对相关申请的交叉引用

本申请是提交于2003年5月20日，题为“Generation and Selection of Protein Library in Silico”的美国申请号10/443,134的部分继续申请，所述美 国申请号10/443,134是提交于2002年5月20日的，题为“Structure-Based Selection And Affinity Maturation of Antibody Library”美国申请号 10/153,159的部分继续申请，也是提交于2002年5月20日的题为 “Generation Affinity Maturation of Antibody Library in Silico”的申请号 10/153,176的部分继续申请，上述两者是在2002年4月17日提交的题为 “Structure-based construction of human antibody library”的美国专利申请系 列号10/125,687的部分继续申请，所述美国专利申请系列号10/125,687要 求在2001年4月17日提交的题为“Structure-based construction of human antibody library”的美国临时申请序列号60/284,407的利益。将这些申请并 入本文作为参考。

发明背景

本发明提供针对人抗原的抗体和产生针对这些靶点的高亲和力抗体 的方法。更具体地，本发明提供针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化或 人抗体和产生这样的抗-VEGF的抗体的方法。此外，本发明提供使用这些 抗体及其衍生物来体外抑制血管发生的组合物，试剂盒和方法，所述组合 物，试剂盒和方法用于诊断或治疗与异常血管发生相关的疾病诸如癌症、 类风湿性关节炎、与局部缺血-再灌注相关的脑水肿和损伤、皮质局部缺血、 卵巢增生和血管过多、子宫内膜异位、牛皮癣、糖尿病性视网膜病 (retinopaphy)，和其它的眼科血管源性疾病。

血管发生涉及许多生理和病理过程。血管发生由多个步骤组成，其最 终导致内皮细胞的增生和分化，并且形成管和腔(血管发生)。促进血管发 生的因子包括VEGF、aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、血 管生成素、IL-8等，而抑制血管发生的因子包括血小板反应蛋白(Good等. Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：6624-6628(1990))，促乳素的N末端片段 (Clapp等.Endocrinology，133：1292-1299(1993))，纤维蛋白溶酶原的三环 5结构域(Cao等.，J.Biol.Chem.，271：29461-29467(1996)，制管张素 (O′Reilly等.Cell，79：315-328(1994))和内皮抑制素(O′Reilly等.Cell，88： 277-285(1996))。

血管内皮细胞生长因子(VEGF)是与其在血管内皮细胞上的受体特异 性作用从而促进它们的血管发生的生长因子。已知血管发生在从在先存在 的血管和/或循环内皮干细胞中发展新的脉管系统中具有重要作用 (Asahara等.，Science，275(5302)：964-967，1997；Springer等.，Mol.Cell， 2(5)：549-558，1998；Folkman和Shing，J.Biol.Chem.，267：10931-10934， 1992)。血管发生还在许多生理过程中具有重要作用，所述生理过程诸如胚 胎发生、伤口愈合和月经。更重要的是，血管发生还涉及病理状态，所述 病理状态诸如肿瘤形成、转移、糖尿病性视网膜病等。已知实体肿瘤的生 长需要肿瘤血管形成从而供应氧和养分并且肿瘤细胞的转移通过来自肿 瘤血管化的血管而发生。认为VEGF是在肿瘤的这种血管化中的关键生血 管因子。因此，预期肿瘤的生长和转移可以通过某些物质中和VEGF的血 管化活性而得到抑制。最近的研究(Burrows和Thorpe，Pharmacol.Ther.， 64：155-174，1994；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8996-9000，1994)已经使用 了这样策略来靶向实体肿瘤的脉管系统。靶向肿瘤的血管，而不是肿瘤细 胞本身，具有一些优势，因为其不大可能导致抗性肿瘤细胞的发展，并且 被靶向的细胞易于到达。而且，血管的破坏导致抗肿瘤效果的扩大，因为 许多肿瘤细胞依赖于单一的血管来供应它们的氧和养分。

在几乎一半的糖尿病患者中，糖尿病性视网膜病的发生是由糖尿病的 其中一个并发症引起的。认为在糖尿病性视网膜病中的微细管的形成是由 氧缺乏促进的。这些微细管将迟早破裂出血从而形成瘢疤组织，导致视网 膜脱离。年龄相关的斑(macular)退化是另一种眼病，其已经被证实涉及视 网膜的病理性血管化。因此，预期血管化的抑制可以预防视网膜病的发展。 基于使用猴的实验，Miller等报道VEGF与增生性(vegetative)视网膜病的 发展紧密相关(Miller等.：Am.J.Pathol.145，574-584(1994))。为此，考虑将 中和VEGF的血管化活性的物质用于预防或治疗糖尿病性视网膜病和 AMD(Lopez等.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855-868(1996))。

VEGF作为病理状态中的血管发生的主要刺激物的认识已经导致阻断 VEGF活性的各种尝试。已经提议将抑制性抗-VEGF受体抗体，可溶性受 体构建体，反义策略，针对VEGF的RNA适体和低分子量的VEGF受体 酪氨酸激酶(RTK)抑制剂用在VEGF信号传导的干扰中(Siemeister等.， Cancer Metastasis Rev.，17(2)：241-248.，1998)。事实上，已经显示针对VEGF 的单克隆抗体在小鼠中抑制人肿瘤异种移植物生长和腹水形成(Kim等.， Growth Factors 7：53(1992)；Nature 362：841-844(1993)；Asano等.， Hybridoma，17：185-90，(1998)；Mesiano等.，Am.J.Pathol.，153(4)： 1249-1256，(1998)；Luo等.，Cancer Res.；58(12)：2594-2600，(1998)；Cancer Res.，58(12)：2652-2660，(1998)；Borgstrom等.Cancer Res.56：4032-4039 (1996)；Borgstrom等.，Prostate，35(1)：1-10，(1998))。而且，已经将使用抗 -生血管分子，抗-VEGF抗体和VEGF拮抗剂的相同策略用在AMD和糖 尿病性的视网膜病的实验性治疗中(Adamis等.Arch.Ophthalmol.114： 66-71(1996))。对于这些治疗性应用而言，如果它们起初来自小鼠，通常 通过人源化对抗体进行改造以减少它们在重复剂量中的毒性，并提高其它 的特性诸如通过亲和力成熟与靶分子的结合亲和力(Winter和Milstein， Nature，349：293-299，(1991)；Baca等，J.Biol.Chem.，272(16)：10678-84， (1997)；Presta，等.，Cancer Res.，57：4593-4599，(1997)；Chen等.(1999)J. Mol.Biol.293：865-881；和Ryan等.(1999)Toxicologic Pathology， 27(1)：78-86)。

尽管前述研究强调VEGF在实体肿瘤生长中的重要性和其作为肿瘤治 疗的靶标的潜能，鉴定抑制VEGF-诱导的血管发生的另外的试剂将有利于 扩展治疗选择的数量。特异性抑制VEGF与其受体的结合的治疗剂的发展 代表更有效靶向血管发生的重要备选，其具有潜在改善的治疗效果。

发明概述

本发明提供以需要的结构和功能来改造蛋白质，特别是以来自治疗前 景的理想特性改造抗体的革新方法，所述理想特性包括对靶抗原的高结合 亲和力，在体外和体内有效抑制异常细胞增殖的能力，和最低的毒性或副 作用。

在本发明的一个方面，提供用于在计算机上(in silico)和在体外设计和 选择具有高亲和力和特异性的针对人抗原的抗体的方法。在一些具体的实 施方案中，提供设计和选择具有高亲和力和特异性的针对血管内皮生长因 子(VEGF)的人源化抗体或完全的人抗体。

在本发明的另一个方面，提供针对VEGF的单克隆抗体。具体而言， 提供可以以高亲和力结合人VEGF的人源化或人抗-VEGF单克隆抗体。优 选地，这些抗体可以在体外抑制内皮细胞的VEGF-诱导的增殖，并在体内 抑制VEGF-诱导的血管发生。可以将这些抗体和它们的衍生物用在广泛应 用中诸如诊断、预防和治疗疾病诸如癌症、AMD、糖尿病性视网膜病、和 其它来自病理性血管发生的疾病。

在一个实施方案中，以scFv，Fab，或抗体的其它形式，并在约4℃， 25℃，37℃或42℃的温度下进行测量，提供与人VEGF特异性结合的单 克隆抗体，其解离常数Kd等于或低于0.2nM，任选地低于0.1nM，任选 地低于0.08nM，任选地低于0.05nM，任选地低于0.01nM，或任选地低 于0.005nM。

优选地，如果以scFv的形式存在，并且在35-37℃下测量，抗-VEGF 抗体的Kd低于1nM，任选地低于0.8nM，任选地低于0.5nM，任选地低 于0.2nM，任选地低于0.1nM，任选地低于0.08nM，任选地低于0.05nM， 任选地低于0.01nM，或任选地低于0.005nM。

也是优选地，如果以Fab的形式存在，并且在35-37℃的温度下进行 测量，抗-VEGF抗体的Kd低于0.5nM，任选地低于0.2nM，任选地低于 0.1nM，任选地低于0.08nM，任选地低于0.05nM，任选地低于0.01nM， 或任选地低于0.005nM。

在体外的内皮细胞的VEGF诱导的增殖的抑制中，当以scFv，Fab或 抗体的其它形式存在时，所述抗-VEGF抗体优选地具有这样的抑制50％ 细胞增殖的有效剂量ED50，所述有效剂量ED50等于或低于10nM，任选 地低于5nM，任选地低于1nM，任选地低于0.5nM，任选地低于0.1nM， 任选地低于0.05nM，或任选地低于0.01nM。

在优选的实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗体，并 且所述单克隆抗体具有包括下列氨基酸序列的VL：

X1X2X3X4TQX5PSX6X7SX8X9X10GX11X12X13X14IX15C X16 X17 SX18 X19 LX20 X21 X22 X23 X24WYQQX25PGX26APX27X28LX29Y X30 X31 X32 X33 LX34 X35GVX36X37RFSGX38X39S GTDFX40LTIX41X42LQX43X44DX45AX46YYC QQX47 X48 X49 X50 PX51 TFGX52GTKX53 X54IK，

其中将下划线区域分别称为VL/CDR1，VL/CDR2，和VL/CDR3，而将其余 区域称为构架，并且其中X1是D，E或A；X2是I，或T；X3是V， E，K，R，Q，或T；X4是M，或L；X5是S，或T，X6是S， 或T；X7是L，或V；X8是A，或V；X9是S，或T；X10是P， V，L，A，或I；X11是E，或D；X12是R，或T；X13是A，或V I；X14是T，或A；X15是T，S，或A；X16是S，R，N，K，H，或 Q；X17是A，或S；X18是Q，或R；X19是S，D，A，或P；X20 是S，G，R，T，或Y；X21是T，N，S，D，或K；X22是Y， 或D；X23是L，或I；X24是A，N，或T；X25是K，或I；X26是Q， K，T，或I；X27是R，K，Q，N，H，S，或E；X28是V，或L； X29是I，或V；X30是F，A，G，D，或S；X31是A，或T；X32是 S，或T；X33是N，S，R，或T；X34是A，H，或Q；X35是S， 或G；X36是P，T；X37是S，N，D，G，或Y；X38是S，或T； X39是G，或R；X40是T，或A；X41是S，或R；X42是S，或R； X43是P，或A；X44是E，或D；X45是F，V，或S；X46是V，T， I，A，或S；X47是Y，或S；X48是S，Y，或N；X49是S，或T； X50是T，V，A，P，K，G，S，或I；X51是W，或Y；X52是Q，或 G；X53是V，或L；和X54是E，D，或A。

这些优选的VL序列可以组合以优选的VH序列或其它抗体的VH，条 件是这样产生的抗体以期望的亲和力与人VEGF结合。

在另一个优选的实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗 体，所述单克隆抗体具有包括下列氨基酸序列的VL：

X1X2X3LTQPPSX4SX5TPGQX6VTISCS GX7 X8 SNX9 GX10 NX11 VX12WYQQX13PGX14 APKX15LX16Y X17 NX18 X19 RPSGVPX20RX21SGSX22SX23TSASLAISGLX24SEDE ADYYC X25 X26 WDDSLX27 GYVFGX28GTX29LTVL，

其中将下划线的区域分别称为VL/CDR1，VL/CDR2，和VL/CDR3，而将其 余的区域称为构架，并且其中X1是QL，或N；X2是PAF，或S；X3是 V，或M；X4是A，或T；X5是G，或A；X6是R，或S；X7是S， 或T；X8是S，TY，或N；X9是I，或V；X10是S，或R；X11是S， P，N，A，或T；X12是N，T，或Y；X13是L，或F；X14是T，或A； X15是V，L或F；X16是M，或I；X17是G，T或S；X18是N，或D；X19 是Q，或E；X20是D，或E；X21是F，或L；X22是K，或R；X23是G， 或A；X24是Q，L或R；X25是A，或G；X26是A，S或T；X27是N，S 或T；X28是T，或A；和X29是K，或Q。

这些优选的VL序列可以组合以优选的VH序列或其它抗体的VH，条 件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在另一个优选实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗 体，其具有包括下列的氨基酸序列的VL：

QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRSSNIGAGHDVHWYQQLPGTAPKLLIYAN DQRPSGVPDRFSDSKSGTSASLGISGLRSEDEADYFCATWDDSLHGYVFGTGT KVTVL(SEQ ID No：54) 。这些优选的VL序列可以组合以优选的VH序列 或其它抗体的VH，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结 合。

在另一个优选的实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗 体，其具有包括下列氨基酸序列的VH：

X1X2QLVX3SGGGX4VQPGGX5LRLX6CAX7S GX8 X9 X10 X11 X12 X13 GX14 NWX15RQ APGKGX16EWVG WX17 NTX18 X19 GX20 X21 TYX22 X23 X24 FX25 RRX26TX27SX28X29X30 SKX31X32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCA X35 YPX36 YYGX37 SHWYFDVWX38Q GTLVTVSS，

其中按照Kabat命名法，分别将下划线区域称为CDR1，CDR2和CDR3， 而将其余的区域称为构架，并且其中X1是E，或Q；X2是V，或G；X3 是Q，或E；X4是V，或L；X5是S，或T；X6是ST，或R；X7是A， 或V；X8是Y，或F；X9是T，D，N，S，或A；X10是F，或L；X11是T，D， Y，A，S，或N；X12是N，H，或S；X13是Y，或F；X14是M，L，I或V； X15是I，V，或L；X16是L，或P；X17是I，或V；X18是Y，或N；X19 是T，或N；X20是E，或A；X21是P，T，或S；X22是A，或V；X23是 A，H，Q，P，D，或E；X24是D，或E；X25是K，或T；X26是V，F，或L； X27是F，或I；X28是L，或R；X29是D，或N；X30是T，或N；X31是S， 或N；X32是T，Q，P，或K；X33是A，V，或P；X34是L，或M；X35是K， 或R；X36是H，或Y；X37是S，R，或T；和X38是G，或A。

这些优选的VH序列可以组合以优选的VL序列或其它抗体的VL，条 件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗体，并且 其具有这样的VL，所述VL包括选自由SEQ ID Nos：2-54组成的组的氨基 酸序列，更优选地包括选自由SEQ ID No：14、SEQ ID No：26、SEQ ID No： 28、SEQ ID No：36、SEQ ID No：37、SEQ ID No：44、SEQ ID No：47， 和SEQ ID No：54组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VL序列可以组合以优选的VH序列或其它抗体的VH，条 件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗体，其具 有这样的VH，所述VH包括选自由SEQ ID Nos：57-110和SEQ ID Nos：285-310组成的组的氨基酸序列，优选地包括选自由SEQ ID Nos：61-64，SEQ ID No：67，68，70，75，83，88，89，90，91，92，93， 94和96-110组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VH序列可以组合以优选的VL序列或其它抗体的VL，条 件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在还有的另一个实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗 体，其在VL区域中具有CDR1(VL/CDR1)，所述CDR1包括选自由SEQ ID Nos：164-194组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VL/CDR1可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻 链的其它区域，和优选的重链可变区序列，或组合以其它的重链可变区序 列，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在另一个实施方案中，提供与人VEGF特异性结合的单克隆抗体，其 在VL区域中具有CDR2(VL/CDR2)，所述CDR2包括选自由SEQ ID NOs： 195-209组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VL/CDR2可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻 链的其它区域，和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列， 条件是这样产生的抗体结合人VEGF。

在还有的另一个实施方案中，提供特异性结合人VEGF的单克隆抗 体，其在VL区域中具有CDR3(VL/CDR3)，所述CDR3包括选自由SEQ ID NOs：210-228组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VL/CDR3可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻 链的其它区域，和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列， 条件是这样产生的抗体以需要的亲和力结合人VEGF。

在另一个实施方案中，提供特异性结合人VEGF的单克隆抗体，其在 VL区域中具有构架区域(FR)CDR3(VL/FR)，所述构架区域(FR)CDR3包 括选自由SEQ ID NO：229-269组成的组的氨基酸序列，并且优选地包括 选自由SEQ ID NO：232，235，237，251，255，263，和265组成的组的氨基 酸序列。

这些优选的VL/FR可以组合以优选的轻链的CDR区域，或其它轻链 的CDR区域，和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列， 条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，提供特异性结合于人VEGF的单克隆抗体，其在 VH区域中具有CDR1(VH/CDR1)，所述CDR1包括GX1X2X3X4X5X6GX7N 的氨基酸序列，其中X1是Y，或F；X2是D，N，T，S，或A；X3是F，或 L；X4是T，D，S，Y，A，或N；X5是H，N，或S，X6是Y，或F；X7是M，L， I，或V。

此外，所述单克隆抗体的VH/CDR1优选地包括选自由SEQ ID NOs： 111-135组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VH/CDR1可以组合以优选的重链的其它区域或其它重链 的其它区域，和优选的轻链的可变区序列或组合以其它轻链可变区序列， 条件是这样产生的抗体结合人VEGF。

在一个实施方案中，提供特异性结合人VEGF的单克隆抗体，其在 VH区域中具有CDR2(VH/CDR2)，所述CDR2包括 WX1NTX2X3GEX4TYX5X6X7FX8R的氨基酸序列，其中X1是I，或V；X2 是Y，或N；X3是T，或N；X4是P，T，或S；X5是A，或V；X6是A， Q，PY，H，D，或E；X7是D，或E；和X8是K，或T

所述单克隆抗体的VH/CDR2优选地包括选自由SEQ ID NOs：136-156 组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VH/CDR2可以组合以优选的重链的其它区域或其它重链 的其它区域，和优选的轻链的可变区序列或组合以其它轻链可变区序列， 条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，提供特异性结合人VEGF的单克隆抗体，其在 VH区域中具有CDR3(VH/CDR3)，所述CDR3包括 KYPX1YYGX2SHWYFDV的氨基酸序列，其中X1是Y，或H，且X2是R。

优选地，所述抗-VEGF抗体VH/CDR3具有选自由SEQ ID NOs： 311-337组成的组的氨基酸序列。

这些优选的VH/CDR3可以组合以优选的重链的其它区域或其它重链 的其它区域，和优选的轻链的可变区序列或组合以其它轻链可变结构域序 列，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，提供特异性结合人VEGF的单克隆抗体，其在 VH区域中具有FR(VH/FR)，所述FR包括以下氨基酸序列：

