血管内皮细胞PINK1乙酰化抑制剂及应用
阅读：428发布：2020-05-12
专利汇可以提供血管内皮细胞PINK1乙酰化抑制剂及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种能够抑制血管内皮细胞PINK1乙酰化的药物组合物，其特征在于含有虾青素。并公开了该药物组合物在制备 预防 或/和 治疗 心 血管 疾病 药物中的应用，所述心 血管疾病 包括但不限于动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛、脑血栓、 高血压 、高血糖、高血脂、心肌梗死、缺血性 肺 心病等疾病。，下面是血管内皮细胞PINK1乙酰化抑制剂及应用专利的具体信息内容。
血管内皮细胞PINK1乙酰化抑制剂及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种能够抑制血管内皮细胞PINK1乙酰化的药物组合物，具体涉及一种含有虾青素的药物组合物，其能够抑制血管内皮细胞PINK1乙酰化。
背景技术
[0002] 近年来随着研究深入，血管内皮细胞不再被认为是一个简单的屏障，而是一个复杂的器官。这些细胞在维持血管稳定性中发挥着极为重要的作用，内皮细胞分泌的各种调节素是调节血管紧张性，血液粘稠度，免疫反应和细胞生长的必要因子。内皮细胞所含的一氧化氮合酶(eNOS)催化产生一氧化氮(NO)，NO一经释放入血液，作用至邻近的平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶将GTP转化为cGMP，cGMP依赖的蛋白激酶进一步活化，导致血管舒张。但在病理状态下血管内皮细胞内环境的稳定性容易受到干扰，最终导致血管内皮功能障碍。
[0003] 我国今年来代谢性疾病发病率快速上升，该疾病往往是造成血管病变的主要元凶，如高脂血症、糖尿病及高尿酸血症等。研究表明2型糖尿病(T2DM)患者心血管疾病的风险，比非糖尿病患者要高2-4倍，而中年糖尿病人群中心血管疾病的发生率可高达44％,且糖尿病人群心血管疾病的死亡率达到了2.7％。脂肪组织作为一个新的内分泌器官已被重新认识，肥胖，尤其是中心性肥胖，堆积的内脏脂肪会分泌多种生物活性物质；另外，高胆固醇血症时，氧自由基过多形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，这些有害物质对血管内皮细胞都具有毒性作用，是导致血管内皮功能障碍的重要因素。血管内皮损伤既是众多慢性疾病的结果，又是其它疾病的起始。糖尿病的一些慢性并发症均与内皮血管损伤有关，如糖尿病视网膜病变，神经病变，糖尿病肾病，糖尿病足等。已有研究表明血管内皮细胞受损并内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因子，即动脉粥样硬化是动脉壁对内皮细胞损伤的一种慢性炎症反应，反映血管内皮功能的相关因子，同样也能预测动脉粥样硬化的严重程度。血管内皮的修复也已成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。
发明内容
[0004] 本发明人在预实验中发现，糖尿病和高脂血症患者动脉内皮出现α-平滑肌肌动蛋白 (α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)异常堆积、Collagen IV(胶原IV)高表达和高脂血症患者内皮依赖性血管舒张功能减退，提示，糖尿病人和高脂血症患者明显出现血管内皮功能损伤迹象。然而，代谢性疾病造成血管内皮损伤的细胞生物学关键点目前尚未明了。另外，课题组的前期研究结果显示，自然发病2型糖尿病大鼠(OLTEF)在病程早期机体处于糖调节受损阶段出现糖耐量受损和高血脂时，血管内皮细胞已发生凋亡。细胞凋亡，又名程序性细胞死亡(Program Cell Death)，是细胞受到损伤时由线粒体参与并主导的机体清除受损细胞的自我保护性机制，但内皮细胞凋亡的结果往往是血管内皮受损。课题组随后的预实验结果表明，糖尿病和高脂血症患者动脉血管内皮线粒体自噬相关蛋白LC3和PINK1 表达水平明显下降，结果提示：糖尿病等代谢性疾病血管内皮细胞线粒体稳定性遭到干扰。
