PP-折叠肽家族-NPY(神经肽Y)(人序列-SEQ ID.No：1)、PYY(肽YY)(人 序列-SEQ ID.No：2)和PP(胰腺多肽)(人序列-SEQ ID.No：3)是天然分泌的同源 性，36个氨基酸，C-末端酰胺化的肽，这些肽的特征为有共同的三维结构-PP- 折叠，该结构即使在稀释的水溶液中也出人意料地稳定并且对这些肽的受体识 别很重要。
首先，通过下调分辨率至0.98的X-射线晶体图分析和该肽获得名称的独特 结构详细鉴定了禽类PP的X-射线结构特征(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78：4175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142：379-85)。然后，特别 通过NMR图谱分析分析了该家族其它成员的PP-折叠结构。X-射线和NMR分析 显然要在高度浓缩的或固体条件下进行；然而，详细的圆二色性分析提示NPY和 PP即使在水溶液中仍采取PP-折叠结构，这对此种小肽是罕见的(Fuhlendorff等， 1990 J.Biol.Chem.265：11706-12)。重要的是，对这些肽以及它们的片段和类似物 的蛋白酶水解稳定性分析表明，例如全长PP1-36即使为稀释的水溶液也保持折叠 构型从而保护其免遭某些酶的降解，所述酶能容易且快速地降解因少许取代而不能 采取PP-折叠结构的类似物(Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.611：35-47)。
NPY、PYY和PP共有的PP-折叠结构由以下部分组成：1)N-末端聚脯氨酸样 螺旋(对应于含Pro2、Pro5和Pro8的残基1-8)，其后是2)I型β-转角区(对应 于残基9-12)，然后是3)与聚脯氨酸螺旋反平行的具有152°角度的两亲性α- 螺旋(残基13-30)，和4)C-末端六肽(残基31-36)。与3个疏水性脯氨酸残基紧 密相互交叉的两亲性α-螺旋侧链之间的疏水相互作用稳定了此折叠结构 (Schwartz等，1990)。除了受体识别C-末端六肽中的关键残基外，稳定PP-折 叠结构的核心疏水残基在PP-折叠肽家族中也是保守的。图1A描述了NPY、 PYY和PP中保守的NPY序列和残基，以黑底白字表示。图1A也说明了上述 PP-折叠结构的元件。对受体识别重要的C-末端六肽是非结构性的 (unstructured)，但PP折叠提供了将C-末端六肽提供给受体的稳定支架(见图1B 描述)，就变化程度而言，这些受体也依赖于或不依赖于这些肽的N-末端部分。 NMR图谱分析证明，例如NPY的远处C-末端和N-末端部分颇可移动，这意 味着PP-折叠经常处于游离末端被“拉开”的危险中。
NPY是在中枢和外周神经系统各部分中具有多种作用的分布极广的神经肽， 通过人体中许多不同的受体亚型，Y1、Y2、Y4和Y5起作用。主要的NPY受体 是Y1受体和Y2受体，Y1受体一般是传输NPY神经元“冲动”的突触后受体， Y2受体一般是突触前抑制性受体。该情况也见于下丘脑，下丘脑中也表达黑皮素 受体拮抗剂/反向激动剂AgRP(野灰相关肽)的NPY神经元在弓形核的刺激(传入) 支中起基础“传感”神经元作用。因此，在该控制食欲和能量消耗的“传感核”中， NPY/AgRP神经元与抑制性POMC/CART神经元一起监控机体的激素和营养状 态，因为这些神经元是长期调节剂如瘦蛋白和胰岛素，和短期调节剂如生长素 释放肽和PYY(见下文)的靶点。刺激性NPY/AgRP神经元也凸入例如下丘脑的 室旁核中，认为该处其突触后靶受体是Y1和Y5受体。就增进食物摄入而言， NPY是已知最强效化合物，因为啮齿类动物经脑室内(ICV)注射NPY后将不断 进食直至饱撑。NPY/AgRP神经元的AgRP作用主要是作为4型黑皮素受体 (MC-4)的拮抗剂，能阻断POMC衍生肽(主要是aMSH)对该受体的作用。由于 MC4受体信号起到进食抑制剂作用，AgRP的作用与NPY的一样是一种进食刺 激信号(即，对抑制作用的抑制)。在NPY/AGRP神经元上发现了抑制性突触前 Y2受体，该受体是局部释放的NPY以及肠激素PYY(另一种PP-折叠肽)的靶 点。