X1VQLVX2SGGGX3VQPGGX4LRLX5CAX6S/CDR1/WX7RQAPGKGLEWVG/CD R2/RX8TX9SX10DX11SKX12X13X14YLQX15NSLRAEDTAVYYCA/CDR3/WX16QG TLVTVSS，

其中X1是E，或Q；X2是Q，或E；X3是V，或L；X4是S，或T； X5是S，T，或R；X6是A，或V；X7是I，或V；X8是F，或V； X9是F，或I；X10是L，或R是X11是T，或N；X12是S，或N； X13是T，Q，或K；X14是A，或V；X15是M，或L；且X16是G，

或A。

在一个实施方案中，提供特异性与人VEGF结合的单克隆抗体，其具 有这样的VL和VH对，所述VL和VH对选自由下列组成的组：SEQ ID NO： 1和70；SEQ ID NO：1和67；SEQ ID NO：1和75；SEQ ID NO：1和 83；SEQ ID NO：14和55；SEQ ID NO：1和101；SEQ ID NO：1和100； SEQ ID NO：14和102；SEQ ID NO：1和103；SEQ ID NO：1和：104； SEQ ID NO：1和105；SEQ ID NO：36和100；SEQ ID NO：26和100； SEQ ID NO：28和100；SEQ ID NO：37和100；SEQ ID NO：44和 100；SEQ ID NO：54和100；和SEQ ID NO：47和100，优选地选自由 下列组成的组：SEQ ID NO：28和61；SEQ ID NO：28和62；SEQ ID NO： 28和63；SEQ ID NO：28和64；SEQ ID NO：28和68；SEQ ID NO：28 和85；SEQ ID NO：28和86；SEQ ID NO：28和87；SEQ ID NO：28和 88；SEQ ID NO：28和89；SEQ ID NO：28和90；SEQ ID NO：28和 91；SEQ ID NO：28和92；SEQ ID NO：28和93；SEQ ID NO：28和 94；SEQ ID NO：28和95；SEQ ID NO：28和96；SEQ ID NO：28和 97；SEQ ID NO：28和98；SEQ ID NO：28和99；SEQ ID NO：28和 106；SEQ ID NO：28和107；SEQ ID NO：28和108；SEQ ID NO：28和 109；和SEQ ID NO：28和110。

以scFv，Fab或抗体的其它形式存在，并且在约4℃，25℃，37℃或42℃ 下测量时，由解离常数Kd所代表的上述抗体与人VEGF的结合亲和力， 是任选地低于100nM，任选地低于10nM，任选地低于8nM，任选地低 于5nM，任选地低于1nM，任选地低于0.8nM，任选地低于0.5nM， 任选地低于0.2nM，任选地低于0.1nM，任选地低于0.08nM，任选地 低于0.05nM，任选地低于0.01nM，或任选地低于0.005nM。

本发明公开的来自全长VH和VL，VH/CDR，VH/FR，VI/CDR，VL/FR 的组合(例如，在图1A和1B中提供的命中(hit)变体，和在图1C和1D中 显示的氨基酸序列)的抗体在本发明的范围内；并且这些组合不包括在美国 专利申请顺序号：09/056,160，公开号：2002/0032315中公开的抗-VEGF 抗体。

附图简述

图1A显示通过使用在计算机上的本发明方法来设计VL命中变体的 AA-PVP模式。

图1B显示通过使用在计算机上的本发明方法来设计VH命中变体的 AA-PVP模式。

图1C显示按照本发明的抗体的某些实施方案的全长VL，VL/CDR， 和VL/FR的氨基酸序列。

图1D显示按照本发明的抗体的某些实施方案的全长VH，VH/CDR， 和VH/FR的氨基酸序列。

图2A和2B显示在25℃下使用BioCore生物传感器进行的人源化抗 -VEGF抗体的一组变体的亲和力分析。将以单链形式存在的抗体片段如下 面所述进行表达并进行纯化。当纯化的抗体于25℃结合于固定在CM5生 物芯片上的其抗原(VEGF)时，通过测量SPR单位(y-轴)对时间(x-轴)的变 化来进行测量。通过Kon与Koff的比率来计算Kd值。还计算了对于每种变 体抗体，变体Kd与hAB 1的Kd的比率。将Kon定义为被表示为抗体片段 的浓度(以摩尔表示)和时间(以秒表示)的倍数(multiple)的倒数的缔合速率 常数；而将Koff定义为被表示为时间(以秒表示)的倒数的解离速率常数； 将Kd定义为解离常数，其是以摩尔浓度表示的Koff与Kon的比率。hAB1 包含SEQ1和SEQ55(如果以Fab形式存在，其将基本上是Fab-12，如在 Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293：865-881中所述)；hAB2包含SEQ1和 SEQ70；hAB3包含SEQ1和SEQ67；hAB4包含SEQ1和SEQ83；hAB5 SEQ1和SEQ75；hAB9包含SEQ14和SEQ102；hAB10包含SEQ1和 SEQ103；hAB11包含SEQ1和SEQ104；hAB12包含SEQ1和SEQ105， 分别作为VL和VH。

图2C显示在35℃下使用BioCore生物传感器进行的一组人源化抗 -VEGF抗体的变体进行的亲和力分析。将以单链形式存在的抗体片段如下 所述表达并进行纯化。当纯化的抗体于35℃结合于固定在CM5生物芯片 上的其抗原(VEGF)时，通过测量SPR单位(y-轴)对时间(x-轴)的变化来进 行测量。通过Kon与Koff的比率来计算Kd值。还计算了对于每种变体抗体， 变体Kd与hAB1的Kd的比率。hAB1包含SEQ1和SEQ55(如果以Fab 形式存在，其将基本上是Fab-12，如在Chen等.(1999)J.Mol.Biol. 293：865-881中所述)；hAB7包含SEQ1和SEQ101；hAB8包含SEQ1和 SEQ100；hAB13包含SEQ1和SEQ56(如果以Fab的形式存在，其将是 Y0317，如在Chen等.(1999)J.Mol.Biol.293：865-881中所述)；hAB14包 含SEQ36和SEQ100；hAB15包含SEQ26和SEQ100；hAB16包含SEQ28 和SEQ100；hAB35包含SEQ28和SEQ106；hAB36包含SEQ28和 SEQ107；hAB37包含SEQ28和SEQ108；hAB38包含SEQ28和SEQ109； hAB39包含SEQ28和SEQ110，分别作为VL和VH。

图3显示使用BIAcore生物传感器进行的6种人源化抗-VEGF抗体的 亲和力分析。在测定前，将所述抗体于4℃，37℃，或42℃在1xPBS缓冲 液中进行温育16小时。当纯化的抗体于25℃结合固定在CM5生物芯片上 的其抗原(VEGF)时，通过测量SPR单位(y-轴)对时间(x-轴)的变化来进 行测量。使用1∶1 Langmuir结合模型来测定结合速率和脱离速率二者的变 化，而通过Koff与Kon的比率来测定Kds。如下分别列出VL和VH的组成： hAB1包含SEQ1和SEQ55；hAB2包含SEQ1和SEQ70；hAB3包含 SEQ1和SEQ67；hAB7包含SEQ1和SEQ101；hAB8包含SEQ1和 SEQ100；hAB13包含SEQ1和SEQ56，分别作为VL和VH。

图4总结了在图3中显示的人源化抗-VEGF抗体的稳定性的数据。y- 轴显示在将纯化的抗体如图3所述在4℃，37℃和42℃温育16小时后， 在25℃使用BIAcore在结合固定的VEGF抗原方面保持活性的抗体的百分 比。将在不同条件下的每种抗体的最大结合表示为在4℃的结合的百分位 数。

图5显示使用如下所述的大肠杆菌(E.coli)表达系统的人源化的抗 -VEGF抗体的表达。通过应用相同体积的来自相同级分的纯化物质，如通 过SDS-PAGE/考马斯蓝染色来检测所显示，来评价每种抗体片段的表达水 平。如下分别列出VL和VH的组成：hAB1包含SEQ1和SEQ55；hAB35 包含SEQ28和SEQ106；hAB36包含SEQ28和SEQ107；hAB37包含 SEQ28和SEQ108；hAB38包含SEQ28和SEQ109；hAB39包含SEQ28 和SEQ110，分别作为VL和VH。

图6显示在如下所述的真核生物系统中的人源化抗-VEGF抗体的表 达。通过应用相同体积的来自相同级分的纯化物质，如通过SDS-PAGE/ 考马斯蓝染色检测所显示，来评价每种抗体片段的表达水平。如下分别列 出VL和VH的组成：hAB1包含SEQ1和SEQ55；hAB2包含SEQ1和 SEQ70；hAB3包含SEQ1和SEQ67；hAB5包含SEQ1和SEQ75； hAB7包含SEQ1和SEQ101；hAB8包含SEQ1和SEQ100；hAB13包 含SEQ1和SEQ56，分别作为VL和VH。

图7举例说明用于在大肠杆菌中表达可溶性抗体片段的载体的图谱。

发明详述

本发明提供以需要的结构和功能，来改造蛋白质，特别是抗体的革新 性方法。在一个方面，提供用于设计和选择具有高亲和力和特异性的针对 人抗原的抗体。在一些具体的实施方案中，提供用于设计和选择具有高亲 和力和特异性的针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化抗体或完全的人 抗体的方法。在另一个方面，提供使用这些抗体及其衍生物来在体外抑制 血管发生的组合物、试剂盒和方法，且所述组合物、试剂盒和方法用于诊 断或治疗与异常血管发生相关的疾病诸如癌症、类风湿性关节炎、与局部 缺血-再灌注相关的脑水肿和损伤、皮质局部缺血、卵巢增生和血管过多、 子宫内膜异位、牛皮癣、糖尿病性视网膜病(retinopaphy)、和其它的眼科 血管源性疾病。

1.VEGF和针对VEGF的抗体

VEGF是发育中的关键生血管因子，并且涉及通过刺激内皮细胞的实 体肿瘤的生长。发现鼠单克隆抗体阻止VEGF-依赖性的细胞增殖并减缓体 内的肿瘤生长(Kim KJ，Li B，Winer J，Armanini M，Gillett N，Phillips HS， Ferrara N(1993)Nature 362，841-844)。通过使用噬菌体展示和脱离速率选 择(Chen Y，Wiesmann C，Fuh G，Li B，Christinger HW，McKay P，de Vos AM(1999)J Mol Biol 293，865-881)来对这种鼠抗体进行人源化(Presta LG， Chen H，O′Connor SJ，Chisholm V，Meng YG，Krummen L，Winkler M， Ferrara N(1997)Cancer Res.57，4593-4599；Baca M，Presta LG，O′Connor SJ， Wells JA(1997)J Biol Chem 272，10678-10684)和亲和力成熟化。报道了在 VEGF和母体抗体之间形成的复合体的X-射线结构(Muller YA，Chen Y， Christinger HW，Li B，Cunningham，BC，Lowman HB，de Vos AM(1998) Structure 6，1153-1167。)，以及在VEGF和成熟的抗体之间形成的X-射 线结构(Chen Y，Wiesmann C，Fuh G，Li B，Christinger HW，McKay P，de Vos AM，Lowman HB(1999)J.Mol Biol 293，，865-881)。此外，美国专利 申请系列号：09/056,160，公开号2002/0032315公开了某些抗-VEGF抗体。 将这些关于VEGF和抗-VEGF抗体的出版物的全部内容并入本文作为参 考。

本发明提供以高亲和力和特异性结合人VEGF的新的抗-VEGF抗体。 对这些抗-VEGF抗体进行人源化，并且关于在结合亲和力、稳定性、表达 效率中的一些重要特性进行优化，所述重要特性对于研究、诊断和治疗应 用是理想的。

当以在约4℃、25℃、37℃或42℃测量的scFv，Fab，或抗体的其它形 式存在时，由解离常数Kd所代表的本发明的选定的抗-VEGF抗体对于人 VEGF的结合亲和力，是任选地低于100nM，任选地低于10nM，任选地 低于8nM，任选地低于8nM，任选地低于5nM，任选地低于1nM，任选 地低于0.8nM，任选地低于0.5nM，任选地低于0.2nM，任选地低于0.1 nM，任选地低于0.08nM，任选地低于0.05nM，任选地低于0.01nM，或 任选地低于0.005nM。

优选地，如果以scFv的形式存在，并且在35-37℃的温度测量，本发 明的选定抗-VEGF抗体的Kd低于1nM，任选地低于0.8nM，任选地低于 0.5nM，任选地低于0.2nM，任选地低于0.1nM，任选地低于0.08nM， 任选地低于0.05nM，任选地低于0.01nM，或任选地低于0.005nM。

也是优选地，如果以Fab的形式存在，并且在35-37℃的温度进行测 量，本发明的选定的抗-VEGF抗体的Kd低于0.5nM，任选地低于0.2nM， 任选地低于0.1nM，任选地低于0.08nM，任选地低于0.05nM，任选地 低于0.01nM，或任选地低于0.005nM。

在体外的内皮细胞的VEGF-诱导的增殖的抑制中，当以scFv、Fab或 抗体的其它形式存在时，本发明的选定的抗-VEGF抗体优选地具有这样的 ED50(抑制50％细胞增殖的有效剂量)，所述ED50等于或低于10nM，任选 地低于5nM，任选地低于1nM，任选地低于0.5nM，任选地低于0.1nM， 任选地低于0.05nM，或任选地低于0.01nM。

在优选的实施方案中，提供具有轻链可变区的抗-VEGF抗体，所述轻 链可变区包含下列氨基酸序列：

X1X2X3X4TQX5PSX6X7SX8X9X10GX11X12X13X14IX15C X16 X17 SX18 X19 IX20 X21 X22 X23 X24WYQQX25PGX26APX27X28LX29Y X30 X31 X32 X33 LX34 X35GVX36X37RFSGX38X39S GTDFX40LTIX41X42LQX43X44DX45AX46YYC QQX47 X48 X49 X50 PX51 TFGX52GTKX53 X54IK，

其中将下划线区域分别称为VL/CDR1，VL/CDR2，和VL/CDR3，而将其余 区域称为构架，并且其中指定为“X”的位置可以是下面列出的氨基酸：

X1：D，E或A

X2：I，或T

X3：V，E，K，R，Q，或T

X4：M，或L

X5：S，或T，

X6：S，或T

X7：L，或V

X8：A，或V

X9：S，或T

X10：P，V，L，A，或I

X11：E，或D

X12：R，或T

X13：A，或VI

X14：T，或A

X15：T，S，或A

X16：S，R，N，K，H，或Q

X17：A，或S

X18：Q，或R

X19：S，D，A，或P

X20：S，G，R，T，或Y

X21：T，N，S，D，或K

X22：Y，或D

X23：L，或I

X24：A，N，或T

X25：K，或I

X26：Q，K，T，或I

X27：R，K，Q，N，H，S，或E

X28：V，或L

X29：I，或V

X30：F，A，G，D，或S

X31：A，或T

X32：S，或T

X33：N，S，R，或T

X34：A，H，或Q

X35：S，或G

X36：P，T

X37：S，N，D，G，或Y

X38：S，或T

X39：G，或R

X40：T，或A

X41：S，或R

X42：S，或R

X43：P，或A

X44：E，或D

X45：F，V，或S

X46：V，T，I，A，或S

X47：Y，或S

X48：S，Y，或N

X49：S，或T

X50：T，V，A，P，K，G，S，或I

X51：W，或Y

X52：Q，或G

X53：V，或L

X54：E，D，或A。

这些优选的轻链可变结构域可以组合以优选的重链可变结构域序列， 或组合以其它的重链可变结构域序列，条件是这样产生的抗体以需要的亲 和力与人VEGF结合。

在另一个优选的实施方案中，提供具有轻链可变区的抗-VEGF抗体， 所述轻链可变区包括下列氨基酸序列：

X1X2X3LTQPPSX4SX5TPGQX6VTISCS GX7 X8 SNX9 XG10 NX11 VX12WYQQX13PGX14 APKX15LX16Y X17 NX18 X19 RPSGVPX20RX21SGSX22SX23TSASLAISGLX24SEDE ADYYC X25X26WDDSLX27 GYVFGX28GTX29LTVL，

其中将下划线的区域分别称为VL/CDR1，VL/CDR2，和VL/CDR3，而将其余 的区域称为构架，并且其中指定为“X”的位置可以是下面列出的氨基酸：

X1：QL，或N

X2：PAF，或S

X3：V，或M

X4：A，或T

X5：G，或A

X6：R，或S

X7：S，或T

X8：S，TY，或N

X9：I，或V

X10：S，或R

X11：S，P，N，A，或T

X12：N，T，或Y

X13：L，或F

X14：T，或A  

X15：V，L或F，

X16：M，或I

X17：G，T或S

X18：N，或D

X19：Q，或E

X20：D，或E

X21：F，或L

X22：K，或R

X23：G，或A

X24：Q，L或R

X25：A，或G

X26：A，S或T

X27：N，S或T

X28：T，或A

X29：K，或Q。

这些优选的轻链可变结构域序列可以组合以优选的重链可变结构域 序列，或组合以其它重链可变结构域序列，条件是这样产生的抗体以需要 的亲和力与人VEGF结合。

在另一个优选的实施方案中，提供具有轻链可变区的抗-VEGF抗体， 所述轻链可变区包括下列氨基酸序列：

QSALTQPPSVSGAPGQRVTISCTGRSSNIGAGHDVHWYQQLPGTAPKLLIYAN DQRPSGVPDRFSDSKSGTSASLGISGLRSEDEADYFCATWDDSLHGYVFGTGT KVTVL(SEQ ID NO：54)，

这些优选的轻链可变结构域序列可以组合以重链可变结构域序列，或组合 以其它重链可变结构域序列，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人 VEGF结合。

在另一个优选的实施方案中，提供具有重链可变区的抗-VEGF抗体， 所述重链可变区包括下列氨基酸序列：

X1X2QLVX3SGGGX4VQPGGX5LRLX6CAX7S GX8 X9 X10 X11 X12 X13 GX14 NWX15RQ APGKGX16EWVG WX17 NTX18 X19 GX20 X21 TYX22 X23 X24 FX25 RRX26TX27SX28X29X30 SKX31X32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCA X35 YPX36 YYGX37 SHWYFDVWX38Q GTLVTVSS，

