新用途
阅读：865发布：2021-02-04
专利汇可以提供新用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供式I化合物或其 金属化 衍 生物 用于杀伤、抑制或防止 微生物 生物膜 生长的用途：其中X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3、Y4和Z具有 说明书 所给定的含义。所述生物膜可位于有生命支持体或惰性支持体上。优选所述微生物选自细菌和 真菌 。，下面是新用途专利的具体信息内容。
1.下式I化合物用于杀伤、抑制或防止微生物生物膜生长的用途：
其中：
X1、X2、X3和X4独立代表氢原子、亲脂部分、苯基、低级烷基、烷芳基或芳烷基或下式阳离子基团：
+
-L-R1-N(R2)(R3)R4
其中：
L为连接部分或不存在；
R1代表低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基，其任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入氧)、氟、OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11+
和NR12R13R14；和
R2、R3和R4独立代表H、芳基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入氧)、芳基、OR5、C(O)R6、+
C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11和NR12R13R14Z为-CH或N；和
Y1、Y2、Y3和Y4不存在或独立代表芳基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入氧)、芳基、OR5、+
C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11、NR12R13R14；或与它们所连接的吡咯环一起形成环状基团；和
R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14独立代表H或低级烷基，
前提为X1、X2、X3和X4中的至少一个为如上所定义的阳离子基团，并且X1、X2、X3和X4中的至少一个为氢原子。
2.下式II化合物用于杀伤、抑制或防止微生物生物膜生长的用途：
其中M为金属元素或类金属元素；
和X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3、Y4和Z如权利要求1所定义。
3.权利要求1或2用于杀伤、抑制或防止微生物生长的用途，所述用途通过不包括让所述化合物与激活抗微生物活性的刺激物接触的方法来实现。
4.前述权利要求中任一项的用途，其中所述化合物在缺乏用光动力学疗法光源或超声源的辐照情况下表现出抗微生物活性。
5.权利要求2-4中任一项的用途，其中M为二价或三价金属元素。
6.权利要求2-5中任一项的用途，其中M选自Zn(II)、Cu(II)、La(III)、Lu(III)、Y(III)、In(III)、Cd(II)、Mg(II)、Al(III)、Ru、Ni(II)、Mn(III)、Fe(III)和Pd(II)。
7.权利要求2-4中任一项的用途，其中M为类金属元素，例如硅(Si)或锗(Ge)。
8.前述权利要求中任一项的用途，其中Y1、Y2、Y3和Y4不存在。
9.前述权利要求中任一项的用途，其中Z为-CH。
10.前述权利要求中任一项的用途，其中R1为未被取代的低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基。
11.前述权利要求中任一项的用途，其中R1为-(CH2)m-，‘m’为1-20的整数。
12.权利要求11的用途，其中‘m’为1-10的整数，例如1-6、1-5、1-4或1-3。
13.权利要求12的用途，其中‘m’为3。
14.前述权利要求中任一项的用途，其中R2、R3和/或R4为低级烷基、低级烯基或低级炔基。
15.权利要求14的用途，其中R2、R3和/或R4为未被取代的低级烷基。
16.权利要求14或15的用途，其中R2、R3和R4中的至少一个为被伯胺、仲胺、叔胺基团或季铵基团取代的烷基。
17.前述权利要求中任一项的用途，其中R1为-(CH2)3-，R2和R3为CH3，R4
为-(CH2)3-N(CH3)2。
18.前述权利要求中任一项的用途，其中R1为-(CH2)3-，R2、R3和R4各自为CH3。
19.前述权利要求中任一项的用途，其中R1为-(CH2)3-，R2、R3和R4各自为C2H5。
20.前述权利要求中任一项的用途，其中L选自苯氧基、亚苯基、磺酰氨基、氨磺酰基、磺酰亚氨基、苯基磺酰基-氨基、苯基氨磺酰基、脲、脲烷和氨基甲酸酯连接部分。
21.权利要求20的用途，其中X1、X2、X3和/或X4为
其中R为权利要求1所定义的-R1-N+(R2)(R3)R4，‘n’为1-3的整数。
22.权利要求20的用途，其中X1、X2、X3和/或X4为
其中R为权利要求1所定义的-R1-N+(R2)(R3)R4，‘m’为1-3的整数。
23.权利要求20的用途，其中X1、X2、X3和/或X4为
+
其中每一个R独自为权利要求1所定义的-R1-N(R2)(R3)R4，‘n’和‘m’为1-3的整数，其中‘n’和‘m’的和为1-3的整数。
24.权利要求21-23中任一项的用途，其中‘n’或‘m’为3。
25.权利要求21-23中任一项的用途，其中‘n’或‘m’为2。
26.权利要求21-23或25中任一项的用途，其中‘n’和/或‘m’为1。
27.权利要求21-23中任一项的用途，其中L在对位被单取代。
28.权利要求21-23中任一项的用途，其中L在间位被单取代或二取代。
29.权利要求21-23中任一项的用途，其中L在邻位被单取代或二取代。
30.前述权利要求中任一项的用途，其中所述化合物在卟啉环的相对侧包含两个如权利要求1所定义的阳离子基团，所述卟啉环的相对侧即环的5和15位或环的10和20位。
31.权利要求30的用途，其中X1和X3为氢原子、亲脂部分、苯基、低级烷基、烷芳基或芳烷基，X2和X4为阳离子基团，或反之亦然。
32.权利要求1-30中任一项的用途，其中所述化合物在卟啉环的邻位包含两个如权利要求1所定义的阳离子基团，所述卟啉环的邻位即环的5和10位或环的10和15位或环的
15和20位或环的20和5位。
33.权利要求32的用途，其中X1和X2为氢，X3和X4为阳离子基团，或X2和X3为氢，X4和X1为阳离子基团。
34.前述权利要求中任一项的用途，其中X1、X2、X3和X4中的至少一个为亲脂部分。
35.权利要求34的用途，其中所述亲脂部分为式-(CH2)pCH3的饱和直链烷基，其中‘p’为1-22的整数。
36.权利要求35的用途，其中‘p’介于1-18，例如2-16或4-12。
37.权利要求1-33中任一项的用途，其中X1、X2、X3和X4中无一为亲脂部分。
38.前述权利要求中任一项的用途，其中X1、X2、X3和X4中无一为苯基。
39.前述权利要求中任一项的用途，其中所述化合物为水溶性的。
40.权利要求1的用途，其中所述化合物为5，15-双-(4-{3-[(3-二甲基氨基-丙基)-二甲基-铵基]-丙基-氧基}-苯基)-卟啉或其盐。
41.权利要求1的用途，其中所述化合物为5，15-双-[4-(3-三乙基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉或其盐。
42.权利要求1的用途，其中所述化合物为5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉或其盐。
43.权利要求1的用途，其中所述化合物为5，15-双-[4-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉或其盐。
44.权利要求1的用途，其中所述化合物为5-[3，5-双-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-15-十一烷基-卟啉或其盐。
45.权利要求1的用途，其中所述化合物为5-{4-[3-二甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基-丙基-氧基]-苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉或其盐。
46.权利要求1的用途，其中所述化合物为3-[({3-[(3-{4-[15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉-5-基]-苯氧基}-丙基)-二甲基-铵基]-丙基}-二甲基-铵基)-丙基]-三甲基-铵或其盐。
47.权利要求1的用途，其中所述化合物为5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-10-十一烷基-卟啉或其盐。
48.权利要求1的用途，其中所述化合物为5-{4-[3-二甲基-(3-三甲基铵基-丙基)-铵基-丙氧基]-苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉或其盐。
49.权利要求1的用途，其中所述化合物为5-[4-(3-二甲基癸基-铵基丙氧基)-苯基]-15-{4-[3-二-甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基丙氧基]-苯基}-卟啉或其盐。
50.权利要求40-49中任一项的用途，其中所述化合物为氯化物盐。
51.权利要求40-49中任一项的用途，其中所述化合物为15-双-[4-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉(“XF-73”)或5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉(“XF-70”)或其二氯化物盐。
52.权利要求40-50中任一项的用途，其中所述化合物包含中心金属离子。
53.权利要求52的用途，其中所述中心金属离子选自Cu(II)和Fe(III)。
54.权利要求53的用途，其中所述化合物为XF-73Fe(III)-15-双-[4-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉或其二氯化物盐。
55.前述权利要求中任一项的用途，其中所述化合物基本上对哺乳动物细胞无毒性。
56.前述权利要求中任一项的用途，其中所述微生物生物膜包括选自以下的微生物或由选自以下的微生物组成：细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。
57.权利要求56的用途，其中所述微生物对一种或多种常规抗生素有抗性。
58.权利要求56或57的用途，其中所述微生物为细菌。
59.权利要求58的用途，其中所述细菌为革兰氏阳性菌。
60.权利要求59的用途，其中所述细菌为葡萄球菌或链球菌。
61.权利要求60的用途，其中所述细菌为葡萄球菌。
62.权利要求61的用途，其中所述细菌为金黄色葡萄球菌。
63.权利要求62的用途，其中所述细菌为甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)。
64.权利要求60的用途，其中所述细菌为链球菌。
65.权利要求64的用途，其中所述细菌为变异链球菌和/或血链球菌。
66.权利要求58的用途，其中所述细菌为革兰氏阴性菌。
67.权利要求59的用途，其中所述细菌为军团菌。
68.权利要求56或57的用途，其中所述微生物为真菌。
69.权利要求68的用途，其中所述真菌为假丝酵母。
70.权利要求56或57的用途，其中所述微生物为古细菌。
71.权利要求56或57的用途，其中所述微生物为原生动物。
72.权利要求56或57的用途，其中所述微生物为藻类。
73.权利要求1-72中任一项的用途，其中所述生物膜在家庭环境中。
74.权利要求1-72中任一项的用途，其中所述生物膜在商业或工业环境中。
75.权利要求1-74中任一项所定义的化合物，用于治疗或防止与活哺乳动物身体上或内的生物膜的存在或生长有关的病况或病症。
76.权利要求75的化合物，其中所述哺乳动物为人。
77.权利要求75或76的化合物，其中所述生物膜粘附至有生命支持体。
78.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在口腔中。
79.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在尿道中。
80.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在窦中。
81.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在耳内。
82.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在心脏中。
83.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在前列腺内。
84.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在骨中。
85.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在肺内。
86.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在肾中。
87.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜在皮肤内或上。
88.权利要求75-77中任一项的化合物，其中所述生物膜粘附至身体内的惰性支持体。
89.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至血管内装置。
90.权利要求88或89的化合物，其中所述生物膜粘附至导管。
91.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至支架。
92.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至分流器。
93.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附插管或气管切开套管。
94.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至眼科装置。
95.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至人工关节。
96.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至人造心瓣膜。
97.权利要求88的化合物，其中所述生物膜粘附至乳房假体。
98.权利要求1-74中任一项所定义的化合物用于杀伤、抑制或防止缓慢生长期细菌的生长的用途。
99.权利要求1-74中任一项所定义的化合物用于杀伤、抑制或防止静止期细菌的生长的用途。
100.权利要求98或99的用途，其中所述细菌为权利要求59-67中任一项所定义的细菌。
101.权利要求1-55中任一项所定义的化合物，用于治疗或防止与活哺乳动物例如人身体上或内的缓慢生长期或静止期细菌的存在或生长有关的病况或病症。
102.一种用于治疗罹患或易感与微生物生物膜有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-97中任一项所述的化合物。
103.一种用于治疗罹患或易感与缓慢生长期细菌有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-97中任一项所述的化合物。
104.一种用于治疗罹患或易感与静止期细菌有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-97中任一项所述的化合物。
105.权利要求102-104中任一项的方法，其中将所述化合物经口给予。
106.权利要求102-104中任一项的方法，其中将所述化合物经胃肠外给予。
107.权利要求102-104中任一项的方法，其中将所述化合物局部给予。
108.权利要求102-107中任一项的方法，其中所述生物膜在口腔、尿道、窦、耳朵、心脏、前列腺、骨、肺、肾和/或皮肤中。
109.权利要求102-107中任一项的方法，其中所述生物膜粘附至身体内的惰性支持体。
110.权利要求109的方法，其中所述患者拥有导管、支架、分流器、插管或气管切开套管、眼科器械、人工关节、人造心瓣膜和/或乳房假体。
111.一种用权利要求1-97中任一项所述的化合物浸渍、包被或另外处理的可植入医疗装置。
112.权利要求111的可植入医疗装置，其选自血管内装置、导管、分流器、插管和气管切开套管、眼科装置、人工关节、人造心脏瓣膜和乳房假体。
113.一种制备权利要求111或112的可植入医疗装置的方法，所述方法包括将权利要求1-97中任一项所述的化合物施用到未处理的可植入医疗装置的表面。
114.式I化合物用于杀伤、抑制或防止基本上如下文根据说明书所述的微生物生物膜的生长的用途。
115.式I化合物用于杀伤、抑制或防止基本上如下文根据说明书所述的缓慢生长期或静止期细菌的生长的用途。
116.一种用于治疗罹患或易感与基本上如下文根据说明书所述的微生物生物膜有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法。
117.一种用于治疗罹患或易感与基本上如下文根据说明书所述的缓慢生长期或静止期细菌有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法。
118.一种基本上如下文根据说明书所述的可植入医疗装置。
119.一种用于制备基本上如下文根据说明书所述的可植入医疗装置的方法。
新用途
[0001] 领域
[0003] 背景
[0004] 形成生物膜是普遍的细菌生存策略。在自然环境和工业设备的惰性支持体及有生命支持体中都存在生物膜。
[0005] 生物膜是包裹在自主发育的聚合物基质内并粘附于生命表面或无生命表面的微生物的结构化群落。生物膜的特征通常亦为表面粘附、结构异质性、遗传多样化、复杂的群落作用和细胞外聚合物性质的基质。