PYY在进食期间从小肠末端和结肠部位的肠道-内分泌细胞释放(与食物中的 卡路里含量成比例)，作用于胃肠道外周(神经)功能和中枢(神经)，是一种饱食信号。 就外周(神经)而言，认为PYY的功能是上部胃肠道运动性、胃酸和胰腺外分泌的 抑制剂(回肠中断(illeal break))。就中枢(神经)而言，认为PYY主要作用于弓形核 NPY/AgRP神经元的突触前抑制性Y2受体，认为其可通过血液接近该受体 (Batterham等，2002 Nature 418：650-4)。该肽以PYY1-36释放，但是其一部分(约 50％)以PYY3-36在血中循环，PYY3-36是二肽基肽酶-IV的降解产物，该酶切除 此肽的N-末端二肽，前提是如所有三种PP-折叠肽-PP、PYY和NPY那样，在二 位发现Pro或Ala(Eberlein等，1989 Peptides 10：797-803)。因此，血循环中的 PYY是作用于Y1和Y2受体的PYY1-36和对Y1、Y4和Y5受体的亲和力低于Y2 受体的PYY3-36的混合物。
PP是一种胰岛内分泌细胞释放的激素，几乎完全受特别是食物摄入引起的迷 走神经胆碱能刺激的控制(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。PP对胃 肠道有各种作用，但是无一在分离的细胞和器官中未观察到，并且似乎均依赖于完 整的迷走神经供应(supply)(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。鉴于此， 称为Y4受体的PP受体位于脑干中，在迷走神经运动神经元(vagal motor neurones)(其激活导致PP的外周作用)和单生核束(NTS)(其激活导致PP作为饱食激 素的作用)中有强烈表达(Whitecomb等，1990 Am.J.Physiol.259：G687-91， Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res 48：1-6)。应理解，由于在血脑 屏障的感觉性外周(神经)区域各种激素对该区域是“可渗入的”，血液中的PP可 进入大脑的该区域。近年来，有争论说PP对食物摄入的部分作用是通过对神经元， 特别是弓形核中的POMC/CRAT神经元起作用而介导的(Batterham等，“Coimbra 国际NPY研讨会2004摘要3.3”(2004 Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP通过Y4受体起作用，与PYY和NPY对Y4受体的亲 和力为纳摩尔(nanomolar)级，PP对该受体的亲和力为亚纳摩尔(subnanomolar)级 (Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50：143-150)。PP对Y5受体也具有相应的亲和 力，但由于无法接近CNS中专门表达该受体的细胞和(该受体)对PP的亲和力较低， PP的生理学重要性不可能与循环PP有相关。
PP-折叠肽受体
熟知人体中有四种类型以相似亲和力识别NPY1-36和PYY1-36的PP-折叠肽 受体：Y1、Y2、Y4和Y5。曾提出过对NPY的亲和力超过PYY的Y3受体类型， 但现在不接受其为真正的受体亚型(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50：143- 150)。Y6受体亚型已得到克隆，然而它在人体内表达为缺乏TM-VII以及受体尾 部的截短形式，因此看来至少其本身不能形成功能性受体分子。
Y1受体-亲和力研究提示Y1能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上不结 合PP。对Y1的亲和力取决于PP-折叠分子(NPY/PYY)的两末端序列(例如，残基 Try1和Pro2是必须的)和此肽两末端能否以正确方式呈递。在含几个必需残基侧链 的C-末端，Y1受体(像Y5和Y4受体而不是Y2受体那样)可耐受34位(通常是Gln) 的某些取代，例如Pro(Fuhlendorff等，1990J.Biol.Chem.265：11706-12；Schwartz 等，1990 Annals NY Acad.Sci.61：35-47)。关于Y1和Y2受体必须的某些结构- 功能研究已见报道(Beck-Sickinger等，1994 Eur.J.Biochem.225：947-58；Beck- Sickinger和Jung，1995 Biopolymers 37：123-42；Sll等，2001 Eur.J.Biochem.268： 2828-37)。