其中按照Kabat命名法将下划线区域分别称为CDR1，CDR2，和CDR3， 而将其余的区域称为构架，其中被指定为“X”的位置可以是下面列出的氨 基酸：

X1：E，或Q

X2：V，或G

X3：Q，或E

X4：V，或L

X5：S，或T

X6：ST，或R

X7：A，或V

X8：Y，或F

X9：T，D，N，S，或A

X10：F，或L

X11：T，D，Y，A，S，或N

X12：N，H，或S

X13：Y，或F

X14：M，L，I或V

X15：I，V，或L

X16：L，或P

X17：I，或V

X18：Y，或N

X19：T，或N

X20：E，或A

X21：P，T，或S

X22：A，或V

X23：A，H，Q，P，D，或E

X24：D，或E

X25：K，或T

X26：V，F，或L

X27：F，或I

X28：L，或R

X29：D，或N

X30：T，或N

X31：S，或N

X32：T，Q，P，或K

X33：A，V，或P

X34：L，或M

X35：K，或R

X36：H，或Y

X37：S，R，或T

X38：G，或A。

在另一个优选的实施方案中，提供具有重链可变区的抗-VEGF抗体， 所述重链可变区包括下列氨基酸序列：

X1X2QLVX3SGGGX4VQPGGX5LRLX6CAX7S GX8 X9 X10 X11 X12 X13 GX14 NWX15RQ APGKGX16EWVG WX17 NTX18 X19 GX20 X21 TYX22 X23 X24 FX25 RRX26TX27SX28X29X30 SKX31X32X33YLQX34NSLRAEDTAVYYCA X35 X36 X37 X38 X39 X40 X41 X42 X43 X44 X45 YX46DX47WX48QGTLVTV，

其中按照Kabat命名法，分别将下划线区域称为CDR1，CDR2，和CDR3， 而将其余的区域称为构架，并且其中指定为“X”的位置可以是下面列出的 氨基酸：

X1：E，或Q

X2：V，或G

X3：Q，或E

X4：V，或L

X5：S，或T

X6：ST，或R

X7：A，或V

X8：Y，或F

X9：T，D，N，S，或A

X10：F，或L

X11：T，D，Y，A，S，或N

X12：N，H，或S

X13：Y，或F

X14：M，L，I或V

X15：I，V，或L

X16：L，或P

X17：I，或V

X18：Y，或N

X19：T，或N

X20：E，或A

X21：P，T，或S

X22：A，或V

X23：A，H，Q，P，D，或E

X24：D，或E

X25：K，或T

X26：V，F，或L

X27：F，或I

X28：L，或R

X29：D，或N

X30：T，或N

X31：S，或N

X32：T，Q，P，或K

X33：A，V，或P

X34：L，或M

X35：K，R或H

X36：YAD或S

X37：PRS或G

X38：YH，或D

X39：Y，或F

X40：YNS，或H

X41：G，或S

X42：S，T，R，G或A

X43：S，Y，C，或T

X44：H，P，C，N，Q或S

X45：W，Q，或C

X46：F，或L

X47：V，L或Y

X48：G或A。

这些优选的重链可变结构域序列可以组合以优选的轻链可变结构域 序列或组合以其它的轻链可变结构域序列，条件是这样产生的抗体以需要 的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域的抗 -VEGF抗体，所述轻链可变结构域包括下列其中之一的氨基酸序列：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11， SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21， SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32， SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO： 43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：49， SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，和SEQ ID NO：53， 另外优选地SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：54。这些优选的轻链可变结构域序列可以组合以优选的重链可变结构 域序列或组合以其它的重链可变结构域序列，条件是这样产生的抗体以需 要的亲和力与人VEGF结合。

在另一个实施方案中，本发明提供优选地包含重链可变结构域的抗 -VEGF抗体，所述重链可变结构域包括下列其中之一的氨基酸序列： SEQ ID NO：ID NO：57，SEQ ID NO：ID NO：58，SEQ IDNO：ID NO：59，SEQ ID NO：ID NO：60，SEQ ID NO：ID NO：65，SEQ ID NO：ID NO：66，SEQ ID NO：ID NO：69，SEQ ID NO：ID NO：71，SEQ ID NO：ID NO：72，SEQ ID NO：ID NO：73，SEQ ID NO：ID NO：74，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO： 81，SEQ ID NO：82，SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：86，SEQID NO：87，另外优选地SEQ ID NO：61，或SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO： 63，或SEQ ID NO：64，或SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：70，或SEQ ID NO：75，或SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：88，或SEQ ID NO：89，或SEQ ID NO：90，或SEQ ID NO：91，或SEQ ID NO：92，或 SEQ ID NO：93，或SEQ ID NO：94，或SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：96， SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：98，或SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：100， 或SEQ ID NO：101，或SEQ ID NO：102，或SEQ ID NO：103，或SEQ ID NO：104，或SEQ ID NO：105，或SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：107，或 SEQ ID NO：108，或SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：110；或SEQ ID NOs： 285-310之一。这些优选的重链可变区序列可以组合以优选的轻链可变区 序列或组合以其它的轻链可变区序列，条件是这样产生的抗体以需要的亲 和力与人VEGF结合。

在另一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域的 CDR1区域的抗-VEGF抗体，所述CDR1区域包括下列其中之一的氨基酸 序列：SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO： 167，SEQ ID NO：168，SEQ ID NO：169，SEQ D NO：170，SEQ ID NO：171， SEQ ID NO：172，SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：179，SEQ ID NO：180，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：191，SEQ ID NO：192，SEQ ID NO：193，和SEQ ID NO：194。这些优选的轻链可 变结构域的CDR1序列可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻链的 其它区域，和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列，条件 是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在另一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域的 CDR2区域的抗-VEGF抗体，所述CDR2区域包含下列其中之一的氨基酸 序列：SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO： 198，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：202， SEQ ID NO：203，SEQ ID NO：204，SEQ ID NO：205，SEQ ID NO：206，SEQ ID NO：207，SEQ ID NO：208，和SEQ ID NO：209。这些优选的轻链可变结 构域的序列可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻链的其它区域， 和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列，条件是这样产生 的抗体结合人VEGF。

在另一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域的 CDR3区域的抗-VEGF抗体，所述CDR3区域包括下列其中之一的氨基酸 序列：SEQ ID NO：210，SEQ ID NO：211，SEQ ID NO：212，SEQ ID NO：213，SEQ ID NO：214，SEQ ID NO：215，SEQ ID NO：216，SEQ ID NO： 217，SEQ ID NO：218，SEQ ID NO：219，SEQ ID NO：220，SEQ ID NO：221， SEQ ID NO：222，SEQ ID NO：223，SEQ ID NO：224，SEQ ID NO：225，SEQ ID NO：226，SEQ ID NO：227，和SEQ ID NO：228。这些优选的轻链可变结 构域的CDR3序列可以组合以优选的轻链的其它区域，或其它轻链的其它 区域，和优选的重链可变区序列或组合以其它重链可变区序列，条件是这 样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在另一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域的构架 区域的抗-VEGF抗体，所述构架区域包含下列其中之一的氨基酸序列： SEQ ID NO：229，SEQ ID NO：230，SEQ ID NO：231SEQ ID NO：233，SEQ ID NO：234，SEQ ID NO：236，SEQ ID NO：238，SEQ ID NO：239，SEQ ID NO：240，SEQ ID NO：241，SEQ ID NO：242，SEQ ID NO：243，SEQ ID NO：244，SEQ ID NO：245，SEQ ID NO：246，SEQ ID NO：247，SEQ ID NO：248，SEQ ID NO：249，SEQ ID NO：250，SEQ ID NO：252，SEQ ID NO：253，SEQ ID NO：254，SEQ ID NO：256，SEQ ID NO：257，SEQ ID NO：258，SEQ ID NO：259，SEQ ID NO：260，SEQ ID NO：261，SEQ ID NO：262，SEQ ID NO：264，SEQ ID NO：266，SEQ ID NO：267，SEQ ID NO：268，和SEQ ID NO：269；另外，优选地包含轻链可变结构域的构架区 域，所述构架区域包含下列其中之一的氨基酸序列：SEQ ID NO：232，SEQ ID NO：235，SEQ ID NO：237，SEQ ID NO：251，SEQ ID NO：255，SEQ ID NO：263，和SEQ ID NO：265。这些优选的轻链可变区的构架区域序列可以 组合以优选的轻链的CDR区域，或其它轻链的CDR区域，和优选的重链 可变区序列，或组合以其它重链可变区序列，条件是这样产生的抗体以需 要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，本发明提供优选地包含重链可变结构域的CDR1 区域的抗-VEGF抗体，所述CDR1区域包括下列其中之一的氨基酸序列： GX1X2X3X4X5X6GX7N，其中被指定为“X”的位置可以是下面列出的氨基 酸：

X1：Y，或F

X2：D，N，T，S，或A

X3：F，或L

X4：T，D，S，Y，A，或N

X5：H，N，或S

X6：Y，或F

X7：M，L，I，或V。

另外，优选地，重链可变结构域的CDR1区域包含下列其中之一的氨 基酸序列：SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：121，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：123，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：134，和SEQ ID NO：135。这些优选的重链可变结构域的CDR1序列可以组合以优选的重链 的其它区域或其它重链的其它区域，和优选的轻链可变区序列或组合以其 它轻链可变区序列，条件是这样产生的抗体结合人VEGF。

在一个实施方案中，本发明提供优选地包含重链可变结构域的CDR2 的抗-VEGF抗体，所述CDR2包括下列之一的氨基酸序列： WX1NTX2X3GEX4TYX5X6X7FX8R，其中被指定为“X”的位置可以是下面列 出的氨基酸：

X1：I，或V

X2：Y，或N

X3：T，或N

X4：P，T，或S

X5：A，或V

X6：A，Q，P，H，D，或E

X7：D，或E

X8：K，或T

另外，优选地，重链可变结构域的CDR2包括下列其中之一的氨基酸 序列：SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：139， SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：141，SEQ ID NO：142，SEQ ID N：143，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO： 152，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：155，和SEQ ID NO： 156。这些优选的重链可变结构域的CDR2序列可以组合以优选的重链或 其它重链的其它区域，和优选的轻链可变区序列或组合以其它轻链可变区 序列，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力结合于人VEGF。

在一个实施方案中，本发明提供包含重链可变结构域的CDR3的抗 -VEGF抗体，所述CDR3包含氨基酸序列：KYPX1YYGX2SHWYFDV， 其中被指定为″X″的位置可以是下面列出的氨基酸：X1：Y，或H，和X2：R。

优选地，所述抗-VEGF抗体具有重链可变结构域的CDR3，所述CDR3 具有SEQ ID NOs：311-337的氨基酸序列，和下列序列：

                    HSRHYYGSSPQYFDV

                    KYGYYYGSSHWYFDV

                    KYPHYYGASHWYFDV

                    KYPHYYGGCHWYFDV

                    KYPHYYGGSHWYFDV

                    KYPHYYGGYNQYFDV

                    KYPHYYGRSHWYFDV

                    KYPHYYGRSQWYLDV

                    KYPHYYSRTCQYFDV

                    KYPHYYSSSHWYFDV

                    KYPYFYGSSHWYFDV

                    KYPYYHGSSHWYFDV

                    KYPYYNGSSHWYFDV

                    KYPYYNSTSHWYFDV

                    KYPYYSGTSHWYFDV

                    KYPYYSGTSHWYFDY

                    KYPYYYGRSHWYFDV

                    KYPYYYGSSHWYFDV

                    KYPYYYGSSSWYFDV

                    KYPYYYSTSHWYFDV

                    KYRDFNGSSHWYFDV

                    KYSYYYGSSHWYFDV

                    RARHYYGSSHCYFDL

                    RDSHYYGSSHQYFDL

                    KYPHYYGTSHWYFDV

                    KYPHYYGS SHWYFDV

                    KYPYYYGTSHWYFDV.

这些优选的重链可变结构域的CDR3序列可以组合以优选的重链或其 它重链的其它区域，和优选的轻链可变区序列或组合以其它轻链可变结构 域序列，条件是这样产生的抗体以需要的亲和力与人VEGF结合。

在一个实施方案中，本发明提供优选地包含重链可变结构域的构架区 域的抗-VEGF抗体，所述构架区域包括下列其中之一的氨基酸序列：

X1VQLVX2SGGGX3VQPGGX4LRLX5CAX6S/CDR1/WX7RQAPGKGLEWVG/CD R2/RX8TX9SX10DX11SKX12X13X14YLQX15NSLRAEDTAVYYCA/CDR3/WX16QG TLVTVSS，

其中被指定为“X”的位置可以是下面列出的氨基酸：

X1：E，或Q

X2：Q，或E

X3：V，或L

X4：S，或T

X5：S，T，或R

X6：A，或V

X7：I，或V

X8：F，或V

X9：F，或I

X10：L，或R

X11：T，或N

X12：S，或N

X13：T，Q，或K

X14：A，或V

X15：M，或L

X16：G，或A。

在一个实施方案中，本发明提供优选地包含轻链可变结构域和重链可 变结构域的抗-VEGF抗体，其包括下列VL和VH对其中之一的氨基酸序 列：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：70；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：67； SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：75；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：83；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：55；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：101；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：102；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：103；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：104；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：105；SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：100；SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：100；和SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：100，另外 优选地：SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：62；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：64；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：85；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：86；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：87；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：88；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：89；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：90；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：91；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：92；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：93；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：94；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：95；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：96；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：97；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：98；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：99；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：106；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：107；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：109；和SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：110。

本发明公开的来自全长VH和VL，VH/CDR，VH/FR，VL/CDR，VL/FR 的组合(例如，在图1A和1B中提供的命中(hit)变体，和在图1C和1D中 显示的氨基酸序列)的抗体在本发明的范围内；并且这些组合不包括在美国 专利申请顺序号：09/056,160，公开号：2002/0032315中公开的抗-VEGF 抗体。

2.设计和构建人源化或完全的人抗-VEGF抗体的方法

使用革新方法来设计本发明的抗体，所述方法包括在计算机上和在体 外构建和选择蛋白质文库。下面描述所述方法的一些方面。更详细的方法 的描述出现在美国专利申请号：10/443,134，10/153,159，10/153,176， 10/125,687，和60/284,407中，将它们全部内容并入本文作为参考。

按照本发明，提供有效产生和筛选蛋白质文库得到具有理想生物学功 能的优化的蛋白质的革新方法，所述生物学功能诸如针对生物学和治疗上 重要的靶分子的结合亲和力。将所述方法用于通过产生具有提高的特性的 蛋白质的新变体来优化蛋白质。具体而言，将该方法用于设计文库用于非 人抗体的人源化，和优化抗体的亲和力和其它特性。以人或类人序列来产 生抗体的氨基酸和核酸的新变体，同时它们的结合亲和力、稳定性和表达 效率得到显著提高。

通过开采所有的生物，尤其是人的蛋白质序列的不断扩充的数据库， 并通过使它们的特异性序列或它们的变体与功能提高诸如通过实验检验 的结合亲和力和稳定性相关联而以高通量方式在计算机上实施本发明的 方法。通过使用本发明的方法，可以基于极端多样化的蛋白质序列的计算 机评价和在计算机上的功能上相关的结构来构建扩充的和功能上有偏向 (biased)的蛋白质诸如抗体的文库，并将其随后通过实验筛选和体外或体内 选择来进行检验。

在本发明的一个方面，提供用于设计和选择具有理想的功能的蛋白质 的方法。所述方法基于在下文被称为“前导序列”的前导蛋白质的靶结构/ 功能性基序或结构域的氨基酸序列，通过在计算机上(in silico)的蛋白质序 列的选择，优选地，在计算机上来进行。将所述前导序列用于搜索蛋白质 序列的数据库。数据库的选择取决于设计的基序的具体功能要求。例如， 如果前导蛋白质是酶并且靶基序包括酶的活性位点，使用各种搜索标准来 产生命中的序列列表可以查询特定起源、生物、物种或其组合的蛋白质/ 肽的数据库，所述命中的序列列表中的每个都可以取代前导蛋白质中的靶 基序。可以将类似的方法用于设计前导蛋白质的其它基序或结构域。可以 将每个个体基序/结构域的设计的序列进行组合以产生设计的蛋白质的文 库。此外，为了减少用于人应用，诸如治疗或诊断的设计的蛋白质的免疫 原性，优选地搜索人起源的蛋白质或人源化蛋白质的数据库来产生命中的 序列列表，所述命中的序列列表尤其是针对来自前导蛋白质的位点的基 序，所述基序充当前导蛋白质的支架诸如抗体的构架。可以对被设计的蛋 白质的文库通过实验进行检验从而产生具有超过所述前导蛋白质的提高 的生物学功能的蛋白质。

在本发明的特定方面，所述本发明的方法在设计抗体中来进行，所述 设计的抗体在序列上多样然而在功能上彼此相关。基于被设计的抗体序 列，可以构建抗体的文库从而以高通量方式，包括在非人抗体的互补决定 区域(CDRs)和/或人源化构架(FRs)中的多样序列。可以针对广泛多样的靶 分子来筛选这种抗体文库的新的或提高的功能。

在本发明的另一个方面中，提供基于前导抗体中的区域的氨基酸序 列，在计算机上选择抗体序列的方法，所述氨基酸序列在下文被称为“前 导序列”。将所述前导序列用于搜索蛋白质序列的数据库。数据库的选择 取决于被设计的基序的具体功能要求。例如：为了设计用于治疗性应用的 可变链的构架区域，除了几个结构上关键的位点，应该使用蛋白质序列的 集合，所述蛋白质序列在进化上相关，诸如完全人的免疫球蛋白序列和人 种系免疫球蛋白序列。这将通过在这高度保守的区域(对于构架区域)中尽 可能少的引入外源突变体，通过保存序列的起源而减少免疫原性应答。在 另一方面，可以将多样化的序列数据库诸如genbank中的各种物种的免疫 球蛋白序列或甚至不相关序列用于设计CDRs从而提高在这种高度可变区 中与抗原的结合亲和力。通过使用所述方法，可以构建多样的抗体序列的 文库，并且通过实验在体外或在体内来筛选具有改善或需要的功能的抗体 的突变体。

在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：提供前导抗体的重链(VH) 或轻链(VL)的可变区的氨基酸序列；鉴定在前导抗体的CDRs中的氨基酸 序列；选择在前导抗体的VH或VL区域中的CDRs其中之一；提供在选定 的CDR中包括至少3个连续氨基酸残基的氨基酸序列，所述选定的氨基 酸序列是前导序列；将前导序列与多种测试蛋白质序列进行比较；和从多 种测试蛋白质序列中选择至少两种肽片段，所述肽片段与前导序列具有至 少15％的序列同一性，所述选定的肽片段形成命中文库。

所述方法还包括下列步骤：构建包括编码所述命中文库的氨基酸序列 的DNA片段的核酸文库。

任选地，所述方法还可以包括下列步骤：构建命中文库的氨基酸位置 (positional)变体图谱；通过将氨基酸位置变体反向翻译(back-translating)成 它们相应的遗传密码子而将命中文库的氨基酸位置变体图谱转化成核酸 位置变体图谱；和通过以组合方式将核酸位置变体组合在一起而构建DNA 片段的简并核酸文库。

任选地，所述遗传密码子可以是这样的密码子，其优选用于在细菌中 的表达。任选地，遗传密码子可以是这样的密码子，其可以减少选择的大 小从而使DNA片段的简并核酸文库的多样性在实验上可覆盖的多样性范 围内，而无需过度的实验尝试，例如，低于1×107，并且优选地低于1×106。