[0006] 单细胞生物体通常表现出两种不同的行为模式。第一种是常见的自由漂浮或浮游形式，其中单个细胞在某些液体介质中独立漂浮或泳动。第二种是粘附状态，其中细胞紧密聚集成团，牢牢地彼此粘附，通常形成稳定的表面。行为的变化由多种因素触发，所述因素包括群体感应(quorum sensing)以及在不同物种之间不同的其它机制。当细胞转换模式时，其经历行为方面的表型改变，其中众多基因被增量调节和减量调节。
[0007] 形成
[0008] 生物膜的形成开始于自由漂浮的微生物粘附到表面。这些最初的定殖者通过可逆的弱范德瓦尔斯力开始粘附于所述表面。若定殖者没有立即与该表面分开，它们可用细胞粘附结构例如毛发使自己更长久地锚定。最初的定殖者通过提供更多种形式的粘附位点并开始建造使生物膜聚在一起的基质来促进其它细胞的来到。某些物种靠自己不能够粘附在表面，但通常能够使自己锚定在基质上或直接锚定在早期定殖者上。在这种定植期间细胞能够经由群体感应来交换信息。一旦开始定植，生物膜就通过联合细胞分裂和补充新来者来生长。生物膜形成的最后阶段称为发育，该阶段已建立生物膜，并仅可使其在形态及大小方面变化。生物膜的这种发育可使得细胞对抗生素的抵抗更强。认为细菌生物膜至少因两个原因抵抗抗生素作用：生物膜形成物理障碍来防止抗生素渗入细菌；第二是生物膜内的细菌往往长得更慢，因而为抗生素的靶向提供了更低的代谢特征。
[0009] 性质
[0010] 通常在淹没在或暴露在某些水溶液的固态基质上发现生物膜，但它们也可在液体表面及亦在树叶表面(尤其是在高湿度气候下)形成浮游垫。给予充足的生长资源，生物膜将很快长成肉眼可见。生物膜可含有很多不同类型的微生物，例如细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类；每一组都表现出特化的代谢功能。然而，某些生物体在某些条件下将形成单物种膜。
[0011] 生物膜似乎使自己能防御消毒剂和抗生素、吞噬细胞和人免疫系统。
[0012] 细胞外基质
[0013] 生物膜聚在一起，受到称为EPS的分泌性的聚合化合物基质的保护。EPS是细胞外聚合物或表多糖的缩写。该基质保护其内的细胞，通过生化信号促进这些细胞之间的信息传递。发现某些生物膜含有帮助分送营养物及信号分子的水通道。该基质足够强，使得在某些条件下生物膜可成为化石。
[0014] 生活在生物膜中的细菌通常与同一物种的自由漂浮的细菌的性质明显不同，因为密集受到保护的膜环境使得这些细菌能以不同方式协作并相互作用。该环境的好处之
一是提高对去污剂和抗生素的抵抗，因为密集的细胞外基质和细胞外层保护群落内部。在某些情况下，抗生素抗性可提高1000倍(参见Stewart P，Costerton J，2001，Lancet
358(9276)：135-8)。
一是提高对去污剂和抗生素的抵抗，因为密集的细胞外基质和细胞外层保护群落内部。在某些情况下，抗生素抗性可提高1000倍(参见Stewart P，Costerton J，2001，Lancet
358(9276)：135-8)。
[0015] 实例
[0016] 生物膜普遍存在。不仅是细菌和古细菌，几乎每一种微生物都具有可粘附到表面并彼此粘附的机制。
[0018] ●生物膜生长在黄石国家公园(USA)的酸性热水池中和南极冰川上。
[0019] ●生物膜可极为容易地在淋浴间生长，因为淋浴间为生物膜兴旺生长提供了潮湿温暖的环境。
[0020] ●生物膜可在管道内部形成，导致管道堵塞及腐蚀。地板和台面上的生物膜可使得烹饪区的卫生难以实现。已知冷却水系统中的生物膜降低热交换(参见W.G.Characklis等，1981，Heat Trans.Eng.3：23-37)。
[0021] ●细菌粘附到船体充当海轮生物污着的基础。当细菌膜形成后，其它的海洋生物例如附着甲壳动物就更容易粘附。所述生物污着可减慢船只速度达至20％，使得航行时间更长和需要额外的燃油。在干船坞整修及重新油漆的时间降低了船舶资产的生产力，由于来自船体外壳的海洋生物的腐蚀和机械脱除(刮擦)，船舶的使用寿命亦降低了。
[0022] ●亦可利用生物膜用于建设性目的。例如，很多污物处理厂包括废水通过生长在过滤器上的生物膜的处理阶段，该生物膜提取和消化有机化合物。在这样的生物膜中，细菌主要负责除掉有机物(BOD)；而原生动物和轮虫主要负责除掉包括病原体和其它微生物在内的悬浮固体(SS)。慢砂滤池以同样的方式依赖生物膜形成来过滤来自湖泊、泉水或江河来源的表面水用于饮用目的。我们认作净水的东西对于这些微细胞生物而言是废物，因为它们不能从纯水中提取任何另外的营养物。
[0023] ●生物膜可有助于消除污染海洋或船舶系统中的石油。石油通过微生物群落、尤其是通过最近非凡地发现的号称解烃菌(hydrocarbonoclastic bacteria，HCB)的专家菌群体降解烃的活动来消除，。
[0025] ●在植物表面及内部发现生物膜。它们既可以造成农作物疾病，或者又可在根部的固氮根瘤菌情况下与植物共生[6]。与生物膜有关的农作物疾病包括柑桔溃疡、葡萄的皮尔斯病(Pierce’s Disease)和诸如胡椒及西红柿等植物的细菌性斑腐病。
[0026] 生物膜和传染病
[0027] 业已发现生物膜参与身体内多种微生物感染，估计其为全部感染的80％(参见“Research on microbial biofilms(微生物生物膜研究)(PA-03-047)″，NIH，National Heart，Lung，and Blood Institute，2002-12-20)。生物膜参与的感染过程包括诸如尿道感染、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、龈炎、包被隐性眼镜(coating contact lens)等常见问题和诸如心内膜炎和囊性纤维化感染和永久性留置装置(例如人工关节及心脏瓣膜)感
染等较不常见但更致命的过程。
染等较不常见但更致命的过程。
[0028] 最近证明生物膜存在于经受慢性鼻窦炎手术患者的80％被除掉的组织中。已证明有生物膜的患者不象具有正常的纤毛细胞和杯形细胞形态的没有生物膜的对照，前者的纤毛细胞和杯形细胞裸露。亦在来自上述10个健康对照者中2个的样品中发现有生物膜。
来自术中培养物(interoperative culture)的细菌物种与各自患者组织的生物膜中的细
菌物种并不对应。换言之，尽管存在细菌，但培养物为阴性。
来自术中培养物(interoperative culture)的细菌物种与各自患者组织的生物膜中的细
菌物种并不对应。换言之，尽管存在细菌，但培养物为阴性。
[0029] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)生物膜
[0030] 由于在无免疫应答的患者及老年群体中越来越明显的慢性机会性感染，工业化社会的医疗处理成就受到显著削弱。慢性感染一直是医疗职业的主要挑战，并具有很大的经济关联性，因为传统抗生素治疗通常不足以根除这些感染。细菌持续存在的一个主要原因似乎是细菌在保护其免受有害环境因素损害的生物膜中生长的能力。铜绿假单胞菌不仅是新兴医院感染的的重要机会病原体和致病因子，而且还可将其作为研究造成细菌持续存在的不同细菌机制的模型生物。在这种情况下，根除造成从浮游生长转变为生物膜表型并负责顽疾中细菌间信息交流的作用的分子机制，应该提供对铜绿假单胞菌的致病性的新见识，有助于更好地临床管理慢性感染患者，并应该导致对新的药物靶标的鉴定，用于开发备选抗感染治疗策略。
[0031] 牙菌斑
[0032] 牙菌斑是粘附在牙齿上的物质，由细菌细胞(主要是变异链球菌(Streptococcus mutans)和血链球菌(Streptococcus sanguis))、唾液聚合物和细菌胞外产物组成。牙斑是牙齿表面上的生物膜。微生物的这种聚积使得牙齿及齿龈组织遭受高浓度的细菌代谢物，从而导致产生牙病。
[0033] 军团杆菌病
[0034] 已知军团菌属细菌在某些条件下在生物膜中生长，其在生物膜中受到保护免受消毒剂的作用。冷却塔中的工人、空调房间内工作的人和进行淋浴的人，可在系统建筑、设计不完美且未恰当维护时通过吸入而与军团菌接触。
[0035] 引人关注的是，诸如粘附到表面并作为生物膜生长的细菌等微生物对常规抗生素治疗较不敏感。降低的抗生素易感性造成生物膜感染(例如与植入装置有关联的感染)的持续存在。生物膜中起作用的保护机制似乎与造成常规抗生素抗性的机制完全不同。在生物膜中，假设是抗生素渗透差、营养物限制、生长缓慢、胁迫适应性反应和形成耐药细胞构成了多层防御。
[0036] 此外，生物膜培养物通常在未形成基因型耐药的情况下，就非常难以用化疗根除。因此，治疗选择的数量有限，开发抗生物膜活性的新抗微生物剂越来越重要。
[0037] 因此，需要用于杀伤、抑制或防止微生物生物膜(在医疗和非医疗两种环境中)生长的新方法。
[0038] 发明简述
[0039] 本发明第一方面提供式I化合物用于杀伤、抑制或防止微生物生物膜的生长的用途：
[0040]
[0041] 其中：
[0042] X1、X2、X3和X4独立代表(即相同或不同)氢原子、亲脂部分、苯基、低级烷基、烷芳基或芳烷基或下式阳离子基团：
[0043] -L-R1-N+(R2)(R3)R4
[0044] 其中：
[0045] L为连接部分或不存在；
[0046] R1代表低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基，其任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入氧)、氟、OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、+NR10R11和NR12R13R14；和
[0047] R2、R3和R4独立代表(即相同或不同)H、芳基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入+氧)、芳基、OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11和NR12R13R14；
[0048] Z为-CH或N；
[0049] Y1、Y2、Y3和Y4不存在或独立代表芳基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任选插入氧)、芳基、+OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11、NR12R13R14；或可与它们所连接的吡咯环一起形成环状基团；和
[0050] R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14独立代表H或低级烷基，
[0051] 前提为X1、X2、X3和X4中的至少一个为如上所定义的阳离子基团并且X1、X2、X3和X4中的至少一个为氢原子、苯基、亲脂部分或低级烷基、烷芳基或芳烷基。
[0052] 就“生物膜”而言，我们包括通常被由微生物细胞产生的细胞外基质包裹的微生物(例如细菌、真菌、藻类)群落，其可粘附到液体界面和表面(例如，在身体、任何宿主组织或器官内的粘膜上，或者永久性或半永久性植入医疗装置(例如静脉导管)的表面)。
[0053] 术语“低级烷基”意欲包括线性或支链、环状或无环的C1-C20烷基，其可插入氧(优选每个烷基链中存在的氧原子不超过5个)。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的低级烷基包括C1-C18烷基、C1-C16烷基、C1-C14烷基、C1-C12烷基、C1-C10烷基、C1-C9烷基、C1-C8烷基、C1-C7烷基、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基和C1-C2烷基。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的优选低级烷基包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15和C16烷基。
[0054] 因此，N+R2R3R4和/或N+R12R13R14中的任何一个或多个可代表环胺/铵基，例如：
[0055]+
[0056] (其中所述基团通过如上述结构底部所示的来自N 原子的未定义键与化合物连接)
[0057] 应理解的是，环胺/铵基团亦可包含少于或多于6元，例如，所述基团可包含4-、5-、7-、8-、9-或10-元环。
[0058] 相应地解释术语“低级亚烷基”。
[0059] 术语“低级烯基”和“低级炔基”分别意欲包括线性或支链、环状或无环的C2-C20烯基和炔基，其各自可插入氧(优选在每一烯基或炔基链中存在的氧原子不超过5个)。
[0060] 术语“低级烯基”亦包括顺式和反式两种几何异构体。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的低级烯基包括C2-C18烯基、C2-C17烯基、C2-C16烯基、C2-C14烯基、C2-C12烯基、C2-C10烯基、C2-C8烯基、C2-C7烯基、C2-C6烯基、C2-C5烯基、C2-C4烯基、C2-C3烯基和C3-C4烯基。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的优选低级烯基包括C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14烯基。
[0061] 相应地解释术语“低级亚烯基”。
[0062] R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的“低级炔基”包括C2-C18炔基、C2-C16炔基、C2-C14炔基、C2-C12炔基、C2-C10炔基、C2-C9炔基、C2-C8炔基、C2-C7炔基、C2-C6炔基、C2-C5炔基、C2-C4炔基、C2-C3炔基和C3-C4炔基。R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13和R14可代表的优选低级炔基包括C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13和C14炔基。
[0063] 相应地解释术语“低级亚炔基”。
[0064] 术语“芳基”包括6-10元碳环芳族基团，例如苯基和萘基，所述基团任选被选自以下的一个或多个取代基取代：氟、氰基、硝基、低级烷基(即烷芳基)、OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9和NR10R11。
[0065] 术语“芳烷基”包括经由低级烷基与卟啉环连接的芳基。
[0066] 本发明第二方面提供式II化合物用于杀伤、抑制或防止微生物生物膜生长的用途：
[0067]
[0068] 其中M为金属元素或类金属元素，X1、X2、X3、X4、Y1、Y2、Y3、Y4和Z如上所定义。
[0070] 更优选地，金属元素选自Zn(II)、Cu(II)、La(III)、Lu(III)、Y(III)、In(III)、Cd(II)、Mg(II)、Al(III)、Ru、Ni(II)、Mn(III)、Fe(III)和Pd(II)。最优选地，金属元素为Cu(II)或Fe(III)。
[0072] 应理解的是，术语金属元素和类金属元素包括具有正氧化态的金属元素或类金属元素，它们中的所有可被选自氟、OH、OR15中的一个或多个配体取代，其中R15为如上所定义的低级烷基、低级烯基、低级炔基、芳烷基、芳基或烷芳基(其中芳基和烷芳基为单取代的)。
[0073] 式I和II化合物包括至少一个阳离子基团。因此，本发明化合物可携带净正电荷，例如+1、+2、+3、+4、+5、+6或更多个电荷。在优选实施方案中，化合物携带小于+4的净电荷，例如+1、+2或+3。在尤其优选的实施方案中，化合物携带+2净电荷。
[0074] 本领域技术人员应该理解，式I和II化合物可由反荷阴离子来平衡。例示性反荷阴离子包括但不限于：卤化物(例如氟化物、氯化物和溴化物)、硫酸盐(例如癸基硫酸盐)、硝酸盐、高氯酸盐、磺酸盐(例如甲磺酸盐)和三氟乙酸盐。其它合适的反荷阴离子为本领域技术人员所熟知。因此，式I和II化合物的药学上和/或兽医学上可接受的衍生物
(例如盐和溶剂化物)亦可包括在本发明范围内。可提及的盐包括：酸加成盐，例如与无机酸(盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)形成的盐、与羧酸或与有机磺酸形成的盐；碱加成盐；与碱形成的金属盐，例如钠盐和钾盐。
(例如盐和溶剂化物)亦可包括在本发明范围内。可提及的盐包括：酸加成盐，例如与无机酸(盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)形成的盐、与羧酸或与有机磺酸形成的盐；碱加成盐；与碱形成的金属盐，例如钠盐和钾盐。
[0075] 技术人员应进一步了解，式I化合物可表现互变异构。所有互变异构形式及其混合物都包括在本发明范围内。
[0076] 式I和II化合物亦可含有一个或多个不对称碳原子，由此可表现出光学和/或非对映异构现象。可用常规技术分离非对映异构体，例如色谱法或分步结晶。可通过用诸如分步结晶或HPLC等常规技术分离化合物的外消旋混合物或其它混合物来分离不同的立体
异构体。或者，可通过在不引起外消旋化或差向异构化的条件下让合适光学活性原料反应，或通过例如用纯手性酸衍生接着由常规手段(例如HPLC、经由二氧化硅的色谱法)分离非
对映异构酯，来制备所需光学异构体。所有立体异构体都包括在本发明范围内。
异构体。或者，可通过在不引起外消旋化或差向异构化的条件下让合适光学活性原料反应，或通过例如用纯手性酸衍生接着由常规手段(例如HPLC、经由二氧化硅的色谱法)分离非
对映异构酯，来制备所需光学异构体。所有立体异构体都包括在本发明范围内。
[0077] 在本发明第一和第二方面的优选实施方案中，Z为-CH。
[0078] 本发明第一和第二方面的特征性特征为取代基X1、X2、X3和X4中的至少一个为如+上所定义的式-L-R1-N(R2)(R3)R4的季铵阳离子基团。优选地，X1、X2、X3和X4皆不是苯胺或吡啶 阳离子基团。
[0079] 在优选实施方案中，R1为未被取代的低级亚烷基、低级亚烯基或低级亚炔基。
[0080] 有利的是，R1为下式直链低级亚烷基：
[0081] -(CH2)m-。
[0082] 优选地，‘m’为1-20的整数。更优选地，‘m’为1-10的整数，例如1-6、1-5、1-4或1-3。R1可代表的优选直链低级亚烷基包括上式基团，其中m为2、3、4、5、6、7、8、9或10。最优选地，‘m’为2或3。
[0083] 季铵部分的其余三个取代基即R2、R3和R4可相同或不同，并选自H、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、OR5、+C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11和NR12R13R14。