Y2受体-亲和力研究提示Y2受体能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上 不结合PP。该受体特别需要PP-折叠肽(NPY/PYY)的C-末端。因此，长的C- 末端片段(下至例如NPY13-36(整个α螺旋加上C-末端六肽))识别亲和力较高， 即该全长肽的亲和力的10倍之内(Sheikh等，1989 FEBS Lett.245：209-14； Sheikh等，1989 J.Biol.Chem.264：6648-54)。所以，各种不能结合Y1受体的 N-末端缺失(片段)在一定程度上仍能结合Y2受体。然而，即使较长的C-末端 片段的亲和力与NPY/PYY相比降低了约10倍。NPY和PYY的34位Gln残基 对Y2受体的配体识别极其重要(Schwartz等，1990 Annas NY Acad.Sci.611： 35-47)。
Y4受体-亲和力研究提示对应于血浆中发现的浓度，Y4以亚纳摩尔亲和力结 合PP，而以低得多的亲和力结合NPY和PYY。这种研究提示Y4受体高度依赖于 PP-折叠肽的C-末端，较短的N-末端缺失将损伤对配体的亲和力。关于Y4受体的 几项结构活性研究已见报道(Gehlert等，1996 Mol.Pharmacol.50：112-18；Walker 等，1997 Peptides 18：609-12)。
Y5受体-亲和力研究提示Y5能同样良好地结合NPY和PYY，也以较低的亲 和力结合PP，然而亲和力低于该激素的正常血循环水平。Y5受体也能良好地识别 PYY3-36，然而该受体在CNS中也有很大程度的表达，当将PYY3-36施用于外周 (神经)中时，不易接近CNS中的此受体。
根据这些肽中的某些在动物模型和人体中所显示的作用和肥胖人的PYY和 PP基础水平低以及对这些肽的进食反应较低，已提出PP-折叠肽及其类似物可用 于治疗肥胖和相关疾病，包括例如普-韦综合征(Holst JJ等，1983 Int.J.Obes.7： 529-38；Batterham等，1990 Nature)。从17世纪中叶已知PP可以影响啮齿类动 物中的食物摄入。在1993年，有报道说给普-韦综合征的病态肥胖患者输注PP降 低了食物摄入(Berntson等，1993 Peptide 14：497-503)。近来，PP的该作用通过在 正常人对象中输注PP而得到证实，在24小时期间观察到持久的食欲抑制和食物 摄入降低(Batterham等，2003 Clin.Endocrinol.Metab.88：3989-92)。
然而，天然PP-折叠肽用作生物药物不是最佳，例如，它们对各种肽酶，如 DPP-IV的降解敏感。因此，天然肽的蛋白质稳定性未经优化，因为它们作为神经 肽或神经激素的作用时间通常较短。
因此，为治疗对Y受体调节起反应的疾病，例如肥胖和肠分泌过多，需要采 用PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽或模拟物对选作靶点的Y4受体具有特 异性并稳定地保留了对受体结合重要的PP-折叠结构元件。特别是更需要采用对Y4 受体的选择性超过Y1和Y2受体的这类药物。由于对Y1受体的激动作用可能导 致有害的心血管和肾脏副作用，例如血管收缩和尿钠排泄。此外，激活Y2受体也 可导致副作用。虽然还不清楚真正有效的血管生产Y受体情况是什么，Y2激动剂， 例如NPY3-36明显可在例如局部缺血后肢模型中诱导血管再生，即，当以高剂量 持续接触给药时，例如从引入的药丸中释放(Zukowska Z等，Trends Cardiovasc Med. 2003，13：86-92)。Y2受体敲除动物中NPY的血管生成应答降低；然而，事实上 对该广谱Y2受体激动剂NPY的应答未消除，Y2和Y5受体在局部缺血血管中得 到上调(Lee等，J.Clin.Invest.2003，111：1853-62)。但是，PP-折叠肽或PP-折叠肽 模拟物可通过激活Y2受体在例如糖尿病患者中造成副作用，例如加重视网膜病变， 并且可能有助于某些肿瘤生长相关的新血管生成。因此，使用对Y4受体有效且选 择性超过Y1和Y2受体的激动剂在治疗对Y4受体激活敏感的疾病和病症中特别 有用。
本说明书中所用的一些共同术语
亲和力：肽与特异性受体的亲和力以例如IC50值或Kj或Kd值给出，在具体的 非限制性例子中，这些值可用试验，例如竞争性结合试验测定。IC50值对应于取代 所用的与给定受体相关的放射性配体50％的肽浓度，其用量远低于该放射性配体 的Kd。
食欲：对食物的自然欲望或渴求。食欲增加通常导致进食行为的增加。
食欲抑制剂：能降低对食物需求的化合物。