[0005] 乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它是在乙酰基转移酶的催化下，在蛋白质特定的位置添加乙酰基的过程，是细胞通过翻译后修饰控制基因表达、蛋白质活性和调节细胞内信号转导等生物活动的一种机制。乙酰化对磷酸化有调节作用。磷酸化也是一种重要的蛋白质翻译后修饰，PINK1的磷酸化是启动PINK1,P-Ub,Parkin通路的活性状态，PINK1 的磷酸化位点是Ser228/Ser402或Thr257，而邻近激酶功能域(Kinase Domain)中的 Lys347/Lys369是潜在的乙酰化位点。
[0006] 有研究报道PCAF可以介导IL-6等在赖氨酸位点的乙酰化。本发明人在进一步的预实验中发现,在HAEC细胞，PCAF介导IL-6乙酰化PINK1，其结果是干扰了PINK1的磷酸化并抑制线粒体自噬。同时还发现脂毒性物质ox-LDL对线粒体自噬也有抑制作用。IL-6 通过PCAF乙酰化PINK1以干扰PINK1磷酸化，进而抑制线粒体自噬,导致线粒体功能障碍。附图说明
[0007] 图1.T2DM病人和高脂血症病人动脉内皮细胞a-SMA水平。A.激光共聚焦显微镜免疫荧光分析，绿色：VIII因子，红色：a-SMA，蓝色：DAPI，白色箭头所指血管内皮a-SMA 堆积。比例尺：50mm。B.Leica LAS X Hardware Configurator软件扫描分析各例标本a-SMA 含量。C.方差分析和t检验各组a-SMA变化，*与对照组比，P<0.01。
[0008] 图2.Western Blot分析T2DM患者和高脂血症患者动脉内皮Collagen IV的表达。
[0009] 图3.高脂血症病人血管内皮依赖性舒张功能受损(Endothelium-dependent relaxations)。高脂血症病人肠系膜动脉Myograph分析血管内皮依赖性舒张功能，对照为无代谢性疾病。代表性图见(A)，统计结果见(B)。*P<0.05VS对照。
[0010] 图4.T2DM病人和高脂血症病人动脉内皮线粒体自噬相关性蛋白表达降低。A.激光共聚焦显微镜观察血管内皮LC3-I/II表达，绿色：VIII因子，红色：LC3-I/II。B.Western Blot 分析LC3-I/II、Beclin1、PINK1和Parkin在血管内皮的表达。
具体实施方式
[0012] 1.采用线粒体分离试剂A处理心肌组织。
[0013] 2.戊巴比妥麻醉小鼠，打开胸腔剪取左心室心肌，在1.5ml离心管内对剪取的组织进行称重，记录重量。然后用预冷的PBS清洗一次心肌组织。
[0015] 4.随后加入10体积预冷的PBS，冰浴3min。
[0016] 5.放入离心机中，600rpm离心10-20s，弃上清。
[0017] 6.再加入8体积预冷的胰酶消化液，冰浴20min后，放入离心机中600rpm离心 10-20s，弃上清。
[0018] 7.随后加入2体积相应线粒体分离试剂，用于洗去残余的胰酶消化液。放入离心机 600rpm离心15s，弃上清。
[0019] 8.加入8体积预冷的线粒体分离试剂A，并进行匀浆约25次。把匀浆液放入离心机中600rpm，4℃离心5min。
[0020] 9.取出匀浆液，小心将上清转移到另一离心管中，并用11,000rpm，4℃离心10min，得到的沉淀即为线粒体，然后收集上清，并将上清12,000rpm，4℃离心10min，再次取上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。
[0021] 10.用添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体沉淀可以得到线粒体蛋白。BCA法测定线粒体蛋白及细胞浆蛋白浓度，进行后续western blot检测。
[0022] western blot检测相关分子表达水平
[0023] 提蛋白
[0024] 1)腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉小鼠，暴露胸腔剪取小鼠心脏，然后用干净的PBS 清洗小鼠心脏。
