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抗微 生物组合物

阅读：132发布：2021-02-13

专利汇可以提供抗微生物组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了包含萜类化合物和抗微生物剂的抗微生物组合物，以及所述组合物在不同应用中的用途，包括防止、对抗或治疗微生物感染，或防止微生物生长或定居。，下面是抗微生物组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抗微生物组合物，包含萜类化合物或其衍生物，以及抗微生物剂，所述抗微生物剂干扰细胞膜完整性或蛋白质合成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述萜类化合物和/或抗微生物剂来自硬木或软木。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述萜类化合物和/或抗微生物剂来自冬青树（冬青属）、橡树（栎属）、山毛榉（山毛榉属）、白蜡树（白蜡树属）、枫树（槭属）、白杨树（杨属）、柳树（柳属），或栗树（栗属），例如甜栗（欧洲板栗）。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述萜类化合物和/或抗微生物剂来自
松树（松属）、云杉（云杉属）、雪松（雪松属）、冷杉（冷杉属）、落叶松（落叶松属）、花旗松（黄衫属）、铁杉（毒参属）、柏树（柏科）、红杉（北美红杉属）或紫杉（红豆杉属）。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述萜类化合物是二萜类化合物或三萜类化合物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述三萜类化合物选自乌索酸、石竹素、桦木酸、模绕酮酸和羽扇豆醇。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述二萜类化合物选自脱氢松香酸、松香
酸、海松酸、异贝壳杉烯酸、ent-3-β-羟基异贝壳杉烯酸(ent-3-β-hydroxykaurenoic acid)、salvic酸（salvic acid）、桃拓酮、18-乙酸基-顺式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸(18-acetoxy-cis-cleroda-3,13-Z-dien-15-oic acid)、松香醇(7,13-松香二烯-18-醇，7,13-abietadien-18-ol)、脱氢松香基胍（dehydroabieticylguanidines）、花柏酸、铁锈醇、异海松酸、7-氧代-脱氢松香酸、7-羟基-脱氢松香酸和13-羟基-罗汉松-8,11,13-三烯-18酸（13-hydroxy-podocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid）。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述萜类化合物为松香酸，或其衍生物，例如脱氢松香酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂包含香精油。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述香精油是百里香油、丁香油、茶树精油、大茴香子油、菖蒲油、樟脑油、柏木油、肉桂油、香茅油、柠檬油、柠檬草油、梨莓油、肉豆蔻油、玫瑰草油(pamarosa oil)、薄荷油、迷迭香油、罗勒油、香根草油、黑胡椒油、姜油、没药油、牛至油、月桂叶油、香叶油、橙油、莳萝油或冬青油。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂是香草醛，或其衍生物，例如香草酸或乙基香草醛。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂是1，2-二苯乙烯，或其衍生物。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂是松柏醛或其衍生物。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂是脱氢姜油酮或其衍生物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述抗微生物剂用分子式XII表示：
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自选自H、OH、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的饱和或不饱和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中，R1是OH、C1-C4的烷基或烷氧基、C1-C4的醛或C1-C2的烷基取代的苯基，优选为OH、C1的烷氧基、C1的醛或C1-C2的烷基取代的苯基；R2是H、C1-C4的烷基或烷氧基，或C2-C4的酯，优选为H、C1-C3的烷基、或C1-C3烷氧基，或C2-C3的酯；R3是H或C1-C4的烷基，优选为H或C1-C3的烷基；R4是H、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4饱和或不饱和的醛，或C2-C4的酮，优选为H、C1-C3的烷基或亚烷基、C1-C2的烷氧基、C1-C2的饱和或不饱和的醛，或C2-C3的酮；R5是H或C1-C4的烷基，优选为H或C1-C2的烷基；以及R6是H或C1-C4的烷基，优选为H或C1-C2的烷基。
17.一种抗微生物组合物，包含萜类化合物或其衍生物，以及用分子式XII表示的抗微生物剂：
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如权利要求15或16中所限定。
18.萜类化合物或其衍生物增加抗微生物剂的抗微生物活性的用途，所述抗微生物剂干扰细胞膜完整性或蛋白质合成。
19.萜类化合物或其衍生物增加用分子式XII表示的抗微生物剂的抗微生物活性的用
途：
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6如权利要求15或16中所限定。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中，所述抗微生物剂的抗微生物活性增加至少8倍。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的用途，其中，所述萜类化合物和抗微生物剂如权利要求1-17中任一项中所限定。
22.含有极性基团和刚性疏水部分的化合物用于增加香精油或香草醛的抗微生物活性的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述化合物是类异黄酮植物抗毒素（例如菜豆素）、大豆抗毒素或紫檀碱。
24.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的液体剂型。
25.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的动物垫料。
26.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的覆盖物。
27.一种防止或抑制微生物定居于物体的方法，其包含用根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物接触或涂覆所述物体的表面。
28.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的物体。
29.一种根据权利要求28所述的物体，其中所述物体是医疗器械，例如医用导管、支架、创伤敷料、绷带、避孕器、外科用植入物、替代的关节、隐型眼镜、绷带、创伤敷料或石膏。
30.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的纺织品或聚合物。
31.一种包含根据权利要求30所述的纺织品或聚合物的衣着类商品。
32.一种包含根据权利要求30所述的纺织品或聚合物的鞋或其鞋垫。
33.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的包装材料。
34.一种根据权利要求33所述的包装材料，其中，所述包装材料用于包装食品或食品原料。
35.根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的用途，其用于防止或抑制食品的微生物感染的方法中，该方法包含用权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物接触或涂覆食品的表面。
36.一种包含根据权利要求1-17中任一项所述的抗微生物组合物的容器。
37.一种根据权利要求36所述的容器，其中，所述容器能够容纳食品，或为废物容器。

说明书全文

抗微 生物组合物

[0001] 本发明涉及抗微生物组合物。特别地，本发明涉及包含萜类化合物和抗微生物剂的抗微生物组合物，以及所述组合物在不同应用中的用途，包括防止、对抗或治疗微生物感染，或防止微生物生长或定居的应用。所述抗微生物组合物的具体应用包括用于动物垫料产业，例如禽舍，用于普通抗微生物产品，例如抗菌剂和消毒剂，用于食品工业，例如包装材料，以及用于产品的直接处理，用于土壤、覆盖物或植物材料以防止植物病原体的扩散，还能用于各种医疗方面的应用。

[0002] 禽舍中垫料材料内的微生物活性导致鸡粪便中的尿酸转变成氨。这对饲养密度高的禽舍是一个特有的问题，禽舍中废弃物的高浓度的铵使其变成碱性，这导致铵转变为氨气，高浓度的氨气对禽类有毒害，当其排入大气时，成为酸雨的重要促成因素。因此，动物房的氨排放受到密切关注，新法案迫使农户遵守严格的排放法规（IPPC，国际植物保护公约）。实际上，实施国际植物保护公约意味着拥有40,000多只禽类的农户必须：（1）使氨的排放最小化，（2）减少由禽舍散发的臭味，以及（3）制定适当的粪便管理计划。

[0003] 在富含铵的垫料上饲养的家禽会遭受足、胸的“腐蚀性烧伤”以及足垫皮肤炎（FPD）之苦，这就降低了最终的食品的质量。防止铵造成的“腐蚀性烧伤”不仅能改善动物的健康安乐，也会因动物生长得更好，以及更高质量的动物产品而减少农户的损失。因此有必要使禽舍中的微生物活性最小化。

[0004] 目前，减少微生物活性以防止动物垫料中的微生物将尿酸转变成氨和铵通过保持尽可能低的垫料含水量来实现。据称在这方面有效的报道是使用吸湿的垫料材料。然而，实际上，很难保持垫料的低湿度水平，因为禽类饲养密度通常较高，并且冷凝和液体溅出会导致垫料越来越湿。潮湿会助长微生物活性，其导致鸡粪便中存在的尿酸形成铵。

[0005] 当pH值升至高于7时，铵转变成氨，在pH值高于8时氨浓度明显增高。为了防止垫料材料产生腐蚀性，一旦尿酸转变成氨，可以添加酸式盐，例如明矾（KAl(SO4)2.12H2O）或硫酸氢钠以保持低pH值。然而，这些化合物并不持久，且对农户而言价格昂贵。而且所产生的废物内的大量的铝会因重金属浓度升高而产生废物处理问题。因此，上述“酸化物质”并不常用，禽舍中氨的形成仍旧普遍。

[0006] 经饲养用于食肉或产蛋的动物，例如鸡的另一个问题是食品中携带病原体的风险。据估计超市销售的75-95％的冷冻鸡肉感染有弯曲杆菌，10％的感染有沙门氏菌。对于从事育种和产崽的农户而言，在动物房中检测到沙门氏菌则意味着整个崽群需要销毁，这造成农户严重的经济损失。一般认为，这些细菌从动物房，尤其是垫料中进入动物体。据信，上述问题的原因在于动物垫料为这些细菌提供了适宜的基底，包括高温（25-35°C）、高湿度水平、粪便中高浓度的营养物以及处于适合所述细菌生长范围的pH值。因此，迫切需要减少动物垫料中的微生物活性，以防止病原体生长。

[0007] 坏死梭杆菌和黑色素类杆菌是足跟（蹄皮炎）的病原体，其病症为绵羊、山羊和牛脚趾间区域感染，造成蹄腐烂。该病非常痛苦，且具接触传染性。接触时能杀灭所述细菌的动物垫料会显著降低所述细菌对偶蹄类动物造成的伤害。

[0008] 市面上有众多合成消毒剂和消毒剂，其特征可描述为基于醇类、醛类、氧化剂、酚类或季铵的化合物。通常这些物质可以有效杀灭微生物，但存在如下问题：（1）细菌对醛类产生抗性；（2）氧化剂和酚类腐蚀性极强；（3）有机物质使醛类失活；（4）醇类不持久；（5）上述物质大多数对人类具有毒性或刺激性：或者（6）对环境有负面影响。

[0009] 由于上述问题的存在，对“天然”和更“绿色”的抗微生物剂，例如香精油以及其他具有抗微生物性能的天然产品，例如香草醛有极大的需求。常见的香精油的例子包括百里香酚（来自百里香的天然酚类产品），含有茶树精油的产品，以及包含其他来自丁香（丁香酚）、桉树、松树等的香精油的产品。然而，香精油和其他植物来源的抗微生物产品的抗微生物性通常较弱，因此，为了发挥效力，需要使用高浓度而致使上述产品有强烈的气味，这样不仅昂贵，而且令使用者感到非常不悦。因此，本领域存在提高已知抗微生物剂活性的需求。