结合：两种分子之间的特异性相互作用，可使得该两种分子相互作用。与受 体的结合可以是特异性和选择性的，所以与另一种分子相比，可优先结合某种分子。 可通过解离常数(Kd)鉴定特异性结合。其值取决于对测试化合物的选择性。例如， 通常认为Kd小于10nM的化合物是优秀的候选药物。然而，亲和力较低但对具体 受体具有选择性的化合物也可以是良好的候选药物。
体重指数(BMI)：一种衡量体重的数学式，有时也称为Quetelet指数。通过体 重(以千克计)除以身高2(以米计)来计算BMI。目前，所接受的男性和女性的“正常” 标准为BMI约20kg/m2。在一个实施方案中，超过25kg/m2的BMI可用于鉴定肥 胖对象。I级肥胖对应的BMI是25kg/m2。II级肥胖对应的BMI是30-40kg/m2； III级肥胖对应的BMI是40kg/m2以上(Jequier 1987 Ain.J Clin.Nutr.45：1035-47)。 按照身高、身体构成、骨架结构和性别，不同人种和个体的理想体重有所不同。
热量摄入或卡路里摄入：个体所消耗的卡路里(能量)数量。在本文中该术语等 同于“能量摄入”。
美容治疗：该术语表示不是为医学目的，而是为改善对象的幸福程度，例如 与对象外貌有关的治疗。该术语包括治疗想要降低体重，但不一定是超重或肥胖的 对象。
食物摄入：个体消耗的食物量。食物摄入可通过体积或重量来衡测。包括：I) 食物摄入是个体消耗的食物总量，和ii)食物摄入指个体的蛋白质、脂肪、碳水化 合物、胆固醇、维生素、矿物质或其它食物成分的摄入量。因此，本文使用的术语 食物摄入类似于术语“能量摄入”。
每日正常饮食：给定人种的个体平均食物摄入。每日正常饮食可以卡路里摄 入、蛋白质摄入、碳水化合物摄入和/或脂肪摄入表达。人的每日正常饮食一般含 有：约2,000、约2,400或约2,800到明显更多的卡路里。此外，人的每日正常饮 食一般含有约12g-45g蛋白质、约120g-610g碳水化合物和约11g-90g脂肪。 低卡路里饮食的卡路里摄入不超过个人的正常卡路里摄入的约85％、优选不超 过约70％。在动物中，卡路里和营养需求随动物的种类和体积而不同。例如， 在猫中，每kg的总卡路里摄入以及蛋白质、碳水化合物和脂肪的分布百分比 随猫的年龄和生殖状态而不同。
肥胖：过多的身体脂肪使人们处于健康危险之中的状况(参见Barlow和Dietz， Pediatrics 102：E29，1998；国家卫生研究院，国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI)，Obes.Res.6(增刊2)：59 S209S，1998)。过多的身体脂肪是能量摄入 和能量消耗失衡的结果。在一个实施方案中，用体重指数(BMI)评估肥胖。在一个 实施方案中，BMI为约22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2，特别是 约25.0kg/m2-30kg/m2认为是超重，BMI为30kg/m2或更高是肥胖。
超重：体重超过其理想体重的个体。超重的个体可以是肥胖，但不一定是肥 胖。在一个实施方案中，超重的个体是需要降低他们体重的任何个体。在另一实施 方案中，认为超重个体是BMI约为22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2， 特别是从约25.0kg/m2-30kg/m2的个体。应注意BMI略微高于正常值的个体(例 如约22kg/m2-25kg/m2)经常想减轻体重，虽然仅是为美容目的。
效力：化合物的体外效力定义为EC50值，即在给定受体相关的信号转导试验 中测定的导致最大可达到作用的50％的浓度。
对象：对象可以是任何对象，包括人和兽医哺乳动物对象。因此，所述对象 可以是人或者可以是非人灵长类，农业动物，例如猪、牛、绵羊和家禽，运动动物 (sport animal)或宠物，例如狗、猫、马、仓鼠和啮齿类动物。
治疗有效量：足以预防、治疗或缓解特定病症或疾病和/或缓解特定病症或疾 病的特定体征或症状的剂量。该术语包括足够的或能预防疾病发展，或导致疾病衰 退，或能减轻疾病的体征或症状，或能实现所需结果的剂量。在涉及美容治疗或超 重或肥胖治疗的实施方案中，受体激动剂的治疗有效量是足以抑制或停止体重的增 加，或足以降低食欲的量，或足以减少能量或食物摄入或增加能量消耗的量。术语 “美容有效量”指足以治疗对象以实现所需效果的剂量。
发明详述
