再狭窄发生风险的遗传标志物
阅读：64发布：2020-05-13
专利汇可以提供再狭窄发生风险的遗传标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及确定个体植入 支架 后 再狭窄 发生 风 险的方法。该方法基于对样品进行分析以确定选自下列的至少一个单核苷酸多态性(SNP)的基因型：CCNB1基因中的rs350099、rs350104、rs164390和rs875459，以及任选地分别位于CCNA1和CDKN1A基因中的rs2282411和/或rs733590，其中任何所述多态性中某些等位位点的存在标志着发生再狭窄的风险。，下面是再狭窄发生风险的遗传标志物专利的具体信息内容。
1.用于确定个体在植入支架后再狭窄发生风险的方法，其包括：a)从所述个体的样品中获得基因组DNA；b)分析所述样品以确定选自如图3所定义的CCNB1因中SNP1、SNP2、SNP3和SNP4的至少一个单核苷酸多态性(SNP)的基因型，其中SNP1的TT基因型、SNP2的CC基因型、SNP3的GG基因型和SNP4的GG基因型的存在标志着所述再狭窄发生风险。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤b)包括确定所述多态性SNP1和SNP2的基因型。
3.根据权利要求1的方法，其中所述DNA样品获得自唾液、血液或从血液中纯化的白细胞。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其还包括确定如图3所定义的CCNA1因的多态性SNP5的基因型，其中在共显性模型中TT或TC基因型的存在，或者在显性模型中GG基因型的存在标志着所述再狭窄发生风险。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其还包括确定如图3所定义的CDKN1A基因的多态性SNP6的基因型，其中TT基因型的存在标志着所述再狭窄发生风险。
6.用于实施根据权利要求1-5的方法的试剂盒，其包含一组寡核苷酸和试剂，其适于确定选自SNP1、SNP2、SNP3、SNP4及其组合的CCNB1基因至少一种SNP的基因型。
7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述SNP1基因型的确定通过序列SEQ ID NO 7和8的寡核苷酸对来进行。
8.根据权利要求6的试剂盒，其中所述SNP2基因型的确定通过序列SEQ ID NO 9和
10的寡核苷酸对来进行。
9.根据权利要求6的试剂盒，其中所述SNP3基因型的确定通过序列SEQ ID NO 11和
12的寡核苷酸对来进行。
10.根据权利要求6的试剂盒，其中所述SNP4基因型的确定通过序列SEQ ID NO 13和
14的寡核苷酸对来进行。
11.根据权利要求6的试剂盒，其还包含适于确定所述CCNA1因SNP5的基因型的寡核苷酸。
12.根据权利要求11的试剂盒，其中所述SNP5基因型的确定通过序列SEQ ID NO 15和16的寡核苷酸对来进行。
13.根据权利要求6的试剂盒，其还包含适于确定所述CDKN1A基因SNP6的基因型的寡核苷酸。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述SNP6基因型的确定通过序列SEQ ID NO 17和18的寡核苷酸对来进行。
15.如图3所定义的多态性SNP1、SNP2、SNP3、SNP4以及任选地SNP5和SNP6中的一个或更多个用作个体植入支架后再狭窄发生风险的标志物的用途。
再狭窄发生风险的遗传标志物
技术领域
[0001] 本发明在分子生物技术领域的卫生保健方面具有其应用。特别地，本发明的目的是根据单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)的检测来诊断通过支架(stent)植入进行血管重建之后再狭窄发生风险的方法。
背景技术
[0002] 对受动脉硬化影响的血管进行血管重建的最常用临床治疗是经皮腔内冠状动脉成形术(transluminal percutaneous coronary angioplasty，PCTA)。常与该介入关联的病理过程是再狭窄，其为经手术血管的过度再阻塞。再狭窄对卫生保健和社会经济有强烈的冲击，因为它使得必须重复进行PCTA或者使受影响的患者接受另外的血管重建治疗(例如主动脉冠状动脉分流)。与具有缓慢发展特征(通常经过数十年)的自然发生的粥样病变相比，再狭窄病变通常在PCTA后最初4-12个月中发生(Serruys，Kutryk and Ong，″Coronary-artery stents″，N Engl J Med 2006，354，483-95)。目前，超过90％的PCTA使用称为支架的支持金属内置假体，其增加了手术的安全性，并且与通常跟常规PCTA相关的25-50％再狭窄率相比，其再狭窄率降低至15-30％(Serruys，Kutryk and Ong，″Coronary-artery stents″，N Engl J Med 2006，354，483-95，Andrés，″Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling：new perspectives and therapeutic potential″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21)。使用药物洗脱支架进一步降低了再狭窄率。
[0003] 再狭窄是多因素过程，其中涉及许多细胞类型，主要是血小板、单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)。认为再狭窄病变(也称为新生内膜病变)的发展是由支架植入导致的机械损伤起始的过程(Andrés，″Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling：new perspectives and therapeutic potential ″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21，Costa and Simon，″Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents″，Circulation 2005，111，2257-73)。再狭窄的初始急性期涉及血小板的活化以及局部血栓形成，其伴随有循环单核细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞募集至受损动脉表面。这些细胞类型发动慢性炎症应答，其特征为中膜驻留SMC的活化，其表现为具有以下特征的“综合性”表型：形态学改变、收缩蛋白胚胎同工型的表达、对生长和趋化刺激的高应答性以及细胞外基质的大量合成。