[0084] 在优选实施方案中，R2、R3和/或R4为低级烷基、低级烯基或低级炔基。
[0085] 优选地，R2、R3和/或R4为未被取代的低级烷基。
[0086] 任选R2、R3和R4中的至少一个为被伯胺、仲胺或叔胺基团或者季铵基团取代的烷基。
[0087] 在本发明第一和第二方面的优选实施方案中，R1为-(CH2)3-，R2和R3为CH3，R4为-(CH2)3-N(CH3)2。
[0088] 在本发明第一和第二方面的备选优选实施方案中，R1为-(CH2)3-，R2、R3和R4各自为CH3。
[0089] 在本发明第一和第二方面的另一备选优选实施方案中，R1为-(CH2)3-，R2、R3和R4各自为C2H5。
[0090] 有利的是，X1、X2、X3和X4中的至少一个为如上所定义的阳离子基团，并且X1、X2、X3和X4中的至少一个为氢原子。
[0091] 优选地，X1、X2、X3和X4各自为氢原子或如上所定义的阳离子基团。
[0092] 合宜的是，任何伯胺、仲胺或叔胺基团(若本发明化合物中存在)的pK值大于8，以确保在生理环境中时所述基团被质子化。
[0093] 季铵阳离子基团任选经由连接部分L与卟啉环连接。
[0095] 在优选实施方案中，季铵阳离子基团经由苯氧基接头与卟啉环连接。
[0096] 因此，X1、X2、X3和/或X4可具有下式：
[0097]+
[0098] 其中R为如上所定义的R1-N(R2)(R3)R4，‘n’为1-3的整数(其中所述基团经由左边游离键与卟啉环连接)。
[0099] 在备选优选实施方案中，季铵阳离子基团经由亚苯基接头与卟啉环连接。
[0100] 因此，X1、X2、X3和/或X4可具有下式：
[0101]
[0102] 其中R为如上所定义的R1-N+(R2)(R3)R4，‘m’为1-3的整数(其中所述基团经由左边的游离键与卟啉环连接)。
[0103] 优选地，‘m’为2，最优选为1。
[0104] 在备选优选实施方案中，X1、X2、X3和/或X4可具有下式：
[0105]+
[0106] 其中R为R1-N(R2)(R3)R4，‘n’和‘m’如上所定义，‘n+m’介于1-3(其中所述基团经由左边的游离键与卟啉环连接)。
[0107] 有利的是，L包含在相对于连接卟啉大环的苯环位置的对位单取代的苯环(例如苯氧基、亚苯基、苯基磺酰氨基或苯基氨磺酰基)。或者，L可在相对于连接卟啉大环的苯环位置的间位或邻位被单取代或二取代。L亦可在对位和邻位两个位置被取代。
[0108] 在备选优选实施方案中，季铵阳离子基团直接与卟啉环连接，即L不存在。
[0109] 在本发明第一和第二方面的优选实施方案中，化合物在卟啉环的相对侧包含两个如上所定义的阳离子基团，即在环的5位和15位或环的10和20位。例如，X1和X3可为氢原子、亲脂部分、苯基、低级烷基、烷芳基或芳烷基，X2和X4可为阳离子基团，或反之亦然。优选地，X1和X3两个都为氢原子，X2和X4两个都为阳离子基团，或反之亦然。
[0110] 或者，化合物可在卟啉环的邻位包含两个如上所定义的阳离子基团，即在环的5位和10位或环的10和15位，或环的15位和20位或环的20位和5位。例如，X1和X2可为氢，X3和X4可为阳离子基团，或X2和X3可为氢，X4和X1可为阳离子基团等。
[0111] 本领域技术人员应该理解，当Z代表氮时，产生了另外的异构结构的可能性。所述可能性包括在本发明范围内。
[0112] 在本发明第一和第二方面另一优选实施方案中，化合物在其个组成吡咯环中的一个或多上被取代。因此，Y1、Y2、Y3和Y4可不存在，或独立代表芳基、低级烷基、低级烯基或低级炔基，其中后三者任选被选自以下的一个或多个取代基取代：低级烷基、低级亚烷基(任+选插入氧)、芳基、OR5、C(O)R6、C(O)OR7、C(O)NR8R9、NR10R11和NR12R13R14。技术人员应该理解，Y1、Y2、Y3和/或Y4可包含可为饱和或芳族的环状基团。例如，一个或多个吡咯环可被取代以形成异吲哚基团，即Y1、Y2、Y3和/或Y4与其所连接的吡咯环一起可为环状的。
[0113] 在本发明第一和第二方面的备选优选实施方案中，Y1、Y2、Y3和Y4不存在。因此，卟啉环优选仅在5、10、15或20位中的一处或多处被取代。
[0114] 在本发明第一和第二方面的再一优选实施方案中，X1、X2、X3和X4中的至少一个为或包括亲脂部分。
[0115] 就‘亲脂部分’而言，我们包括具有1-正辛醇与水之间的分配系数(表示为log P)在生理pH和25℃时大于1.0的部分。
[0116] 合宜的是，亲脂部分为式-(CH2)pCH3的饱和直链烷基或式-(CH2)p-的等价亚烷基，其中‘p’为1和22之间的整数，例如，1-18。优选地，‘p’为1-18，更优选为2-16、4-16、6-18、8-16或4-12。最优选‘p’为10-12。
[0117] 应该理解，X1、X2、X3和/或X4可为如上所定义的阳离子基团，其亦包含亲脂部分。
[0118] 在本发明第一和第二方面备选优选实施方案中，X1、X2、X3和X4皆不是亲脂部分。
[0119] 有利的是，在本发明第一和第二方面所用的化合物可溶于水。优选地，化合物可溶于水到至少5μg/l的浓度，例如，至少10μg/l、15μg/l或20μg/l。更优选地，化合物可溶于水到至少100μg/l的浓度，例如200μg/l、300μg/l、400μg/l、500μg/l、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml或100mg/ml。
[0120] 合宜的是，本发明第一和第二方面所用化合物对微生物表现出选择性毒性。就‘选择性’而言，我们意指化合物对一种或多种微生物(例如细菌、支原体、酵母菌、真菌和/或病毒)比对哺乳动物(例如人、宿主细胞)具有优先毒性。优选地，化合物对靶标微生物的毒性为该化合物对哺乳动物细胞的毒性的至少2倍，更优选至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。最优选本发明化合物基本上对哺乳动物细胞无毒。
[0121] 在该方式中，例如当化合物用于治疗细菌感染时，可选择给药方案以便在对健康宿主组织伤害最小的情况下摧毁细菌细胞。因此，用于本发明第一和第二方面的化合物优选展现‘治疗窗口’。
[0122] 在优选实施方案中，化合物以低剂量对靶标微生物(例如细菌细胞)有毒。优选地，化合物以小于10μM例如小于1μM、小于0.1μM、小于0.01μM、小于0.005μM或小于
0.001μM(参见实施例B)的浓度对靶标微生物有毒。
0.001μM(参见实施例B)的浓度对靶标微生物有毒。
[0123] 用于本发明第一和第二方面的优选化合物包括以下化合物：
[0124] (a)5，15-双-(4-{3-[(3-二甲基氨基-丙基)-二甲基-铵基]-丙氧基}-苯基)-卟啉(“化合物8”)
[0125]
[0126] 优选地，以二氯化物或四氯化物盐来提供该化合物。
[0127] (b)5，15-双-[4-(3-三乙基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉(“化合物9”)；
[0128]
[0129] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0130] (c)5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉(本文亦称为“化合物12”或“XF-70”)；
[0131]
[0132] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0133] (d)5，15-双-[4-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉(本文亦称为“化合物10”或“XF-73”)；
[0134]
[0135] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0136] (e)5-[3，5-双-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-15-十一烷基-卟啉(“化合物6”)；
[0137]
[0138] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0139] (f)5-{4-[3-二甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基-丙氧基]苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉(“化合物23”)；
[0140]
[0141] 优选地，以氯化物或二氯化物盐来提供该化合物。
[0142] (g)3-[({3-[(3-{4-[15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉-5-基]-苯氧基}-丙基)-二甲基-铵基]-丙基}-二甲基-铵基)-丙基]-三甲基-铵(“化合物25”)；
[0143]
[0144] 优选地，以三氯化物盐来提供该化合物。
[0145] (h)5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-10-十一烷基-卟啉(“化合物28”)；
[0146]
[0147] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0148] (i)5-{4-[3-二 甲 基 -(3-三 甲 基 铵 基-丙 基 )-铵 基- 丙 氧 基]- 苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉(“化合物31”)；和
[0149]
[0150] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0151] (j)5-[4-(3-二甲基癸基-铵基丙氧基)-苯基]-15-{4-[3-二甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基丙氧基]-苯基}-卟啉(“化合物32”)
[0152]
[0153] 优选地，以二氯化物盐来提供该化合物。
[0154] 在特别优选实施方案中，所述化合物为以上化合物10或化合物12的二氯化物盐。
[0155] 应该理解，以上化合物可备选地呈金属化物形式，即它们可在卟啉环内包含螯合的金属元素或类金属元素。
[0156] 优选螯合的金属元素包括Cu(II)和Fe(III)。
[0158] 可以以各种浓度配制按照本发明第一或第二方面制备的化合物，这视所用化合物的功效/毒性及其使用目的而定。优选地，将化合物配制为0.1μM-1mM的浓度，更优选为1μM-100μM、5μM-50μM、10μM-50μM、20μM-40μM的浓度，最优选为约30μM的浓度。
对于体外应用，制剂可包含较低浓度的化合物，例如0.0025μM-1μM。
对于体外应用，制剂可包含较低浓度的化合物，例如0.0025μM-1μM。
[0159] 本领域技术人员应该理解，当将所述化合物用于药物时，其通常与合适的药用赋形剂稀释剂或载体混合给予，根据计划给药途径及标准药物实践来选择所述药用赋形剂稀释剂或载体(例如参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995，Alfonso Gennaro编辑，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA)。在下面讨论合适的给药途径，包括局部、静脉内、经口、肺部、鼻部、耳部、眼部、膀胱和CNS递送。
[0160] 例如，对于局部施用至例如皮肤或伤口位点，可以以洗剂、溶液剂、乳膏剂、凝胶剂、软膏剂或撒布粉的形式给予化合物(例如参见Remington，上述，第1586-1597页)。因此，可将化合物配制为合适的软膏剂，所述软膏剂含有悬浮于或溶解于例如以下一种或多种物质的混合物中的活性化合物：矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将它们配制为合适的洗剂或乳膏剂，其悬浮于或溶解于例如以下一种或多种物质的混合物中：矿物油、硬脂山梨坦、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、e-十二烷基硫酸酯、醇(例如乙醇、鲸腊硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇)和水。
[0161] 在优选实施方案中，药剂(例如洗剂、溶液剂、乳膏剂、凝胶剂或软膏剂)以水为基质。
[0162] 适于在口中局部给予的制剂进一步包括：锭剂，其包含在通常为蔗糖和阿拉伯树胶或西黄蓍胶的矫味基质中的活性成分；软锭剂，其包含在例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶等惰性基质中的活性成分；和涑口水，其包含在合适的液态载体中的活性成分。
[0163] 用于本发明第一或第二方面的药物亦可经鼻或通过吸入给药，它们可适宜地以干粉吸入剂形式或从压力容器、泵、喷雾器或雾化器中在使用合适的抛射剂情况下以喷雾剂形式来递送，所述抛射剂为例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃
3
(hydrofluoroalkane)例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷
3
(HFA 227EA)、二氧化碳或其它合适的气体。在压力气雾剂情况下，可通过提供递送测定量的阀门来确定剂量单位。压力容器、泵、喷雾器或雾化器可含有例如用乙醇和抛射剂混合物作为溶剂的活性化合物的溶液或悬浮液，所述溶剂可另外含有润滑剂例如三油酸山梨坦。
可配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如用明胶制备)以含有本发明化合物和合适
的粉状基质例如乳糖或淀粉的粉状混合物。
3
(hydrofluoroalkane)例如1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷
3
(HFA 227EA)、二氧化碳或其它合适的气体。在压力气雾剂情况下，可通过提供递送测定量的阀门来确定剂量单位。压力容器、泵、喷雾器或雾化器可含有例如用乙醇和抛射剂混合物作为溶剂的活性化合物的溶液或悬浮液，所述溶剂可另外含有润滑剂例如三油酸山梨坦。
可配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如用明胶制备)以含有本发明化合物和合适
的粉状基质例如乳糖或淀粉的粉状混合物。
[0164] 优选安排气雾剂或干粉制剂使得每一次测定剂量或“喷气”含有至少1mg的化合物用于递送给患者。应该理解，气雾剂的总剂量随不同患者及不同适应症而不同，可在一天中以单剂量或更通常地以分剂量给予。
[0165] 或者，亦可采用本领域已知的其它常规给药途径；例如，可经口、含服或舌下以可含有矫味剂或着色剂的片剂、胶囊剂、胚珠(ovule)、酏剂、溶液剂或混悬剂形式来递送用于本发明第一或第二方面的药物，用于即释、延释或控释应用。亦可在眼内(参见以下)、耳内或经由海绵窦内注射来给予药物。
[0166] 亦可胃肠外给予药物，例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下(包括经由一排细针或用无针Powderject 技术)给予，或可将它们通过输注技术给予。最好以可含有其它物质的无菌水溶液形式来使用它们，所述其它物质为例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。若需要，应该适当地缓冲(优选到3-9的pH)水
溶液。通过本领域技术人员众所周知的标准药物技术容易地完成对在无菌条件下合适的胃肠外制剂的制备。
溶液。通过本领域技术人员众所周知的标准药物技术容易地完成对在无菌条件下合适的胃肠外制剂的制备。
[0167] 适于胃肠外给予的制剂包括：水性和非水性无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和赋予制剂与计划受者的血液等渗的溶质；和水性及非水性无菌混悬剂，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可在单位剂量或多剂量容器中提供，所述容器为例如密封安瓿和小瓶；并可冻干(冷冻干燥)条件下储存，这仅需要在临用前加入无菌液态载体例如注射用水。可从先前所述无菌粉末、颗粒和片剂类别制备临时注射溶液剂和混悬剂。
[0168] 亦可通过眼部途径给予药物，尤其是用于治疗眼睛疾病。为了眼科使用，可在等渗、已调节pH的无菌盐水中将化合物配制为微粉化混悬剂，或优选地在等渗、已调节pH的无菌盐水中将化合物配制为溶液剂，并任选与防腐剂例如苯扎氯铵组合。或者，它们可在软膏例如矿脂中配制。
[0169] 对于兽用，可按照正常兽医实践以合适可接受的制剂给予化合物，兽医将确定最适于特定动物的剂量方案和给药途径。
[0170] 可将药物储存在本领域已知的任何合适的容器或器皿中。本领域技术人员应该理解，所述容器或器皿应该优选密封和/或灭菌。有利的是，所述容器或器皿由塑料材料例如聚乙烯制成。
[0171] 应该理解，可将用于本发明第一或第二方面的化合物用于杀伤多种类型的形成生物膜的微生物，包括细菌、古细菌、原生动物、真菌和藻类。所述微生物可对一种或多种常规抗生素例如甲氧西林有耐药性(例如MRSA)。
[0172] 在一个实施方案中，微生物处于静止期或缓慢生长期。
[0173] 技术人员应该进一步了解，可用所述化合物来防止和/或治疗所述微生物的感染，即所述化合物适于预防性和/或治疗性治疗。例如，可将化合物用于防止或降低病原体传播或转移到其它对象(例如患者、卫生保健人员等)。
[0174] 在本发明第一和第二方面的一个实施方案中，微生物为细菌。
[0175] 细菌可为革兰氏阳性细菌，例如选自葡萄球菌或链球菌的细菌。
[0176] 例如，细菌可为葡萄球菌，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(例如甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌，MRSA)。
[0177] 或者，细菌可为链球菌，例如变异链球菌和/或血链球菌。
[0178] 细菌亦可为革兰氏阴性细菌，例如军团菌。