[0010] 发明人现证实，萜类化合物及其衍生物显著改善已知抗微生物剂的抗微生物性能。

[0011] 因此，根据本发明第一方面，提供了抗微生物组合物，所述组合物包含萜类化合物或其衍生物，以及抗微生物剂，所述抗微生物剂干扰细胞膜完整性或蛋白质合成。

[0012] 第二方面，提供萜类化合物或其衍生物用于增加抗微生物剂的抗微生物活性的用途，所述抗微生物剂干扰细胞膜完整性或蛋白质合成。

[0013] 发明人研究了轻微加热的木屑变得具有抗微生物活性的机制，并惊讶地发现，包含萜类化合物脱氢松香酸和抗微生物剂香草醛的所述木屑的提取物能够强烈杀菌。然而，如实施例1所描述，最令人惊讶的是，他们发现，包含上述两种物质的提取物表现出比仅含香草醛，即不与萜类化合物组合时高出1000倍的抗微生物活性。如实施例3所示，该效应并不仅限于二萜类化合物，例如松香酸、脱氢松香酸和海松酸，还扩大至许多三萜类化合物，例如乌索酸、石竹素以及白桦脂醇。通常抗微生物物质以纯品形式使用，因而发明人相信，他们第一个发现任何萜类化合物，例如脱氢松香酸，都具有惊人的提高天然或合成抗微生物剂，例如香草醛的抗微生物活性的性能。

[0014] 术语“增加抗微生物剂的抗微生物活性”可以意味着，当萜类化合物存在时，所述抗微生物剂呈现出比不存在萜类化合物时更高的抗微生物活性。活性的出人意料的增加可能是协同效应的结果，其中两种物质以互补的方式干扰微生物细胞膜完整性或蛋白质合成。因此，所述抗微生物剂能够干扰微生物的细胞膜的完整性或其蛋白质合成（例如RNA合成），而所述萜类化合物会使所述抗微生物剂更容易进入细胞，或增强其功能。

[0015] 所述抗微生物剂的抗微生物活性可以增加至少1倍，至少2倍，至少3倍，至少5倍，至少8倍，或至少10倍。抗微生物活性可以增加至少20倍，至少50倍，至少100倍，200倍，300倍，500倍，700倍，或1000倍。抗微生物活性甚至可以增加至少1200倍，至少1500倍，1700倍，或至少2000倍或更多。所述抗微生物活性的增加可以用例如在实施例中描述的那些检测法来确定。

[0016] 发明人测试了多种加热后的植物材料，发现经加热的来自不同硬木和软木，例如松木和葱木的包含萜类化合物和抗微生物剂的木屑呈现出令人惊讶的抗微生物性能。因此，所述萜类化合物和/或抗微生物剂可以来自植物，例如硬木或软木。作为所述萜类化合物和/或抗微生物剂来源的适合的硬木种属的例子包括冬青树（冬青属，Ilex genus）、橡树（栎属，Quercus genus）、山毛榉（山毛榉属，Fagus genus）、白蜡树（白蜡树属，Fraxinus genus）、枫树（槭属，Acer genus）、白杨树（杨属，Populus genus）、柳树（柳属，Salix genus），以及栗树（栗属，Castanea genus），例如甜栗（欧洲板栗，Castanea sativa）。

[0017] 作为所述萜类化合物和/或抗微生物剂来源的适合的软木种属包括针叶树或松树。适合的软木种属的例子包括松树（松属，Pinus genus）、云杉（云杉属，Picea genus）、雪松（雪松属，Cedrus genus）、冷杉（冷杉属，Abies genus）、落叶松（落叶松属，Larix genus）、花旗松（黄衫属，Pseudotsuga genus）、铁杉（毒参属，Conium genus）、柏树（柏科Cupressaceae family）、红杉（北美红杉属，Sequoia genus）和紫杉（红豆杉属，Taxus genus）。发明人发现源自松树，尤其是欧洲赤松的材料表现出令人惊讶的抗微生物活性，由此为本发明的组合物提供了有用的来源。因此，所述萜类化合物和/或抗微生物剂可以源自松科，优选为松属，例如silvestrus松(Pinus silvestrus）或negrus松(Pinus negrus)。诸如松香和歧化松香等来自木材的材料也是本发明所用萜类化合物的优良来源。

[0018] 作为所述萜类化合物和/或抗微生物剂来源的植物材料可以先加热，例如暴露于至少50°C或至少115°C的温度。所述植物材料可以暴露于低于200°C或低于150°C的温度。所述植物材料可以暴露于介于75°C和175°C或介于100°C和160°C的温度。所述植物材料可以暴露于所述处理温度至少30分钟，至少1小时，至少5小时，至少24小时，至少36小时，至少48小时或至少72小时。发明人发现，经所述热处理结果会产生本发明的抗微生物组合物。

[0019] 用于第一方面的组合物中，或用于第二方面的用途中的萜类化合物由异戊二烯单元，即2-甲基-1,3-丁二烯或CH2=C(CH3)CH=CH2组成。异戊二烯单元可以由通式（I）表示：

[0020]

[0021] 萜类化合物具有亲水部分（通常为羧酸）以及疏水部分（通常为多环结构）。所述萜类化合物可以是树脂酸，树脂酸可以作为保护剂或木材防腐剂，它由树木的树脂导管周边的薄壁组织上皮细胞产生。

[0022] 萜类化合物可依据异戊二烯单元的数量进行分类。因此，所述萜类化合物可以是二萜类或三萜类化合物。二萜类化合物含有四个异戊二烯单元，三萜类化合物含有六个异戊二烯单元。可用于第一或第二方面的适宜的三萜类化合物可以选自三萜类化合物乌索酸、石竹素、桦木酸、模绕酮酸和羽扇豆醇。三萜类化合物在实施例3中描述。

[0023] 二萜类化合物，其包括树脂酸和氧化树脂酸，具有由取代的十氢萘骨架和包含一个氢键供体基团的亲水区域组成的疏水部分。二萜类化合物在实施例1和2中描述。适宜的二萜类化合物可选自二萜类化合物脱氢松香酸、松香酸、海松酸、贝壳杉烯酸、ent-3-β-羟基贝壳杉烯酸、salvic酸（salvic acid）、桃拓酮、18-乙酸基-顺式-海州常山-3,13-Z-二烯-15-酸(18-acetoxy-cis-cleroda-3,13-Z-dien-15-oic acid)、松香醇(7,13-松香二烯-18-醇，7,13-abietadien-18-ol)、脱氢枞酸基胍（dehydroabieticylguanidines）、花柏酸、铁锈醇、异海松酸、7-氧代-脱氢松香酸、7-羟基-脱氢松香酸和13-羟基-罗汉松-8,11,13-三烯-18酸（13-hydroxy-podocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid）。

[0024] 松香酸可以由通式（II）表示：

[0025]

[0026] 相应地，第一方面的组合物中的或第二方面用途中的所述萜类化合物可以是松香酸，或其衍生物。

[0027] 发明人相信，他们最先生产出了包含松香酸和抗微生物剂的消毒或抗菌组合物。因此，第一方面的所述组合物可以是抗菌剂或消毒剂。抗菌剂可以是任何抗微生物的物质，其用于活组织或皮肤，以减少或防止微生物感染或脓毒症。因此所述抗菌剂中的有效成分最好具有足够的特异性和浓度，其可用于皮肤或组织，而不会产生毒性作用或刺激，但能杀灭微生物。消毒剂可以是任何抗微生物的物质，其杀灭在无生命物体或其表面上的微生物。

[0028] 可依照本发明使用的适宜的松香酸，可包括新松香酸、棕榈酸、左旋海松酸、脱氢松香酸，或其衍生物。

[0029] 优选地，所述萜类化合物是脱氢松香酸(DHAA)，或其衍生物。脱氢松香酸以及适合的衍生物可以由通式(III)、(IV)或(V)表示：

[0030]

[0031] 其中，R是CO2H，CO2Me，CH2OH或CHO；R2是CO2H，CO2Me或CH2OH；R3是CO2H，CO2Me或CH2OH。

[0032] 萜类化合物可以通过不同的方式修饰，例如脱水、卤化、氧化或甲基化以形成一系列具有上述性能的衍生物。因此，适合的萜类化合物衍生物可以包括脱水、氧化、甲基化或卤化形式的萜类化合物。例如，松香酸可脱水形成海松酸。另外，脱氢松香酸可卤化形成12，14-二氯脱氢松香酸。

[0033] 所述萜类化合物或其衍生物可用碱，例如氢氧化钠处理，以形成相应的盐（例如DHAA氢氧化物）。所述盐易溶于水形成溶液，其可用于表面，例如通过喷洒或浸入溶液自身。

[0034] 依照本发明使用的所述抗微生物剂能干扰微生物细胞膜的完整性，该过程发生的机制被认为因物质不同而各异，但一般认为，所述抗微生物剂中的亲脂部分能与微生物细胞膜的磷脂成分发生反应，从而改变位于细胞膜上的钙离子通道和钾离子通道的活性。另外，所述抗微生物剂可以通过其生化性能和分子形状与细胞膜相互作用，从而影响膜酶、膜载体分子和膜受体的活性。上述任一种或全部的机制能干扰微生物细胞膜的完整性，导致细胞死亡。

[0035] 许多香精油，例如那些自植物提取的，呈现出不同的抗微生物活性。因此，在本发明的一个实施方案中，用于第一或第二方面的所述抗微生物剂可包含香精油。可用的适合的香精油包括百里香油（活性成分：百里香酚）、丁香油（活性成分：丁香酚）、茶树精油（活性成分：松油烯-4-醇）、大茴香子油、菖蒲油、樟脑油、柏木油、肉桂油、香茅油、柠檬油、柠檬草油、梨莓油、肉豆蔻油、玫瑰草油、薄荷油、迷迭香油、罗勒油、香根草油、黑胡椒油、姜油、没药油、牛至油、月桂叶油、香叶油、橙油、莳萝油或冬青油。

[0036] 因此，所述抗微生物剂可包含百里香酚，或其衍生物。百里香酚的化学分子式和结构式在此提供。

[0037] 据信，香精油以上述方式与微生物细胞膜整体相互作用，即油中的亲脂部分与细胞膜的脂质部分发生反应，改变细胞膜中离子通道的活性。另外，香精油据信通过其生化性能和分子形状与细胞膜相互作用。香精油通常包含生物活性化合物的混合物，但被认为对其抗微生物活性起作用的主成分是酚类。在香精油中发现的酚类化合物的例子记载于表1。

[0038] 表1：香精油中发现的抗微生物酚类化合物的例子

[0039]

