Cell Mol.Biol.27：593-602，2002)。用10X物镜检查玻片，数码相机获取图 像。每只动物获取至少4幅代表性的横向或径向气道截面图像。仅分析可观 察到完整的气道周径并可将其纳入图像中的那些气道。不分析那些直接敞开 至肺泡空间的气道。可通过一名对各个切片的处理条件不知情的检查者对图 像中各气道内PAS-阳性染色的程度进行半定量，采用如下5级系统：0级， 无PAS染色；1级，25％或以下的气道上皮具有PAS染色；2级，26-50％的 气道上皮具有PAS染色PAS染色；3级，51-75％的气道上皮具有PAS染 色；和4级，＞75％的气道上皮具有PAS染色。采用这一分级系统来计算各 组的粘液指数评分，结果表示为平均值±SE。
所有结果表示为平均值±标准误(n＝5只动物，每只10-20个切片)。将利 用SPSS 6.1软件采用单向方差分析继以Scheffe’s检验来计算显著性水平(*＝ 具有p＜0.05阈值的数据间显著性)。
实施例5：体内分析
下组实验的目的旨在明确通过局部滴入炎症部位或静脉注射而体内施用 本发明的肽与对照肽例如RNS相比对炎症的影响。两种模型可用于此目的： (i)鼠的气囊(air pouch)炎症模型和(ii)鼠的巯基醋酸盐(thioglycollate)诱导的腹 膜炎模型。两者均为充分表征的炎症模型，中性粒细胞在所述模型中具有关 键作用。气囊模型能够确定肽对短期炎症(约4小时)的作用，而腹膜炎模型 可用于较长期的炎症(约24小时)。
总体实验设计：
4项研究，每一模型两项，其一测试静脉输送所述肽，另一个测试局部 输送所述肽，这些研究可用于研究本发明的肽的作用。每一项研究包括2个 实验组，一个是非炎症对照(用载体处理)，另一个是炎症组(即，用炎性刺 激物处理)。各组分为5个以及任选地6个处理亚组，各亚组n＝6。处理亚 组例如为：载体、MANS、RNS、测试肽、任选地具有测试肽的乱序序列的 肽(该乱序序列称为“肽-SCR”)、和地塞米松。地塞米松充当参照抗炎剂。根 据初步的剂量应答实验确定如何选择用于静脉注射或者局部滴入的合适剂 量。基于MANS在人中性粒细胞上的抑制活性的试验剂量为：1mg/kg用于 静脉输送单次施用或者终浓度50μM用于局部输送(至气囊或腹腔)。所选的 静脉输送剂量假定分布容积为2L/kg。
气囊炎症模型：
按照文献所述进行小鼠气囊内的中性粒细胞侵润和炎症分析：Clish CB， O′Brien JA，Gronert K，Stahl GL，Petasis NA，Serhan CN.Local and systemic delivery of a stable aspirin-triggered lipoxin prevents neutrophil recruitment in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jul 6；96(14)：8247-52。因此，用Isoflurane 麻醉白色雄性BALB/c小鼠(6-8wk)，通过在第0天和第3天皮下注射3ml 无菌空气而产生背部气囊。在第6天，用Isoflurane麻醉小鼠，同时将载 体、MANS、RNS、测试肽、或任选地肽-SCR以团注形式，于100μL无菌 的0.9％盐水中静脉输送至尾静脉内，或者于900μL的PBS/-(不含镁离子 或钙离子的杜伯科磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)， BioWhittaker)中局部输送至气囊内。地塞米松(Sigma)以0.1rmg/kg于100μl 无菌0.9％盐水中静脉输送或者10μg于900μL的PBS-/-中局部输送，充当 参照抗炎剂。通过局部注射溶于100μL无菌PBS内的重组鼠肿瘤坏死因子α (TNF-α，20ng)(Boehringer Mannheim)在气囊内诱导炎症。用Isoflurane麻醉 小鼠，同时在首次注射TNF-α后4小时用3mL无菌PBS灌洗气囊。抽出物 2,000rpm离心15分钟，23℃。去除上清液，细胞悬浮于500μL的PBS中。 取等量上清液用于测定炎症介质浓度(任选地除外TNFα)、MPO活性和脂质 过氧化作用。
使用血球计数器和光学显微镜计数细胞悬液中的总白细胞。将重悬的抽 出物细胞(50μL)加至150μL的30％BSA中并用离心机以2,200rpm离心4分 钟至显微镜载片上。在Wright Giemsa染料染色的细胞离心涂片上确定分类 白细胞计数并用于计算每一气囊渗出液中各类白细胞的绝对数量。对于显微 镜分析，用6-mm组织活检针(Acu-Punch，Acuderm)获取组织并固定于10％缓 冲甲醛中。样品以石蜡包埋，切片并以苏木精-伊红染色。通过计数每高倍视 野的细胞计数组织切片内的中性粒细胞。用远处的真皮作为炎症气囊真皮的 对照。
数据表示为每一渗出物的中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱 性粒细胞和淋巴细胞的总数，或者每一组织高倍视野的中性粒细胞数。所给 出的数值的形式为平均值±SEM(n＝6)。通过ANOVA确定任一处理对迁移 之影响的显著性。P＜0.05被认为是具有显著性。
实施例6：炎性腹膜模型
使用雄性BALB/c小鼠(6-8wk)并按照如下文献所述建立巯基醋酸盐诱 导的腹膜炎模型：Tedder TF，Steeber DA，Pizcueta P.L-selectin-deficient mice have impaired leukocyte recruitment into inflammatory sites.J Exp Med.1995Jun 1；181(6)：2259-64。将载体、MANS、RNS、测试肽、和任选地肽-SCR以团注 形式，于100μL无菌的0.9％盐水中输送至尾静脉内，或者于900μL的PBS -/-中局部输送至腹腔内，随后立即腹腔注射巯基醋酸盐。地塞米松(Sigma) 以0.1rmg/kg于100μl无菌0.9％盐水中静脉输送或者10μg于900μL的PBS -/-中局部输送，充当参照抗炎剂。通过给小鼠腹腔注射1mL巯基醋酸盐溶 液(3％wt/vol；Sigma Immunochemicals)引导炎症。诱导炎症后24小时对小 鼠实施安乐死，并向腹腔内注射5mL温(37℃)培养基(RPMI 1640，2％FCS， 和2mM EDTA)，随后轻柔按摩腹部。将腹腔灌洗液抽出物在2,000rpm离 心15分钟，23℃。去除上清液，将细胞悬浮于500μL的PBS中。取等量的 上清液用于测定MPO活性、炎症介质浓度和脂质过氧化作用。
使用血球计数器和光学显微镜计数细胞悬液中的总白细胞。将重悬的抽 出物细胞(50μL)加至150μL的30％BSA中并用离心机以2,200rpm离心4分 钟至显微镜载片上。在Wright Giemsa染料染色的细胞离心涂片上确定分类 白细胞计数并用于计算每一气囊抽出液中各类白细胞的绝对数量。
数据表示为每一渗出物的中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱 性粒细胞和淋巴细胞的总数。所给出的数值的形式为平均值±SEM(n＝6)。 通过ANOVA确定任一处理对迁移之影响的显著性。P＜0.05被认为是具有 显著性。
脱颗粒：
将髓过氧化物酶用作脱颗粒的标志物。如上所述采用TMB方法测定并 分析从气囊或腹腔灌洗液得来的细胞上清液中的髓过氧化物酶活性。
炎症介质浓度：
使用商品化的ELISA试剂盒(R&D Systems)按照生产商的说明确定气囊 和腹腔灌洗液内的关键促炎症介质TNFα、IL-1β、IL-10、IL-6、KC和PGE2 的浓度。
脂质过氧化作用：
F2-异前列烷(F2-isoprostane)浓度是中性粒细胞和其他细胞释放的活性氧 中间体所造成的氧化损伤的敏感而特异的测量指标(Milne GL，Musiek ES， Morrow JD.F2-isoprostanes as markers of oxidative stress in vivo：an overview. Biomarkers.2005Nov；10Suppl 1：S10-23)。使用商品化的ELISA试剂盒(8- Isoprostane EIA，Cayman Chemical)按照生产商的说明确定气囊和腹腔渗出物 上清液内的F2-isoprostane浓度。
终点：
如果局部输送或者全身输送测试肽通过一或多种上述抑制炎症介质释放 的方式减轻了炎症，则认为这一实验是成功的。
本发明的活性片段肽抑制中性粒细胞进入气囊或腹腔以及在其中脱颗 粒，由此造成MPO活性降低、脂质过氧化作用减轻、和炎症介质产生减 少。
上述实施例是本发明的例证，因此不能被理解为是对本发明的限制。本 发明由所附权利要求书来限定，其中也包括权利要求的各种等价形式。
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年7月26日提交的美国专利申请No.：60/833,239的优 先权，在此通过引用将其全部内容并入本申请。
序列表
<110>拜欧马克医药有限公司
<120>减少炎症介质释放的方法和可用于该方法的肽
<130>BMRK-004/01WO
<150>US 60/833,239
<151>2006-07-26
<160>252
<170>PatentIn version 3.3
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<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>31
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10                  15
Gly
<210>32
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>32
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu
<210>33
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artific ial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>33
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ala
<210>34
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Dcscription ofArtificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pepti de may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>34
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10                  15
Ala
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>35
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
Val
<210>36
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>36
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Ala
<210>37
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
      modified
<400>37
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala LysGly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>38
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
<210>39
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>39
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10                  15
<210>40
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>40
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>41
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
<210>42
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>42
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10                  15
<210>43
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>43
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>44
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>45
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
<210>46
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-tcrm
     modified
<400>46
Gly Ala Gln Phe Ser Lys ThrAla Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                  10                  15
<210>47
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>47
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
<210>48
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>48
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10                  15