[0025] 2)将小鼠心脏的左心室剪下来放入到干净的EP管中，加入适量的PBS并用剪刀剪碎心肌组织，剪碎后将其放到离心机中调整转速为12000rpm，温度为4℃，离心8min，离心完成后小心将上清吸掉。
[0026] 3)将心肌组织取出并用滤纸吸尽水分，然后将其放入到研磨碗中，加入适量的RIPA 裂解液，均匀研磨心肌组织10min，然后静置于冰上10min以充分反应，再次研磨10min 及静置10min，并重复三次。研磨后置于离心机中，4℃、12000rpm离心20min，上清即为所得蛋白样品。取少量蛋白样品做后续蛋白定量。
[0027] 4)计算所得蛋白样品的体积并加入5×上样缓冲液，混匀。
[0028] 5)将蛋白样品置于100℃沸水中煮7min，自然冷却后放于-80℃冰箱。
[0029] BCA蛋白定量
[0030] 1)按比例用双蒸水稀释蛋白标准液，使其浓度呈一定梯度。
[0031] 2)然后，按说明配置BCA工作液并计算出所需要的总量。
[0032] 3)在96孔板中小心加入蛋白标准液和待测样品，注意不要产生气泡。然后，再在相应的孔中加入一定量的BCA工作液。
[0033] 4)随后，将96孔板用锡箔纸包裹住，放入孵箱中孵育1h。
[0034] 5)1h以后，用酶标仪测出每孔的吸光值并根据标准液的吸光值画出标准曲线。然后，根据所得的标准曲线算出每组蛋白浓度。
[0035] 6)跑电泳加样时，根据所得的浓度调整每组的蛋白上样量。
[0036] 配胶、上样及电泳
[0037] 1)将厚薄两块玻璃板用小夹子夹好对齐，往里加满双蒸水，过5min后观察其水平面下降情况以明确有无渗漏。准备两个小烧杯，一个用来装凝胶试剂，一个用来装酒精。按照说明往烧杯中依次加入相应试剂配制下层胶，配好后用转子快速搅拌混匀以免其凝固，然后用1ml的枪快速加入到玻璃板中，并用酒精封胶，静置30min。
[0038] 2)期间配好上层胶。待下层胶完全凝固后，倒掉酒精并用双蒸水冲洗，滤纸吸尽残留水分。
[0039] 3)转子搅拌均匀上层胶，用1ml枪将其加入到玻璃板中，然后迅速、小心插入用双蒸水清洗过的梳子，注意插入时要倾斜一遍且不要产生气泡，如果插得不好，可以快速拔出梳子重新插入，让上层胶静置30min。
[0040] 4)将配好的胶卸下，放入到电泳的内芯中，再把内芯放入槽中，往槽中加入新配的 1X电泳缓冲液，注意内平面要比外平面高，然后再用10ul的枪进行加样。
[0042] 湿转
[0043] 1)电泳完成后，断开电源，取出内芯，小心将嵌入其中的两块凝胶取出，注意不要弄碎凝胶，然后观察marker的位置，将凝胶裁剪成所需的大小，注意操作轻柔，随后将凝胶放入到转膜缓冲液中清洗一下。将事先裁好的PVDF膜用甲醇浸泡使其激活活性便于转膜。
[0044] 2)在转膜夹子中，在白色一边先铺一层海绵，然后铺5层滤纸，然后再铺一层PVDF 膜，然后再把凝胶铺在PVDF膜，轻轻拨弄PVDF膜和凝胶以赶走气泡，然后再在凝胶上铺5层滤纸，最后再铺一层海绵，关闭夹子，放入转膜内芯中转膜。
[0045] 3)转膜夹子小心放到湿转槽中，倒入新配的预冷的转缓液，盖上盖子，放入冰槽中接通电源，恒流270mA转膜2h。
[0046] 牛奶封闭、一抗孵育
[0047] 1)转膜结束后，取出PVDF膜并用丽春红染色以显示蛋白条带，据此剪取所需的蛋白条带，然后用TBST洗涤条带5min×5次。
[0048] 2)50mlTBST溶液中加入2.5g脱脂奶粉配成封闭液，然后将裁剪下来的蛋白条带放入一个小盒子中，倒入封闭液封闭1h。
[0049] 3)1h以后，倒掉牛奶封闭液，重新往小盒子中倒入干净的TBST溶液清洗蛋白条带，清洗3次，每次定时5min。
[0051] 敷二抗、发光
[0052] 1)第二天，将泡沫盒子中的蛋白条带取出，注意不要倒掉一抗，可以回收一抗以备下次重新利用。然后将条带放入一个小盒子中，倒入干净的TBST清洗条带3次，每次 5min。
[0053] 2)用TBST液稀释相对应的二抗，若一抗是兔来源的，就用相应的抗兔二抗，若是鼠来源的，就用抗鼠的二抗，稀释比例一般是1:5000，配成50ml即可。然后将蛋白条带放入其中孵育50min。
[0055] 4)提前打开电脑，打开软件预冷15min，等条带清洗好后，放到滤纸上吸除多余水分。然后关闭灯光配置发光液，用1ml的枪将发光液淋在条带上，