[0040] 因此，依照本发明使用的所述抗微生物剂可扩大至使用表1所列任何一种酚类化合物。香精油中同样也被认为具有抗微生物活性的其他生物活性化合物包括邻甲酚、间甲酚、对甲酚、香芹酚、甲氧甲酚、异丁子香酚、对苯二酚、愈创木酚、水杨酸甲酯、反式-茴香醚、甲基丁子香酚、甲基胡椒酚、对甲氧基苯丙酮、苯甲醛、茴香醛和枯茗醛。因此，本发明所述抗微生物剂也可包括上述化合物中的任何一种。

[0041] 如实施例中所描述，发明人证实，当与萜类化合物脱氢松香酸组合时，香草醛的抗微生物活性出人意料地增强。因此，所述抗微生物剂可以是香草醛或其衍生物。需要注意的是，香草醛（又名甲基香兰素或4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是具有C8H8O3分子式的有机化合物，由分子式VI表示：

[0042]

[0043] 相应地，在一个实施方案中，本发明第一方面的组合物包含脱氢松香酸或其衍生物，以及香草醛或其衍生物。在第二方面用途的一个实施方案中，脱氢松香酸或其衍生物用于提高香草醛或其衍生物的抗微生物特性。

[0044] 香草醛的常见衍生物是香草酸，其由分子式VII表示：

[0045]

[0046] 另一种适合的香草醛衍生物可包括乙基香草醛。

[0047] 如图2所示，发明人证实，1，2-二苯乙烯的抗微生物活性也能被萜类化合物，例如脱氢松香酸令人惊讶地增强。因此，在另一实施方案中，所述抗微生物剂可以是1，2-二苯乙烯，或其衍生物。1，2-二苯乙烯存在两种可能的同分异构体，顺式和反式同分异构体，其由分子式VIII和IX表示：

[0048]

[0049] 如实施例12中所述，发明人证实，松柏醛的抗微生物活性也能被萜类化合物，例如脱氢松香酸令人惊讶地增强。因此，在另一实施方案中，所述抗微生物剂可以是松柏醛或其衍生物，其由分子式X表示：

[0050]

[0051] 如实施例8中所述，发明人证实，脱氢姜油酮的抗微生物活性也能被萜类化合物，例如脱氢松香酸令人惊讶地增强。因此，在另一实施方案中，所述抗微生物剂可以是脱氢姜油酮或其衍生物，其由分子式XI表示：

[0052]

[0053] 因此，在另一实施方案中，本发明第一方面的组合物可以包含脱氢松香酸或其衍生物，香草醛或其衍生物，和/或1，2-二苯乙烯和/或松柏醛和/或脱氢姜油酮，或其衍生物。

[0054] 另外，在另一实施方案中，第二方面的用途可以包含脱氢松香酸和/或1，2-二苯乙烯和/或松柏醛和/或脱氢姜油酮，或其衍生物用于提高香草醛或其衍生物的抗微生物特性。

[0055] 在另一实施方案中，所述抗微生物剂可以是蛋白质性质的，优选包含至少一种多肽。因此，当被试验者食用后，所述抗微生物剂可以被蛋白酶消化。例如，所述抗微生物剂可以是乳酸链球菌肽，其为具有34个氨基酸的多环肽抗微生物化合物。当被试验者食用后，乳酸链球菌肽被体内存在的蛋白酶快速失活。如实施例5中所述，发明人证实，脱氢松香酸水溶性差，且证实，令人惊讶的是，包含脱氢松香酸和香草醛的材料的水提取物对微生物细胞并无毒性。相反，抗微生物活性保留在处理过的材料中。因此，将脱氢松香酸与蛋白性质的抗微生物剂例如乳酸链球菌肽组合将制得非常安全的产品，因为不仅脱氢松香酸不易溶解，而且还有变性蛋白，该产品不会对试验者具有任何毒性作用。

[0056] 除了之前提到的可依照本发明用作抗微生物剂的“天然产品”，还有许多也能破坏微生物细胞膜的化学制品，其造成微生物的死亡，因此也可依照本发明用作抗微生物剂。这些化合物可分为醇类、醛类、氧化剂、酚类或季铵化合物。通常，这些化合物用于清洁表面，并以水溶液形式提供（例如氯）。因此，这些化合物与萜类化合物例如脱氢松香酸组合以增强其抗微生物活性可使得这些化合物更加有效，即便被稀释时。所述抗微生物剂可以是或不是抗生素。所述抗微生物剂可以是或不是重金属，例如锌。

[0057] 发明人还发现，除了萜类化合物之外，其他具有极性、酸性基团或部分以及刚性疏水部分的分子，也可用于增强抗微生物剂例如香草醛的抗微生物活性。

[0058] 因此，根据本发明的第三方面，提供了具有极性部分和刚性疏水部分的化合物用于增强香精油或香草醛，或其衍生物抗微生物活性的用途。

[0059] 所述极性部分可包含羟基，例如羧酸部分。所述疏水部分可包含至少一个芳香环，优选多个芳香环。所述化合物可以是类异黄酮植物抗毒素（例如菜豆蛋白）、大豆抗毒素或紫檀碱。所述香精油可以是前述中的任一个，或其活性成分。需要注意的是，第三方面的用途可用于本发明以下任一方面中所述的任何应用中。

[0060] 发明人仔细研究了于此描述的可依照本发明使用的每种抗微生物剂的化学结构，发现它们均可用相同的化学分子式表示。

[0061] 因此，所述抗微生物剂可用分子式XII表示：

[0062]

[0063] 其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自选自H、OH、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的饱和或不饱和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。

[0064] R1可以是OH、C1-C4的烷基或烷氧基、C1-C4的醛或C1-C2的烷基取代的苯基。R1可以是OH、C1的烷氧基、C1的醛或C1-C2的烷基取代的苯基。

[0065] R2可以是H、C1-C4的烷基或烷氧基，或C2-C4的酯。R2可以是H、C1-C3的烷基、C1-C3的烷氧基，或C2-C3的酯。

[0066] R3可以是H或C1-C4的烷基。R3可以是H或C1-C3的烷基。

[0067] R4可以是H、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的的饱和或不饱和醛，或C2-C4的酮。R4可以是H、C1-C3的烷基或亚烷基、C1-C2的烷氧基、C1-C2的饱和或不饱和醛，或C2-C3的酮。

[0068] R5可以是H或C1-C4的烷基。R5可以是H或C1-C2的烷基。

[0069] R6可以是H或C1-C4的烷基。R6可以是H或C1-C2的烷基。

[0070] R1、R2、R3、R4、R5和R6可以如下表所限定。

[0071]

[0072] 需要注意的是，有许多氧化的香精油或其衍生物的组分具有上述通式XII，但其并未在列表中逐一提及。

[0073] 第四方面中，提供了包含萜类化合物或其衍生物，以及由分子式XII表示的抗微生物剂的抗微生物组合物。

[0074]

[0075] 其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自选自H、OH、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的饱和或不饱和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。

[0076] 第五方面中，提供了萜类化合物或其衍生物用于增强由分子式XII表示的抗微生物剂的抗微生物活性的用途。

[0077]

[0078] 其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自选自H、OH、C1-C4的烷基或亚烷基、C1-C4的烷氧基、C1-C4的饱和或不饱和醛、C2-C4的酯或酮、C1-C4的羧基以及C1-C3的烷基取代的苯基。依照本发明的所述抗微生物组合物可用于防止、对抗或治疗任何微生物感染，其为细菌或真菌感染。可用第一或第四方面的抗微生物组合物治疗或防止的细菌感染可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染。可用所述组合物对抗的革兰氏阳性细菌的例子包括厚壁菌(Firmicutes)门中的细菌，其包括芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、梭状杆菌属(Clostridium spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)和肠球菌属(Enterococcus spp.)。例如，所述革兰氏阳性细菌可以是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。可用所述组合物对抗的革兰氏阴性细菌的例子包括肠杆菌科(Enterobaceriaceae)，例如沙门氏菌属(Salmonella spp.)（例如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠炎沙门菌(S.enteritidis)或鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)），以及肠杆菌属(Escherichia spp.)（例如大肠杆菌(E.coli))）。弯曲菌属(Campylobacter spp.)和假单胞菌属(Pseudomonas spp.)是可用本发明的组合物治疗的革兰氏阴性细菌的其他例子。

[0079] 可用所述组合物对抗的感染人或动物的真菌感染的例子主要是皮肤病。例如，可对抗的真菌可以是丝状真菌，例如青霉属(Penicillium spp.)或曲霉属(Aspergillus spp.)。感染皮肤的真菌病的例子有花斑癣（致病病原为正圆瓶形酵母(Pityrossporum orbiculare)）、金钱癣、足癣（致病病原为小孢霉属(Microsporum)、毛癣菌属(Trichophyton)和表皮癣菌属(Epidermophyton)的真菌）以及例如鹅口疮（致病病原为白假丝酵母(Candida albicans)）的酵母感染。造成皮肤成片剥落（头皮屑）的头皮真菌感染也能用本发明的组合物治疗。除了感染哺乳动物的真菌感染之外，本发明的组合物可用于对抗植物或植物产品的真菌感染。特别令人感兴趣的是那些即便在植物本身已死亡时，也能在植物残体上存活或产生孢子的真菌。能在死亡的植物材料上存活，并造成严重损失的真菌病的例子包括疫霉属（Phytophthora）、腐霉菌（Pythium）、核盘菌属（Sclerotinia）、轮枝孢属（Verticillium）、文图拉属（Ventura）、葡萄孢属（Botrytis）和镰刀菌属（Fusarium）的真菌。一个极具破坏性的疾病的例子是栎树猝死病菌，即栎树猝死病的致病病原Phytophthora ramorum。该病感染杜鹃花属种，并对橡树（栎属）具有毁灭性的作用。本发明的组合物也可用于对抗例如酿酒酵母（S.cerevisiae）的酵母感染。

[0080] 已知可用本发明组合物对抗的多种不同的微生物，发明人认为，第一和第四方面的组合物可通过增强已知抗微生物剂的活性，应用于多种不同的抗微生物用途（临床或其他方面的），例如在工业的、家用的、医疗保健、包装和工程方面的应用，其中微生物活性或甚至其存在是个问题。优选地，所述组合物以可溶的形式（即溶于乙醇或丙酮），或通过使其转变成可溶于水的盐来应用。然而，当不是盐的形式时，一旦溶剂挥发，所述组合物自身以水不溶的形式存在，即吸收、整合或覆盖到支持表面或材料上。

[0081] 因此，本发明第六方面中提供了包含第一或第四方面的所述抗微生物组合物的液体剂型。对哺乳动物具有低毒性，味道或气味良好或完全无味，并具有优良且广泛的抗微生物性能的天然化合物可应用在很多方面。例如，它们可用于为动物垫料和动物床消毒，或为例如用于制备食物的器具表面消毒。组合物也可用于抗菌洗手液和肥皂、去屑洗发露、皮肤霜和漱口水。