[0179] 在本发明第一和第二方面的备选实施方案中，微生物为真菌(例如假丝酵母(Candida spp))。
[0180] 在本发明第一和第二方面的另一实施方案中，微生物为古细菌。
[0181] 在本发明第一和第二方面的再一实施方案中，微生物为原生动物。
[0182] 在本发明第一和第二方面的再一实施方案中，微生物为藻类。
[0183] 本发明第一或第二方面所用化合物的剂量将视若干因素而定；所述因素包括所用的特定化合物、制剂、给药途径和所用化合物的适应症。然而，通常剂量介于每千克体重
0.01-20mg之间，优选0.1-15mg/kg，例如1-10mg/kg体重。
0.01-20mg之间，优选0.1-15mg/kg，例如1-10mg/kg体重。
[0184] 本领域技术人员应该理解，可将本文所述化合物用于杀伤、抑制或防止可发现微生物生物膜的任何环境中的所述生物膜的生长。因此，生物膜可与惰性支持体或有生命支持体缔合。
[0185] 在一个实施方案中，生物膜与有生命支持体相关。例如，生物膜可在人或动物身体内的表面上生长或易于在其上生长。
[0186] 因此，本发明提供如上所定义的化合物用于治疗或防止与生物膜的存在或生长有关的病况。
[0187] 例如，本文所述化合物可用于治疗或防止与身体内以下部位之一的微生物生物膜生长有关的病症或病况：
[0189] 然而，在一个实施方案中，所述化合物不用于治疗性和/或预防性治疗牙周炎或其它牙科感染。
[0190] (b)尿道(例如膀胱炎)。
[0191] (c)窦(例如慢性鼻窦炎)。
[0192] (d)耳朵(例如中耳感染)。
[0193] 然而，在一个实施方案中，所述化合物不用于治疗性和/或预防性治疗耳炎。
[0194] (e)心脏(例如心内膜炎)。
[0195] (f)前列腺(例如慢性细菌性前列腺炎)。
[0196] (g)骨(例如骨髓炎)。
[0197] 然而，在一个实施方案中，所述化合物不用于治疗性和/或预防性治疗骨髓炎。
[0198] (h)肺(例如囊性纤维化感染，例如肺炎)。
[0199] 然而，在一个实施方案中，所述化合物不用于治疗性和/或预防性治疗囊性纤维化患者的假单胞菌感染。
[0201] (j)皮肤。
[0202] 然而，在一个实施方案中，所述化合物不用于治疗性和/或预防性治疗特应性皮炎。
[0203] 在另一实施方案中，生物膜与惰性支持体相关。因此，生物膜可生长或易于生长在植入或另外插入在人或动物体内的装置的表面。
[0204] 例如，本文所述化合物可用于治疗或防止与身体内以下惰性表面之一上的微生物生物膜生长有关的感染：
[0205] (a)导管(例如用于血管内或尿道应用)。
[0207] (c)分流器(例如脑脊髓分流器)。
[0209] (e)眼科装置(例如隐性眼镜、巩膜环和人工晶状体)。
[0210] (f)人工关节(即关节造形术和其它整形外科装置植入)。
[0211] (g)人造心脏瓣膜。
[0212] (h)乳房假体。
[0213] 因此，应该理解，本文所述化合物尤其适合治疗和防止医院内感染。
[0214] 在优选实施方案中，在本发明第一或第二方面使用的化合物与常规抗微生物剂联合使用。例如，化合物可与一种或多种以下常规抗生素联合使用：抗菌剂，例如天然和人工合成的青霉素类和头孢菌素类、磺胺类、红霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、利福平，并包括庆大霉素、氨苄西林、青霉素(benzypenicillin)、苯明青霉素、苄星青霉素、非奈西林、苯氧基-甲基青霉素、普鲁卡因青霉素、氯唑西林、氟氯西林、甲氧西林钠、阿莫西林、盐酸巴氨西林、环己西林、美洛西林、匹氨西林、盐酸酞氨西林、卡非西林钠、哌拉西林、替卡西林、美西林、pirmecillinan、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢噻肟、头孢西丁、头孢磺啶钠、头孢他啶、头孢唑肟、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢孟多、头孢唑林、头孢拉定、拉氧头孢钠、氨曲南、盐酸金霉素、氯莫环素钠、盐酸地美环素、多西环素、赖甲环素、米诺环素、土霉素、阿米卡星、硫酸新霉素B、硫酸新霉素、奈替米星、妥布霉素、多粘菌素E、夫西地酸钠、硫酸多粘菌素B、大观霉素、万古霉素、磺胺酞酸钙(calcium sulphaloxate)、磺胺林、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺脒、磺胺酰脲(sulphaurea)、卷曲霉素、甲硝唑、替硝唑、西诺沙星、环丙沙星、呋喃妥因、乌洛托品、链霉素、羧苄西林、多粘菌素E甲磺酸(Colistimethate)、多粘菌素B、呋喃唑酮、萘啶酸、甲氧苄啶-磺胺甲 唑复方、克林霉素、林可霉素、环丝氨酸、异烟肼、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、吡嗪酰胺等；抗真菌剂，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、两性霉素、氟胞嘧啶、灰黄霉素、那他霉素、制霉菌素等；和抗病毒剂例如阿昔洛韦、AZT、ddI、盐酸金刚烷胺、异丙肌苷、阿糖腺苷等。
[0215] 在另一优选实施方案中，药物包含促渗剂(例如聚乙烯亚胺)或表现出这类促渗能力的抗生素(例如多粘菌素或粘菌素)和/或与促渗剂或所述抗生素共同给予。
[0216] 亦可采用在本发明第一和第二方面使用的化合物来在体外杀伤、抑制或防止微生物生物膜的生长。例如，化合物亦可以以灭菌溶液或洗液的形式用于防止例如家庭环境(例如厨房工作表面、淋浴器、管道、地面等)或商业或工业环境(例如在冷却系统内、管道、地面表面等)环境中的表面或基材上的微生物生物膜生长。
[0217] 优选所述药物在溶液中包含1-100μg/ml浓度的抗微生物化合物。
[0218] 优选所述溶液进一步包含表面活性剂。合适的表面活性剂包括阴离子表面活性剂(例如脂族磺酸盐)、两性和/或两性离子表面活性剂(例如脂族季铵、膦和锍化合物的衍生物)和非离子表面活性剂(例如脂肪族醇、酸、酰胺或含氧化烯的烷基酚)。
[0219] 适宜的是，表面活性剂以0.5-5％重量的浓度存在。
[0220] 在体外及体内两者应用中，本发明第一和第二方面使用的化合物优选与靶标表面接触至少5分钟。例如，接触时间可至少为10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、5小时、12小时和24小时。
[0221] 本发明第三方面提供本文所述化合物用于杀伤、抑制或防止缓慢生长期的细菌生长的用途。
[0222] 本发明第四方面提供本文所述化合物用于杀伤、抑制或防止静止期细菌生长的用途。
[0223] 因此，本发明提供如上所定义的化合物，用于治疗或防止与缓慢生长期或静止期细菌的存在或生长有关的病况。
[0224] 如随附实施例所证明，本发明化合物可用于杀伤、抑制或防止缓慢生长期或静止期细菌的生长。
[0225] 本领域技术人员应该理解，在某些条件(例如环境和/或生理条件)下，细菌可进入缓慢生长期(这时细菌的生长速率降低)和/或静止期(这时不能检测到细菌的生长)。就“生长”而言，我们包括细菌细胞(或所述细胞群)的复制和/或繁殖和/或分裂，亦包
括细菌细胞(或所述细胞群)内的细胞组分和/或化合物的再生和/或复制。
括细菌细胞(或所述细胞群)内的细胞组分和/或化合物的再生和/或复制。
[0226] 众所周知，生长速率在不同细菌之间不同，因此不同的细菌属、种、类型及菌株可具有不同的生长速率。生长速率亦由目的细菌遭受的具体环境条件决定，并根据周围介质中营养物的含量和组成以及诸如例如温度、通气、搅拌、光和pH等其它因素而变化。
[0227] 可在体外(例如在实验室试管或烧瓶培养中)通过测量标准条件(即限定培养基和温度、通气、搅拌、光和pH)下指数生长期的生长速率，来确定细菌生长的最佳速率。
[0228] 细菌细胞分裂及菌体规模增倍所需时间(“增代时间”)视细菌不同在约12分钟-24小时或更长时间之间变化。用于计算细菌增代时间的方法在本领域众所周知(参见
例如Brock等，Biology of Microorganisms，第6版，1991，Prentice Hall，和http://www.textbookofbacteriology.net/growth.html)。
例如Brock等，Biology of Microorganisms，第6版，1991，Prentice Hall，和http://www.textbookofbacteriology.net/growth.html)。
[0229] 实验室中大肠杆菌(E.coli)增代时间为15-20分钟，但估计肠道中为12-24小时。对于可被培养的大部分已知细菌，增代时间介于约15分钟-1小时之间(但共生体例
如根瘤菌(Rhizobium)和无机营养生物例如硝化细菌往往具有更长的增代时间)。某些病
原体细菌例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)具有特别长的增代时间。少数细菌的增代时间示于以下：
如根瘤菌(Rhizobium)和无机营养生物例如硝化细菌往往具有更长的增代时间)。某些病
原体细菌例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)具有特别长的增代时间。少数细菌的增代时间示于以下：
[0230]
[0231] 应该理解，可通过与该细菌在体外(例如在标准培养基、温度、通气、搅拌、光和pH条件下的实验室试管或烧瓶培养中)的最佳生长速率进行比较，来鉴别缓慢生长期或静止期的细菌。
[0232] 例如，缓慢生长速率可小于体外该细菌最佳生长速率的50％，例如小于该细菌最佳生长速率的60％或70％或80％或90％或95％。
[0233] 在优选实施方案中，本发明第三或第四方面的细菌如上所述(与本发明第一方面有关)。优选地，本发明第三或另外方面的细菌在活哺乳动物例如人身体表面或身体内，例如如上所述(与本发明第一方面有关)。
[0234] 已知可由选自或包括以下的缓慢生长或静止期的细菌引起感染(例如哺乳动物感染)：
[0235] 分枝杆菌(载于：Laboratory diagnosis of bacterial infections；NevoiCimolai编辑，Informa Healthcare出版，2001，第384-5页)；
[0236] 放 线 菌 (actinomycetes)( 载 于：Laboratory diagnosis of bacterialinfections；Nevoi Cimolai编辑，Informa Healthcare出版，2001，第384-5页)；
[0237] 金黄色葡萄球菌小菌落变种(Vaudaux P等，Difficult to diagnose anddifficult to treat，Clinical Infectious Diseases(2006)；43：968-70)；和
[0238] 布 鲁 氏 菌 (brucellae)(Guerra H.The brucellae and their success aspathogens(布鲁氏菌及其作为病原体的成功).Crit.Rev.Microbiol.(2007)；33(4)：
325-31)。
325-31)。
[0239] 因此，在一个优选的实施方案中，本发明第三和第四方面包括以下用途，其中处于缓慢生长期或静止期的细菌选自或包括以下细菌：分枝杆菌；放线菌；金黄色葡萄球菌小菌落变种；布鲁氏菌。
[0240] 本发明第五方面提供用于治疗罹患或易感与微生物生物膜有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予患者本文所述化合物。
[0241] 本发明第六方面提供用于治疗罹患或易感与缓慢生长期的细菌有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予患者本文所述化合物。
[0242] 如上所述，已知可由选自或包括以下的缓慢生长或静止期细菌引起感染(例如哺乳动物感染)：分枝杆菌；放线菌；金黄色葡萄球菌小菌落变种；和布鲁氏菌。
[0243] 因此，在优选实施方案中，本发明第五方面包括以下方法，其中缓慢生长期或静止期细菌选自或包括以下细菌：分枝杆菌；放线菌；金黄色葡萄球菌小菌落变种；布鲁氏菌。
[0244] 本发明第七方面提供用于治疗罹患或易感与静止期细菌有关或由其引起的疾病或病况的患者的方法，所述方法包括给予患者本文所述化合物。
[0245] 本领域技术人员应该理解，化合物可以以光动力学疗法的形式使用，或者，可开发其固有的抗微生物活性(如国际专利申请号：PCT/GB2003/005649[WO 2004/056828]和PCT/GB2005/002457[WO 2006/000765]中所述，其公开内容在此引作参考)。
[0246] 可用本领域众所周知方法配制并给予化合物。例如，可经口、胃肠外或局部给予化合物。
[0247] 如上所述，生物膜可存在于口腔、尿道、窦、耳朵、心脏、前列腺、骨、肺、肾和/或皮肤中的有生命支持体上。
[0248] 或者，生物膜可存在于身体内的惰性支持体上，例如导管、支架、分流器、插管或气管切开套管、眼科装置、人工关节、人造心脏瓣膜和/或乳房假体上。
[0249] 本发明第八方面提供用本文所述化合物浸渍、包被或另外处理的可植入医疗装置。
[0250] 例如，所述可植入医疗装置可选自血管内装置、导管、分流器、插管和气管切开套管、眼科装置、人工关节、人造心脏瓣膜和乳房假体。就“可植入装置”而言，我们包括粘附到身体表面的装置，例如隐形眼镜。
[0251] 优选地，可植入医疗装置使用前包装在密封或无菌容器中。
[0252] 本发明进一步提供制备本发明第八方面的可植入医疗装置的方法，所述方法包括用本文所述化合物处理未经处理的可植入医疗装置或其部件或组分。
[0253] 就本发明该方面内容中的‘处理’而言，我们意指将化合物包被、浸渍、共价结合未经处理的可植入医疗装置或其部件或组分或者另外与其混合。
[0254] 优选用化合物包被可植入医疗装置。就‘包被’而言我们意指将化合物施用到可植入医疗装置表面。因此，可用包含化合物的溶液涂抹或喷洒可植入医疗装置。或者，可将可植入医疗装置浸到含化合物的溶液的储库中。
[0256] 或者，用化合物浸渍可植入医疗装置。就‘浸渍’而言，我们意指在制备期间让化合物掺入可植入医疗装置的部件或组分中或另外与其混合，以使化合物分布在整个组合装置中。
[0258] 图1显示皮肤结构示意图。
[0259] 图2显示用化合物10孵育5分钟、1小时和4小时后对正常人真皮成纤维细胞的细胞毒性。
[0260] NHDF与不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1.0μM、10μM)的化合物10孵育5分钟、1小时和4小时。然后将细胞在黑暗中孵育24小时。通过标准MTT-测定测试毒性。将细胞生存力标准化为1，这意指将对照细胞值标准化为1。灰色点线：5分钟孵育；黑色点线：
1小时孵育；黑线：4小时孵育；(n＝3，平均值±SD)。
1小时孵育；黑线：4小时孵育；(n＝3，平均值±SD)。
[0261] 图3显示用化合物10孵育5分钟、1小时和4小时后对正常人表皮角质形成细胞的细胞毒性。
[0262] NHEK与不同浓度(0μM、0.01μM、0.1μM、1.0μM、10μM)的化合物10孵育5分钟、1小时和4小时。然后细胞在黑暗中孵育24小时。通过标准MTT-测定测试毒性。将细胞生存力标准化为1，这意指将对照细胞值标准化为1。红色点线：5分钟孵育；黑色点线：
1小时孵育；蓝色点线：4小时孵育；(n＝3，平均值±SD)。
1小时孵育；蓝色点线：4小时孵育；(n＝3，平均值±SD)。
[0263] 图4显示配制为固体(A)、配制在水中(B)及PBS中(C)的化合物10的化学稳定性。
[0264] 图5显示化合物10在PBS缓冲液中21天后的稳定性(由HPLC测量)的3D图。
[0265] 图6显示不同制剂经8周后的稳定性：(A)化合物1；(B)化合物8；(C)化合物12；和(D)化合物10。
[0266] 图7显示不同制剂经17周后延长的稳定性：(A)化合物10和(B)化合物8。
[0267] 图8显示化合物10(“XF-73”)及对照物质以4x MIC对金黄色葡萄球菌SH1000冷-培养物的作用。
[0268] 图9显示化合物10(“XF-73”)及对照物质以4x MIC对严紧型金黄色葡萄球菌SH1000培养物的作用。
[0269] 图10显示化合物12(“XF-70”)和化合物10(“XF-73”)及比较物质(以4x MIC)对严紧型金黄色葡萄球菌SH1000培养物的生存力的影响。在前30分钟(-30分钟)加入
莫匹罗星((5ug/ml)以诱导严紧型反应，接着在零分钟加入其它抑制剂和药物。
莫匹罗星((5ug/ml)以诱导严紧型反应，接着在零分钟加入其它抑制剂和药物。
[0270] 图11显示化合物12(“XF-70”)和化合物10(“XF-73”)及比较物质(以4x MIC)对在4℃Mueller-Hinton肉汤中保存的金黄色葡萄球菌SH1000的生存力的影响。
[0271] 图12显示化合物10(“XF-73”)、化合物12(“XF-70”)和多种抗微生物剂对表现严紧型反应的金黄色葡萄球菌SH1000细胞的杀伤动力学。所示值为来自三次独立实验的三个重复值的平均值和标准偏差。
[0272] 图13显示化合物10(“XF-73”)、化合物12(“XF-70”)和多种抗微生物剂对冷培养物中的金黄色葡萄球菌SH1000细胞的杀伤动力学。所示值为来自三次独立实验的三个重复值的平均值和标准偏差。
[0273] 图14显示化合物10(“XF-73”)、化合物12(“XF-70”)和多种抗微生物剂对早稳定期的金黄色葡萄球菌SH1000细胞的杀伤动力学。所示值为来自三次独立实验的三个重复值的平均值和标准偏差。
[0274] 图15显示化合物10(“XF-73”)、化合物12(“XF-70”)和多种抗微生物剂对中稳定期的金黄色葡萄球菌SH1000细胞的杀伤动力学。所示值为来自三次独立实验的三个重复值的平均值和标准偏差。
[0275] 图16显示化合物10(“XF-73”)、化合物12(“XF-70”)和多种抗微生物剂对晚稳定期的金黄色葡萄球菌SH1000细胞的杀伤动力学。所示值为来自三次独立实验的三个重复值的平均值和标准偏差。
实施例
实施例
[0276] 实施例A：合成例示性化合物
[0277] 材料和方法
[0278] NMR-测量
[0279] 在Bruker B-ACS60(300MHz)仪器上用TMS作为内标记录质子NMR光谱。在所给溶剂中，用ppm表示化学位移，用Hz表示偶合常数。NMR的某些缩写：单峰(s)、宽峰(bs)、双峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、五重峰(quint)、多重峰(m)。
