发明背景

癌症治疗和诊断方法包括将抗体或抗体片段导向疾病组织，其中 抗体或抗体片段可将诊断剂或治疗剂靶向疾病部位。业已表明，诸如 癌细胞的病原细胞在与正常细胞相比时过量表达某些靶或表达不同 的靶。例如，在多发性骨髓瘤—以骨髓中的浆细胞增殖为特征的B细 胞恶性肿瘤中，抗原CD38、CD138和CD56全都高表达。结合这些 靶的抗体在癌症治疗和诊断中有用。

(曲妥珠单抗)和(利妥昔单抗)(均来自 Genentech，S.San Francisco)已分别成功地用于治疗乳癌和非霍奇金淋 巴瘤。是遗传工程改造过的抗CD20嵌合鼠/人单克隆抗体。 是选择性结合人表皮生长因子受体2(HER2)原癌基因 胞外结构域的重组DNA衍生的人源化单克隆抗体。赫赛汀(Herceptin) 靶HER-2/neu也称为c-erb B-2，是具有蛋白酪氨酸激酶活性的185kDa 跨膜受体，为在患有乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤和前列腺肿瘤的部 分患者的这些肿瘤上表达的表皮生长因子(EGF)受体家族成员。该受 体在正常成体组织中适度表达，然而，其与表皮实体恶性肿瘤强烈相 关，并在约25-35％的人胃癌、肺癌、前列腺癌和乳癌中过量表达。

包括单克隆抗体在内的当前治疗通常针对单独限定的靶，其在整 个群体中是不同的，或者在疾病于整个群体中或个体中扩散的过程中 改变、发展和突变。另外，单一抗体或结构域不可能识别出患者体内 的所有肿瘤细胞，但抗体或结构域的组合可能明显更有效。而且，对 于抗体而言交叉反应性可能是个问题。使用抗CEA抗体用于临床用 途的其中一个主要缺点是这些抗体与某些表观正常的成体组织的交 叉反应性。先前的研究已经表明，针对不同免疫原性形式的CEA产 生的大部分常规超免疫抗血清与存在于正常个体的正常结肠粘膜、脾 脏、肝脏、肺、汗腺、多形核白细胞和单核细胞中以及许多不同类型 的癌症中的CEA相关抗原交叉反应。

因此，仍然需要改进的药物，用于治疗疾病(例如癌症)。

发明概述

本发明涉及结合存在于细胞上的两个细胞表面靶的配体。例如， 配体可含有第一多肽域和第二多肽域，所述第一多肽域具有对第一细 胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有对第二细 胞表面靶具有结合特异性的结合位点。优选地，第一多肽域(例如免疫 球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第一细胞表面靶，所述第二多肽 域(免疫球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第二细胞表面靶。

如本文所述并例举的，这些配体可选择性结合含有第一细胞表面 靶和第二细胞表面靶这二者的双阳性细胞。因此，以低亲和力结合期 望的细胞表面抗原的多肽，例如抗体和抗原的抗原结合片段，可制成 如本文所述的配体，以提供可选择性结合双阳性细胞的物质。

本发明的配体提供一些优势。例如，如本文所述，结合两种不同 细胞表面靶的配体可在结合细胞表面上的两个靶时内化进入细胞中。 因此，所述配体可用于将治疗剂如毒素递送到表达第一细胞表面靶和 第二细胞表面靶的双阳性细胞如癌细胞中。因为所述配体可选择性结 合双阳性细胞，所以可能由将治疗剂递送到单阳性细胞引起的可能不 需要的作用(例如副作用，如免疫抑制)可使用本发明的配体来避免。

本发明的配体可结合同时存在于正常细胞和病原细胞上但以较 高水平存在于病原细胞上的细胞表面靶。在这些情况下，配体可用于 优先将治疗剂(例如毒素)递送到病原细胞。例如，由于病原细胞上的 较高水平的细胞表面靶，所以与结合并内化进入正常细胞中的配体相 比，更多的配体将结合病原细胞并内化。因此，有效量的毒素可优先 被递送到病原细胞。

此外，如本文所述，配体可被修饰以具有期望的体内血清半衰期。 因此，所述配体可用于控制、减少或消除治疗剂的一般毒性，所述治 疗剂例如为用于治疗癌症的细胞毒素。

一般而言，配体结合的两个细胞表面靶都存在于病原细胞上，但 不同时存在于正常细胞上。如本文所示，在这些情况下，配体可以以 导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原细胞的浓度(以其中配体 基本不结合单阳性正常细胞的浓度)使用。

某些正常细胞可具有存在于它们的细胞表面上、由本发明配体结 合的两个细胞表面靶，但所述靶以较高水平存在于病原细胞(例如癌细 胞)表面上。优选地，两个细胞表面靶基本上不存在于正常细胞表面上。 在这些情况下，配体可以导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原 细胞的浓度(以其中配体基本不结合含低水平的细胞表面靶的正常细 胞的浓度)使用。

一方面，所述配体含有第一多肽域和第二多肽域，所述第一多肽 域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽 域具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，其中所述第一 细胞表面靶和所述第二细胞表面靶是不同的，所述第一细胞表面靶和 所述第二细胞表面靶存在于病原细胞上，其中所述配体结合所述病原 细胞上的所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶，其中所述配体 被所述病原细胞内化。

优选地，配体优先被病原细胞内化。例如，配体基本上没有被单 阳性细胞或正常细胞内化，或者选择性地结合病原细胞。在某些实施 方案中，当配体以介于1pM至约150nM之间的浓度存在时，所述配 体选择性地结合病原细胞。

在某些实施方案中，第一多肽域以低亲和力结合第一细胞表面 靶，第二多肽域以低亲和力结合第二细胞表面靶。例如，根据表面等 离子共振(surface plasmon resonance)测定，第一多肽域和第二多肽域可 各自以介于约10μM至约10nM之间的亲和力(KD)结合它们各自的细 胞表面靶。

在优选的实施方案中，具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的 结合位点的第一多肽域和具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的 结合位点的第二多肽域分别是第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫 球蛋白单可变区。例如，第一免疫球蛋白单可变区和/或第二免疫球蛋 白单可变区可以是VHH，或者第一免疫球蛋白单可变区和第二免疫球 蛋白单可变区可独立地选自人VH和人VL。

在更具体的实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区具有对细胞表 面靶具有结合特异性的结合位点，所述细胞表面靶选自CD38、CD138、 癌胚抗原(CEA)、CD56、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受 体(EGFR)和HER2。在某些实施方案中，第二免疫球蛋白单可变区具 有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述细胞表面靶选自 CD38、CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2，前提条件是 所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区不结 合同一细胞表面靶。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结 合CD38:DOM11-14(SEQ ID NO:242)、DOM11-22(SEQ ID NO:246)、 DOM11-23(SEQ ID NO:247)、DOM11-25(SEQ ID NO:249)、 DOM11-26(SEQ ID NO:250)、DOM11-27(SEQ ID NO:251)、 DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30 (SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ ID NO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、DOM11-4(SEQ ID NO:235)、 DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44(SEQ ID NO:267)、 DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ ID NO:236)、DOM11-7 (SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2(SEQ ID NO:233)、 DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ ID NO:245)、 DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、 DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、 DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、 DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、 DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6 (SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID NO:239)和DOM11-9(SEQ ID NO:240)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CD38，并且与选自以下的抗CD38域抗体(dAb)竞争结 合CD38:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM11-14(SEQ ID NO:242)、DOM11-22 (SEQ ID NO:246)、DOM11-23(SEQ ID NO:247)、DOM11-25(SEQ ID NO:249)、DOM11-26(SEQ ID NO:250)、DOM11-27(SEQ ID NO:251)、 DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30 (SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ ID NO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、DOM11-4(SEQ ID NO:235)、 DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44(SEQ ID NO:267)、 DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ ID NO:236)、DOM11-7 (SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2(SEQ ID NO:233)、 DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ ID NO:245)、 DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、 DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、 DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、 DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、 DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6 (SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID NO:239)和DOM11-9(SEQ ID NO:240)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2 (SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争 结合CD138:DOM12-1(SEQ ID NO:289)、DOM12-15(SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19(SEQ ID NO:291)、 DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ ID NO:293)、DOM12-21 (SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ ID NO:295)、DOM12-3(SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39(SEQ ID NO:298)、 DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ ID NO:300)、DOM12-41 (SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ ID NO:302)、DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6(SEQ ID NO:305)、 DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ ID NO:307)、DOM12-11 (SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ ID NO:309)、DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、DOM12-25(SEQ ID NO:312)、 DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27(SEQ ID NO:313)、DOM12-28 (SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ ID NO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、DOM12-32(SEQ ID NO:318)、 DOM12-34(SEQ ID NO:319)、DOM12-35(SEQ ID NO:320)、 DOM12-36(SEQ ID NO:321)、DOM12-37(SEQ ID NO:322)、 DOM12-38(SEQ ID NO:323)、DOM12-43(SEQ ID NO:324)、 DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5(SEQ ID NO:325)、DOM12-8 (SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ ID NO:327)。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CD138，并且与选自以下的抗CD138域抗体(dAb)竞争 结合CD138:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM12-1(SEQ ID NO:289)、DOM12-15 (SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19(SEQ ID NO:291)、DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ ID NO:293)、 DOM12-21(SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ ID NO:295)、DOM12-3 (SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39(SEQ ID NO:298)、DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ ID NO:300)、 DOM12-41(SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ ID NO:302)、 DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6 (SEQ ID NO:305)、DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ ID NO:307)、DOM12-11(SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ ID NO:309)、 DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、 DOM12-25(SEQ ID NO:312)、DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27 (SEQ ID NO:313)、DOM12-28(SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ ID NO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、 DOM12-32(SEQ ID NO:318)、DOM12-34(SEQ ID NO:319)、 DOM12-35(SEQ ID NO:320)、DOM12-36(SEQ ID NO:321)、 DOM12-37(SEQ ID NO:322)、DOM12-38(SEQ ID NO:323)、 DOM12-43(SEQ ID NO:324)、DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5 (SEQ ID NO:325)、DOM12-8(SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ ID NO:327)。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、 DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、 DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、 DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、 DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、 DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、 DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、 DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、 DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、 DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、 DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、 DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、 DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、 DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、 DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、 DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、 DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、 DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、 DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合 CEA:DOM13-1(SEQ ID NO:328)、DOM13-12(SEQ ID NO:329)、 DOM13-13(SEQ ID NO:330)、DOM13-14(SEQ ID NO:331)、 DOM13-15(SEQ ID NO:332)、DOM13-16(SEQ ID NO:333)、 DOM13-17(SEQ ID NO:334)、DOM13-18(SEQ ID NO:335)、 DOM13-19(SEQ ID NO:336)、DOM13-2(SEQ ID NO:337)、DOM13-20 (SEQ ID NO:338)、DOM13-21(SEQ ID NO:339)、DOM13-22(SEQ ID NO:340)、DOM13-23(SEQ ID NO:341)、DOM13-24(SEQ ID NO:342)、 DOM13-25(SEQ ID NO:13)、DOM13-26(SEQ ID NO:343)、DOM13-27 (SEQ ID NO:344)、DOM13-28(SEQ ID NO:345)、DOM13-29(SEQ ID NO:346)、DOM13-3(SEQ ID NO:347)、DOM13-30(SEQ ID NO:348)、 DOM13-31(SEQ ID NO:349)、DOM13-32(SEQ ID NO:350)、 DOM13-33(SEQ ID NO:351)、DOM-13-34(SEQ ID NO:352)、 DOM13-35(SEQ ID NO:353)、DOM13-36(SEQ ID NO:354)、 DOM13-37(SEQ ID NO:355)、DOM13-4(SEQ ID NO:356)、DOM13-42 (SEQ ID NO:357)、DOM13-43(SEQ ID NO:358)、DOM13-44(SEQ ID NO:359)、DOM13-45(SEQ ID NO:360)、DOM13-46(SEQ ID NO:361)、 DOM13-47(SEQ ID NO:362)、DOM13-48(SEQ ID NO:363)、 DOM13-49(SEQ ID NO:364)、DOM13-5(SEQ ID NO:365)、DOM13-50 (SEQ ID NO:366)、DOM13-51(SEQ ID NO:367)、DOM13-52(SEQ ID NO:368)、DOM13-53(SEQ ID NO:369)、DOM13-54(SEQ ID NO:370)、 DOM13-55(SEQ ID NO:371)、DOM13-56(SEQ ID NO:372)、 DOM13-57(SEQ ID NO:14)、DOM13-58(SEQ ID NO:15)、DOM13-59 (SEQ ID NO:16)、DOM13-6(SEQ ID NO:373)、DOM13-60(SEQ ID NO:374)、DOM13-61(SEQ ID NO:375)、DOM13-62(SEQ ID NO:376)、 DOM13-63(SEQ ID NO:377)、DOM13-64(SEQ ID NO:17)、DOM13-65 (SEQ ID NO:18)、DOM13-66(SEQ ID NO:378)、DOM13-67(SEQ ID NO:379)、DOM13-68(SEQ ID NO:380)、DOM13-69(SEQ ID NO:381)、 DOM13-7(SEQ ID NO:382)、DOM13-70(SEQ ID NO:383)、DOM13-71 (SEQ ID NO:384)、DOM13-72(SEQ ID NO:385)、DOM13-73(SEQ ID NO:386)、DOM13-74(SEQ ID NO:19)、DOM13-75(SEQ ID NO:387)、 DOM13-76(SEQ ID NO:388)、DOM13-77(SEQ ID NO:389)、 DOM13-78(SEQ ID NO:390)、DOM13-79(SEQ ID NO:391)、DOM13-8 (SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:393)、DOM13-81(SEQ ID NO:394)、DOM13-82(SEQ ID NO:395)、DOM13-83(SEQ ID NO:396)、 DOM13-84(SEQ ID NO:397)、DOM13-85(SEQ ID NO:398)、 DOM13-86(SEQ ID NO:399)、DOM13-87(SEQ ID NO:400)、 DOM13-88(SEQ ID NO:401)、DOM13-89(SEQ ID NO:402)、 DOM13-90(SEQ ID NO:403)、DOM13-91(SEQ ID NO:404)、 DOM13-92(SEQ ID NO:405)、DOM13-93(SEQ ID NO:20)、DOM13-94 (SEQ ID NO:406)和DOM13-95(SEQ ID NO:21)。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CEA，并且与选自以下的抗CEA域抗体(dAb)竞争结合 CEA:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM13-1(SEQ ID NO:328)、DOM13-12 (SEQ ID NO:329)、DOM13-13(SEQ ID NO:330)、DOM13-14(SEQ ID NO:331)、DOM13-15(SEQ ID NO:332)、DOM13-16(SEQ ID NO:333)、 DOM13-17(SEQ ID NO:334)、DOM13-18(SEQ ID NO:335)、 DOM13-19(SEQ ID NO:336)、DOM13-2(SEQ ID NO:337)、DOM13-20 (SEQ ID NO:338)、DOM13-21(SEQ ID NO:339)、DOM13-22(SEQ ID NO:340)、DOM13-23(SEQ ID NO:341)、DOM13-24(SEQ ID NO:342)、 DOM13-25(SEQ ID NO:13)、DOM13-26(SEQ ID NO:343)、DOM13-27 (SEQ ID NO:344)、DOM13-28(SEQ ID NO:345)、DOM13-29(SEQ ID NO:346)、DOM13-3(SEQ ID NO:347)、DOM13-30(SEQ ID NO:348)、 DOM13-31(SEQ ID NO:349)、DOM13-32(SEQ ID NO:350)、 DOM13-33(SEQ ID NO:351)、DOM-13-34(SEQ ID NO:352)、 DOM13-35(SEQ ID NO:353)、DOM13-36(SEQ ID NO:354)、 DOM13-37(SEQ ID NO:355)、DOM13-4(SEQ ID NO:356)、DOM13-42 (SEQ ID NO:357)、DOM13-43(SEQ ID NO:358)、DOM13-44(SEQ ID NO:359)、DOM13-45(SEQ ID NO:360)、DOM13-46(SEQ ID NO:361)、 DOM13-47(SEQ ID NO:362)、DOM13-48(SEQ ID NO:363)、 DOM13-49(SEQ ID NO:364)、DOM13-5(SEQ ID NO:365)、DOM13-50 (SEQ ID NO:366)、DOM13-51(SEQ ID NO:367)、DOM13-52(SEQ ID NO:368)、DOM13-53(SEQ ID NO:369)、DOM13-54(SEQ ID NO:370)、 DOM13-55(SEQ ID NO:371)、DOM13-56(SEQ ID NO:372)、 DOM13-57(SEQ ID NO:14)、DOM13-58(SEQ ID NO:15)、DOM13-59 (SEQ ID NO:16)、DOM13-6(SEQ ID NO:373)、DOM13-60(SEQ ID NO:374)、DOM13-61(SEQ ID NO:375)、DOM13-62(SEQ ID NO:376)、 DOM13-63(SEQ ID NO:377)、DOM13-64(SEQ ID NO:17)、DOM13-65 (SEQ ID NO:18)、DOM13-66(SEQ ID NO:378)、DOM13-67(SEQ ID NO:379)、DOM13-68(SEQ ID NO:380)、DOM13-69(SEQ ID NO:381)、 DOM13-7(SEQ ID NO:382)、DOM13-70(SEQ ID NO:383)、DOM13-71 (SEQ ID NO:384)、DOM13-72(SEQ ID NO:385)、DOM13-73(SEQ ID NO:386)、DOM13-74(SEQ ID NO:19)、DOM13-75(SEQ ID NO:387)、 DOM13-76(SEQ ID NO:388)、DOM13-77(SEQ ID NO:389)、 DOM13-78(SEQ ID NO:390)、DOM13-79(SEQ ID NO:391)、DOM13-8 (SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:393)、DOM13-81(SEQ ID NO:394)、DOM13-82(SEQ ID NO:395)、DOM13-83(SEQ ID NO:396)、 DOM13-84(SEQ ID NO:397)、DOM13-85(SEQ ID NO:398)、 DOM13-86(SEQ ID NO:399)、DOM13-87(SEQ ID NO:400)、 DOM13-88(SEQ ID NO:401)、DOM13-89(SEQ ID NO:402)、 DOM13-90(SEQ ID NO:403)、DOM13-91(SEQ ID NO:404)、 DOM13-92(SEQ ID NO:405)、DOM13-93(SEQ ID NO:20)、DOM13-94 (SEQ ID NO:406)和DOM13-95(SEQ ID NO:21)。

在某些实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、 DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和 DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区结合CD56，并且与选自以下的抗CD56域抗体(dAb)竞争结 合CD56:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、 DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、 DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、 DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、 DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、 DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2 (SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、 DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、 DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、 DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31 (SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、 DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、 DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4 (SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、 DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、 DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、 DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、 DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、 DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、 DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、 DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、 DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、 DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、 DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、 DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、 DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、 DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和 DOM14-69(SEQ ID NO:538)。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区或第二免疫球蛋白 单可变区包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约90％氨基酸序列相似性:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10 (SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、 DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、 DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、 DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2 (SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、 DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、 DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、 DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31 (SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、 DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、 DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4 (SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、 DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、 DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、 DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、 DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、 DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、 DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、 DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、 DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、 DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、 DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、 DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、 DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、 DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和 DOM14-69(SEQ ID NO:538)。

在更具体的实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区具有对CD38 具有结合特异性的结合位点，第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以 下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD138、CEA、CD56、 VEGF、EGFR和HER2。在某些实施方案中，第二免疫球蛋白单可变 区具有对CD138具有结合特异性的结合位点。

在另一个实施方案，第一免疫球蛋白单可变区具有对CD138具 有结合特异性的结合位点，第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下 的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CEA、CD56、VEGF、 EGFR和HER2。在某些实施方案中，第二免疫球蛋白单可变区具有 对CEA具有结合特异性的结合位点。

在其它实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区具有对CEA具有 结合特异性的结合位点，第二免疫球蛋白单可变区具有对选自以下的 细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD38、CEA、VEGF、 EGFR和HER2。在某些实施方案中，第二免疫球蛋白单可变区具有 对CD56具有结合特异性的结合位点。

如有需要，配体还可以含有毒素，例如表面活性毒素。表面活性 毒素可包括自由基产生物或放射性核素。

在某些实施方案中，配体还含有半衰期延长部分，例如聚亚烷基 二醇部分、血清白蛋白或其片段、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部 分，或者包含增强体内半衰期的多肽结合位点的抗体或抗体片段。在 某些实施方案中，半衰期延长部分是聚乙二醇部分。

在其它实施方案中，半衰期延长部分是抗体或抗体片段，例如免 疫球蛋白单可变区，其含有针对血清白蛋白或新生动物Fc受体的结 合位点。

在具体的实施方案中，半衰期延长部分是与选自以下的dAb竞争 结合人血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、 DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7 (SEQ ID NO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、 DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、 DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17 (SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ ID NO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、 DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24 (SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、 DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31 (SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)。

在另一个实施方案中，半衰期延长部分是结合人血清白蛋白的免 疫球蛋白单可变区，其包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序 列具有至少约90％氨基酸序列同一性:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、 DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、 DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4 (SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ ID NO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、 DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6 (SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7(SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565) 和DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、 DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、 DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17 (SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ ID NO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、 DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24 (SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、 DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31 (SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)。

另一方面，配体包含第一多肽域、第二多肽域和至少一种毒素部 分，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位 点，所述第二多肽域具有对第二细胞表面靶具有结合特异性的结合位 点；其中所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶是不同的，所述 第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶存在于病原细胞上；其中所述 配体以介于约10-6M至约10-12M之间的亲合力结合所述病原细胞上 的所述第一细胞表面靶和所述第二细胞表面靶；其中所述配体被所述 病原细胞内化。如本文所述，毒素可以是表面活性毒素。所述表面活 性毒素可包含自由基产生物或放射性核素。

优选地，配体优先被病原细胞内化。例如，配体基本上没有被单 阳性细胞或正常细胞内化，或者选择性地结合病原细胞。在某些实施 方案中，当配体以介于1pM至约150nM之间的浓度存在时，所述配 体选择性地结合病原细胞。

本发明还涉及用于治疗或诊断的配体，以及配体在制备用于治疗 如本文所述的疾病(例如癌症、多发性骨髓瘤、肺癌)的药物中的用途。

本发明还涉及配体在制备用于选择性杀伤癌细胞、而不是正常细 胞的药物中的用途。

本发明还涉及配体在制备用于胞内递送治疗剂的药物中的用途。

本发明还涉及配体在制备用于在细胞中将治疗剂递送到组织蛋 白酶B区室的药物中的用途。

本发明还涉及配体在制备用于在细胞中将配体定位于组织蛋白 酶B区室的药物中的用途。

本发明还涉及治疗疾病的方法，其包括给予有需要的受试者治疗 有效量的本发明配体。在某些实施方案中，所述疾病为癌症，例如多 发性骨髓瘤或肺癌(例如小细胞肺癌)。

本发明还涉及在内部将治疗剂(例如毒素)递送到细胞的方法，其 包括使细胞与本发明的配体接触。

本发明还涉及包含本发明的配体和生理上可接受的载体的组合 物(例如药物组合物)。在某些实施方案中，组合物包含用于静脉内、 肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、关节内或皮下给药的溶媒。在其它实 施方案中，所述组合物包含用于肺、鼻内、阴道或直肠给药的溶媒。

本发明还涉及包含本发明组合物的递药装置。在某些实施方案 中，递药装置选自胃肠外递药装置、静脉内递药装置、肌内递药装置、 腹膜内递药装置、经皮递药装置、肺递药装置、动脉内递药装置、鞘 内递药装置、关节内递药装置、皮下递药装置、鼻内递药装置、阴道 递药装置和直肠递药装置。在其它实施方案中，递药装置选自注射器、 经皮递药装置、胶囊剂、片剂、喷雾器、吸入器、雾化器、烟雾器、 气雾器(mister)、干粉吸入器、计量吸入器、计量喷雾器、计量气雾器、 计量雾化器和导管。

本发明还涉及编码本发明配体的分离或重组核酸，以及包含本发 明的重组核酸的载体和包含本发明的重组核酸或载体的宿主细胞。本 发明还涉及生产配体的方法，其包括将本发明的宿主细胞在适于表达 本发明的核酸或载体的条件下进行培养，由此产生配体。在某些实施 方案中，该方法还包括分离出配体。

在某些实施方案中，本发明的配体被包含细胞表面靶的细胞内 化。例如，至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约 70％、或至少约80％、或至少约90％、或基本全部的配体被细胞内化 (例如结合双阳性细胞或病原细胞的配体)。

本发明还涉及本文公开的域抗体，以及包含其的配体和形式。本 发明还涉及编码本文公开的域抗体的分离或重组核酸，以及包含重组 核酸的载体，和包含重组核酸或载体的宿主细胞。本发明还涉及生产 本文公开的dAb或包含此dAb的配体或形式的方法，包括将本发明的 宿主细胞在适于表达本发明的核酸或载体的条件下进行培养，由此产 生本文公开的dAb或包含此dAb的配体或形式。在某些实施方案中， 所述方法还包括分离出配体。

附图简述

图1A-1H是荧光曲线图，显示了结合CD38、CD138、CEA或 CD56的dAb的结合特异性。图1A和1B表明，结合CD38的dAb (DOM11-3和DOM11-30)结合CD38+细胞(RPMI细胞)，但不结合 CD38-细胞(K299细胞)。图1C和1D表明，结合CD138的dAb (DOM12-45)结合CD138+细胞(RPMI细胞)，但不结合CD138-细胞 (K299细胞)。图1E和1F表明，结合CEA的dAb(DOM13-25)结合 CEA+细胞(H69细胞)，但不结合CEA-细胞(CHO细胞)。图1G和1H 表明，结合CD56的dAb(DOM14-23)结合CD56+细胞(H69细胞)，但 不结合CD56-细胞(CHO细胞)。

图2为传感图(sensogram)，图示了根据表面等离子共振测定的结 合CD38的dAb(DOM11-3和DOM11-30)的结合和解离。DOM11-3 的亲和力(KD)经测定为250nM，DOM11-30的亲和力经测定为150 nM。

图3A-3D是传感图，表明结合CD38的dAb(DOM11-3、 DOM11-30和DOM11-23)结合CD38上的不同表位。CD38固定在表 面等离子共振芯片上，第一抗CD38 dAb流过表面(第一个箭头)，然 后第二dAb流过表面(第二个箭头)。该图表明，DOM11-30结合已结 合DOM11-3的CD38(图3A)，DOM11-23结合已结合DOM11-30的 CD38(图3B)，DOM11-3结合已结合DOM11-23的CD38(图3C)，表 明这些dAb结合CD38抗原上的不同表位。相比之下，DOM11-30流 过已结合DOM11-30的CD38不导致结合增加。

图4A-4D是荧光斑点图，表明结合CD38和CD138的配体 (DOM11-3/DOM12-45)(50nM)选择性结合双阳性RPMI82265细胞 (CD38+/CD138+)。DOM11-3/DOM12-45基本上不结合单阳性Raji细 胞(CD38+/CD138-)或H647细胞(CD38-/Cd138+)或双阴性细胞 (CCRF-CEM)。

图5A-5C是显微照片，显示了用结合CD38和CD138的配体 (DOM11-3/DOM12-45)(500nM)标记Raji(CD38+)细胞系。配体使用 二级和三级试剂(FITC标记的)和共焦显微镜(Zeiss LSM510META)显 现。细胞维持在4℃，以抑制内化，或维持在37℃，以允许内化。图 4A和4B表明，DOM11-3/DOM12-45结合Raji细胞，但于4℃基本不 内化，如图4B中没有耐酸荧光所示。相比之下，图4C显示了于37℃ 的耐酸荧光，表明DOM11-3/DOM12-45内化。

图6A-6B为荧光曲线图，表明结合CD38和CD138的配体 (DOM11-3/DOM12-45)结合双阳性骨髓瘤细胞系(OPM2、 CD38+/CD138+)。如在图5A-5C中所述用DOM11-3/DOM12-45于4℃ 或37℃处理OPM2细胞。于37℃检测到耐酸荧光，表明配体内化。 相比之下，于4℃或在用不结合CD38或CD138的dAb(Vk对照(Vk dummy))处理的细胞中几乎检测不到耐酸荧光，表明配体或dAb未内 化。

图7是一系列共焦显微镜显微照片，表明在Raji细胞中结合CD38 和CD138的配体(DOM11-3/DOM12-45)(绿色荧光)和溶酶体标记组织 蛋白酶B(红色荧光)共定位。共定位的配体和组织蛋白酶B在叠加图 中显示为黄色荧光。

