在过去的十年里，使阻塞性动脉粥样硬化的血管换血管术的机械方 法已有了很大的改进。经皮经腔冠状血管成形术(PTCA)方法包括但 不限于：气囊扩张、动脉粥样硬化斑切除术、腔内放置斯滕特固定膜、 腐烂脱离(rotablation)和激光切除术。但是，换血管术会导致血栓 形成和新内膜增生，这又会在成功的气囊血管成形术后引起冠状动脉大 面积再狭窄和主动脉冠状动脉的隐静脉帕旁路移植物以及其他冠脉移 植物的再狭窄。另外，内膜增生会在许多股骨浅层血管成形术、颈动脉 内膜切除术和股远侧静脉旁路中引起再狭窄。血管内斯滕特固定膜的引 入有助于减少再狭窄的发生，但这个问题仍然很重要(1-9)。尽管迄今为 止已利用人和动物模型对发生率、时间选择、机理和药理学干预等进行 了广泛的研究，但没有能始终防止冠脉再狭窄的疗法(10-12)。现在我们 仍然非常需要能用于减少或预防再狭窄的组合物和方法。
双膦酸类化合物(Bisphosphonates)(BP)(以前叫做二膦酸类 化合物(diphosphonates))是以两个C-P键为特征的化合物。如果 这两个键位于同一碳原子上(P-C-P)，就将它们称作孪位双膦酸类化 合物。BP是与骨的形成和吸收的调节有关的内源性无机焦磷酸的类似 物。术语“双膦酸盐”一般用于指孪位和非孪位双膦酸类化合物。BP 和焦磷酸类化合物有时可能一起构成聚合物链。BP因其对骨矿质的亲 和力而作用于骨，并且是骨吸收和异位钙化的有效抑制剂。BP或焦磷 酸已在临床上主要用作(a)抗溶骨药，用于骨的破坏增加的病人，尤 其是佩吉特氏病、肿瘤性骨病和骨质疏松症；(b)用于诊断目的的骨 骼标记(与99mTc相连)；(c)异位钙化和骨化病人的钙化抑制剂；以 及(d)加入牙膏中的抗牙结石剂(13)。
发明概述
按照本发明，BP或焦磷酸(本文中统称为“活性成分”)用于治 疗或预防血管的。本文中所用的术语“双膦酸(biphosphonate)(BP)” 表示孪位和非孪位双膦酸类化合物(biophosphonates)。术语“活 性成分”的范围内还包括BP或焦磷酸(pyrophosphate)的聚合物链， 特别是由最多40个BP单体组成的链。优选的活性成分是下式(Ⅰ)表 示的化合物： 其中R代表O或CR1R2基； R1是H、OH或卤素基；和 R2是卤素；任选地被杂芳基或杂环基C1-C10烷基氨基或C3-C8环烷基氨 基(其中氨基可能是伯氨基、仲氨基或叔氨基)取代的直链或支链C1-C10 烷基或C2-C10链烯基；-NHY，其中Y是氢、C3-C8环烷基、芳基或杂芳 基；或者R2是-SZ，其中Z是氯取代的苯基或吡啶基；
本发明因此提供了所述活性成分、所述活性成分的络合物 (complex)或其可药用盐或酯在制备用于预防或治疗血管再狭窄的药 物中的用途。
本发明还提供了治疗再狭窄的方法，该方法包括对需要的个体给药 有效量的所述活性成分、其络合物或其可药用盐或酯。
本发明进一步提供了用于预防或治疗再狭窄的药物组合物，包含作 为活性成分的有效量的所述活性成分、其可药用游离酸、络合物或盐， 任选地加上可药用载体或稀释剂。特别优选的载体是脂质体制剂。
术语“有效量”的意思是指能有效地达到所需治疗结果，即预防或减 少血管再狭窄的活性成分的量。有效量可取决于许多因素，包括：所治疗 个体的体重和性别；医学方法的类型，例如，要抑制的血管再狭窄是否是 在气囊血管成形术后，是否在气囊血管成形术后配置斯滕特固定膜，等等； 活性成分的给药方式(即是系统给药还是直接给药到病变部位)；所用载 体的类型(例如，是迅速释放活性成分的载体还是在一定期间内释放活性 成分的载体)；治疗方案(例如，活性成分是每天给药一次、一日数次还 是几天一次)；影响再狭窄发展速度的临床因素诸如糖尿病、吸烟、血胆 甾醇过多、肾病等；解剖学因素，诸如是否有严重的血管成形术前狭窄、 全部闭塞、左前位下行性冠状动脉特定区域、隐静脉移植物损害、长的损 害、多脉管或多损害PTCA；组合物的剂型；等等。此外，方法上的变化 也可能与剂量有关，诸如PTVA后较大的残余狭窄、重解剖、内膜撕裂、 气囊的适宜大小以及血栓的存在。技术人员通过常规形式的实验应当能基 本上没有困难地确定每种情况下的有效量。