<210>49
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>49
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10                  15
<210>50
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>50
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10                  15
<210>51
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>51
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>52
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10                  15
<210>53
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>53
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10                  15
<2l0>54
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>54
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
<210>55
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>55
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
<210>56
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>56
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>57
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>57
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>58
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>58
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>59
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>59
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10
<210>60
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>60
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10
<210>61
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>61
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>62
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>62
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10
<210>63
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>63
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>64
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>64
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>65
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>65
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10
<210>66
<211>14
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>66
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10
<210>67
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>67
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>68
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>68
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>69
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may ormay not be C-term and/or N-term
     modified
<400>69
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>70
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>70
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>71
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>71
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10
<210>72
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>72
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10
<210>73
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>73
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>74
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>74
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10
<210>75
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>75
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>76
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>76
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>77
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>77
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10
<210>78
<211>13
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>78
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10
<210>79
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>79
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>80
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not bc C-term and/or N-term
     modified
<400>80
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>81
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide mayor may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>81
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>82
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>82
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>83
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>83
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>84
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>84
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10
<210>85
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>85
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10
<210>86
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>86
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>87
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>87
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10
<210>88
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>88
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>89
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>89
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>90
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-termand/or N-term
     modified
<400>90
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10
<210>91
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>91
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10
<210>92
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>92
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly
1               5                   10
<210>93
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>93
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>94
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>94
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>95
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>95
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>96
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>96
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>97
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>97
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>98
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>98
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10
<210>99
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>99
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10
<210>100
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>100
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>101