图8A-8E是荧光曲线图，表明用5K(图8B)、20K(图8C)、30K (图8D)或40K(图8E)的线性PEG进行PEG化的、结合CD38和CD138 的配体(DOM11-3/DOM12-45；da-dAb)于37℃被内化至和未PEG化配 体(图8A)大约相同的程度。这些图显示了每种配体于37℃的耐酸荧 光，表明配体内化。

图9A-9D是荧光曲线图，表明结合CD38和CD138并包含毒素(硒) 的配体(DOM11-3/DOM12-45-Se)由OPM2细胞内化至和不含毒素的 相应配体(DOM11-3/DOM12-45)相同的程度。这些图显示了 DOM11-3/DOM12-45-Se和DOM11-3/DOM12-45于37℃的耐酸荧光， 表明配体被内化。相比之下，不结合CD38或CD138的配体(Vk对照 /Vk对照和Vk对照/Vk对照-Se)不结合细胞或不被内化。

图10是直方图，显示了由喜树碱、结合CD38和CD138并包含 毒素(硒)的配体(DOM11-3/DOM12-45-Se)、结合CD38和CD138的配 体(DOM11-3/DOM12-45)、不结合CD38和CD138并包含毒素(硒)的 配体(Vkd Se)以及不结合CD38和CD138的配体(Vkd)诱导的OPM2 MM细胞系(CD38+/CD138+)和不表达CD38或CD138的细胞(抗原-ve 细胞系)的凋亡。结果表明，DOM11-3/DOM12-45-Se选择性诱导双阳 性OPM2MM细胞系的凋亡，而喜树碱诱导两种细胞系的凋亡， DOM11-3/DOM12-45、Vkd Se和Vkd不诱导任一种细胞系的凋亡。

图11是直方图，表明结合CD38和CD138并包含毒素(硒)的配 体(DOM11-3/DOM12-45-Se；38/138Se)选择性诱导双阳性OPM2细胞 (CD38+/CD138+)的细胞死亡(细胞活力降低)，但不诱导单阳性Raji细 胞(CD38+/Cd138-)或双阴性CEM细胞(CD38-/CD138-)的细胞死亡。不 包含毒素的相应配体(DOM11-3/DOM12-45；38/138-)、不结合CD38 或CD138的配体(VKD/VKD-)以及不结合CD38或CD138并包含毒素 (硒)的配体(VKD/VKD Se)不降低任一种细胞系的细胞活力。

图12是荧光曲线图，表明结合CEA和CD56的配体 (DOM14-23/DOM13-25)结合双阳性H69细胞(CEA+/CD56+)，但结合 CD56但不结合CEA的配体(DOM14-23/Vk对照)以及结合CEA但不 结合CD56的配体(Vk对照/DOM13-25)不结合H59细胞。Vk对照是 不结合CEA或CD56的dAb。

图13A-13G图示了一些人抗CD38 dAb的核苷酸序列。

图14A-14G图示了一些人抗CD138 dAb的核苷酸序列。

图15A-15O图示了一些人抗CEA dAb的核苷酸序列。

图16A-16K图示了一些人抗CD56 dAb的核苷酸序列。

图17A-17F图示了一些人抗CD38 dAb的氨基酸序列。

图18A-18F图示了一些人抗CD138 dAb的氨基酸序列。

图19A-19G图示了一些人抗CEA dAb的氨基酸序列。

图20A-20E图示了一些人抗CD56 dAb的氨基酸序列。

图21A为结合小鼠血清白蛋白(MSA)的3种Vκ的氨基酸序列的 比对。经比对的氨基酸序列来自称为MSA16的Vκ(其也被称为 DOM7m-16)(SEQ ID NO:541)、称为MSA 12的Vκ(其也被称为 DOM7m-12)(SEQ ID NO:542)和称为MSA 26的Vκ(其也被称为 DOM7m-26)(SEQ ID NO:543)。

图21B为结合大鼠血清白蛋白(RSA)的6种Vκ的氨基酸序列的比 对。经比对的氨基酸序列来自称为DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、 DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5 (SEQ ID NO:547)、DOM7r-7(SEQ ID NO:548)和DOM7r-8(SEQ ID NO:549)的Vκ。

图21C为结合人血清白蛋白(HSA)的6种Vκ的氨基酸序列的比 对。经比对的氨基酸序列来自称为DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、 DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6 (SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:554)和DOM7h-7(SEQ ID NO:555)的Vκ。

图21D为结合人血清白蛋白的7种VH氨基酸序列和共有序列 (SEQ ID NO:556)的比对。经比对的氨基酸序列来自称为DOM7h-22 (SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)和DOM7h-27(SEQ ID NO:563)的VH。

图21E是结合人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的3种Vκ的氨基 酸序列的比对。经比对的氨基酸序列来自称为DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14(SEQ ID NO:566) 的Vκ。

图22图示了结合大鼠血清白蛋白(RSA)的Vκ氨基酸序列。图 示的序列来自称为DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17(SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、 DOM7r-19(SEQ ID NO:571)的Vκ。

图23A-23B图示了结合大鼠血清白蛋白(RSA)的VH的氨基酸序 列。图示的序列来自称为DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21 (SEQ ID NO:573)、DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24(SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、 DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28 (SEQ ID NO:580)、DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31(SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584) 和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)的VH。

图24图示了在WO 2004/041862中公开的一些结合小鼠血清白蛋 白的骆驼科动物(Camelid)VHH的氨基酸序列。序列A(SEQ ID NO:586)、序列B(SEQ ID NO:587)、序列C(SEQ ID NO:588)、序列D (SEQ ID NO:589)、序列E(SEQ ID NO:590)、序列F(SEQ ID NO:591)、 序列G(SEQ ID NO:592)、序列H(SEQ ID NO:593)、序列I(SEQ ID NO:594)、序列J(SEQ ID NO:595)、序列K(SEQ ID NO:596)、序列L (SEQ ID NO:597)、序列M(SEQ ID NO:598)、序列N(SEQ ID NO:599)、 序列O(SEQ ID NO:600)、序列P(SEQ ID NO:601)、序列Q(SEQ ID NO:602)。

图25图示了OMP2多发性骨髓瘤细胞上的dAb组合的细胞结合 测定。DOM11-3-1/DOM12-45-2的EC50为13.81， DOM11-3-15/DOM12-45-2的EC50为16.73， DOM11-3-20/DOM12-45-2的EC50为11.88， DOM11-3-23/DOM12-45-2的EC50为11.0，而DOM11-3/DOM12-45 的EC50为44.35。

图26A-26D图示了一些亲和力成熟的人抗CD38dAb的核酸序 列。

图27A-27C图示了一些亲和力成熟的人抗CD38 dAb的核酸序 列。

图28A-28G图示了一些亲和力成熟的人抗CD138 dAb的核酸序 列。

图29图示了抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)氨基酸序 列(SEQ ID NO:677)、抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)核酸序 列(SEQ ID NO:678)、Vk对照氨基酸序列(SEQ ID NO:679)和Vk对照 核酸序列(SEQ ID NO:680)。

图30图示了编码一些亲和力成熟的人抗CEA dAb的核酸序列。

图31A-31C图示了一些人dAb的氨基酸序列和/或核酸序列。在 DOM14-3A dAb的氨基酸序列的C末端有3个丙氨酸残基(AAA)不是 实际dAb的氨基酸序列的一部分，而是由克隆位点编码。

发明详述

在本说明书中描述了许多实施方案，撰写方式使得本说明书能够 既清楚又简明，但是应当理解，在不偏离本发明的情况下，可以对这 些实施方案进行各种组合或分开。

本文使用的术语“配体”是指含有第一多肽域和第二多肽域的多 肽，所述第一多肽域具有对第一细胞表面靶具有结合特异性的结合位 点，所述第二多肽域具有对第二个第一细胞表面靶具有结合特异性的 结合位点。第一细胞表面靶和第二细胞表面靶是不相同的(即为不同的 靶(例如蛋白质))，但均存在(例如共表达)于细胞上，例如本文描述的 病原细胞。相比于仅含一个靶的细胞，本发明的配体更强地(例如以更 大的亲合力)结合含第一细胞表面靶和第二细胞表面靶的细胞。因此， 本发明配体可选择性结合含第一细胞表面靶和第二细胞表面靶的细 胞。

本发明的配体可结合同时存在于正常细胞和病原细胞上但以较 高水平存在于病原细胞上的细胞表面靶。在此情况下，配体可优先用 于将治疗剂(例如毒素)递送到病原细胞。例如，由于病原细胞上较高 水平的细胞表面靶，所以与结合并内化进入正常细胞中的配体相比， 更多的配体将结合病原细胞并内化。因此，有效量的毒素可优先被递 送到病原细胞。

本发明的配体优选包含这样的免疫球蛋白可变区:其具有不同的 结合特异性，且不包含具有相同特异性的可变区对。具有对细胞表面 靶具有结合特异性的结合位点的每个结构域优选为对期望的细胞表 面靶(例如膜蛋白质，例如受体蛋白质)具有结合特异性的免疫球蛋白 单可变区(例如免疫球蛋白单重链可变区(例如VH、VHH)、免疫球蛋白 单轻链可变区(例如VL))。具有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位 点的每个多肽域还可以含有抗体或抗体片段(例如免疫球蛋白单可变 区)的一个或多个互补决定区(CDR)，所述抗体或抗体片段对合适形式 的目标细胞表面靶具有结合特异性，使得结合域对细胞表面靶具有结 合特异性。例如，CDR可移植到合适的蛋白质支架或骨架上，例如亲 和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类区或EGF区。此外，配体 可为本文所述的二价(杂二价)或多价(杂多价)。因此，“配体”包括含 有两个dAb的多肽，其中每个dAb都结合不同的细胞表面靶。配体还 包括含有至少两个dAb的多肽，所述dAb以合适的形式(例如抗体形 式(例如IgG样形式、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2))或合适的蛋白质支架 或骨架(例如本文描述的亲和体、SpA支架、LDL受体A类区、EGF 区、高亲和性多聚体(avimer)和多特异性配体)结合不同的细胞表面靶 (或dAb的CDR)。具有对细胞表面靶(即第一或第二细胞表面靶)具有 结合特异性的结合位点的多肽域还可以为含有针对目标靶的结合位 点的蛋白域，例如选自亲和体、SpA区、LDL受体A类区、高亲和性 多聚体的蛋白域(参见例如美国专利申请公布号2005/0053973、 2005/0089932、2005/0164301)。

本文所用的术语“靶”是指具有结合位点的多肽域可与其结合的 生物分子(例如肽、多肽、蛋白质、脂质、糖)。所述靶可以是例如胞 内靶(例如胞内蛋白质靶)或细胞表面靶(例如膜蛋白质、受体蛋白质)。 靶优选为细胞表面靶，例如细胞表面蛋白质。优选地，第一细胞表面 靶和第二细胞表面靶均存在于病原细胞(例如癌细胞、肿瘤细胞)上。 例如，第一细胞表面靶和第二细胞表面靶可在细胞(例如病原细胞)上 共表达。第一细胞表面靶和第二细胞表面靶可独立地存在于某些正常 细胞上，并可以同时存在于病原细胞上(例如在癌细胞上共表达、在肿 瘤细胞上共表达)。

某些合适的靶(例如某些第一细胞表面靶和某些第二细胞表面靶) 可同时存在于正常细胞上。在这些情况下，所述靶以低水平在正常细 胞上表达，但以较高水平在例如病原细胞上表达。例如，第一细胞表 面靶和第二细胞表面靶可以比正常细胞上的水平高至少约2倍、约3 倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或至少约10 倍的水平存在于病原细胞上。细胞上的靶水平(例如细胞表面上的靶的 量)可使用多种合适的方法测定，例如抗体结合和流式细胞术。

本文使用的术语“病原细胞”是指细胞生理发生改变的细胞，其 可产生或有助于产生病症(例如癌症)。病原细胞可以是例如携带一个 或多个突变的细胞，所述突变使细胞分裂、增殖、分化、衰老和/或死 亡的正常细胞过程失调。具体的病原细胞包括癌细胞，例如癌症细胞、 淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肉瘤细胞等。

术语“免疫球蛋白单可变区”是指独立于其它V区而特异性结合 靶、抗原或表位的抗体可变区(VH、VHH、VL)；然而，本文所用的术 语免疫球蛋白单可变区可以与其它可变区(variable region，variable domain)呈现为某种形式(例如杂多聚体)，其中其它区(region，domain) 不是免疫球蛋白单可变区的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单 可变区与抗原的结合独立于另外的可变区)。每个“免疫球蛋白单可变 区”不仅包括分离的抗体单可变区多肽，而且包括含有抗体单可变区 多肽序列的一个或多个单体的较大多肽。“域抗体”或“dAb”与本 文所用的术语“免疫球蛋白单可变区”多肽同义。本文所用的免疫球 蛋白单可变区多肽是指哺乳动物免疫球蛋白单可变区多肽，优选人、 但也包括啮齿动物(例如公开于WO 00/29004，所述文献的内容通过引 用全部结合到本文中)或骆驼科动物VHH dAb。本文使用的骆驼科动物 dAb是免疫球蛋白单可变区多肽，它来自骆驼(camel)、美洲驼(llama)、 羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)和栗色骆马(guanaco)等物种，并且 包含天然缺乏轻链的重链抗体(VHH)。可由其它物种如鲨鱼(nurse shark) 获得类似dAb的单链抗体。优选的配体含有至少两个不同的免疫球蛋 白单可变区多肽或至少两个不同的dAb。

本文使用的“选择性结合”是指本发明的配体相对于单阳性细胞 优先结合双阳性细胞的能力。例如，本发明的配体可结合双阳性细胞， 但基本不结合单阳性细胞。当在相同结合条件下结合单阳性细胞的量 不超过结合双阳性细胞的量的约25％、约24％、约23％、约22％、约 21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、 约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、 约5％、约4％、约3％、约2％或约1％时，配体“基本不结合”单阳 性细胞。选择性结合可受例如配体的亲和力(affinity)和亲合力(avidity) 以及配体浓度影响。本领域普通技术人员可使用任何合适的方法确定 在其下本发明的配体选择性结合双阳性细胞的合适条件，例如在合适 的细胞结合测定中滴定配体。

本文使用的术语“双阳性”是指包含本发明配体结合的两个不同 细胞表面靶(不同的靶类别)的细胞。本发明的配体以高亲合力结合双 阳性细胞。本文使用的术语“单阳性”是指仅包含一种由本发明配体 结合的细胞表面靶的细胞。

本文使用的术语“被……内化”、“内化的”和“内化”以及相 关派生术语是指在结合第一细胞表面靶和第二细胞表面靶时通过其 将配体带进细胞中的细胞过程(例如胞吞作用)。内化可在配体诱导的 细胞表面靶簇集后由包被网格蛋白的小窝胞吞作用介导。一旦被胞 吞，配体就可以被递送到细胞的溶酶体区室，其中诸如组织蛋白酶B 的细胞酶可切割配体部分(例如切割连接物，以便从配体释放毒素)。

“亲和力”和“亲合力”是本领域用来描述结合作用强度的术语。 就本发明配体而言，亲合力是指细胞上的靶(例如第一细胞表面靶和第 二细胞表面靶)和配体之间的总结合强度。亲合力大于单个靶的各亲和 力之和。

本文使用的“毒素部分”是指包含毒素的部分。毒素是对细胞生 理具有有害作用或改变细胞生理(例如引起细胞坏死、凋亡或抑制细胞 分裂)的物质。

本文使用的术语“剂量”是指一次性全部给予受试者的配体的量 (单位剂量)，或者在限定的时间间隔内分两次或更多次给予受试者的 配体的量。例如，剂量可以指在1天(24小时)(日用量)、2天、1周、 2周、3周或1个月或数月的过程中给予(例如通过单次给予，或2次 或更多次给予)受试者的配体(例如包含结合CEA的免疫球蛋白单可变 区和结合CD56的免疫球蛋白单可变区的配体)的量。给药之间的间隔 可以是任何所需时间。

本文使用的“互补”是指当两个免疫球蛋白结构域属于能构成关 联对或关联组的结构家族的时候，或者它们来源于这样的家族并保留 了该特征的时候，那么它们是“互补”的。例如，抗体的VH区和VL 区是互补的；两个VH区不互补，两个VL区不互补。在免疫球蛋白超 家族其它成员中也可发现互补区，例如T细胞受体的Vα和Vβ(或γ和 δ)区。人工结构域，例如基于蛋白质支架的结构域(它们不结合表位， 除非经改造使它们结合表位)，是非互补的。同样，基于(例如)免疫球 蛋白结构域和纤连蛋白结构域的两个结构域不是互补的。

本文使用的“免疫球蛋白”是指这样的多肽家族:其保留抗体分 子的免疫球蛋白折叠特征，含有两个β折叠，一般还含有保守二硫键。 免疫球蛋白超家族成员在体内参与细胞和非细胞相互作用的许多方 面，包括在免疫系统中的广泛作用(例如抗体、T细胞受体分子等)、 参与细胞粘附(例如ICAM分子)和胞内信号转导(例如受体分子，例如 PDGF受体)。本发明适用于所有具有结合域的免疫球蛋白超家族分 子。优选本发明涉及抗体。

本文使用的“domain(域、结构域、区)”，是指经过折叠的蛋白 质结构，它保留了蛋白质三级结构，但独立于蛋白质的其余部分。通 常，各结构域负责蛋白质的分离的功能性，并且在许多情况下可以添 加、去除或转移给其它蛋白质，而不丧失该蛋白质和/或该结构域的其 余部分的功能。单抗体可变区是指经过折叠的多肽域，包含特征为抗 体可变区的序列。因此，它包含完整抗体可变区和修饰可变区(例如其 中一个或多个环已经被不具有抗体可变区特征的序列所置换)，或者已 被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变区，以及保留全长结构域 的至少部分结合活性和特异性的可变区的折叠片段。因此，每个配体 都包含至少两个不同区。

“库(repertoire)”，一级序列不同的多样化变异体(例如多肽变异 体)的集合。本发明所用的文库包括含有至少1000个成员的多肽库。

“文库(library)”，术语文库是指异源多肽或核酸的混合物。文 库由成员组成，每个成员都具有一个多肽或核酸序列。就这一方面而 言，文库(library)和库(repertoire)同义。文库成员间的序列差异造成文 库中存在的多样性。文库可以呈多肽或核酸的简单混合物的形式，或 者可以呈用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、 动物或植物细胞等。优选各个生物体或细胞仅含有一个文库成员或数 目有限的文库成员。最好将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所 编码的多肽。因此，在一个优选方面，文库可以呈宿主生物体群体的 形式，每个生物体含有一个或多个拷贝的表达载体，所述载体含有呈 核酸形式的文库的一个成员，该成员可以被表达而产生其相应多肽成 员。因此，宿主生物体群体具有编码很大的具有遗传多样性的多肽变 异体库的潜力。

本文使用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段(例 如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗 体、二硫键连接的scFv、双链抗体)，无论是来自任何物种的天然产 生的抗体，还是由重组DNA技术产生的抗体；无论是从下列哪种样 品中分离的:血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。

如本文所述，“抗原”是一种由本发明的结合域结合的分子。通 常，抗原与抗体配体结合并能在体内产生抗体反应。抗原可以是多肽、 蛋白质、核酸或其它分子。一般而言，针对两种特定靶(例如抗原)的 靶特异性而选择本发明双特异性配体。就常规抗体及其片段而言，由 可变环(L1、L2、L3和H1、H2、H3)所限定的抗体结合位点能够结合 抗原。

“表位”为与免疫球蛋白VH/VL对常规结合的结构单元。表位限 定针对抗体的最小结合位点，因此代表了抗体特异性的靶。就单域抗 体而言，表位代表了与分离的可变区结合的结构单元。

“通用构架(universal framework)”是指单抗体构架序列，对应于 序列保守的抗体区，根据Kabat(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，US Department of Health and Human Services (美国健康和人类服务部))所定义；或者对应于人种系免疫球蛋白库或 结构，根据Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:910-917(1987)所定义。 本发明提供单构架或一组这样的构架的用途，所述构架已被发现允许 衍生事实上任何的结合特异性，尽管变异仅在超变区内。

术语“半衰期”是指配体的血清浓度在体内降低50％所需要的时 间，例如因为通过天然机制配体所致的双特异性配体降解和/或清除或 螯合。本发明的配体在体内是稳定的，其半衰期因结合抵抗降解和/ 或清除或螯合的分子而延长。通常，这类分子是天然存在的蛋白质， 它们本身在体内的半衰期较长。如果一种配体的功能活性在体内的持 续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的另一种类似配体更长 的话，则该配体的半衰期延长。因此，将对HSA和两个靶分子具有 特异性的配体与其中不存在对HAS的特异性且不结合HAS而结合另 一分子的相同配体进行比较。例如，它能结合细胞上第三个靶。通常， 半衰期延长10％、20％、30％、40％、50％以上。半衰期延长范围在 2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x以上是可能的。或者， 另外，半衰期延长范围高达30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、 100x、150x也是可能的。

本文提到的术语“竞争”是指当第二个靶与其关联靶结合域结合 时，第一个靶与其关联靶结合域的结合受到抑制。例如，结合可以是 空间上受到抑制，例如通过结合域的物理阻断或通过改变结合域的结 构或环境，使其对靶的亲和力或亲合力降低。

本文所用的术语“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性” 或“极高严格性条件”描述了核酸杂交和洗涤条件。进行杂交反应的 指南可参见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons， N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6，所述文献通过引用全部结合到本文中。该参 考文献中描述了含水方法和无水方法，都可以采用。本文提及的具体 杂交条件如下:(1)低严格性杂交条件在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中， 在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％ SDS中，在至少50℃(对于低严格 性条件，洗涤温度可升高至55℃)洗涤两次；(2)中等严格性杂交条件 在6X SSC中，在约45℃，再在0.2X SSC、0.1％ SDS中，在60℃洗 涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件在6X SSC中，在约45℃，再在 0.2X SSC、0.1％ SDS中，在65℃洗涤一次或多次；和优选(4)极高严 格性杂交条件是0.5M磷酸钠、7％ SDS，在65℃，再在0.2X SSC、 1％ SDS中，在65℃洗涤一次或多次。极高严格性条件(4)是优选的条 件，除非另有说明，否则应采用该条件。

与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的 序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序 列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％以上。或者，当核酸区段在所选杂交条件(例如极高 严格性杂交条件)下与互补链杂交时，存在基本的同一性。核酸可以存 在于完整细胞中，存在于细胞裂解物中，或者呈部分纯化或基本纯化 的形式。

两序列间的“同源性”或“序列同一性”或“相似性”(这些术 语在本文可互换使用)的计算如下进行。为了优化比较目的比对序列 (例如对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或 两个中引入空位，为了比较目的，非同源序列可以忽略不计)。在一个 优选的实施方案中，为了比较目的所比对的参考序列长度占参考序列 长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少 60％、甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，对相应氨基 酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中 的某个位置被与第二序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据 时，那么分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸“同源性” 等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两序列间的同一性百分率是考虑到 空位数和各空位长度后的序列共享的相同位置数的函数，需要引入这 些空位以进行两序列的最佳比对。

氨基酸和核苷酸序列比对以及如本文定义的同源性、相似性或同 一性优选使用采用默认参数的算法BLAST 2 Sequences准备和确定 (Tatusova，T.A.等，FEMS Microbiol Lett，174:187-188(1999))。或者，采 用BLAST算法(2.0版)进行序列比对，参数设定到默认值。BLAST(基 本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool))是blastp、 blastn、blastx、tblastn和tblastx程序所采用的启发式检索算法；这些 程序都采用Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6): 2264-8的统计学方法给它们的发现结果确定显著性。

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域(例 如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术 人员公知的相同含义。标准技术用于分子、遗传和生化方法(一般参见 Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和 Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley & Sons，Inc.，所述文献通过引用结合到本文中)和化学方法。

本发明涉及结合存在于细胞上的两个细胞表面靶的配体。例如， 配体可含有第一多肽域和第二多肽域，所述第一多肽域具有对第一细 胞表面靶具有结合特异性的结合位点，所述第二多肽域具有对第二细 胞表面靶具有结合特异性的结合位点。优选地，第一多肽域(例如免疫 球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第一细胞表面靶，所述第二多肽 域(免疫球蛋白单可变区)以低亲和力结合所述第二细胞表面靶。

如本文所述和例举的，这些配体可选择性地结合含有第一细胞表 面靶和第二细胞表面靶这二者的双阳性细胞。因此，以低亲和力结合 期望的细胞表面抗原的多肽，例如抗体和抗原的抗原结合片段，可被 制成如本文所述的配体，以提供可选择性结合双阳性细胞的物质。

本发明的配体提供一些优势。例如，如本文所述，结合两种不同 细胞表面靶的配体可在结合细胞表面上的两个靶时内化进入细胞中。 因此，所述配体可用于将治疗剂如毒素递送到表达第一细胞表面靶和 第二细胞表面靶的双阳性细胞如癌细胞中。因为所述配体可选择性结 合双阳性细胞，所以可能由将治疗剂递送到单阳性细胞引起的可能不 需要的作用(例如副作用，如免疫抑制)可使用本发明的配体来避免。

本发明的配体可结合同时存在于正常细胞和病原细胞上但以较 高水平存在于病原细胞上的细胞表面靶。在这些情况下，配体可用于 优先将治疗剂(例如毒素)递送到病原细胞。例如，由于病原细胞上的 较高水平的细胞表面靶，所以与结合并内化进入正常细胞中的配体相 比，更多的配体将结合病原细胞并内化。因此，有效量的毒素可优先 被递送到病原细胞。

此外，如本文所述，可修饰配体使之具有期望的体内血清半衰期。 因此，所述配体可用于控制、减少或消除治疗药的一般毒性，所述治 疗药例如为用于治疗癌症的细胞毒素。

一般而言，配体结合的两个细胞表面靶都存在于病原细胞上，但 不同时存在于正常细胞上。如本文所示，在这些情况下，配体可以以 导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原细胞的浓度(以其中配体 基本不结合单阳性正常细胞的浓度)使用。

某些正常细胞可具有在它们的细胞表面上存在的、由本发明配体 结合的两个细胞表面靶，但所述靶以较高水平存在于病原细胞(例如癌 细胞)表面。优选地，两个细胞表面靶基本上不存在于正常细胞表面上。 在这些情况下，配体可以导致选择性结合含有两个细胞表面靶的病原 细胞的浓度(以其中配体基本不结合含低水平的细胞表面靶的正常细 胞的浓度)使用。

优选的配体含有对第一细胞表面靶具有结合特异性的第一免疫 球蛋白单可变区和对第二细胞表面靶具有结合特异性的第二免疫球 蛋白单可变区。在优选的实施方案中，第一免疫球蛋白单可变区具有 对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点:CD38、CD138、 癌胚抗原(CEA)、CD56、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子受 体(EGFR)和HER2。在特别优选的实施方案中，第二免疫球蛋白单可 变区具有对选自以下的细胞表面靶具有结合特异性的结合位点: CD38、CD138、CEA、CD56、VEGF、EGFR和HER2，前提条件是 所述第一免疫球蛋白单可变区和所述第二免疫球蛋白单可变区不结 合同一细胞表面靶。

本发明的配体可如本文所述配制。例如，可配制本发明的配体， 以改变体内血清半衰期。如有需要，配体还可以包含如本文所述的毒 素或毒素部分。在某些实施方案中，配体包含表面活性毒素，例如自 由基产生物(例如含硒的毒素)或放射性核素。在其它实施方案中，毒 素或毒素部分是具有对胞内靶具有结合特异性的结合位点的多肽域 (例如dAb)。

       表1:配体的靶特异性

  第一细胞表面靶 疾病 第二细胞表面靶变化 CD38 癌症(例如多发性骨髓瘤) CD138 CD56  CD138 癌症(例如多发性骨髓瘤) CD38 CD56 CD138 癌症(例如肺癌，小细胞肺癌) CD56 CEA  CD56 癌症(例如肺癌，小细胞肺癌) CD138 CEA   EGFR 癌症(例如肺癌，小细胞肺癌， 乳癌，结肠癌)               HER2/neu VEGF    