新生内膜病变细胞所产生的过量趋化因子和有丝分裂因子导致中膜SMC的第一增殖期以及其向病变的迁移，随后是新生内膜病变SMC的第二增生性应答(Andrés，″Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling：new perspectives and therapeutic potential″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21，Costa and Simon，″Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents″，Circulation 2005，111，2257-73)。PCTA后期血管病变的炎症和瘢痕的消退伴随着新生内膜SMC的收缩型表型恢复和细胞外基质成分的变化，所述细胞外基质成分变得更类似于未受损的动脉壁。如前所述，如果再狭窄过度，则临床症状再次出现，使得必需再进行血管重建介入。
[0004] 在动物和人研究中鉴定的新生内膜增生调节因子包括：凝血因子(例如组织因子、凝血酶受体)、细胞粘附分子(例如VCAM、ICAM、LFA-1、Mac-1)、信号传导因子(例如PI3K、MEK/ERK)、转录因子(例如NF-κB、E2F、AP-1、c-myc、c-myb、YY1、Gax)、细胞周期调节蛋白(例如pRb、p21、p27、CDK2、CDC2、细胞周期蛋白B1、PCNA)、生长因子(例如PDGF-BB、TGFβ、FGF、IGF、EGF、VEGF)、炎性细胞因子(例如TNFα)、趋化因子(例如CCR2、MCP-1)和金属蛋白酶(例如MMP-2、MMP-9)。
[0005] 再狭窄的重要增殖特征引起了研究细胞周期调节基因在该病理过程中可能起到的作用的极大兴趣。在哺乳动物中，细胞周期由称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的催化亚基和称为细胞周期蛋白的调节亚基构成的全酶进行正向调控(Ekholm and Reed， ″ Regulation of G(1)cyclin-dependent kinases in the mammalian cell cycle″，Curr Opin Cell Biol 2000，12，676-84)。CDK/细胞周期蛋白的依次活化使参与细胞增殖的细胞底物发生不同的磷酸化事件。另一方面，还有称为CKI(CDK抑制蛋白)的CDK/细胞周期蛋白的抑制蛋白，其分为CIP/KIP(p21、p27和p57)和INK4(p15、p16、p18和p19)亚家族。CKI的累积应答于抗有丝分裂刺激，其引发对CDK/细胞周期蛋白复合物的可逆抑制。表达研究和基因治疗实验揭示了这些分子在新生内膜病变发生中的重要性。因此，对动物和人血管成形术模型中由机械损伤诱导的阻塞性血管病变的分析证实了细胞周期调节基因(例如CDK、细胞周期蛋白、CKI、p53、pRb)表达的改变，许多实验动物研究显示，CDK和细胞周期蛋白(例如细胞周期蛋白B、CDK2、CDK1)的失活或者生长抑制因子(例如p21、p27、pRb、p53)的过表达抑制了血管成形术后阻塞性血管病变的发生(Andrés，″Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling：new perspectives and therapeutic potential″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21，Nabel，″CDKs and CKIs：molecular targets for tissue remodelling ″，Nat Rev Drug Discov 2002，1，587-98，Dzau，Braun-Dullaeus and Sedding，″Vascular proliferation and atherosclerosis：new perspectives and therapeutic strategies″，Nat Med 2002，8，1249-56)。
[0006] 尽管来自多个动物模型的临床前数据令人鼓舞，但是许多预防或治疗再狭窄的全身性治疗方法在临床试验中失败。然而，最近出现的抗增殖药物洗脱支架(drug-eluting stents，DES)改革了介入性心脏病学。应注意支架递送两种亲脂性药物西罗莫司(也称为雷帕霉素或雷帕鸣)和紫杉醇(也称为泰素)的用途，所述药物以细胞增殖的共同最终途径--真核细胞的有丝分裂周期--作为靶标。这些在受损动脉壁局部释放高剂量药物的装置的使用显著地降低了再狭窄率(Costa and Simon，″Molecular basis of restenosis and drug-eluting stents″，Circulation 2005，111，2257-73，Wessely，Schomig and Kastrati，″ Sirolimus and Paclitaxel on polymer-based drug-eluting stents：similar but different″，J Am Coll Cardiol 2006，47，708-14)。因此，目前在欧洲每
3个植入的支架中就有2个为DES植入(Baz，Mauri，Albarran and Pinar，″[Spanish Cardiac Catheterization and Coronary Intervention Registry.16th Official Report of the Spanish Society of Cardiology Working Group on Cardiac Catheterization and Interventional Cardiology(1990-2006)] ″，Rev Esp Cardiol 2007，60，
1273-89)。相比于常规支架，DES使用的相关缺点在于其十分昂贵(贵2-3倍)，并且需要延长抗血小板治疗以避免与晚期血栓形成有关的不良事件(综述参见Lázaro and de Mercado，″Stents recubiertos de fármacos：eficacia，efectividad，eficiencia y evidencia″，Revista de Cardiología 2004，57，608-12)。