在最广义方面，本发明提供了除PP以外的Y4受体激动剂在制备治疗了对Y4 受体激活起反应的疾病的组合物中的应用，该激动剂对Y4受体的选择性超过Y1 和Y2受体，
(a)所述激动剂是PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，其具有
(i)以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y4受体识别氨基酸 序列，其中R1和R1独立为氢或C1-C6烷基，X是Val、Ile、Leu或Ala，X3是除 Gln以外的残基，或其保守性取代变体，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被 Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代，和
(ii)以H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示的N-末端Y受体识别氨基酸序列，其 中X1不存在或是任何氨基酸残基，X2是Leu、Ile或Ser或它们的保守性取代变体， 或
(b)所述激动剂含有
如以上(i)所定义的C-末端Y4受体识别序列，
所述序列与毗邻所述六肽序列的N-末端处具有至少一个α螺旋转角的两亲性 氨基酸序列结构域融合，
所述转角因分子内共价键而束缚于螺旋构型中，和任选的
始于以上(ii)所定义的Y4受体识别氨基酸序列的N-末端序列；或
(c)所述激动剂含有两条共价连接的C-末端Y4受体识别氨基酸序列，其中每 条含有以上(i)所定义序列的最后4个残基。
发明相关的特定术语
本发明所考虑的激动剂是对Y4受体的选择性超过Y1和Y2受体的激动剂。 在本文中，当激动剂用本文所述亲和力试验测定时，对Y4的IC50值比对Y1和Y2 受体的至少低10倍，则符合该条件。总体上，就效力而言，本发明的激动剂用本 文所述效力试验测定时，对Y4的EC50值比对Y1和Y2受体的至少低10倍。许多 本发明优选的激动剂对Y4受体的亲和力和效力比对Y1和Y2受体的至少高100 倍。一些本发明优选的激动剂对Y4受体的亲和力和效力比对Y1和Y2受体的至 少高1000倍。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽是具有3-D结构的分子，当用X-射线晶体图 测定禽类PP的原始3-D结构(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78： 4175-79；Glover等，1984，Eur.J Biochem.142：379-85)作图时，该结构的结构 域相当于(和基本上这样排列的)所述NPY、PYY和/或PP的N-末端聚脯氨酸样螺 旋、I型β转角区域、两亲性α-螺旋和C-末端六肽结构域(图1)。因此，本文所用 的PP-折叠肽不同结构域的描述可参见禽类PP的原始X-射线结构(Blundell等， 1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：4175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142： 379-85；Schwartz等，1990)。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽模拟物是具有3-D结构的分子，当对禽类PP 的原始3-D结构作图时，该结构的结构域相当于(和基本上这样排列的)所述PP两 亲性α-螺旋最后一个转角和C-末端六肽结构域。当如上述作图时，PP-折叠肽模拟 物的结构域也相当于两亲性α螺旋的一个或多个其余的转角(remaining turn)、N-末 端聚脯氨酸样螺旋和I型β转角区域。肽模拟物无需完全由经典肽键相连的α氨基 酸序列构成。这种序列中的一个或多个键可被肽模拟物键，例如反酰胺(reverse amide)和还原的肽键替代，因而可将该肽模拟物视为拟肽序列。这类键替代能赋予 该分子抵抗内肽酶的降解和改善其药代动力学特性。