  VEGF 癌症(例如转移癌，肿瘤血管 生成)                     EGFR HER2

本领域技术人员将意识到，在表1中提供的靶组合和在实施例中 提供的靶组合只不过代表了按照本发明使用的适宜组合的范例。

                    表2

  靶 其它名称 功能 参考文献/登录号 CD38                          T10ADP-核糖基环化酶/ 环状ADP-核糖水解酶                                                                                       CD38是新的多功能细   胞外酶，在细胞和组织 中广泛表达，尤其在白 细胞中广泛表达。     CD38还在细胞粘附、   信号转导和钙信号转   导中起作用。         Ferrero E J.Leukoc. Biol.1999 65:151   Genebank登录号:   P28907                                                CD56           Leu-19、NKH1、神经细 胞粘附分子、NCAM                          在某些细胞类型中介 导同嗜性粘附                          Thiery JP等，Proc Natl Acad Sci USA 1982     79:6737Genebank登    录号:P13592          CD138                         硫酸乙酰肝素蛋白聚糖； 多配体蛋白聚糖-1       (syndecan-1)                                                         多配体蛋白聚糖介导   细胞结合、细胞信号转 导和细胞骨架形成，多 配体蛋白聚糖受体是   HIV-1tat蛋白内化所   必需的               J Biol Regul Homeost       Agents，2002年4-6月； 16(2):152-5 Genebank  登录号:P18827                               CEA         癌胚抗原                   复合的免疫反应性糖 蛋白                                  Duffy，M.J.，Clin      Chem.2001年4月；      47(4):624-30 Genebank 登录号:P06731        

  EGFR                受体酪氨酸激酶的ErbB 家族                                                           受体酪氨酸激酶是细   胞生长、分化和存活的 重要介导物                                Baselga和Mendelsohn Pharmac.Ther.     64:127-154(1994). Genebank登录号:   AAB19486          HER2                               调蛋白(heregulin)2EC  2.7.1.112            p185erbB2            C-erbB-2             NEU原癌基因          酪氨酸激酶型细胞表面 受体HER2             MLN19                神经调节蛋白受体复   合物的必需组分，尽管 神经调节蛋白不与其   单独相互作用。GP30   是该受体的潜在配体。 不被EGF、TGFα和双   调蛋白活化           Science 230(4730)， 1132-1139(1985)     Genebank登录号:     NP_004439                                                                       VEGF 血管通透因子 血管生成的诱导物 Genebank登录号: NP_001020537   

配体形式

本发明的配体可以制成本文描述的双特异性配体。配体还可以制 成例如在WO 03/002609中描述的多特异性配体，该文献的全部公开 内容都通过引用结合到本文中。此双特异性配体包含具有不同结合特 异性的免疫球蛋白单可变区。此双特异性配体可包含重链区和轻链区 的组合。例如，双特异性配体可包含VH区和VL区，这两区可以连接 在一起呈scFv的形式(例如使用合适的接头，例如Gly4Ser)，或者制成 双特异性抗体或其抗原结合片段(例如F(ab’)2片段)。双特异性配体不 包含形成常规的双链抗体抗原结合位点的互补VH/VL对，所述双链抗 体抗原结合位点协同结合抗原或表位。相比之下，双型配体包含VH/VL 互补对，其中V区具有不同的结合特异性。

另外，如有需要，双特异性配体可包含一个或多个CH区或CL区。 如有需要也可包含铰链区。这样的各区组合可以例如模拟天然抗体， 例如IgG或IgM或其片段，例如Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。也考 虑了其它结构，例如包含VH、VL、CH1和CL区的IgG分子的单臂。 优选本发明的双特异性配体仅包含两个可变区，尽管几个这样的配体 也能掺入同一蛋白质，例如两个这样的配体可以掺入IgG或多聚体形 式的免疫球蛋白，例如IgM。或者，在另一个实施方案中，多个双特 异性配体结合在一起形成多聚体。例如，两个不同双特异性配体结合 在一起，产生四特异性分子。本领域技术人员可以理解，本发明方法 所产生的双特异性配体的轻链可变区和重链可变区可以在同一多肽 链上或者在不同多肽链上。就可变区在不同多肽链上而言，它们可以 通过接头、通常是柔性接头(例如多肽链)、化学连接基团连接，或者 通过本领域已知的任何其它方法连接。

配体可以制成双特异性或多特异性抗体或抗体片段，或者制成双 特异性或多特异性非抗体结构。合适的形式包括任何合适的多肽结 构，其中可以掺入抗体可变区或其一个或多个CDR，以便在结构上赋 予对抗原的结合特异性。各种合适的抗体形式是本领域已知的，例如 双特异性IgG样形式(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、 抗体重链和/或轻链的异型二聚体、任何前述的抗原结合片段(例如Fv 片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、 F(ab’)2片段)、单可变区(例如VH、VL、VHH)、dAb和任何前述的修饰 形式(例如通过共价连接聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚 丁二醇)或其它合适的聚合物)而修饰)，或其它合适的聚合物)。参见 2003年6月30日申请的指定国为美国的PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)有关PEG化的单可变区和dAb、其合适的制备方法、PEG 化单可变区和dAb单体和多聚体的延长的体内半衰期、合适的PEG、 优选的流体动力学尺寸的PEG和优选的流体动力学尺寸的PEG化单 可变区和dAb单体和多聚体。PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的 全部公开内容，包括上面提及的部分，全都通过引用结合到本文中。

配体可使用合适的接头如(Gly4Ser)n制成，其中n＝1-8，例如2、 3、4、5、6或7。如有需要，包括dAb单体、二聚体和三聚体在内的 配体，可以连接抗体Fc区(包含CH2和CH3区中的一个或两者都包含)， 以及任选的铰链区。例如，编码以单核苷酸序列连接至Fc区的配体 的载体，可用于制备所述多肽。

配体和dAb单体还可以结合和/或制成非抗体多配体结构的形式， 以形成多价复合物，其结合具有相同表位的靶分子，因而提供较高亲 合力。例如天然细菌受体(例如SpA)已可以用作移植CDR的支架，以 产生特异性结合一个或多个表位的配体。在US 5,831,012中描述了该 方法的细节。其它合适的支架包括基于纤连蛋白和亲和体的支架。合 适方法的细节描述于WO 98/58965。其它合适的支架包括脂质运载蛋 白和CTLA4，如在van den Beuken等，J.Mol.Biol.310，591-601(2001) 中所述，以及例如描述于WO 00/69907(Medical Research Council)的支 架，所述支架是基于例如细菌GroEL的环状结构或其它伴侣分子多 肽。蛋白质支架可以进行组合；例如，CDR可以移植到CTLA4支架 上并且与免疫球蛋白VH区或VL区一起使用，以构成配体。同样，纤 连蛋白、脂质运载蛋白和其它支架也可以进行组合。

用于制备任何需要形式的多种合适方法是本领域已知的。例如， 抗体链和抗体形式(例如双特异性IgG样形式、嵌合抗体、人源化抗体、 人抗体、单链抗体、抗体重链和/或轻链的同型二聚体和异型二聚体) 可通过表达合适的表达构建体和/或合适的细胞培养物(例如杂交瘤、 异型杂交瘤、含有编码所述形式的重组构建体的重组宿主细胞)制备。 此外，可通过表达合适的表达构建体，和/或通过抗体的酶促消化(例 如用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)，制备诸如抗体或抗体链的抗原结合片段 (例如双特异性结合片段，例如Fv片段(例如单链Fv(scFv)、二硫键连 接的Fv)、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段)的形式。

配体可制成多特异性配体的形式，如在WO 03/002609中所述， 该文献的全部公开内容通过引用结合到本文中。此多特异性配体具有 1个以上的表位结合特异性。一般而言，多特异性配体含有两个或更 多个表位结合域，例如含有针对表位的结合位点的dAb或非抗体蛋白 质区，例如亲和体、SpA区、LDL受体A类区、EGF区、高亲和性 多聚体(avimer)。多特异性配体可如本文所述进一步制备。

在某些实施方案中，配体是IgG样形式。这类形式具有IgG分子 的常规4条链结构(2条重链和2条轻链)，其中一个或多个可变区(VH 和/或VL)已经被所需特异性的dAb或单可变区置换。优选各可变区(2 个VH区和2个VL区)被dAb或单可变区置换。包括在IgG样形式中 的dAb或单可变区可具有相同特异性或不同特异性。在某些实施方案 中，IgG样形式是四价的，并且可具有1、2、3或4种特异性。例如， IgG样形式可以是单特异性的，并且包含4个具有相同特异性的dAb； 可以是双特异性的，并且包含3个具有相同特异性的dAb和另一具有 不同特异性的dAb；可以是双特异性的，并且包含2个具有相同特异 性的dAb和2个具有相同特异性但该特异性与上述的不同的dAb；可 以是三特异性的，并且包含具有相同特异性的第一和第二dAb，具有 不同特异性的第三dAb，具有不同于第一、第二和第三dAb的特异性 的第四dAb；或者可以是四特异性的，并且包含4个各自具有不同特 异性的dAb。可以制备IgG样形式的抗原结合片段(例如Fab、F(ab’)2、 Fab’、Fv、scFv)。

本发明的配体可精制成含有第一免疫球蛋白单可变区直接与第 二免疫球蛋白单可变区融合的融合蛋白。如有需要，此形式还可以包 含半衰期延长部分。例如，配体可包含第一免疫球蛋白单可变区、第 二免疫球蛋白单可变区和能结合血清白蛋白的免疫球蛋白单可变区， 其中第一免疫球蛋白单可变区直接与第二免疫球蛋白单可变区融合， 而第二免疫球蛋白单可变区又直接与能结合血清白蛋白的免疫球蛋 白单可变区融合。

一般而言，具有对细胞表面靶具有结合特异性的结合位点且不管 配体是否含有接头的多肽域的方向是设计选择的问题。但是，有或没 有接头情况下的某些方向可提供比其它方向更好的结合特征。本发明 包含所有方向(例如dAb1-接头-dAb2；dAb2-接头-dAb1)，所含方向提 供期望的结合特征的配体可通过筛选容易地鉴别。

延长半衰期的形式

可制备本文公开的配体和dAb单体，以延长其体内血清半衰期。 增加的体内半衰期对免疫球蛋白的体内应用有用，尤其是抗体，最特 别地是小尺寸的抗体片段，例如dAb。这类片段(Fv、二硫键连接的 Fv、Fab、scFv、dAb)被快速地从体内清除掉，这极大地限制了临床 应用。

配体可以制成抗体的较大抗原结合片段或具有较大流体动力学 尺寸的抗体(例如制成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv)。配体 还可以被制备得具有较大流体动力学尺寸，例如通过连接聚亚烷基二 醇基团(例如聚乙二醇(PEG)基团、聚丙二醇、聚丁二醇)、血清白蛋白、 转铁蛋白、转铁蛋白受体或者至少其转铁蛋白结合部分、抗体Fc区， 或者通过与抗体区缀合。在某些实施方案中，配体被PEG化。优选地， PEG化配体以和未PEG化的同一配体基本相同的亲合力结合双阳性 细胞。例如，配体可以是含有结合CD38的dAb和结合CD138的第 二dAb的PEG化配体，其中PEG化配体与CD38+CD138+细胞结合的 亲合力与非PEG化形式的配体的亲合力之间的差异不超过约1000倍、 优选不超过约100倍，更优选不超过约10倍，或者前者的亲合力相 对于未PEG化形式基本不变。参见2003年6月30日申请的指定国为 美国的PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)有关PEG化的单可变区 和dAb、其合适的制备方法、PEG化单可变区和dAb单体和多聚体的 延长的体内半衰期、合适的PEG、优选的流体动力学尺寸的PEG和 优选的流体动力学尺寸的PEG化单可变区和dAb单体和多聚体。 PCT/GB03/002804(WO 2004/081026)的全部公开内容，包括上面提及 的部分，都通过引用结合到本文中。

本发明配体(例如dAb单体或多聚体)的流体动力学尺寸可使用本 领域众所周知的方法进行测定。例如，可使用凝胶过滤层析来测定配 体的流体动力学尺寸。适于测定配体的流体动力学尺寸的凝胶过滤基 质，例如交联琼脂糖基质，是众所周知并容易获得的。

配体形式的大小(例如连接dAb单体的PEG部分的大小)可根据需 要的应用而变化。例如，在希望配体离开循环并进入外周组织的情况 下，最好保持配体的流体动力学尺寸较小，以便从血流中外渗。或者， 在期望使配体保留在系统循环中达较长的时间段的情况下，可增加配 体的尺寸，例如通过制成为Ig样蛋白质或通过加入30-60kDa PEG部 分(例如线性或分支的30-40kDa PEG，例如加入两个20kDa PEG部 分)。可改变配体形式的尺寸，以达到需要的体内血清半衰期、例如控 制与毒素的接触和/或减少毒素物质的副作用。

配体的流体动力学尺寸及其血清半衰期还可以通过将配体与结 合域缀合或连接而增加，所述结合域结合如本文所述增加体内半衰期 的抗原或表位。例如，配体(例如dAb单体)可缀合或连接至抗血清白 蛋白或抗新生动物Fc受体抗体或抗体片段，(例如抗SA或抗新生动 物Fc受体dAb、Fab、Fab’或scFv)，或者缀合或连接至抗SA亲和体 或抗新生动物Fc受体亲和体。

用于本发明配体的合适白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体的实 例描述于WO 2005/077042A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。 具体地讲，下面的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变异体可用于本发明:

·公开于WO 2005/077042A2的SEQ ID NO:1，该序列通过引用 明确地结合到本文公开内容中；

·白蛋白片段或变异体，其包含WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸1-387或由其组成；

·白蛋白或其片段或变体，其包含选自以下的氨基酸序列:

(a)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸54-61；

(b)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸76-89；

(c)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸92-100；

(d)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸170-176；

(e)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸247-252；

(f)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸266-277；

(g)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸280-288；

(h)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸362-368；

(i)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸439-447；

(j)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸462-475；

(k)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸478-486；和

(1)WO 2005/077042A2中SEQ ID NO:1的氨基酸560-566。

用于本发明配体的合适白蛋白、片段和类似物的其它实例描述于 WO 03/076567A2，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲， 下面的白蛋白、片段或变异体可用于本发明:

·人血清白蛋白，如WO 03/076567A2所述，例如在图3中(该序 列信息通过引用明确地结合到本文公开内容中)；

·人血清白蛋白(HA)，它由585个氨基酸的单一非糖基化多肽链 组成，分子量为66,500(参见Meloun等，FEBS Letters 58:136 (1975)；Behrens等，Fed.Proc.34:591(1975)；Lawn等，Nucleic Acids Research 9:6102-6114(1981)；Minghetti等，J.Biol.Chem. 261:6747(1986))；

·白蛋白多态变异体或其类似物或片段，如Weitkamp等，Ann. Hum.Genet.37:219(1973)所述；

·如在EP 322094中所述的白蛋白片段或变异体，例如 HA(1-373)、HA(1-388)、HA(1-389)、HA(1-369)和HA(1-419) 以及1-369和1-419间的片段；

·如在EP 399666中所述的白蛋白片段或变异体，例如HA(1-177) 和HA(1-200)以及HA(1-X)之间的片段，其中X为178-199间 的任意数字。

当(一个或多个)半衰期延长部分(例如白蛋白、转铁蛋白及其片段 和类似物)用于本发明的配体时，可以用任何合适方法将其与配体缀 合，例如通过与靶结合部分(例如dAb或抗体片段)直接融合，例如通 过使用编码融合蛋白的单个核苷酸构建体，其中融合蛋白作为具有半 衰期延长部分(位于细胞表面靶结合部分的N端或C端)的单一多肽链 被编码。或者，可以通过使用各部分间的肽接头(例如WO 03/076567 A2或WO 2004/003019所述的肽接头(这些接头的公开内容通过引用 结合到本文公开内容中，以提供用于本发明的实例))，来实现缀合。

通常，增强体内血清半衰期的多肽为体内天然存在并抵抗降解或 由生物体(例如人)中去除不需要的物质的内源机制去除的多肽。例如， 可从以下蛋白质中选出延长体内血清半衰期的多肽:来自胞外基质的 蛋白质，存在于血液中的蛋白质，在血脑屏障或神经组织中发现的蛋 白质，局限于肾脏、肝脏、肺、心脏、皮肤或骨的蛋白质，应激蛋白， 疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白。

增强体内血清半衰期的合适多肽包括例如转铁蛋白受体特异性 配体-神经药物(neuropharmaceutical agent)融合蛋白(参见美国专利第 5,977,307号，该专利公开的内容通过引用结合到本文中)、脑毛细血 管内皮细胞受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体(例如可溶性转铁蛋白受 体)、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2 (IGF2)受体、胰岛素受体、血液凝固X因子、α1抗胰蛋白酶和HNF 1α。 增强血清半衰期的合适多肽还包括α-1糖蛋白(血清类粘蛋白 (Orosomucoid)；AAG)、α-1抗胰凝乳蛋白酶(ACT)、α-1微球蛋白(蛋 白HC；AIM)、抗凝血酶III(AT III)、载脂蛋白A-1(Apo A-1)、载脂 蛋白B(Apo B)、血浆铜蓝蛋白(Cp)、补体成分C3(C3)、补体成分C4 (C4)、C1酯酶抑制剂(C1INH)、C-反应蛋白(CRP)、铁蛋白(FER)、血 红素结合蛋白(HPX)、脂蛋白(a)(Lp(a))、甘露糖结合蛋白(MBP)、肌 红蛋白(Myo)、前白蛋白(运甲状腺素蛋白(Transthyretin)；PAL)、视黄 醇结合蛋白(RBP)和类风湿因子(RF)。

来自胞外基质的合适蛋白质包括例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整 联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是胞外基质的主要蛋白质。目前已经知 道约15种胶原蛋白分子，在身体的不同部位发现，例如在骨、皮肤、 腱、韧带、角膜、内脏中发现的I型胶原蛋白(占身体总胶原蛋白的 90％)，或者在软骨、椎间盘(vertebral disc)、脊索和眼睛的玻璃体中发 现的II型胶原蛋白。

来自血液的合适蛋白质包括例如血浆蛋白(例如血纤蛋白、α-2巨 球蛋白、血清白蛋白、血纤蛋白原(例如血纤蛋白原A、血纤蛋白原 B)、血清淀粉样蛋白A、触珠蛋白、抑制蛋白、泛蛋白、子宫球蛋白 和β-2-微球蛋白)；酶和酶抑制剂(例如血纤蛋白溶解酶原、溶菌酶、半 胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂)；免 疫系统蛋白质，例如免疫球蛋白(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、免 疫球蛋白轻链(κ/λ))；转运蛋白(例如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白)； 防卫素(例如β-防卫素1、嗜中性粒细胞防卫素1、嗜中性粒细胞防卫 素2和嗜中性粒细胞防卫素3)等。

在血脑屏障或神经组织中发现的合适蛋白质包括例如黑皮质素 受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白等。

增强体内血清半衰期的合适多肽还包括局限于肾脏中的蛋白质 (例如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann 抗原)；局限于肝脏中的蛋白质(例如醇脱氢酶、G250)；局限于肺部的 蛋白质(例如结合IgA的分泌成分))；局限于心脏中的蛋白质(例如与扩 张型心肌病相关的HSP 27)；局限于皮肤的蛋白质(例如角蛋白)；骨特 异性蛋白质(例如骨形态发生蛋白(BMP)，它们是表现出成骨活性的转 化生长因子β蛋白超家族亚类，例如BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、 BMP-7、BMP-8)；肿瘤特异性蛋白(例如滋养层抗原、赫赛汀(herceptin) 受体、雌激素受体、组织蛋白酶(例如可存在于肝脏和脾脏中的组织蛋 白酶B))。

合适的疾病特异性蛋白包括例如仅在活化T细胞上表达的抗原， 包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)、护骨蛋白(osteoprotegerin)配体 (OPGL，参见Nature 402，304-309(1999))、OX40(TNF受体家族成员， 在活化T细胞上表达，在人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)生产细胞 中被特异性上调；参见Immunol.165(1):263-70(2000))。合适的疾病 特异性蛋白还包括例如金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512 果蝇(Drosophila)、人截瘫蛋白、人FtsH、人AFG3L2、鼠ftsH；以及 血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)、碱性成纤 维细胞生长因子(FGF-2)、血管内皮生长因子/血管通透因子 (VEGF/VPF)、转化生长因子-α(TGFα)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、 血管生成素、白介素-3(IL-3)、白介素-8(IL-8)、血小板衍生内皮生长 因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PlGF)、中期因子(midkine)血小板衍 生生长因子-BB(PDGF)和CXXXC趋化因子(fractalkine)。

增强体内血清半衰期的合适多肽还包括应激蛋白，例如热激蛋白 (HSP)。HSP通常在胞内发现。当在胞外发现它们时，就表明细胞已 经死亡并溢出其内容物。这样的非程序性细胞死亡(坏死)仅在胞外 HSP由于创伤、疾病或损伤而触发免疫系统的反应时才发生。结合胞 外HSP可以使本发明的组合物定位于疾病部位。

参与Fc转运的合适蛋白质包括例如Brambell受体(也称为 FcRB)。该Fc受体具有两个功能，这两个功能都可以潜在用于递送。 所述功能是:(1)穿过胎盘将IgG从母亲转运给孩子，(2)保护IgG免遭 降解，因而延长IgG的血清半衰期。有人认为受体从核内体中再利用 IgG(参见Holliger等，Nat Biotechnol 15(7):632-6(1997))。

药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人 员熟知的。有关细节可参见Kenneth，A等:Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和Peters等， Pharmacokinetc analysis:A Practical Approach(1996)。参考文献也可参 见“Pharmacokinetics”，M Gibaldi & D Perron，Marcel Dekker出版，2nd Rev.ex edition(1982)，该文献介绍了药代动力学参数，例如tα和tβ半 衰期以及曲线下面积(AUC)。

包含毒素部分或毒素的配体

本发明还涉及含有毒素部分或毒素的配体。合适的毒素部分包括 毒素(例如表面活性毒素、细胞毒素)。可使用任何合适的方法使毒素 部分或毒素与配体连接或缀合。例如，毒素部分或毒素可直接地或通 过合适的接头共价连接至配体。合适的接头可包括不可切割的或可切 割的接头，例如含有细胞酶(例如细胞酯酶、细胞蛋白酶，例如组织蛋 白酶B)的切割位点的pH可切割的接头。这样的可切割接头可用于制 备在配体被内化后可释放毒素部分或毒素的配体。

缀合

可使用多种将毒素部分或毒素连接或缀合至配体的方法。选定的 具体方法取决于毒素部分或毒素以及要连接或缀合的配体。如有需 要，可使用含有末端官能团的接头连接配体与毒素部分或毒素。一般 而言，通过使含有活性官能团(或经修饰而含有活性官能团)的毒素部 分或毒素与接头反应或与配体直接反应实现缀合。可如下形成共价 键:使含有(或经修饰而含有)化学部分或官能团(所述化学部分或官能 团可在合适的条件下与第二个化学基团反应)的毒素部分或毒素反应， 由此形成共价键。

许多合适的活性化学基团组合是本领域已知的，例如胺基团可与 亲电子基团反应，所述亲电子基团例如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素 (氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。硫醇可与马来酰亚 胺、碘乙酰基、丙烯酰基(acrylolyl)、吡啶二硫物、5-巯基-2-硝基苯甲 酸硫醇(TNB-硫醇)等反应。醛官能团可与含有胺或酰肼的分子偶联， 叠氮基可与三价磷基团反应而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺键 (phosphorimide linkage)。将活化基团引入分子中的合适方法是本领域 已知的(参见例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press:San Diego，CA(1996))。

可如本文所述，通过使合适的配体与含有反应性化学基团或官能 团的毒素反应，产生本发明的缀合毒素的配体。例如，缀合可经由伯 胺残基、羧基和半胱氨酸残基实现。工程改造过的半胱氨酸残基作为 用于毒素缀合的位点提供了某些优势，因为毒素经由未配对的半胱氨 酸残基(例如经工程改造而进入配体的半胱氨酸残基)缀合提供了实现 位点特异性缀合的方法，并降低了缀合干扰抗原结合功能的可能性。 例如，未配对的半胱氨酸可在dAb的羧基末端掺入，以提供用于位点 特异性硫醇缀合的残基。另外，在双特异性配体中为非天然存在的半 胱氨酸残基的特异性溶剂可及位点可突变为用于连接毒素的半胱氨 酸。双特异性配体中的溶剂可及位点可使用本领域已知的方法确定， 例如配体的晶体结构分析。例如，使用Vk对照dAb(SEQ ID NO:679) 的已解析晶体结构，残基Val-15、Pro-40、Gly-41、Ser-56、Gly-57、 Ser-60、Pro-80、Glu-81、Gln-100、Lys-107和Arg-108已被鉴定为溶 剂可及的，因此在本文所述的双特异性配体上的相应位置的残基为用 于突变为缀合毒素的半胱氨酸残基的潜在候选物。

硫醇缀合物可使用任何合适的方法制备，例如用于形成二硫键的 众所周知的方法或通过与硫醇反应基反应，所述硫醇反应基例如为马 来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶二硫物、5-巯基-2-硝基苯甲酸 硫醇(TNB-硫醇)等。

在某些实施方案中，可通过使用胺反应性化学基团或官能团，例 如使配体与毒素的NHS酯反应，使毒素或毒素部分以非位点特异性 方式与配体键合。

优选的缀合是位点特异性缀合，例如在半胱氨酸、氨基末端或羧 基末端缀合。氨基末端缀合可使用任何合适的方法实现，例如描述于 EP 0 822 199 B1的方法。例如，配体可与胺反应性毒素或毒素部分在 还原性烷基化条件下(例如在硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼酸二甲胺、 硼酸三甲胺或硼酸吡啶存在下)于适于选择性活化配体氨基末端上的α 氨基的pH(例如4.0-6.0)反应，使得毒素连接至α氨基，由此获得配体 毒素缀合物。

合适的毒素部分和毒素包括例如美登木素生物碱(maytansinoid) (例如美登木醇，例如DM1、DM4)、紫杉烷(taxane)、加利车霉素、倍 癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。美登木素生物碱可以是例如美登木 醇或美登木醇类似物。美登木醇类似物的实例包括那些具有修饰芳环 的美登木醇(例如C-19-脱氯、C-20-脱甲氧基、C-20-酰氧基)和那些在 其它位置具有修饰的美登木醇(例如C-9-CH、C-14-烷氧基甲基、C-14- 羟甲基或乙酰氧基甲基(aceloxymethyl)、C-15-羟基/酰氧基、C-15-甲 氧基、C-18-N-脱甲基、4，5-脱氧)。美登木醇和美登木醇类似物描述于 例如美国专利第5,208,020和6,333,410号，所述专利的内容通过引用 结合到本文中。可以使用例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺 基酯(也称为4-(2-吡啶基二硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯或SPP)、4- 琥珀酰亚胺基-氧羰基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基 二硫基)丁酸N-琥珀酰亚胺基酯(SDPB)、2-亚氨基硫杂环戊烷(2 iminothiolane)或S-乙酰基琥珀酸酐，使美登木醇与抗体和抗体片段偶 联。紫杉醇可以是例如泰素、泰索帝或新的紫杉烷(参见例如WO 01/38318)。加利车霉素可以是例如溴-加利车霉素络合物(例如α、β或γ 溴络合物)、碘-加利车霉素络合物(例如α、β或γ碘络合物)或者其类似 物和模拟物。溴-加利车霉素络合物包括I1-BR、I2-BR、I3-BR、I4-BR、 J1-BR、J2-BR和K1-BR。碘-加利车霉素络合物包括I1-I、I2-I、I3-I、 J1-I、J2-I、L1-I和K1-BR。加利车霉素及其突变体、类似物和模拟物 描述于例如美国专利第4,970,198、5,264,586、5,550,246、5,712,374 和5,714,586号，所述每个专利的内容都通过引用结合到本文中。倍 癌霉素(Duocarmycin)类似物(例如KW-2189、DC88、DC89 CBI-TMI) 及其衍生物描述于例如美国专利第5,070,092号、美国专利第5,187,186 号、美国专利第5,641,780号、美国专利第5,641,780号、美国专利第 4,923,990号和美国专利第5,101,038号，所述每个专利的内容都通过 引用结合到本文中。

其它毒素的实例包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌 呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺(decarbazine))、烷 化剂(例如氮芥、塞替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、CC-1065(参见美国专 利第5,475,092、5,585,499、5,846,545号)、美法仑、卡莫司汀(BSNU) 和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲星 (streptozotocin)、丝裂霉素C以及顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽 环类药(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如 放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、丝裂霉素、 嘌罗霉素、安曲霉素(AMC))、倍癌霉素(duocarmycin)及其类似物或衍 生物，以及抗有丝分裂药(例如长春新碱、长春碱、泰素、auristatin(例 如auristatin E)和美登木素生物碱及其类似物或同系物。

毒素也可以是表面活性毒素，例如作为自由基产生物(例如含硒 毒素部分)的毒素或含有放射性核素的部分的毒素。合适的含有放射性 核素的部分包括例如含有放射性碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、 锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝 (99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯 (36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)的部分。