在另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：提供前导抗体的重链 (VH)或轻链(VL)的可变区的氨基酸序列；鉴定在前导抗体的CDRs和FRs 中的氨基酸序列；选择在前导抗体的VH或VL区域的CDRs其中之一；提 供包括至少3个在选定的CDR中的连续的氨基酸残基的第一氨基酸序列， 所述选定的氨基酸序列是CDR前导序列；将CDR前导序列与多种CDR 测试(tester)蛋白质序列进行比较；从多种CDR测试蛋白质序列中选择至 少两种肽片段，所述肽片段与CDR前导序列具有至少15％的序列同一性， 所述选定的肽片段形成CDR命中文库；选择在前导抗体的VH或VL区域 中的FRs的其中之一；提供在选定的FR中包括至少3个连续的氨基酸残 基的第二氨基酸序列，所述选定的氨基酸序列是FR前导序列；将所述FR 前导序列与多种FR测试蛋白质序列进行比较；并且从多种FR测试蛋白 质序列中选择至少两种肽片段，所述肽片段与所述FR前导序列具有至少 15％的序列同一性，所述选定的肽片段形成FR命中文库；并且将CDR命 中文库和FR命中文库进行组合以形成命中文库。

按照所述方法，多种CDR测试蛋白质序列可以包括人或非人抗体的 氨基酸序列。

此外，按照所述方法，多种FR测试蛋白质序列可以包括人起源，优 选地人或人源化抗体(例如，在VH或VL中具有至少50％人序列，优选地 具有至少70％人序列，更优选地具有至少90％人序列，并且最优选地具有 至少95％人序列的抗体)，更优选地，完全的人抗体，并且最优选地人种 系抗体的氨基酸序列。

此外，按照所述方法，将多种CDR测试蛋白质序列中的至少一种与 多种FR测试蛋白质序列中区分开。

此外，按照所述方法，多种CDR测试蛋白质序列是人或非人抗体序 列并且多种FR测试蛋白质序列是人抗体序列，优选地人种系抗体序列。

所述方法还包括下列步骤：构建包括编码所述命中文库的氨基酸序列 的DNA片段的核酸文库。

任选地，所述方法还可以包括下列步骤：构建所述CDR命中文库的 氨基酸位置变体图谱；通过将氨基酸位置变体反向翻译(back-translating) 成它们相应的遗传密码子而将CDR命中文库的氨基酸位置变体图谱转化 成第一核酸位置变体图谱；和通过以组合方式将核酸位置变体组合在一起 而构建DNA片段的简并CDR核酸文库。

任选地，所述遗传密码子可以是这样的密码子，其优选用于在细菌中 的表达。任选地，遗传密码子可以是这样的密码子，其可以减少选择的大 小从而使DNA片段的简并核酸文库的多样性在实验上可覆盖的多样性范 围内，而无需过度的实验尝试，例如，多样性低于1×107，优选地低于1× 106。

在另一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：提供前导抗体的重链 (VH)或轻链(VL)的可变区的氨基酸序列；鉴定前导抗体的FRs的氨基酸序 列；选择前导抗体的VH或VL区域中的FRs的其中之一；提供包括在选定 的FR中至少3个连续的氨基酸残基的第一氨基酸序列，所述选定的氨基 酸序列是第一FR前导序列；将第一前导FR序列与多种FR测试蛋白质序 列进行比较；和从多种FR测试蛋白质序列中选择至少两种肽片段，所述 至少两种肽片段与第一FR前导序列具有至少15％的序列同一性，所述选 定的肽片段形成第一FR命中文库。

所述方法还可以包括下列步骤：提供在不同于选定的FR的包括FR 中至少3个连续的氨基酸残基的第二氨基酸序列，所述选定的氨基酸序列 是第二FR前导序列；将第二FR前导序列与多种FR测试蛋白质序列进行 比较；和从多种FR测试蛋白质序列中选择至少两种肽片段，所述肽片段 与所述第二FR序列具有至少15％的序列同一性，所述选定的肽片段形成 第二FR命中文库；并且将第一FR命中文库和第二FR命中文库进行组合 从而形成命中文库。

按照所述方法，前导CDR序列可以包括选定的CDR中至少5个连续 的氨基酸残基。所述选定的CDR可以选自由所述前导抗体的VHCDR1， VHCDR2，VHCDR3，VLCDR1，VLCDR2，和VLCDR3组成的组。

此外，按照所述方法，所述前导FR序列可以包括选定的FR中至少5 个连续的氨基酸残基。所述选定的FR可以选自由所述前导抗体的VHFR1， VHFR2，VHFR3，VHFR4，VLFR1，VLFR2，VLFR3和VLFR4组成的组。

所述方法还可以包括下列步骤：构建包括编码命中文库的氨基酸序列 的DNA片段的核酸或简并核酸文库。

在本发明的另一个方面，提供基于在前导抗体中的区域的氨基酸序 列，即，“前导序列”及其3D结构，在计算机上选择抗体序列的方法。将 前导序列的结构用于关于具有类似的3D结构的片段对蛋白质结构的数据 库进行搜索。将这些片段进行比对从而产生序列图谱，在下文将其称为“前 导序列图谱”。将所述前导序列图谱用于关于具有低序列同一性然而在结 构上类似的前导序列的远距离的同源物，对蛋白质序列进行数据库的搜 索。通过使用所述方法，可以构建多样的抗体序列的文库并且将其通过实 验方法在体外或在体内筛选具有提高的或需要的功能的抗体的突变体。

在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：提供前导抗体的重链(VH) 或轻链(VL)的可变区的氨基酸序列；鉴定前导抗体的CDRs中的氨基酸序 列；选择在前导抗体的VH或VL区域中的CDRs其中之一；提供包括选定 的CDR中至少3个连续的氨基酸残基的氨基酸序列，所述选定的氨基酸 序列是前导序列；提供所述前导序列的三维结构；基于所述前导序列的结 构，构建前导序列图谱；将所述前导序列图谱与多种测试蛋白质序列进行 比较；和从多种测试蛋白质序列中选择至少两种肽片段，所述肽片段与前 导序列具有至少10％的序列同一性，所述选定的肽片段形成命中文库。

按照所述方法，前导序列的三维结构可以是衍生自X-晶体学、核磁共 振(NMR)光谱学或理论结构建模的结构。

按照所述方法，构建前导序列图谱的步骤可以包括：将所述前导序列 的结构与多种测试蛋白质片段的结构进行比较；确定前导序列和测试蛋白 质片段的主链构象的均方根差；选择主链构象的均方根差小于5_，优选 地小于4_，更优选地小于3_，和最优选地小于2_的测试蛋白质片段； 并且将选定的测试蛋白质片段与所述前导序列的氨基酸序列进行对比以 构建前导序列图谱。

任选地，多种测试蛋白质片段的结构从蛋白质数据库进行检索。

任选地，构建前导序列图谱的步骤可以包括：将前导序列的结构与多 种测试蛋白质片段的结构进行比较；确定前导序列和测试蛋白质片段的主 链构象的Z-得分(score)；选择具有高于2，优选地高于3，更优选地高于4 并且最优选地高于5的Z-得分的测试蛋白质片段的片段；并且对选定的测 试蛋白质片段与前导序列的氨基酸序列进行对比以构建前导序列图谱。

任选地，构建前导序列图谱的步骤可以通过选自由CE，MAPS，Monte Carlo和3D聚簇算法组成的组的算法来进行。

所述方法还可以包括下列步骤：构建包括编码命中文库的氨基酸序列 的DNA片段的核酸文库。

任选地，所述方法还可以包括下列步骤：构建所述命中文库的氨基酸 位置变体图谱；通过将氨基酸位置变体反向翻译为它们相应的三核苷酸密 码子来将命中文库的氨基酸位置变体图谱转变为核酸位置变体图谱；和通 过将核酸位置变体以组合方式组合在一起来构建DNA片段的简并核酸文 库。

在本发明的另一个方面，提供基于前导抗体的3D结构来在计算机上 选择抗体序列的方法。将来自前导抗体的特定区域的前导序列或序列图谱 用于关于前导序列的远同源物进行对蛋白质序列数据库的搜索，所述前导 序列的远同源物具有低序列同一性然而在结构上类似。这些远同源物形成 命中文库。对命中文库中的序列进行关于它们与前导抗体的3D结构的结 构相容性的评估，将所述3D结构在下文称为“前导结构模板”。选择在结 构上与前导结构模板在结构上相容的命中文库中的序列，并将其在体外或 在体内，以实验方法进行关于具有提高的或需要的功能的抗体突变体的筛 选。

在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤：提供前导抗体的重链(VH) 或轻链(VL)的可变区的氨基酸序列，所述前导抗体具有已知的被定义为前 导结构模板的三维结构；鉴定在前导抗体的CDRs中的氨基酸序列；选择 前导抗体的VH或VL区域的CDRs其中之一；提供包括选定的CDR中至 少3个连续的氨基酸残基的氨基酸序列，所述选定的氨基酸序列是前导序 列；将所述前导序列图谱与多种测试蛋白质序列进行比较；从多种测试蛋 白质序列中选择至少两种肽片段，所述至少两种肽片段与前导序列具有至 少10％的序列同一性，所述选定的肽片段形成命中文库；使用得分函数来 确定命中文库的成员在结构上与前导结构模板是否相容；和选择命中文库 的成员，所述成员的评分等于或好于或等于前导序列。

按照所述方法，得分函数是选自由静电相互作用、范德华相互作用、 静电溶剂化能、溶剂可及的表面溶剂化能，和构象熵组成的组的能量得分 函数。

任选地，所述得分函数是结合力场(forcefield)的函数，所述力场选自 由Amber力场，Charmm力场，Discover cvff力场，ECEPP力场， GROMOS力场，OPLS力场，MMFF94力场，Tripos力场，MM3力 场，Dreiding力场，UNRES力场和其它的基于常识的统计学力场(均场) 和基于结构的热力势函数组成的组。

此外按照所述方法，选择命中文库的成员的步骤包括选择这样的命中 文库的成员，基于式ΔE总＝Evdw+E键+E角+E静电+E溶剂化计算，其与前 导序列的总能量相比，具有更低或相同的总能量。

此外，按照所述方法，选择命中文库的成员的步骤包括选择这样的命 中文库的成员，所述命中文库的成员与前导序列的结合自由能相比，具有 更低的结合自由能，所述结合自由能使用改进的得分函数被计算为在结合 的和未结合的状态之间的差异：

ΔGb＝ΔGMM+ΔGsol-TΔSss

其中

ΔGMM＝ΔGele+ΔGvdw(1)

ΔGsol＝ΔGele-sol+ΔGASA(2)

所述方法还可以包括下列步骤：构建包括DNA片段的核酸文库，所 述DNA片段编码所述命中文库的氨基酸序列。

任选地，所述方法还可以包括下列步骤：构建所述命中文库的氨基酸 位置变体图谱；通过将氨基酸位置变体反向翻译成它们相应的三核苷酸密 码子来将命中文库的氨基酸位置变体图谱转变为核酸位置变体图谱；和通 过将核酸位置变体以组合方式组合在一起来构建DNA片段的简并核酸文 库。

在本发明的另一个方面，提供基于以下总称为前导结构模板的前导抗 体的3D结构或结构集合(ensemble)或多个抗体的结构集合，在计算机 上选择抗体序列的方法。前导抗体特定区域的前导序列或序列图谱被用于 搜索蛋白质序列数据库中前导序列的远(remote)同源物，其具有低序列同 一性然而结构类似。这些远同源物形成命中文库。基于在前导序列每个位 置上出现的氨基酸变体频率，构建命中文库的氨基酸位置变体图谱 (AA-PVP)。基于AA-PVP，通过以组合的方式组合前导序列每个位置的氨 基酸变体并且截止(cutoff)或不截止低频率变体来构建命中变体文库。将命 中变体文库的序列进行它们与前导结构模板的结构相容性的评估。选择命 中文库中与前导结构模板结构相容的序列并用体内或体外实验筛选具有 改善或所需功能的抗体变体。

在一个实施方案中，该方法包含以下步骤：提供前导抗体的重链(VH) 或轻链(VL)可变区的氨基酸序列，所述前导抗体具有被定义为前导结构 模板的已知的三维结构；鉴定前导抗体的CDRs中的氨基酸序列；选择前 导抗体VH或VL区中的CDRs之一；提供包含选定的CDRs中至少3个连 续氨基酸残基的氨基酸序列，选定的氨基酸序列是前导序列；将前导序列 与多种测试蛋白质序列比较；从多种测试蛋白质序列中选择至少两种与前 导序列具有至少10％序列同一性的肽片段，选定的肽片段形成命中文库； 基于在前导序列每个位置出现的氨基酸变体频率，构建命中文库的氨基酸 位置变体图谱；组合命中文库中的氨基酸变体以产生形成命中变体文库的 命中变体的组合；使用得分函数确定命中变体文库的成员是否在结构上与 前导结构模板相容；和选择得分等于或好于前导序列的命中变体文库成 员。

按照该方法，组合命中文库中氨基酸变体的步骤包括：选择这样的氨 基酸变体，所述氨基酸变体具有比氨基酸截止发生的频率的2％，优选地 5％，更优选地8％倍(times)，和最优选地10％更高的出现频率，于是如果 它们在截止后丢失则包括来自前导序列的一些氨基酸；和组合命中文库中 选定的氨基酸变体以产生形成命中变体文库的命中变体的组合。

按照所述方法，得分函数是选自由下列各项组成的组的能量得分函数： 静电相互作用，范德华相互作用，静电溶剂化能，溶剂可及表面溶剂化能， 和构象熵。

任选地，得分函数是结合选自由下列各项组成的组的力场的函数： Amber力场，Charmm力场，Discover cvff力场，ECEPP力场，GROMOS 力场，OPLS力场，MMFF94力场，Tripos力场，MM3力场，Dreiding力 场，和UNRES力场，以及其它基于知识的统计学力场(均场)和基于结 构的热力学势函数。

所述方法还可以包含以下步骤：构建包含编码命中变体文库的选定成 员的氨基酸序列的DNA片段的核酸文库。

任选地，所述方法还可以包含以下步骤：将命中变体的选定成员划分 和解析成至少两个命中变体子文库；选择命中变体子文库；构建选定的命 中变体子文库的氨基酸位置变体图谱；通过将氨基酸位置变体反翻译成它 们相应的三核苷酸密码子，将选定的命中变体子文库的氨基酸位置变体图 谱转变成核酸位置变体图谱；和通过以组合的方式组合核酸位置变体构建 DNA片段的简并核酸文库。

解析(parsing)命中变体文库的步骤可包括：随机选择10-30个得分等 于或好于前导序列的命中变体文库成员，所述选定的成员形成变体子文 库。

任选地，解析命中变体文库的步骤可以包括：构建命中变体文库的氨 基酸位置变体图谱，得到命中变体图谱；基于前导序列的结构或结构集合 的Cα或Cβ或重原子在特定距离截止值(8A-4.5A)范围内的接触图谱， 将命中变体图谱解析成子变体图谱的片段。结构模型或前导结构模板在 8_，优选6_，更优选5_，和最优选4.5_的距离内。

在另一实施方案中，该方法包含以下步骤：提供前导抗体的重链(VH) 或轻链(VL)可变区的氨基酸序列，所述前导抗体具有已知的三维结构； 提供一个或多个抗体的3D结构，所述一个或多个抗体与前导抗体相比在 VH或VL区具有不同的序列；通过组合前导抗体和一个或多个抗体的结构 形成结构集合；将结构集合定义为前导结构模板；鉴定前导抗体的CDRs 中的氨基酸序列；选择前导抗体VH或VL区中的CDRs之一；提供在选定 的CDRs中包含至少3个连续氨基酸残基的氨基酸序列，所述选定的氨基 酸序列是前导序列；将前导序列与多种测试蛋白质序列比较；从多种测试 蛋白质序列中选择至少两种与前导序列具有至少10％序列同一性的肽片 段，所述选定的肽片段形成命中文库；基于在前导序列每个位置出现的氨 基酸变体的频率，构建命中文库的氨基酸位置变体图谱；组合命中文库中 的氨基酸变体以产生形成命中变体文库的命中变体的组合；使用得分函数 确定命中变体文库的成员是否在结构上与前导结构模板相容；和选择得分 等于或好于前导序列的命中变体文库成员。

在具体实施方案中，所述方法包含以下步骤：a)提供前导抗体的重链 (VH)或轻链(VL)可变区的氨基酸序列，所述前导抗体具有已知的三维 结构；b)鉴定前导抗体的CDRs中的氨基酸序列；c)选择前导抗体VH 或VL区中的CDRs之一；d)提供包含选定CDRs中至少3个连续氨基酸 残基的氨基酸序列，将选定氨基酸序列定义为前导序列；e)将前导序列 与多种测试蛋白质序列比较；f)从多种测试蛋白质序列中选择至少两种与 前导序列具有至少10％序列同一性的肽片段，选定肽片段形成命中文库； g)基于在前导序列每个位置出现的氨基酸变体频率，构建命中文库的氨 基酸位置变体图谱；h)组合命中文库中的氨基酸变体以产生形成命中变 体文库的命中变体的组合；I)使用得分函数确定命中变体文库的成员是否 在结构上与前导结构模板相容；j)选择得分等于或好于前导序列的命中变 体文库成员；k)构建包含编码命中变体文库选定成员的氨基酸序列的DNA 片段的简并核酸文库；l)测定核酸文库的多样性，如果多样性高于1×106， 重复步骤j)至l)直至核酸文库的多样性等于或低于1×106；m)将简并 核酸文库中的DNA片段引入宿主生物体细胞；n)在所述宿主细胞中表达 DNA片段以使在宿主生物体细胞中产生含有命中文库的氨基酸序列的重 组抗体；o)选择以高于106M-1的亲和力结合靶抗原的重组抗体；和p) 如果未发现以高于106M-1的亲和力结合靶抗原的重组抗体，重复步骤e) 至o)。

在另一个具体实施方案中，所述方法包含以下步骤：

a)提供前导抗体的重链(VH)或轻链(VL)可变区的氨基酸序列， 所述前导抗体具有已知的被定义为前导结构模板的三维结构；b)鉴定前 导抗体的CDRs中的氨基酸序列；c)选择前导抗体VH或VL区中的CDRs 之一；d)提供包含选定的CDRs中至少3个连续氨基酸残基的氨基酸序 列，所述选定的氨基酸序列被定义为前导序列；e)通过用一个或多个不 同的氨基酸残基替代前导序列的一个或多个氨基酸残基突变前导序列，产 生前导序列突变文库；f)使用第一得分函数确定前导序列突变文库的成员 是否与前导结构模板在结构上相容；g)选择分数等于或好于前导序列的 前导序列突变体；h)将前导序列与多种测试蛋白质序列比较；I)从多种 测试蛋白质序列中选择至少两种与前导序列具有至少10％序列同一性的 肽片段，所述选定的肽片段形成命中文库；j)基于在前导序列每个位置出 现的氨基酸变体频率，构建命中文库的氨基酸位置变体图谱；k)组合命 中文库中的氨基酸变体以产生命中变体的组合；l)结合所述选定的前导序 列突变体和命中变体的组合以产生命中变体文库；m)使用第二得分函数 确定命中变体文库的成员是否在结构上与前导结构模板相容；n)选择分 数等于或好于前导序列的命中变体文库的成员；o)构建包含编码命中变 体文库的选定成员的氨基酸序列的DNA片段的简并核酸文库；p)测定核 酸文库的多样性，如果多样性高于1×106，重复步骤n)至p)直至核酸文 库的多样性等于或低于1×106；q)将简并核酸文库中的DNA片段引入宿 主生物体的细胞；r)在宿主细胞中表达DNA片段以使在宿主生物体细胞 中产生包含命中文库的氨基酸序列的重组抗体；s)选择以高于106M-1的 亲和力结合靶抗原的重组抗体；和t)如果未发现以高于106M-1的亲和力 结合靶抗原的重组抗体，重复步骤e)至s)。