[0280] 化学药品
[0281] 所有溶剂和试剂购自Aldrich、Fluka、Merck和Lancaster，在没有进一步纯化的情况下使用。
[0282] 如C.Brücker等，J.Porphyrins Phthalocyanines，2 455(1998)所述制备二吡咯基甲烷。
[0283] 色谱分析
[0284] 用 硅 胶 (Merck 硅 胶 60，Fluka 60，0.040-0.063mm) 和 SephadexLH-20(Pharmacia)实施柱色谱。用于色谱分析的所有溶剂(Synopharm)为技术纯级别。
[0285] 缩写
[0286] DDQ：2，3-二氯-5，6-二氰基-对-苯醌
[0287] DMF：N，N-二甲基甲酰胺
[0288] TFA：三氟乙酸
[0289] 测试化合物的合成途径
[0290] 如WO 2004/056828、WO 2006/000765和WO 2007/074340(其公开内容在此引作参考)所述合成以下测试化合物：
[0291] 本发明使用的例示性化合物
[0292] 化合物6、8-10、12、23、25、28、31和32。
[0293] 参比化合物(用作比较对照)
[0294] 化合物1、3、16、19、26、29、33、36、37、39、41和46-51。
[0295] 化学中间体
[0296] 化合物2、4、5、7、11、13-15、17、18、20-22、24、27、30、34、35、38、40和42-45。
[0297] 化合物6
[0298] 5-[3，5-双-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-15-十一烷基-卟啉二氯化物
[0299]
[0300] 于50℃向剧烈搅拌的含化合物5(80mg，0.14毫摩尔)和K2CO3(230mg，1.7毫摩尔)的DMF(30mL)悬浮液中加入溴化(1-溴丙基)-三甲基铵(0.3g，16.6毫摩尔)。让混合物在该温度搅拌18小时。减压下除去DMF后，让获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢
化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(大约1L)洗涤硅胶垫后，用
乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱粗产物。收集合适流分，减压下蒸发溶剂后，通
过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(5∶4∶1体积比，上相)
洗脱的色谱法，来纯化获得的残留物。减压下从合适流分除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)的短柱(3.5x20cm)。收集洗出物后，减压下除去溶剂，高真空下干燥获得的残留物，得到作为紫色固体的二氯化物盐。
化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(大约1L)洗涤硅胶垫后，用
乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱粗产物。收集合适流分，减压下蒸发溶剂后，通
过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(5∶4∶1体积比，上相)
洗脱的色谱法，来纯化获得的残留物。减压下从合适流分除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)的短柱(3.5x20cm)。收集洗出物后，减压下除去溶剂，高真空下干燥获得的残留物，得到作为紫色固体的二氯化物盐。
[0301] 1H-NMR：
[0302] δH(300Mz，CD3OD)：0.75(t，3J 7.5Hz，3H)，1.05-1.20(m，14H)，1.45-1.50(m，2H)，3
2.05-2.15(m，4H)，2.15-2.20(m，2H)，2.95(s，18H)，3.35-3.45(m，4H)，3.95(t，J 7.5Hz，
3
4H)，4.55(t，J 7.5Hz，2H)，6.85(m，1H)，7.35(m，2H)，8.85-8.90，9.15-9.20，(3x m，8H)，
10.10(s，2H)。
2.05-2.15(m，4H)，2.15-2.20(m，2H)，2.95(s，18H)，3.35-3.45(m，4H)，3.95(t，J 7.5Hz，
3
4H)，4.55(t，J 7.5Hz，2H)，6.85(m，1H)，7.35(m，2H)，8.85-8.90，9.15-9.20，(3x m，8H)，
10.10(s，2H)。
[0303] 化合物8
[0304] 5，15-双-(4-{3-[(3-二甲基氨基-丙基)-二甲基-铵基]-丙氧基}-苯基)-卟啉二氯化物
[0305]
[0306] 让化合物7(200mg，0.27毫摩尔)溶解于含N，N，N’，N’-四甲基-1，3-丙二胺(5mL，13，9毫摩尔)的纯DMF(40mL)中，于50℃在氩气中过夜搅拌该溶液。减压下蒸发溶剂后，让获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤该溶液。用甲醇(大约1L)接着用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱硅胶
垫。从合适流分蒸发溶剂后，将获得的粗产物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)作为展开相的色谱法来
进一步纯化。洗脱的第一流分为期需产物。减压下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x
20cm)。减压下从洗出物除去溶剂后，用二乙醚处理残留物，高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
1
垫。从合适流分蒸发溶剂后，将获得的粗产物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)作为展开相的色谱法来
进一步纯化。洗脱的第一流分为期需产物。减压下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x
20cm)。减压下从洗出物除去溶剂后，用二乙醚处理残留物，高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
1
[0307] H-NMR：
[0308] δH(300MHz，CD3OD)：2.20-2.35(m，4H)，2.40-2.50(m，4H)，2.80(s，12H)，3.05(4H，3 3
t，J 7.8，2H)，3.25(s，12H)，3.45-3.55(bs，4H)，3.65-3.75(m，4H)，4.30(t，J 4.2Hz，4H)，
3 3
7.40，8，10(2x d，J 7.5Hz，2x 4H)，8.95，9.45(2x d，J 4.2Hz，8H)，10.40(s，2H)。
t，J 7.8，2H)，3.25(s，12H)，3.45-3.55(bs，4H)，3.65-3.75(m，4H)，4.30(t，J 4.2Hz，4H)，
3 3
7.40，8，10(2x d，J 7.5Hz，2x 4H)，8.95，9.45(2x d，J 4.2Hz，8H)，10.40(s，2H)。
[0309] 化合物9
[0310] 5，15-双-[4-(3-三乙基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉二氯化物
[0311]
[0312] 向含化合物7(50mg，0.068毫摩尔)的纯DMF(20mL)溶液中加入三乙胺(4，7mL，0.034摩尔，500当量)。于60℃将该混合物搅拌24小时。减压下除去溶剂，让获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇
(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱硅胶垫。从洗脱的流分蒸发
溶剂后，将获得的粗产物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的色谱法来纯化。减压下从合适流分除
去溶剂，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)，蒸发溶剂后得到作为紫色固体的产物。
(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱硅胶垫。从洗脱的流分蒸发
溶剂后，将获得的粗产物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的色谱法来纯化。减压下从合适流分除
去溶剂，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)，蒸发溶剂后得到作为紫色固体的产物。
[0313] 1H-NMR：
[0314] δH(300Mz，CD3OD)：1.25(m，18H)，2.13(m，4H)，-CH2NCH2(16H)信号作为溶剂信号3 3
覆盖的多重峰的部分在3.00-3.40区域，4.15(t，4H，J＝7.5Hz)，7.36(d，4H，J＝7.5Hz)，
3 3 3
8.15(d，4H，J＝7.5Hz)，9.05(d，4H，J＝7.5Hz)，9.54(d，4H，J＝7.5Hz)，10.45(s，2H)。
覆盖的多重峰的部分在3.00-3.40区域，4.15(t，4H，J＝7.5Hz)，7.36(d，4H，J＝7.5Hz)，
3 3 3
8.15(d，4H，J＝7.5Hz)，9.05(d，4H，J＝7.5Hz)，9.54(d，4H，J＝7.5Hz)，10.45(s，2H)。
[0315] 化合物10
[0316] 5，15-双-[4-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉二氯化物
[0317]
[0318] 将含化合物7(300mg，0.41毫摩尔)的纯DMF(50mL)溶液转移到100mL的高压灭菌器中。加入三甲胺(4.5g)后，让混合物在50℃搅拌16小时。蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤该溶液。用
甲醇(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱硅胶垫。从合适流分
蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的色谱法来纯化。获得两个流分，
其中首先洗脱的流分为期需产物。减压下除去溶剂，将获得的残留物重溶于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。减
压下蒸发溶剂后，用甲醇∶二乙醚处理残留物，高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
1
甲醇(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体积比)洗脱硅胶垫。从合适流分
蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的色谱法来纯化。获得两个流分，
其中首先洗脱的流分为期需产物。减压下除去溶剂，将获得的残留物重溶于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。减
压下蒸发溶剂后，用甲醇∶二乙醚处理残留物，高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
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[0319] H-NMR：
[0320] δH(300Mz，CD3OD)：2.40-2.60(m，4H)，3.30-3.25(bs，18H)，3.75-3.80(m，4H)，3 3 3
4.40(t，J 7.5Hz，4H)，7.40，8.20(2x d，J 8.5Hz，8H)，9.05，9.50(2x d，J 4.5Hz，8H)，
10.45(s，2H)。
4.40(t，J 7.5Hz，4H)，7.40，8.20(2x d，J 8.5Hz，8H)，9.05，9.50(2x d，J 4.5Hz，8H)，
10.45(s，2H)。
[0321] 化合物10的备选合成途径
[0322] 让化合物42(100mg，0.2毫摩尔；参见以下)溶解并让碳酸钾(230mg 1.7毫摩尔)悬浮在DMF(30mL)中，于50℃向该剧烈搅拌的混合物中在30分钟期间滴加含溴化(1-溴丙基)-三甲基铵(350mg，1.3毫摩尔)的DMF(5mL)溶液。让该混合物加热15小时。通过
旋转蒸发除去DMF，将获得的残留物溶解于甲醇中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅
胶垫(厚2cm)过滤该溶液。用甲醇(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体
积比)洗脱硅胶垫。从合适流分蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的
色谱法纯化。获得两个流分，其中首先洗脱的流分为期需产物。减压下除去溶剂，将获得的残留物复溶于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。减压下蒸发溶剂后，用甲醇∶二乙醚处理残留物，在高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
旋转蒸发除去DMF，将获得的残留物溶解于甲醇中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅
胶垫(厚2cm)过滤该溶液。用甲醇(大约1L)洗涤后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1体
积比)洗脱硅胶垫。从合适流分蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗脱的
色谱法纯化。获得两个流分，其中首先洗脱的流分为期需产物。减压下除去溶剂，将获得的残留物复溶于甲醇(5mL)中，让该溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。减压下蒸发溶剂后，用甲醇∶二乙醚处理残留物，在高真空下干燥，得到作为紫色固体的产物。
[0323] 化合物12
[0324] 5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-卟啉二氯化物
[0325]
[0326] 将含化合物11(400mg，0.543毫摩尔)的DMF(50mL)溶液转移到100mL高压灭菌器中。在加入三甲胺(6.3g)后，于50℃让混合物搅拌8小时。减压下蒸发溶剂后，将获
得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让溶液通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚
2cm)过滤。用甲醇(大约1L)洗涤硅胶垫后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗
脱得到流分，减压下蒸发溶剂后，得到固态残留物。让该残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗
脱的色谱法来纯化。从柱中洗脱出两个流分，其中第一个为期需产物。减压下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)，减压下除去溶剂，用甲醇∶二乙醚处理粗产物，得到紫色固体，将其在高真空下干燥。
得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让溶液通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚
2cm)过滤。用甲醇(大约1L)洗涤硅胶垫后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗
脱得到流分，减压下蒸发溶剂后，得到固态残留物。让该残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过在Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1体积比，上相)洗
脱的色谱法来纯化。从柱中洗脱出两个流分，其中第一个为期需产物。减压下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，让溶液流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)，减压下除去溶剂，用甲醇∶二乙醚处理粗产物，得到紫色固体，将其在高真空下干燥。
[0327] 1H-NMR：
[0328] δH(300Mz，CD3OD)：2.30-2.35(m，4H)，3.15(s，18H)，3.95-4.05(m，4H)，4.20-4.25(m，4H)，7.40-7.45，7.65-7.70，7.80-7.85(3x m，8H)，9.00-9.05，9.40-9.45，(2x m，8H)，10.40(m，2H)。
[0329] 化合物23
[0330] 5-{4-[3-二甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基-丙氧基]苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉氯化物
[0331]
[0332] 将化合物20(30mg，0.038毫摩尔)溶解于含N，N，N’，N’-四甲基-1，3-丙二胺(156mg，1.2毫摩尔)的THF∶DMF(1∶1体积比，20mL)中，于50℃搅拌18小时。减压下蒸发溶剂后，让残留物溶解于二氯甲烷中，并通过柱色谱(硅胶Merck 60)用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗脱来纯化。合并合适的流分和减压下除去溶剂，然后用二氯甲