3个植入的支架中就有2个为DES植入(Baz，Mauri，Albarran and Pinar，″[Spanish Cardiac Catheterization and Coronary Intervention Registry.16th Official Report of the Spanish Society of Cardiology Working Group on Cardiac Catheterization and Interventional Cardiology(1990-2006)] ″，Rev Esp Cardiol 2007，60，
1273-89)。相比于常规支架，DES使用的相关缺点在于其十分昂贵(贵2-3倍)，并且需要延长抗血小板治疗以避免与晚期血栓形成有关的不良事件(综述参见Lázaro and de Mercado，″Stents recubiertos de fármacos：eficacia，efectividad，eficiencia y evidencia″，Revista de Cardiología 2004，57，608-12)。
[0007] 由于再狭窄对卫生保健和社会经济的巨大影响，会非常有用的是具有这样的生物标志物，其在需要血管重建的患者中能以可重现、可靠和经济的形式进行定量。在这些患者中评估再狭窄风险的可能性能帮助进行治疗决策，例如是支架植入还是主动脉冠状动脉分流，或者是使用常规支架还是DES(更昂贵并且晚期血栓形成的风险增加)。
[0008] 单核苷酸多态性(SNP)是在整个人基因组中存在的数百万的遗传变体。近年来，已在人基因中鉴定到与较高或较低的再狭窄发生风险相关的SNP，包括β2肾上腺素受体基因、CD14基因、集落刺激因子(CSF)基因、嗜酸粒细胞趋化蛋白基因、胱天蛋白酶-1基因、P2RY12受体基因和白介素-10基因(Monraats et al.″Inflammation and apoptosis genes and the risk of restenosis after percutaneous coronary intervention″，Pharmacogenet Genomics 2006，16，747-754；Monraats et al.″Interleukin 10：a new risk marker for the development of restenosis after percutaneous coronary intervention″，Genes Immun 2007，8，44-50；Monraats et al.″Genetic inflammatory factors predict restenosis after percutaneous coronary interventions ″，Circulation 2005，112，2417-25；Rudez et al.″Platelet receptor P2RY12 haplotypes predict restenosis after percutaneous coronary interventions″，Hum Mutat 2008，29，375-80)。
[0009] 但是，目前为止，未见将细胞周期调节基因中的SNP与再狭窄发生风险较高或较低相联系的基因型-表型关系描述。
[0010] 在进行了重要的研究工作之后，本发明人鉴定到多个细胞周期调节基因中的不同SNP，其具有作为再狭窄发生的遗传风险标志物的潜在诊断性价值。具体地，本发明人鉴定到作为再狭窄发生风险诊断标志物的下列SNP：CCNB1因(细胞周期蛋白B1)中的rs164390、rs350099、rs350104、rs875459；CCNA1基因(细胞周期蛋白A1)中的rs2282411以及CDKN1A基因(p21Kip1/Cip1蛋白)中的rs733590。
[0011] 这些标志物为进行治疗决策提供了重大改进。例如，再狭窄发生风险相对低的患者接受常规支架，而DES的使用(更昂贵并且晚期血栓形成的风险增加)可限于风险较高的患者。
[0013] 图1：表格总结了细胞周期蛋白基因中检测的25个多态性。
[0014] 图2：表格总结了细胞生长抑制因子基因中检测的22个多态性。
[0015] 图3：表格总结了与支架植入后再狭窄发生风险统计学显著相关的6个SNP。
[0017] 图5：人CCNB1基 因 启 动子 区 域的 图，其显 示SNP rs350099(SNP1) 和rs350104(SNP2)的定位区域以及转录因子NF-Y(NF-Y bs)的结合位点。
[0018] 图6：电泳迁移率改变分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)中所用的探针列表。
[0019] 图7：带放射性标记的探针NF-Ycons、SNP1-T和SNP1-C与来自人宫颈癌细胞(HeLa)的可溶性细胞核级分提取物一起孵育的EMSA。通过与抗NF-YB和抗CREBII抗体一起孵育来进行超迁移实验(后者用作特异性对照)。
[0020] 图8：通过EMSA技术实施的竞争性测定，其中将带放射性标记的NF-Ycons探针和过量未标记双链寡核苷酸NF-Ycons、NF-Ymut、SNP1-T和SNP1-C与来自人宫颈癌细胞(HeLa)的可溶性细胞核级分提取物一起孵育。
[0021] 图9：通过EMSA技术实施的竞争性测定，其中将带放射性标记的NF-Y探针(-30/-10)和过量未标记双链寡核苷酸NF-Y(-30/-10)、SNP1-T和SNP1-C与来自人宫颈癌细胞(HeLa)的可溶性细胞核级分提取物一起孵育。
[0022] 图10：a)通过EMSA技术实施的竞争性测定，其中将带放射性标记的AP-1cons探针和过量未标记双链寡核苷酸AP-1cons、SNP2-C和SNP2-T与人骨肉瘤上皮细胞(U2OS)的可溶性细胞核级分提取物一起孵育。b)五个EMSA平均的DNA-蛋白质复合物相对强度，以及通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验(Bonferroni post-hoc test)进行的统计学分析。将测定中具有竞争剂的条带强度与不具有竞争剂条带强度的比较表示为：*：p＜0.05，**：p＜0.01。
[0023] 图11：与支架植入后再狭窄发生风险表现出统计学显著相关性的6个SNP相邻的核苷酸的序列。
[0024] 图12：SNP1的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0025] 图13：SNP2的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0026] 图14：SNP3的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0027] 图15：SNP4的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0028] 图16：SNP5的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0029] 图17：SNP6的熔解曲线。a)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线(依赖于温度)，b)显示正常曲线和因存在多态性而偏移的曲线之间的差异(依赖于温度)。熔解曲线的差异是PCR产物序列变化之间差异的结果，其根据每种基因型将样品分组。