[0082] 有利地，使用萜类化合物改善干扰细胞膜完整性的抗微生物剂活性，例如香草醛或香精油，导致现有天然产品活性显著增强，即使在原始活性成分处于低浓度（即非常稀）的情况下。因此，第一或第四方面的组合物在其没有气味或味道的低浓度的情况下是有效的。另外，重要的是，本发明的组合物对人或哺乳动物是无害的，因为所述化合物天然地普遍存在于周围环境中，因此当处理过的产品通过常规废物处理渠道处理时，对环境的影响没有显著的增加。

[0083] 在一个实施方案中，所述抗微生物组合物可用于处理动物垫料，因为其抗微生物性能，防止了沙门氏菌、弯曲杆菌、分枝杆菌和大肠杆菌的生长，已知这些菌均为与动物垫料相关的主要动物病原体。对各种参与将尿酸和尿素转变成氨的微生物的抑制可防止动物垫料产生腐蚀性，并防止氨释放入大气中。

[0084] 因此，第七方面中提供了包含依照第一或第四方面所述的抗微生物组合物的动物垫料。为了有效减少第五方面的动物垫料中氨的形成以及病原体数量，用第一方面所述的组合物对木屑或其他吸附剂，例如纸、珍珠岩或其他多孔材料进行处理。所述组合物最好是包含脱氢松香酸或其衍生物与香草醛。所述组合物可包含作为溶剂的乙醇或丙酮。因此，垫料原料可通过直接喷洒，或通过浸入溶液，或将溶液与垫料原料混合来处理，然后令溶剂挥发。可选地，所述组合物先通过成盐而具有水溶性，使其可与水和其他极性溶质配合。

[0085] 有利地，第七方面所述的垫料减少了异味，并增进了动物的健康安适。所述动物垫料可用于动物饲养产业，例如用于家禽，例如雏鸡、火鸡、鸭、鸡或鹅，也可用于猪、牛、羊、马以及其他动物的垫料。可选地，所述动物垫料可用于宠物产业，例如作为兔子、豚鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠、小鼠或笼中鸟的垫料。第七方面的垫料也可用于在动物实验室试验中的动物，例如小鼠、大鼠或兔子（例如基因敲除小鼠/裸鼠）。所述垫料也可用于动物园中饲养动物的垫料/窝。所述垫料也可用于运输活动物的动物垫料，或用于产卵母鸡的动物垫料/窝，因为已知肠炎沙门氏菌感染健康母鸡的卵巢，并在蛋壳形成前感染鸡蛋。

[0086] 第一或第四方面的组合物也可用于园艺和造林，以防止因真菌或细菌感染引起的植物病所造成的农作物损失。因此，所述组合物可用作覆盖物，即土壤表面的保护性覆盖，以防止土壤滋生的病原体感染植物、果实或蔬菜。可选地，所述组合物可直接用于植物残体，以防止定居于这些材料的病原体扩散。

[0087] 因此，第八方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物组合物的覆盖物。

[0088] 所述覆盖物可用来使微生物感染引起的农作物损失最小化或防止该损失。例如，50％的草莓和20-40％的葡萄因诸如葡萄孢属的真菌感染受损，苹果70％的经济价值因苹果黑星病受损。据信上述农作物损失可通过使用所述覆盖物而避免。

[0089] 发明人还认为，第一或第四方面的所述组合物能用于防止或抑制微生物定居于物体自身。因此，第九方面中提供了防止或抑制微生物定居于物体本身的方法，其包含用第一或第四方面的所述组合物接触或涂覆所述物体的表面。

[0090] 医院“超级细菌”是医疗系统的主要问题之一，抗微生物产品是克服该问题的有效解决方法。本发明的组合物已显示出能有效防止革兰氏阴性细菌，例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和艰难梭菌(Clostridium difficile)的生长。该技术也能用于天然（即羊毛、棉花、亚麻、黄麻等）的纤维和例如由尼龙和聚酯制成的人造纤维，其可用于制造病号服，以及床上用品。其他应用包括处理医疗设备、家具、电器和电子产品，以及窗框。

[0091] 第十方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物组合物的物体。

[0092] 所述物体可涂有所述组合物。优选地，一经涂覆，所述组合物便处于不溶的形式。优选地，用于第九方面所述方法或第十方面所述物体的组合物的用量足以有效杀灭或防止微生物生长。需要注意的是，本发明的组合物对涂覆需要无菌的表面或物体特别有用，并且如上述讨论，所述组合物具有持久抗微生物的优势。本发明组合物可用于涂覆生物或医疗场所或环境中所用的任何物体或设备，对这些物体或设备而言，长期防止可导致病人感染的微生物感染或污染非常重要。

[0093] 所述物体可以是医疗器械。可用本发明的组合物涂覆的医疗器械的例子包括医用导管、支架、创伤敷料、绷带、避孕器、外科用移植物和替代关节、隐型眼镜等。本发明的组合物对涂覆生物材料和物体，以及由此制备的器械特别有用。生物材料的微生物污染/定居是特别棘手的问题，因为微生物可用上述材料作为生长基质。生物材料（例如胶原和其他生物聚合物）可用于涂覆人工关节表面。或者，某些移植物可基本上包含含有本发明的消毒剂的上述生物材料。

[0094] 开发绷带、创伤敷料和石膏时，产生针对致病原的有效屏障是一个重要的考虑因素。因此，尽管产生针对病原生物体的屏障，用本发明的组合物处理上述产品可以允许气体交换。相似地，被单和枕套能用所述组合物处理，使其具有抗微生物活性。

[0095] 本发明的组合物可用于涂覆处于要求无菌的环境中的任何表面，例如在医疗环境中的任何表面。所述组合物可用于保持医院病房清洁，因此几乎医院的任何部分均可用本发明的组合物涂覆。所述组合物可用于防止手术室中的医疗设备（例如手术台），以及手术室墙壁和地板的表面感染，因此，这些表面可涂以本发明的组合物。发明人相信，此处描述的组合物将对总体改善无菌性和洁净性非常有用。

[0096] 本发明的组合物也可用于保护多种不同易于受微生物感染的家用产品。所述产品可涂以所述组合物，而且该产品可为各种不同类型的产品，例如制备食物的表面，厨房案板或地毯。地毯通常由羊毛、尼龙、聚酯和聚丙烯纤维制成，其可简单地涂以本发明组合物。然而，需要注意的是，潜在的应用可能更广。上述依照本发明的组合物可应用的物体和表面的名单尚不详尽。因此，所述组合物可用于任何易于受微生物感染或污染的表面，例如厨房和浴室表面及产品，例如马桶座或马桶自身。

[0097] 发明人认为，本发明的组合物可用于制造抗微生物材料，例如由聚合物、纺织品或纤维织物制成的鞋垫，所述聚合物、纺织品或纤维织物可用于制造垫料，也可用于服装和时装行业。因此，第十一方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物组合物的聚合物或纺织品。

[0098] 所述聚合物的纺织品可用于例如医院和手术室所用的寝具，例如枕套、床单，以及被套。所述纺织品或聚合物可用于制造衣物，例如易于受微生物感染的衣物，例如内衣或鞋垫。

[0099] 因此，第十二方面中提供了包含依照第十一方面的所述纺织品或聚合物的衣着类商品。所述衣着类商品可以是内衣或鞋垫。所述衣着类商品可以是鞋类。

[0100] 因此，第十三方面中提供了包含依照第十一方面的所述纺织品或聚合物的鞋类或其鞋垫。本发明的抗微生物组合物也可用于国防的应用。士兵，尤其是战争中的士兵，由于不能经常清洗而受困于卫生问题，因而易于受微生物感染。因此，第十二方面的衣着类商品可为制服，优选为军装。

[0101] 本发明的其他应用包括食品包装。水果收获后，因真菌和细菌感染导致的农作物损失很普遍，估计收获后损失至少与收获前损失相当。因此，迫切需要能用于食品包装行业的抗微生物材料。

[0102] 因此，第十四方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物组合物的包装材料。优选地，所述包装材料用于包装易腐烂的产品，即任何寿命有限的产品或具有微生物感染风险的产品。优选地，所述包装材料用于包装食品或食品原料。所述包装材料可防止易腐烂或刚收获的食物产品的损失，例如易受腐败菌，例如真菌和细菌感染的水果和蔬菜。为了防止由上述腐败菌造成的损失，所述包装材料可用第一或第四方面的组合物涂覆或喷洒，或浸入所述组合物中。

[0103] 可用所述包装材料包装的所述食品可以是水果（例如油桃、桃子、苹果或梨）或蔬菜、肉、面包或饼干等。水果此处用作高度易感收获后疾病的农产品的例子，然而其他农产品，例如西红柿、胡萝卜、生菜等，能受益于本发明组合物的保护。

[0104] 第十五方面中提供了第一或第四方面的所述抗微生物组合物的下述用途，即在防止或抑制食品的微生物感染的方法中的使用，该方法包含用第一或第四方面的所述抗微生物组合物接触或涂覆食品的表面。

[0105] 所述食品可以是水果、蔬菜、肉或奶制品。香精油经常用于水果包装，因为由于其挥发性而产生抑制食品腐败微生物的气氛。一旦食品开封，香精油挥发，而不会在食物产品上有任何残留。发明人因此设想，使用第一或第四方面的所述组合物，其中萜类化合物与香精油组合，用于处理食品，诸如水果。萜类化合物与干扰细胞膜完整性的抗微生物剂组合使用，例如与香精油组合，产生更大的抗微生物效应。当水果开封时，所述香精油挥发，不会有香精油残留，而剩余分子本身并无害。因此，所述处理对食用所述水果的人无害。

[0106] 举例来讲，脱氢松香酸与天然抗微生物剂一起的应用是用于食品，例如水果的表面。因为仅是水果表面被处理，即使每单位表面面积浓度较高，每单位重量或体积的浓度会较低，取决于水果的大小。而且，水果的摄入将导致所述组合物在消化道内因食物与唾液和消化液的混合而进一步稀释。众所周知，脱氢松香酸和其他萜类化合物难溶于水，因此可以设想，当其被摄入时，甚至与影响细胞膜完整性的物质共用时，其效果甚微。

[0107] 另外，实施例5中，发明人检测了加热的松树木屑（其包含脱氢松香酸和多种抗微生物产品，包括香草醛）的水提取物的抗微生物性能。每种提取物对沙门氏菌效果甚微，然而经提取后的木屑本身保留了极高的抗微生物活性。这清楚地表明，脱氢松香酸难溶于水，因此当被摄入时，不太可能造成任何毒性效应。为了使所述组合物更安全，优选将萜类化合物与可在胃中快速降解的抗微生物剂组合，例如蛋白性质的化合物，例如乳酸链球菌肽。