烷∶己烷处理残留物，得到作为紫色固体的产物。
烷∶己烷处理残留物，得到作为紫色固体的产物。
[0333] 1H-NMR：
[0334] δH(300Mz，CDCl3+1 ％ 乙 酸 )：0.85(m，3H)，1.20-1.40(m，18H)，1.55-1.60(m，2H)，1.60-1.65(m，4H)，2.10-2.20(bs，8H)，3.15-3.25(m，8H)，3.75(bs，2H)，4.20(bs，2H)，
4.35(bs，2H)，7.15-7.20，8.10-8.15(2x m，8H)，8.95-9.00，9.10-9.15，9.25-9.30(3x bs，
8H)，10.20(s，2H)。
4.35(bs，2H)，7.15-7.20，8.10-8.15(2x m，8H)，8.95-9.00，9.10-9.15，9.25-9.30(3x bs，
8H)，10.20(s，2H)。
[0335] 化合物25
[0336] 3-[({3-[(3-{4-[15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉-5-基]-苯氧基}-丙基)-二甲基-铵基]-丙基}-二甲基-铵基)-丙基]-三甲基-铵三氯化物
[0337]
[0338] 让化合物23(20mg，0.022毫摩尔)和溴化(1-溴丙基)-三甲基-铵(26mg，0.1毫摩尔)溶解于DMF(15ml)中，于50℃搅拌过夜。减压下蒸发溶剂后，让残留物溶解于甲醇(5mL)中，将其施用到硅胶垫(3cm厚)上，用甲醇(500ml)接着乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗涤该硅胶垫。蒸发溶剂后，通过柱色谱(硅胶Merck 60)先用乙酸∶甲醇∶水
(3∶2∶1，体积比)然后用吡啶∶乙酸(1∶1，体积比)，来纯化残留物。收集洗脱的第
二个流分，真空下干燥。让残留物溶解于甲醇(2ml)中，并通过色谱法在用正丁醇∶乙酸∶水(5∶1∶4体积比，上相)洗脱的Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上来纯化。减压下
除去溶剂后，让残留物于80℃在真空下干燥。NMR光谱学表明产物污染了少量排除产物。
(3∶2∶1，体积比)然后用吡啶∶乙酸(1∶1，体积比)，来纯化残留物。收集洗脱的第
二个流分，真空下干燥。让残留物溶解于甲醇(2ml)中，并通过色谱法在用正丁醇∶乙酸∶水(5∶1∶4体积比，上相)洗脱的Sephadex LH-20柱(2.5x 40cm)上来纯化。减压下
除去溶剂后，让残留物于80℃在真空下干燥。NMR光谱学表明产物污染了少量排除产物。
[0339] 化合物28
[0340] 5，15-双-[3-(3-三甲基铵基-丙氧基)-苯基]-10-十一烷基-卟啉二氯化物
[0341]
[0342] 在氩气氛下向含化合物27(50mg，0.08毫摩尔)的DMF(20mL)溶液中加入K2CO3(100mg，0.72毫摩尔)和溴化(3-溴丙基)-三甲基铵(300mg，1.2毫摩尔)，于50℃
将该混合物搅拌18小时。高真空下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(500mL)洗涤硅胶垫后，
用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，v∶v)洗脱。高真空下干燥合适的合并流分后，让残留物
溶解于甲醇中，通过柱色谱法在Sephadex LH-20上用正丁醇∶乙酸∶水(5∶1∶4体积
比，上相)洗脱来纯化。蒸发溶剂后，将从洗脱的第一个流分获得的残留物溶解于甲醇中，并流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱，蒸发溶剂后获得纯产物。
1
将该混合物搅拌18小时。高真空下除去溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(500mL)洗涤硅胶垫后，
用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，v∶v)洗脱。高真空下干燥合适的合并流分后，让残留物
溶解于甲醇中，通过柱色谱法在Sephadex LH-20上用正丁醇∶乙酸∶水(5∶1∶4体积
比，上相)洗脱来纯化。蒸发溶剂后，将从洗脱的第一个流分获得的残留物溶解于甲醇中，并流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱，蒸发溶剂后获得纯产物。
1
[0343] H-NMR：3
[0344] δH(300Mz，CD3OD)：0.85(t，J 7.5Hz，3H)，1.20-1.40(m，12H)，1.50(m，2H)，1.80(m，2H)，2.40(bs，4H)，2.55(m，2H)，3.20(bs，18H)，3.65(bs，4H)，4.35(bs，4H)，
5.10(m，2H)，7.50-7.55，7.70-7.85(2xm，8H)，8.95-9.00，9.25-9.24，9.50-9.70(3x bs，
8H)，10.15(bs，1H)。
5.10(m，2H)，7.50-7.55，7.70-7.85(2xm，8H)，8.95-9.00，9.25-9.24，9.50-9.70(3x bs，
8H)，10.15(bs，1H)。
[0345] 化合物31
[0346] 5-{4-[3-二甲基-(3-三甲基铵基-丙基)-铵基-丙氧基]-苯基}-15-(4-十二烷氧基-苯基)-卟啉二氯化物
[0347]
[0348] 将化合物23(50mg，0.055毫摩尔)与碘甲烷(5mL，80毫摩尔)溶解于纯DMF(30mL)中，让该混合物在40℃搅拌3小时。蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(5mL)中，通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(大约1L)洗涤硅胶垫后，用二氯甲烷∶甲醇(2∶3体积比，500mL)然后是乙酸∶水∶甲醇(3∶1∶2体积比)洗脱。
从合适的合并流分除去溶剂后，将获得的残留物溶解于乙酸中，通过柱色谱法在Sephadex LH-20上用乙酸洗脱来纯化。从合适的合并流分蒸发溶剂后，高真空下将获得的残留物干燥，让该残留物溶解于甲醇中，流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)小柱(3.5x 20cm)。从洗出物蒸发溶剂后，在高真空下干燥产物。
从合适的合并流分除去溶剂后，将获得的残留物溶解于乙酸中，通过柱色谱法在Sephadex LH-20上用乙酸洗脱来纯化。从合适的合并流分蒸发溶剂后，高真空下将获得的残留物干燥，让该残留物溶解于甲醇中，流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)小柱(3.5x 20cm)。从洗出物蒸发溶剂后，在高真空下干燥产物。
[0349] 化合物32
[0350] 5-[4-(3-二甲基癸基-铵基丙氧基)-苯基]-15-{4-[3-二甲基-(3-二甲基氨基丙基)-铵基丙氧基]-苯基}-卟啉二氯化物
[0351]
[0352] 将化合物23(50mg，0.068毫摩尔)与N，N，N’，N’-四甲基-1，3-丙二胺(354mg，1.36毫摩尔)和N，N-二甲基癸胺(1g，2.72毫摩尔)溶解于DMF∶THF(30mL，1∶1，，体
积比)中，让该混合物于50℃搅拌过夜。减压下蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(10mL)并通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(大约500mL)
洗涤硅胶垫后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗脱。合并洗脱的头两个流分，减压下蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇中，并通过色谱法在Sephadex LH-20柱(2.5x
40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1，体积比)洗脱来纯化。从洗脱的第二个流分减压
下除去溶剂后，将残留物溶解于甲醇(5mL)中，流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。蒸发洗出物到干燥，在高真空下干燥获得的残留物，获得产物。
积比)中，让该混合物于50℃搅拌过夜。减压下蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇(10mL)并通过钢化玻璃(直径3.5cm)支撑的硅胶垫(厚2cm)过滤。用甲醇(大约500mL)
洗涤硅胶垫后，用乙酸∶甲醇∶水(3∶2∶1，体积比)洗脱。合并洗脱的头两个流分，减压下蒸发溶剂后，将获得的残留物溶解于甲醇中，并通过色谱法在Sephadex LH-20柱(2.5x
40cm)上用正丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1，体积比)洗脱来纯化。从洗脱的第二个流分减压
下除去溶剂后，将残留物溶解于甲醇(5mL)中，流过阴离子交换树脂(Amberlite IRA 400，氯化物形式)短柱(3.5x 20cm)。蒸发洗出物到干燥，在高真空下干燥获得的残留物，获得产物。
[0353] 1H-NMR：δH(300MHz，CD3OD)：0.80(m，3H)，1.05-1.25(m，10H)，1.25-1.40(bs，2H)，1.80-1.90(bs，4H)，2.15-2.30(bs，2H)，2.80-3.60(m，20H)，3.80-3.95(bs，4H)，
7.05-7.15，7.85-8.00(2x m，2x 4H)，8.75-8.90，9.20-9.35(2x bs，2x 4H)，10.15(bs，
2H)。
7.05-7.15，7.85-8.00(2x m，2x 4H)，8.75-8.90，9.20-9.35(2x bs，2x 4H)，10.15(bs，
2H)。
[0354] 实施例B：化合物10的固有抗菌活性-最小抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
[0355] 将抗微生物剂针对特定微生物的最小抑制浓度(MIC)定义为在观察不到生物体的明显可见生长时抗菌剂的最小浓度(最小抑制浓度的FDA定义)。通常用传统
上来自系列2倍稀释的浓度测定MIC(全国临床实验标准委员会(NCCLS)手册M7-A5：
“Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically(对需氧生长细菌的稀释抗菌剂易感性测试的方法)；核定标准-第5版”第20卷第2期。2000年1月)。用基于NCCLS(全国临床实验标准委员会(NCCLS)手册M7-A5，
同上)产生的MIC方案的方案研究了化合物10在缺乏光时的MIC。
上来自系列2倍稀释的浓度测定MIC(全国临床实验标准委员会(NCCLS)手册M7-A5：
“Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically(对需氧生长细菌的稀释抗菌剂易感性测试的方法)；核定标准-第5版”第20卷第2期。2000年1月)。用基于NCCLS(全国临床实验标准委员会(NCCLS)手册M7-A5，
同上)产生的MIC方案的方案研究了化合物10在缺乏光时的MIC。
[0356] 将最小杀菌浓度(MBC)定义为在既定的一套条件下孵育固定时间长度(通常为24小时)后，杀死大部分(99.9％)有活力的生物体所需药物的最小浓度(全国临床实验
标准委员会(NCCLS)手册M26-A；“Methods for determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents(用于测定抗微生物剂的杀菌活性的方法)；核定指南”第19卷第
18期，1999年9月)。
标准委员会(NCCLS)手册M26-A；“Methods for determining Bactericidal Activity of Antimicrobial Agents(用于测定抗微生物剂的杀菌活性的方法)；核定指南”第19卷第
18期，1999年9月)。
[0357] 方法
[0358] 将从ATCC目录获得的金黄色葡萄球菌BAA-44这种多药耐药性甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株用于本研究。调查了化合物10的以下浓度：0.764；
0.382；0.191；0.0955；0.0478；0.0239；0.0119；0.00597；0.00298；0.00149；0.00075 和
0.00037μg/mL。在重蒸水中制备储液，在临用前将该储液进行系列稀释以产生所需浓度。
0.382；0.191；0.0955；0.0478；0.0239；0.0119；0.00597；0.00298；0.00149；0.00075 和
0.00037μg/mL。在重蒸水中制备储液，在临用前将该储液进行系列稀释以产生所需浓度。
[0359] 从琼脂板培养物选择至少3-5株具有相同形态类型的完全分离的克隆，将该生长物转移到含100mL Isosensitest肉汤的试管中，让肉汤培养物在37℃孵育过夜。然后用新4
鲜Isosensitest肉汤将培养物稀释到最终密度10 个细胞/mL，在37℃振摇孵育直到细胞
进入指数生长。
鲜Isosensitest肉汤将培养物稀释到最终密度10 个细胞/mL，在37℃振摇孵育直到细胞
进入指数生长。
[0360] 将0.09mL调整过的接种物转移到聚苯乙烯96孔微量滴定板的24孔的每孔中。包括只有生长培养基的单独细菌对照孔(作为阳性对照)。
[0361] 将来自稀释系列的0.09mL化合物10储液用移液管吸取到微量滴定板的相关孔中，于37℃在黑暗中孵育，24小时孵育后检查该板，以测定每孔浊度。用这些数据来测定MIC。
[0362] 在37℃孵育24小时后，将来自没有可见细菌生长的孔中的25μL流体样品(4孔以上)点接到营养琼脂板中，在37℃再孵育24小时以测定MBC。
[0363] 结果
[0364] 结果显示化合物10在缺乏光时的MIC为0.0955μg/mL，MBC为0.382μg/mL(表1)。
[0365] 表1
[0366] 化合物10的MIC和MBC数据
[0367]
[0368] *在0.191的继代培养(sub)上的生长由初始接种物甚至减少到约103/ml
[0369] 结论
[0370] 结果显示，化合物10在缺乏光时具有低MIC和MBC值。这些数据表明，化合物10作为抗生素比某些传统抗生素显著更为有效(参见表2)：
[0371] 表2
[0372] 化合物10和常规抗生素的MIC和MBC值
[0373]
[0374] (a)Critchley IA等Baseline study to determine in vitro activities ofdaptomycin against gram-positive pathogens isolated in the United States in
2000-2001(测定达托霉素对2000-2001年在美国分离的革兰氏阳性病原体的体外活性的
基线研究).Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2003)；47(5)：1689-93
2000-2001(测定达托霉素对2000-2001年在美国分离的革兰氏阳性病原体的体外活性的
基线研究).Antimicrobial Agents and Chemotherapy(2003)；47(5)：1689-93
[0375] (b)Biavasco F 等 In vitro antibacterial activity of LY333328，a newsemi-synthetic glycopeptide(LY333328这种新型半-人工合成的糖肽的体外抗细菌活
性).Antimicrobial Agents and Chemotherapy(1997)；41(10)：2165-72
性).Antimicrobial Agents and Chemotherapy(1997)；41(10)：2165-72
[0376] (c)Fuchs PC 等 In vitro bactericidal activity of daptomycinagainst staphylococci(达托霉素对葡萄球菌的体外杀菌活性).Journal of
AntimicrobialChemotherapy(2002)；49：467-70
AntimicrobialChemotherapy(2002)；49：467-70
[0377] 实施例C：化合物10的固有抗菌活性-对一系列参考菌株和临床分离株的活性
[0378] 用IsoSensitest 肉汤测定了化合物10对一系列参考菌株和临床分离株的最小抑制浓度(MIC)，并通过在Columbia血琼脂中的继代培养测定最小杀菌浓度(MBC)。
[0379] 方法
[0380] 1.在水中制备化合物10的5mg/ml储液
[0381] 2.进行系列稀释以产生32-0.001mg/L之间的浓度范围
[0382] 3.在IsoSensitest 肉汤中过夜生长测试微生物
[0384] 5.将90μl含有微生物的肉汤培养物用转移到微量滴定盘的一排12孔的每一孔中，在对照盘中重复操作-每盘4种生物体
[0385] 6.然后将90μL合适的化合物10稀释液加到含有生物体的各孔中，以得到16mg/L-0.0005mg/L的最终系列稀释液
[0386] 7.充分混合溶液，在黑暗中孵育24小时
[0387] 8.记录MIC，让来自显示无生长的孔的25μL在血琼脂上继代培养进行MBC测定
[0388] 9.过夜孵育继代培养物后记录MBC值
[0389] 10.每盘中每种生物体都有未接种的肉汤对照及肉汤加接种物对照
[0390] 结果
[0391] 结果示于表3中
[0392] 表3
[0393] 化合物10及常规抗生素的MIC和MBC值
[0394]
[0395]
[0396]
[0397] *＝临床分离株
[0398] 结论
[0400] 实施例D：化合物10对人细胞的毒性测试
[0401] 方法