在本发明的另一方面，提供基于前导抗体构建突变抗体文库的计算机 实现的方法。

在一个实施方案中，该方法包含：将包含前导抗体CDR区域中至少3 个连续氨基酸残基的氨基酸序列作为输入，所述氨基酸序列为前导序列； 利用计算机可执行的逻辑比较前导序列和多种测试蛋白质序列；从多种测 试蛋白质序列中选择至少两种与前导序列具有至少15％序列同一性的肽 片段；和产生作为输出的形成命中文库的选定的肽片段。

按照上述方法中任何一种，前导序列的长度优选为介于5-100aa之间， 更优选介于6-80aa之间，最优选介于8-50aa之间。

按照上述方法中任何一种，通过使用Kabat标准或Chothia标准进行 鉴定CDRs中氨基酸序列的步骤。

此外，按照上述方法中任何一种，前导序列可包含来自前导抗体VH 或VL中特定区域，CDR1，CDR2或CDR3，或来自CDR和FRs的组合， 如CDR1-FR2，FR2-CDR2-FR3，和全长VH或VL序列的氨基酸序列。前 导序列优选包含选定的CDR中至少6个连续氨基酸残基，更优选地选定 CDR中至少7个连续氨基酸残基，最优选选定CDR中所有氨基酸残基。

还按照上述方法中任何一种，前导序列还可包含至少一个紧邻选定 CDR的氨基酸残基。

还按照上述方法中任何一种，前导序列还可包含至少一个在选定CDR 侧翼的FRs。

还按照上述方法中任何一种，前导序列可另外包含一个或多个邻近选 定CDR的C-末端或N-末端的CDRs或FRs。

还按照上述方法中任何一种，前导结构模板可以是完全组装前导抗体 或前导抗体重链或轻链可变区(例如CDR，FR及其组合)的3D结构。

还按照上述方法中任何一种，多种测试蛋白质序列包括优选地，抗体 序列，更优选人抗体序列，和最优选人种系抗体序列(V-数据库)，特别 是关于构架区。

还按照上述方法中任何一种，从NIH的genbank或Swiss-Prot数据库 或关于抗体CDRs的Kabat数据库中检索多种测试蛋白质序列。

还按照上述方法中任何一种，比较前导序列与多种测试蛋白质序列的 步骤是通过选自由BLAST，PSI-BLAST，图谱HMM，和COBLATH组成 的组的算法来实现。

还按照上述方法中任何一种，命中文库中选定肽片段与前导序列的序 列同一性优选地是至少25％，优选地是至少35％，最优选地是至少45％。

还按照上述方法中任何一种，该方法另外包含下列步骤：将核酸或简 并核酸文库中的DNA片段引入宿主生物体细胞中；在宿主细胞中表达 DNA片段以使含有由核酸或简并核酸文库编码的命中文库的氨基酸序列 的重组抗体在宿主生物体细胞中生产；和选择以高于106M-1，任选地107 M-1，任选地108M-1，任选地109M-1，任选地2×109M-1，任选地5×109M-1， 任选地1×1010M-1，任选地5×1010M-1，和任选地1×1011M-1的亲和力结合 靶抗原的重组抗体。

重组抗体可以是完全组装的抗体，Fab片段，Fv片段，或单链抗体。

宿主生物包括能够表达转移的外源基因序列的任何生物或其细胞系， 包括但不限于细菌，酵母，植物，昆虫，和哺乳动物。

重组抗体可以是完全组装的抗体，Fab片段，Fv片段，或单链抗体。 例如重组抗体可以在细菌细胞中表达和在噬菌体颗粒的表面上展示。在噬 菌体颗粒上展示的重组抗体可以是在VH和VL之间形成的双链杂二聚体。 通过在分别与VH和VL链融合的两条非抗体多肽链之间形成的杂二聚体可 促进VH和VL，链的杂二聚体化。例如，这两个非抗体多肽可以分别来源于 杂二聚体的受体GABAB R1(GR1)和R2(GR2)。

备选地，在噬菌体颗粒上展示的重组抗体可以是含有通过肽接头连接 的VH和VL的单链抗体。通过单链抗体与GR1的融合和噬菌体pIII衣壳 蛋白与GR2的融合之间形成的杂二聚体可以促进噬菌体颗粒表面上单链 抗体的展示。

筛选针对的靶抗原包括小分子和大分子如蛋白质，肽，核酸和多糖。

上述方法的任一种还可以包含下列步骤：将核酸或简并核酸文库中的 DNA片段引入宿主生物的细胞中；在宿主细胞中表达所述DNA片段，从 而在宿主生物细胞中产生含有命中文库氨基酸序列的重组抗体；以及选择 以高于106M-1的亲和力结合靶抗原的重组抗体。

选定的重组抗体与靶抗原的结合亲和力任选地高于107M-1，任选地高 于108M-1，任选地高于1×109M-1，任选地高于2×109M-1，任选地高于5×109 M-1，任选地高于8×109M-1，任选地高于1×1010M-1，任选地高于2×1010 M-1，任选地高于5×1010M-1，任选地高于8×1010M-1，或任选地高于1×1011 M-1。

选定的抗体与其抗原的结合亲和力可以根据被测试的抗体的形式而 变化。被测试的选定的抗体可以以包括VH和VL的单链抗体(scFv)的形式 存在，所述VH和VL通过使用本发明的方法进行设计。任选地，被测试的 选定的抗体可以以包括VH和VL的Fab的形式存在，所述VH和VL通过使 用本发明的方法进行设计。可能，由于其更高的构象柔性和不稳定性，与 以Fab形式存在的选定的抗体相比，以scFv形式存在的选定的抗体的结 合亲和力可以低1-2个数量级。因此，对于以scFv形式存在的选定的抗体， 解离常数优选地低于106M-1，任选地高于107M-1，任选地高于1×108M-1， 任选地高于2×108M-1，任选地高于5×108M-1，任选地高于8×108M-1， 任选地高于1×109M-1，任选地高于2×109M-1，任选地高于5×109M-1， 任选地高于8×109M-1，任选地高于1×1010M-1，任选地高于5×1010M-1， 或任选地高于1×1011M-1。

选定的重组抗体与靶抗原的结合亲和力也可以由解离常数Kd表示， 所述解离常数Kd，例如通过使用仪器诸如BIAcore生物传感器(见实施例)， 在特定温度(例如，4℃，25℃，35℃，37℃，或42℃)下，以在抗体和靶 抗原之间的结合相互作用的动力学研究来进行测量。一般来说，测量的 Kd越低，抗体的亲和力越高；对于相同的抗体而言，测量的温度约高，测 量得到的Kd越高。

如果以scFv、Fab或抗体的其他形式存在，在约4℃，25℃，35℃， 37℃，或42℃的温度下测量，选定的抗体的Kd任选地低于100nM，任选 地低于10nM，任选地低于8nM，任选地低于8nM，任选地低于5nM， 任选地低于1nM，任选地低于0.8nM，任选地低于0.5nM，任选地低于 0.2nM，任选地低于0.1nM，任选地低于0.08nM，任选地低于0.05nM， 任选地低于0.01nM，或任选地低于0.005nM，

按照上述实施方案的任一个，设计的蛋白质(例如，抗体)可以在任何 生物的细胞中合成或表达，所述生物包括，但不限于，细菌、酵母、植物、 昆虫和哺乳动物。具体类型的细胞包括但不限于果蝇(Drosophila melanogaster)细胞，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和其它酵母， 大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，SF9细胞，C129 细胞，293细胞，脉孢菌(Neurospora)，BHK，CHO，COS，和HeLa细 胞，成纤维细胞，Schwanoma细胞系，无限增殖的哺乳动物骨髓和淋巴细 胞系，Jurkat细胞，肥大细胞和其它内分泌和外分泌细胞，和神经元细胞。 哺乳动物细胞的实例包括但不限于，所有类型的肿瘤细胞(特别是黑素瘤， 骨髓性白血病，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，结肠癌，肾癌，前列腺癌，胰腺 癌和睾丸癌)，心肌细胞，内皮细胞，上皮细胞，淋巴细胞(T-细胞和B- 细胞)，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，血管内膜细胞，肝细胞，白细胞，包 括单核白细胞，干细胞如造血干细胞，神经干细胞，皮肤干细胞，肺干细 胞，肾干细胞，肝干细胞和肌干细胞，破骨细胞，软骨细胞和其它结缔组 织细胞，角质形成细胞，黑素细胞，肝细胞，肾细胞，和脂肪细胞。

优选地，按照本领域技术人员已知的方法在表达后纯化或分离设计的 蛋白质。纯化方法的实例包括电泳，分子，免疫学和层析技术，包括离子 交换，疏水，亲和和反相HPLC层析法，和层析聚焦。所需纯化的程度将 取决于设计的蛋白质的应用。在一些情形中，不需要纯化。

还按照上述实施方案中的任何一种，可以筛选设计的蛋白质的期望功 能，优选地生物学功能如它们与已知结合配偶体的结合，生理活性，稳定 性曲线(pH，热，缓冲液条件)，底物特异性，免疫原性，毒性等。

在使用基于细胞的测定的筛选中，基于改变的细胞表型，优选以某一 可检测和/或可测量的方式，可以选择设计的蛋白质。表型改变的实例包括 但不限于，总物理变化如细胞形态、细胞生长、细胞生存力，与基质或其 它细胞的粘附、和细胞密度的变化；一种或多种RNAs、蛋白质、脂质、 激素、细胞因子或其它分子的表达变化；平衡状态(即半衰期)或一种或 多种RNAs、蛋白质、脂质、激素、细胞因子、或其它分子的变化；一种 或多种RNAs、蛋白质、脂质、激素、细胞因子、或其它分子的定位的变 化；一种或多种RNAs、蛋白质、脂质，激素、细胞因子、受体、或其它 分子的生物活性或比活性的变化；离子、细胞因子、激素、生长因子、或 其它分子的分泌的变化；细胞膜电势、极化、完整性或转运的变化：病毒 和细菌病原体的感染性、敏感性、潜伏期、粘附、和摄取的变化。

按照上述实施方案中任何一种，可以合成或作为与标记蛋白质或肽的 融合蛋白表达设计的蛋白质(例如抗体)。标记蛋白质或肽可以用于设计 蛋白质的鉴定、分离、信号传导、稳定、柔性增加、降解增加、分泌增加、 转运或胞内保留或表达增加。

本发明还提供：分离编码所述抗体的核酸；包括该核酸的载体，所述 载体任选地与控制序列可操作地连接，所述控制序列由以所述载体转化的 宿主细胞所识别；包括该载体的宿主细胞；产生所述抗体的方法，所述方 法包括培养所述宿主细胞，从而使核酸进行表达，和任选地，从所述宿主 细胞培养物中回收所述抗体。

3.使用本发明的抗体的方法

通过使用本发明方法设计的抗体可以用于诊断或治疗处理各种疾病， 包括但不限于，癌症，自身免疫疾病如多发性硬化，类风湿性关节炎，系 统性红斑狼疮，I型糖尿病，和重症肌无力，移植物抗宿主疾病，心血管 疾病，病毒感染如HIV，肝炎病毒，和单纯疱疹病毒，细菌感染，变态反 应，II型糖尿病，血液病如贫血症。

所述抗体也可以用作与诊断或治疗部分连接的缀合物，或与化学治疗 剂或生物制剂联合。

本发明的抗体还可以用作亲和力纯化试剂。在该方法中，使用本领域 众所周知的方法，将所述抗体固定在固相如Sephadex树脂或滤纸上。使 固定的抗体与待纯化的包含VEGF蛋白质(或其片段)的样品接触，随后用 适合的溶剂来洗涤所述支持体，所述适合的溶剂将基本上去除样品中所有 的物质，除了结合于固定的抗体的VEGF蛋白质。最终，用另一种适合的 溶剂，诸如甘氨酸缓冲液，pH 5.0来洗涤所述支持体，所述溶剂将从抗体 中释放VEGF蛋白质。

抗-VEGF抗体还可以用在对于VEGF蛋白质的诊断测定中，例如在特 异性细胞、组织或血清中检测其表达。这些诊断方法可以用在癌症诊断中。

对于诊断应用而言，可以以可检测的部分来标记所述抗体。例如，可 以使用例如在Current Protocols in Immunology，卷1和2，Coligen等，Ed. Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中所述的技术，以放 射性同位素，诸如35S，14C，125I，3H，和131I来标记所述抗体，并且使用 闪烁计数来测量放射性。

所述抗体还可以缀合以荧光标记诸如稀土元素螯合剂(例如，铕螯合 剂)，荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，丽斯胺，藻红素和得 克萨斯红。例如，使用在上文的Current Protocols in Immunology中公开的 技术，可以将荧光标记缀合于所述抗体。使用荧光计可以对荧光进行量化。

可以以各种酶-底物标记诸如在美国专利号4,275,149中公开的那些， 对抗体进行标记。酶通常催化显色底物的化学变化，所述显色底物可以使 用各种技术进行测量。例如，所述酶可以催化底物的颜色变化，其可以通 过分光光度法进行测量。备选地，所述酶可以改变底物的荧光或化学发光。

在一种诊断应用中，本发明提供确定VEGF蛋白质存在的方法，所述 方法包括将怀疑含有VEGF蛋白质的样品暴露于抗-VEGF抗体并且确定 所述抗体与所述样品的结合。对于该应用而言，本发明提供包括所述抗体 的试剂盒和使用所述抗体来检测所述VEGF蛋白质的说明书。

还可以配制本发明的抗体以用于通过各种各样的给药途径进行递送。 通过将具有需要纯度的抗体与任选的生理接受的载体、赋形剂或稳定剂混 合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备所述抗体的治疗制剂以进行贮存 (Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))。例 如，所述抗体可以通过口服，局部，肠胃外，腹膜内，静脉内，动脉内， 透皮，舌下，肌内，直肠，透颊，鼻内，经吸入，阴道，眼内，经局部传 递(例如通过导管或支架)，皮下，脂肪内(intraadiposally)，关节内，或鞘 内进行施用或共同施用。

根据所述疾病的类型和严重性，约1μg/kg到约50mg/Kg(例如，0.1-20 mg/Kg，0.5-15mg/Kg，和1-10mg/kg)的抗体是施用于患者的起初候选剂 量，无论，例如，是通过一次或多次单独施用，还是通过持续输注。根据 上述提及的因素，典型的每日一次或每周一次的剂量范围可以在约1μg/kg 到约20mg/kg或更多的范围内。根据状况，对于在数天或更多天内的重复 施用，重复所述治疗直到发生疾病症状的所需的抑制。然而，其他的剂量 给药方案可以是有用的。这种治疗的方法通过例如包括放射显影肿瘤成像 的常规技术和测定容易地进行监测。

可以将本发明的抗-VEGF抗体用于治疗广泛种类的适应证，因为抗 -VEGF抗体具有治疗活性。这些适应症包括，但不限于再狭窄(例如，冠 状动脉、颈动脉和大脑病变)，良性肿瘤，各种类型的癌症诸如原发肿瘤和 肿瘤转移，内皮细胞的异常刺激(动脉粥样硬化)，由于外科手术造成的对 身体组织的损伤，异常的伤口愈合，异常的血管发生，产生组织纤维化的 疾病，肌肉变性，重复性运动疾病，未高度脉管化的组织的疾病，和与器 官移植相关的增生反应。

良性肿瘤的实例包括，血管瘤，肝细胞腺瘤，多孔血管瘤，病灶性(focal) 结节增生，听神经瘤，神经纤维瘤，胆小管腺瘤，胆小管cystanoma，纤 维瘤，脂肪瘤，平滑肌瘤，间皮瘤，畸胎瘤，粘液瘤，结节状的再生性增 生，沙眼和化脓性肉芽肿(pyogenic granulomas)。

特定类型的癌症包括，但不限于，白血病，乳腺癌，皮肤癌，骨癌， 前列腺癌，肝癌，肺癌，脑癌，喉癌，胆囊癌，胰腺癌，直肠癌，甲状旁 腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，神经组织癌，头颈癌，结肠癌，胃癌，支气 管癌，肾癌，基底细胞癌，溃烂性和乳头状类型的鳞状细胞癌，转移性皮 肤癌，骨肉瘤，尤因肉瘤，veticulum细胞肉瘤，骨髓瘤，巨细胞肿瘤，小 细胞肺肿瘤，胆石，胰岛细胞肿瘤，原发性脑肿瘤，急性和慢性淋巴细胞 和粒细胞肿瘤，毛细胞肿瘤，腺瘤，增生，髓样癌，嗜铬细胞瘤，粘膜 neuronms，肠ganglloneuromas，增生性角膜神经肿瘤，马方综合征体型 (marfanoid habitus)肿瘤，维尔姆斯瘤，精原细胞瘤，卵巢肿瘤，leiomyomater 肿瘤，宫颈发育异常和原位癌，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，软组织 肉瘤，恶性的类癌瘤，局部皮肤病变，覃样霉菌病，横纹肌肉瘤，卡波西 肉瘤，成骨的和其他肉瘤，恶性高钙血症，肾细胞肿瘤，红细胞增多症 (polycythermia vera)，腺癌，多形性成胶质细胞瘤，白血病，淋巴瘤，恶 性黑素瘤，表皮样瘤癌症，和其他的癌症和肉瘤。

与异常血管发生相关的疾病包括，但不限于，类风湿性关节炎、与局 部缺血-再灌注相关的脑水肿和损伤、皮质局部缺血、卵巢增生和血管过多、 (多囊卵巢综合症)、子宫内膜异位、牛皮癣、糖尿病性视网膜病，和其它 的眼科血管源性疾病诸如早熟性视网膜病(晶状体后纤维形成)、斑退化、 角膜移植排异反应、neuroscular青光眼和Oster Webber综合症。在具体的 实施方案中，可以将本发明的抗-VEGF抗体用于治疗年龄相关的斑退化 (AMD)。

视网膜/脉络膜新血管形成的实例包括，但不限于，贝斯特病、近视、 视窝(optic pits)、施塔加特病、佩吉特病、静脉闭塞、动脉闭塞、镰状细 胞贫血、类肉瘤、梅毒、假黄瘤elasticum肉样瘤abostructive病、慢性眼 色素炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早熟性视网 膜病、伊尔斯病、糖尿病性视网膜病、斑退化、Bechets病、导致视网膜 炎或脉络膜炎的感染、推定的眼组织胞浆菌病、扁平部睫状体炎、慢性视 网膜脱离、高粘滞性综合症、弓形体病、损伤和激光后并发症、与rubesis 相关的疾病(踝的新血管形成)和由纤维血管或纤维性组织的异常增生造成 的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病。