[0056] 注意要均匀，不然影响发光效果，然后将条带放入到电脑中等待发光，保存图片作后续分析。
[0057] 统计学分析
[0058] 应用GraphPad Prism5.01软件进行本实验的统计学分析，实验数据用均数±标准差表示。每组之间的实验数据比较用单因素方差分析(ANOVA)，如果差异显著，再用SNK-q 检验分析相应两组间的显著性差别。当P<0.05时为具有统计学意义。
[0059] 作为细胞能量代谢的主要细胞器，线粒体功能正常与否对细胞生长、增殖、分化和凋亡至关重要。线粒体内设有质量控制(Quality Control,QC)体系以应对各种损伤和应激， QC包括通过线粒体自噬清除受损的线粒体；通过高度动态性的融合与裂变过程重塑线粒体网络；通过线粒体未折叠蛋白反应，拆解错误折叠的蛋白质，以保证线粒体内稳态。然而，当线粒体受损太大时将启动凋亡程序，以清除受损细胞。线粒体功能损伤还将引起线粒体广泛的修复反应，激活多个线粒体修复信号(Mitochondrial Retrograde Signaling)以链接并调节核DNA编码蛋白的表达。
[0060] 线粒体自噬受损将破坏线粒体QC体系，其结果是功能障碍的线粒体不能被及时清除而影响细胞内线粒体的数量和质量，包括线粒体DNA(mtDNA)拷贝数降低和/或发生突变。人类mtDNA是全长约为16.6kb的双链闭环分子。mtDNA编码2种rRNA和22种tRNA，同时还参与细胞呼吸链上4种复合酶中13种多肽的形成。尽管线粒体和细胞核都有DNA 修复系统，但mtDNA更容易发生突变。在哺乳类动物肿瘤细胞，mtDNA含量降低直接影响线粒体呼吸链(Electron Transport Chain,ETC)/氧化磷酸化(OXPHOS)系统，造成ROS 堆积，并通过激活MAPK、NFkB、PI3K/AKT、TGF/Smads等信号通路启动细胞发生上皮-间质转化(Epirhelial-Mesenchmal Transition,EMT)，导致肿瘤细胞侵袭和远处转移。如 ErbB2阳性的乳腺癌细胞，通过β-catenin和mtDNA低拷贝协同作用下调线粒体生物源性转录因子TFAM和PGC-1α，启动EMT，促进肿瘤细胞转移。提示，线粒体功能损伤mtDNA 低拷贝数与EMT的发生相关联。
[0061] 内皮-间质转化(Endothelial-Mesenchymal Transition,EndoMT)是发生在内皮细胞的 EMT，其发生由EndoMT诱导相关转录因子调节，切换“间充质”基因与“内皮”基因表达的“开与关”。其中“内皮”标记性基因有：E-Cadherin、Occludins、Claudins和Cytokoratin等；“间充质”标记性基因有：N-Cadherin、Fibronectin、Vimentin、MMPs、SNAIL和α-SMA等。通过EndoMT，内皮细胞失去细胞极性，失去与基底膜连接等上皮表型，获得较高的迁移侵袭能力和抗降解细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)能力等间质表型，并导致ECM 在内皮细胞异常堆积等细胞生物学改变。ECM主要在间质类细胞表达并转运到细胞外， ECM表达转运失衡并出现细胞内异常堆积是纤维化的重要病理生理过程。正常情况下内皮细胞α-SMA等ECM的表达很低，但病理情况下α-SMA在内皮细胞表达增高并堆积将严重影响内皮细胞功能，甚至引起内皮细胞凋亡。然而，血管内皮细胞中mtDNA与EndoMT 的关系则未见报道。本发明人的预实验结果显示，糖尿病和高脂血症患者动脉内皮mtDNA 含量下降(图1A)，同样，IL-6缓释泵皮下植入小鼠的主动脉内皮和IL-6处理的HAEC 细胞mtDNA拷贝数也都下降(图1B和图1C)，并发生EndoMT和α-SMA等ECM在血管内皮细胞内异常堆积。由此导致血管内皮功能障碍，产生大量ROS，eNOS水平下降，内皮细胞凋亡，db/db糖尿病小鼠主动脉内皮依赖性舒张功能障碍。结果提示，线粒体功能障碍所至的代谢相关性血管内皮功能损伤是通过EndoMT及ECM内皮细胞异常堆积得以实现。
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