本发明可以用于预防、减少或治疗血管再狭窄，主要但不限于血管 成形术后的冠状再狭窄(coronary restenosis)。血管再狭窄产生 于各种血管成形术操作，包括气囊血管成形术、血管内斯滕特固定膜植 入或其他经皮血管成形术方法(包括冠状动脉、颈动脉和经得起血管成 形术的其他血管的血管成形术)，以及用于产生于血管移植狭窄的再狭 窄(例如在旁路手术后)(16)。此外，本发明还可用于预防、减少或治 疗周围动脉和静脉中的血管再狭窄。
本发明的一个范例性的应用是用于预防和治疗斯滕特固定膜 (stent)内再狭窄。在血管成形术操作中在血管内配置斯滕特固定膜 来支持血管壁，这是一个可广泛接受的医疗方法。但是，尽管血管内存 在斯滕特固定膜，仍常常发生再狭窄。按照本发明，可以给药上述活性 成分，无论是全身性给药还是直接给药到某部位，以预防或抑制这种再 狭窄。可能地，所述活性成分可以用使其掺入到斯滕特固定膜上的方式 配制，这事实上将使所述活性成分直接在某部位给药。活性成分可以用 这样的方式配制，例如将其包含在斯滕特固定膜的涂层中。涂层的实例 是聚合物涂层，例如由聚氨酯或凝胶制成。
按照本发明所用的活性成分可以利用本领域中已知的任何一种常 规技术配制成药物组合物(参见，例如Alfonso等，1995年(17))。 组合物可以制备成各种形式，诸如胶囊，片剂，气溶胶，溶液，悬浮液， 作为医用设备诸如斯滕特固定膜的涂层(参见上文)，等等。此外，本 发明的药物组合物可以用载体配制成适于局部给药的形式，或者配制成 允许活性成分通过皮肤渗透到体内以便起全身作用的释放形式。每种情 况下的优选给药方式将取决于所需释放模式，它通常是在生理学上与患 者的病情、患者接受的其他治疗等最相容的。按照本发明的优选实施方 案，所述活性成分配制成微粒形式。这可以通过将活性成分包封或浸渍 到颗粒，例如聚合物颗粒、脂质囊泡或脂质体中达到。另外，这些颗粒 可以是聚合活性成分的颗粒(参见下文)。特别优选的是所述活性成分 的脂质体制剂。脂质体可以利用本领域中已知的任何方法制备(关于脂 质体的制备方法参见Mnkknen等，1994年(14)和Mnkknen等，(18)。 脂质体可能是带正电荷的、中性的或带负电荷的(负电荷脂质体是目前 优选的)，可能是单层或多层的。有时，也可以使用包含游离活性成分 (即未包封的)和所述包封在脂质体中的活性成分的组合的组合物。
利用本发明的优选实施方案，活性成分是优选地选自能经受细胞内 代谢的化合物的BP。这类的一种优选的活性成分是具有下式(Ⅱ)的 化合物氯甲双磷酸(clodronate)：
氯甲双磷酸，以前的记载是在与骨质溶解相关的肿瘤的治疗中用于 治疗因恶性肿瘤导致的高钙血症(13)，和作为巨噬细胞的抑制剂(14,18)。
其他这样的优选活性成分是分别具有下式(Ⅲ)和(Ⅳ)的羟乙 二磷酸(Etidronate)和Tiludronate：
按照本发明，具有与氯甲双磷酸类似活性的其他BP也是优选的。 这些BP可以在它们模拟氯甲双磷酸的生物活性的能力的基础上进行选 择。这包括，例如：抑制吞噬细胞(例如巨噬细胞和成纤维细胞)的吞 噬活性的体外活性；抑制IL-1和/或IL-6和/或TNF-α从巨噬细胞的 分泌的体外活性；体内活性，例如所测试的BP预防或减少实验动物模 型(诸如象下面的实施例1中描述的大鼠或兔颈动脉导管损伤模型，或 再狭窄的猪模型)的再狭窄的能力；等等。
本发明的另一组优选的活性成分是氨基-BP和具有下列通式(Ⅴ) 的任何其他含氮的BP：
其中X代表C1-C10烷基氨基或C3-C8环烷基氨基，此处氨基可以是 伯氨基、仲氨基或叔氨基；或者X代表NHY，其中Y是氢、C3-C8环烷 基、芳基或杂芳基。