角膜新血管形成的实例包括，但不限于，流行性角结膜炎、维生素A 缺陷、接触透镜过度磨损、异位角膜炎、上缘(superior limbic)角膜炎、翼 状胬肉角膜炎sicca、sjogrens、玫瑰痤疮、phylectenulosis、糖尿病性视网 膜病、早熟性视网膜病、角膜移植排异反应、莫伦溃疡、Terrien′s缘退化、 缘角质分离、多动脉炎、Wegener肉样瘤病、巩膜炎、periphigoid辐射状 角膜切开术、新血管青光眼和晶状体后纤维增生、梅毒、分枝杆菌感染、 脂质退化、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱 疹感染、原生动物感染和卡波西肉瘤。

可以将本发明的抗-VEGF抗体与抗血管发生药剂组合在一起使用以 治疗与异常血管发生相关的疾病。

抗血管发生的药剂的实例包括，但不限于，视黄酸及其衍生物，2-甲 氧基雌二醇，ANGIOSTATINTM蛋白质，ENDOSTATINTM蛋白质，苏拉 明，角鲨胺，金属蛋白酶I的组织抑制剂，金属蛋白酶-2的组织抑制剂， 纤溶酶原激活物抑制剂-1，纤溶酶原激活物抑制剂-2，软骨衍生的抑制剂， 紫杉醇，血小板因子4，硫酸鱼精蛋白(鲱精蛋白)，硫酸化的几丁质衍生 物(制备自母蟹壳)，硫酸化的多糖肽聚糖复合物(sp-pg)，星形孢菌素，基 质代谢的调节剂，包括例如，脯氨酸类似物((铃兰氨酸(LACA)，顺式羟基 脯氨酸，d，l-3，4-脱氢脯氨酸，thiaproline)，α，α-二吡啶基，β-氨基丙腈富马 酸盐，4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3h)-噁唑酮；甲氨蝶呤，米托蒽醌，肝素，干 扰素，2巨球蛋白-血清，chimp-3，胰凝乳蛋白酶抑制剂，β-环糊精十四硫 酸盐，eponemycin；夫马洁林，金硫丁二钠，d-青霉胺(CDPT)，β-1-抗胶 原酶-血清，□2-抗纤维蛋白溶酶，比生群，氯苯扎利二钠，n-(2-羧苯基 -4-chloroanthronilic acid二钠或″CCA″，沙利度胺；angostatic类固醇， cargboxynaminolmidazole；金属蛋白酶抑制剂诸如BB94。其它的抗血管发 生药剂包括抗体，诸如针对这些生血管生长因子：bFGF，aFGF，FGF-5， VEGF同工型，VEGF-C，HGF/SF和Ang-1/Ang-2的单克隆抗体。

本发明的抗-VEGF抗体，优选地具有与抗-VEGF抗体的治疗协同作 用的那些，可以与所述抗-VEGF抗体组合使用从而进一步增加这两种类型 药物的治疗效果。治疗剂的实例包括，但不限于，烷化剂，抗生素药，抗 代谢药，激素药，植物衍生药和生物制剂。

烷化剂的实例包括，但不限于，二氯乙胺(氮芥，例如，苯丁酸氮芥， 环磷酰胺，异环磷酰胺，氮芥，美法仑，尿嘧啶氮芥)，吖丙啶(例如，塞 替派)，磺酸烷酮(例如，白消安)，亚硝基脲(例如，卡莫斯汀，洛莫斯汀， 链佐星)，非经典烷化剂(六甲蜜胺，达卡巴嗪，和丙卡巴肼)，铂化合物(卡 铂和顺铂)。

抗生素药的实例包括，但不限于，蒽环霉素(例如，多柔比星，柔红 霉素，表柔比星，伊达比星和蒽二酮(anthracenedione))，丝裂霉素C，博 来霉素，放线菌素D，plicatomycin。

抗代谢药的实例包括，但不限于，氟尿嘧啶(5-FU)，氟尿苷(5-FUdR)， 甲氨蝶呤，亚叶酸，羟基脲，硫鸟嘌呤(6-TG)，巯嘌呤(6-MP)，阿糖胞苷， 喷司他丁，磷酸氟达拉滨，克拉曲滨(2-CDA)，天冬酰胺酶，甲磺酸伊马 替尼(或GLEEVAC_)，和吉西拉滨。

这些激素药的实例是合成雌激素(例如，二乙基己烯雌酚)，抗雌激素 药(例如，他莫昔芬，托瑞米芬，fluoxymesterol和雷洛昔芬)，抗雄激素药 (比拉鲁胺，尼鲁米特，氟他胺)，芳香酶抑制剂(例如，氨鲁米特，阿那曲 唑和四唑)，酮康唑，醋酸戈舍瑞林，亮丙立德，醋酸甲地孕酮和米非司酮。

植物衍生的药剂的实例包括，但不限于，长春花生物碱(例如，长春 新碱，长春碱，长春地辛，长春利定和长春瑞滨)，鬼臼毒素(例如，依托 泊甙(VP-16)和替尼泊苷(VM-26))，喜树碱化合物(例如，20(S)喜树碱，托 泊替康，卢比替康，和伊立替康)，紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)。

生物制剂的实例包括，但不限于，免疫调剂蛋白质诸如细胞因子，针 对肿瘤抗原的单克隆抗体，肿瘤抑制基因，和癌症疫苗。可以与本发明的 抗体组合使用的白介素的实例包括，但不限于，白介素2(IL-2)，和白介素 4(IL-4)，白介素12(IL-12)。可以与本发明的抗体组合使用的干扰素的实例 包括，但不限于，干扰素a，干扰素b(成纤维细胞干扰素)和干扰素g(成 纤维细胞干扰素)。这些细胞因子的实例包括，但不限于，红细胞生成素 (epoietin a)，粒细胞-CSF(非格司亭)，和粒细胞，巨噬细胞-CSF(沙格司亭)。 除了细胞因子，其他的免疫调节剂包括，但不限于卡介苗，左旋咪唑和奥 曲肽。

本发明的抗-VEGF抗体还可以与肿瘤坏死因子(TNF)或其突变蛋白组 合使用在上述疾病或病症的治疗中。重复施用抗-VEGF抗体和TNF直到 达到需要的临床效果。在其中实体肿瘤见于四肢或其它位点的情形中，可 以将所述抗体和/或TNF施用于分离的肿瘤或器官，所述其它位点易感于 从一般循环中分离。在其它的实施方案中，将FGF或血小板衍生的生长因 子(PDGF)拮抗剂，诸如抗-FGF或抗-PDGF中和抗体与抗-VEGF抗体组合 施用于患者。用抗-VEGF抗体进行的治疗最好可以在伤口愈合的时期或需 要的新血管化过程中暂停。

可以与本发明的抗-VEGF抗体组合使用的针对肿瘤抗原的单克隆抗 体的实例包括，但不限于，HERCEPTIN_(Trastruzumab)，RITUXAN_(利 妥昔单抗)，MYLOTARG_(吉姆单抗奥佐米星)，CAMPATH_(阿仑单抗)， ZEVALIN_)(替伊莫单抗(ibritumomab yiuxetan))，PANOREX_(依决可单 抗)，BEXXAR_(托西莫单抗)，ERBITUX_(西妥昔单抗)，和AVASTIN_(贝 伐单抗)。

所述肿瘤抑制基因的实例包括，但不限于，DPC-4，NF-1，NF-2，RB， p53，WT1，BRCAL和BRCA2。

癌症疫苗的实例包括，但不限于，神经节苷脂(GM2)，前列腺特异性 抗原(PSA)，甲胎球蛋白(AFP)，癌胚抗原(CEA)(由结肠癌和其它腺癌，例 如，乳腺癌、肺癌、胃癌和胰腺癌产生)，黑素瘤相关抗原(MART-1，gp100， MAGE 1，3酪氨酸酶)，乳头瘤病毒E6和E7片段，自体肿瘤细胞和异源 肿瘤细胞的整个细胞或部分/裂解物。

可以将佐剂用于增大针对TAAs的免疫应答。佐剂的实例包括，但不 限于，卡介苗(BCG)，内毒素脂多糖，匙孔血蓝蛋白(GKLH)，白介素-2 (IL-2)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和环磷酰胺，认为当以低 剂量给药时，会减少肿瘤诱导抑制的化疗剂。

                          实施例

1.在计算机上设计用于人源化和亲和力成熟的抗-VEGF抗体

将在本发明中提供的方法用于设计非人抗体的人源化的文库和优化 抗体的亲和力和其它特性。以人或人样序列来产生抗体的氨基酸和核酸的 新变体，同时它们的结合亲和力、稳定性、表达得以显著提高。

通过开采所有的生物，尤其是人的蛋白质序列的不断扩充的数据库， 并通过使它们的特异性序列或它们的变体与功能提高诸如通过实验检验 的结合亲和力和稳定性关联，而以高通量方式在计算机上实施本发明的方 法。通过使用本发明的方法，可以基于极端多样化的蛋白质序列和在计算 机上的功能上相关的结构的计算机评价来构建扩充的和功能上有偏向的 抗体文库，并将其随后通过实验筛选和体外或体内选择来进行检验。

通常，所述方法基于在下文被称为“前导序列”的前导蛋白质中的靶结 构/功能基序或结构域的氨基酸序列，通过在计算机上的蛋白质序列的选 择，在计算机上来进行。将所述前导序列用于搜索蛋白质序列的数据库。 数据库的选择取决于设计的基序的具体功能要求。例如，如果前导蛋白质 是酶并且靶基序包括酶的活性位点，可以使用各种搜索标准来查询特定起 源、生物、物种或其组合的蛋白质/肽的数据库，产生命中序列的列表，所 述命中序列的列表中的每个都可以取代前导蛋白质中的靶基序。可以将类 似的方法用于设计前导蛋白质的其它基序或结构域。可以将每个个体基序 /结构域的设计的序列进行组合以产生被设计的蛋白质的文库。此外，为了 减少用于人应用，诸如治疗或诊断的被设计的蛋白质的免疫原性，优选地 搜索人起源的蛋白质或人源化蛋白质的数据库来产生命中的序列列表，所 述命中的序列列表尤其是针对来自前导蛋白质的位点的基序，其充当前导 蛋白质的支架诸如抗体的构架。可以对设计的蛋白质的文库通过实验进行 检验从而产生具有超过所述前导蛋白质的改善的生物学功能的蛋白质。

在本实施例中，将本发明方法用在设计抗-VEGF抗体中，所述抗 -VEGF抗体在序列上多样，然而在功能上彼此相关。基于被设计的抗体序 列，对抗体文库进行构建从而以高通量方式在非人抗体的互补决定区 (CDRs)和/或人源化构架(FRs)中包括多样序列。为了改善的功能诸如结合 亲和力和药物代谢动力学特性，针对人VEGF筛选这种抗体文库。

在设计所述抗-VEGF抗体中，基于前导抗-VEGF抗体中区域或基序的 氨基酸序列，以下称为“前导序列”，在计算机上选择抗体序列。使用前导 序列来搜索蛋白质序列数据库。数据库的选择取决于设计的基序的特定功 能要求。例如：为了针对治疗应用设计可变链的构架区，除了一些结构关 键位点以外，应当使用进化上相关蛋白质序列如完全人免疫球蛋白序列和 人种系免疫球蛋白序列的集合。通过在该高度保守区域(对于构架区)引 入尽可能少的外源突变体而保留序列来源，这将减小免疫原应答。在另一 方面，不同序列的数据库如genbank中的各种物种的免疫球蛋白序列或甚 至不相关序列可以用于设计CDRs以便改善该高变区中与抗原的结合亲 和力。通过使用该方法，构建多样的抗体序列的文库，并通过实验方法在 体外和/或体内筛选具有改善的或需要的功能的抗体突变体。

1)在计算机上设计抗-VEGF抗体文库进行亲和力成熟

鼠抗-VEGF抗体的可变重链区的氨基酸序列和构架及CDRs的片段 (下划线和注解的)是：

EIQLVQSGPELKQPGETVRISCKAS GYTFTNYGMN(VH/CDR1)WVKQAPGKG LKWMG WINTYTGEPTYAADFKR(VH/CDR2)RFTFSLETSASTAYLQISNLKND DTATYFCA KYPHYYGSSHWYFDV(VH/CDR3)WGAGTTVTVSS(SEQ ID NO：283)

该VH序列在下文被称为“母体抗-VEGF抗体”。按照Kabat标准(Kabat EA，Redi-Miller M，Perry HM，Gottesman KS(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest第4版，National Institutes of Health，Bethesda，MD) 来设计所述构架和CDRs。

使用计算机模块进化设计方法来靶向所述抗体的CDR和构架区，所 述设计方法如在美国专利申请系列号10/443,134，10/153,159，10/153,176， 10/125,687，和60/284,407中所详细描述，将其全部内容并入作为参考。使 用鼠抗-VEGF抗体作为前导蛋白质及其VH CDR3作为前导序列，通过下 列方法构建VH CDR3的数字式文库。

所述前导序列包括母体抗-VEGF抗体的VH CDR3和来自邻近构架区 CAK YPHYYGSSHWYFDVWG的几个氨基酸残基。通过从序列数据库中 搜索和选择针对VH CDR3的命中氨基酸序列来构建命中文库。基于命中 文库，来构建变体图谱以列出在每个位点的所有的变体，并以一定的截止 值来过滤它们从而减少得到的命中变体文库的大小到在计算机或实验限 制范围内。还构建变体图谱从而促进i)对覆盖适合度景观(landscape)中的 优选区域的序列空间进行取样；ii)靶向优选的肽的集合序列的简并核酸 文库的划分和合成；iii)实验筛选所述抗体文库的所需功能；和iv)以反 馈分析实验结果以进行进一步设计和优化。

前导结构模板获自在VEGF和抗-VEGF抗体之间形成的复合体的可 获得的X-射线结构。将VEGF和母体抗-VEGF抗体的复合结构称为1BJ1， 并且在VEGF和成熟的抗-VEGF抗体之间形成的复合结构称为1CZ8。以 扫描序列的相对等级次序，来自1CZ8结构模板的结果类似于来自1BJ1 的那些。还可以使用抗-VEGF抗体的结构模型。

按照Kabat分类由母体抗-VEGF抗体取得VH CDR3的前导序列，其 中氨基酸残基CAK和WG分别来自在N和C末端的VH CDR3序列的侧 翼的邻近构架区。只利用母体抗体的VH CDR3序列建立HMM用于搜索 蛋白质数据库。

校准利用单一前导序列或结构集合序列建立的HMM并将其用于搜索 Kabat数据库(Johnson，G和Wu，TT(2001)Nucleic Acids Research，29， 205-206)。列出在期望值或E-值以上的所有序列命中，并利用HAMMER 2.1.1软件包进行比对。在从命中列表中除去冗余序列后，前导HMM的其 余命中序列形成命中文库。

利用每个位置上的变体图谱建立AA-PVP表(氨基酸位置变体图谱)， 其给出了每种氨基酸残基在每个位置上出现的数目。

可以将变体图谱进行过滤以利用基于结构的评分除去以某种截止值 频率或比它更小的频率和/或组合变体重作图(reprofiling)而发生的变体。来 自序列库的变体图谱提供了信息数据以鉴定前导序列中的位置，其既可以 是变化的也可以是固定的。所述位点可以分成三类：i)在进化过程中保守 的结构保守性位点。高频残基可以用来保持这些位置上靶基序的支架；ii) 可变功能性热点应当以集中的突变进行靶向；iii)组合i)和ii)使靶支架 稳定化，同时提供功能性热点上的可变性。

一组来自功能变体的氨基酸应当按照它们在变体图谱中的频率包括 在功能热点上，因为它们是在进化上选择或优化的。而且，在每个位置上 的变体都可以进行过滤或区分优先次序来包括其它可能有益的突变体或 排除可能不需要的突变体以满足计算机和实验的限制。

尽管所述变体图谱对每个位置上的优选氨基酸残基和以优选次序排 列的特定突变体是信息性的，未修饰的，它包括了大量的重组子。一些利 用频率截止值的过滤能够可以减少组合序列，所述组合序列需要通过计算 机筛选进行评估或被实验文库直接进行靶向。

应用基于结构的评分来筛选命中文库及其形成命中变体文库的组合 序列。母体抗-VEGF抗体的VHCDR3的侧链在每个残基位置上被来自命 中变体文库的相应氨基酸变体的旋转异构体所取代。利用主链依赖型旋转 异构体文库，通过使用程序SCWRL_(版本2.1)建立和优化旋转异构体 的构象(Bower MJ，Cohen FE，Dunbrack RL(1997)JMB 267，1268-82)。

在存在和缺少抗原VEGF结构的情况下，通过使用CONGEN [Bruccoleri和Karplus(1987)Biopolymers 26：137-168]中的Amber94力场的 100-200个步骤，通过搜索最优旋转异构体和最小化能量完成评分。在有 和/无VEGF抗原时基于计算得分的抗VEGF变体文库的能量得分表明对 于各种变体文库来说有大量的序列比母体序列具有更高的得分。

可以使用一种包括侧链熵、非极性溶剂化能和静电溶剂化能的改进的 自定制得分函数(custom scoring function)来校准用于评分的简单函数。 计算三种能量术语：侧链熵、非极性溶剂化能和静电溶剂化能以及环的主 链熵。

如通过GEPOL93算法计算的，使非静电溶剂化能与分子表面成比例， 缩放比例常数为70cal/mol/A2(Tunon I，Silla E，Pascual-Ahuir JL(1992) Prot Eng 5，715-716)，利用在CONGEN中执行的GEPOL(Pascual-AhuirJL， Silla E(1993)J Comput Chem 11，1047-1060)命令。

使用如在UHBD程序(Davis ME，Madura JD，Luty BA，McCammon JA (1991)Comput Phys Commun 62，187-197)中进行的有限差PB(FDPB)方 法计算静电溶剂化能。将聚焦法用于突变周围区域。自动方案产生三个格 子：粗糙的，精细的，和焦点格子。格子单位分别是1.5，0.5，和0.25埃。 聚焦格子是跨越由突变残基占有的笛卡儿体积的立方格子。精细格子是跨 越整个蛋白质或复合体体积的立方格子。粗糙格子是设定为每个轴中精细 格子大约两倍大小的立方格子，并覆盖约8倍体积的精细格子。粗糙格子 用于说明长范围的溶剂效应和设定精细格子的边界条件。类似地，精细格 子说明蛋白质内部的静电贡献和设定焦点格子的边界条件。焦点格子说明 由于突变导致的局部效应的更细微的细节。将蛋白质内部和外部的介电常 数分别设定为4和78。温度设定为300开尔文和离子强度设定为150mM。 最大迭代设定为200。用统一的电介质重复计算从而使内部和外部电介质 设定为4，计算两种能量之间的差异。后者计算代表由于将电荷带到格子 中导致的能量。