[0108] 发明人还设想用第一或第四方面的所述组合物处理或涂覆盛器或容器。

[0109] 因此，第十六方面中提供了包含依照第一或第四方面的所述抗微生物组合物的容器。

[0110] 所述容器可容纳食品，即食品容器。所述容器可容纳任何易腐败、损耗或受微生物感染的食品材料，例如新鲜食品或产品。例如，所述食品可包括水果或蔬菜。第一或第四方面的所述组合物也可用于处理容纳废料的盛器，或作为废料容器的添加剂。因此，所述容器可容纳废料，即废物容器。所述容器可用于存储任何可能降解的废料，例如食余残渣。可降解垃圾，例如有机厨房垃圾处理不当时会招引苍蝇，并产生异味。因此，经所述组合物处理的所述废物容器可以是家用或商用垃圾箱，其导致苍蝇或异味的减少或消除。

[0111] 总而言之，本发明的组合物包含与抗微生物剂组合的萜类化合物，该抗微生物剂干扰微生物细胞膜的完整性或蛋白质合成，例如RNA合成。需要注意的是，大多数合成的抗微生物剂（例如苯酚、乙醇、氯化的化合物等）高度可溶，因此，通过接触，对人细胞有毒害。香精油趋于更加疏水，但仅有温和的抗微生物活性。然而，如实施例5中所述，脱氢松香酸难溶于水，因此其效果仅限于经处理的特定表面。因为其用于上述的任何应用中，例如用于动物垫料、医院和家用表面及鞋垫时，不会导致所述物质转移至与经处理物体接触的人，因而优势明显。因此，经处理的物体具有抗微生物活性，但对动物和人无毒害。另外，萜类化合物例如脱氢松香酸与温和的抗微生物天然产品（例如香精油）的组合，允许这些通常价格昂贵，且具强烈的味道和气味的产品，可以在大大降低的浓度下使用而保持高效力。

[0112] 另一方面提供了包含萜类化合物或其衍生物，以及干扰细胞膜完整性的抗微生物剂的抗微生物组合物。

[0113] 另一方面提供了萜类化合物或其衍生物增强抗微生物剂的抗微生物活性的用途，所述抗微生物剂干扰细胞膜完整性。

[0114] 此处描述的所有特征（包括任何附随的权利要求、摘要和附图），和/或由此公开的任何方法或程序中的所有步骤，可与任何上述方面以任何方式组合，除了至少一些上述特征和/或步骤相互排斥的组合之外。

[0115] 为了更好的了解本发明，并展示本发明的实施方案如何实施，以下附图和实施例可作为参考。

[0116] 图1显示使用本发明一个实施例中包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）的抑制实验；

[0117] 图2显示使用包含1，2-二苯乙烯和脱氢松香酸的组合物抗金黄色葡萄球菌的抑制实验；

[0118] 图3显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗肠炎沙门菌（革兰氏阴性细菌）的抑制实验；

[0119] 图4显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗鼠伤寒沙门菌（革兰氏阴性细菌）的抑制实验；

[0120] 图5显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）的抑制实验；

[0121] 图6显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗青霉属（丝状真菌）的抑制实验；

[0122] 图7显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗曲霉属（丝状真菌）的抑制实验；以及

[0123] 图8显示使用包含香草醛和脱氢松香酸的组合物抗酿酒酵母（酵母）的抑制实验；实施例

[0124] 发明人研究了轻微加热的松树木屑产生抗微生物活性的机制。如下述实施例所述，他们观察到，萜类化合物，脱氢松香酸能显著提高香草醛和其他天然抗微生物剂，例如香精油的抗微生物活性。

[0125] 实施例1脱氢松香酸对香草醛抗微生物活性的协同效应

[0126] 本实施例的目的在于确定脱氢松香酸增强香草醛的抗微生物活性的程度。

[0127] 方法

[0128] 用乙醇和水（80/20体积比）由20mmol的香草醛制备按2倍稀释的系列，产生20mmol-0.00975mmol的各种浓度。另制备20mmol的脱氢松香酸的醇和水的溶液。

[0129] 为了比较脱氢松香酸对香草醛抗微生物效果的影响，10μl每种浓度的香草醛稀释液，连同10μl的20mmol脱氢松香酸，滴至三块10mg的珍珠岩上，使每克珍珠岩具有与在该溶液中相同的浓度。一套对照处理不加脱氢松香酸，另一套对照处理仅加20mmol脱氢松香酸，第三套对照处理仅加10μl以80/20配比的醇和水，不加香草醛或脱氢松香酸。醇6
一经挥发，所有重复样品接受10μl包含每毫升约5x10 菌落形成单位（cfu）的肠道沙门
4
氏菌悬液，每块珍珠岩颗粒上的细菌载量约为5x10。将每块珍珠岩颗粒在微量离心管中于
25°C温育24小时，最终分散在1ml 0.25强度的林格氏液中。从每份悬液中取6滴20μl的液滴置于木糖-赖氨酸-脱氧胆盐（XLD）琼脂培养基上，每滴约含1000个细菌细胞。

[0130] 结果

[0131] 结果见表2。

[0132] 表2-香草醛以及香草醛和脱氢松香酸组合物对肠道沙门氏菌存活的影响（n=3）[0133]

[0134] 结论

[0135] 表2所示结果表明：

[0136] （1）浓度为20mmol或低于20mmol的香草醛单独对沙门氏菌无抑制效果；

[0137] （2）当与脱氢松香酸组合时，浓度为0.019mmol的香草醛仍具有显著抑制效果。这表明脱氢松香酸使香草醛的抗微生物活性至少增强1000-2000倍；以及

[0138] （3）浓度为20mmol的脱氢松香酸无显著的抗微生物活性。

[0139] 实施例2有机酸对香草醛的抗微生物活性影响

[0140] 本实施例目的在于评估脱氢松香酸对香草醛的协同效应是否特异性地与脱氢松香酸有关，或者能否解释为酸的pH效应。

[0141] 方法

[0142] 用乙醇和水（80/20体积比）由20mmol的香草醛制备按2倍稀释的系列，产生20mmol-0.078mmol的各种浓度。另制备20mmol的柠檬酸水溶液。

[0143] 为了评估柠檬酸是否具有与脱氢松香酸相同的效果（如实施例1所述），10μl的每种香草醛稀释溶液滴至三块10mg的珍珠岩上，使每克珍珠具有与在该溶液中相同的浓度。随后，10μl的20mmol柠檬酸滴至每块珍珠岩颗粒。一套对照处理不加柠檬酸，另一套对照处理仅加10μl以80/20配比的醇和水，不加香草醛或柠檬酸。醇一经挥发，所有重复6
样品接受10μl包含每毫升约5x10cfu的沙门氏菌悬液，每块珍珠岩颗粒上的细菌载量约
4
为5x10。

[0144] 将每块珍珠岩颗粒在微量离心管中于25°C温育24小时，最终分散在1ml 0.25强度的林格氏液中。从每份悬液中取6滴20μl的液滴置于XLD琼脂培养基上，每滴约含1000个细菌细胞。

[0145] 结果

[0146] 结果见表3。

[0147] 表3-香草醛和柠檬酸的组合对肠道沙门氏菌存活的影响（n=3）

[0148]

[0149]

[0150] 结论

[0151] 表3所示结果表明：

[0152] （1）柠檬酸非常轻微地增加香草醛的效果（最大2倍）；以及

[0153] （2）脱氢松香酸对香草醛活性的影响并非由于pH效应。

[0154] 实施例3香草醛与各种不同的三萜类化合物组合的抗微生物活性

[0155] 实施例3的目的在于确定同样也具有亲水和疏水部分的三萜类化合物，是否具有和二萜类化合物脱氢松香酸相似的与香草醛相关的活性。

[0156] 方法

[0157] 用乙醇和水（80/20体积比）由20mmol的香草醛制备按10倍稀释的系列，产生20mmol-0.02mmol的各种浓度。另制备20mmol的乌索酸、石竹素以及白桦脂醇的醇溶液。

[0158] 为了确定乌索酸、石竹素以及白桦脂醇、脱氢松香酸对香草醛抗微生物效果的影响，10μl的每种香草醛稀释溶液，连同10μl的20mmol的每种三萜类化合物，滴至三块10mg的珍珠岩上，使每克珍珠岩具有与在该溶液中相同的浓度。一套对照处理不加三萜类化合物，另一套仅加20mmol脱氢松香酸。醇一经挥发，所有重复样品接受10μl包含每毫
6 4
升约5x10cfu的肠道沙门氏菌悬液，每块珍珠岩颗粒上的细菌载量约为5x10。将每块珍珠岩颗粒在微量离心管中于25°C温育24小时，最终分散在1ml 0.25强度的林格氏液中。
从每份悬液中取6滴20μl的液滴置于XLD琼脂培养基上，每滴约含1000个细菌细胞。

[0159] 结果

[0160] 结果见表4。

[0161] 表4：香草醛与三种三萜类化合物（乌索酸（a）、石竹素（b）以及白桦脂醇（c））的组合物对肠道沙门氏菌存活的影响（n=3）

[0162] （a）乌索酸

[0163]

[0164] （b）石竹素

[0165]

[0166] （c）白桦脂醇

[0167]

[0168] 结论

[0169] 表4所示结果表明：

[0170] （1）所有测试的三萜类化合物均增强香草醛活性；

[0171] （2）所述三种三萜类化合物在增强抗微生物活性的效果方面没有显著区别，以及[0172] （3）三萜类化合物与香草醛结合的协同效应比所观察到的脱氢松香酸与香草醛组合使用的协同效应弱。最有可能的原因是三萜类化合物极难溶，即便近距离接触时，也可能无法被微生物细胞吸取足够的量以发挥显著的效果。

[0173] 实施例4来自不同树种的加热和不加热木屑的抗微生物效果

[0174] 实施例4的目的在于确定来自一系列有代表性的软木种和硬木种的加热和不加热木屑的抗微生物效果。

[0175] 方法

[0176] 本实验选取不同软木（松树、云杉、雪松）和不同硬木（山毛榉、桦木、白蜡木、甜栗、红橡木）的主干木料的木屑，每种木屑分置于六个炉中。其中三个炉于140°C加热72小时，其他三个炉于20°C干燥，每种处理给出三个重复样品。随后，取自每种处理的1g木屑8
置于通用瓶中，每瓶接种1ml肠道沙门氏菌的乳浊液（每毫升约10cfu）。接种后的木屑于-8
25°C温育20小时，随后，由所述木屑制备10倍稀释的系列（未稀释-10 ），取0.1ml的每种稀释液置于XLD琼脂培养基上铺板。25°C温育36小时后，对沙门氏菌菌落进行计数。