属于该组中的BP据信不会被代谢并已显示在相对低的浓度下能诱 导白介素IL-1的分泌，并且在相对高的浓度下能使巨噬细胞产生编程 性细胞死亡(18)。属于该组中的优选的BP是例如分别具有下列结构式 (Ⅵ)和(Ⅶ)的氨羟二磷酸(Pamidronate)和阿仑特罗 (Alendronate)：
尽管孪位BP是本发明中优选的BP，但非孪位BP，通称之为膦酸类 化合物的BP的一膦酸类化合物(monophosphonates)，也可用作本 发明中的活性成分。
另一种优选的活性成分是具有结构式(Ⅷ)的焦磷酸 (pyrophosphate)：
焦磷酸优选在脂质体中或聚合物颗粒制剂配制并给药。
本发明组合物可包含所述活性成分，该活性成分可以是其游离酸形 式，与金属阳离子诸如钙、镁或有机碱形成的络合物形式，或者可以是 盐或酯形式，或者它们可以聚合成多达40个单体的聚合物。盐可以是 钠、钾、铵或钙盐或与其他任何适宜的碱性阳离子(例如有机氨基化合 物)形成的盐。盐或聚合物可以是直径在大约0.01-10μm范围内，优 选直径在大约0.1-5μm范围内的微粉化颗粒形式。本发明组合物中的 无论是游离酸形式还是盐形式的活性成分可以带有或不带有结晶水(含 水的和无水的)。
通过优选的实施方案，活性成分包封在利用本领域中已知的任何一 种方法制备的脂质体中。本发明中适宜的脂质体优选无毒脂质体，诸如 象用磷脂酰-胆碱磷脂酰甘油和胆固醇制备的那些，例如在下文中描述 的。在许多情况下，使用包封在脂质体中的活性成分使得活性成分经由 胞吞作用被细胞的摄取增加了(14,18)(这种摄取可在治疗效果中起作用)。 下面的实施例中所用的脂质体的直径在0.15nm至300nm之间。不过， 这不是限制性的，而只是一个例子，其他尺寸范围的脂质体也可以使用。
此外，活性成分可以包封或包埋在惰性聚合物颗粒中，诸如象本领 域中已知的任何一种微胶囊、纳米胶囊、纳米颗粒、纳米球、微球、微 粒等(19)。活性成分从这类颗粒的释放可以是可控释放，在有些情况下， 这导致了所述活性成分的长时间和增强的作用和摄取。
用于本发明组合物的药物载体或稀释剂可以是本领域中已知的任 何一种常规固体或液体载体。例如固体载体可以是乳糖、蔗糖、滑石、 明胶、琼脂等。当载体为液体载体时，它可以是例如花生油、磷脂、水 等。当固体载体是用于口服给药时，组合物可以是片剂、硬胶囊剂(例 如明胶胶囊)、粉末剂或糖丸等形式。当使用液体载体时，制剂可以是 糖浆、乳剂、脂质体、软明胶胶囊或无菌可注射液体等形式，诸如脂质 体制剂、含水或无水液体悬浮液或溶液(17)。
注射用的本发明组合物可以选自含有适宜添加剂的乳液、溶液、悬 浮液、胶体溶液等。
本发明的组合物可以利用能有效地将活性化合物转输到合适或所 需的作用部位的任何途径给药。在本发明的优选实施方案中，给药方式 是静脉内注射(i.v.)和动脉内注射(i.a.)(特别适用于在线给药)。 其他给药方式包括肌内注射(i.m.)或皮下注射(s.c.)。这种注射 可以是浓注或输液。该组合物也可以局部给药到动脉的病变部位，例如 借助本领域中已知的合适的渗液性/渗出性气囊。另外的给药方式可以 是借助血管周围释放、气囊或斯滕特固定膜上的释放系统的涂层或借助 本领域中已知的其他任何一种心血管药物释放系统的方法。本发明中也 可以使用上述给药途径的任何组合方式。
要使用的活性成分的剂量也取决于所用活性成分的特定活性、给药 方式(例如系统给药或局部释放)、活性成分的形式(例如是药物形式、 聚合物形式，还是包封在颗粒诸如脂质体中，等等)，以及本质上已知 的其他因素。
按照本发明的优选实施方案，个体用活性成分进行治疗可以是为了 在再狭窄发生前预防其发生。对于预防来说，活性成分可以在血管成形 术操作前、操作中或操作后对个体给药，也可以是这几种给药方式的组 合形式。