定制评分函数或使用CONGEN中的Amber94力场加上来自本文所用 UHBD中PB的溶剂化术语的分子力学能量类似于MM-PBSA或 MM-GBSA。能量函数显示与实验数据更好的一致(Sharp KA.(1998) Proteins 33，39-48；Novotny J，Bruccoleri RE，Davis M，Sharp KA(1997)J Mol Biol 268，401-411)，特别是当通过分子动力学计算的结构整体 (ensemble)用于提供更准确的基于能量函数整体平均值对序列和它的变体 评分的方法(Kollman PA，Massova I，Reyes C，Kuhn B，Huo SH，Chong LT， Lee M，Lee TS，Duan Y，Wang W，Donini O，Cieplak P，Srinivasan P，Case DA， 和Cheatham TE(2000)Acc.Chem Res.33，889-897)。

过滤来自如上所述的命中变体文库的变体图谱，以便减小潜在文库大 小而同时保持大多数优选残基。基于有利分数和/或可能参与有利相互作用 的残基的存在选择最佳序列的策略被用于鉴定一个或多个用于核酸文库 设计的氨基酸序列簇。如上所述，分别选择对于VHCDR3，CDR2和CDR1 的计算筛选的序列簇用于进一步体外实验测试。

用单一简并核酸文库来靶向上述构建的命中变体文库。使用以最小的 大小组合的具体生物的最佳密码子，来构建核酸序列图谱。通过将碱基的 混合物结合到每个简并位置中来合成简并核酸文库。作为合成的组合效应 的结果，这种简并核酸文库编码扩充的氨基酸文库。

VH和VL的每个位置的变体分别显示在VH和VL氨基酸位置变体图 谱中。将VH和/或VLCDR3，CDR2，和CDR1，FR123的详细结果总结在 抗-VEGF VH和VL表中。这些实验证明，通过使用本发明的方法，不仅 可以用多样序列和系统发生距离，还可以用与靶VEGF抗原结合的改善的 结合亲和力来选择抗体。

图1A是对于使用上述方法设计的抗-VEGF抗体的VL的氨基酸位置 变体图谱(AA-PVP)。所述VL链的AA-PVP使用Baca等.(1997)J Biol Chem 272：10678-10684的人源化的VL(SEQ ID NO：1)作为参考序列。点表 示与参考相同的氨基酸。将CDRs以粗体字母强调表示。

图1B是对于使用上述方法设计的抗-VEGF抗体的VH的氨基酸位置 变体图谱(AA-PVP)。所述VH链的AA-PVP使用Baca等.(1997)上文的 人源化的VH(SEQ ID NO：55)作为参考序列。点表示与参考相同的氨基酸。 将CDRs以粗体字母强调表示。

通过使用新的噬菌体展示系统，来检验所述抗体文库与抗原，VEGF， 结合的能力，所述抗体文库通过使用上述方法，基于母体抗-VEGF抗体的 前导序列，在计算机上进行设计。

2)产生抗-VEGF抗体文库来进行构架优化

发现鼠单克隆抗体封闭VEGF-依赖型细胞增殖并且减慢体内肿瘤生 长(Kim KJ，Li B，Winer J，Armanini M，Gillett N，Phillips HS，Ferrara N (1993)Nature 362，841-844)。在移植抗原-结合环后使用一些关键构架位置 上的随机诱变，来对这种鼠抗体进行人源化(Presta LG，Chen H，O′ConnorSJ， Chisholm V，Meng YG，Krummen L，Winkler M，Ferrara N(1997)Cancer Res. 57，4593-4599；Baca M，Presta LG，O′Connor SJ，Wells JA(1997)J Biol Chem 272，10678-10684)。典型地，在数轮定点诱变和选择后，通过在某些预定 的关键位置，以来自母体非人抗体的非人氨基酸置换人或保守(concensus) 人构架，来产生人源化的抗体。通常，这些人源化抗体将以相对于其母体 抗体的减少的亲和力，结合于其母体抗体的同源抗原(对于人源化的抗 -VEGF，相对于其母体鼠抗体，约6倍更弱，见Baca M，Presta LG，O′Connor SJ，Wells JA(1997)J Biol Chem 272，10678-10684，并且对于人源化抗 -VEGF的另一种形式，2倍更弱，见Presta LG，Chen H，O′Connor SJ， Chisholm V，Meng YG，Krummen L，Winkler M，Ferrara N(1997)Cancer Res. 57，4593-4599；Baca M，Presta LG，O′Connor SJ，Wells JA(1997)J Biol Chem 272，10678-10684)。通过使用CDRs中的亲和力成熟来恢复这种结合 亲和力的损失(Chen Y，Wiesmann C，Fuh G，Li B，Christinger HW，McKay P， de Vos AM，Lowman HB(1999)J.Mol Biol 293，865-881)。

使用所述的本发明方法，我们已经发现这样的一些人源化的构架，其 在构架优化后，在结合亲和力上数倍于(对于hAB2是3.3倍，对于hAB3 是4倍并且对于hAB4是2倍)报道的人源化的抗-VEGF抗体序列(对于在 文献(Presta LG，Chen H，O′Connor SJ，Chisholm V，Meng YG，Krummen L， Winkler M，Ferrara N(1997)Cancer Res.57，4593-4599)中报道的人源化的 抗-VEGF抗体构架，见图2中的hAB1)。因为报道的人源化抗-VEGF抗 体是～2倍弱于其相应的鼠抗体，我们的人源化抗体(hAB2和hAB3)在人源 化后与相应的鼠抗体相比，应该具有～2倍更高的结合亲和力。此外，通过 相对于报道的人源化的抗体(hAB1)，增加结合速率(Kon)或减小脱离速率 (Koff)，我们可以获得这样的改善(见图2)。

鼠抗-VEGF抗体的构架fr123区的氨基酸序列是：

EIQLVQSGPELKQPGETVRISCKASWVKQAPGKGLKWMGRFTFSLETSASTA YLQISNLKNDDTATYFCA.

该序列在下文中称作“鼠抗-VEGF抗体”的fr123，见Presta LG，Chen H， O′Connor SJ，Chisholm V，Meng YG，Krummen L，Winkler M，Ferrara N (1997)Cancer Res.57，4593-4599)。如果需要可以利用相同方法对相对恒定 的构架4进行设计。按照Kabat标准对构架和CDRs进行指定(Kabat EA， Redi-Miller M，Perry HM，Gottesman KS(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest第4版，NATional Institutes of Health，Bethesda，MD)， 尽管也可以使用其它分类。另外，可以分别地对构架FR1或FR2或FR3 和FR4的单独片段进行设计并且如果需要将其粘在一起。利用本文所述 的方法，通过设计每个片段或片段的组合可以同时设计CDRs和FRs的 组合。所述CDRs与来自鼠抗-VEGF的SEQ283或利用本文所述方法设计 的那些中的CDRs相同。不过，还可以设计不同的CDRs并且与设计的 FR123文库组合使用。利用基于鼠抗-VEGF抗体的VHFR123前导序列的 人VH种系序列，生成命中文库的变体图谱并且通过利用一定的截止值进 行过滤。在每个位置上的变体都可以基于其与抗体结构的结构相容性、利 用总能量或其它评分项目进行排序。基于其总能量或特异性折叠，发现一 些参考氨基酸在某些位置上是有利的，尽管它们的出现频率非常低。利用 源于Kabat的人VH序列、基于鼠抗VEGF抗体的VHFR123前导序列可 以生成和改进命中文库的变体图谱。如果只使用抗体结构的话，可以对经 过滤的变体图谱作进一步计算性筛选以反映结构相容性的排序次序。尽管 人相对非人序列在整个VH链的许多位置上不同，在其它人源化方法中使 用的氨基酸文库集中在移植的CDRs侧翼的少许位置上的随机化，而在优 选的实施方案中，人源化文库靶向VH和VL链上的各个位置，在那些位 置上对于起始抗-VEGF抗体有少许突变。

在优选的实施方案中，每种基序如构架FR1，FR2，FR3和FR4或其 组合如抗体的FR123可以利用模块计算机进化设计方法进行靶向。已理解 的是，对于每种基序或其组合只有有限数目的构象(称为正则结构)。抗 体的这些结构特征对于基于抗体结构的广泛分析，通过利用抗体各区上结 构化基序测试进化序列设计提供了极好的系统。在不同的物种之间观察到 这些结构和序列的保守性。事实上，抗体的支架，或免疫球蛋白折叠，是 自然界中观察到的最丰富的结构之一，并且在各种抗体和相关分子之间高 度保守。

在优选的实施方案中，该方法还可以用来利用基于序列的方法或含有 CDRs中诱导的结构变化的结构集合来设计抗体构架。利用鼠抗-VEGF抗 体构架作为前导蛋白和其VHFR123作为前导序列，构建VHFR123的数字 式文库。

在优选的实施方案中，通过利用VHFR123作为前导序列搜索和选择 命中氨基酸序列来构建命中文库。建立变体图谱以便基于命中文库在每个 位置上列出所有变体，并且以一定截止值进行过滤以便减小得到的命中变 体文库的大小在计算机或实验限制内。还建立变体图谱以便促进i)覆盖 适合度景观中优选区域的序列空间的取样；ii)靶向优选的肽集合序列的 简并核酸文库的划分和合成；iii)对抗体文库实验筛选所需功能；和iv)以 反馈分析实验结果作进一步设计和优化。

前导结构模板获自在VEGF和抗VEGF抗体之间形成的复合体的可获 得的X-射线结构。将VEGF和母体抗-VEGF抗体的复合结构命名为1BJ1， 而在VEGF和成熟抗-VEGF抗体之间形成的复合结构命名为1CZ8。来自 1CZ8结构模板的结果与来自1BJ1的结果在所扫描序列的相对排列次序 上相似。模型化的结构或结构集合或集合均值也可以用于筛选序列。VH FR123(SEQ283)的前导序列按照Kabat分类取自鼠抗-VEGF抗体。校准利 用单一前导序列建立的HMM并用于搜索源自Kabat数据库(Johnson，G和 Wu，TT(2001)Nucleic Acids Research，29，205-206)的人重链种系序列数据 库和/或人序列数据库(包括人种系和人源化序列)。列出在期望值或E-值 以上的所有序列命中并利用HAMMER 2.1.1软件包进行比对。在从命中列 表中除去冗余序列后，前导HMM的其余命中序列形成命中文库。来自人 VH种系的命中序列与前导序列的序列同一性为40到68％，而来自源于 Kabat数据库(该数据库被解析为fr123片段以便增加搜索的敏感性以及 它们的相对排序)(如果包含人起源的免疫球蛋白序列则使用其它数据库) 的人免疫球蛋白序列的命中序列的对应序列同一性为～30到75％。通过 利用程序TreeView 1.6.5( http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)可 以分析命中序列之间的进化距离。

AA-PVP表给出了每个位置上每种氨基酸残基出现的数目。在来自人 VH种系的命中序列与来自源于Kabat的人VH序列的命中序列之间有一些 差异：来自在结构上重要以稳定靶抗体等的支架的氨基酸的非人起源的氨 基酸。如果仅使用抗体结构的话，可以进一步在计算机上对这种过滤的变 体图谱进行筛选从而反映结构相容性的排列顺序。简而言之，使用人起源 的不同的数据库进行构架优化将提供多样的但是有效的氨基酸的选择来 进行构架优化，包括以改善的结合亲和力和稳定性的人源化。随着我们在 开发治疗性抗体中知识的增加，越来越多的抗体序列数据被积累并且使用 本发明指导我们的设计。不需要在前的假设来假定关键位置和与那些位置 相关的氨基酸。因为使用本发明的方法自动揭示了这种信息，因此随着当 更多的数据被积累时它们在数据库中出现的增加，其将更好地被限定。可 以使用基于结构的标准，对变体进行重作图或区分优先次序来包括其他可 能有利的突变体。基于结构的能量评分提供了另一种方式来对命中变体文 库在每个位置的变体的出现进行重新作图，所述命中变体文库起初基于选 自蛋白质数据库的序列的作图进行构建。一些使用频率截止值的过滤可以 减少需要通过计算机筛选来评价或被实验文库直接靶向的组合序列。即使 对变体图谱应用了截止值，在进行实验筛选的最终序列中，仍旧有大量的 组合序列需要进行评分和评价。

应用基于结构的评分来筛选命中文库及其形成命中变体文库的组合 序列。使用主链依赖型旋转异构体文库，通过使用程序SCWRL_(版本 2.1)，以在每个残基位置上来自命中变体文库的相应氨基酸变体的旋转异 构体来取代在1CZ8或1BJ1中的抗-VEGF抗体的VHFR123的侧链(Bower MJ，Cohen FE，Dunbrack RL(1997)JMB 267，1268-82)。在存在和缺乏抗原 VEGF的结构的情况下，使用在CONGEN中[Bruccoleri和Karplus(1987) Biopolymers 26：137-168]的Amber94力场，使用最优旋转异构体和能量最 低化对结构进行优化后，使用能量项目或它们与对于每个项目的标度因子 的组合来进行评分。

设计的构架VH fr123相对于鼠对照，与结构具有良好的结构相容性。 利用设计序列与来自人种系或人源化构架的那些的系统发生距离分析，也 对如部分由其数据库限定的构架优化的人样特征进行评价。

对如上所述来自命中变体文库的变体图谱进行过滤以便减小可能的 文库规模，同时在消除一定氨基酸之后和/或通过基于它们与结构支架的相 容性来筛选序列而保持大多数获自命中变体文库的优选残基，所述氨基酸 具有比截止值低的出现率。

以简并寡核苷酸靶向上面构建的命中变体文库。将上面构建的简并核 酸文库克隆入噬菌体展示系统并基于噬菌体展示抗体与包被到96孔板上 的固定VEGF的结合来选择噬菌体展示抗体(ccFv)。将文库置于噬菌体展 示载体pABMD12中，其中抗-VEGF的VH被所述文库所替代。作为结果， VL和多种由文库生成的VH将配对以形成抗-VEGF的功能性ccFv。随后 利用噬菌体展示文库对于固定的VEGF蛋白抗原作进一步淘洗(panning)。

为了生成能够覆盖广泛散布的简并性位置的文库，在设计文库的位点 上以简并性位置合成多种重叠性简并DNA寡核苷酸。组装方法由两个 PCR反应，组装PCR和扩增PCR组成。设计组装寡核苷酸，35-40链节， 被15-20个碱基重叠，平均熔点温度为大约60℃。产生另外一对扩增寡核 苷酸引物(Amp93和Amp94)进行设计产物的最后扩增。因此，所述组装 PCR包括：在最终总浓度为8μM，dNTP 0.8μM，1×pfu缓冲液(Strategene)， 和2.5单位的pfu turbo(Strategene)中等量的组装寡核苷酸引物。热循环如 下进行：94℃×45″，58℃×45″，72℃×45″进行30个循环以及在72℃上 进行10分钟的最后延伸。将PCR产物混合物稀释10倍并且用作扩增PCR 的模板，其中所有试剂都保持相同，除了加入最终浓度为1μM的扩增引 物以外。热循环如下进行：94℃×45″，60℃×45″，72℃×45″进行30个 循环以及在72℃上进行20分钟的最后延伸。将最终产物(VH文库)纯化， 用HindIII和StyI消化，并且最后亚克隆入载体pABMD12中以替换原始 的鼠VH。利用文库电转化TG1感受态细胞，其又通过辅助噬菌体KO7 (Amersham)扩增和救获(rescue)，随后按照标准方法在30℃下过夜生产文 库噬菌体。

为了筛选上面实施例中所述构建的文库，将纯化的同型二聚VEGF蛋 白(Calbiochem)以指定浓度稀释在包被缓冲液(0.05M NaHCO3，pH 9.6)中 并于4℃过夜固定在Maxisorb孔(Nunc)上。随后在将稀释于PBS中的噬 菌体文库应用在孔中于37℃温育2小时之前，将经包被的孔在5％奶中于 37℃封闭1小时。温育混合物还常规包含2％的奶以使非特异性结合最小 化。在温育结束时，洗涤孔并且随后在感染TG1细胞之前通过1.4％的三 乙胺洗脱结合的噬菌体，在所述感染之后由KO7辅助噬菌体进行拯救来 扩增。为了扩增所述噬菌体，随后在收获噬菌体文库之前在存在羧苄青霉 素和卡那霉素时将感染的和拯救的TG1细胞于30℃过夜生长。将扩增的 噬菌体用作输入文库进行下一轮淘洗。同时，随后对来自第5轮等的淘洗 的单个克隆随机取样进行噬菌体ELISA，其中将证实与固定VEGF的特 异性结合，并且证明从第5轮到第7轮淘洗100％的阳性。最后，从第5 轮淘洗(P5)开始，对在2xYT/羧苄青霉素(100μg/ml)/卡那霉素(70μg/ml) 的平板上生长的分离克隆取样测序，以便确定针对设计的命中位置和命中 序列。

图1C显示选定的抗-VEGF抗体的全长VL的氨基酸序列(与Baca等 (1997)J Biol Chem 272：10678-10684中人源化VL的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，和Kim等(1993)Nature 362：841-844中的小鼠抗-VEGF单克隆 抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：284)进行比较)，VL/CDR，和VL/FR的氨 基酸序列。

图1D显示选定抗-VEGF抗体的全长VH的氨基酸序列(与Baca等 (1997)J Biol Chem 272：10678-10684中人源化VH的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)，Chen等(1999)J.Mol.Biol.293：865-881的亲和力成熟VH的氨基 酸序列(SEQ ID NO：56)，以及Kim等(1993)Nature 362：841-844中的小鼠 抗-VEGF单克隆抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO：283)进行比较)，VL/CDR， VH/CDR，和VH/FR。

为了与其它方法生成的抗-VEGF抗体进行直接比较的目的，本发明中 公开的人源化VL(SEQ ID NO：1)与Chen等(1999)J.Mol.Biol. 293：865-881中所述抗体Y0317的VL相同；而本发明中公开的VH(SEQ ID NO：55)与Chen等(1999)，同上中所述的抗体Y0192的VL相同。本发 明中公开的人源化和亲和力成熟VH(SEQ ID NO：56)与Chen等(1999)，同 上中所述的抗体Y0317的VH相同。

选定的优化VH构架也与人源化VH序列聚类在一起，与人种系VH3 家族的系统发生距离非常近，而鼠VH构架与优化VH构架和人种系非常 远。命中序列相对于VH的完整人免疫球蛋白所有组成成分的系统发育分 析提示它们实际上与人种系家族III关系最近。

这支持这样的结论，即本发明的方法可以用于以优化抗体的完整人或 人样序列设计优化的构架，这依赖于人样序列和与结构模板或来自集合结 构或结构平均值的模板的相容性之间的很好平衡。