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pcptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>101
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10
<210>102
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence    
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>102
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>103
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>103
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>104
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>104
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10
<210>105
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>105
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>106
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>107
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>107
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly
1               5                   10
<210>108
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>108
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide mayor may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>109
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>110
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>110
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>111
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>111
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>112
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>112
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5                   10
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>113
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5                   10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>114
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5                   10
<210>115
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>115
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5                   10
<210>116
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>116
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5                   10
<210>117
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>117
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5                   10
<210>118
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>118
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5                   10
<210>119
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>119
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5                   10
<210>120
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>120
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5                   10
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>121
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala
1               5
<210>122
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>122
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5
<210>123
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>123
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly
1               5
<210>124
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>124
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5
<210>125
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>125
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5
<210>126
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>126
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>127
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>127
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5
<210>128
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may ormay not be C-term and/or N-term
     modified
<400>128
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5
<210>129
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>129
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5
<210>130
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>130
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5
<210>131
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>131
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>132
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>133
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
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     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>134
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>135
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>136
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     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>137
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<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>138
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala
1               5
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<213>Artificial Sequence
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     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>139
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     peptide
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     modified
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     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>141
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<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>142
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>143
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1               5
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>144
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>145
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>146
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>147
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1               5
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<213>Artificial Sequence
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<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>148
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1               5
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
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<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
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<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>149
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may ormay not be C-term and/or N-term
     modified
<400>150
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5
<210>151