[0402] 用购自CellSystems Biotechnologie GmbH(德国)的正常人表皮角质形成细胞(NHEK)和正常人真皮成纤维细胞(NHDF)，筛选测试化合物对培养的人皮肤细胞的毒性。
[0403] 用3和10代之间的NHEK和NHDF细胞。让细胞以7.5和/或15x 104个细胞/孔(微量滴定板)接种，使其在培养箱(37℃，5％CO2)中过夜贴壁。与不同浓度的所选光敏
剂孵育不同时间后，让细胞在黑暗中孵育24小时。
剂孵育不同时间后，让细胞在黑暗中孵育24小时。
[0404] 由标准MTT-测定(Mossman等，1983 J.Immunological Methods 65：55-63)来测试毒性。MTT是代谢活性细胞的指示剂。取决于线粒体中的酶活性，显色反应可被可视化，这可由ELISA读数器(540nm)测量。将细胞生存力标准化为1，这意指将在缺乏测试化合物时孵育后的细胞OD值标准化为1。每一实验重复3次。
[0405] 结果
[0406] 在角质形成细胞和成纤维细胞中的毒性研究结果示于图2和3中。数据显示，化合物10在已知具有抗菌作用的剂量时对正常人表皮角质形成细胞或正常人真皮成纤维细
胞都不显示天生毒性。
胞都不显示天生毒性。
[0407] 实施例E：例示性化合物与细菌细胞的结合
[0408] 化合物8、10和12与大肠杆菌的结合
[0409] 让大肠杆菌细胞与化合物8、10或12在各种浓度(1-7.5μM)下孵育5分钟。在孵育期结束时，离心沉降细胞，以除去未结合的测试化合物部分，将细胞沉淀重悬于2ml 2％SDS中，获得细胞裂解液。与SDS过夜孵育后，通过荧光分光光度分析细胞裂解物来估测结合细胞的测试化合物的量。通过测量发射荧光光谱最大时的强度，并将数据内插入校准曲线上，来计算细胞裂解物中化合物的浓度。将结合细胞的测试化合物的量表示为纳摩尔化合物/mg细胞蛋白。由Lowry法(Lowry等，1951，J.Biol.Chem.193：265-275)测定蛋白浓度。
[0410] 所有实验都一式三份进行，结果代表带标准偏差的3次测定的平均值。
[0411] 从细胞中回收的卟啉量示于表4中。
[0412] 表4
[0413]
[0414]
[0415] 表3中所示结果显示，三种测试化合物以相似的效率结合大肠杆菌，用PBS洗涤3次除去约50％的在孵育期(5分钟)结束时与细胞缔合的化合物。
[0416] 实施例F：稳定性研究
[0417] 化学稳定性
[0418] 建立以下HPLC方法用于分析本发明例示性化合物。
[0419] 所述方法涉及在420nm波长处通过UV检测，这对这些化合物极具特异性。为了监测与卟啉结构无关(并因此在420nm处无吸收)的杂质，在某些实验中亦由DAD(二极管阵列检测器)记录200nm和700nm之间的整个色谱图的UV光谱。
[0420] 柱：Zorbax苯基，250x 4.6mm，5μm
[0421] 洗脱剂A：1000mL水中1.5g十二烷基硫酸钠+1mL蚁酸
[0422] 洗脱剂B：200mL水+800mL四氢呋喃中1.5g十二烷基硫酸钠+1mL蚁酸
[0423] 梯度：
[0424]
[0425] 流速：0.4mL/分钟
[0426] 检测：420nm
[0427] 柱温：25℃
[0428] 注入体积：10μl
[0429] 溶液：将卟啉衍生物溶解于洗脱剂A中，得到大约0.3mg/ml的终浓度。
[0430] 例示性化合物的典型保留时间为大约8分钟(18分钟运行时间)。
[0431] 对本发明例示性化合物进行了定性压力测试。由HPLC及LC-MS进行分析。化合物以固相形式、在水溶液和在磷酸缓冲盐水缓冲液中制备的溶液中进行压力测试。样品于
50℃初始孵育7天，取出样品用于测试。然后让该样品在70℃再孵育7天，同前取出样品，让样品在90℃再孵育7天。对新鲜制备的溶液进行HPLC分析，并与经历7、14和21天孵育
后的样品进行比较。然后进行色谱图的肉眼比较，测定作为面积百分比值的主产物和副产物的含量(参见图4)。
50℃初始孵育7天，取出样品用于测试。然后让该样品在70℃再孵育7天，同前取出样品，让样品在90℃再孵育7天。对新鲜制备的溶液进行HPLC分析，并与经历7、14和21天孵育
后的样品进行比较。然后进行色谱图的肉眼比较，测定作为面积百分比值的主产物和副产物的含量(参见图4)。
[0432] 色谱图的3D图显示，没有另外形成片段的迹象(在低波长时无信号)。
[0433] 图5中的图显示，PBS缓冲液中经历21天后的样品显示最大的降解作用。对加热到80℃数周的固体药物和溶液中的药物分析，结果显示最小的降解。
[0434] 结论
[0435] 发现化合物10和12二者都表现出良好的稳定性，甚至在测试方案的压力条件下也极为稳定。尽管化合物8不如化合物10和12稳定，但发现所显示的稳定性足以用于实
践应用。
践应用。
[0436] 例示性化合物在制剂中的稳定性
[0437] 如下评估三种例示性化合物(化合物8、10和12)和一种参比化合物(化合物1)的稳定性，它们以各种基于水性的制剂在聚乙烯小瓶中在黑暗和40℃下储存8周：
[0438] -十二烷基硫酸钠(SLES)+水
[0439] -9∶1水∶乙醇
[0440] -SLES+9∶1水∶乙醇
[0441] 在7周时间内记录在350-700nm范围内的UV光谱，在8周时进行样品的肉眼评估。
[0442] 结果表明，所有的测试化合物在8周时间内都表现出良好的稳定性(参见图6)。
[0443] 对于化合物8和10而言，稳定性研究延伸到17周(参见图7)。
[0444] 实施例G：化合物10的急性毒性测定
[0445] 在标准急性真皮毒性测定中以3.2mM检测局部制剂中的化合物10，以确定是否能检测到该化合物的任何临床或组织学毒性。
[0446] 急性毒性方案基于测试化学药品的OECD指南/第4部分-健康效果测定编号402：急性真皮毒性。
[0447] 结果和结论
[0448] 在临床、宏观和微观观察后，未观察到临床毒性。未观察到任何主要器官(包括皮肤)的组织学毒性。
[0449] 总之，化合物10并不导致任何急性毒性作用：事实上，未观察到与该物质或其溶媒应用有关的显著临床或病理学征象。
[0450] 实施例H：化合物10对金黄色葡萄球菌的生物膜和缓慢生长培养物的功效
[0452] 背景：生物膜形成的关键特征是细菌抵抗抗生素活性的能力。生物膜中细菌的较慢的生长速率可能是抗性提高的重要因素。我们研究了化合物10(为整个新型抗微生物剂的先导化合物)对金黄色葡萄球菌的生物膜和缓慢生长的培养物的活性。
[0453] 方法：按照英国抗菌化学治疗学会(BSAC)指南通过肉汤微稀释法测定浮游培养物的MIC。用卡尔加里生物膜装置测定生物膜MIC(bMIC)和最小生物膜根除浓度(MBEC)。
通过让金黄色葡萄球菌SH1000在37℃生长到早期指数生长期并将细胞重悬于预冷的培养
基中(在此处它们在存在及不存在化合物10和对照物质情况下维持)，测定化合物10对
冷培养物细胞的生存力的作用。亦通过让培养物生长到早期对数生长期并通过加入异亮氨酰-tRNA合成酶抑制剂莫匹罗星诱导严紧型反应，来测定化合物10对表现严紧型反应的缓慢生长细胞的作用。然后加入化合物10和对照物质，将样品回收用于细胞存活测定。
通过让金黄色葡萄球菌SH1000在37℃生长到早期指数生长期并将细胞重悬于预冷的培养
基中(在此处它们在存在及不存在化合物10和对照物质情况下维持)，测定化合物10对
冷培养物细胞的生存力的作用。亦通过让培养物生长到早期对数生长期并通过加入异亮氨酰-tRNA合成酶抑制剂莫匹罗星诱导严紧型反应，来测定化合物10对表现严紧型反应的缓慢生长细胞的作用。然后加入化合物10和对照物质，将样品回收用于细胞存活测定。
[0454] 结果：针对金黄色葡萄球菌SH1000，与环丙沙星、夫西地酸、四环素和利福平的bMIC分别为4、0.5、0.5和0.03μg/mL，以及MBEC分别为＞256、＞256、＞256和128μg/mL相比，化合物10具有有效的抗生物膜活性，bMIC为1μg/mL和MBEC为2μg/mL。冷培养和严紧型反应培养物对化合物10保持易感，且与磷霉素、万古霉素和达托霉素处理的培养物未损失生存力相比，其在1小时内观察到生存力下降5log。
[0455] 结论：化合物10对金黄色葡萄球菌生物膜和缓慢生长金黄色葡萄球菌培养物的有效活性证明，其抗菌活性不依赖于细菌的生长状态，提示化合物10在治疗生物膜相关的金黄色葡萄球菌感染中的应用。
[0456] 介绍
[0457] 越来越认识到生物膜的形成是广泛细菌感染的主要因素。异物相关的感染、囊性纤维化患者肺的慢性感染和牙科感染仅是生物膜介导的感染的几个实例。事实上，近来报1
道发达世界的80％的人感染是生物膜形成的直接结果 。
道发达世界的80％的人感染是生物膜形成的直接结果 。
[0458] 此外，生物膜培养物通常对用化疗根除高度抵抗，但没有发展出基因型耐药。因此，治疗选项数目有限，具抗生物膜活性的新型抗微生物剂的开发愈发重要。
[0459] 化合物10是抗微生物剂新类别的实例，代表抗菌疗法的新途径。化合物10杀菌(MBC50 1μg/mL)，先前业已显示对多种金黄色葡萄球菌菌株(包括甲氧西林敏感性金黄
色葡萄球菌(MSSA)、健康护理相关的甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌和群落相关的甲氧西
2
林耐药性金黄色葡萄球菌 )有活性(MIC50 1μg/mL)。
色葡萄球菌(MSSA)、健康护理相关的甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌和群落相关的甲氧西
2
林耐药性金黄色葡萄球菌 )有活性(MIC50 1μg/mL)。
[0460] 本研究目的是证明化合物10对生物膜和其它缓慢生长的细菌培养物的活性。
[0461] 方法
[0462] ●按照BSAC指南测定浮游MIC3
[0463] ●在卡里加里装置中按照标准方法测定bMIC和MBEC4
[0464] ●用标准时间-杀伤方案(但培养物要维持在4℃)测定化合物10对冷培养物中的金黄色葡萄球菌SH1000(MSSA)的杀伤动力学
[0465] ●按照Oliva等(2003)5的方法测定化合物10对莫匹罗星诱导的金黄色葡萄球菌SH1000的严紧型培养物的杀伤动力学
[0466] 结果
[0467] ●针对金黄色葡萄球菌SH1000，与环丙沙星、夫西地酸、四环素和利福平的bMIC分别为4、0.5、0.5和0.03μg/mL，以及MBEC分别为＞256、＞256、＞256和128μg/mL相比(表5)，化合物10具有抗生物膜活性，bMIC为1μg/mL和MBEC为2μg/mL。
[0468] ●冷培养和严紧型反应培养物保持对化合物10易感，且与用磷霉素处理的培养物的生存力未损失相比，观察到1小时内生存力下降5-log(图8及9)
[0469] 表5
[0470] 金黄色葡萄球菌SH1000生物膜对化合物10(XF-73)和对照物质的易感性
[0471]
[0472] 结论
[0473] ●与环丙沙星、夫西地酸、四环素和利福平相比，化合物10具有更高的抗-金黄色葡萄球菌生物膜活性
[0474] ●化合物10保持对冷培养和严紧型反应培养物的有效杀菌性，而其它抗菌剂的杀菌活性显著降低
[0475] ●这些数据显示，化合物10的杀菌活性不依赖于所处理的细菌的生长状态
[0476] ●将化合物10的有效抗金黄色葡萄球菌生物膜活性与其保持对缓慢生长的培养物的杀菌活性联合，使其成为用于防止和治疗这类感染的有用物质
[0477] 参考文献
[0478] 1.美国国立卫生研究院[互联网].[2008年9月17日引用]；可自http://grants.nih.gov/grants/guide/pa-files/PA-03-047.html获得
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[0483] 实施例I：化合物10和化合物12对金黄色葡萄球菌的生物膜和缓慢生长培养物的功效
[0484] 以下实施例涉及化合物10(XF-73)和化合物12(XF-70)对金黄色葡萄球菌的生物膜和缓慢生长培养物的功效，并提供这些化合物与各种对照物质的比较。
[0485] XF药物对无分裂的葡萄球菌的作用
[0486] 在感染期间，细菌很少遇到最佳生长条件，甚至长期受限或受阻生长是正常的，其中生物体进入休眠状态(Kolter等，1993)，这可造成产生细菌的持续感染(Nataro等，2000)。已知金黄色葡萄球菌调节基因表达以承受亚最佳生长条件(Somerville等，2002)，很可能在葡萄球菌心内膜炎和骨髓炎中存在不分裂的细菌(Mascio等，2007)。因此，在
生长阻抑条件下杀菌的抗微生物药物可相对于那些不显示所述活性的药物具有临床优势
(Mascio等，2007)。
生长阻抑条件下杀菌的抗微生物药物可相对于那些不显示所述活性的药物具有临床优势
(Mascio等，2007)。
[0487] 当营养物成为生长限制时，细菌将其代谢从支持生长调节到在缺乏营养时长期存活。在很多细菌中，这种称为严紧型反应的生理学转变的关键促进剂是鸟苷焦磷酸盐及五磷酸盐的聚积(Traxler等，2008)。抗生素莫匹罗星在金黄色葡萄球菌中是严紧型反应的强力诱导剂，其通过有效抑制异亮氨酰tRNA合成酶(IRS)有效引起带电荷的异亮氨酰tRNA饥饿(Oliva等，2003)。因此，检查了XF药物对通过加入莫匹罗星阻止生长的金黄色葡萄球菌SH1000(Oliva等，2003)的活性(图10)。作为阻抑生长的备选方法，将细菌悬浮于冷生长培养基中(Mascio等，2007)，亦在这些条件下测定XF药物的杀菌活性(图11)。
[0488] 先前的研究业已显示，严紧型反应完全废除了磷霉素、环丝氨酸、β-内酰胺和万古霉素对金黄色葡萄球菌8325-4的杀菌活性(Oliva等，2003)。磷霉素在本研究中作为菌株SH1000的对照(图10)，结果不出意外地显示，磷霉素的杀菌活性在严紧型条件下完全减弱，由此验证了莫匹罗星作为菌株SH1000的严紧型反应诱导剂的应用。XF-70和XF-73保留对通过诱导严紧型反应阻止生长的未处于生长期的SH1000培养物的有效杀菌活性(图
10)。乳链菌肽在严紧型条件下保留一些杀菌活性，但这不如XF-70和XF-73显示的那样占主导(图10)。
10)。乳链菌肽在严紧型条件下保留一些杀菌活性，但这不如XF-70和XF-73显示的那样占主导(图10)。
[0489] 如下测定XF药物对冷培养细胞生存力的作用：通过让金黄色葡萄球菌SH1000在37℃生长到早期指数生长期，通过离心(5,000xg，10分钟)收获细胞，然后将其重悬于预冷的培养基中，在此处其在存在及缺乏XF药物和对照物质下保持5小时。XF-70和XF-73保
留对通过将温度降到4℃来阻抑生长的金黄色葡萄球菌SH1000的有效杀菌活性(图11)。
在这些条件下，达托霉素和乳链菌肽二者都保留一些杀菌活性，但万古霉素杀伤生物体的能力被废除了(图11)。
留对通过将温度降到4℃来阻抑生长的金黄色葡萄球菌SH1000的有效杀菌活性(图11)。
在这些条件下，达托霉素和乳链菌肽二者都保留一些杀菌活性，但万古霉素杀伤生物体的能力被废除了(图11)。
[0490] XF药物对金黄色葡萄球菌SH1000生物膜的活性
[0491] 生物膜是微生物细胞群落，所述群落不可逆地与表面缔合，并包裹在由生物体分泌的多糖物质基质中(Costerton 2001；Donlan，2002；Hall-Stoodley等，2004)。在导管和其它留置医疗装置上由病原性革兰氏阳性菌形成的生物膜在医院环境中产生了大量问题(Costerton 2001；Donlan，2002；Hall-Stoodley等，2004；Toney 2007)。众所周知生物膜用抗生素治疗是难以治疗的，通常不被宿主免疫应答消除。显然需要鉴别具有防止细菌生物膜形成或一旦形成后也能根除它们的抗微生物剂(Toney 2007)。生物膜中细菌的较低的生长速率可能是提高对传统抗生素抗性的重要因素。鉴于XF-70和XF-73保留对不在生长
期的葡萄球菌的杀菌活性的能力(参见以上)，我们亦研究了这些药物对金黄色葡萄球菌
SH1000生物膜的活性。
期的葡萄球菌的杀菌活性的能力(参见以上)，我们亦研究了这些药物对金黄色葡萄球菌
SH1000生物膜的活性。
[0492] 在卡尔加里生物膜装置(Nunc Inc，Roskilde，丹麦)中如Miller等，2005所述测定生物膜MIC和最小生物膜根除浓度(MBEC)。这涉及以下步骤。将菌株SH1000的等分样(200μL)指数生长期培养物加入到96孔微量滴定盘的各孔中。然后将具有对应于各孔的
96个聚苯乙烯栓的盖组件重新盖上，让系统在摇床上于37℃孵育24小时。此后在每一个
7
栓上长成大约10cfu的生物膜。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤盖2次，以除去残留的浮
游生长，然后将含有测试抗生素的2倍稀释液的新鲜培养基加到微量滴定盘中。然后让系统在摇床上于37℃孵育24小时。将MIC定义为在该孵育后完全抑制可见生长的抗生素的
最低浓度。在记录MIC后，用PBS再洗涤盖组件2次，以除去浮游细胞和残留的抗生素，然后置于无药物的新鲜培养基中。让系统再孵育24小时，将MBEC定义为完全抑制浮游生长
重新建立的抗生素的最低浓度。
96个聚苯乙烯栓的盖组件重新盖上，让系统在摇床上于37℃孵育24小时。此后在每一个
7
栓上长成大约10cfu的生物膜。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤盖2次，以除去残留的浮
游生长，然后将含有测试抗生素的2倍稀释液的新鲜培养基加到微量滴定盘中。然后让系统在摇床上于37℃孵育24小时。将MIC定义为在该孵育后完全抑制可见生长的抗生素的
最低浓度。在记录MIC后，用PBS再洗涤盖组件2次，以除去浮游细胞和残留的抗生素，然后置于无药物的新鲜培养基中。让系统再孵育24小时，将MBEC定义为完全抑制浮游生长
重新建立的抗生素的最低浓度。
[0493] 与很多其它抗微生物剂相比，XF化合物显示对金黄色葡萄球菌SH1000生物膜具有极好的活性(表6)。这由低bMIC值来反映，并扩大到有效的生物膜根除活性(MBEC)，后者是用作对照的其它抗微生物剂未表现出的性质(表6)。
[0494] 表6.金黄色葡萄球菌SH1000生物膜对化合物12(XF-70)、化合物10(XF-73)和比较抗生素的易感性。bMIC＝生物膜MIC，MBEC＝最小生物膜根除浓度
[0495]
[0496] 参考文献
[0497] Costerton，J.W.(2001).Cystic fibrosis pathogenesis and the role ofbiofilms in persistent infection(囊性纤维化发病机理和生物膜在持续感染中的作
用).Trends in Microbiology 9：50-52.