按照本发明的另一个实施方案，活性成分对患有再狭窄的个体给 药，目的是减少或治疗再狭窄。在这种情况下，活性成分也可以在发现 了再狭窄后的不同时期对给体给药，单独的或与其他治疗方式结合。
此外，活性成分也可以在可能导致加速动脉硬化的任何其他疾病之 前给药，以及在该方法已开始抑制病情的进一步发展之后急性给药。
附图的简要描述
图1-3是说明在实验大鼠颈动脉导管损伤模型中，包封在脂质体中 的氯甲双磷酸对再狭窄的减少的作用与不含氯甲双磷酸的对照脂质体 对相同大鼠的作用进行对比的结果的条型图。在这些图中：
图1显示了在用含有氯甲双磷酸的脂质体治疗的大鼠中与用对照脂 质体治疗的大鼠比较，平均腔内膜形成和平均新内膜与血管中层比值的 程度。
图2显示了用含有氯甲双磷酸的脂质体治疗的大鼠的狭窄百分数与 用对照脂质体治疗的大鼠的狭窄百分数的对比情况；和
图3显示了在用含有氯甲双磷酸的脂质体治疗的大鼠中与仅用对照 脂质体治疗的大鼠比较，作为平滑肌细胞活力的间接指数和作为总动脉 面积和原始腔面积之间的差值而测定的血管中层面积范围。
实施例
现在将利用非限制性实施例并参照附图来阐述本发明：
实施例1
材料和方法
氯甲双磷酸的脂质体
通过将药物以0.11M,pH7的浓度溶解于去离子水中而制备氯甲双 磷酸的储备溶液。
脂质体制剂
在圆底烧瓶中精确称取38.9mg二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、 118.5mg二硬脂酰-磷脂酰胆碱(DSPC)和38.7mg胆固醇并将它们溶 于20ml氯仿∶甲醇(9∶1)。将烧瓶温和加热，然后在旋转蒸发器中 蒸发溶剂。之后加入20ml水合二异丙醚并将该烧瓶放入水浴中，直至 内容物溶解。加入如上制备的8ml氯甲双磷酸溶液，并将该溶液在55 ℃下超声处理45分钟。有机相在旋转蒸发器中蒸发(55℃,100rpm)。 类似地，可以制备其他含有药物的脂质体。
制得的脂质体的纯化
通过将2.6gr Sephadex G-50溶于40ml水中并稳定化过夜而制 得Sephadex凝胶。分析柱用100ml缓冲液(50mM Mes+50mM  HEPES+75mM NaCl,pH7.2)冲洗。将脂质体加到分析柱上，该分析柱 用缓冲液冲洗。脂质体可以通过其颜色而在分析柱中观察到它的条带。 从分析柱收集大约20滴到每个试管中。
动物
按照耶路撒冷Hebrew大学实验室动物的照料和使用标准，获得动 物并将其关在耶路撒冷Hebrew大学医学系的动物设备中。使用重 350-420g的Sabra种雄性大鼠。动物食用标准实验室食物并随意饮用 自来水。所有体内实验在用80mg/kg氯胺酮和5mg/kg甲苯噻嗪腹膜内 注射达到全身麻醉的条件下进行。
大鼠颈动脉导管损伤模型
通过脖子上的中线切口暴露出远侧左颈总动脉和颈外动脉。左颈总 动脉利用通过颈外动脉引入的2F气囊导管的管腔内通道剥去内皮。导 管利用用盐水足够扩张的气囊通过三次以产生轻微的抗性。然后除去导 管，将颈外动脉结扎，伤口用手术钉关闭。
用7只大鼠组成对照组，6只大鼠组成治疗组(随机选定)。在动 脉损伤前的一天对“治疗组”静脉内注射氯甲双磷酸脂质体(每只大鼠 注射6mg氯甲双磷酸)并在第6天时重复注射。在对照组中，用“空” 脂质体(没有氯甲双磷酸)进行类似注射。
所有动物在损伤14天后利用过量戊巴比妥处死。动脉用150ml 4％ 甲醛溶液pH7.4在100mmHg下灌注固定。将右心房切开，将与灌注系 统相连的18G导管插入左心室。将动脉段切开，切割，轻轻与聚合物分 离，并在相同的固定溶液中后固定至少48小时。将动脉段包埋在石蜡 中并距离600μm切割8-10处，将6μm的切片封固并用Verhoeff弹性 蛋白染剂染色以用于组织学检查。
形态测定分析