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>151
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>152
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>152
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5
<210>153
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial  Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>153
Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>154
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr
1               5
<210>155
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>155
Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala
1               5
<210>156
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>156
Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala
1               5
<210>157
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>157
Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5
<210>158
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>158
Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly
1               5
<210>159
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>159
Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5
<210>160
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>160
Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5
<210>161
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>161
Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>162
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>162
Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5
<210>163
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>163
Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5
<210>164
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>164
Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5
<210>165
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     pcptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>165
Glu Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5
<210>166
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>166
Ala Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5
<210>167
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>167
Ala Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5
<210>168
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>168
Ala Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5
<210>169
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Scquence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>169
Glu Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>170
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descriptionof Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>170
Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5
<210>171
<211>7
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>171
Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5
<210>172
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>172
Gly Ala Gln Phe Ser Lys
1               5
<210>173
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>173
Ala Gln Phe Ser Lys Thr
1               5
<210>174
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>174
Gln Phe Ser Lys Thr Ala
1               5
<210>175
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>175
Phe Ser Lys Thr Ala Ala
1               5
<210>176
<211>6
<212>PRT
<213>ArtificialSequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>176
Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5
<210>177
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-termand/or N-term
     modified
<400>177
Lys Thr Ala Ala Lys Gly
1               5
<210>178
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>178
Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5
<210>179
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide mayor may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>179
Ala Ala Lys Gly Glu Ala
1               5
<210>180
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>180
Ala Lys Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>181
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>181
Lys Gly Glu Ala Ala Ala
1               5
<210>182
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may ormay not bc C-term and/or N-term
     modified
<400>182
Gly Glu Ala Ala Ala Glu
1               5
<210>183
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>183
Glu Ala Ala Ala Glu Arg
1               5
<210>184
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>184
Ala Ala Ala Glu Arg Pro
1               5
<210>185
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>185
Ala Ala Glu Arg Pro Gly
1               5
<210>186
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>186
Ala Glu Arg Pro Gly Glu
1               5
<210>187
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Art ificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may ormay not be C-term and/or N-term
     modified
<400>187
Glu Arg Pro Gly Glu Ala
1               5
<210>188
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>188
Arg Pro Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>189
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>189
Pro Gly Glu Ala Ala Val
1               5
<210>190
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>190
Gly Glu Ala Ala Val Ala
1               5
<210>191
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>191
Gly Ala Gln Phe Ser
1               5
<210>192
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>192
Ala Gln Phe Ser Lys
1               5
<210>193
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>193
Gln Phe Ser Lys Thr
1               5
<210>194
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>194
Phe Ser Lys Thr Ala
1               5
<210>195
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>195
Ser Lys Thr Ala Ala
1               5
<210>196
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>、
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>196
Lys Thr Ala Ala Lys
1               5
<210>197
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>197
Thr Ala Ala Lys Gly
1               5
<210>198
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>198
Ala Ala Lys Gly Glu
1               5
<210>199
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>199
Ala Lys Gly Glu Ala
1               5
<210>200
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>200
Lys Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>201
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>201
Gly Glu Ala Ala Ala