毒素可以是蛋白质、多肽或肽，来源于细菌蛋白质(例如白喉毒 素、假单胞菌外毒素(PE))和植物蛋白质(例如篦麻毒蛋白A链(RTA))， 而多花白树毒蛋白(gelonin)、美洲商陆抗病毒蛋白、皂草毒蛋白和商 陆毒蛋白(dodecandron)等核糖体失活蛋白(RIP)，也可考虑用作毒素。

设计用于结合、废止和促进降解、或防止产生导致产生特定靶蛋 白的mRNA的核酸的反义化合物也可以用作毒素。反义化合物包括单 链或双链的反义RNA或DNA、寡核苷酸或它们的类似物，它们可与 单独的mRNA物质特异性杂交，并阻止mRNA物质的转录和/或RNA 加工和/或所编码多肽的翻译，由此实现对应的编码多肽的数量减少。 Ching等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10006-10010(1989)；Broder 等，Ann.Int.Med.113:604-618(1990)；Loreau等，FEBS Letters 274: 53-56(1990)；有用的反义治疗剂包括例如:VeglinTM(VasGene)和 OGX-011(Oncogenix)。

毒素还可以是光敏剂。合适的光敏剂包括基于卟啉的物质，例如 卟吩姆钠、绿卟啉、二氢卟酚E6、其血卟啉衍生物、酞菁、初红紫素 (etiopurpurin)、德卟啉(texaphrin)等。

毒素可以是结合胞内靶的抗体或抗体片段(例如胞内抗体)，例如 结合胞内靶的dAb。这样的抗体或抗体片段(dAb)可针对限定的亚细胞 区室或靶。例如，抗体或抗体片段(dAb)可结合选自以下的胞内靶: erbB2、EGFR、BCR-ABL、p21Ras、半胱天冬酶3、半胱天冬酶7、 Bcl-2、p53、细胞周期蛋白E、ATF-1/CREB、HPV16 E7、HP1、IV 型胶原酶、组织蛋白酶L以及在Kontermann，R.E.，Methods，34:163-170 (2004)中描述的其它靶，该文献整体通过引用结合到本文中。

结合CD38的多肽域

本发明提供具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域 (例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域(例如dAb)以低亲和力结合 CD38。优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM 至约10nM之间的Kd结合CD38。例如，多肽域可以约10μM至约 300nM或约10μM至约400nM的亲和力结合CD38。在某些实施方 案中，多肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲 和力结合CD38。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD38:DOM11-14(SEQ ID NO:39)、DOM11-22(SEQ ID NO:40)、DOM11-23(SEQ ID NO:32)、 DOM11-25(SEQ ID NO:41)、DOM11-26(SEQ ID NO:42)、DOM11-27 (SEQ ID NO:43)、DOM11-29(SEQ ID NO:44)、DOM11-3(SEQ ID NO:30)、DOM11-30(SEQ ID NO:31)、DOM11-31(SEQ ID NO:45)、 DOM11-32(SEQ ID NO:36)、DOM11-36(SEQ ID NO:46)、DOM11-4 (SEQ ID NO:47)、DOM11-43(SEQ ID NO:48)、DOM11-44(SEQ ID NO:49)、DOM11-45(SEQ ID NO:50)、DOM11-5(SEQ ID NO:51)、 DOM11-7(SEQ ID NO:33)、DOM11-1(SEQ ID NO:52)、DOM11-10 (SEQ ID NO:53)、DOM11-16(SEQ ID NO:54)、DOM11-2(SEQ ID NO:55)、DOM11-20(SEQ ID NO:56)、DOM11-21(SEQ ID NO:57)、 DOM11-24(SEQ ID NO:38)、DOM11-28(SEQ ID NO:58)、DOM11-33 (SEQ ID NO:59)、DOM11-34(SEQ ID NO:60)、DOM11-35(SEQ ID NO:61)、DOM11-37(SEQ ID NO:37)、DOM11-38(SEQ ID NO:34)、 DOM11-39(SEQ ID NO:35)、DOM11-41(SEQ ID NO:62)、DOM11-42 (SEQ ID NO:63)、DOM11-6(SEQ ID NO:64)、DOM11-8(SEQ ID NO:65)和DOM11-9(SEQ ID NO:66)。

在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD38:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM11-14(SEQ ID NO:261)、DOM11-22(SEQ ID NO:262)、DOM11-23(SEQ ID NO:9)、 DOM11-25(SEQ ID NO:263)、DOM11-26(SEQ ID NO:264)、 DOM11-27(SEQ ID NO:265)、DOM11-29(SEQ ID NO:266)、DOM11-3 (SEQ ID NO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ ID NO:267)、DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:268)、 DOM11-4(SEQ ID NO:269)、DOM11-43(SEQ ID NO:270)、DOM11-44 (SEQ ID NO:271)、DOM11-45(SEQ ID NO:272)、DOM11-5(SEQ ID NO:273)、DOM11-7(SEQ ID NO:3)、DOM11-1(SEQ ID NO:274)、 DOM11-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-16(SEQ ID NO:276)、DOM11-2 (SEQ ID NO:277)、DOM11-20(SEQ ID NO:278)、DOM11-21(SEQ ID NO:279)、DOM11-24(SEQ ID NO:6)、DOM11-28(SEQ ID NO:280)、 DOM11-33(SEQ ID NO:281)、DOM11-34(SEQ ID NO:282)、 DOM11-35(SEQ ID NO:283)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38 (SEQ ID NO:4)、DOM11-39(SEQ ID NO:5)、DOM11-41(SEQ ID NO:284)、DOM11-42(SEQ ID NO:285)、DOM11-6(SEQ ID NO:286)、 DOM11-8(SEQ ID NO:287)和DOM11-9(SEQ ID NO:288)。

在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-3(SEQ ID NO:271)、DOM11-3-4(SEQ ID NO:272)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-9(SEQ ID NO:274)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-11(SEQ ID NO:276)、DOM11-3-14(SEQ ID NO:277)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-17(SEQ ID NO:279)、DOM11-3-19(SEQ ID NO:280)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-21(SEQ ID NO:282)、DOM11-3-22(SEQ ID NO:283)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)、DOM11-3-24(SEQ ID NO:285)、DOM11-3-25(SEQ ID NO:286)、DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)、DOM11-3-27(SEQ ID NO:288)、DOM11-3-28(SEQ ID NO:289)、DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-3(SEQ ID NO:292)、DOM11-30-5(SEQ ID NO:293)、DOM11-30-6(SEQ ID NO:294)、DOM11-30-7(SEQ ID NO:295)、DOM11-30-8(SEQ ID NO:296)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-30-10(SEQ ID NO:298)、DOM11-30-11(SEQ ID NO:299)、DOM11-30-12(SEQ ID NO:300)、DOM11-30-13(SEQ ID NO:301)、DOM11-30-14(SEQ ID NO:302)、DOM11-30-15(SEQ ID NO:303)、DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)和DOM11-30-17(SEQ ID NO:305)。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CD38。

在优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点 的多肽域选自DOM11-3(SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ ID NO:254)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-38(SEQ ID NO:262)、 DOM11-39(SEQ ID NO:263)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、 DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)和 DOM11-23(SEQ ID NO:247)。

在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合 位点的多肽域选自DOM11-3-1(SEQ ID NO:269)、DOM11-3-2(SEQ ID NO:270)、DOM11-3-6(SEQ ID NO:273)、DOM11-3-10(SEQ ID NO:275)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:278)、DOM11-3-20(SEQ ID NO:281)、DOM11-3-23(SEQ ID NO:284)和DOM11-3-26(SEQ ID NO:287)。

在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合 位点的多肽域选自DOM11-30-1(SEQ ID NO:290)、DOM11-30-2(SEQ ID NO:291)、DOM11-30-9(SEQ ID NO:297)、DOM11-3-15(SEQ ID NO:303)和DOM11-30-16(SEQ ID NO:304)。

具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合 适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变 区。在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域含有如本文所述的通用构架。

通用构架可以是VL构架(Vλ或Vκ)，例如包含由人种系DPK1、 DPK2、DPK3、DPK4、DPK5、DPK6、DPK7、DPK8、DPK9、DPK10、 DPK12、DPK13、DPK15、DPK16、DPK18、DPK19、DPK20、DPK21、 DPK22、DPK23、DPK24、DPK25、DPK26或DPK28免疫球蛋白基 因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。如有需要，VL构架还可以包 含由人种系Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5免疫球蛋白基因区段所编码的构 架氨基酸序列。

在其它实施方案中，通用构架可以是VH构架，例如包含由人种 系DP4、DP7、DP8、DP9、DP10、DP31、DP33、DP38、DP45、DP46、 DP47、DP49、DP50、DP51、DP53、DP54、DP65、DP66、DP67、 DP68或DP69免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列的构架。 如有需要，VH构架还可包含由人种系JH1、JH2、JH3、JH4、JH4b、JH5 和JH6免疫球蛋白基因区段所编码的构架氨基酸序列。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含一个或多个构架区，所述架构区包含的氨基酸序列与人种 系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者一个或 多个所述构架区的氨基酸序列相对于人种系抗体基因区段所编码的 所述相应构架区的氨基酸序列总共包含最多5个氨基酸差异。

在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与人种系抗体基因 区段所编码的相应构架区的氨基酸序列相同，或者FW1、FW2、FW3 和FW4的氨基酸序列相对于所述人种系抗体基因区段所编码的相应 构架区的氨基酸序列总共包含最多10个氨基酸差异。

在其它实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含FW1、FW2和FW3区，所述FW1、FW2和FW3区的氨 基酸序列与人种系抗体基因区段所编码的相应构架区的氨基酸序列 相同。

在具体的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点 的多肽域包含DPK9 VL构架或选自DP47、DP45和DP38的VH构架。 具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含普通配体 (例如蛋白A、蛋白L和蛋白G)的结合位点。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域基本上能抵抗聚集。例如，在某些实施方案中，当将1-5mg/ml、 5-10mg/ml、10-20mg/ml、20-50mg/ml、50-100mg/ml、100-200mg/ml 或200-500mg/ml配体或dAb于药物配制常用溶剂(例如盐水、缓冲盐 水、柠檬酸缓冲盐水、水、乳化剂和任何这些含有可接受的赋形剂的 溶剂，所述赋形剂例如为由FDA批准的赋形剂)中的溶液在约22℃、 22-25℃、25-30℃、30-37℃、37-40℃、40-50℃、50-60℃、60-70℃、 70-80℃、15-20℃、10-15℃、5-10℃、2-5℃、0-2℃、-10℃至0℃、-20℃ 至-10℃、-40℃至-20℃、-60℃至-40℃或-80℃至-60℃的温度下保持一 段时间(例如10分钟、1小时、8小时、24小时、2天、3天、4天、1 周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、1年或2 年)时，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域有小于约 10％、小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％、小于约5％、 小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％聚集。

可采用诸如显微镜检、通过目测或分光镜或任何其它合适的方法 评价溶液浊度的任何合适方法，对聚集进行评价。优选通过动态光散 射来评价聚集。抗聚集的、具有对CD38具有结合特异性的结合位点 的多肽域具有若干优势。例如，通过采用合适的生物生产系统(例如大 肠杆菌)进行表达，容易以可溶性蛋白质的形式以高收率产生这类具有 对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域，并可以比常规多肽更 高的浓度来配制和/或贮存，几乎没有聚集和活性损失。

另外，可以比其它抗原或表位结合多肽(例如常规抗体)更经济地 生产抗聚集的、具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域。 例如，一般来说，预期用于体内应用的抗原或表位结合多肽的制备包 括除去聚集多肽的过程(例如凝胶过滤)。不能除去这样的聚集物会使 制剂不适用于体内应用，因为例如希望起到拮抗剂作用的抗原结合多 肽聚集可通过诱导靶抗原的交联或成簇而起到激动剂的作用。蛋白聚 集还可以通过在它们所给予的患者体内诱导免疫应答而降低治疗性 多肽的功效。

相比之下，可以制备本发明的抗聚集的、具有对CD38具有结合 特异性的结合位点的多肽域，用于体内应用，而无需包括除去聚集物 的过程，并且可用于体内应用，而没有聚集多肽所引起的上述缺点。

在某些实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的 多肽域当加热到温度(Ts)和冷却到温度(Tc)时能可逆地解折叠，其中 Ts高于具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度 (Tm)，而Tc低于具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域 的解链温度。例如，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽 域当加热到80℃和冷却到约室温时能可逆地解折叠。可逆地解折叠的 多肽在解折叠时会丧失功能，而一旦重折叠后又会恢复功能。这类多 肽不同于在解折叠时聚集的多肽或不适当重折叠(即不能恢复功能)的 多肽(错误折叠的多肽)。

可以采用任何合适方法，通过直接或间接测定多肽结构来评价多 肽解折叠和重折叠。例如，可以通过圆二色性(CD)(例如远UV CD、 近UV CD)、荧光(例如色氨酸侧链的荧光)、对蛋白酶解的敏感性、核 磁共振(NMR)，或者通过检测或测定依赖于正确折叠的多肽功能(例如 与靶配体的结合、与通用配体的结合)，来测定多肽结构。在一个实例 中，采用功能测定评价多肽解折叠，其中结合功能(例如结合通用配体 和/或靶配体、结合底物)的丧失表明该多肽是解折叠的。

可以采用解折叠或变性曲线，测定具有对CD38具有结合特异性 的结合位点的多肽域的解折叠和重折叠的程度。可通过纵坐标为温度 与横坐标为折叠多肽相对浓度作图，绘制解折叠曲线。可以采用任何 合适的方法(例如CD、荧光、结合测定)，直接或间接测定具有对CD38 具有结合特异性的结合位点的折叠多肽域的相对浓度。例如，可以制 备具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶液，并通过CD 测定溶液的椭圆率。所得椭圆率值表示折叠配体或dAb单体的相对浓 度为100％。再通过逐渐升高溶液温度，使溶液中具有对CD38具有 结合特异性的结合位点的多肽域解折叠，然后以合适增量(例如温度每 升高一度后)测定椭圆率。然后通过逐渐降低溶液温度，使溶液中具有 对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域重折叠，再以合适增量 测定椭圆率。可以对数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线。解折 叠曲线和重折叠曲线具有特征性的S形曲线，它包括其中具有对CD38 具有结合特异性的结合位点的多肽域分子折叠的部分，其中具有对 CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域分子解折叠到不同程度的 解折叠/重折叠转换部分，以及其中具有对CD38具有结合特异性的结 合位点的多肽域解折叠的部分。重折叠曲线的Y轴截距是恢复的重折 叠的具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的相对数量。 至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约75％、或至少 约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％的恢复，表明 配体或dAb单体可逆地解折叠。

在一个优选实施方案中，通过制备具有对CD38具有结合特异性 的结合位点的多肽域溶液并绘制加热解折叠和重折叠曲线，测定具有 对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域解折叠的可逆性。可以 在任何合适溶剂中制备具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多 肽域溶液，所述溶剂例如为含水缓冲液，其pH适于让具有对CD38 具有结合特异性的结合位点的多肽域溶解(例如pH比等电点(pI)高或 低约3个单位)。具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域溶 液足够浓，以便可检测出解折叠/折叠。例如，配体或dAb单体溶液 可以为约0.1μM至约100μM、或优选约1μM至约10μM。

如果具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温 度(Tm)是已知的，则可将溶液加热至比Tm低约10度(Tm-10)，然后 通过椭圆率或荧光(例如从200nm至250nm的远UV CD扫描，于235 nm或225nm的固定波长CD；于300-450nm的色氨酸荧光发射光谱 和298nm的激发)评价折叠，以提供100％的相对折叠配体或dAb单 体。再按预定增量(例如约0.1度至约1度的增加)，将溶液加热至比 Tm高至少10度(Tm+10)，以每个增量测定椭圆率或荧光。然后，通 过以预定增量冷却到至少Tm-10，使具有对CD38具有结合特异性的 结合位点的多肽域重折叠，并以每个增量测定椭圆率或荧光。如果不 知道具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的解链温度， 则可以通过从约25℃至约100℃递增加热，使溶液解折叠，再递增冷 却到至少约25℃使其重折叠，以每个加热和冷却增量测定椭圆率或荧 光。可以对所得数据作图，绘制解折叠曲线和重折叠曲线，其中重折 叠曲线的Y轴截距是恢复的重折叠蛋白质的相对数量。在某些实施方 案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域不含骆驼科 动物免疫球蛋白可变区，或者不含骆驼科动物种系抗体基因区段所编 码的免疫球蛋白可变区所特有的一个或多个构架氨基酸。

优选地，具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域当在 大肠杆菌(E.coli)或毕赤酵母(Pichia sp.)(例如巴斯德毕赤酵母(P. pastoris))中表达时，其分泌量为至少约0.5mg/L。在其它优选的实施 方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时， 具有对CD38具有结合特异性的结合位点的多肽域的分泌量为至少约 0.75mg/L、至少约1mg/L、至少约4mg/L、至少约5mg/L、至少约 10mg/L、至少约15mg/L、至少约20mg/L、至少约25mg/L、至少约 30mg/L、至少约35mg/L、至少约40mg/L、至少约45mg/L、或至少 约50mg/L、或至少约100mg/L、或至少约200mg/L、或至少约300 mg/L、或至少约400mg/L、或至少约500mg/L、或至少约600mg/L、 或至少约700mg/L、或至少约800mg/L、至少约900mg/L、或至少 约1g/L。在其它优选的实施方案中，当在大肠杆菌或毕赤酵母(例如 巴斯德毕赤酵母)中表达时，具有对CD38具有结合特异性的结合位点 的多肽域的分泌量为至少约1mg/L到至少约1g/L、至少约1mg/L到 至少约750mg/L、至少约100mg/L到至少约1g/L、至少约200mg/L 到至少约1g/L、至少约300mg/L到至少约1g/L、至少约400mg/L 到至少约1g/L、至少约500mg/L到至少约1g/L、至少约600mg/L 到至少约1g/L、至少约700mg/L到至少约1g/L、至少约800mg/L 到至少约1g/L、或至少约900mg/L到至少约1g/L。尽管在大肠杆菌 或毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)中表达时，本文所述的具有对CD38 具有结合特异性的结合位点的多肽域可为可分泌的，但是它们也可以 采用任何合适方法来制备，例如不需要用大肠杆菌或毕赤酵母的合成 化学方法或生物学制备方法。

结合CD138的多肽域

本发明提供具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域 (例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CD138。 优选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10 nM之间的Kd结合CEA。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或 约10μM至约400nM的亲和力结合CD138。在某些实施方案中，多 肽域以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合 CD138。

在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点 的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD138:DOM12-1(SEQ ID NO:70)、DOM12-15(SEQ ID NO:71)、DOM12-17(SEQ ID NO:68)、 DOM12-19(SEQ ID NO:72)、DOM12-2(SEQ ID NO:73)、DOM12-20 (SEQ ID NO:74)、DOM12-21(SEQ ID NO:75)、DOM12-22(SEQ ID NO:76)、DOM12-3(SEQ ID NO:77)、DOM12-33(SEQ ID NO:78)、 DOM12-39(SEQ ID NO:79)、DOM12-4(SEQ ID NO:80)、DOM12-40 (SEQ ID NO:81)、DOM12-41(SEQ ID NO:82)、DOM12-42(SEQ ID NO:83)、DOM12-44(SEQ ID NO:84)、DOM12-46(SEQ ID NO:85)、 DOM12-6(SEQ ID NO:86)、DOM12-7(SEQ ID NO:87)、DOM12-10 (SEQ ID NO:88)、DOM12-11(SEQ ID NO:89)、DOM12-18(SEQ ID NO:90)、DOM12-23(SEQ ID NO:91)、DOM12-24(SEQ ID NO:92)、 DOM12-25(SEQ ID NO:93)、DOM12-26(SEQ ID NO:69)、DOM12-27 (SEQ ID NO:94)、DOM12-28(SEQ ID NO:95)、DOM12-29(SEQ ID NO:96)、DOM12-30(SEQ ID NO:97)、DOM12-31(SEQ ID NO:98)、 DOM12-32(SEQ ID NO:99)、DOM12-34(SEQ ID NO:100)、DOM12-35 (SEQ ID NO:101)、DOM12-36(SEQ ID NO:102)、DOM12-37(SEQ ID NO:103)、DOM12-38(SEQ ID NO:104)、DOM12-43(SEQ ID NO:105)、 DOM12-45(SEQ ID NO:67)、DOM12-5(SEQ ID NO:106)、DOM12-8 (SEQ ID NO:107)和DOM12-9(SEQ ID NO:108)。

在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点 的多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD138:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。

在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点 的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM12-1(SEQ ID NO:289)、 DOM12-15(SEQ ID NO:290)、DOM12-17(SEQ ID NO:11)、DOM12-19 (SEQ ID NO:291)、DOM12-2(SEQ ID NO:292)、DOM12-20(SEQ ID NO:293)、DOM12-21(SEQ ID NO:294)、DOM12-22(SEQ ID NO:295)、 DOM12-3(SEQ ID NO:296)、DOM12-33(SEQ ID NO:297)、DOM12-39 (SEQ ID NO:298)、DOM12-4(SEQ ID NO:299)、DOM12-40(SEQ ID NO:300)、DOM12-41(SEQ ID NO:301)、DOM12-42(SEQ ID NO:302)、 DOM12-44(SEQ ID NO:303)、DOM12-46(SEQ ID NO:304)、DOM12-6 (SEQ ID NO:305)、DOM12-7(SEQ ID NO:306)、DOM12-10(SEQ ID NO:307)、DOM12-11(SEQ ID NO:308)、DOM12-18(SEQ ID NO:309)、 DOM12-23(SEQ ID NO:310)、DOM12-24(SEQ ID NO:311)、 DOM12-25(SEQ ID NO:312)、DOM12-26(SEQ ID NO:12)、DOM12-27 (SEQ ID NO:313)、DOM12-28(SEQ ID NO:314)、DOM12-29(SEQ ID NO:315)、DOM12-30(SEQ ID NO:316)、DOM12-31(SEQ ID NO:317)、 DOM12-32(SEQ ID NO:318)、DOM12-34(SEQ ID NO:319)、 DOM12-35(SEQ ID NO:320)、DOM12-36(SEQ ID NO:321)、 DOM12-37(SEQ ID NO:322)、DOM12-38(SEQ ID NO:323)、 DOM12-43(SEQ ID NO:324)、DOM12-45(SEQ ID NO:310)、DOM12-5 (SEQ ID NO:325)、DOM12-8(SEQ ID NO:326)和DOM12-9(SEQ ID NO:327)。

在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点 的多肽域包含的氨基酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)、DOM12-45-3(SEQ ID NO:350)、DOM12-45-4(SEQ ID NO:351)、DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)、DOM12-45-6(SEQ ID NO:353)、DOM12-45-8(SEQ ID NO:354)、DOM12-45-9(SEQ ID NO:355)、DOM12-45-10(SEQ ID NO:356)、DOM12-45-11(SEQ ID NO:357)、DOM12-45-12(SEQ ID NO:358)、DOM12-45-13(SEQ ID NO:359)、DOM12-45-14(SEQ ID NO:360)、DOM12-45-15(SEQ ID NO:361)、DOM12-45-16(SEQ ID NO:362)、DOM12-45-17(SEQ ID NO:363)、DOM12-45-18(SEQ ID NO:364)、DOM12-45-19(SEQ ID NO:365)、DOM12-45-20(SEQ ID NO:366)、DOM12-45-21(SEQ ID NO:367)、DOM12-45-22(SEQ ID NO:368)、DOM12-45-23(SEQ ID NO:369)、DOM12-45-24(SEQ ID NO:370)、DOM12-45-25(SEQ ID NO:371)、DOM12-45-26(SEQ ID NO:372)、DOM12-45-27(SEQ ID NO:373)、DOM12-45-28(SEQ ID NO:374)、DOM12-45-29(SEQ ID NO:375)、DOM12-45-30(SEQ ID NO:376)、DOM12-45-31(SEQ ID NO:377)、DOM12-45-32(SEQ ID NO:378)、DOM12-45-33(SEQ ID NO:379)、DOM12-45-34(SEQ ID NO:380)、DOM12-45-35(SEQ ID NO:381)、DOM12-45-36(SEQ ID NO:382)、DOM12-45-37(SEQ ID NO:383)和DOM12-45-38(SEQ ID NO:384)。

在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点 的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CD138。

在优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合位点 的多肽域选自DOM12-45(SEQ ID NO:346)、DOM12-17(SEQ ID NO:318)和DOM12-26(SEQ ID NO:327)。

在其它优选的实施方案中，具有对CD38具有结合特异性的结合 位点的多肽域选自DOM12-45-1(SEQ ID NO:348)、DOM12-45-2(SEQ ID NO:349)和DOM12-45-5(SEQ ID NO:352)。

具有对CD138具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何 合适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变 区。在某些实施方案中，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的 多肽域含有如本文所述的通用构架。

在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结 合位点的多肽域的描述，具有对CD138具有结合特异性的结合位点的 多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。

结合CEA的多肽域

本发明提供具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域(例 如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CEA。优选 地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM 之间的Kd结合CEA。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约 10μM至约400nM的亲和力结合CEA。在某些实施方案中，多肽域 以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CEA。

在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域与选自以下的dAb竞争结合CEA:DOM13-1(SEQ ID NO:385)、 DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、 DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、 DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、 DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2 (SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ ID NO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、 DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、 DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、 DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3 (SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ ID NO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、 DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、DOM13-35(SEQ ID NO:416)、 DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4 (SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ ID NO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、 DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、 DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5 (SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ ID NO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、 DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、 DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、 DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6 (SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ ID NO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、 DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、 DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、 DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7 (SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ ID NO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ ID NO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、 DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、 DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8 (SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ ID NO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、 DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SEQ ID NO:462)、 DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、 DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、 DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、 DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、 DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。

在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域与选自以下的dAb竞争结合CEA:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。

在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM13-1(SEQ ID NO:385)、 DOM13-12(SEQ ID NO:393)、DOM13-13(SEQ ID NO:394)、 DOM13-14(SEQ ID NO:395)、DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、 DOM13-16(SEQ ID NO:397)、DOM13-17(SEQ ID NO:398)、 DOM13-18(SEQ ID NO:399)、DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2 (SEQ ID NO:386)、DOM13-20(SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ ID NO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、 DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、 DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、 DOM13-28(SEQ ID NO:409)、DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3 (SEQ ID NO:387)、DOM13-30(SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ ID NO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、 DOM-13-34(SEQ ID NO:415).DOM13-35(SEQ ID NO:416)、 DOM13-36(SEQ ID NO:417)、DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4 (SEQ ID NO:388)、DOM13-42(SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ ID NO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、 DOM13-46(SEQ ID NO:423)、DOM13-47(SEQ ID NO:424)、 DOM13-48(SEQ ID NO:425)、DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5 (SEQ ID NO:389)、DOM13-50(SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ ID NO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、 DOM13-54(SEQ ID NO:431)、DOM13-55(SEQ ID NO:432)、 DOM13-56(SEQ ID NO:433)、DOM13-57(SEQ ID NO:434)、 DOM13-58(SEQ ID NO:435)、DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6 (SEQ ID NO:390)、DOM13-60(SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ ID NO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、 DOM13-64(SEQ ID NO:441)、DOM13-65(SEQ ID NO:442)、 DOM13-66(SEQ ID NO:443)、DOM13-67(SEQ ID NO:444)、 DOM13-68(SEQ ID NO:445)、DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7 (SEQ ID NO:391)、DOM13-70(SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ ID NO:3448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ ID NO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、DOM13-75(SEQ ID NO:452)、 DOM13-76(SEQ ID NO:453)、DOM13-77(SEQ ID NO:454)、 DOM13-78(SEQ ID NO:455)、DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8 (SEQ ID NO:392)、DOM13-80(SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ ID NO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、 DOM13-84(SEQ ID NO:461)、DOM13-85(SEQ ID NO:462)、 DOM13-86(SEQ ID NO:463)、DOM13-87(SEQ ID NO:464)、 DOM13-88(SEQ ID NO:465)、DOM13-89(SEQ ID NO:466)、 DOM13-90(SEQ ID NO:467)、DOM13-91(SEQ ID NO:468)、 DOM13-92(SEQ ID NO:469)、DOM13-93(SEQ ID NO:470)、 DOM13-94(SEQ ID NO:471)和DOM13-95(SEQ ID NO:472)。

在其它实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM13-25-3(SEQ ID NO:473)、DOM13-25-23(SEQ ID NO:474)、DOM13-25-27(SEQ ID NO:475)和DOM13-25-80(SEQ ID NO:476)。