[0030] 发明目的
[0031] 本发明的一个目的是确定个体在植入支架后再狭窄发生风险的方法，其基于对样品进行分析以确定选自以下的至少一个单核苷酸多态性(SNP)的基因型：CCNB1基因中的rs350099、rs350104、rs164390和rs875459以及任选地分别位于CCNA1和CDKN1A基因中的rs2282411和/或rs733590，其中如下所示，任何这些多态性中特定等位位点的存在标志着发生再狭窄的风险。
[0032] 本发明的一个目的还在于实施所述方法的试剂盒，其包含适于确定所述多态性之基因型的一组探针和试剂。
[0033] 最后，本发明的一个目的是所述多态性(rs350099、rs350104、rs164390、rs875459以及任选地rs2282411和rs733590)中的一种或更多种用作个体在植入支架后再狭窄发生风险之标志物的用途。
发明内容
[0034] 本发明的一个主要方面设想了确定个体在植入支架后再狭窄发生风险的方法，其包括：a)获得来自个体样品的基因组DNA；b)分析所述样品的DNA以确定选自如图3所示的rs350099(SNP1)、rs350104(SNP2)、rs164390(SNP3)和rs875459(SNP4)的CCNB1基因的至少一个单核苷酸多态性(SNP)的基因型，其中如下所示，任何这些多态性中特定等位位点的存在标志着发生再狭窄的风险(参见图4)。
[0035] 在一个优选实施方案中，步骤b)包括对样品的DNA进行分析以确定多态性SNP1和SNP2的基因型的组合。
[0036] 多态性rs350099(SNP1)(参见图3)位于启动子区域，从CCNB1基因转录起点的-957位，CCNB1基因编码细胞周期蛋白B1，其在多种生理病理环境中是细胞增殖必需的正调控因子(Santamaria and Ortega，″Cyclins and CDKS in development and cancer：lessons from genetically modified mice″，Front Biosci 2006，11，1164-88)，所述环境包括血管机械损伤诱导的新生内膜病变的发生(Morishita，Gibbons，Kaneda，Ogihara and Dzau，″Pharmacokinetics of antisense oligodeoxyribonucleotides(cyclin B1 and CDC 2 kinase)in the vessel wall in vivo：enhanced therapeutic utility for restenosis by HVJ-liposome delivery″，Gene 1994，149，13-9)。-957位还对应CCNB1基因(GenBank数据库中的登录号U22364)的1172碱基对(bp)序列的36位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途通过检测该SNP中T等位位点纯合(T/T基因型)来确定(参见图4)。另外，本发明人在具有T等位位点的序列中鉴定到序列(CCAAT)，其构成了转录因子NF-Y的特异性结合位点(参见图7-9)。
[0037] 转录因子NF-Y与位于人基因CCNB1启动子的-150至+182区域中的两个顺式调控序列结合，这使其对于高增殖率的细胞中CCNB1的转录活化很重要(Sciortino，Gurtner，Manni，Fontemaggi，Dey，Sacchi，Ozato and Piaggio，″The cyclin B1 gene is actively transcribed during mitosis in HeLa cells″，EMBO Rep 2001，2，1018-23，Farina，Manni，Fontemaggi，Tiainen，Cenciarelli，Bellorini，Mantovani，Sacchi and Piaggio， ″ Down-regulation of cyclin B1 gene transcription in terminally differentiated skeletal muscle cells is associated with loss of functional CCAAT-binding NF-Y complex″，Oncogene 1999，18，2818-27)。
[0038] 图5是人CCNB1基因的启动子区域图示，其显示了EMSA测定研究的SNP(SNP1和SNP2)的定位。NF-Ybs框表示位于启动子的-21/-17位的CCAAT序列，转录因子NF-Y与其结合。将转录起点的值设为+1，其由弯箭头表示。
[0039] 多态性rs350104(SNP2)(参见图3)位于启动子区域，在编码细胞周期蛋白B1的CCNB1基因转录起点的-475位。-475位还对应于CCNB1基因(GenBank数据库中的登录号U22364)的1172bp序列的519位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途通过检测该SNP中C等位位点纯合(C/C基因型)来确定(参见图4)。另外，本发明人在具有C等位位点的序列中鉴定到转录因子AP-1的结合位点，其相比于此多态性的T等位位点亲合性更高(参见图10)。
[0040] AP-1是与大量细胞周期基因(包括细胞周期蛋白)活化的调节过程广泛相关的转录因子(Shaulian and Karin，″AP-1 in cell proliferation and survival″，Oncogene2001，20，2390-400)。
[0041] 多态性rs164390(SNP3)(参见图3)位于编码细胞周期蛋白B1的CCNB1基因的5’非翻译区+102位。+102位还对应于CCNB1基因(GenBank数据库中的登录号NC_000005)的11160bp序列的104位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途通过检测该SNP中G等位位点纯合(G/G基因型)来确定(参见图4)。
[0042] 多态性rs875459(SNP4)(参见图3)位于相对于编码细胞周期蛋白B1的CCNB1基因转录起点的+7010。+7010位还对应于CCNB1基因(GenBank数据库中的登录号NC_000005)的11160bp序列的7012位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途通过检测该SNP中G等位位点纯合(G/G基因型)来确定(参见图4)。