可根据原子坐标通过构建比较分子模型，或利用一种或多种计算机程序来比 较以上“PP-折叠肽”和“PP-折叠肽模拟物”定义的3-D结构，所述原子坐标可通 过例如X-射线衍射方法测定，所述计算机程序可购得以便从其分子结构式目测其 预期的3-D结构，例如：Schrdinger Inc(1500 S.W.，First Avenue，Suite 1180， Portland，OR 97201)的“Maestro Modelling Environment”；Accelrys Inc.(San Diego)的“InsightII Modeling Environment”，Release 4.0；和Tripos Inc.(1699 South Hanley Rd.，St.Louis，Missouri，63144，USA)的“SYBYL7.0”。应注 意本发明的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的3-D结构与天然的NPY、POY或 PP无需和一般不具有精确的对应关系。PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的表观 3-D结构视用于研究该结构的实验条件而不同，特别是较小的肽在某些条件下 可呈现或多或少的非折叠结构。然而，以下条件是充分的：PP-折叠肽或PP-折 叠肽模拟物应具有对应于上述那些PP-折叠结构域的结构域，具有使之采取类 似于天然肽总体形状的结构元件，其中C-末端序列和N-末端序列(如果存在的 话)是正常取向。
本发明考虑的激动剂具有C-末端Y4受体识别序列。该序列是位于该激动剂 C-末端的通常约5-7个残基长的序列，特别是六肽序列，当存在于PP-折叠肽或PP- 折叠肽模拟物中时，它能结合Y4受体和单独通过该结合作用而激活该受体，或者 作为该结合作用和存在于激动剂中的N-末端Y4受体序列的Y4受体结合的结果(而 激活该受体)。N-末端Y4受体识别序列是位于激动剂的N-末端，通常约3-5个残 基长的序列，特别是4个残基的序列，当存在于PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物中 时，该序列结合Y4受体并通过该结合作用联合与存在于激动剂中的N-末端Y4受 体序列的Y4受体结合而激活该受体。典型的C-末端和N-末端Y4受体识别序列在 天然PP肽中发现，但是从本文将明白，这些典型的序列可经修饰以保留Y4识别(能 力)但降低Y1和Y2识别(能力)。如果在本文所述的亲和力和/或效力试验中所述PP- 折叠肽或PP-折叠肽模拟物与Y4受体相互作用，存在于任何具体激动剂中的C-末 端序列是Y4受体识别序列，当该识别序列被删除，C-末端序列虽存在但不能(相 互作用)(或程度不明显)。
在本说明书中，诸如“对应于NPY的Ser3的残基”术语指该激动剂的3-D 结构对NPY的3-D结构作图时，图中最接近NPY的Ser3的氨基酸残基。类似地， 诸如“在对应于PP的Pro34位”的术语指该激动剂的3-D结构对PP的3-D结构 作图时，该激动剂在图中最接近PP的Pro34的氨基酸残基位置。由于其天然肽中 可能发生例如缺失，特定肽中具体残基的实际编号可能与此不同。
总体上，本发明考虑的PP-折叠或PP-折叠模拟物激动剂通常具有肽骨架或部 分是肽的骨架，至少具有C-末端氨基酸序列和经常具有N-末端氨基酸序列，虽然 骨架的其余部分可以是非肽接头基团，例如直链或支链亚烷基链。存在于该激动剂 的肽(peptidic)部分，特别是与Y4受体相互作用的C-和N-末端序列中的氨基酸通 常是天然产生的，但也可存在保留了PP-折叠但不阻止Y4受体结合的非天然α氨 基酸。
当本发明考虑的激动剂具有C-或N-末端氨基酸序列时，可以酰胺化C-末端和 /或可以酰化N-末端以赋予对羧肽酶和/或氨肽酶的抗性。事实上，天然NPY、PYY 和PP肽的C-末端是酰胺化的，所以本发明激动剂的C-末端氨基酸也可酰胺化。
在本说明书中，提及氨基酸时可用其通用名或缩写，例如缬氨酸(Val)、亮 氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、天冬酰胺(Asn)、 谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、 天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、 酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)。当用通用名或 缩写提到氨基酸而未明确说明其立体异构形式时，应理解所述氨基酸是L-形。 在提到D-形时会特别指明D-形氨基酸。有时，在本文想要这样做时，特指L- 形而非推断。