在优选的实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点 的多肽域选自:DOM13-25(SEQ ID NO:80)、DOM13-57(SEQ ID NO:81)、DOM13-58(SEQ ID NO:82)、DOM13-59(SEQ ID NO:83)、 DOM13-64(SEQ ID NO:84)、DOM13-65(SEQ ID NO:85)、DOM13-74 (SEQ ID NO:86)、DOM13-93(SEQ ID NO:87)和DOM13-95(SEQ ID NO:88)。在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位 点的多肽域与本文公开的任一种dAb竞争结合CEA。

具有对CEA具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合 适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变 区。在某些实施方案中，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域含有如本文所述的通用构架。

在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结 合位点的多肽域的描述，具有对CEA具有结合特异性的结合位点的 多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。

结合CD56的多肽域

本发明提供具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域 (例如dAb)。在优选的实施方案中，多肽域以低亲和力结合CD56。优 选地，根据表面等离子共振的测定，多肽域以介于约10μM至约10nM 之间的Kd结合CD56。例如，多肽域可以约10μM至约300nM或约 10μM至约400nM的亲和力结合CD56。在某些实施方案中，多肽域 以约300nM至约10nM或约200nM至约10nM的亲和力结合CD56。

在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的 多肽域与选自以下的dAb竞争结合CD56:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、 DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、 DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、 DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、 DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20 (SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、 DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、 DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3 (SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、 DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、 DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、 DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40 (SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、 DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、 DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、 DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、 DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、 DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、 DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、 DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、 DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、 DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、 DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、 DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、 DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、 DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。

在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的 多肽域包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列或dAb具有至少 约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少 约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少 约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM14-1(SEQ ID NO:477)、 DOM14-10(SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、 DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、 DOM14-13(SEQ ID NO:484)、DOM14-14(SEQ ID NO:485)、 DOM14-15(SEQ ID NO:486)、DOM14-16(SEQ ID NO:487)、 DOM14-17(SEQ ID NO:488)、DOM14-18(SEQ ID NO:489)、 DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2(SEQ ID NO:478)、DOM14-20 (SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-24(SEQ ID NO:495)、 DOM14-25(SEQ ID NO:496)、DOM14-26(SEQ ID NO:497)、 DOM14-27(SEQ ID NO:498)、DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3 (SEQ ID NO:479)、DOM14-31(SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、 DOM14-35(SEQ ID NO:504)、DOM14-36(SEQ ID NO:505)、 DOM14-37(SEQ ID NO:506)、DOM14-38(SEQ ID NO:507)、 DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4(SEQ ID NO:480)、DOM14-40 (SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、DOM14-44(SEQ ID NO:513)、 DOM14-45(SEQ ID NO:514)、DOM14-46(SEQ ID NO:515)、 DOM14-47(SEQ ID NO:516)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、 DOM14-49(SEQ ID NO:518)、DOM14-50(SEQ ID NO:519)、 DOM14-51(SEQ ID NO:520)、DOM14-52(SEQ ID NO:521)、 DOM14-53(SEQ ID NO:522)、DOM14-54(SEQ ID NO:523)、 DOM14-55(SEQ ID NO:524)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、 DOM14-57(SEQ ID NO:526)、DOM14-58(SEQ ID NO:527)、 DOM14-59(SEQ ID NO:528)、DOM14-60(SEQ ID NO:529)、 DOM14-61(SEQ ID NO:530)、DOM14-62(SEQ ID NO:531)、 DOM14-63(SEQ ID NO:532)、DOM14-64(SEQ ID NO:533)、 DOM14-65(SEQ ID NO:534)、DOM14-66(SEQ ID NO:535)、 DOM14-67(SEQ ID NO:536)、DOM14-70(SEQ ID NO:539)、 DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-69(SEQ ID NO:538)。

在优选的实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点 的多肽域选自:DOM14-23(SEQ ID NO:494)、DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、 DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、 DOM14-68(SEQ ID NO:537)和DOM14-70(SEQ ID NO:539)。在某些 实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域与本 文公开的任一种dAb竞争结合CD56。

具有对CD56具有结合特异性的结合位点的多肽域可包含任何合 适的免疫球蛋白可变区，优选含有人可变区或含有人构架区的可变 区。在某些实施方案中，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的 多肽域含有如本文所述的通用构架。

在某些实施方案中，如以上对具有对CD38具有结合特异性的结 合位点的多肽域的描述，具有对CD56具有结合特异性的结合位点的 多肽域能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或含有构架区并被分泌。

具有结合血清白蛋白的dAb单体的配体

本发明的配体还可以含有dAb单体，其以1nM-500μM(即1× 10-9至5×10-4)、优选100nM至10μM的Kd结合血清白蛋白(SA)。 优选地，对于含有抗SA dAb的配体来说，配体与其靶标的结合(例如 通过表面等离子共振(例如使用BiaCore)测定的Kd和/或K解离)比SA强 1-100000倍(优选100-100000倍、更优选1000-100000倍、或 10000-100000倍)。优选地，血清白蛋白为人血清白蛋白(HSA)。在一 个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)与SA(例如HSA)结合的Kd 约为50nM、优选70nM、更优选100nM、150nM或200nM。

在某些实施方案中，如以上对结合CD38的dAb单体的描述，结 合SA的dAb单体能抵抗聚集、可逆地解折叠和/或包含构架区。

在具体的实施方案中，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段是 结合人血清白蛋白的dAb。在某些实施方案中，dAb结合人血清白蛋 白，并且与选自以下的dAb竞争结合白蛋白:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、 DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7 (SEQ ID NO:548)、DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、 DOM7h-6(SEQ IDNO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、 DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、 DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17 (SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ ID NO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、 DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24 (SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、 DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31 (SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)。

在某些实施方案中，所述dAb结合人血清白蛋白，其含有的氨基 酸序列与选自以下dAb的氨基酸序列具有至少约80％、或至少约85％、 或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至 少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性:DOM7m-16(SEQ ID NO:541)、DOM7m-12(SEQ ID NO:542)、DOM7m-26(SEQ ID NO:543)、DOM7r-1(SEQ ID NO:544)、DOM7r-3(SEQ ID NO:545)、 DOM7r-4(SEQ ID NO:546)、DOM7r-5(SEQ ID NO:547)、DOM7r-7 (SEQ ID NO:548)、DOM7r-8(SEQ ID NO:549)、DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、 DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:555)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:477)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、 DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、DOM7h-27(SEQ ID NO:563)、 DOM7r-15(SEQ ID NO:567)、DOM7r-16(SEQ ID NO:568)、DOM7r-17 (SEQ ID NO:569)、DOM7r-18(SEQ ID NO:570)、DOM7r-19(SEQ ID NO:571)、DOM7r-20(SEQ ID NO:572)、DOM7r-21(SEQ ID NO:573)、 DOM7r-22(SEQ ID NO:574)、DOM7r-23(SEQ ID NO:575)、DOM7r-24 (SEQ ID NO:576)、DOM7r-25(SEQ ID NO:577)、DOM7r-26(SEQ ID NO:578)、DOM7r-27(SEQ ID NO:579)、DOM7r-28(SEQ ID NO:580)、 DOM7r-29(SEQ ID NO:581)、DOM7r-30(SEQ ID NO:582)、DOM7r-31 (SEQ ID NO:583)、DOM7r-32(SEQ ID NO:584)和DOM7r-33(SEQ ID NO:585)。

例如，结合人血清白蛋白的dAb可含有与以下的序列具有至少约 90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％ 或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列:DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3(SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、 DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:554)、DOM7h-7 (SEQ ID NO:555)、DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)、DOM7r-14(SEQ ID NO:566)、DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、 DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、 DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、 DOM7h-21(SEQ ID NO:562)和DOM7h-27(SEQ ID NO:563)。

氨基酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进 行测定，例如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6):2264-2268(1990))。

在更具体的实施方案中，dAb为结合人血清白蛋白并具有选自以 下的氨基酸序列的Vκ dAb:DOM7h-2(SEQ ID NO:550)、DOM7h-3 (SEQ ID NO:551)、DOM7h-4(SEQ ID NO:552)、DOM7h-6(SEQ ID NO:553)、DOM7h-1(SEQ ID NO:554)、DOM7h-7(SEQ ID NO:555)、 DOM7h-8(SEQ ID NO:564)、DOM7r-13(SEQ ID NO:565)和DOM7r-14 (SEQ ID NO:566)，或者为具有选自以下的氨基酸序列的VH dAb: DOM7h-22(SEQ ID NO:557)、DOM7h-23(SEQ ID NO:558)、 DOM7h-24(SEQ ID NO:559)、DOM7h-25(SEQ ID NO:560)、 DOM7h-26(SEQ ID NO:561)、DOM7h-21(SEQ ID NO:562)、 DOM7h-27(SEQ ID NO:563)。在其它实施方案中，结合血清白蛋白的 抗体的抗原结合片段是结合人血清白蛋白并含有任一种前述氨基酸 序列的CDR的dAb。

结合血清白蛋白的合适的骆驼科动物VHH包括公开于WO 2004/041862(AblynxN.V.)的那些和本文的序列A(SEQ ID NO:586)、 序列B(SEQ ID NO:587)、序列C(SEQ ID NO:588)、序列D(SEQ ID NO:589)、序列E(SEQ ID NO:590)、序列F(SEQ ID NO:591)、序列G (SEQ ID NO:592)、序列H(SEQ ID NO:593)、序列I(SEQ ID NO:594)、 序列J(SEQ ID NO:595)、序列K(SEQ ID NO:596)、序列L(SEQ ID NO:597)、序列M(SEQ ID NO:598)、序列N(SEQ ID NO:599)、序列 O(SEQ ID NO:600)、序列P(SEQ ID NO:601)、序列Q(SEQ ID NO:602)。在某些实施方案中，骆驼科动物VHH结合人血清白蛋白， 并含有与SEQ ID NO:586-602中的任一种具有至少约80％、或至少约 85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、 或至少约98％、或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。氨基 酸序列同一性优选使用合适的序列比对算法和默认参数进行测定，例 如BLAST P(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(6): 2264-2268(1990))。

在某些实施方案中，配体含有的抗血清白蛋白dAb与本文公开的 任何抗血清白蛋白dAb竞争结合血清白蛋白(例如人血清白蛋白)。

核酸分子、载体和宿主细胞

本发明还提供编码如本文所述的配体(双特异性配体和多特异性 配体)的分离和/或重组核酸分子。

在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列编码如 本文所述的配体，所述配体包含的氨基酸序列与选自以下的氨基酸序 列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约 92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约 97％、至少约98％或至少约99％同源性:DOM11-14(SEQ ID NO:242)、 DOM11-22(SEQ ID NO:246)、DOM11-23(SEQ ID NO:247)、 DOM11-25(SEQ ID NO:249)、DOM11-26(SEQ ID NO:250)、 DOM11-27(SEQ ID NO:251)、DOM11-29(SEQ ID NO:253)、DOM11-3 (SEQ ID NO:234)、DOM11-30(SEQ ID NO:254)、DOM11-31(SEQ ID NO:255)、DOM11-32(SEQ ID NO:256)、DOM11-36(SEQ ID NO:260)、 DOM11-4(SEQ ID NO:235)、DOM11-43(SEQ ID NO:266)、DOM11-44 (SEQ ID NO:267)、DOM11-45(SEQ ID NO:268)、DOM11-5(SEQ ID NO:236)、DOM11-7(SEQ ID NO:238)、DOM11-1(SEQ ID NO:232)、 DOM11-10(SEQ ID NO:241)、DOM11-16(SEQ ID NO:243)、DOM11-2 (SEQ ID NO:233)、DOM11-20(SEQ ID NO:244)、DOM11-21(SEQ ID NO:245)、DOM11-24(SEQ ID NO:248)、DOM11-28(SEQ ID NO:252)、 DOM11-33(SEQ ID NO:257)、DOM11-34(SEQ ID NO:258)、 DOM11-35(SEQ ID NO:259)、DOM11-37(SEQ ID NO:261)、 DOM11-38(SEQ ID NO:262)、DOM11-39(SEQ ID NO:293)、 DOM11-41(SEQ ID NO:264)、DOM11-42(SEQ ID NO:265)、DOM11-6 (SEQ ID NO:237)、DOM11-8(SEQ ID NO:239)、DOM11-9(SEQ ID NO:240)、DOM12-1(SEQ ID NO:306)、DOM12-15(SEQ ID NO:317)、 DOM12-17(SEQ ID NO:318)、DOM12-19(SEQ ID NO:320)、DOM12-2 (SEQ ID NO:307)、DOM12-20(SEQ ID NO:321)、DOM12-21(SEQ ID NO:322)、DOM12-22(SEQ ID NO:323)、DOM12-3(SEQ ID NO:308)、 DOM12-33(SEQ ID NO:334)、DOM12-39(SEQ ID NO:340)、DOM12-4 (SEQ ID NO:309)、DOM12-40(SEQ ID NO:341)、DOM12-41(SEQ ID NO:342)、DOM12-42(SEQ ID NO:343)、DOM12-44(SEQ ID NO:345)、 DOM12-46(SEQ ID NO:347)、DOM12-6(SEQ ID NO:311)、DOM12-7 (SEQ ID NO:312)、DOM12-10(SEQ ID NO:315)、DOM12-11(SEQ ID NO:316)、DOM12-18(SEQ ID NO:319)、DOM12-23(SEQ ID NO:324)、 DOM12-24(SEQ ID NO:325)、DOM12-25(SEQ ID NO:326)、 DOM12-26(SEQ ID NO:327)、DOM12-27(SEQ ID NO:328)、 DOM12-28(SEQ ID NO:329)、DOM12-29(SEQ ID NO:330)、 DOM12-30(SEQ ID NO:331)、DOM12-31(SEQ ID NO:332)、 DOM12-32(SEQ ID NO:333)、DOM12-34(SEQ ID NO:335)、 DOM12-35(SEQ ID NO:336)、DOM12-36(SEQ ID NO:337)、 DOM12-37(SEQ ID NO:338)、DOM12-38(SEQ ID NO:339)、 DOM12-43(SEQ ID NO:344)、DOM12-45(SEQ ID NO:346)、DOM12-5 (SEQ ID NO:310)、DOM12-8(SEQ ID NO:313)、DOM12-9(SEQ ID NO:314)、DOM13-1(SEQ ID NO:385)、DOM13-12(SEQ ID NO:393)、 DOM13-13(SEQ ID NO:394)、DOM13-14(SEQ ID NO:395)、 DOM13-15(SEQ ID NO:3396)、DOM13-16(SEQ ID NO:397)、 DOM13-17(SEQ ID NO:398)、DOM13-18(SEQ ID NO:399)、 DOM13-19(SEQ ID NO:400)、DOM13-2(SEQ ID NO:386)、DOM13-20 (SEQ ID NO:401)、DOM13-21(SEQ ID NO:402)、DOM13-22(SEQ ID NO:403)、DOM13-23(SEQ ID NO:404)、DOM13-24(SEQ ID NO:3405)、DOM13-25(SEQ ID NO:406)、DOM13-26(SEQ ID NO:407)、DOM13-27(SEQ ID NO:408)、DOM13-28(SEQ ID NO:409)、 DOM13-29(SEQ ID NO:410)、DOM13-3(SEQ ID NO:387)、DOM13-30 (SEQ ID NO:411)、DOM13-31(SEQ ID NO:412)、DOM13-32(SEQ ID NO:413)、DOM13-33(SEQ ID NO:414)、DOM-13-34(SEQ ID NO:415)、 DOM13-35(SEQ ID NO:416)、DOM13-36(SEQ ID NO:417)、 DOM13-37(SEQ ID NO:418)、DOM13-4(SEQ ID NO:388)、DOM13-42 (SEQ ID NO:419)、DOM13-43(SEQ ID NO:420)、DOM13-44(SEQ ID NO:421)、DOM13-45(SEQ ID NO:422)、DOM13-46(SEQ ID NO:423)、 DOM13-47(SEQ ID NO:424)、DOM13-48(SEQ ID NO:425)、 DOM13-49(SEQ ID NO:426)、DOM13-5(SEQ ID NO:389)、DOM13-50 (SEQ ID NO:427)、DOM13-51(SEQ ID NO:428)、DOM13-52(SEQ ID NO:429)、DOM13-53(SEQ ID NO:430)、DOM13-54(SEQ ID NO:431)、 DOM13-55(SEQ ID NO:432)、DOM13-56(SEQ ID NO:433)、 DOM13-57(SEQ ID NO:434)、DOM13-58(SEQ ID NO:435)、 DOM13-59(SEQ ID NO:436)、DOM13-6(SEQ ID NO:390)、DOM13-60 (SEQ ID NO:437)、DOM13-61(SEQ ID NO:438)、DOM13-62(SEQ ID NO:439)、DOM13-63(SEQ ID NO:440)、DOM13-64(SEQ ID NO:441)、 DOM13-65(SEQ ID NO:442)、DOM13-66(SEQ ID NO:443)、 DOM13-67(SEQ ID NO:444)、DOM13-68(SEQ ID NO:445)、 DOM13-69(SEQ ID NO:446)、DOM13-7(SEQ ID NO:391)、DOM13-70 (SEQ ID NO:447)、DOM13-71(SEQ ID NO:448)、DOM13-72(SEQ ID NO:449)、DOM13-73(SEQ ID NO:450)、DOM13-74(SEQ ID NO:451)、 DOM13-75(SEQ ID NO:452)、DOM13-76(SEQ ID NO:453)、 DOM13-77(SEQ ID NO:454)、DOM13-78(SEQ ID NO:455)、 DOM13-79(SEQ ID NO:456)、DOM13-8(SEQ ID NO:392)、DOM13-80 (SEQ ID NO:457)、DOM13-81(SEQ ID NO:458)、DOM13-82(SEQ ID NO:459)、DOM13-83(SEQ ID NO:460)、DOM13-84(SEQ ID NO:461)、 DOM13-85(SEQ ID NO:462)、DOM13-86(SEQ ID NO:463)、 DOM13-87(SEQ ID NO:464)、DOM13-88(SEQ ID NO:465)、 DOM13-89(SEQ ID NO:466)、DOM13-90(SEQ ID NO:467)、 DOM13-91(SEQ ID NO:468)、DOM13-92(SEQ ID NO:469)、 DOM13-93(SEQ ID NO:470)、DOM13-94(SEQ ID NO:471)、 DOM13-95(SEQ ID NO:472)、DOM14-1(SEQ ID NO:477)、DOM14-10 (SEQ ID NO:481)、DOM14-100(SEQ ID NO:540)、DOM14-11(SEQ ID NO:482)、DOM14-12(SEQ ID NO:483)、DOM14-13(SEQ ID NO:484)、 DOM14-14(SEQ ID NO:485)、DOM14-15(SEQ ID NO:486)、 DOM14-16(SEQ ID NO:487)、DOM14-17(SEQ ID NO:488)、 DOM14-18(SEQ ID NO:489)、DOM14-19(SEQ ID NO:490)、DOM14-2 (SEQ ID NO:478)、DOM14-20(SEQ ID NO:491)、DOM14-21(SEQ ID NO:492)、DOM14-22(SEQ ID NO:493)、DOM14-23(SEQ ID NO:494)、 DOM14-24(SEQ ID NO:495)、DOM14-25(SEQ ID NO:496)、 DOM14-26(SEQ ID NO:497)、DOM14-27(SEQ ID NO:498)、 DOM14-28(SEQ ID NO:499)、DOM14-3(SEQ ID NO:479)、DOM14-31 (SEQ ID NO:500)、DOM14-32(SEQ ID NO:501)、DOM14-33(SEQ ID NO:502)、DOM14-34(SEQ ID NO:503)、DOM14-35(SEQ ID NO:504)、 DOM14-36(SEQ ID NO:505)、DOM14-37(SEQ ID NO:506)、 DOM14-38(SEQ ID NO:507)、DOM14-39(SEQ ID NO:508)、DOM14-4 (SEQ ID NO:480)、DOM14-40(SEQ ID NO:509)、DOM14-41(SEQ ID NO:510)、DOM14-42(SEQ ID NO:511)、DOM14-43(SEQ ID NO:512)、 DOM14-44(SEQ ID NO:513)、DOM14-45(SEQ ID NO:514)、 DOM14-46(SEQ ID NO:515)、DOM14-47(SEQ ID NO:516)、 DOM14-48(SEQ ID NO:517)、DOM14-49(SEQ ID NO:518)、 DOM14-50(SEQ ID NO:519)、DOM14-51(SEQ ID NO:520)、 DOM14-52(SEQ ID NO:521)、DOM14-53(SEQ ID NO:522)、 DOM14-54(SEQ ID NO:523)、DOM14-55(SEQ ID NO:524)、 DOM14-56(SEQ ID NO:525)、DOM14-57(SEQ ID NO:526)、 DOM14-58(SEQ ID NO:527)、DOM14-59(SEQ ID NO:528)、 DOM14-60(SEQ ID NO:529)、DOM14-61(SEQ ID NO:530)、 DOM14-62(SEQ ID NO:531)、DOM14-63(SEQ ID NO:532)、 DOM14-64(SEQ ID NO:533)、DOM14-65(SEQ ID NO:534)、 DOM14-66(SEQ ID NO:535)、DOM14-67(SEQ ID NO:536)、 DOM14-70(SEQ ID NO:539)、DOM14-68(SEQ ID NO:537)和 DOM14-69(SEQ ID NO:538)。

在某些实施方案中，分离和/或重组核酸包含的核苷酸序列编码如 本文所述的配体，其中所述核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列具有 至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、 至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、 至少约98％或至少约99％的核苷酸序列同一性:DOM11-14(SEQ ID NO:10)、DOM11-22(SEQ ID NO:11)、DOM11-23(SEQ ID NO:3)、 DOM11-25(SEQ ID NO:12)、DOM11-26(SEQ ID NO:13)、DOM11-27 (SEQ ID NO:14)、DOM11-29(SEQ ID NO:15)、DOM11-3(SEQ ID NO:1)、DOM11-30(SEQ ID NO:2)、DOM11-31(SEQ ID NO:16)、 DOM11-32(SEQ ID NO:7)、DOM11-36(SEQ ID NO:17)、DOM11-4 (SEQ ID NO:18)、DOM11-43(SEQ ID NO:19)、DOM11-44(SEQ ID NO:20)、DOM11-45(SEQ ID NO:21)、DOM11-5(SEQ ID NO:22)、 DOM11-7(SEQ ID NO:4)、DOM11-1(SEQ ID NO:23)、DOM11-10 (SEQ ID NO:24)、DOM11-16(SEQ ID NO:25)、DOM11-2(SEQ ID NO:26)、DOM11-20(SEQ ID NO:27)、DOM11-21(SEQ ID NO:28)、 DOM11-24(SEQ ID NO:9)、DOM11-28(SEQ ID NO:29)、DOM11-33 (SEQ ID NO:30)、DOM11-34(SEQ ID NO:31)、DOM11-35(SEQ ID NO:32)、DOM11-37(SEQ ID NO:8)、DOM11-38(SEQ ID NO:5)、 DOM11-39(SEQ ID NO:6)、DOM11-41(SEQ ID NO:33)、DOM11-42 (SEQ ID NO:34)、DOM11-6(SEQ ID NO:35)、DOM11-8(SEQ ID NO:36)、DOM11-9(SEQ ID NO:37)、DOM12-1(SEQ ID NO:41)、 DOM12-15(SEQ ID NO:42)、DOM12-17(SEQ ID NO:39)、DOM12-19 (SEQ ID NO:43)、DOM12-2(SEQ ID NO:44)、DOM12-20(SEQ ID NO:45)、DOM12-21(SEQ ID NO:46)、DOM12-22(SEQ ID NO:47)、 DOM12-3(SEQ ID NO:48)、DOM12-33(SEQ ID NO:49)、DOM12-39 (SEQ ID NO:50)、DOM12-4(SEQ ID NO:51)、DOM12-40(SEQ ID NO:52)、DOM12-41(SEQ ID NO:53)、DOM12-42(SEQ ID NO:54)、 DOM12-44(SEQ ID NO:55)、DOM12-46(SEQ ID NO:56)、DOM12-6 (SEQ ID NO:57)、DOM12-7(SEQ ID NO:58)、DOM12-10(SEQ ID NO:59)、DOM12-11(SEQ ID NO:60)、DOM12-18(SEQ ID NO:61)、 DOM12-23(SEQ ID NO:62)、DOM12-24(SEQ ID NO:63)、DOM12-25 (SEQ ID NO:64)、DOM12-26(SEQ ID NO:40)、DOM12-27(SEQ ID NO:65)、DOM12-28(SEQ ID NO:66)、DOM12-29(SEQ ID NO:67)、 DOM12-30(SEQ ID NO:68)、DOM12-31(SEQ ID NO:69)、DOM12-32 (SEQ ID NO:70)、DOM12-34(SEQ ID NO:71)、DOM12-35(SEQ ID NO:72)、DOM12-36(SEQ ID NO:73)、DOM12-37(SEQ ID NO:74)、 DOM12-38(SEQ ID NO:75)、DOM12-43(SEQ ID NO:76)、DOM12-45 (SEQ ID NO:38)、DOM12-5(SEQ ID NO:77)、DOM12-8(SEQ ID NO:78)、DOM12-9(SEQ ID NO:79)、DOM13-1(SEQ ID NO:89)、 DOM13-12(SEQ ID NO:90)、DOM13-13(SEQ ID NO:91)、DOM13-14 (SEQ ID NO:92)、DOM13-15(SEQ ID NO:93)、DOM13-16(SEQ ID NO:94)、DOM13-17(SEQ ID NO:95)、DOM13-18(SEQ ID NO:96)、 DOM13-19(SEQ ID NO:97)、DOM13-2(SEQ ID NO:98)、DOM13-20 (SEQ ID NO:99)、DOM13-21(SEQ ID NO:100)、DOM13-22(SEQ ID NO:101)、DOM13-23(SEQ ID NO:102)、DOM13-24(SEQ ID NO:103)、 DOM13-25(SEQ ID NO:80)、DOM13-26(SEQ ID NO:104)、DOM13-27 (SEQ ID NO:105)、DOM13-28(SEQ ID NO:106)、DOM13-29(SEQ ID NO:104)、DOM13-3(SEQ ID NO:108)、DOM13-30(SEQ ID NO:109)、 DOM13-31(SEQ ID NO:110)、DOM13-32(SEQ ID NO:111)、 DOM13-33(SEQ ID NO:112)、DOM-13-34(SEQ ID NO:113)、 DOM13-35(SEQ ID NO:114)、DOM13-36(SEQ ID NO:115)、 DOM13-37(SEQ ID NO:116)、DOM13-4(SEQ ID NO:117)、DOM13-42 (SEQ ID NO:118)、DOM13-43(SEQ ID NO:119)、DOM13-44(SEQ ID NO:120)、DOM13-45(SEQ ID NO:121)、DOM13-46(SEQ ID NO:122)、 DOM13-47(SEQ ID NO:123)、DOM13-48(SEQ ID NO:124)、 DOM13-49(SEQ ID NO:125)、DOM13-5(SEQ ID NO:126)、DOM13-50 (SEQ ID NO:127)、DOM13-51(SEQ ID NO:128)、DOM13-52(SEQ ID NO:129)、DOM13-53(SEQ ID NO:130)、DOM13-54(SEQ ID NO:131)、 DOM13-55(SEQ ID NO:132)、DOM13-56(SEQ ID NO:133)、 DOM13-57(SEQ ID NO:81)、DOM13-58(SEQ ID NO:82)、DOM13-59 (SEQ ID NO:83)、DOM13-6(SEQ ID NO:134)、DOM13-60(SEQ ID NO:135)、DOM13-61(SEQ ID NO:136)、DOM13-62(SEQ ID NO:137)、 DOM13-63(SEQ ID NO:138)、DOM13-64(SEQ ID NO:84)、DOM13-65 (SEQ ID NO:85)、DOM13-66(SEQ ID NO:139)、DOM13-67(SEQ ID NO:140)、DOM13-68(SEQ ID NO:141)、DOM13-69(SEQ ID NO:142)、 DOM13-7(SEQ ID NO:143)、DOM13-70(SEQ ID NO:144)、DOM13-71 (SEQ ID NO:145)、DOM13-72(SEQ ID NO:146)、DOM13-73(SEQ ID NO:147)、DOM13-74(SEQ ID NO:86)、DOM13-75(SEQ ID NO:148)、 DOM13-76(SEQ ID NO:149)、DOM13-77(SEQ ID NO:150)、 DOM13-78(SEQ ID NO:151)、DOM13-79(SEQ ID NO:152)、DOM13-8 (SEQ ID NO:153)、DOM13-80(SEQ ID NO:154)、DOM13-81(SEQ ID NO:155)、DOM13-82(SEQ ID NO:156)、DOM13-83(SEQ ID NO:157)、 DOM13-84(SEQ ID NO:158)、DOM13-85(SEQ ID NO:159)、 DOM13-86(SEQ ID NO:160)、DOM13-87(SEQ ID NO:161)、 DOM13-88(SEQ ID NO:162)、DOM13-89(SEQ ID NO:163)、 DOM13-90(SEQ ID NO:164)、DOM13-91(SEQ ID NO:165)、 DOM13-92(SEQ ID NO:166)、DOM13-93(SEQ ID NO:87)、DOM13-94 (SEQ ID NO:167)、DOM13-95(SEQ ID NO:88)、DOM14-1(SEQ ID NO:176)、DOM14-10(SEQ ID NO:177)、DOM14-100(SEQ ID NO:178)、DOM14-11(SEQ ID NO:179)、DOM14-12(SEQ ID NO:180)、 DOM14-13(SEQ ID NO:181)、DOM14-14(SEQ ID NO:182)、 DOM14-15(SEQ ID NO:183)、DOM14-16(SEQ ID NO:184)、 DOM14-17(SEQ ID NO:185)、DOM14-18(SEQ ID NO:186)、 DOM14-19(SEQ ID NO:187)、DOM14-2(SEQ ID NO:188)、DOM14-20 (SEQ ID NO:189)、DOM14-21(SEQ ID NO:190)、DOM14-22(SEQ ID NO:191)、DOM14-23(SEQ ID NO:168)、DOM14-24(SEQ ID NO:192)、 DOM14-25(SEQ ID NO:193)、DOM14-26(SEQ ID NO:194)、 DOM14-27(SEQ ID NO:195)、DOM14-28(SEQ ID NO:196)、DOM14-3 (SEQ ID NO:197)、DOM14-31(SEQ ID NO:198)、DOM14-32(SEQ ID NO:199)、DOM14-33(SEQ ID NO:200)、DOM14-34(SEQ ID NO:201)、 DOM14-35(SEQ ID NO:202)、DOM14-36(SEQ ID NO:203)、 DOM14-37(SEQ ID NO:204)、DOM14-38(SEQ ID NO:205)、 DOM14-39(SEQ ID NO:206)、DOM14-4(SEQ ID NO:207)、DOM14-40 (SEQ ID NO:208)、DOM14-41(SEQ ID NO:209)、DOM14-42(SEQ ID NO:210)、DOM14-43(SEQ ID NO:211)、DOM14-44(SEQ ID NO:212)、 DOM14-45(SEQ ID NO:213)、DOM14-46(SEQ ID NO:214)、 DOM14-47(SEQ ID NO:215)、DOM14-48(SEQ ID NO:169)、 DOM14-49(SEQ ID NO:216)、DOM14-50(SEQ ID NO:217)、 DOM14-51(SEQ ID NO:218)、DOM14-52(SEQ ID NO:219)、 DOM14-53(SEQ ID NO:220)、DOM14-54(SEQ ID NO:221)、 DOM14-55(SEQ ID NO:222)、DOM14-56(SEQ ID NO:170)、 DOM14-57(SEQ ID NO:171)、DOM14-58(SEQ ID NO:223)、 DOM14-59(SEQ ID NO:224)、DOM14-60(SEQ ID NO:225)、 DOM14-61(SEQ ID NO:226)、DOM14-62(SEQ ID NO:172)、 DOM14-63(SEQ ID NO:173)、DOM14-64(SEQ ID NO:227)、 DOM14-65(SEQ ID NO:228)、DOM14-66(SEQ ID NO:229)、 DOM14-67(SEQ ID NO:230)、DOM14-70(SEQ ID NO:175)、 DOM14-68(SEQ ID NO:174)和DOM14-69(SEQ ID NO:231)。