[0043] 在一个特定实施方案中，所述方法的步骤b)另外包括确定如图3中所定义的CCNA1基因中多态性rs2282411(SNP5)的基因型。
[0044] 多态性rs2282411(SNP5)(参见图3)位于相对于编码细胞周期蛋白A1的CCNA1基因转录起点的+7733，细胞周期蛋白A1也是细胞周期的正调控因子(Santamaria and Ortega，″Cyclins and CDKS in development and cancer：lessons from genetically modified mice″，Front Biosci 2006，11，1164-88)。+7733位还对应于CCNA1基因(GenBank数据库中的登录号NC_000013)的10376bp序列的7735位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途通过在共显性模型中检测该SNP中T等位位点纯合或杂合(TT或CT基因型)，或者在显性模型中检测该SNP中G等位位点纯合(GG基因型)来实现(参见图4)。
[0045] 在另一特定实施方案中，所述方法的步骤b)另外包括确定如图3中所定义的CDKN1A基因中多态性rs733590(SNP6)的基因型。
[0046] 多态性rs733590(SNP6)(参见图3)位于编码蛋白p21Kip1/Cip1的CDKN1A基因Kip1/Cip1转录起点的-1284位，在多种生理病理环境中蛋白p21 是细胞周期的负调控因子(Massague，″G1 cell-cycle control and cancer″，Nature 2004，432，298-306)，所述环境包括由机械性血管损伤诱导的新生内膜病变(Andrés，″Control of vascular cell proliferation and migration by cyclin-dependent kinase signalling：
new perspectives and therapeutic potential ″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21，Nabel，″CDKs and CKIs：molecular targets for tissue remodelling ″，Nat Rev Drug Discov 2002，1，587-98)。-1284位还对应于CDKN1A基因(GenBank数据库中的登录号AF497972)的10907bp序列的57位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途包括在显性和共显性模型中检测该SNP中T等位位点纯合(T/T基因型)(参见图4)。
new perspectives and therapeutic potential ″，Cardiovasc Res 2004，63，11-21，Nabel，″CDKs and CKIs：molecular targets for tissue remodelling ″，Nat Rev Drug Discov 2002，1，587-98)。-1284位还对应于CDKN1A基因(GenBank数据库中的登录号AF497972)的10907bp序列的57位碱基。其用作人体中植入支架后再狭窄发生风险的诊断性标志物的用途包括在显性和共显性模型中检测该SNP中T等位位点纯合(T/T基因型)(参见图4)。
[0047] 图11显示了根据公共数据库GenBank(“National Center of Biotechnology Information”，NCBI)中所记录的信息，与所述6个SNP(SNP1-SNP6)相邻的6个核苷酸序列(SEQ ID NO 1-6)。括号内显示每个SNP的两种多态性变体。
[0048] 所述方法可应用于从患者的不同样品(例如唾液、血液或从血液中纯化的白细胞)获得的DNA。
[0049] 本发明的对象SNP的基因分型用于开发诊断植入支架后再狭窄发生风险的试剂盒。鉴定SNP最合适的方法有：微测序(minisequencing)(使用优先结合所述多态性的探针，用带有荧光标记的ddNTP延伸以在自动测序仪上显示)；定量PCR(扩增发现每个多态性的区域，并通过不同类型的探针或通过熔解曲线对其进行鉴定)；PCR和限制性消化(用经修饰以产生限制性位点的寡核苷酸作为PCR反应中的引物，以扩增多态性所处区域，并用合适的限制性酶消化，将其应用于自动测序仪、琼脂糖凝胶等)；以及等位特异性扩增并在自动测序仪、琼脂糖凝胶等中观察。
[0050] 优选地，为了确定这些多态性，使用了借助“高分辨率熔解曲线”的熔解曲线方法，其中从发现目的多态性的区域扩增DNA，在定量热循环仪上分析熔解曲线https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/lightcycler/index.jsp。这是简单、快速且可靠的方法，由以下构成：用合适寡核苷酸扩增含有多态性的区域，通过熔解曲线来鉴定多态性，通过使所得产物经历温度变化(取决于所用系统的特征)获得所述熔解曲线。这使得开发简单可靠的诊断测试成为可能。
[0051] 因此，在本发明的另一主要方面中，设想了用于实施本发明方法的试剂盒，其包含适于测定选自SNP1、SNP2、SNP3、SNP4及其组合的CCNB1基因多态性的基因型的一组寡核苷酸和试剂。
[0052] 在一个优选实施方案中，用于对SNP1进行基因分型的寡核苷酸对(引物)具有序列SEQ ID NO 7(有义)和SEQ ID NO 8(反义)(参见表3)。
[0053] 在另一优选实施方案中，用于对SNP2进行基因分型的寡核苷酸对具有序列SEQ ID NO 9(有义)和SEQ ID NO 10(反义)(参见表3)。
[0054] 在另一优选实施方案中，用于对SNP3进行基因分型的寡核苷酸对具有序列SEQ ID NO 11(有义)和SEQ ID NO 12(反义)(参见表3)。
[0055] 在另一优选实施方案中，用于对SNP4进行基因分型的寡核苷酸对具有序列SEQ ID NO 13(有义)和SEQ ID NO 14(反义)(参见表3)。
[0056] 任选地，在一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含适于对CCNA1基因的SNP5进行基因分型的寡核苷酸。优选地，所用的寡核苷酸具有序列SEQ ID NO 15(有义)和SEQ ID NO 16(反义)(参见表3)。