1               5
<210>202
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may notbe C-term and/or N-term
     modified
<400>202
GluAla Ala Ala Glu
1              5
<210>203
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>203
Ala Ala Ala Glu Arg
1               5
<210>204
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>204
Ala Ala Glu Arg Pro
1               5
<210>205
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artifi cial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>205
Ala Glu Arg Pro Gly
1               5
<210>206
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>206
Glu Arg Pro Gly Glu
1               5
<210>207
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>207
Arg Pro Gly Glu Ala
1               5
<210>208
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>208
Pro Gly Glu Ala Ala
1               5
<210>209
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>209
Gly Glu Ala Ala Val
1               5
<210>210
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>210
Glu Ala Ala Val Ala
1               5
<210>211
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>211
Gly Ala Gln Phe
1
<210>212
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>212
Ala Gln Phe Ser
1
<210>213
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>213
Gln Phe Ser Lys
1
<210>214
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>214
Phe Ser Lys Thr
1
<210>215
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>215
Ser Lys Thr Ala
1
<210>216
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>216
Lys Thr Ala Ala
1
<210>217
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>217
Thr Ala Ala Lys
1
<210>218
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>218
Ala Ala Lys Gly
1
<210>219
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>219
Ala Lys Gly Glu
1
<210>220
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>220
Lys Gly Glu Ala
1
<210>221
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptidemay or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>221
Gly Glu Ala Ala
1
<210>222
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>222
Glu Ala Ala Ala
1
<210>223
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>223
Ala Ala Ala Glu
1
<210>224
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>224
Ala Ala Glu Arg
1
<210>225
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>225
Ala Glu Arg Pro
1
<210>226
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>226
Glu Arg Pro Gly
1
<210>227
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/orN-term
     modified
<400>227
Arg Pro Gly Glu
1
<210>228
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthctic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>228
Pro Gly Glu Ala
1
<210>229
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>229
Gly Glu Ala Ala
1
<210>230
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>230
Glu Ala Ala Val
1
<210>231
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Syntheti c  
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>231
Ala Ala Val Ala
1
<210>232
<211>24
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>232
Gly Thr Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ala Gly Ala Glu Val Lys Arg Ala
1               5                   10                  15
Ser Ala Glu Ala Lys Gln Ala Phe
            20
<210>233
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>233
Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>234
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>234
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>235
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>235
Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>236
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artifi cial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>236
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>237
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Descript ion of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>237
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>238
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>238
Gly Ala Glu Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu
1               5                   10
<210>239
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>239
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala Gly Glu
1               5                   10
<210>240
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N term
     modified
<400>240
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Ala Glu
1               5                   10
<210>241
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Pept ide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>241
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Ala
1               5                   10
<210>242
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Seouence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>242
Ala Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>243
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>243
Gly Ala Ala Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>244
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>244
Gly Ala Gln Phe Ala Lys Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>245
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>245
Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Lys
1               5                   10
<210>246
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>246
Lys Ala Ala Thr Lys Ser Phe Gln Ala Gly
1               5                   10
<210>247
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>247
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Ala Ala Ala Lys
1               5                  10
<210>248
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>248
Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>249
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>249
Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>250
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>250
Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala
1               5
<210>251
<211>4
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>251
Ala Ala Gly Glu
1
<210>252
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<220>
<223>Peptide may or may not be C-term and/or N-term
     modified
<400>252
Gly Lys Ala Ser Gln Phe Ala Lys Thr Ala
1               5                   10