本发明还提供包含本发明的重组核酸分子的载体。在某些实施方 案中，所述载体为含有一个或多个与本发明的重组核酸有效连接的表 达控制元件或序列的表达载体。本发明还提供包含本发明的重组核酸 分子或载体的重组宿主细胞。合适的载体(例如质粒、噬菌粒)、表达 控制元件、宿主细胞和生产本发明的重组宿主细胞的方法在本领域众 所周知，本文进一步描述了实例。

合适的表达载体可包含许多元件，例如复制起点、选择标记基因、 一个或多个表达控制元件(例如转录控制元件(例如启动子、增强子、 终止子))和/或一个或多个翻译信号、信号序列或前导序列等。表达控 制元件和信号序列如果存在的话，则可由载体或其它来源提供。例如， 编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列可用于指导表达。

可提供用于在期望的宿主细胞中表达的启动子。启动子可以是组 成型的或诱导型的。例如，启动子可与编码抗体、抗体链或其部分的 核酸有效连接，使得其指导核酸的转录。可获得多种适于原核宿主的 启动子(例如大肠杆菌的lac、tac、T3、T7启动子)和适于真核宿主的 启动子(例如猿猴病毒40早期或晚期启动子、劳斯肉瘤病毒长末端重 复序列启动子、巨细胞病毒启动子、腺病毒晚期启动子)。

另外，表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标 记，就复制型表达载体而言，还包含复制起点。赋予抗生素或药物抗 性的基因编码产物是常用的选择标记，可用于原核细胞(例如内酰胺酶 基因(氨苄青霉素抗性)、用于四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(例如 新霉素(G418或遗传霉素)、gpt(霉酚酸)、氨苄青霉素或潮霉素抗性基 因)。二氢叶酸还原酶标记基因允许用甲氨蝶呤在多种宿主中进行选 择。编码宿主的营养缺陷型标记的基因产物的基因(例如LEU2、URA3、 HIS3)经常在酵母中用作选择标记。还考虑了病毒(例如杆状病毒)或噬 菌体载体以及能够整合入宿主细胞基因组中的载体(例如逆转录病毒 载体)的应用。适于在哺乳动物细胞和原核细胞(大肠杆菌)、昆虫细胞 (果蝇Schnieder S2细胞、Sf9)和酵母(甲醇毕赤酵母(P.methanolica)、 巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的表达载 体在本领域众所周知。

合适的宿主细胞可以是原核细胞，包括细菌细胞，例如大肠杆菌 (E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和/或其它合适的细菌；真核细胞， 例如真菌或酵母细胞(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉 (Aspergillus sp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa))或其它 低等真核生物的细胞，以及高等真核生物的细胞，例如昆虫细胞(例如 果蝇Schnieder S2细胞、Sf9昆虫细胞(WO 94/26087(O’Connor))、哺 乳动物细胞(例如COS细胞，例如COS-1(ATCC保藏号CRL-1650) 和COS-7(ATCC保藏号CRL-1651)、CHO(例如ATCC保藏号 CRL-9096，CHO DG44(Urlaub，G.和Chasin，LA.，Proc.Natl.Acac.Sci. USA，77(7):4216-4220(1980)))、293(ATCC保藏号No.CRL-1573)、 HeLa(ATCC保藏号CCL-2)、CV1(ATCC保藏号CCL-70)、WOP (Dailey，L.等，J.Virol，54:739-749(1985)、3T3、293T(Pear，W.S.等， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90:8392-8396(1993))、NS0细胞、SP2/0、 HuT 78细胞等，或植物细胞(例如烟草细胞)。(参见例如Ausubel，F.M. 等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.(1993))。在某些实施方案中，宿 主细胞为分离的宿主细胞，不是多细胞生物(例如植物或动物)的组成 部分。在优选的实施方案中，宿主细胞为非人宿主细胞。

本发明还提供生产本发明配体(例如双特异性配体、多特异性配 体)的方法，该方法包括将包含本发明重组核酸的重组宿主细胞在适于 表达重组核酸的条件下进行培养，由此表达重组核酸并产生配体。在 某些实施方案中，该方法还包括分离出配体。

基于免疫球蛋白的配体的制备

本发明的配体(例如双特异性配体、多特异性配体)可按照抗体工 程领域中用于制备scFv、“噬菌体”抗体和其它的工程抗体分子的先 前建立的技术来制备。抗体的制备技术例如描述于以下综述及其中所 引用的参考文献:Winter和Milstein，(1991)Nature 349:293-299； Pluckthun(1992)Immunological Reviews 130:151-188；Wright等(1992) Crti.Rev.Immunol.，12:125-168；Holliger，P.和Winter，G.(1993)Curr. Op.Biotechn.，4，446-449；Carter等(1995)J.Hematother.，4，463-470； Chester，K.A.和Hawkins，R.E.(1995)Trends Biotechn.，13，294-300； Hoogenboom，H.R.(1997)Nature Biotechnol.，15，125-126；Fearon，D. (1997)Nature Biotechnol.，15，618-619；Plückthun，A.和Pack，P.(1997) Immunotechnology 3，83-105；Carter，P.和Merchant，A.M.(1997)Curr. Opin.Biotechnol.，8，449-454；Holliger，P.和Winter，G.(1997)Cancer Immunol.Immunother.，45，128-130。

适用于选择具有所需特异性的抗体可变区的技术采用本领域已 知的文库和选择程序。采用从人B细胞收获的重排V基因的天然文库 (Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222:581；Vaughan等(1996)Nature Biotech.，14:309)是本领域技术人员众所周知的。合成文库 (Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227:381；Barbas等(1992) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89:4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13: 692；Griffiths等(1994)EMBO J.，13:3245；De Kruif等(1995)J.Mol. Biol.，248:97)通常采用PCR通过克隆免疫球蛋白V基因制备。PCR 过程中的错误可导致高度随机化。可单独地(在此情况下直接选择单域 结合)或一起选择针对靶抗原或表位的VH和/或VL文库。

文库载体系统

适用于本发明的各种选择系统是本领域已知的。这些系统的实例 如下所述。

可以直接筛选噬菌体λ表达系统的噬菌斑或溶原体的菌落，这两 者先前都有描述(Huse等(1989)Science，246:1275；Caton和Koprowski (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax等(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，87:8095；Persson等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，88:2432)，可用于本发明。尽管这样的表达系统可以用于筛选 多达106个不同文库成员，但是它们确实不适合筛选更大数量(大于106 个成员)。文库构建中特别有用的是选择展示系统，所述系统使所连接 的核酸能够表达为多肽。本文所用的选择展示系统是允许通过合适展 示方法选择结合通用配体和/或靶配体的各个文库成员的系统。

从大文库中分离出所需成员的选择方案是本领域已知的，以噬菌 体展示技术为代表。这些将多样化肽序列展示在丝状噬菌体表面的系 统(Scott和Smith(1990)Science，249:386)，已经证明可用于产生抗体 片段(及编码它们的核苷酸序列)的文库，用于体外选择和扩增结合靶 抗原的特异性抗体片段(McCafferty等，WO 92/01047)。编码可变区的 核苷酸序列连接到编码前导信号的基因片段上，所述前导信号可指导 它们到达大肠杆菌的壁膜间隙，结果所得抗体片段展示在噬菌体表 面，通常是与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合。或者，抗体片 段向外展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的优势 在于:因为它们是生物系统，所以可以仅通过将含有所选文库成员的 噬菌体在细菌细胞中培养来扩增所选文库成员。此外，因为编码多肽 文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上，所以测序、表 达和其后的遗传操作相对直接。

噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的构建方法在本领域众 所周知(McCafferty等(1990)Nature，348:552；Kang等(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88:4363；Clackson等(1991)Nature，352:624； Lowman等(1991)Biochemistry，30:10832；Burton等(1991)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.，88:10134；Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.， 19:4133；Chang等(1991)J.Immunol.，147:3610；Breitling等(1991) Gene，104:147；Marks等(1991)，出处同上；Barbas等(1992)，出处同 上；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22:867；Marks等，1992，J. Biol.Chem.，267:16007；Lerner等(1992)Science，258:1313，所述文献 通过引用结合到本文中)。

一个特别具有优势的方法是使用scFv噬菌体文库(Huston等， 1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85:5879-5883；Chaudhary等(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87:1066-1070；McCafferty等(1990)，出处 同上；Clackson等(1991)Nature，352:624；Marks等(1991)J.Mol.Biol.， 222:581；Chiswell等(1992)Trends Biotech.，10:80；Marks等(1992)J. Biol.Chem.，267)。在噬菌体外壳蛋白上展示的scFv文库的各种实施 方案已有描述。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如参见 WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等)以及 WO97/08320(Morphosys)，所述文献通过引用结合到本文中。

产生多肽文库的其它系统包括使用无细胞酶促机制，用于体外合 成文库成员。在一个方法中，通过交替多轮的针对靶的选择和PCR扩 增来选择RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Science，249:505；Ellington 和Szostak(1990)Nature，346:818)。一项类似技术可用于鉴定结合预 定的人转录因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)Nucleic Acids Res.， 18:3203；Beaudry和Joyce(1992)Science，257:635；WO92/05258和 WO92/14843)。以类似方式，体外翻译可用于合成多肽，这作为产生 大文库的方法。这些通常包括稳定的多核糖体复合物的方法进一步描 述于WO88/08453、WO90/05785、WO90/07003、WO91/02076、 WO91/05058和WO92/02536。并非基于噬菌体的替代展示系统，例如 那些公开于WO95/22625和WO95/11922(Affymax)的系统，采用多核 糖体来展示多肽，用于选择。

还有一类技术包括对人工区室中的库的选择，这允许将基因与其 基因产物联系起来。例如，其中可在由油包水乳剂形成的微囊中选择 编码所需基因产物的核酸的选择系统描述于WO99/02671、 WO00/40712以及Tawfik和Griffiths(1998)Nature Biotechnol 16(7)， 652-6。将编码具有所需活性的基因产物的遗传元件在微囊中区室化， 然后在微囊内转录和/或翻译，以产生它们相应的基因产物(RNA或蛋 白质)。随后分选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。该方法通 过多种手段检测所需活性而选择目标基因产物。

文库构建

用于选择的文库可以采用例如以上提出的本领域已知技术构建， 或者可以从商业来源购买。可用于本发明的文库描述于例如 WO99/20749。一旦选定载体系统并将一个或多个编码目标多肽的核酸 序列克隆到文库载体中，通过在表达前进行诱变，就可以在克隆分子 内产生多样性；或者，可以在诱变和另外的多轮选择进行之前如上所 述表达并选择所编码的蛋白质。按照标准分子方法，对编码结构优化 多肽的核酸序列进行诱变。特别有用的是聚合酶链式反应即PCR (Mullis和Faloona(1987)Methods Enzymol，155:335，所述文献通过引 用结合到本文中)。PCR是本领域众所周知的，它采用由热稳定的DNA 依赖性DNA聚合酶催化的多轮DNA复制，来扩增目标靶序列。各种 抗体文库的构建已论述于Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology，12， 433-55及其中引用的参考文献。

用模板DNA(至少1fg；更有用的为1-1000ng)和至少25pmol 寡核苷酸引物进行PCR；当引物库(primer pool)非常不均一时，最好 采用较大量引物，因为各序列仅由少量引物库分子作为代表，而且数 量在随后的扩增循环中成为限制。通常反应混合物包括:2μl DNA、 25pmol寡核苷酸引物、2.5μl 10X PCR缓冲液1(Perkin-Elmer，Foster City，CA)、0.4μl1.25μM dNTP、0.15μl(或2.5单位)Taq DNA聚合 酶(Perkin Elmer，Foster City，CA)和去离子水，至总体积为25μl。覆盖 矿物油，用可编程热循环仪进行PCR。PCR循环中各步骤的长度和温 度以及循环次数，按照实际所需的严格性来调整。退火温度和时间由 预计引物与模板退火的效率和可耐受的错配程度这二者而定；显然， 当核酸分子同时扩增和诱变时，错配是必需的，至少在合成的第一轮。 优化引物退火条件的严格性的能力完全属于本领域中等技术人员的 知识范围。采用的退火温度在30℃和72℃之间。模板分子开始变性 通常发生在92℃和99℃之间达4分钟，再是20-40次循环，循环由变 性(94-99℃ 15秒至1分钟)、退火(如上所述确定的温度；1-2分钟)和 延伸(72℃ 1-5分钟，取决于扩增产物的长度)组成。最终延伸通常72℃ 4分钟，可后接于4℃的不确定(0-24小时)步骤。

组合单可变区

本发明所用的结构域，一旦选出就可以通过本领域已知的各种方 法组合，包括共价和非共价方法。优选的方法包括采用如上所述的多 肽接头，例如连接scFv分子(Bird等(1988)Science 242:423-426)。有 关合适接头的讨论参见Bird等，Science 242，423-426；Hudson等， Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc.Nat. Acad Sci.USA，85，5879-5883。接头优选是柔性的，允许两个单域相互 作用。一个接头的实例是(Gly4Ser)n接头，其中n＝1-8，例如2、3、4、 5或7。也可采用双链抗体中使用的接头(其柔性较差)(Holliger等(1993) Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)90:6444-6448)。在一个实施方案中，所用 的接头不是免疫球蛋白铰链区。

可变区可采用不用接头的方法而组合。例如，可以开发二硫桥的 用途(所述二硫桥是通过天然存在的或改造的半胱氨酸残基而提供 的)，以便稳定VH-VH、VL-VL或VH-VL二聚体(Reiter等(1994)Protein Eng.，7:697-704)，或者通过可变区之间界面的重构以改善“适合性 (fit)”，因而改善相互作用的稳定性(Ridgeway等(1996)Protein Eng.7: 617-621；Zhu等(1997)Protein Science 6:781-788)。如果适当的话，可 以使用用于连接或稳定免疫球蛋白可变区、尤其是抗体VH区的其它 技术。

配体特征

双特异性配体与细胞的结合或者每个结合域与每个特异性靶的 结合可以用本领域技术人员熟知的方法来测定，该方法包括ELISA。 在本发明的一个优选的实施方案中，采用单克隆噬菌体ELISA来测定 结合。可以按照任何合适方法进行噬菌体ELISA:示例性方案如下。

可以通过ELISA筛选每轮选择中产生的、与所选抗原或表位结 合的噬菌体群体，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后可通过ELISA 筛选来自这些群体中单个受感染细菌菌落的噬菌体，以鉴定“单克隆” 噬菌体抗体。还需要筛选结合抗原或表位的可溶性抗体片段，这也可 通过ELISA、采用例如针对C-端或N-端标记的试剂来进行(参见例如 Winter等(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55及其中引用的参考文 献。

可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等1991，出处同上；Nissim 等1994，出处同上)、探测(Tomlinson等，1992)J.Mol.Biol.227，776) 或通过载体DNA测序，来评价所选噬菌体单克隆抗体的多样性。

配体结构

在例如采用本文所述的噬菌体展示技术从V基因库中选出每个 可变区的情况下，这些可变区包含通用构架区，使得它们可以被本文 定义的特异性通用双特异性配体所识别。通用构架、通用配体等的用 途描述于WO 99/20749。

当使用V基因库时，多肽序列中的变异优选位于可变区结构环 内。各可变区的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变，以 便增强各可变区与其互补对的相互作用。DNA改组是本领域已知的， 参见例如Stemmer，1994，Nature 370:389-391和美国专利第6,297,053 号，所述文献都通过引用结合到本文中。其它诱变方法也是本领域技 术人员众所周知的。

一般而言，可以按照标准实验室手册(例如Sambrook等(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA)的 陈述，构建并操作用于选择、制备和形成双特异性配体所需的核酸分 子和载体构建体。

本发明所用的核酸的操作通常在重组载体中进行。本文所用的载 体是指这样的分离元件:所述元件用于将异源DNA引入用于其表达 和/或复制的细胞中。选择或构建以及随后使用所述载体的方法是本领 域普通技术人员众所周知的。大量载体是公众可得的，包括细菌质粒、 噬菌体、人工染色体和附加型载体。这类载体可用于简单的克隆和诱 变；或者采用基因表达载体。可以选择本发明所用的载体，以适应所 需大小的多肽编码序列，长度通常为0.25千碱基对(kb)至40kb或更 大。体外克隆操作后，用载体转化合适的宿主细胞。各载体含有不同 的功能性组件，通常包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少 一个选择标记基因。如果给定的载体是表达载体，它还可具有一个或 多个以下元件:增强子元件、启动子、转录终止序列和信号序列，每 个都位于克隆位点附近，使得它们与编码本发明的双特异性配体的基 因有效连接。

克隆载体和表达载体一般都含有使载体在一种或多种所选宿主 细胞中能复制的核酸序列。通常在克隆载体中，该序列使载体独立于 宿主染色体DNA而复制，并且包含复制起点或自主复制序列。这类 序列众所周知可用于多种多样的细菌、酵母和病毒。质粒pBR322的 复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而 各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物细胞中的克隆载 体。通常，复制起点对哺乳动物表达载体而言是不需要的，除非这些 起点用于能高水平复制DNA的哺乳动物细胞，例如COS细胞。

最好克隆载体或表达载体可含有选择基因，也称为选择标记。该 基因编码在选择培养基中培养的转化宿主细胞存活或生长所必需的 蛋白质。因此，没有被含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在 培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质赋予抗生素抗性和其它 毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性，补充 营养缺陷，或提供生长培养基中所没有的关键营养物。

因为编码本发明的双特异性配体的载体的复制在大肠杆菌中最 便利进行，所以采用大肠杆菌选择标记，例如赋予抗生素氨苄青霉素 抗性的β-内酰胺酶基因。这些选择标记可以得自大肠杆菌质粒，例如 pBR322或pUC质粒，例如pUC18或pUC19。

表达载体通常含有宿主生物可识别的启动子，并且该启动子与目 标编码序列有效连接。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。术语 “有效连接”是指并置方式使所述组件的关系允许它们以既定方式起 作用。控制序列与编码序列“有效连接”是指连接方式使得在与控制 序列相容的条件下可实现编码序列的表达。

适用于原核宿主的启动子包括例如β-内酰胺酶和乳糖启动子系 统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子(例如tac启动 子)。用于细菌系统的启动子一般还含有与编码序列有效连接的SD序 列(Shine-Delgarno sequence)。

优选的载体是能表达对应于多肽文库成员的核苷酸序列的表达 载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆的单独增殖和表 达或者通过使用任何选择展示系统，用第一和/或第二抗原或表位进行 选择。如上所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使 用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列 包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是具有大肠杆 菌复制起点(用于双链复制)以及噬菌体复制起点(用于产生单链DNA) 的噬菌粒载体。这类载体的操作和表达是本领域众所周知的 (Hoogenboom和Winter(1992)，出处同上；Nissim等(1994)，出处同 上)。简而言之，该载体含有β-内酰胺酶基因(以便赋予噬菌粒选择性) 和表达盒上游的lac启动子，后者由以下部分组成(N端→C端):pelB 前导序列(将表达多肽引导到壁膜间隙)、多克隆位点(用于克隆核苷酸 形式的文库成员)、任选一个或多个肽标记(用于检测)、任选一个或多 个TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的不同抑 制菌株和非抑制菌株，并且添加葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (IPTG)或辅助噬菌体(例如VCS M13)，载体能够作为质粒进行复制， 但却不表达，仅产生大量多肽文库成员或产生噬菌体，它们中的一些 在其表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。

编码本发明的双特异性配体的载体的构建采用常规连接技术。分 离的载体或DNA片段被切割、修饰并重新连接成产生所需载体需要 的形式。如有需要，可以用已知方式进行分析，以证实所构建的载体 中存在正确序列。适于构建表达载体、制备体外转录物、将DNA引 入宿主细胞以及进行评价表达和功能的分析的方法是本领域技术人 员已知的。通过常规方法，例如DNA或RNA印迹分析、蛋白质印迹、 DNA、RNA或蛋白质的斑点印迹、原位杂交、免疫细胞化学或者核 酸或蛋白质分子的测序分析，检测样品中存在的基因序列，或定量其 扩增和/或表达。如有需要，本领域技术人员会容易地知道如何改进这 些方法。

骨架

骨架可以基于免疫球蛋白分子，或者可以是如上所述来源的非免 疫球蛋白。双特异性配体的每个区都可以为不同骨架。如本文定义的 优选免疫球蛋白骨架包括任何一个或多个选自以下的骨架:至少包含 以下部分的免疫球蛋白分子:(i)抗体的CL(κ或λ亚类)区；或(ii)抗体 重链的CH1区；包含抗体重链CH1区和CH2区的免疫球蛋白分子； 包含抗体重链CH1区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白分子；或任何 (ii)亚类以及抗体的CL(κ或λ亚类)区。也可以包含铰链区域。这样的 各区组合可以例如模拟天然抗体，例如IgG或IgM或其片段，例如 Fv、scFv、Fab或F(ab’)2分子。本领域技术人员知道，该名单并非是 详尽而无遗漏的。

蛋白质支架

各结合域包含蛋白质支架和一个或多个CDR，它们参与结构域与 一个或多个表位的特异性相互作用。最好本发明的表位结合域包含3 个CDR。合适的蛋白质支架包括选自以下的任何支架:基于免疫球蛋 白结构域的支架、基于纤连蛋白的支架、基于亲和体的支架、基于 CTLA4的支架、基于伴侣分子例如GroEL的支架、基于脂质运载蛋 白的支架和基于细菌Fc受体SpA和SpD的支架。本领域技术人员可 以理解，该名单并非是详尽而无遗漏的。

用于构建配体的支架

主链构象的选择

免疫球蛋白超家族成员都共享其多肽链的类似折叠。例如，尽管 抗体在其一级序列上具有高度多样性，但是序列比较和晶体学结构已 揭示，与预期相反，抗体的6个抗原结合环中有5个(H1、H2、L1、 L2、L3)采用数目有限的主链构象或正则结构(Chothia和Lesk(1987)J. Mol.Biol.，196:901；Chothia等(1989)Nature，342:877)。因此，分析 环长度和关键残基能够预测在大多数人抗体中存在的H1、H2、L1、 L2和L3的主链构象(Chothia等(1992)J.Mol.Biol.，227:799； Tomlinson等(1995)EMBO J.，14:4628；Williams等(1996)J.Mol.Biol.， 264:220)。尽管H3区在序列、长度和结构上更具多样性(因为使用D 区段)，但是它也构成数目有限的短环长度的主链构象，这取决于环及 抗体构架的关键位置上特定残基的长度和存在与否或残基种类 (Martin等(1996)J.Mol.Biol.，263:800；Shirai等(1996)FEBS Letters， 399:1)。

可设计配体和/或结构域文库，其中已选择出某些环长度和关键残 基，以保证各成员的主链构象是已知的。如上所述，最好这些是天然 存在的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机 会降至最低。种系V基因区段用作一个合适的基本构架，用于构建抗 体或T细胞受体文库；也可使用其它序列。可以低频率发生变异，使 得少量功能性成员可具有改变的主链构象，这样的改变并不影响其功 能。

正则结构理论也用于评价配体所编码的不同主链构象的数目，以 预测基于双特异性配体序列的主链构象并选择不影响正则结构的用 于多样化的残基。已经知道，在人Vκ区中，L1环可采用4种正则结 构之一，L2环具有一种正则结构，而且90％的人Vκ区的L3环采用4 或5种正则结构之一(Tomlinson等(1995)，出处同上)；因此，仅在Vκ 区，不同正则结构就可组合产生一系列不同的主链构象。假定Vλ区为 L1、L2和L3环编码不同系列的正则结构，且Vκ区和Vλ区可与任何 VH区(其可为H1和H2环编码几种正则结构)配对，则这5个环所观察 到的正则结构组合数量将会非常庞大。这表明主链构象多样性的产生 对产生广泛范围的结合特异性来说可能是必不可少的。然而，通过构 建基于一种已知主链构象的抗体文库，已经发现，与预期相反，主链 构象的多样性并非是产生足以靶向几乎所有抗原的多样性所必需的。 甚至更令人吃惊的是，该单一主链构象不一定是共有结构，共有结构 是可以用作整个文库基础的一种天然构象。因此，在优选方面，本发 明的配体具有一种已知主链构象。

所选的一种主链构象优选在所述免疫球蛋白超家族类型的分子 中是常见的。当观察到大量天然存在的分子采用某种构象时，该构象 是常见的。因此，在本发明的优选方面，单独考虑免疫球蛋白结构域 的各结合环的不同主链构象的天然发生率，然后选择具有不同环的主 链构象所需组合的天然存在的可变区。如果没有可用的，则可选择最 接近的等同物。优选不同环的主链构象的所需组合是由所选种系基因 区段(其编码所需主链构象)产生的。更优选所选种系基因区段在自然 界频繁表达，最优选它们在所有天然种系基因区段中是最频繁表达 的。