[0057] 在另一个特定实施方案中，所述试剂盒还可包含适于对CDKN1A基因的SNP6进行基因分型的寡核苷酸。优选地，所用的寡核苷酸具有序列SEQ ID NO 17(有义)和SEQ ID NO 18(反义)(参见表3)。
[0058] 最后，本发明的另一主要方面涉及图3中所定义的多态性SNP1、SNP2、SNP3、SNP4以及任选地SNP5和SNP6中的一个或更多个用作个体植入支架后再狭窄发生风险之标志物的用途。实施例
[0059] 患者群描述
[0060] 患者群体
[0061] 在12个月期间，满足下列录入标准的在Clinica Mediterranea(Naples，Italy)就医的所有连续性患者参与该研究：1)天然冠状动脉中的经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)，2)新发病变的治疗，3)植入裸露的金属支架，和4)可以在6-9个月时进行冠状动脉造影。地方伦理委员会批准了该研究方案，所有患者签署了知情同意书。
[0062] 在参与研究的434名患者中，仅有284名(65％)进行了6-9个月时的随访血管造影。这284名患者构成了患者群体。
[0063] 生物化学测量
[0064] 利用酶学技术测定血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和甘油三酯。通过应用Level修正的肾脏疾病饮食改变(Modification of Diet in Renal Disease，MDRD)公式计算肾小球估计滤过率(Estimated glomerular2
filtration rate，eGFR)。慢性肾脏疾病定义为eGFR＜60ml/min/1.73m。
filtration rate，eGFR)。慢性肾脏疾病定义为eGFR＜60ml/min/1.73m。
[0065] 血液取样
[0066] 在PCI之前从患者抽取静脉血样品。将所有样品收集到柠檬酸三钠试管内，立刻置于冰中。自收集起1小时内，将血液样品以4000rpm(1400g)离心20分钟，收集血浆，以等分试样保存于-80℃直至分批分析。
[0067] 经皮冠状动脉血管成形术
[0068] 在最初和最终血管造影之前，对患者经冠状动脉内施用硝酸异山梨酯(0.1-0.3mg)以实现最大的血管扩张。用基于计算机的自动化系统(QCA-CMS version 3.0，MEDIS，Leiden，The Netherlands)进行血管造影测量。通过在支架植入后6-9个月时测量最小腔内直径(minimal lumen diameter，MLD)分析随访再狭窄。此外，评估下列变量：急性增加，其定义为手术后MLD减去手术前MLD；后期减少，其定义为手术后MLD减去随访时MLD；以及减少指数，其定义为后期减少与急性增加的平均比值。再狭窄定义为随访时狭窄程度≥50％。
[0069] 统计学分析
[0070] 连续变量表示为平均值±标准差(SD)。在合适时，通过Student t检验或Mann-Whitney U检验确定两组中连续值的差异(如血管造影病变进展所定义的)。通过卡方检验分析分类变量。检验为两侧的(2-sided)。用SPSS for Windows，version 13.0(SPSS Inc.，Chicago，Illinois)分析数据。
[0071] 表1.植入冠状动脉支架后具有或没有再狭窄的患者的临床特征。
[0072]
[0073] *根据加拿大心血管学会(Canadian Cardiovascular Society，CCS)的分类标准。eGFR＝肾小球估计滤过率。
[0074] 表2.在植入冠状动脉支架后具有或没有再狭窄的患者的血管造影特征。
[0075]
[0076] LAD＝左前降动脉；LCx＝左回旋动脉；RCA＝右冠状动脉。
[0077] 本研究分析了位于8个调节细胞周期的人基因中的47个SNP，所述基因包括增殖活化因子(细胞周期蛋白A1、E1、B1和D1)(参见图1)和细胞生长抑制因子(p21、p27、p57和p53)(参见图2)。
[0078] 图1显示细胞周期活化因子基因中检查的25个SNP和其所编码的蛋白(括号中)：CCNA1(细胞周期蛋白A1)、CCNE1(细胞周期蛋白E1)，CCNB1(细胞周期蛋白B1)和CCND1(细胞周期蛋白D1)。“多态性”栏包含与所述多态性相关的位置和等位位点。多态性的位置相对于定为+1位核苷酸碱基的基因转录起点显示。当多态性位于转录起点之前时，其显示为负数，当其位于后面的位置时显示为正数。“定位区域”栏表示多态性相对于基因功能性结构的位置。更具体地，“启动子区域”定位表示多态性位于调节基因转录的区域，其位于转录起点(显示为+1)之前。“外显子”定位表示多态性位于基因的编码区。“内含子”定位表示多态性位于基因的非编码内含子区。UTR 3’和UTR 5’定位表示多态性分别位于3’或5’区域中的非翻译序列中。
[0079] 图2显示细胞周期抑制基因中检查的22个SNP的和其所编码的蛋白(括号中)：CDKN1A(p21 Kip1/Cip1)、CDKN1B(p27 Kip1/Cip1)、CDKN1C(p57 Kip1/Cip1)和TP53(p53)。
[0080] 在纯化自284名患者的循环白细胞的DNA样品中进行这47个SNP(如下所述)的基因分型，所述患者通过植入支架接受了血管重建，其中168名患者未发生再狭窄，116个发生了该疾病(再狭窄定义为，在介入后6-9个月期间进行血管造影评价后，血管腔的内径相对于紧邻介入区域的区段的腔的内径减少了超过50％)。使用SNPStat程序(Sole，Guino，Valls，Iniesta and Moreno，″SNPStats：a web tool for the analysis of association studies″，Bioinformatics 2006，22，1928-9)通过logistic回归分析进行统计学分析，以鉴定可增加再狭窄发生风险的多态性。在所分析的总共47个SNP中，仅对以下SNP观察到与较大再狭窄风险的统计学显著相关：CCNB1基因中的SNP1-4，rs164390、rs350099、rs350104、rs875459，CCNA1基因中的SNP5，rs2282411，以及CDKN1A基因中的SNP6，rs733590。
[0081] 图3总结了与支架植入后再狭窄发生风险具有统计学显著相关性的6个SNP。
[0082] 图4显示了与支架植入后再狭窄发生风险相关的SNP的logistic回归分析结果。使用SNPStat软件(Sole，Guino，Valls，Iniesta and Moreno，″SNPStats：a web tool for the analysis of association studies″，Bioinformatics 2006，22，1928-9)进行分析，并用年龄和性别进行了校正。