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[0498] Donlan，R.M..(2002).Biofilms：microbial life on surfaces(生物膜：表面上的微生物生命).Emerging Infectious Diseases 8：881-890.
[0499] Hall-Stoodley，L.、Costerton，J.W. 和 Stoodley，P.(2004).Bacterialbiofilms：from the natural environment to infectious diseases(细菌生物膜：从自然环境到传染病).Nature Reviews Microbiology 2：95-108.
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[0501] Mascio，C.T.M.，Alder，J.D.和Silverman，J.A.(2007).Bactericidal action of daptomycin against stationary-phase and nondividing Staphylococcus aureus cells(达托霉素对稳定期和未分裂的金黄色葡萄球菌细胞的杀菌作用).AntimicrobialAgents and Chemotherapy 51：4255-4260.
[0502] Nataro，J.P.，Blaser，M.J. 和 Cunningham-Rundles，S.(2000).Persistent bacterial infections：commensalism gone awry or adaptive niche？(持续性细菌感染：共栖消失或适应性生态位？)载于：持续性细菌感染(J.P.Nataro，M.J.Blaser和
S.Cunningham-Rundles编辑)，American Society for Microbiology Press，Washington，D.C.
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[0503] Oliva，B.，Miller，K.，Caggiano，N.，O’Neill，A.J.，Cuny，G.D.，Hoemann，M.Z.，Hauske，J.R. 和 Chopra，I.(2003).Biological properties of novelantistaphylococcal quinoline-indole agents(新型抗葡萄球菌喹啉-吲哚物质的生物
学性质).Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47：458-466
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[0504] Somerville，G.A.，Chaussee，M.S.，Morgan，C.I.，Fitzgerald，J.R.，Dorward，D.W.，Reitzer，L.J. 和 Musser，J.M.(2002).Staphylococcus aureus aconitaseinactivation unexpectedly inhibits exponential-phase growth and enhances
stationary-phase survival(金黄色葡萄球菌顺乌头酸酶失活出人意料地抑制指数期生
长并提高稳定期存活).
stationary-phase survival(金黄色葡萄球菌顺乌头酸酶失活出人意料地抑制指数期生
长并提高稳定期存活).
[0505] Traxler，M.F.，Summers，S.M.，Nguyen，H-T.，Zacharia，V.M.，Hightower，G.A.，Smith，J.T.和Conway，T.(2008).The global，ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli(大肠杆菌中对氨基酸饥饿的ppGpp-介导的全面严紧型反应).Molecular Microbiology 68：1128-1148.
[0506] Toney，J.H.(2007).Biofilms-a neglected antibacterial target？(生 物膜-被忽略的抗菌靶标？)Current Opinion in Investigational Drugs 8：598-599.
[0507] 实施例J：化合物10和化合物12对金黄色葡萄球菌的缓慢生长培养物的功效
[0508] 方法
[0509] 用标准时间杀伤方法(Oliva等2003，Hobbs等2008)研究了化合物10、化合物12和多种比较物质对金黄色葡萄球菌的缓慢生长培养物的抗-葡萄球菌活性。让金黄色葡萄球菌SH1000培养物在与4XMIC的抗菌剂接触之前，在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中生长
到早期指数生长期(OD600nm为0.2)。未处理的培养物用作阴性对照。实验一式三份进行。
到早期指数生长期(OD600nm为0.2)。未处理的培养物用作阴性对照。实验一式三份进行。
[0510] 表现严紧型反应的培养物
[0511] 抗生素莫匹罗星是金黄色葡萄球菌的严紧型反应强力诱导剂，其通过有效抑制异亮氨酰tRNA合成酶(IRS)引起带电荷的异亮氨酰tRNA饥饿(Oliva等2003，Cassels等1995)。通过将莫匹罗星(4mg/L)加入到处于早期指数生长期(OD600nm为0.2)的细胞，在
SH1000培养物中诱导严紧性(Oliva等2003，Cassels等1995)。开始取样前让培养物与
莫匹罗星孵育30分钟。让培养物保持在37℃，在300分钟时间内以30分钟为间隔进行取
样，让样品在磷酸缓冲盐水(PBS)中系列稀释，将稀释的培养物涂布到Mueller-Hinton琼脂上，并在计数CFU之前让其于37℃孵育18-24小时。
SH1000培养物中诱导严紧性(Oliva等2003，Cassels等1995)。开始取样前让培养物与
莫匹罗星孵育30分钟。让培养物保持在37℃，在300分钟时间内以30分钟为间隔进行取
样，让样品在磷酸缓冲盐水(PBS)中系列稀释，将稀释的培养物涂布到Mueller-Hinton琼脂上，并在计数CFU之前让其于37℃孵育18-24小时。
[0512] 冷培养物
[0513] 通过让SH1000细胞在37℃生长到早期指数生长期(OD600nm为0.2)来制备冷培养物。然后让培养物离心，将细胞沉淀重悬于预冷到4℃的MHB中。如以上章节所述但让培养物在5小时取样期内保持在4℃，研究抗微生物剂的杀伤动力学。
[0514] 结果
[0515] 化合物10和化合物12对表现严紧型反应的金黄色葡萄球菌的作用
[0516] 检查了化合物10和化合物12对通过加入莫匹罗星阻止生长的金黄色葡萄球菌SH1000的活性。先前的研究业已证明，严紧型反应完全废除β-内酰胺抗生素和磷霉素对金黄色葡萄球菌的杀菌活性(Oliva等2003)。磷霉素在本研究中作为对照。在严紧型条件下完全减弱4X MIC的磷霉素活性(图12)。对于利福平观察到相似的作用(图12)。相比
之下，化合物10和化合物12保留对通过诱导严紧型反应而阻止生长的SH1000培养物的有
效杀菌活性(图12)。
之下，化合物10和化合物12保留对通过诱导严紧型反应而阻止生长的SH1000培养物的有
效杀菌活性(图12)。
[0517] 化合物10和化合物12对冷培养物的作用
[0518] 在5小时时间内测定化合物10和化合物12对冷培养细胞生存力的作用(图13)。低温对化合物10和化合物12的活性没有影响，其保留针对通过温度变化阻抑生长的金黄
色葡萄球菌SH1000的有效杀菌活性(图13)。在这些条件下，达托霉素和乳链菌肽二者都
保留有限杀菌活性，但其它物质杀伤生物体的能力被废除了(图13)。
色葡萄球菌SH1000的有效杀菌活性(图13)。在这些条件下，达托霉素和乳链菌肽二者都
保留有限杀菌活性，但其它物质杀伤生物体的能力被废除了(图13)。
[0519] 结论
[0520] 化合物10和化合物12对慢生长或无分裂的金黄色葡萄球菌的各种形式保持高度活性。
[0521] 参考文献
[0522] Cassels R，Oliva B，Knowles D.Occurrence of the regulatory nucleotides ppGpp and pppGpp following induction of the stringent response instaphylococci(在葡萄球菌中诱导严紧型反应后出现调节性核苷酸ppGpp和pppGpp).J
Bacteriol 1995；177：5161-65.
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[0523] Hobbs JK，Miller K，O’Neill AJ等Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus(达托霉素介导的金黄色葡萄球菌膜损伤的后果).J Antimicrob Chemother 2008；62：1003-8.
[0524] Oliva B，Miller K、Caggiano N， 等 Biological properties of novelantistaphylococcal quinoline-indole agents(新型抗葡萄球菌喹啉-吲哚物质的生物
学性质).Antimicrob Agents Chemother 200347：458-466.
学性质).Antimicrob Agents Chemother 200347：458-466.
[0525] 实施例K：化合物10和化合物12对金黄色葡萄球菌的稳定期培养物的功效
[0526] 方法
[0527] 用标准时间-杀伤方法(Oliva等2003，Hobbs等2008)研究了化合物10、化合物12和多种比较物质对金黄色葡萄球菌的稳定生长期培养物的抗-葡萄球菌活性。构建生长曲线以确定SH1000培养物进入及离开稳定期的时间。用500μL金黄色葡萄球菌SH1000
过夜培养物接种50mL Mueller-Hinton肉汤(MHB)，在37℃和搅拌下保持8天。用具有1cm
光程的Jenway 6300分光光度计(Jenway，Essex，UK)定期测量OD600nm处的培养物浊度。
过夜培养物接种50mL Mueller-Hinton肉汤(MHB)，在37℃和搅拌下保持8天。用具有1cm
光程的Jenway 6300分光光度计(Jenway，Essex，UK)定期测量OD600nm处的培养物浊度。
[0528] 让金黄色葡萄球菌SH1000培养物在37℃分别孵育24、48和72小时生长到早期、中期和晚期稳定期。将培养物离心，除去上清液，然后将细胞沉淀部分重悬于对应上清液
8
中，到OD600nm为0.2(10 个细菌/mL)。然后在这些稳定期悬浮液中进行时间-杀伤测定，以研究抗微生物剂对细菌细胞生存力的作用。未处理的培养物用作阴性对照。实验一式三份进行。
8
中，到OD600nm为0.2(10 个细菌/mL)。然后在这些稳定期悬浮液中进行时间-杀伤测定，以研究抗微生物剂对细菌细胞生存力的作用。未处理的培养物用作阴性对照。实验一式三份进行。
[0529] 结果
[0530] 化合物10和化合物12对金黄色葡萄球菌的稳定期培养物的作用
[0531] 通过检查生物体在延长时间内的生长曲线，来对在MHB中于37℃培养的金黄色葡萄球菌SH1000建立稳定期的开始和结束。将24小时生长后的细胞定为进入稳定期，96小时时出稳定期，在这之后培养物浊度下降，表明细菌裂解和死亡。因此，认为接种后24小时开始早期稳定期，48小时时为中期稳定期，72小时时为晚期稳定期。为了避免与在稳定期培养物中获得的高细胞密度有关的接种物对易感性测试的影响，在24小时、48小时和72小时时间点收获生物体，并将其在测定抑制剂的杀菌活性之前用来自这些培养物的已用过生
8
长培养基稀释到10 个细菌/mL。
8
长培养基稀释到10 个细菌/mL。
[0532] 化合物10和化合物12保留对从稳定期的所有时间点收获的细胞的有效杀菌活性(图14-16)。与化合物10和化合物12相反，比较物质对稳定期培养物的活性差(图
14-16)。
14-16)。
[0533] 结论
[0534] 化合物10和化合物12对稳定期的早期、中期和晚期阶段的金黄色葡萄球菌培养物保留高度活性。
[0535] 参考文献
[0536] Hobbs JK，Miller K，O’Neill AJ等Consequences of daptomycin mediated membrane damage in Staphylococcus aureus(达托霉素介导的金黄色葡萄球菌膜损伤的后果).J Antimicrob Chemother 2008；62：1003-8.
[0537] Oliva B，Miller K、Caggiano N， 等 Biological properties of novelantistaphylococcal quinoline-indole agents(新型抗葡萄球菌喹啉-吲哚物质的生物
学性质).Antimicrob Agents Chemother 2003 47：458-466.
学性质).Antimicrob Agents Chemother 2003 47：458-466.
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