[0177] 结果

[0178] 结果见表5。

[0179] 表5：选自软木和硬木的加热和不加热的木屑上的肠道沙门氏菌的复壮(log8
cfu/克木头±SE)（n=3）。每个重复样品接种约10cfu的菌。

[0180]

[0181] *不同的字母代表不同处理之间的显著性差异。

[0182] 结论

[0183] 从表5所示数据可得出以下结论：

[0184] （1）不加热的木屑其抗微生物性能有小的但显著的差别。云杉、桦木和红橡木抗微生物活性最差，因为其每种木材使得细菌菌落复壮数目最大。在加热处理前，柏树和桉树的抗微生物活性最强，因为这两种木材导致较少的细菌菌落生长；

[0185] （2）加热导致所有被测木种的抗微生物活性显著增强；

[0186] （3）加热导致桉树的抗微生物活性增强3倍，云杉的抗微生物活性增强1000倍，松树、柏树、白蜡木、山毛榉、橡木和桦木均完全抑制菌落复壮；以及

[0187] （4）除了香草醛之外，松树和雪松中必定还含有其他抗微生物物质。

[0188] 实施例5毒性测试

[0189] 本实施例的目的在于说明脱氢松香酸和香草醛（或任何其他来源于木材的抗微生物物质）的组合物被人食用时是安全的。

[0190] 物质的潜在危害取决于其潜在毒性和其与靶细胞的接触。因此，搞清潜在的毒性物质将其递呈至人类细胞的潜在通路对确定潜在危害（风险）至关重要。如果能证实所述物质（或物质的毒性组合物）不可能与人类靶细胞接触，则所述物质可认定为安全的。对于脱氢松香酸和香草醛（或任何其他天然抗微生物剂）而言，当涂覆了所述产品的食物被摄入时，有至少四种机制能防止其与人细胞接触，即：

[0191] 1）所述组合物的摄入将导致所述化合物被充分稀释而无效；

[0192] 2）消化系统的细胞由一层粘液保护，使消化系统的细胞免于接触所述组合物；

[0193] 3）一种（或两种）化合物被消化系统失活。这可能是酶活性的结果；以及[0194] 4）所述化合物在胃液中的溶解性不足以对消化系统的细胞产生影响。

[0195] 只有第4种可能性可在不使用喂食研究时进行测试。

[0196] 方法

[0197] 本实验中，加热和不加热的松树木屑用作测试材料。之前的研究表明，加热的松树木屑具有高度抗微生物活性。该效应据信至少部分归因于脱氢松香酸对一些在轻微持久加热期间所形成的温和的抗微生物物质的协同效应（参见实施例1和3）。如果这些物质保持与松树木屑结合而且不能用水提取，可以设想它们无法溶于消化系统，也不会导致任何的接触。沙门氏菌用作测试微生物，因为已经证实，沙门氏菌细胞对松香酸和香草醛的组合物敏感（参见实施例1）。

[0198] 水提取

[0199] 按如下浸泡规定，通过添加5ml无菌水至2g木屑（三个重复样品），使取自每组处理和未处理的松树木屑的6g材料浸泡于水中：

[0200] ●室温浸泡24小时

[0201] ●90°C水浴浸泡24小时

[0202] 为了评估提取物是否具有抗微生物活性，进行如下步骤：

[0203] 1、将1ml提取物倾倒于1g撕碎（高压灭菌）的滤纸（12个样品）上；

[0204] 2、用0.25强度的林格氏液作为对照（3个样品）；

[0205] 3、样品于50°C干燥过夜（或直至干燥）；

[0206] 4、制备于0.25强度的林格氏液中的沙门氏菌乳悬液，每个样品添加1ml该乳悬液；

[0207] 5、30°C温育过夜；

[0208] 6、每个样品经系列稀释（10-1-10-6）后铺板（15x6=90块板）；

[0209] 7、温育并清点计数板；以及

[0210] 8、与对照和不加热木屑的提取物比较抑制效果。

[0211] 为了评估提取后的木屑的抗微生物活性，进行如下程序：

[0212] 1、将提取后的木屑于50°C干燥过夜（或直至干燥）；

[0213] 2、用2g切碎的滤纸作为对照（3个样品）；

[0214] 3、每2g木屑和每2g滤纸添加2ml沙门氏菌悬液；

[0215] 4、30°C温育24小时；

[0216] 5、每个样品经系列稀释（10-1-10-6）后铺板；

[0217] 6、温育并清点计数板；以及

[0218] 7、与对照（滤纸）和不加热木屑比较抑制效果。

[0219] 醇提取

[0220] 从处理和未处理的每批次中取6g材料，通过添加5ml甲醇至2g木屑（三个重复样品），浸泡24小时：

[0221] 为了评估提取物是否具有抗微生物活性，进行如下步骤：

[0222] 1、将1ml提取物倾倒于1g撕碎（高压灭菌）的滤纸（6个样品）；

[0223] 2、用0.25强度的林格氏液作为对照（3个样品）；

[0224] 3、将3个1g的样品用甲醇浸泡（为保证醇类残留不会抑制微生物生长）；

[0225] 4、样品于50°C干燥过夜（或直至干燥）；

[0226] 5、制备0.25强度的林格氏液的沙门氏菌乳状悬液，每个样品中添加1ml该乳悬液；

[0227] 6、30°C温育过夜；

[0228] 7、每个样品经系列稀释（10-1-10-6）后铺板（12x6=72块板）；

[0229] 8、温育并清点计数板；以及

[0230] 9、与对照和不加热木屑比较抑制效果。

[0231] 为了评估提取后的木屑的抗微生物活性，进行如下程序：

[0232] 1、将提取后的木屑于50°C干燥过夜（或直至干燥）；

[0233] 2、用2g撕碎的滤纸作为对照（3个样品）；

[0234] 3、每2g木屑和滤纸添加2ml沙门氏菌悬液；

[0235] 4、30°C温育24小时；

[0236] 5、每个样品经系列稀释（10-1-10-6）后铺板（9x6=54个板）；

[0237] 6、温育并清点计数板；以及

[0238] 7、与对照（滤纸）和不加热木屑比较抑制效果。

[0239] 结果

[0240] 结果见表6和7。

[0241] 表6-经加热和不加热的松树木屑的提取物处理的滤纸上接种的沙门氏菌的复壮-1(log cfu g ±SE)。提取物经在冷水（冷水提取）、90°C水（热水提取）或甲醇（醇提取）中浸泡2g木屑而获得。对照未经处理，但加入与经处理的滤纸同样数量的沙门氏菌（n=3）。

[0242]

[0243] *不同的字母代表不同处理之间的显著性差异。

[0244] 表7-事先经提取过的加热和不加热松树木屑上接种的沙门氏菌的复壮(log cfu -1g ±SE)，所述提取为在冷水（冷水提取）、90°C水（热水提取）或甲醇（醇类提取）中浸泡2g木屑。对照由接受与松树木屑同样数量的沙门氏菌的滤纸组成（n=3）。

[0245]

[0246]

[0247] *不同的字母代表不同处理之间的显著性差异。

[0248] 结论

[0249] 从表6和7中可得出以下结论：

[0250] （1）加热的松树木屑的冷水和热水提取物对沙门氏菌均无毒效；

[0251] （2）经冷水或热水提取后，松树木屑仍保留对微生物毒效；

[0252] （3）加热的松树木屑的醇提取物对沙门氏菌有毒效；

[0253] （4）醇提取去除了部分与加热松树木屑相关的毒性；

[0254] （5）脱氢松香酸与加热的松树木屑中的其他抗微生物物质组合时，其在水中的可溶性不足以对细菌细胞造成显著毒性；

[0255] （6）可以预料，经脱氢松香酸与诸如香草醛的天然抗微生物剂共同处理的食物被摄入后，不会造成显著的与人类细胞的接触。

[0256] 实施例6本发明组合物的应用

[0257] 发明人已将其惊人的发现，即当诸如香草醛的已知抗微生物剂与萜类化合物组合时，其抗微生物活性能显著改善，用于各种不同的应用。

[0258] （1）动物垫料

[0259] 他们制备了包含脱氢松香酸与香草醛的组合物的液体制剂，并将其喷洒至一些在禽舍中使用的现有类型的动物垫料。发明人发现，所述垫料受弯曲杆菌和沙门氏菌感染的程度降低，并且在所述垫料上饲养的鸡未呈现任何细菌感染的迹象。

[0260] （2）覆盖物

[0261] 发明人还制造了一些覆盖物，其已浸入包含脱氢松香酸与香草醛的液体制剂中保持过夜，以致足量的制剂被吸收。然后将所述覆盖物覆盖在一块土地上，并进行测试以确认其能防止土壤滋生的病原体感染植物、水果或蔬菜。发明人兴奋地发现，与使用普通覆盖物的对照相比，所述经处理的覆盖物使生长在该覆盖物内的草莓免受微生物感染。

[0262] （3）医疗器械

[0263] 发明人然后测试了能否赋予医疗器械表面以抗微生物活性，并用创伤敷料（即绷带）作为模型，将绷带浸入制剂，放置过夜，使其吸收活性剂量。他们发现，令其惊讶的是，所述绷带防止了自绷带下伤口散发出的微生物的扩散。

[0264] （4）纺织品或聚合物

[0265] 所述制剂然后被用于棉花和羊毛，并用其制造衣着类商品。也可以制鞋，且发明人发现，各种情况下，微生物感染均被防止。当用于鞋类时，也使产生的异味减到最小。

[0266] （5）食品包装材料

[0267] 发明人还用所述液体制剂喷洒食品包装产品，例如纸板模。易腐烂的食材例如水果和蔬菜储存在包装材料中，发明人发现，所述食品原料并不像储存在传统包装材料中的对照食品一样腐烂得那么快。

[0268] 总结

[0269] 发明人证实，具有极性、热解的基团以及刚性疏水部分的分子能增加干扰微生物细胞膜的温和抗微生物物质的抗微生物活性。萜类化合物，例如脱氢松香酸，能使抗微生物剂香草醛的抗微生物活性增强1000-2000倍。发明人还证实，脱氢松香酸难溶于水，因此，包含脱氢松香酸和香草醛的材料的水提取物对微生物细胞无毒性。相反，抗微生物活性保留在处理过的材料中。因此，摄入经诸如脱氢松香酸的萜类化合物与诸如香草醛的天然抗微生物剂共同处理的食物不会导致显著的与人类细胞的接触。