[0083] 结果显示，对于SNP1，与带有纯合(C/C)或杂合(C/T)C等位位点的个体相比，带有纯合(T/T)T等位位点的个体发生再狭窄的概率显著增加1.74倍(参见图4)。
[0084] 对于SNP2，与带有纯合(T/T)或杂合(T/C)T等位位点的个体相比，带有纯合(C/C)C等位位点的个体发生再狭窄的概率显著增加1.77倍(参见图4)。
[0085] 对于SNP3，与带有纯合(T/T)或杂合(G/T)T等位位点的个体相比，带有纯合(G/G)G等位位点的个体发生再狭窄的概率显著增加1.81倍(参见图4)。
[0086] 对于SNP4，与带有纯合(T/T)或杂合(G/T)T等位位点的个体相比，带有纯合(G/G)G等位位点的个体发生再狭窄的概率显著增加1.78倍。应用于SNP4的logistic回归分析考虑了下列因素：所分析患者的再狭窄、性别、年龄和家族史(参见图4)。
[0087] 对于SNP5，在共显性模型中，与纯合(C/C)C等位位点相比，纯合(T/T)或杂合(C/T)T等位位点的存在使发生再狭窄的概率分别显著增加1.26倍和3.10倍。在显性模型中，与纯合(T/T)或杂合(G/T)T等位位点相比，纯合(G/G)G等位位点的存在与发生再狭窄概率显著增加1.78倍相关。应用于SNP5的logistic回归分析考虑了下列因素：所分析患者的再狭窄、性别、年龄和植入支架类型(参见图4)。
[0088] 对于SNP6，在共显性模型中，与杂合(C/T)或纯合(C/C)C等位位点相比，纯合(T/T)T等位位点的存在使发生再狭窄的概率分别显著增加1.92倍和2.38倍。在显性模型中，与杂合(T/C)或纯合(C/C)C等位位点相比，纯合(T/T)T等位位点的存在使发生再狭窄概率显著增加2.08倍(参见图4)。
[0089] 基因分析
[0090] 对于多态性的检测和样品的基因分型，使用LightCycler 480 Scanning软件和LightCycler 480 High Resolution Melting Master试剂盒。
[0091] 所述试剂盒的混合物含有荧光团LightCycler 480 ResoLight，其均匀结合双链DNA并且可在高浓度下使用而不抑制扩增反应，这归因于其化学特征。
[0092] 在PCR反应循环中，监测扩增片段的形成。通过熔解曲线的差异区分序列有变化的样品。通过使用该技术，可以区分纯合和杂合样品，甚至可以区分野生和突变纯合子。
[0093] 引物设计
[0094] 使 用 Primer 3 程 序 (Howard Hughes Medical Institute and National Institutes of Health，National Human Genome Research Institute http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)设计用于每个基因的PCR反应的每对引物(参见表3)。
[0095] 在引物的设计中(参见表3)，指出熔解温度在62℃左右，扩增子的大小为100-250bp。
[0096] 表3.设计用于所研究多态性的引物
[0097]
[0098] 扩增反应
[0099] 对于每个扩增反应，使用Roche Applied Science的High Resolution the LightCycler 480 Master试剂盒。2x混合物包含在无MgCl2的反应缓冲液中的FastStart Taq DNA聚合酶和荧光团LightCycler 480 ResoLight。此混合物与DMSO的添加配合以改善富含GC序列的扩增。
[0100] FastStart Taq DNA聚合酶是热稳定酶，经化学修饰，其在高至75℃的温度下不显示活性。该酶仅在高温下活化，在此温度下引物不能非特异性地与序列结合。
[0101] a.试剂和体积。
[0102] 表4列出了每个扩增反应中所用的试剂，初始和最终浓度以及所需体积。
[0103] 表4.试剂和体积
[0104]
[0105] b.反应条件。
[0106] 表5显示了在不同参数优化后用于扩增反应的条件。
[0107] 表5.扩增反应的条件
[0108]
[0109] 测试的预计时间是PCR 75分钟，变性曲线15分钟(高分辨率熔解)。反应可在常规热循环仪中进行并在LightCycler 480系统中分析结果。
[0110] 在多态性SNP1、SNP3和SNP4的具体情况中，对于每种多态性，在扩增反应后变性步骤前，将1微升具有野生纯合基因型的标准样品添加到每个孔。以这种方式，可以清楚地区分两种纯合子。
[0111] 结果分析
[0112] 使用LightCycler 480 Gene Scanning软件通过分析使用LightCycler 480 High Resolution Melting系统产生的实验数据来确定样品中的杂双链体结构。
[0113] 通过PCR扩增样品并变性获得熔解曲线后，用所述软件对其进行分析，并将具有类似熔解曲线的样品合并成组。
[0114] 在图12和13中分别显示了SNP1和SNP2的熔解曲线。使用“LightCycler 480 High Resolution Melting Master”试剂盒，在不同的人基因组DNA样品中扩增含有上述两种多态性的CCNB1基因的两个片段，通过“LightCycler 480 Scanning”软件进行分析。该软件检测熔解曲线中的差异，该差异源于PCR产物序列中变化的差异，根据每种基因型将样品归类。在这两幅图中，清楚地区分了每种基因型，尤其是纯合变体(红色和绿色)。在图(a)中，可见正常曲线和因多态性存在而改变的曲线(依赖于温度)，而图(b)显示正常曲线与因存在多态性而改变的曲线之间的差异(依赖于温度)。
[0115] 图14、15、16和17显示所研究的其他多态性的标准化的熔解曲线，其使用上一段中所述的相同方法：CCNB1基因中的多态性SNP3(图14)和SNP4(图15)，CCNA1基因中的多态性SNP5(图16)和CDKN1A基因中的多态性SNP6(图17)。
[0116] 与多态性SNP1和SNP2相关的功能性研究
[0117] 因为多态性rs350099(SNP1)和rs350104(SNP2)位于人CCNB1基因的启动子区，本发明入研究了这样的可能性：与支架植入后更高的再狭窄发生风险显示统计学显著相关的这些多态性的等位位点是否利于转录活化因子和/或抑制因子的结合，所述结合可继而改变基因的转录活性。
[0118] 使用Transfac 7.0数据库预测到对于含有多态性SNP1和SNP2的T和C等位位点的核苷酸序列，存在NF-Y和AP-1结合位点。使用EMSA技术检测了这些可能性。
[0119] 因此，对具有SNP1的T等位位点的序列进行分析预测了CCAAT序列的存在，其具有结合转录因子NF-Y的特异性。但是，对SNP1的C等位位点的相同类型分析未预测所述结合位点。