在设计配体(例如ds-dAb)或其文库时，可以单独考虑6个抗原结 合环中每一个的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和 L3，选择被20％至100％的天然分子抗原结合环所采用的给定构象。 通常观察到发生率在35％以上(即介于35％和100％之间)、理想地在 50％以上乃至65％以上。因为绝大多数H3环没有正则结构，所以优 先选择在确实展示正则结构的环中常见的主链构象。因此，对于每个 环来说，选择天然库中最常观察到的构象。在人抗体中，各环最常见 的正则结构(CS)如下:H1-CS 1(表达库的79％)、H2-CS 3(46％)、 L1-Vκ的CS 2(39％)、L2-CS 1(100％)、L3-Vκ的CS 1(36％)(计算 假定κ:λ的比例为70:30，Hood等(1967)Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.，48:133)。对于具有正则结构的H3环而言，具有从残基 94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等(1991) Sequences of proteins of immunological interest，美国健康和人类服务 部)看来是最常见的。EMBL数据文库中至少有16个人类抗体序列具 有构成该构象所需的H3长度和关键残基，并且在蛋白质数据库中至 少有两个晶体结构可用作抗体建模的基础(2cgr和ltet)。最常表达的种 系基因区段的正则结构组合是VH区段3-23(DP-47)、JH区段JH4b、 Vκ区段O2/O12(DPK9)和Jκ区段Jκ1。VH区段DP45和DP38也是合适 的。因此，这些区段可用于组合，作为构建具有所需单一主链构象的 文库的基础。

或者，并非根据分离的各结合环的不同主链构象的天然发生率来 选择单一主链构象，而是采用主链构象组合的天然发生率作为选择单 一主链构象的基础。就抗体而言，例如，可以确定任何2、3、4、5 或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然发生率。在此，优选所 选构象在天然存在的抗体中是常见的，最优选它是天然库中最常观察 到的。因此，在人抗体中，例如当考虑H1、H2、L1、L2和L3五个 抗原结合环的天然组合时，确定最常见的正则结构的组合，然后结合 最常见的H3环构象，作为选择单一主链构象的基础。

正则序列的多样化

如果具有所选几种已知的主链构象或者优选单一已知主链构象， 可以通过改变分子的每个结合位点，构建本发明的双特异性配体(例如 ds-dAb)或本发明所用的文库，以便产生具有结构和/或功能多样性的 库。这表明，产生变异体，使得它们在其结构和/或功能上具有足够的 多样性，使得它们能够提供一系列活性。

所需多样性通常是通过在一个或多个位置上改变所选分子而产 生的。可以随机或优选选择要改变的位置。然后，可以如下达到变异: 通过随机化(其间残余氨基酸被任何氨基酸或其类似物(天然或合成的) 所取代)，产生数量非常大的变异体；或者通过用一个或多个氨基酸的 限定亚类来取代残余氨基酸，产生数目更有限的变异体。

已经报道了多种用于引入这样的多样性的方法。易错PCR (Hawkins等(1992)J.Mol.Biol.，226:889)、化学诱变(Deng等(1994)J. Biol.Chem.，269:9533)或细菌突变菌株(Low等(1996)J.Mol.Biol.，260: 359)可用于将随机突变引入编码分子的基因内。使所选位置发生突变 的方法也是本领域众所周知的，包括使用错配寡核苷酸或简并寡核苷 酸，使用或不使用PCR。例如，通过抗原结合环的定向突变，已经产 生了一些合成抗体文库。使结合人破伤风类毒素的Fab的H3区随机 化，以便产生一系列新的结合特异性(Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，89:4457)。随机或半随机H3和L3区已经附加到种系V基 因区段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter (1992)J.Mol.Biol.，227:381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.，89:4457；Nissim等(1994)EMBO J.，13:692；Griffiths等(1994) EMBO J.，13:3245；De Kruif等(1995)J.Mol.Biol.，248:97)。这样的多 样化已延伸至包括某些或所有其它抗原结合环(Crameri等(1996) Nature Med.，2:100；Riechmann等(1995)Bio/Technology，13:475； Morphosys，WO97/08320，出处同上)。

因为环随机化仅对H3就具有产生约超过1015种结构的潜力，而 对其它5个环也具有产生类似的大数量变异体的潜力，所以不能通过 使用现有的转化技术乃至使用无细胞系统来产生代表所有可能组合 的文库。例如，在迄今为止所构建的最大文库之一中，产生6×1010 个不同抗体，这仅仅是该设计文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等 (1994)，出处同上)。

优选地，只有直接参与产生或修饰双特异性配体分子的每个结构 域所需功能的残基，才被多样化。对于许多分子而言，每个结构域的 功能是要结合靶标的，因此，多样性应该集中在靶结合位点中，而避 免改变对分子总体包装或保持所选主链构象来说必不可少的残基。

正则序列在用于抗体域时的多样化

就基于抗体的配体(例如ds-dAb)而言，每个靶的结合位点都是最 常见的抗原结合位点。因此，优选只有在抗原结合位点的那些残基才 改变。在人抗体库中，这些残基极端多样性，已知让其接触高分辨率 抗体/抗原复合物。例如，在L2中，已知位置50和53在天然存在的 抗体中是不同的，并且观察到它们与抗原接触。相比之下，常规方法 应当已经使相应互补决定区(CDR1)(如Kabat等(1991，出处同上)定义) 中的所有残基多样化，与本发明所用的文库中多样化的两个相比有约 七个残基。这显示了产生一系列抗原结合特异性所需的功能多样性的 显著改善。

在自然界，抗体多样性是两个过程的结果:种系V、D和J基因 区段的体细胞重组，产生幼稚(naive)初级库(所谓的种系和连接多样 性)；以及所得重排V基因的体细胞高变。人类抗体序列的分析已表 明，初级库中的多样性集中在抗原结合位点的中心，而体细胞高变则 将多样性扩散到抗原结合位点周围的区域，而这些区域在初级库中是 高度保守的(参见Tomlinson等(1996)J.Mol.Biol.，256:813)。此互补性 可能逐渐成为检索序列空间的有效策略，而且，尽管显然是抗体所特 有的，但是它也可容易地用于其它多肽库。改变的残基是构成靶的结 合位点的残基的亚类。如有需要，在选择期间的不同时期，改变靶结 合位点中残基的不同(包括重叠)亚类。

就抗体库而言，可产生起始“幼稚”库(initial“naive”repertoire)， 其中抗原结合位点的某些而不是全部的残基出现多样化。在这种情况 下，本文所用的术语“幼稚(naive)”是指没有预定靶标的抗体分子。 这些分子类似于没有经历免疫多样化的个体(胎儿和新生儿个体就是 这种情况)的免疫球蛋白基因所编码的那些分子，所述个体的免疫系统 尚未受到各种抗原性刺激的攻击。然后，针对一系列抗原或表位来选 择该库。如有需要，还可在起始库中被多样化的区域之外引入其它多 样性。可以选择具有修饰功能、特异性或亲和力的这种成熟的库。

用于构建其中抗原结合位点中的某些或所有残基都已改变的双 特异性配体的结合域幼稚库是本领域已知的。(参见WO 2004/058821、 WO 2004/003019和WO03/002609)。“初级”文库模拟天然初级库， 其多样性限于抗原结合位点中心的残基，它们在种系V基因区段中具 有多样性(种系多样性)，或者在重组过程中被赋予多样性(连接多样 性)。这些多样化的残基包括但不限于H50、H52、H52a、H53、H55、 H56、H58、H95、H96、H97、H98、L50、L53、L91、L92、L93、 L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于重组过程中多样化 的残基(连接多样性)或者是高度体细胞突变的。这些多样化的残基包 括但不限于H31、H33、H35、H95、H96、H97、H98、L30、L31、 L32、L34和L96。已知适于这些文库多样性的以上列出的所有残基都 接触一个或多个抗体-抗原复合物。因为在这两种文库中，抗原结合位 点中并非所有残基都改变，在选择当中，通过改变剩余残基而掺入另 外的多样性，如果需要这样做的话。对本领域技术人员显而易见的是， 任何这些残基(或者包括抗原结合位点的其它残基)的任何亚类都可以 用于抗原结合位点的起始和/或后来的多样化。

在用于本发明的文库构建中，所选位置的多样化通常是在核酸水 平上进行，即通过改变指定多肽序列的编码序列，使得许多可能的氨 基酸(所有20种或其亚类)可以在该位置掺入。采用IUPAC命名法， 最通用的密码子是NNK，它编码所有氨基酸以及TAG终止密码子。 优选使用NNK密码子，以便引入所需多样性。也可以使用达到相同 末端的其它密码子，包括NNN密码子，该密码子导致产生额外的终 止密码子TGA和TAA。

人抗体的抗原结合位点中侧链多样性的特征明显对某些氨基酸 残基有偏倚。如果统计每个VH、Vκ和Vλ区中的10个最多变的位置的 氨基酸组成，则超过76％的侧链多样性来自仅7个不同残基，它们是 丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸 (7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种针对可提供主链柔性的亲水 性残基和小残基的偏倚可能反映了倾向于结合广泛范围的抗原或表 位的表面进化，并且可能有助于解释初级库中所需的抗体混杂。

因为优选模拟这样的氨基酸分布，所以在有待改变位置上的氨基 酸分布优选模拟在抗体的抗原结合位点所见到的那些。这种允许针对 一系列靶抗原选择某些多肽(不仅是抗体多肽)的氨基酸取代中的偏 倚，易于用于任何多肽库。有多种方法用于在有待改变的位置上使氨 基酸分布发生偏倚(包括使用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，其中 优选的方法因易于合成而采用常规简并密码子。通过比较由简并密码 子所有组合所编码的氨基酸分布型(在各位置上具有等比例的单、双、 三和四重简并性)与天然氨基酸的使用，可以计算出最具代表性的密码 子。密码子(AGT)(AGC)T、(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)，即使 用IUPAC命名法分别为DVT、DVC和DVY，就是最接近所需氨基 酸分布型的密码子:它们编码22％的丝氨酸以及11％的酪氨酸、天冬 酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选 的文库是在各多样化位置上用DVT、DVC或DVY密码子构建的。

治疗和诊断组合物及其用途

本发明提供包含本发明的配体和药学上可接受的载体、稀释剂或 赋形剂的组合物，以及使用本发明配体或组合物的治疗和诊断方法。 本发明方法的配体可用于体内治疗和预防用途、体内诊断用途等。

本发明配体的治疗和预防用途包括将本发明配体给予受体哺乳 动物，例如人。这样的配体以高亲合力结合靶。在某些实施方案中， 配体可使两个靶交联，例如在募集的细胞毒T细胞中，从而介导肿瘤 细胞系的杀伤。

优选将至少90-95％同质性(homogeneity)的大致纯的配体(例如 ds-dAb)给予哺乳动物，最优选98-99％以上同质性供药用，尤其是当 哺乳动物是人时。一旦部分纯化或纯化至所需同质性，配体就可用于 诊断或治疗(包括离体)或用于开发和实施测定方法、免疫荧光染色等 (Lefkovite和Pernis，(1979和1981)Immunological Methods，第I和II 卷，Academic Press，NY)。

例如，本发明的配体通常可用于预防、抑制或治疗疾病状态。例 如，可以给予配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病、变应性超敏 反应、癌症、细菌性或病毒性感染、自身免疫性疾病(包括但不限于I 型糖尿病、哮喘、多发性硬化、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关 节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节病(spondylarthropathy)(例如强直性 脊柱炎)、系统性红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病(Crohn’s disease)、 溃疡性结肠炎)、重症肌无力和贝赫切特综合征(Behcet’s syndrome))、 银屑病、子宫内膜异位症和腹部粘连(例如腹部手术后)。

配体尤其可用于治疗这样的感染性疾病:其中被感染因子感染的 细胞包含的细胞表面靶水平要比未感染细胞的高，或者包含的一个或 多个细胞表面靶标在未感染细胞上并不存在，例如由感染因子(例如细 菌、病毒)编码的蛋白质。

能够结合胞外靶的本发明配体可被胞吞，并可在胞内递送治疗剂 (例如毒素)(例如递送结合胞内靶的dAb)。另外，配体提供了每个能 够特异性结合胞内靶的结合域(例如dAb单体)可递送到胞内环境的手 段。该策略需要例如具有能使其保留在细胞内的功能的物理性质的结 合域。或者，如果最终目的地胞内区室正在氧化，则良好折叠的配体 可能不一定是无二硫化物的。

在本申请中，术语“预防”包括在诱发疾病之前给予保护性组合 物。“抑制”是指在诱发事件后但在疾病有临床表现前给予组合物。 “治疗”包括在疾病症状出现后给予保护性组合物。治疗包括改善与 疾病相关的症状，还预防或延迟疾病的发作，以及减轻疾病症状的严 重性或减少频率。

术语“癌症”是指或描述了哺乳动物中通常以不受调节的细胞增 殖或存活为特征的病理状态。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、 胚细胞瘤、肉瘤和白血病以及淋巴系统恶性肿瘤。更具体地说，癌症 的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(例如小细胞肺 癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃 癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、 膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、多发性骨 髓瘤、慢性髓细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、子宫内膜癌或子 宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门 癌、阴茎癌、头颈部癌等。

可用于评价本发明配体预防、治疗或抑制疾病(例如癌症)的功效 的动物模型系统是可获得的。合适的癌症模型包括例如人类癌症在动 物模型中的异种移植和原位移植模型，例如SCID-hu骨髓瘤模型 (Epstein J..和Yaccoby，S.，Methods Mol.Med.113:183-90(2005)， Tassone P等，Clin Cancer Res.11(11):4251-8(2005))、人肺癌的小鼠模 型(例如Meuwissen R和Berns A，Genes Dev.19(6):643-64(2005))，以 及转移癌的小鼠模型(例如Kubota T.，J Cell Biochem.56(1):4-8 (1994))。

通常，纯化形式的本发明配体可与药理上合适的载体一起使用。 通常，这些载体包括水性或醇/水溶液剂、乳剂或混悬剂，包括盐水和 /或缓冲介质。胃肠外溶媒包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和 氯化钠以及乳酸化林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的 话，则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，这些增稠剂 例如为羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。

静脉内溶媒包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林 格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、 抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(Mack(1982)Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版)。各种合适制剂都可采用，包括延长释放的制剂。

可以单独给予的组合物形式或者与其它药物一起使用本发明的 配体。配体可与一种或多种其它治疗药或活性剂一起给予和/或配制。 当配体与其它治疗药一起给予时，配体可以在给予其它药物之前、同 时或之后给予。通常，配体和其它药物的给予方式能提供重叠疗效。 可给予本发明配体或与本发明配体一起配制的其它药物包括例如各 种免疫治疗药物，例如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、抗生素、 抗真菌药、抗病毒药和免疫毒素。例如，当给予拮抗剂以预防、抑制 或治疗肺部炎症或呼吸疾病时，其可协同给予磷酸二酯酶抑制剂(例如 磷酸二酯酶4抑制剂)、支气管扩张药(例如β2-激动剂、抗胆碱能药、 茶碱)、短效β-激动剂(例如舒喘灵(albuterol)、沙丁胺醇(salbutamol)、 班布特罗、非诺特罗、异他林(isoetherine)、异丙肾上腺素、左沙丁胺 醇、奥西那林、吡布特罗、特布他林和甲磺酸比托特罗吸入剂 (tornlate))、长效β-激动剂(例如福莫特罗和沙美特罗)、短效抗胆碱能 药(例如异丙托溴铵和氧托溴铵)、长效抗胆碱能药(例如噻托品)、茶碱 (例如短效剂型、长效剂型)、吸入类固醇(例如倍可松(beclomethasone)、 倍氯米松(beclometasone)、布地奈德、氟尼缩松、丙酸氟替卡松和曲 安西龙)、口服类固醇(例如甲泼尼龙、泼尼松龙(prednisolone)、强的 松龙(prednisolon)和泼尼松)、短效β-激动剂和抗胆碱能药的组合(例如 舒喘灵/沙丁胺醇/异丙阿托品(ipratopium)和非诺特罗/异丙阿托品)、长 效β-激动剂和吸入类固醇的组合(例如沙美特罗/氟替卡松和福莫特罗/ 布地奈德)以及粘液溶解药(例如厄多司坦、乙酰半胱氨酸、溴己新 (bromheksin)、羧甲司坦、愈创甘油醚(guiafenesin)和碘化甘油)一起给 予。

本发明的配体可与各种各样合适的共治疗剂一起给予(例如治疗 癌症)，所述共治疗剂包括细胞因子、止痛药/退热药、止吐药和化疗 药。

合适的共治疗剂包括细胞因子，包括但不限于淋巴因子、肿瘤坏 死因子、肿瘤坏死因子样细胞因子、淋巴毒素、干扰素、巨噬细胞炎 性蛋白、粒细胞单核细胞集落刺激因子、白介素(包括但不限于白介素 -1、白介素-2、白介素-6、白介素-12、白介素-15、白介素-18)、生长 因子(包括但不限于例如生长激素、胰岛素样生长因子1和2(IGF-1 和IGF-2)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板衍生生长因子(PGDF)、 表皮生长因子(EGF))，和用于刺激红细胞生成的药物，例如重组人促 红细胞生成素(Epoetinα)、EPO、激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他 胺、他莫昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON))和类固醇药(例如地塞米松、 类视色素、倍他米松、氢化可的松、可的松、泼尼松、去氢睾酮、糖 皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)。

镇痛药/退热药可包括但不限于阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、 萘普生钠、盐酸丁丙诺啡、盐酸丙氧芬、萘磺酸丙氧芬、盐酸度冷丁、 氢吗啡酮、硫酸吗啡、盐酸羟考酮、磷酸可待因、双氢可待因酒石酸 氢盐、盐酸喷他佐辛、氢可酮酒石酸氢盐、酒石酸左啡诺、双氟尼柳、 水杨酸三乙醇胺、盐酸纳布啡、甲芬那酸、酒石酸布托啡诺、水杨酸 胆碱、布他比妥、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、左美丙嗪、盐 酸桂美君、甲丙氨酯等。

还可以共给予止吐药，以预防或治疗恶心和呕吐，例如合适的止 吐药包括盐酸美克洛嗪、大麻隆、丙氯拉嗪、茶苯海明、盐酸异丙嗪、 硫乙拉嗪、东莨菪碱等。

化疗药在本文中作为术语使用时包括但不限于例如抗微管药物， 例如泰素(紫杉醇)、泰索帝(多西他赛)；烷化剂，例如环磷酰胺、卡莫 司汀、洛莫司汀和苯丁酸氮芥；细胞毒性类抗生素，例如放线菌素D、 多柔比星、丝裂霉素C和博来霉素；抗代谢药，例如阿糖胞苷、吉西 他滨、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶；抗有丝分裂药，例如长春花属生物碱， 例如依托泊苷、长春碱和长春新碱；以及其它化疗药，例如顺铂、达 卡巴嗪、丙卡巴肼和羟基脲，以及它们的组合。

本发明的配体可连同其它治疗剂一起用于治疗癌症。例如，本发 明的配体可连同化疗药一起给予。在这样的治疗方案中，最好可以减 少为达到有效而必需给予的化疗药的量。因此，本发明提供治疗癌症 的方法，包括给予有需要的患者治疗有效量的本发明配体和化疗药， 其中化疗药以低剂量给予。一般来说，与本发明配体合用的化疗药的 量是正常给予患者的化疗药单用剂量的约80％、或约70％、或约60％、 或约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％以下。因此， 在化疗药引起有害的或不需要的副作用(在较低剂量时可被降低或消 除)时联合疗法尤其有用。

药物组合物可包括多种细胞毒性剂或其它药物连同本发明配体 乃至具有不同特异性的本发明配体组合(例如使用不同靶抗原或表位 选择的配体)的“合剂”，无论它们是否在给予前混合。

本发明药物组合物的给药途径可以为任何合适途径，例如本领域 普通技术人员公知的任何途径。对于治疗(包括但不限于免疫治疗)来 说，可以采用标准技术，将本发明配体给予任何患者。可通过任何合 适方式给予，包括胃肠外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、鞘内、关 节内、通过肺部途径，或者还合适地直接输注(例如用导管)。给药剂 量和频次将取决于患者年龄、性别和状况、同时给予的其它药物、禁 忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药(例如通过 肺部给药(例如鼻内给药)局部给予至肺部，或者局部直接注射入肿瘤 中)或系统给药。

可将本发明配体冻干后贮存备用，使用前重配在合适载体中。已 表明该技术对常规免疫球蛋白来说是有效的，可以采用本领域已知的 冻干和重配技术。本领域技术人员可以理解，冻干和重配可导致不同 程度的抗体活性丧失(例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体要比IgG抗 体活性损失更高)，可能必须要调高使用水平以便补偿。

可以给予含有配体的组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在某 些治疗应用中，足以达到至少部分抑制、遏制、调节、杀伤或某些其 它可检测参数的所选细胞群体的用量，定义为“治疗有效量”。尽管 达到该剂量所需的用量将取决于疾病严重程度和患者的一般健康状 况，但是通常范围为0.005-5.0mg配体/kg体重，更常用的剂量为 0.05-2.0mg/kg/剂。对于预防应用而言，也可以类似或稍低剂量给予含 有本发明配体或其合剂的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作(例如 维持缓解或静止状态，或者预防急性期)。熟练的临床医生能够确定合 适的给药间隔，以便治疗、抑制或预防疾病。当给予配体治疗、抑制 或预防疾病时，可以例如约10μg/kg至约80mg/kg、约100μg/kg至 约80mg/kg、约1mg/kg至约80mg/kg、约1mg/kg至约70mg/kg、 约1mg/kg至约60mg/kg、约1mg/kg至约50mg/kg、约1mg/kg至 约40mg/kg、约1mg/kg至约30mg/kg、约1mg/kg至约20mg/kg、 约1mg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至约10mg/kg、约10μg/kg至 约5mg/kg、约10μg/kg至约2.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约 3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、 约9mg/kg或约10mg/kg的剂量最多给予每天4次、每周两次、每周 一次、每两周一次、每月一次或每两月一次。在具体的实施方案中， 以约10μg/kg至约10mg/kg(例如约10μg/kg、约100μg/kg、约1

mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、 约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg或约10mg/kg)的剂量每两周一次 或每月一次给予双特异性配体，以治疗、抑制或预防慢性炎性疾病。

在具体的实施方案中，本发明的配体以提供体内选择性结合双阳 性细胞的剂量给药。如本文所述的选择性结合双阳性细胞可在配体于 约1pM至约150nM的浓度使用时实现。可给予足以实现约1pM至 约150nM的配体血清浓度的剂量。熟练医师可确定获得此血清浓度 的合适给药，例如通过滴定配体和监测配体血清浓度。包括给予治疗 剂以实现所需的药物血清浓度的治疗方案是本领域常见的，尤其是在 肿瘤学领域。

用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是:一种 或多种症状相对于治疗前存在的所述症状或者相对于未用所述组合 物或其它合适对照治疗的个体(人或模型动物)中的所述症状被减轻 (例如达至少10％或在临床评价量表中达至少一个点)。尽管症状随所 针对的疾病或障碍而明显不同，但是可以由一般熟练的临床医生或技 术人员进行测定。这些症状例如可如下测定:监测疾病或障碍的一种 或多种生化指标水平(例如与疾病相关的酶或代谢物水平，受累细胞数 量等)、监测身体表现(例如炎症、肿瘤大小等)或者可接受的临床评价 量表，例如扩展残疾状态量表(Expanded Disability Status Scale)(用于 多发性硬化)、Irvine炎性肠病问卷调查表(32点评价表，评价有关肠 功能、全身症状、社交功能和情感状态的生活质量—评分范围为 32-224，评分越高表明生活质量越好)、类风湿性关节炎生活质量量表 或本领域已知的其它可接受的临床评价量表。疾病或障碍症状持续(例 如一天以上，优选超过一天)下降达至少10％或者在给定临床量表上下 降达一个点或多个点，就表明是“有效”治疗。同样，如果一种或多 种症状的发作或严重程度相对于未经本文所述的组合物治疗的类似 个体(人或动物模型)的所述症状被延迟、减少或消除，则用所述组合 物进行预防就是“有效”的。

含有本发明配体的组合物可用于预防和治疗装置，以帮助改变、 失活、杀伤或去除哺乳动物体内的所选靶细胞群体。另外，本文所述 的配体和所选多肽库可用于离体或体外选择性杀伤、耗尽靶细胞群体 或从异质细胞群体中有效去除靶细胞群体。可以按照标准技术，将来 自哺乳动物的血在离体情况下与配体(例如抗体、细胞表面受体或其结 合蛋白)混合，由此杀伤或从血液中除去不想要的细胞，再回输到哺乳 动物体内。

实施例

在本文所述的实施例中，CD38也被称为DOM11，CD138也被 称为DOM12，CEA也被称为DOM13，CD56也被称为DOM14。

与CD38、CD138、CEA或CD56结合的dAb的选择和筛选

使用在哺乳动物细胞中作为Fc融合蛋白表达的抗原选择dAb。 使用针对交替捕获在G蛋白(Dynal)和抗人Fc(Novagen)磁珠上的 CD38、CD138、CEA和CD56的dAb文库进行3轮选择。以ELISA 检验在第2轮和第3轮作为噬菌体和可溶性dAb对关联抗原而不是非 关联抗原具有特异性的选择输出。对于可溶性ELISA，所有Vk dAb 都与蛋白L交联。对于每种抗原，测序可溶性ELISA阳性克隆，表明 选择具有不同输出。

测定dAb阳性克隆的结合测定

ELISA阳性克隆在50ml培养物中表达，并且在适当的时候，在 蛋白A(VH克隆)或蛋白L(Vk克隆)上进行纯化。简而言之，将编码 dAb的噬菌体表达质粒(pDOM5)转化到HB2151大肠杆菌中，并将细 胞铺板在含50μg/ml羧苄青霉素和5％葡萄糖的TYE板上，于37℃孵 育过夜。使用依照以下方法的自动诱导使dAb在培养上清液中表达: 向250ml挡板瓶中加入以下组分:50ml TB、100μg/ml羧苄青霉素、 1滴消泡剂A204(Sigma)、来自Novagen过夜表达自动诱导试剂盒的 1ml溶液1、2.5ml溶液2和0.05ml溶液3，以及来自转化的大肠杆 菌细胞的单个菌落。培养瓶用Milliwrap PTFE膜封口，以250rpm、 30℃使培养物生长和表达蛋白质达48小时。蛋白质使用蛋白A或L 由培养物上清液直接纯化。

所有dAb都使用以下方法通过针对抗原阳性和阴性细胞系的 FACS分析。

通过FACS确定细胞结合如下进行:细胞以250g离心5分钟， 取出生长培养基。于4℃以2×106个细胞/ml的密度将细胞重悬浮在 FACS温育缓冲液中。通过于4℃在FACS温育缓冲液中温育15分钟 封闭细胞。加入50μl 2x一抗母液(抗CD38 FITC、抗CD138 FITC或 缀合mIgG1 FITC的同种型对照(全部都得自BD Biosciences))；或者将 dAb加入到含该细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟。 然后，细胞用FACS温育缓冲液洗涤1次。将100μl二抗(兔抗Vk) 加入到含该细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟。细 胞用FACS温育缓冲液洗涤1次。然后将100μl 1×三抗加入到含该 细胞的FACS温育缓冲液中，于4℃温育30-60分钟(对于dAb，三抗 为抗兔FITC(Sigma))。细胞用FACS温育缓冲液洗涤2次。将细胞沉 淀重悬浮在200μl FACS温育缓冲液+活细胞标记(BD Viaprobe)中。 然后通过流式细胞术分析细胞。

描述于表3的细胞系用于FACS分析。细胞系的表型通过FACS 确定。具有适于评价配体的结合特异性的表型的合适细胞可得自细胞 保藏机构，例如美国典型培养物保藏中心(例如保藏号CCL-155、CRL 9068、CCL-86、CRL1929、TIB 196、CRL 1730、CRL2408、HTB 173、 HTB 119、CRL 5834)和德国菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(例如保藏号ACC50、 ACC31)。

表3:在FACS分析中使用的细胞系表型

  细胞系 通过FACS确定的表型 RPMI8226                   CD138+ CD31-  CD38+  CD56+  OPM2 CD138+ CD38+  NCIH929                 CD138+ CD31-  CD38+  CD56+  RAJI CD83+  CD138- SUPB15               CD138- CD31+  CD38+  CD56- 

  U266           CD138+        CD31+(低表达) CD38+(低表达) CD56-         Huvec             CD138+ CD31+  CD38-  CD56-  CCRF-CEM                   CD38-  CD138- CEA-   CD56-  K299           CD38-  CD138- CD56-  CEA-   NK92MI CEA-  CD56+ NCI-H146 CEA(非常弱+ve) CD56+          NCI-H69 CEA+  CD56+ NCI-H647                   CEA-   CD56-  NCA+   CD138+

结果

在本研究中，dAb DOM11-3、DOM11-30、DOM12-45、DOM13-25 和DOM14-23通过FACS分析被鉴定为分别对CD36、CD38、CD138、 CEA和CD56具有良好结合特征。参见图1A-1H。