本文所用的术语“保守取代”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学类似的 残基取代。例子包括用性质相似的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性 氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸取代。适用于本发明的保守氨 基酸取代的非限制性例子包括用下表中性质相似的非天然α氨基酸的原来残基进 行类似取代。例如，在本发明优选的实施方案中，Met残基可用正亮氨酸(Nle)取代， 正亮氨酸是Met的生物等构物但(与Met相反)不易氧化。用通常在哺乳动物内源性 肽和蛋白质中未发现的残基进行保守性取代的另一例子是用例如鸟氨酸、刀豆氨 酸、氨基乙基半胱氨酸或其它碱性氨基酸保守性取代Arg或Lys。关于肽和蛋白质 中表型沉默取代的其它信息可参见，例如Bowie等，Science 247，1306-1310，1990。
原来残基 保守取代 Ala  Gly Arg  Lys Asn  Gln、His、Thr Asp  Glu Gln  Asn、His Glu  Asp His  Asn、Gln Ile  Leu、Val Leu  Ile、Val Lys  Arg Met  Leu、Ile Phe  Tyr、Trp、His Ser  Thr、Asn Thr  Ser、Asn、Gln Trp  Tyr、Phe、His Tyr  Trp、Phe、His Val  Ile、Leu
除非本文另有指明，应用于本文任何部分的术语“取代的”指用多达4个 相容性取代基取代，其中每个独立为，例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、 羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、卤素(包括氟、溴 和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、苯基、-COOH、-COORA、 -CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、- SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、 -NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、 -NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或- NRACONRARB，其中RA和RB独立为(C1-C6)烷基。“任选的取代基”可以是任 一上述取代基团。
除非本文另有规定，本文提及的NPY、PYY和PP肽和它们的序列涉及那 些肽的人形式和它们的序列。然而，如本文所用的那些术语一样，其它哺乳动 物的NPY、PYY和PP常可构成人NPY、PYY和PP的PP-折叠肽模拟物，或 保守取代的人NPY、PYY或PP。
本发明考虑的激动剂在它们的C-末端Y4受体识别序列中对应于PP的Pro34 位具有除Gln以外的残基，优选除Asn以外的残基。避免这些残基确保对Y2受体 的亲和力降低。
此外，当N-末端Y受体识别氨基酸序列存在于本发明考虑的激动剂中时，其 用H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示，其中X1不存在或是任何氨基酸残基，X2是 Leu、Ile或Ser或它们的保守性取代物。这些要求有助于确保N-末端Y4识别序列 的亲和力以及获得针对Y1和Y2受体的选择性。
本发明所用的(a)型激动剂
总体上，(a)型激动剂是PP、NPY或PYY的PP-折叠类似物，或PP、NPY或 PYY的PP-折叠模拟物，其含有修饰以保留或赋予Y4受体效力，但大大降低了它 们对Y1和Y2受体的效力。这种PP-折叠类似物和模拟物包括具有PP-折叠性质的 完全互补序列的肽(N-末端聚脯氨酸样螺旋、β转角、两亲性α螺旋和C-末端六肽)、 部分骨架(例如β转角残基和毗邻的残基)用非肽间隔链替代的肽类似物，和拥有C- 末端六肽和两亲α螺旋最后一个转角但缺乏所有或部分聚脯氨酸样螺旋和/或β转 角的截短的肽。总体上，(a)型激动剂是。这种PP-折叠类似物和模拟物包括具有 PP-折叠性质的全部补体的肽(N-末端聚脯氨酸样螺旋、β转角、两亲性α螺旋和C- 末端六肽)、部分骨架(例如β转角残基和毗邻的残基)被非肽间隔链替代的肽类似物 和拥有C-末端六肽和两亲α螺旋的最后一个转角但缺乏所有或部分聚脯氨酸样螺 旋和/或β转角的截短的肽。