玻片由不知道实验组类型的检验员用显微镜检查。每个玻片上的 6-8个切片利用计算机形态测定分析进行评估，切片的平均数据进一步 用作整个玻片的代表用于组间对比。残余的腔、由内弹性层限定的区域 (原始腔)和由外弹性层环成的区域(“总动脉面积”)直接测量。新 内膜增厚的程度表示为新内膜的面积与原始腔之间的比值(％狭窄)， 和新内膜的面积与中层的面积之间的比值(N/M)。中层面积(SMC活 力的间接指数)测定为总动脉面积和原始腔面积之间的差值。
结果
手术操作和处理没有引起动物的死亡或表观发病。
从图1可以看出，在用包封了氯甲双磷酸的脂质体治疗后，平均新 内膜形成和平均新内膜与中层的比值(N/M)的范围明显减小了。用氯 甲双磷酸治疗的大鼠的N/M比值为0.28±0.23，对照组为1.42±0.26 (均值±SD,p＜0.01)。类似地，如图2中所示，治疗组中达到了％狭 窄的明显抑制：治疗组和对照组分别为9.8±7.76和41.53±7.9(均值 ±SD,p＜0.01)。如图3中所示，没有明显的全身性副作用，对躯体的 生长也没有任何影响。
结论：从颈动脉的气囊损伤后的新内膜形成情况可以看出，用含有 氯甲双磷酸的脂质体治疗的大鼠的再狭窄明显减少了。
实施例2
材料和方法
用气囊损伤大鼠和动脉粥样硬化兔的颈动脉模型研究氯甲双磷酸 脂质体注射的抗再狭窄作用。大鼠用含有氯甲双磷酸的脂质体、空的脂 质体(对照)和在溶液中的氯甲双磷酸(另外的对照)进行治疗。氯甲 双磷酸的注射剂量在手术操作前的一天(-1)和/或损伤后的第6天(+6) 为1.5和15mg/kg。兔子(喂食动脉粥样硬化饮食30天后)在气囊血 管成形术之前的一天用氯甲双磷酸脂质体治疗(10mg/kg)。对于大鼠 和兔模型，利用组织学切片的数字面积测量学，分别在损伤后的第14 和30天，测量治疗和对照动物组中动物的腔、新内膜、中层和血管的 面积和体积。
结果
结果显示在下表1中。     治疗类型 动物(No.)    给药天     N/M    ％狭窄     空脂质体 大鼠(20)    -1,+6  1.62±0.1  44.5±2.0    氯甲双磷酸 大鼠(10)    -1,+6  1.2±0.2  40.2±7.2  氯甲双磷酸脂质    体15mg/kg 大鼠(10)      -1  0.45±0.1  15.4±3.4  氯甲双磷酸脂质    体15mg/kg 大鼠(10)    -1,+6  0.35±0.07  12.0±2.3     空脂质体 兔(10)      -1  1.94±0.3  86.6±4.0  氯甲双磷酸脂质    体10mg/kg 兔(10)      -1  1.11±0.2  71.5±2.1   二氧化硅颗粒    1000mg/kg 大鼠(10)      -1  0.8±0.1  24.2±3.8
可以看出，在用空脂质体和在溶液中的游离氯甲双磷酸治疗的组间 没有明显差异(参见上表)，显示出显著的新内膜形成。用装载氯甲双磷 酸的脂质体治疗后，平均新内膜形成、平均新内膜与中层的比值(N/M) 和％狭窄的范围明显减小了。中层面积不受各种治疗的影响，表明对休 眠细胞没有毒害作用。另外，既没有明显的全身性副作用，对骨和躯体 的生长也没有任何影响。显著更有效的治疗是1×15mg/kg(-1)和2× 15mg/kg(-1和+6)注射，在它们之间没有显著差异。在用兔子进行 的研究中观察到没有副作用的类似结果。在减少新内膜形成和％狭窄方 面，氯甲双磷酸脂质体明显有效。
注射二氧化硅颗粒也减少了内膜的形成(表1)。这一作用可归因 于已知的二氧化硅对巨噬细胞的抑制作用。
结果显示，用含有氯甲双磷酸的脂质体进行治疗显著减少了大鼠和 兔模型的气囊损伤后的新内膜形成。既没有明显的全身性和局部副作 用，对身体的生长也没有任何影响。应当注意：尽管已知BP对骨有影 响，但在用氯甲双磷酸的脂质体制剂进行治疗后，既没有观察到对骨的 作用，也没有观察到对骨和血液中的钙和磷的浓度的作用。