表4:通过FACS分析的抗CD38和抗CD138dAb的特性

  RPMI SUPB HUVEC K299 CD38+/138+ CD38+/CD138- CD38-/CD138+ CD38-/138- 抗CD38 DOM11-3 √ √ X X DOM11-7 √ √ X X

  DOM11-23 √ DOM11-24 √ X DOM11-30 √ X DOM11-32 √ X DOM11-37 √ DOM11-38 √ X DOM11-39 √ X 抗CD138 DOM12-17 √ √ X DOM12-26 √ √ (√) DOM12-45 √ √ X

√＝dAb结合

×＝dAb不结合

BIACORE分析

被鉴定为FACS阳性克隆的抗CD38、抗CEA和抗CD56 dAb另 外使用以下程序通过Biacore分析。CM5芯片表面通过1:1 EDC/NHS (0.4M 1-乙基-3-(3-二薄荷基氨基丙基)-碳二亚胺的水溶液；0.1M N- 羟基琥珀酰亚胺的水溶液)以流速5μL/分钟冲洗10分钟接触时间而活 化。CD38以500nM的乙酸盐缓冲液pH4以5μL/分钟固定，重复此 步骤，直至RU达到500-1000(低密度)。CEA和CD56在乙酸盐缓冲 液pH4.5中偶联。任何过量的反应基团都通过使1M盐酸乙醇胺流经 CM5芯片(再以5μL/分钟达7分钟)而钝化。如上所述，以biacore检 测抗CD38、抗CEA和抗CD56 dAb的亲和力。对于每个靶，都发现 dAb以100-200nM范围的亲和力结合。图2显示了检测Biacore亲和 力的两个抗CD38 dAb(DOM11-30和DOM11-3)的结果。DOM11-30 的亲和力(KD)为150nM，DOM11-2的亲和力为250nM。

表位作图抗CD38 dAb

进行表位作图，以确定抗CD38 dAb是否结合CD38上的不同表 位。测定如上所述使用以中等密度包被的芯片(约2000RU)在BIAcore 上进行。CD38以如上所述的中等密度包被在CM5芯片上。使用共注 射功能，以500nM的浓度注射第一抗CD38 dAb。第一和第二抗CD38 dAb均以相同浓度(500nM)共注射。由于两种dAb结合不同表位，所 以在第二次注射过程中的RU增加，超过第一dAb的结合水平。

结果表明，抗CD38 dAb DOM113、DOM11-30和DOM11-23结 合CD38上的不同表位。参见图3A-3D。

表5 抗CEA dAb的特性

  dAb LS174-T H69 biacore H647 (CEA-/NCA+) DOM13-25 ++ ++ 100-200nM亲和力 - DOM13-57 +(非常弱) NT - DOM13-58 +(弱) + 低亲和力结合 - DOM13-59 +(弱) + 400-800nM亲和力 - DOM13-64 NT NT 低亲和力结合 - DOM13-65 + + 低亲和力结合 - DOM13-74 + + 100-200nM亲和力 - DOM13-93 + + 低亲和力结合 - DOM13-95 + + 低亲和力结合 -

++强结合

+结合

-不结合

NT未测

表6:抗CD 56 dAb的特性

  dAb H82 H69 biacore DOM14-23 +(作为二聚体) ND 100-200nM亲和力 DOM14-48 - ++ 低亲和力结合 DOM14-56 - ～+ 低亲和力结合 DOM14-57 - + 不结合 DOM14-62 - ～+ 不结合 DOM14-63 - ++ 100nM亲和力 DOM14-68 + ++ 不结合 DOM14-70 + + 500-800nM亲和力

++强结合

+结合

-不结合

含有抗CD38 dAb和抗CD138 dAb的配体

已鉴定出结合CD38或CD 138的低亲和力dAb。这些dAb已通 过线性融合(in line fusion)连接，产生通过FACS特异性结合抗原表达 细胞的双特异性dAb(配体)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需 要时依次使用蛋白L琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。

业已表明，所有dAb都作为单体结合抗原表达细胞系，但不结合 抗原阴性细胞系。抗CD38 dAb和抗CD138 dAb已作为线性融合体配 对，并如上所述通过FACS对双阳性和阴性细胞系进行结合检验。最 佳双特异性dAb配对是DOM11-3/DOM12-45和 DOM11-30/DOM12-45。在最佳浓度(25-50nM)，这些配对强结合双阳 性细胞系(CD38+/CD138+)，但不结合单阳性或阴性细胞系。参见图 4A-4D。

内化

方法

细胞用RPMI 1640+10％ FCS(内化缓冲液)洗涤1次。细胞沉淀重 悬浮在所需体积的内化缓冲液中，并在合适的管数之间分配(50μl/ 管)。细胞在内化缓冲液中温育15分钟以封闭。然后将50μl预混合的 一抗和二抗的2×母液(dAb+兔抗Vk)加入到含该细胞的内化缓冲液 中，并于4℃温育60分钟。细胞用内化缓冲液洗涤1次。将100μl 的1×三抗(抗兔FITC)加入含该细胞的内化缓冲液中，于4℃温育 30-60分钟。

细胞用内化缓冲液洗涤1次。相关样品于37℃温育1.5小时，以 允许内化。2组双份样品于4℃保持多肽。

为区分表面结合和内化的dAb，用酸洗涤仅于4℃温育的细胞样 品和于37℃温育的细胞，仅去除细胞表面dAb。然后，细胞用酸性洗 涤缓冲液洗涤2次，然后用PBS洗涤2次。细胞重悬浮在200μl PBS +10μl BD Viaprobe中，并通过流式细胞术进行分析。通过FACS评 价标记细胞和仅于4℃酸洗(细胞表面结合)相比于37℃用酸洗处理(内 化)的比例。或者，对于共焦显微镜，细胞固定在4％低聚甲醛溶液中， 并在盖玻片上封片。

结果

通过FACS和共焦显微镜表明，抗CD38/抗CD138双特异性配体 (DOM11-3/DOM12-45和DOM11-30/DOM12-45)于CD38+细胞系Raji 上内化。图5A-5C显示了CD38阳性细胞系用DOM11-3/DOM12-45 (500nM，用FITC染色在Zeiss LSM510 META共焦显微镜上显现)标 记。内化作为37℃的抗酸荧光显示。

也已表明，抗CD38/抗CD138双特异性配体DOM11-3/DOM12-45 和DOM11-30/DOM12-45在双重表达的多发性骨髓瘤细胞系OPM2 (DSMZ ACC50)上内化。参见图6A和6B。

表7.内化双特异性dAb比例的确定

  DOM11-3/ DOM12-45 DOM11-30/ DOM12-45  DOM14-23/ DOM12-45  Vk对照 ％内化 76％ 8％ 43％ 0.2％

胞内定位

在本研究中，对内化双特异性dAb的胞内定位进行了研究。

方法

简而言之，对内化双特异性dAb(ds-dAb)的胞内定位进行了研究。 如上所述Raji(CD38+)细胞内化的dAb已按照生产商的说明(serotec) 用魔力红(magic red)复染色。魔力红是一种用于定位于溶酶体区室的 组织蛋白酶B的标记。DOM11-30/DOM12-45和DOM11-3/DOM12-45 均已显示与该标记共定位。

结果

图7表明，通过共焦显微镜检，CD38/CD138与Raji细胞上的溶 酶体标记组织蛋白酶B共定位。DOM11-30/DOM12-45和 DOM11-3/DOM12-45均已显示与该标记共定位。

这些结果表明，配体可被内化至溶酶体区室，在该区室中，配体 可被加工，例如通过蛋白酶剪切(组织蛋白酶B剪切)，以例如释放毒 素。

双特异性配体-聚乙二醇(PEG)缀合物

方法

使用5K、20K、30K或40K PEG经c端半胱氨酸残基使抗CD38/ 抗CD138双特异性配体DOM11-3/DOM12-45和 DOM11-30/DOM12-45进行PEG化。位于dAb的C端的工程半胱氨 酸残基允许MAL-PEG的位点特异性连接。

向dAb蛋白溶液加入甘油至终浓度为20％(体积/体积)，加入二 硫苏糖醇至5mM。溶液于室温温育20分钟，以使表面硫醇减少。通 过使用离心式浓缩器(Vivascience)(4,500rpm)使样品体积减小至2.5 ml。使用PD-10柱(Amersham)对蛋白溶液进行缓冲交换，以去除还原 剂。PD-10柱用25ml偶联缓冲液(20mM BIS-Tris pH6.5、5mM EDTA 和10％甘油[体积/体积])平衡，之后加入2.5ml还原的蛋白样品。使蛋 白溶液完全进入树脂床，然后通过加入另3.5ml偶联缓冲液洗脱dAb。 然后蛋白立即发生偶联。蛋白浓度(mg/ml)通过检测280nm的吸光度 确定。将蛋白量从mg/ml换算成摩尔浓度。加入3摩尔过量的 MAL-PEG。使反应在室温下过夜。样品使用PD-10脱盐柱进行缓冲 交换，以去除未偶联的MAL-PEG。如上所述对PEG化样品的dAb结 合和内化进行FACS分析。

结果

结果表明，在PEG化时，双特异性配体以类似于非PEG化双特 异性配体的程度结合其靶。观察到结合有些下降，尤其是抗CD38/抗 CD138双特异性配体DOM11-30/DOM12-45的较大PEG。另外，PEG 化形式的抗CD38(DOM11)被OPM2多发性骨髓瘤细胞内化，其程度 类似于非PEG化配体(参见图8A-8E)。

抗CD38/抗CD138双特异性配体-毒素缀合物

抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体的制备

抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体在大肠 杆菌中表达，并依次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析 进行纯化。还表达并纯化Vk对照/Vk对照同二聚体，用作阴性对照。

毒素-硒与抗CD38/抗CD138(DOM11-3/12-45)的缀合

使用3碳酸或3碳胺接头将硒缀合至抗CD38/抗CD138双特异性 配体。(参见美国专利第5,783,454号，其公开内容通过引用结合到本 文中)。每个抗CD38/抗CD138双特异性配体平均偶联2个硒分子。

缀合Se的双特异性配体的内化

如上所述，通过FACS检验OPM2细胞对缀合Se的dAb的内化。 缀合Se的抗CD38/抗CD138(DOM11-3/DOM12-45)双特异性配体以 和未缀合的dAb相同的程度内化，而未缀合或缀合硒的Vk对照dAb 未被内化。参见图9A-9D。

抗CD38/抗CD138细胞杀伤测定

为确定双特异性配体-Se缀合物对凋亡和细胞死亡的作用，用膜 联蛋白V alexa-fluor 488和碘化丙锭(PI)进行双重染色(Vybrant凋亡测 定试剂盒#2，Molecular Probes)。将1×105个OPM2 CD38/CD138阳性 多发性骨髓瘤细胞(ATCC)或CD138/CD38抗原阴性细胞与有或没有 缀合硒的双特异性dAb或Vk-对照温育24小时。作为阳性对照，细 胞与μM喜树碱(Sigma)温育6小时。在治疗后，按照生产商的说明， 细胞用FACS缓冲液洗涤，并在含膜联蛋白V和碘化丙锭的结合缓冲 液中重悬浮。在温育15分钟后，通过FACS测定细胞的凋亡和死亡 细胞群体的存在情况。(如在图10中所示)。

示于图10的结果表明，硒与双特异性抗CD38/抗CD138 dAb的 缀合提供了对双阳性(CD38+/CD138+)细胞的选择性细胞杀伤作用。与 没有硒缀合的双特异性dAb相比，观察到表达CD38和CD138这二 者的多发性骨髓瘤细胞的凋亡增加。而且，这种凋亡增加对表达CD38 和CD138这二者的多发性骨髓瘤细胞是特异性的。对于CD38/CD138 阳性或阴性细胞系用缀合硒的阴性对照dAb没有观察到凋亡增加。

关于配体-Se缀合物对细胞存活力的作用，分析了1×105个OPM2 (CD38+/CD138+)多发性骨髓瘤细胞。如上所述，将Raji细胞(CD38 阳性/CD138阴性)或CD138-/CD38-阴性细胞与有或没有缀合硒的双 特异性配体或Vk-对照温育24小时。洗涤细胞，并用碘化丙锭染色， 通过FACS测定细胞存活力。结果表明，硒与双特异性配体的缀合导 致双阳性多发性骨髓瘤细胞的细胞存活力降低，而单阳性和双阴性细 胞系不受影响。参见图11。

在某些研究中，有和没有缀合的双特异性配体或Vk-对照与细胞 温育24-96小时。

含有抗CD138 dAb和抗CD56 dAb的配体

已鉴定出结合CD138或CD56的低亲和力dAb。然后连接dAb DOM12-45和DOM14-23，产生特异性结合表达靶的细胞的双特异性 dAb(通过FACS)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需要时依次 使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。

抗CD138/抗CD56双特异性配体(DOM12-45/DOM14-23)已按照 线性融合形式制备。这是治疗多发性骨髓瘤的抗CD38/抗CD138配体 的替代配对。通过FACS已表明其强结合双阳性细胞系 (CD138+/CD56+)，但不结合单阳性或阴性细胞系。已表明 DOM14-23/DOM12-45于双阳性多发性骨髓瘤细胞系OPM2上内化 (参见表7)。

含有抗CEA dAb和抗CD56 dAb的配体

已鉴定出结合CEA或CD56的低亲和力dAb。然后连接dAb (DOM13-25和DOM14-23)，产生特异性结合表达靶的细胞的双特异 性dAb(通过FACS)。所有的dAb都在大肠杆菌中表达，在需要时依 次使用L蛋白琼脂糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。

抗CEA/抗CD56双特异性配体(DOM13-25/DOM14-23)已按照线 性融合形式制备。该配体可用于治疗小细胞肺癌。通过FACS已表明 其强结合双阳性细胞系(H69小细胞肺癌，其为CEA+/CD56+)，但不 结合单阳性或阴性细胞系。另外，DOM13-25和DOM14-23已与Vk 对照配对(包含种系氨基酸序列的dAb，其不结合CD38、CD 138、CEA 或CD56)。当与Vk对照配对时，没有dAb显示出与H69细胞的显著 结合，只有在作为双特异性dAb一起配对时，它们才有效结合H69 细胞。

含有抗CEA dAb和抗CD56的配体(DOM13/DOM14)

方法

按照线性融合形式制备抗CEA dAb DOM13-25和抗CD56 dAb DOM14-23。该配体适用于小细胞肺癌。通过FACS已表明其强结合 双抗原阳性细胞系(H69小细胞肺癌，ATCC)，但不结合单抗原阳性或 阴性细胞系。另外，DOM13-25和DOM14-23已与Vk对照配对。当 与Vk对照配对时，没有dAb显示出与H69细胞显著结合，只有在作 为双靶向dAb一起配对时，它们才有效结合H69细胞。

亲和力成熟的抗CD38(DOM11)dAb

通过易错PCR产生针对抗CD38 dAb DOM11-3和DOM11-30的 亲和力成熟文库。对CD38-Fc抗原进行3轮选择。通过噬菌体ELISA， 随后通过可溶性ELISA(如上所述)，表明第2轮和第3轮的dAb特异 性结合。通过BIAcore(如前所述)，随后通过FACS，进行初始筛选。

通过BIAcore和FACS鉴别出某些显示出抗原结合改善的克隆。 表8和表9显示了对亲代dAb和几种亲和力成熟的抗CD38 dAb (DOM11-3-1、DOM11-3-2、DOM11-30-1、DOM11-30-2、DOM11-30-3 和DOM11-30-4)观察到的亲和力(KD)。来自DOM11-30的亲和力成熟 的dAb显示出结合亲和力改善达到约10倍。

  表8

  克隆 KD(nM) DOM11-3 330-500 DOM11-3-1 62 DOM11-3-2 130-160

   表9

  克隆 KD(nM) DOM11-30 190-230 DOM11-30-1 19 DOM11-30-2 62-76 DOM11-30-3 86-93 DOM11-30-4 78-89

亲和力成熟的抗CD138 dAb

通过易错PCR产生针对抗CD138 dAb DOM12-45的亲和力成熟 文库。对CD38-Fc抗原进行3轮选择。通过噬菌体ELISA，随后通过 可溶性ELISA，表明第2轮和第3轮的dAb特异性结合。通过FACS 进行初始筛选。在FACS中鉴定出显示抗原结合改善的主要克隆(lead clone)。亲和力成熟的dAb显示出结合亲和力改善达到约10倍。 亲和力成熟的抗CD38/抗CD138双特异性配体

通过将抗CD38 dAb和抗CD138 dAb克隆到双表达载体中使抗 CD38和抗CD138亲和力成熟的dAb配对，以产生双特异性配体。为 确定单体亲和力增加是否反映双特异性配体的结合亲和力增加，使一 系列亲和力成熟的抗CD38 dAb与抗CD138d Ab DOM12-45配对，使 一系列亲和力成熟的抗CD138 dAb与抗CD38 dAb配对，并使一系列 亲和力成熟的抗CD38 dAb和亲和力成熟的抗CD138 dAb配对。所有 的双特异性配体都在大肠杆菌中表达，在需要时依次使用L蛋白琼脂 糖和Resource S阳离子交换层析进行纯化。双特异性配体的结合亲和 力如前所述通过FACS评价。在本研究中，使用一系列浓度，以允许 测定EC50。某些配对的结果见图25。

尽管参考本发明的优选实施方案具体说明和描述了本发明，但是 本领域技术人员应该理解，在不偏离所附权利要求限定的本发明范围 的情况下，可以对本发明在形式和细节上实施各种修改。

相关申请

本申请要求保护2005年12月6日申请的美国申请号60/742,992 的权益，该申请的全部公开内容都通过引用结合到本文中。

序列表

<110>杜门蒂斯有限公司(Domantis Limited)

Elena de Angelis

Steve Holmes

Ian M.Tomlinson

Eric Yi-Chun Huang

Lucy J.Holt

Claire E.Everett

<120>对细胞表面靶具有结合特异性的双特异性配体及其使用方法

<130>3440.1006002

<150>60/742,992

<151>2005-12-06

<160>711

<170>FastSEQ for Windows Version4.0

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<210>62

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>62

<210>63

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>63

<210>64

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>64

<210>65

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>65

<210>66

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>66

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>67

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>68

<210>69

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>69

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>70

<210>71

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>71

<210>72

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>72

<210>73

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>73

<210>74

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>74

<210>75

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>75

<210>76

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>322

<223>n＝A、T、C或G

<400>76

<210>77

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>77

<210>78

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>78

<210>79

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>79

<210>80

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>80

<210>81

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>81

<210>82

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>82

<210>83

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>83

<210>84

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>84

<210>85

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>85

<210>86

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>86

<210>87

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>87

<210>88

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>88

<210>89

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>89

<210>90

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>90

<210>91

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>91

<210>92

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>92

<210>93

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>93

<210>94

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>94

<210>95

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>95

<210>96

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>96

<210>97

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>97

<210>98

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>98

<210>99

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>99

<210>100

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>100

<210>101

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>101

<210>102

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>275

<223>n＝A、T、C或G

<400>102

<210>103

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>103

<210>104

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>104

<210>105

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>90，102，108，151，153，183，273，287，288

<223>n＝A、T、C或G

<400>105

<210>106

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>106

<210>107

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>107

<210>108

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>108

<210>109

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>109

<210>110

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>110

<210>111

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>111

<210>112

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>112

<210>113

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>113

<210>114

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>114

<210>115

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>115

<210>116

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapi ens)

<400>116

<210>117

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>117

<210>118

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>118

<210>119

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>119

<210>120

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>120

<210>121

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>121

<210>122

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>122

<210>123

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>123

<210>124

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>124

<210>125

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>125

<210>126

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>126

<210>127

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>127

<210>128

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>128

<210>129

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>129

<210>130

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>130

<210>131

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>150

<223>n＝A、T、C或G

<400>131

<210>132

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>132

<210>133

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>114

<223>n＝A、T、C或G

<400>133

<210>134

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>134

<210>135

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>135

<210>136

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>136

<210>137

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>9，114

<223>n＝A、T、C或G

<400>137

<210>138

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>138

<210>139

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>139

<210>140

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>140

<210>141

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>49

<223>n＝A、T、C或G

<400>141

<210>142

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>142

<210>143

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>143

<210>144

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>144

<210>145

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>279

<223>n＝A、T、C或G

<400>145

<210>146

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>146

<210>147

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>147

<210>148

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>148

<210>149

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>149

<210>150

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>244

<223>n＝A、T、C或G

<400>150

<210>151

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>151

<210>152

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>81

<223>n＝A、T、C或G

<400>152

<210>153

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>82，84，89，96，101，108，277，278

<223>n＝A、T、C或G

<400>153

<210>154

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>154

<210>155

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>9

<223>n＝A、T、C或G

<400>155

<210>156

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>114

<223>n＝A、T、C或G

<400>156

<210>157

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>157

<210>158

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>158

<210>159

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>159

<210>160

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>9，168，244

<223>n＝A、T、C或G

<400>160

<210>161

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>81

<223>n＝A、T、C或G

<400>161

<210>162

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>162

<210>163

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>163

<210>164

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>164

<210>165

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>9

<223>n＝A、T、C或G

<400>165

<210>166

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>166

<210>167

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>167

<210>168

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>168

<210>169

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homosapiens)

<400>169

<210>170

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>170

<210>171

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>171

<210>172

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>172

<210>173

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>173

<210>174

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>174

<210>175

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>175

<210>176

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>176

<210>177

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>177

<210>178

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>178

<210>179

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>179

<210>180

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>180

<210>181

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>181

<210>182

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>182

<210>183

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>183

<210>184

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>184

<210>185

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>185

<210>186

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>186

<210>187

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>187

<210>188

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>188

<210>189

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>189

<210>190

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>190

<210>191

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>191

<210>192

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>192

<210>193

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>193

<210>194

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>194

<210>195

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>其他特征

<222>83

<223>n＝A、T、C或G

<400>195

<210>196

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>196

<210>197

<211>334

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>197

<210>198

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>198

<210>199

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>199

<210>200

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>200

<210>201

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>201

<210>202

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>202

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>357

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>358

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>393

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>394

<210>395

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>395

<210>396

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>396

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>397

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>400

<210>401

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>401

<210>402

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>402

<210>403

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>403

<210>404

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>92

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<400>404

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<211>108

<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<212>PRT

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<400>420

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<212>PRT

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<400>421

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>422

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>423

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>424

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>425

<210>426

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>426

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>427

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>428

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>429

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>430

<210>431

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

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<211>108

<212>PRT

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<400>432

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>38

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>433

<210>434

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>434

<210>435

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>435

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>436

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>437

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>438

<210>439

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<211>108

<212>PRT

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<400>440

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<211>108

<212>PRT

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>442

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>443

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>444

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

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<212>PRT

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>447

<210>448

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>93

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>448

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>449

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>450

<210>451

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>451

<210>452

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>452

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>453

<210>454

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>82

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>454

<210>455

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>455

<210>456

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>27

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>456

<210>457

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>457

<210>458

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>3

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>458

<210>459

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>38

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>459

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>460

<210>461

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>461

<210>462

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>462

<210>463

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>3，56，82

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>463

<210>464

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>27

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>464

<210>465

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>465

<210>466

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>466

<210>467

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>467

<210>468

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>3

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>468

<210>469

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>469

<210>470

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapi ens)

<400>470

<210>471

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>471

<210>472

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>472

<210>473

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>473

<210>474

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>474

<210>475

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>475

<210>476

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>476

<210>477

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>477

<210>478

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>478

<210>479

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>479

<210>480

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>480

<210>481

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>481

<210>482

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>482

<210>483

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>483

<210>484

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>484

<210>485

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>485

<210>486

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>486

<210>487

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>487

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>488

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>494

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>495

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>496

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>497

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>28

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>498

<210>499

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>499

<210>500

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>500

<210>501

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>501

<210>502

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>502

<210>503

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>503

<210>504

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>504

<210>505

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>505

<210>506

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>506

<210>507

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>507

<210>508

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>508

<210>509

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>509

<210>510

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>510

<210>511

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>511

<210>512

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>512

<210>513

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>513

<210>514

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>514

<210>515

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>515

<210>516

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>516

<210>517

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>517

<210>518

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>518

<210>519

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>519

<210>520

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>520

<210>521

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>521

<210>522

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>522

<210>523

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>523

<210>524

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>524

<210>525

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>525

<210>526

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>526

<210>527

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>527

<210>528

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>528

<210>529

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>529

<210>530

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>530

<210>531

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>531

<210>532

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>532

<210>533

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>533

<210>534

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>534

<210>535

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>535

<210>536

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>536

<210>537

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>537

<210>538

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>538

<210>539

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>539

<210>540

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>540

<210>541

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>541

<210>542

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>542

<210>543

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>543

<210>544

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>544

<210>545

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>545

<210>546

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>546

<210>547

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>547

<210>548

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>548

<210>549

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>549

<210>550

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>550

<210>551

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>551

<210>552

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>552

<210>553

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>553

<210>554

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>554

<210>555

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>555

<210>556

<211>35

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>30，31

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>556

<210>557

<211>123

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>557

<210>558

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>558

<210>559

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>559

<210>560

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>560

<210>561

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>561

<210>562

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>562

<210>563

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>563

<210>564

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>564

<210>565

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>565

<210>566

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>566

<210>567

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>567

<210>568

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>568

<210>569

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>569

<210>570

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>570

<210>571

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>571

<210>572

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>572

<210>573

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>573

<210>574

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>574

<210>575

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>575

<210>576

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>576

<210>577

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>577

<210>578

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>578

<210>579

<211>122

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>579

<210>580

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>580

<210>581

<211>120

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>581

<210>582

<211>121

<212>PRT    

<213>人(Homo sapiens)

<400>582

<210>583

<211>118

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>583

<210>584

<211>116

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>584

<210>585

<211>117

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>585

<210>586

<211>115

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>586

<210>587

<211>115

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>587

<210>588

<211>114

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camel id)

<400>588

<210>589

<211>114

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>589

<210>590

<211>128

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>590

<210>591

<211>124

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>591

<210>592

<211>120

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>592

<210>593

<211>123

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>593

<210>594

<211>125

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>594

<210>595

<211>125

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>595

<210>596

<211>124

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>596

<210>597

<211>131

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>597

<210>598

<211>126

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>598

<210>599

<211>128

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>599

<210>600

<211>120

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>600

<210>601

<211>123

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>601

<210>602

<211>125

<212>PRT

<213>骆驼科动物(Camelid)

<400>602

<210>603

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>603

<210>604

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>604

<210>605

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>605

<210>606

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>606

<210>607

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>607

<210>608

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>608

<210>609

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>609

<210>610

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>610

<210>611

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>611

<210>612

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>612

<210>613

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>613

<210>614

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>614

<210>615

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>615

<210>616

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>616

<210>617

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>617

<210>618

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>618

<210>619

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>619

<210>620

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>620

<210>621

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>621

<210>622

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>622

<210>623

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>623

<210>624

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>624

<210>625

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>625

<210>626

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>626

<210>627

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>627

<210>628

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>628

<210>629

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>629

<210>630

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>630

<210>631

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>631

<210>632

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>632

<210>633

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>633

<210>634

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapi ens)

<400>634

<210>635

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>635

<210>636

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>636

<210>637

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>637

<210>638

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>638

<210>639

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>639

<210>640

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>640

<210>641

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>641

<210>642

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>642

<210>643

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>643

<210>644

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>644

<210>645

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>645

<210>646

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>646

<210>647

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>647

<210>648

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>648

<210>649

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>649

<210>650

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>650

<210>651

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>651

<210>652

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>652

<210>653

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>653

<210>654

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>654

<210>655

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>655

<210>656

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>656

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>657

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>658

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>659

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>660

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>661

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>662

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>663

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>664

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>665

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>669

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>670

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>671

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>672

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>673

<210>674

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>674

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>675

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

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<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>679

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>680

<210>681

<211>323

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>681

<210>682

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>682

<210>683

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>683

<210>684

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>684

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

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<400>685

<210>686

<211>107

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>686

<210>687

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>687

<210>688

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>688

<210>689

<211>107

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>689

<210>690

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>690

<210>691

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>691

<210>692

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>692

<210>693

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>693

<210>694

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>694

<210>695

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>695

<210>696

<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>变异体

<222>108

<223>Xaa＝任何氨基酸

<400>696

<210>697

<211>110

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>697

<210>698

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>698

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>699

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>700

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>701

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>702

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>703

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>704

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>705

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<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>706

<210>707

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>707

<210>708

<211>324

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>708

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<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>709

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<211>108

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>710

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<400>711