[0120] 根据这些预测，研究中所得数据确认了相对于SNP1中的C等位位点，NF-Y因子对含有T等位位点的序列有效且特异性结合(参见图7-9)。
[0121] 另一方面，对具有SNP2C等位位点的序列进行分析预测了AP-1结合位点的存在。但是，对具有SNP2T等位位点的相同类型分析未预测此结合位点。该研究中所得数据确认了与含有相同多态性的T等位位点的序列相比，当SNP2中存在C等位位点时AP-1的DNA结合活性更强(参见图10)。
[0122] 电泳迁移率改变分析(Electrophoretic Mobility Shift-Assay，EMSA)[0123] 通过将1pmol的双链寡核苷酸在10μL终体积中在65℃下孵育10分钟以使得可能的二级结构去稳定化来进行探针的放射性标记。然后，在冰中快速冷却，加入1μL T4-多32
聚核苷酸激酶和1μL[γ P]-dATP(10mCi/mL)。标记反应在37℃下孵育30分钟。在冰中停止反应，在Sephadex G-50柱中纯化探针，最后使之终体积为100μL。
聚核苷酸激酶和1μL[γ P]-dATP(10mCi/mL)。标记反应在37℃下孵育30分钟。在冰中停止反应，在Sephadex G-50柱中纯化探针，最后使之终体积为100μL。
[0124] 图6显示用作EMSA测定探针的双链寡核苷酸详细列表。“序列”栏显示每种探针的两个互补链序列。探针中所含序列的详细说明显示于“说明”栏。NF-Y和AP-1的预测和共有结合序列以粗体显示，SNP的等位位点显示在白色框中。
[0125] 将人细胞可溶性细胞核级分的蛋白质(3μg)在冰中17μL终体积的EMSA缓冲液(20mM Tris-HCl pH：7.8，5％甘油，3mM MgCl2，KCl 60mM，0.5mM EDTA，0.1mM DTT，50μg/mL聚(d(I-C))中预孵育10分钟。接下来，加入1μl放射性标记的双链寡核苷酸探针，在冰中孵育30分钟。最后，向每个管加入1μl上样缓冲液，在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离样品。分离以200mV在TBE 0.5x缓冲液中(由5X储液制得)在TBE 0.5X缓冲液中制得的5％聚丙烯酰胺凝胶中(80∶1，丙烯酰胺∶双丙烯酰胺)进行约2小时。以80℃的温度将凝胶真空干燥2小时，通过放射自显影对其进行分析(参见图
7-10)。对于竞争性测定，在预孵育步骤中加入放射性标记探针之前，加入过量的未标记双链寡核苷酸。对于超迁移测定，在加入放射性标记探针之前，将2μg特异性抗体(抗NF-YB，Santacruz Biotechnology，reference sc-13045x)或非特异性抗体(抗CREB-II，Santa Cruz Biotechnology，reference sc-180x)与细胞核提取物一起孵育30分钟。
7-10)。对于竞争性测定，在预孵育步骤中加入放射性标记探针之前，加入过量的未标记双链寡核苷酸。对于超迁移测定，在加入放射性标记探针之前，将2μg特异性抗体(抗NF-YB，Santacruz Biotechnology，reference sc-13045x)或非特异性抗体(抗CREB-II，Santa Cruz Biotechnology，reference sc-180x)与细胞核提取物一起孵育30分钟。
[0126] 图7显示与SNP1-T探针(具有SNP1的T等位位点的多态性变体)相关但与SNP1-C探针(具有SNP1的C等位位点的多态性变体)中不相关的NF-Y活性的鉴定，其在HeLa细胞中使用EMSA测定进行。如下进行所述测定：将10fmol的放射性标记的探针NF-Ycons、SNP1-T和SNP1-C与HeLa细胞可溶性细胞核级分提取物(分别为3μg、12μg和12μg蛋白质)一起孵育。样品在聚丙烯酰胺凝胶中分离，通过放射自显影显示DNA-蛋白质复合物。在没有细胞核提取物的情况下孵育结合反应对照(第1、5和9泳道)。超迁移测定如下所述进行：与抗NF-YB和抗CREB-II抗体一起预孵育30分钟(后者用作特异性对照)。
[0127] 图8显示过量SNP1-T探针竞争与NF-Ycons探针的NF-Y序列相关的DNA结合活性，但是SNP1-C不竞争。使用EMSA技术进行竞争性测定，其通过将10fmol NF-Ycons放射性标记探针与3μg HeLa细胞可溶性细胞核级分蛋白质提取物以及过量未放射性标记探针(“冷”探针)一起孵育来进行。竞争性测定中所用的未标记双链寡核苷酸是(过量的括号中显示)：NF-Ycons(第3泳道：100x)、NF-Ymut(第4泳道：100x)、SNP1-T(第5泳道：100x；第6泳道：300x；第7泳道：900x)，和SNP1-T(第8泳道：100x；第9泳道：300x；第10泳道：900x)。在聚丙烯酰胺凝胶中分离样品，通过放射自显影显示DNA-蛋白质复合物。
[0128] 图9显示过量SNP1-T探针竞争与人CCNB1基因启动子的-30/-10区域的NF-Y序列相关的DNA结合活性，但是SNP1-C不竞争。更具体地，其显示了与CCNB1启动子的-27/-17区域的NF-Y的序列结合活性分析(NF-Y探针(-30/-10)与过量“冷”探针SNP1-T和SNP1-C竞争)。使用EMSA技术进行竞争性测定，其通过将以下一起孵育来进行：10fmol NF-Y放射性标记探针(-30/-10)、8μg HeLa细胞可溶性细胞核级分蛋白质提取物以及过量“冷”探针NF-Y(-30/-10)(第3泳道：20x；第4泳道：60x)、SNP1-T(第5泳道：20x；第6泳道：60x)，和SNP1-C(第7泳道：20x；第8泳道：60x)。在聚丙烯酰胺凝胶中分离样品，通过放射自显影显示DNA-蛋白质复合物。
[0129] 图10显示与SNP2-T探针(具有SNP2的T等位位点的多态性变体)相比，SNP2-C探针(具有SNP2的C等位位点的多态性变体)更有效地与共有AP-1探针(AP-1cons)相关的DNA结合活性竞争。通过EMSA技术进行所述测定，其将人骨肉瘤上皮细胞(U2OS)可溶性细胞核提取物与放射性标记的AP-1cons探针一起孵育。竞争性实验通过与过量下述未标记双链核苷酸一起孵育进行：AP-1探针(25倍过量，第3泳道)、SNP2-C(25-至200-倍，第4-7泳道)和SNP2-T(25-至200-倍，第8-11泳道)。该图显示总共5个中的代表性EMSA。通过计算机图像分析系统(“Metamorph software”)对每个EMSA中DNA-蛋白质复合物的相对条带强度进行独立地分析，值在图中表示为平均值±SEM。通过单向ANOVA和Bonferroni事后检验进行结果的统计学分析。相对于对照(无竞争剂)的比较表示为：*p＜0.05，**p＜0.01。
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