[0270] 实施例7利用珍珠岩的生物检测，分析纯化的脱氢松香酸（DHAA）对市售香草醛抗肠炎沙门氏菌的抗微生物效果的协同效应

[0271] 如之前的实施例所述，使用脱氢松香酸和/或已从加热木屑分离得到的香草醛获得了重要的结果。用“珍珠岩生物检测”取代传统的液体培养基稀释分析的实验使香草醛（自加热的木材分离）的抗微生物功效提高了2000倍。存在争议的是，将所述组合物干燥于珍珠岩上，并基于珍珠岩重量计算浓度时，可能会使结果出现偏差。

[0272] 因此，本实验使用分离自歧化松香的纯脱氢松香酸和购自Sigma-Aldrich的纯香草醛，评估珍珠岩生物检测是否使结果出现偏差。

[0273] 制备储液：用丙酮制备20mM的香草醛储液，并进一步通过2倍系列稀释，得到浓度范围为20-0.078mM的系列稀释液。并用丙酮制备20mM的脱氢松香酸储液。

[0274] 生物检测：用含有10mg细珍珠岩的1.5ml微量离心管进行测试。10μl每种浓度的香草醛分别装入4个微量离心管，每种浓度得到4个重复样品。其中两个管各添加10μl脱氢松香酸。将这些离心管置于层流柜3小时，使丙酮挥发。接下来，每管添加1μl过夜培养的肠炎沙门氏菌。温育过程中为保持珍珠岩的湿润，每管分别装入10μl无菌反渗水。仅添加脱氢松香酸的两个管和仅添加反渗水的两个管作为对照。

[0275] 管子温育过夜，并将每管内含物于营养琼脂上铺板，通过细菌计数确定细菌存活量。

[0276] 结果

[0277] 表8-脱氢松香酸对香草醛抗肠炎沙门氏菌的抗微生物活性的影响（CFU/管）[0278]

[0279] 脱氢松香酸：TMTC(多得难以计数)

[0280] 反渗水对照：TMTC

[0281] 结论

[0282] 本实验中，脱氢松香酸使香草醛增效约8倍。因此，珍珠岩生物监测明确提供了关于抗微生物剂活性的有效结果，并证实了用于测试的两种纯化合物之间的协同效应。发明人还认为，当化合物分离自加热的木屑时，可能存在某些能进一步有助于脱氢松香酸和香草醛的协同活性的未知因子。

[0283] 实施例8确定脱氢姜油酮和松柏醛与香草醛和脱氢松香酸混合物组合时，抗肠炎沙门氏菌的最低抑菌浓度（MICs）

[0284] 之前提到，纯脱氢松香酸和纯香草醛的组合在二者之间产生了抗微生物协同作用（即8倍），尽管不及香草醛和分离自加热的松树木屑的脱氢松香酸组合的协同程度（即2000倍）。如果仅其中一种成分来自加热的松木，而另一种成分为市售的纯品形式，也能获得相似强度的抗微生物功效。有趣的是，由此方式获得的抗微生物功效导致混合物为橙色，表明某未知的橙黄色污染物可能与增强香草醛和脱氢松香酸的协同效应相关。松柏醛被认为是可能的候选分子，其之前分离自加热的松树木屑。

[0285] 相似的是，如果香草醛不是立即使用，而是储存在丙酮中，脱氢松香酸与香草醛组合的抗微生物功效大大恢复。众所周知，香草醛与丙酮反应形成酮，即脱氢姜油酮。因此据猜测，脱氢姜油酮也可能参与脱氢松香酸与香草醛产生的抗微生物功效。

[0286] 材料与方法：

[0287] 纯香草醛获自Sigma-Aldrich。脱氢姜油酮通过将香草醛与丙酮缩合制得。纯脱氢松香酸分离自歧化松香。

[0288] 制备20mM的香草醛储液，用于制备不同的终浓度的溶液。0.1，1，5，10mM的脱氢姜油酮和20mM的脱氢松香酸储液通过将所述化合物溶于丙酮制得。储液储存于5°C的冰箱中。体外生物检测：香草醛与潜在协同分子组合的最低抑菌浓度（MIC）通过微量肉汤稀释法确定。使用96孔微量滴定板，以无菌营养肉汤稀释而制得6个2倍稀释的香草醛系列，从而获得20mM到0.078mM的香草醛的2倍稀释系列。制备4个不同浓度（10mM，5mM，1mM以及0.1mM）的脱氢姜油酮（DHZ），并通过添加100μl的每种储液至各孔，与不同浓度的香草醛混合。在一个分开的实验中，脱氢姜酮被松柏醛替代。对照孔加入100μl丙酮。每种处理重复4次。所述微量滴定板置于层流柜中8小时，使丙酮挥发。为了确定各孔的抗微生8
物活性，微量滴定板接种5μl于25°C过夜培养、包含10cfu/ml肠炎沙门氏菌的细菌细胞培养液。接种后，所述微量滴定板于25°C温育24小时。为了确定所述处理是否具有杀菌性，从每孔各取0.01ml点在营养琼脂上。接种后的营养琼脂板温育24-48小时，没有细菌滋生或仅有少数菌落的点被标记为“杀菌的”。为了确定抑菌的效果，在各孔中添加四唑盐溶液以确定代谢活性。25°C温育过夜后颜色不变的定义为抑菌的效果，而进行代谢的（无效）显示为红色至紫色。

[0289] 结果

[0290] 表9-不同浓度的松柏醛和香草醛组合对肠炎沙门氏菌生长的影响。除对照（-DHAA）外，所有处理均包含20mM脱氢松香酸。（n=4）

[0291]

[0292] BS：抑菌；BC：杀菌；G：生长

[0293] 表10-不同浓度的脱氢姜油酮和香草醛组合对肠炎沙门氏菌生长的影响。除对照（-DHAA）外，所有处理均包含20mM脱氢松香酸。（n=4）

[0294]

[0295] BS：抑菌；BC：杀菌；G：生长

[0296] 结论

[0297] 松柏醛是与香草醛和脱氢松香酸组合的有效的抗微生物剂，显示出对肠炎沙门氏菌强的抗微生物功效。脱氢姜油酮是温和的抗微生物剂，其与香草醛和脱氢松香酸组合，显示出对肠炎沙门氏菌强的抗微生物功效。上述结果表明，香草醛和脱氢姜油酮的浓度相加大于5mM（与脱氢松香酸组合）是抑菌所需的。

[0298] 实施例9脱氢松香酸在松柏醛和香草醛的抗微生物活性中的作用

[0299] 在之前的实验中，脱氢松香酸添加至香草醛和松柏醛的组合物中。为了确定脱氢松香酸是否必需，设计单独的实验以量化其在上述三种物质的抗微生物功效中的作用。

[0300] 材料与方法

[0301] 香草醛和松柏醛获自Sigma-Aldrich。利用柱层析法由歧化松香分离出脱氢松香酸。

[0302] 用去离子水制备20mM香草醛储液。用丙酮制备5mM和10mM松柏醛以及20mM脱氢松香酸储液。所有储液均储存于5°C。

[0303] 体外生物检测：不同处理的最低抑菌浓度通过微量肉汤稀释法确定。使用96孔微量滴定板，以无菌水稀释20mM储液制得4倍稀释的香草醛系列，获得浓度介于20mM到0.0002mM之间的香草醛。制备5mM和10mM的2个浓度的松柏醛，并通过添加100μl每种储液至每个孔，与不同浓度的香草醛混合。对照孔添加100μl丙酮。一半的孔添加脱氢松香酸至终浓度为20mM，另一半的孔不加。每种处理重复4次。所述微量滴定板置于层流柜
8
中8小时，使溶剂挥发。随后，每孔接种5μl于25°C过夜培养、包含10cfu/ml肠炎沙门氏菌的悬液。接种后，所述微量滴定板于25°C温育24小时。为了确定所述处理是否具有杀菌性，从每孔各取0.01ml点在营养琼脂上，将所述琼脂板温育24-48小时，没有细菌滋生或仅有少数菌落的点被标记为“杀菌的”。如果可能，对菌落进行计数以获得更准确的定量数据。为了确定抑菌的效果，在每个孔中添加50μl四唑盐溶液以确定代谢活性。25°C温育过夜后颜色不变的定义为抑菌的效果，而进行代谢的（无效）显示为红色至紫色。

[0304] 结果

[0305] 表11-有和无20mM脱氢松香酸（DHAA）时，香草醛与松柏醛（CFA）组合的抗微生物功效。

[0306] 针对肠炎沙门氏菌检测处理的效果。（n=4）

[0307]

[0308] BS：抑菌；BC：杀菌；G：生长

[0309] 表12-由菌落计数得到的5mM松柏醛与浓度为20-0.00029mM的香草醛的组合（下面的4个单元格）以及与香草醛/脱氢松香酸的组合（上面的4个单元格）的96孔的板图[0310]

[0311] 结论

[0312] 脱氢松香酸对松柏醛和香草醛组合的活性呈现协同效应。低浓度（至少0.0003mM）香草醛的存在是5mM松柏醛具有杀菌效果所需的（如果含有20mM脱氢松香酸）。

[0313] 实施例10脱氢姜油酮对香草醛和脱氢松香酸（DHAA）混合物抗肠炎沙门氏菌效果的影响之前推测，脱氢姜油酮（由香草醛形成）可能是加热的木屑抗微生物活性的决定因子。在香草醛和脱氢姜油酮二者与脱氢松香酸组合使用的实验中，暗示上述两分子的抗微生物活性是加和性的。在此，发明人研究了是否确实如此，或是否存在取决于上述两分子比率的协同效应。

[0314] 材料与方法

[0315] 香草醛获自Sigma-Aldrich。脱氢姜油酮由香草醛与丙酮缩合制备如下：0.5g香草醛添加至2ml丙酮中，于螺旋盖瓶中摇动溶解香草醛。香草醛溶解后，添加1ml 10％（w/v）NaOH溶液。混合物于室温储存24小时。随后，添加10ml 3M的HCL，混合物经剧烈摇动，形成黄色的脱氢姜油酮晶体。通过布氏漏斗过滤上述获得的脱氢姜油酮悬液，接着用水冲洗所述晶体，从而分离获得纯化的脱氢姜油酮。经空气干燥后，用NMR对分离得到的脱氢姜油酮进行结构确认。

[0316] 制备香草醛-脱氢姜油酮溶液

[0317] 用5ml丙酮制备包含比例为100∶0，75∶25，50∶50，25∶75，0∶100（w/w）的香草醛和脱氢姜油酮的丙酮溶液。未稀释的脱氢姜油酮和香草醛相加浓度为10mM。抗微生物测试前，在每种比例溶液中添加30.4mg脱氢松香酸，使得每种处理中脱氢松香酸浓度为20mM。对照处理仅由脱氢松香酸和溶剂组成。储液于5°C冰箱中储存48小时。