利用我们所述的发明方法，我们发现多种重链(例如，SEQ ID NO：70， SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：75)人源化构架在构架优化后具有比母体 或参考抗-VEGF抗体序列(SEQ ID NO：55)更高的结合亲和力。这种改进 主要是来自由构架人源化作用单独带来的结合速率(Kon)的较大提高和脱 离速率(Koff)的小的降低。图2A显示5种抗体，母体抗体(hAB1)和利用 BIAcore生物传感器选自设计文库的抗-VEGF抗体的优化构架(hAB2， hAB3，hAB5)的亲和力数据。所述测量是通过测量当纯化的抗体结合其抗 原(VEGF)时SPR单位(y-轴)对时间(x-轴)的变化而实施的，所述 抗原(VEGF)于25℃固定于CM5生物芯片上。两种人源化的构架hAB2 和hAB3在构架优化后在结合亲和力(以单链形式)方面是文献中报道的 母体/参考抗-VEGF抗体序列(Presta LG，Chen H，O′Connor SJ，Chisholm V， Meng YG，Krummen L，Winkler M，Ferrara N(1997)Cancer Res. 57，4593-4599)～4倍，这两种人源化抗体在人源化后应当具有～2倍于对 应鼠抗体的结合亲和力。

2.候选抗体的选择

1)ccFv-杂二聚体卷曲螺旋稳定化的抗体

本发明提供一种新的策略以使VH和VL杂二聚体稳定化。设计独特 的杂二聚体化序列对并且用来生成Fab样的功能性人工Fv片段ccFv (US200030027247A1)。这种序列对特异性地形成卷曲-螺旋结构并且介导 GABAB-R1和GABAB-R2受体的功能性杂二聚体化作用。每种杂二聚体 序列对分别源自杂二聚体受体GABABR1和R2的卷曲螺旋结构域。为了 改造抗体VH和VL杂二聚体的目的，将序列GR1和GR2的对分别融合 到VH和VL片段的羧基末端上。因而VH和VL，ccFv(卷曲螺旋Fv)的 功能性配对，由GR1和GR2的特异性杂二聚化作用介导。表达具有分子 量为35kDa的重组ccFv抗体片段。

将抗-VEGF抗体的VH和VL序列克隆到表达两种融合蛋白的载体 中：VH-GR1和VL-GR2-pIII融合蛋白中。表达的VH-GR1和VL-GR2-pIII 融合蛋白分泌入壁膜间隙中，在那里它们进行杂二聚体化以通过卷曲-螺旋 结构域形成稳定的ccFv抗体。为了在丝状噬菌体的表面上展示ccFv抗体， 将上面的载体转化入细菌TG1细胞中，用KO7辅助噬菌体对其作进一步 超感染。

2)衔接子(adaptor)介导的噬菌体展示系统

在常规的噬菌体展示系统中，将目标蛋白融合到噬菌体衣壳蛋白如 pIII上以便在噬菌体的表面进行展示。这种融合蛋白将与由辅助噬菌体如 KO7提供的野生型噬菌体蛋白一起组装成噬菌体颗粒。将如 US20030104355A1中所述的称作衔接子定向的展示系统的新噬菌体展示 系统用来将各种抗体片段展示于噬菌体表面。通常，抗体片段如单链可变 片段由一对衔接子携带到噬菌体颗粒的表面上，所述一对衔接子特异性形 成杂二聚体，一种融合以表达载体中的展示蛋白而另一种融合了辅助载体 中的噬菌体衣壳蛋白。特别地，杂二聚体序列对GR1和GR2的每个分别 源自杂二聚体的受体GABABR1和R2的卷曲螺旋结构域。为了展示抗体 片段的目的，将序列GR1在原核表达载体中融合到抗体片段的羧基末端 上，而GR2则融合到噬菌体基因组壳体蛋白III的氨基末端上。所述杂二 聚体通过一种序列对形成，所述序列对特异性形成卷曲-螺旋结构并且在通 过辅助噬菌体救获携带表达载体的大肠杆菌之后介导抗体片段的功能性 展示。

3)候选抗体文库的制备

基于PCR组装，利用标准的PCR方法制备候选抗体文库的DNA。随 后将所述DNA进行限制性核酸内切酶消化，纯化，并且连接入如上所述 适合的载体中。连接后，将DNA转化入TG1细胞中。通过辅助噬菌体感 染从TG1细胞中制备噬菌体。将感染的TG1细胞于30℃过夜培养于 2xYT/Amp/Kan中。通过PEG/NaCl由培养物上清液沉淀噬菌粒颗粒，并 将其重悬于PBS中。

4)候选抗体文库的选择

使用候选抗体的噬菌体文库相对于固定的VEGF进行文库选择。纯化 的重组人VEGF165购自Calbiochem(批号：80054-994)。人VEGF的165 个氨基酸残基变体的糖基化的，二硫化物连接的同型二聚体具有42kD的 表观分子量(Burke等，Biochem.Biophys.Res.Commun.207：348(1995)； Neufeld等，Prog.Growth Factor Res.5：89(1994)；Leung等，Science 246： 1306(1989))。通常，在结合的温育期后，洗去未结合的噬菌体，洗脱结合 的噬菌体并扩增进行下一轮淘洗。过去已经举例说明了通常用于噬菌体展 示的类似方法(Barbas等，Phage display：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)。

例如，首先将100μl的2μg/ml纯化人重组VEGF165的等分试样固定 到96孔板的每孔上。在PBS中以5％的牛奶进行封闭后，将2％牛奶/PBS 中的文库噬菌体的等分试样加入孔中并进行温育。随后将含有溶液的噬菌 体弃去，并洗涤孔。最后以100mM三乙胺洗脱结合的噬菌体，并将其加 入到TG1培养物中进行感染。随后将由感染的TG1细胞制备的噬菌体用 于下一轮淘洗。随后通过对于VEGF抗原蛋白的ELISA确认阳性克隆， 其中通过用针对噬菌体外壳蛋白pVIII的HRP缀合的抗-M13抗体温育来 检测结合到固定抗原上的噬菌体。使用底物ABTS[2，2′连氮基-二(3-乙基苯 并噻唑啉-6-磺酸)]进行HRP活性的测量。对确认为阳性的那些克隆的DNA 进行测序。随后将取样的DNA序列翻译成氨基酸序列。将选定的序列组 合以生成新的变体。将选定的变体进行表达以生产可溶性抗体片段进行亲 和力评估。

3.来自人PBLs的Vk和Vl的扩增

从人外周血淋巴细胞(PBLs)中提取总RNA，并用作第一链cDNA合 成的模板，所述cDNA合成是通过利用寡-dT引物和反转录酶以标准方法 进行的(第一链cDNA合成试剂盒购自Roche Applied Science)。通过PCR 由单链cDNA扩增抗体轻链可变基因。设计PCR引物并基于Kaba V-基因 数据库进行合成(表1)。为了扩增Vk基因的全部6个亚家族，使用靶向 40个种系人Vk基因5’末端的6种简并引物和靶向5种人Jk片段基因3’ 末端的3种简并引物。为了进行Vl基因全部10个亚家族的PCR扩增， 使用靶向31个种系人Vl基因5’末端的8种简并引物和靶向4种Jl片段 基因3’末端的2种简并引物。将PCR扩增的Vk和Vl基因进一步克隆 入噬菌粒载体中以生成噬菌体展示文库，所述载体携带人源化抗-VEGF抗 体VH。

             表1：Vk和Vl扩增的引物   Vk   ATTAATGGATCCGMCATCCRGWTGACCCAGTCTCC   ATTAATGGATCCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC   ATTAATGGATCCGAAATWGTGWTGACRCAGTCTCC   ATTAATGGATCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC   ATTAATGGATCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCC   ATTAATGGATCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC   Vl   ATTAATGGATCCCAGTCTGTGYTGACKCAGCC   ATTAATGGATCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCC   ATTAATGGATCCTCCTATGAGCTGACWCAGCyAC   ATTAATGGATCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC   ATTAATGGATCCCTGCCTGTGCTGACTCAGCC   ATTAATGGATCCCAGCYTGTGCTGACTCAATC   ATTAATGGATCCCAGSCTGTGCTGACTCAGCC   ATTAATGGATCCAATTTTATGCTGACTCAGCCC   ATTAATGGATCCCAGRCTGTGGTGACYCAGGAG   ATTAATGGATCCCAGGCAGGGCTGACTCAGCC   Jk   TTAATTGCGGCCGCTTTGATYTCCASCTTGGTCCC   TTAATTGCGGCCGCTTTGATATCCACTTTGGTCCC   TTAATTGCGGCCGCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC   Jl   TTAATTGCGGCCGCTAGGACGGTSASCTTGG   TTAATTGCGGCCGCGAGGACGGTCAGCTGGG

4.可溶性抗体片段的表达

可以在原核(大肠杆菌)和真核(酵母)表达系统中生成以单链可变 片段(scFv)形式存在的可溶性抗体片段用于生物物理分析的目的。scFv的 构建包括如在前研究所述的通过(G4S)3接头连接的VH片段和VL片段 ((Barbas等，Phage display：a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)。用于原核表达的表达载体例示于图7中。制备感 受态细菌细胞，例如，BL21，并用携带抗体片段的载体按照本领域已知的 方法进行转化(Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor， N.Y.，(1989)；Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory， 1988)。在适于蛋白表达的条件下培养转化的细胞。这些条件是本领域技术 人员公知的并且因此不在此详述。利用本领域已知的常规方法收获表达的 抗体并用于进一步分析。使用购自Invitrogen的Pichia表达试剂盒并按照 生产商的说明书进行酵母中的表达。所有的抗体都在C末端用HA-His6 标志物进行标记，并通过NTA和Superdex 75柱进行纯化。为了测定抗 体片段的纯度和表达产率，通过SDS-PAGE凝胶分析20μl纯化的蛋白质， 并通过用考马斯亮蓝R-250染色进行显影。

5.选定的抗体片段的亲和力分析

利用BIAcore Biosensor Assay测定抗体亲和力。通过胺偶联将VEGF 蛋白(购自Calbiochem)偶联到CM-5生物传感器芯片(ship)上。固定后， 将具有200-1000反应单位的VEGF的CM-5芯片在使用前保持于4℃。所 有实验都在25℃或35℃上进行。利用Biacore 1000(Biacore AB，Sweden) 将PBS缓冲液中的每种样品以20μl/min的流速注射到VEGF表面上，并 在每个循环结束时通过10μl的甘氨酸-HCl，PH 1.5将结合的抗体从芯片上 去除。记录每个传感图(sensorgrams)并相对于PBS基线进行标准化。为了 测定抗体亲和力，包括缔合和解离速率常数，利用BIAevalvation version 3 软件通过拟合1∶1 Langmuir结合模型的结合曲线对传感图进行分析。

6.抗体片段稳定性的评估

为了评估所定义抗体片段的稳定性，将PBS中的可溶性抗体分别在 4℃，37℃，和42℃下进行温育。抗体浓度为0.5μM或1μM。在指定的温 育时间后，将抗体溶液置于25℃下1小时，随后在Biacore 1000中直接注 射到VEGF表面上。记录抗体结合RU，并用于稳定性分析。

                               序列表

<110>钟苹羽

     罗培志

     凯文C·王

     马克，赫斯荷

     李艳

<120>针对血管内皮生长因子的人源化抗体

<130>26050-709.601

<150>US 60/284,407

<151>2001-04-17

<150>US 10/125,687

<151>2002-04-17

<150>US 10/153,176

<151>2002-05-20

<150>US 10/443,134

<151>2003-05-20

<150>US 10/723,434

<151>2003-11-26

<160>156

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>2

<211>107

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>VL

<400>2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>3

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>3

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1               5                   10              15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pto Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>4

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>5

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>5

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro His Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                   80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>6

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Hls Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>7

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>7

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ser Leu Leu Val

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arh Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>8

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln TVr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>9

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>9

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro His Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>10

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>10

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>11

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>11

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro His Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>12

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>12

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Thr Leu Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro His Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>13

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>13

Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

                50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>14

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>14

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Prp Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>15

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>15

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Lys Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>16

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Ser Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>17

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>17

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro His Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>18

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro His Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>19

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Thr Pro Tyr

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>20

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>20

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Gly Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>21

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>21

Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>22

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>22

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr

            20                  25                  30  

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>23

<211>107

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>VL

<400>23

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Ala Ile Lys

            100                 105

<210>24

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>25

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>25

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Asn Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pno

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>26

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Try Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>27

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>27

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>28

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>28

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>29

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>29

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Asn Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>30

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>30

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Asn Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pno Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Ala Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>31

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>31

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Asn Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>32

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>32

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>33

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>33

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Als Thr Ile thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>34

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>35

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>35

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1              5                   10                  15

Glu Arg Ala Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Gln Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>36

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>36

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Thr Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp

            20                  25                  30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Gly Ala Thr Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Thr Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

            100                 105

<210>37

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>37

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Arg Asn Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

            100                 105

<210>38

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Thr Thr Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

           100                 105

<210>39

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Arg Asp Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>40

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>40

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Thr Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>41

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>41

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Tyr Asp Tyr

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

            100                  105

<210>42

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>42

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ile Ala Pro Lys Val Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Pro Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>43

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>43

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr

            20                  25                  30

Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Thr Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                  105

<210>44

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>44

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Thr Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Arg Asn Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Ser Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ile Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>45

<211>107

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>45

Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1               5                   10                  15

Asp Thr Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Ile Thr Asn Asp

            20                  25                  30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

        35                  40                  45

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

    50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65                  70                  75                  80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp

                85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>46

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>46

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly ser Asn

            20                  25                  30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Leu Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Leu

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Thr Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>47

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>47

Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Tyr Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Met Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>48

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>48

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Met Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>49

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>49

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Arg Ser Ala Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Ala Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>50

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>50

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>51

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>51

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Arg Asn

            20                  25                  30

Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Phe Leu

        35                  40                  45

Met Tyr Gly Asn Asp Glu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala AsP Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>52

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>52

Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Met Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>53

<211>110

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>53

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn

            20                  25                  30

Asn Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>54

<211>111

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VL

<400>54

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Arg Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

            20                  25                  30

His Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

        35                  40                  45

Leu Ile Tyr Ala Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

    50                  55                  60

Ser Asp Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Ser Gly Leu

65                  70                  75                  80

Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser

                85                  90                  95

Leu His Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

            100                 105                 110

<210>55

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>55

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Tnr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>56

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>56

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>57

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>57

Glu Gly Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>58

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Ser Gln Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Ala Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>59

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>59

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>60

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>60

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gl

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Arg Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp F

    50                  55                  60

Lys Arh Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>61

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>61

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

            85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

        100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

    115                 120

<210>62

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>62

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Leu Asp His Phe

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>63

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>63

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Tyr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala His Glu Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>64

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>64

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Leu Asp His Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

 65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Try Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>65

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>65

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>66

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>66

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>67

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>67

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tvr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser Hls Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>68

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>68

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Trr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asn Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>69

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>69

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>70

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>70

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>71

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>71

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Asn Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>72

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>72

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>73

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>73

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>74

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>74

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>75

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>76

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>76

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>77

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>77

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Lys Ala T

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>78

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Ala Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Let Thr Phe Ser Leu Asp Asn Ser Lys Asn Pro Pro Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His TrP Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>79

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>79

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Asn Ser Lys Ser Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>80

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>80

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>81

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Gln Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>82

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>82

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Typ Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>83

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>83

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Gln Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>84

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>84

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Thr Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>85

<211>122

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH    

<400>85

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly

            20                  25                  30

Leu Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Gly

        35                  40                  45

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Lys

    50                  55                  60

Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu

65                  70                  75                  80

Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

                85                  90                  95

Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp

            100                 105                 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>86

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>86

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Thr His Tyr

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Asn Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser Hls Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>87

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>87

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ala His Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Val Pro Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>88

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>88

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ala His Tyr

            20                  25                  30

Gly Val Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>89

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>89

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Phe

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Gln Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>90

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

400>90

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

                5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Asp His Phe

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>91

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>91

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>92

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>92

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser His Phe

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>93

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>93

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser His Phe

            20                  25                  30

Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Val Pro Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

 <210>94

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>94

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Prp Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Ser Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Try Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ary Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>95

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>95

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Glu Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>96

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>96

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Tyr His Tyr

            20                  25                  30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Gln Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>97

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>97

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Tyr Ser Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>98

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>98

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Asp His Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Typ Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>99

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>99

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser his Trp Try Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>100

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>100

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>101

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>101

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>102

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>102

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>103

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>103

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>104

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>104

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>105

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>105

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

            20                  25                  30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>106

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>106

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pno Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Phe

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>107

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>107

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Leu Ser His Tyr

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe

    50                  55                  60

Thr Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>108

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>108

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ser His Phe

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Pro Asp Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>109

<211>123

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH

<400>109

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asn Phe Ser His Phe

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val

        35                  40                  45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>110

<211>123

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>VH

<400>110

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Phe

            20                  25                  30

Gly Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tpr Val

        35                  40                  45

Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Glu Phe

    50                  55                  60

Lys Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

            100                 105                 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>111

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>111

Gly Phe Asp Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

1               5                   10

<210>112

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>112

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

1               5                   10

<210>113

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>113

Gly Tyr Ser Leu Asp His Tyr Gly Met Asn

1               5                   10

<210>114

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>114

Gly Tyr Ala Leu Asp His Phe Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>115

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>115

Gly Tyr Asp Phe Tyr Asn Tyr Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>116

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>116

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn

1               5                   10

<210>117

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>117

Gly Tyr Ser Phe Asp His Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>118

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>118

Gly Tyr Asp Phe Ser Asn Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>119

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>119

Gly Tyr Asp Phe Ser His Phe Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>120

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>120

Gly Tyr Asp Phe Ala His Tyr Gly Val Asn

1               5                   10

<210>121

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>121

Gly Tyr Asp Phe Asp His Phe Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>122

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>122

Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Tyr Gly Met Asn

1               5                   10

<210>123

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>123

Gly Tyr Asp Phe Ala Ser Phe Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>124

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>124

Gly Phe Asn Phe Thr His Tyr Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>125

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>125

Gly Tyr Asp Phe Ala His Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>126

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>126

Gly Tyr Asn Phe Tyr His Tyr Gly Val Asn

1               5                   10

<210>127

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>127

Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>128

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>128

Gly Tyr Asn Phe Tyr Ser Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>129

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>129

Gly Tyr Asp Phe Ser His Phe Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>130

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>130

Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>131

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>131

Gly Tyr Asp Phe Thr His Phe Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>132

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>132

Gly Tyr Asp Leu Ser His Tyr Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>133

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>133

Gly Tyr Asn Phe Ser His Phe Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>134

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>134

Gly Tyr Asn Phe Ser His Phe Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>135

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR1

<400>135

Gly Tyr Asp Phe Thr His Phe Gly Leu Asn

1               5                   10

<210>136

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>136

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala His Glu Phe Thr

1               5                   10                  15

Arg

<210>137

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>137

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Arg

<210>138

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>138

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Thr

1               5                   10                  15

Arg

<210>139

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>139

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Thr

1               5                   10                  15

Arg

<210>140

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>140

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Val Pro Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>141

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>141

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>142

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>142

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>143

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>143

Trp Ile Asn Tyr Tyr Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>144

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>144

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>145

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>145

Trp Ile Asn Thr Asn Asn Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>146

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>146

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Val Pro Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>147

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>147

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>148

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>148

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>149

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>149

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>150

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>150

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Asp Phe Lys

1               5                    10                 15

Arg

<210>151

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>151

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Asp Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>152

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>152

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Lys

1                5                  10                  15

Arg

<210>153

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>153

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Thr

1               5                   10                  15

Ary

<210>154

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>154

Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Glu Thr Thr Tyr Ala Pro Asp Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg

<210>155

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>155

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Pro Glu Phe Lys

1                5                  10                  15

Arg

<210>156

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>VH/CDR2

<400>156

Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Thr Thr Tyr Ala His Glu Phe Lys

1               5                   10                  15

Arg