[0318] 分析方法

[0319] 香草醛和脱氢姜油酮组合溶液的抑菌活性通过微量肉汤稀释法确定。以9.6mL营养肉汤充满96孔板。为了确定样品的MIC（最低抑菌浓度），用所述肉汤制备几个稀释浓度（0，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128）的样品。做好系列稀释后，将板置8
于层流柜中5小时，使溶剂挥发。随后，每孔接种5μl于25°C过夜培养的、包含10cfu/ml肠炎沙门氏菌的悬液。接种后，所述板于25°C温育24小时。为了确定所述处理是否具有杀菌性，从每孔各取0.01ml点在营养琼脂上，将所述琼脂板温育24-48小时，没有细菌滋生或仅有少数菌落的点被标记为“杀菌的”。如果可能，对菌落进行计数以获得更准确的定量数据。为了确定抑菌的效果，在每孔中添加50μl四唑盐溶液以确定代谢活性。25°C温育过夜后颜色不变的定义为抑菌的效果，而进行代谢的（无效）显示为红色至紫色。

[0320] 表13-20mM脱氢松香酸（DHAA）存在时，香草醛与脱氢姜油酮组合的抗微生物功效。针对肠炎沙门氏菌检测处理的效果。（n＝4）

[0321]

[0322] BS：抑菌；BC：杀菌；G：生长

[0323] 结论

[0324] 脱氢姜油酮与香草醛的组合效应并非加和性，而是取决于两种分子之间的比例。当任一分子与另一分子处于1∶3的比例时，效果最佳。脱氢姜油酮与香草醛自身具有相似的抗微生物活性，但当以1∶3的比例组合时，达到比单独使用或以50∶50的比例大4到8倍的出人意料的效果。

[0325] 实施例11pH值对脱氢松香酸溶解性的影响，以及储液的储存条件对香草醛和脱氢松香酸组合物抗肠炎沙门氏菌抗微生物的活性的影响

[0326] 之前提到，脱氢松香酸和香草醛在高pH值（>9）的组合使所述组合效果变差。据猜测，这可能归因于脱氢松香酸在碱性条件下的低溶解性（导致脱氢松香酸不再溶解）。迄今为止所述的大多数实验都是在pH值为7时进行，其产生良好的活性，但不如直接由加热木屑的提取的提取物效果好。加热木屑的pH值约为4，然而，如此低的pH值可能影响细菌生长，细菌通常更喜欢中性pH值。为了在检测pH的影响时确保脱氢松香酸是溶解的，使用了两种溶解所述化合物的方法。在一种方法中，将所述化合物溶于pH值为4的磷酸缓冲液，在另一种方法中，使用pH值为7的DMSO。对如下处理方式进行检测：

[0327] ●香草醛储液，实验开始前48小时制备；溶液保存于5°C的冰箱；

[0328] ●脱氢松香酸（DHAA）储液，实验开始前48小时制备；溶液保存于5°C的冰箱；

[0329] ●香草醛/脱氢松香酸组合物储液，实验开始前48小时制备；溶液保存于5°C的冰箱；

[0330] ●香草醛储液，实验开始前48小时制备并于室温（20°C）保存；

[0331] ●脱氢松香酸储液，实验开始前48小时制备并于室温（20°C）保存；以及[0332] ●香草醛/脱氢松香酸组合物储液，实验开始前48小时制备并于室温（20°C）保存。

[0333] 材料与方法

[0334] 香草醛获自Sigma-Aldrich，脱氢松香酸分离自歧化松香。

[0335] 在缓冲液配制的pH值为4的肉汤中检测的储液：以丙酮制备两批20mM的香草醛储液和两批香草醛/脱氢松香酸（10mM/20mM）储液。每种储液中的一批于冰箱中保存，另一批于室温保存。

[0336] 在缓冲液配制的pH值为7的肉汤中检测的储液：以DMSO制备两批20mM的香草醛储液和两批香草醛/脱氢松香酸（10mM/20mM）储液。每种储液中的一批于冰箱中保存，另一批于室温保存。

[0337] 生物检测：通过微量肉汤稀释法进行检测。香草醛和香草醛/脱氢松香酸储液经2倍系列稀释，进一步稀释至浓度介于10mM和0.625mM之间。100μL每种浓度的溶液添加至含有100μL营养肉汤的96孔板的每个孔中。每种浓度设3个重复样品。所述微量滴定板置于层流柜中使溶剂挥发。

[0338] 随后，每个孔接种5μl于25°C过夜培养的、包含108cfu/ml肠炎沙门氏菌的悬液。接种后，所述微量滴定板于25°C温育24小时。为了确定所述处理是否具有杀菌性，从每孔各取0.01ml点在营养琼脂上，将所述琼脂板温育24-48小时，没有细菌滋生或仅有少数菌落的点被标记为“杀菌的”。如果可能，对菌落进行计数以获得更准确的定量数据。为了确定抑菌效果，在每个孔中添加50μl四唑盐溶液以确定代谢活性。25°C温育过夜后颜色不变的定义为抑菌效果，而进行代谢的（无效）显示为红色至紫色。

[0339] 表14-pH值，以及香草醛和脱氢松香酸可能的相互作用对肠炎沙门氏菌生长的影响。脱氢松香酸在实验开始添加（单独）或在实验开始前先与香草醛作用48小时后添加（组合）（n=3）

[0340]

[0341] BC：杀菌；BS：抑菌；G：生长

[0342] 结论脱氢松香酸在pH值为4和7时均增强香草醛的抗微生物活性（pH值本身对沙门氏菌的生存影响甚微）。使脱氢松香酸与香草醛相互作用48小时增强了这两种分子的抗微生物活性。

[0343] 实施例12脱氢松香酸与松柏醛、百里香酚和1，2-二苯乙烯的协同效应[0344] 在之前的实验中，抗微生物化合物连同香草醛一起检测使得很难确定脱氢松香酸只是增强香草醛的活性，或者还增强其他天然抗微生物分子，例如百里香酚、松柏醛和1，2-二苯乙烯的活性。在第一个测试中，对这些化合物进行了抗革兰氏阴性菌肠炎沙门氏菌的测试，在第二个测试中，对同样的化合物进行了抗革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的测试。

[0345] 材料与方法

[0346] 百里香酚、反式-1，2-二苯乙烯和松柏醛获自Sigma-Aldrich，脱氢松香酸分离自歧化松香。

[0347] 生物检测：通过微量肉汤稀释法进行检测。脱氢松香酸（20mM）或者与松柏醛、百里香酚组合或者与（反式）1，2-二苯乙烯组合，于25°C温育48小时。对照溶液由不含脱氢松香酸的松柏醛、百里香酚和二苯乙烯组成。另制备仅含丙酮的溶剂对照。为了进行测试，溶液按2倍稀释系列进行稀释，制备浓度介于10-0.156mM之间的活性成分。每种浓度以脱氢松香酸修正，使得脱氢松香酸终浓度为20mM。100μL每种浓度的溶液添加至含有100μL营养肉汤的96孔板的每个孔。每种浓度设3个重复样品。所述96孔板置于层流柜中使溶剂挥发。

[0348] 随后，每个孔接种5μl于25°C过夜培养的、包含108cfu/ml肠炎沙门氏菌的悬液。在第二个测试中使用金黄色葡萄球菌。接种后，所述96孔板于25°C温育24小时。为了确定所述处理是否具有杀菌性，从每孔各取0.01ml点在营养琼脂上，将所述琼脂板温育24-48小时，没有细菌滋生或仅有少数菌落的点被标记为“杀菌的”。如果可能，对菌落进行计数以获得更准确的定量数据。为了确定抑菌的效果，在每个孔中添加50μl四唑盐溶液以确定代谢活性。25°C温育过夜后颜色不变的定义为抑菌效果，而进行代谢的（无效）显示为红色至紫色。

[0349] 结果

[0350] 表15-脱氢松香酸对松柏醛、百里香酚或1，2-二苯乙烯抗肠炎沙门氏菌的协同效应。含有脱氢松香酸的处理包含20mM脱氢松香酸。（n=3）

[0351]

[0352]

[0353] BC：杀菌，BS：抑菌，G：生长

[0354] 结果

[0355] 脱氢松香酸对松柏醛有强烈的协同活性，使松柏醛抗肠炎沙门氏菌的效力提高约16倍。脱氢松香酸使百里香酚抗肠炎沙门氏菌的效力约为原来的两倍。

[0356] 实施例13脱氢松香酸与香草醛组合物抗多种不同的微生物的抗微生物活性[0357] 利用在薄层层析（TLC）纸上的抑菌圈实验，发明人检测了多种不同的化合物对微生物（革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、丝状真菌以及酵母）的抗微生物活性。

[0358] 材料与方法

[0359] 准备两种测试溶液，即：（1）香草醛与脱氢松香酸组合，以及（2）1，2-二苯乙烯与脱氢松香酸组合。针对几种不同的微生物检测所述溶液的活性如下。

[0360] 将一滴测试溶液置于薄层层析板上。使溶剂挥发，将测试微生物的肉汤悬液（革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）均匀地涂于薄层层析板上。所述板温育过夜。为了显示微生物活性，向薄层层析板喷洒四唑盐溶液。微生物活性以红色至紫色显示。

[0361] 为了证实所述溶液抗丝状真菌的效力，接种后的薄层层析板温育至真菌开始生成孢子。为了证实抗酵母的效力，温育后，将薄层层析板在营养琼脂板上按压，所述琼脂板温育直至酵母菌落清楚可见。

[0362] 结果

[0363] 图1-8显示了所述测试溶液对受测微生物生长的影响。

[0364] 参见图1，显示了香草醛和脱氢松香酸组合物对金黄色葡萄球菌的活性。与对照中细菌生长旺盛相比，使用上述测试溶液的板上抑菌圈清晰可见。图2显示了1，2-二苯乙烯与脱氢松香酸组合物与1，2-二本乙烯自身，以及对照相比，其抗金黄色葡萄球菌的抗微生物活性明显地更强。图3显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗肠炎沙门菌的抗微生物活性，而这两种化合物独自均无效。图4显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗鼠伤寒沙门菌的抗微生物活性。

[0365] 图5显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗大肠杆菌的抗微生物活性。图6显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗丝状真菌青霉属的抗微生物活性。图7显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗曲霉属的抗微生物活性。最后，图8显示了香草醛和脱氢松香酸组合物具有抗酿酒酵母的抗微生物活性。香草醛独自在5mM有效，但与脱氢松香酸组合时，仅0.078mM的香草醛便有效。

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