本发明所用的(b)型激动剂
总体上，(b)型激动剂可认为是(a)型PP-折叠肽类似物或PP-折叠模拟物，它们 最小的PP-折叠特征结构(C-末端六肽和α螺旋的最后一个转角)通过特定的分子内 共价键连接而稳定。
该型激动剂的特征在于分子内连接键，这些键或在天然NPY、PYY或PP肽 中无等价物，或对应于或用共价键替代非共价相互作用，例如在禽类PP的X-射线 结构中观察到[Cys2，DCys27]PYY(SEQ ID No：4)中Cys2和D-Cys27之间的共 价二硫键，模拟了Pro2和Tyr27的侧链之间的非共价疏水相互作用。如上所述， 这种键可用于稳定PP-折叠结构的基本元件，特别是可活动的C-末端Y4识别序列 和α螺旋的最后一个转角，和/或提供N-末端。在全长或接近全长的肽中，这种键 可稳定此类天然PP-折叠结构。这有利于两方面，首先，可稳定两亲性α螺旋的C- 末端部分从而可以最佳方式提供C-末端Y4识别氨基酸序列进而提高对Y4受体的 效力；第二，通过稳定整个PP-折叠结构使这类肽不易受蛋白酶解降解，因为这种 酶往往需要它们的靶序列为非折叠形式(Schwartz等，1990)。分子内连接键也能使 Y4-选择性激动剂相对于天然肽的结构有更多修饰，例如激动剂可缺乏天然肽中发 现的一个或多个结构域或部分结构域。
一组类型(b)的激动剂具有PP-折叠结构，此结构中束缚螺旋转角的分子内连接 键从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至该激动剂的N-末端部分的连接点，该 N-末端部分对应于反平行延伸至两亲性结构域的PP-折叠肽的聚脯氨酸结构域。在 上述情况中的束缚螺旋转角的分子内连接键，例如二硫键或内酰胺键可从两亲 性结构域的一个氨基酸残基延伸至4个N-末端残基之一。
该类激动剂的特别优选的亚组由PP-折叠肽构成，所述肽含有从两亲性结构域 的一个氨基酸残基延伸至聚脯氨酸结构域的N-末端部分连接点的束缚螺旋转角的 分子内连接键。这种键可在5位和20位或8位和16位，特别是2位和27位的残 基之间，例如27位的D-Cys和2位的Cys之间的二硫键。D-形Cys优选位于27 位，因为这将巯基侧链最佳地定向为与2位引入的“正常”L-形Cys形成二硫键从 而使整个分子采取并模拟PP-折叠结构。在另一组(b)型激动剂中，束缚螺旋转角的 分子内连接键在α螺旋结构域的最后一个螺旋转角中的残基之间伸，例如在螺旋转 角的Lys和Glu残基之间，或在C-末端Y4识别氨基酸序列中的残基和α螺旋结构 域的最后一个螺旋转角中的残基之间形成的内酰胺键，例如[Iys28， Glu32]PYY25-36(SEQ ID No：5)或[Glu28，Lys32]PYY25-36(SEQ ID No：6)中的Lys 和Glu之间的内酰胺键。
本发明所用的(c)型激动剂
本发明考虑的(c)型激动剂可以认为是存在于(a)和(b)型激动剂中的C-末端Y4 受体识别序列的至少最后4个残基的二聚体，例如末端六肽序列或最后5或4个残 基的二聚体。因此，虽然C-末端Y4受体识别氨基酸序列自身(例如六肽形式)对Y4 受体的亲和力相当低，而(a)和(b)型激动剂中具有其它结构元件以变为高亲和力和 效力的配体，可能通过将两条这样的C-末端Y4受体识别氨基酸序列连接成二聚体 来获得有用的高亲和力与效力。可以想像，这种构建物出乎意料的高亲和力的原因 在于因为发现许多(如果不是全部)其它A型家族的7TM受体并且因为二聚体的功 能是在细胞膜上起作用(Bouvier，2001，Nat Rev Neurosci.2：274-86)。因此，虽然 单独的C-末端Y4受体识别氨基酸序列对Y4受体的亲和力同样相当低，这种序列 的二聚体形式的促进剂结合可导致其它C-末端Y4受体识别氨基酸序列的“非常高 的局部浓度”，从而导致二聚体配体对二聚体受体的高亲和力。在参考文献中， NPY C-末端部分的类似物的二聚构建物已制备为Y1受体拮抗剂(Daniels等，1995 Proc Natl Acad Sci USA.92：9067-71)。出乎意料的是，随后这种构建物显示为Y4 受体激动剂(Parker等，1998 Eur J Pharmacol.349：97-105)。
(c)型激动剂的两条序列可以通过例如位于两条序列中每一条的C末端至少4 个残基处的至少一对残基之间的交联键而连接。例如，两条共价相连的序列可含有 以上定义的C-末端序列的最后5个或最后6个残基。在一个实施方案中，交联是 通过两条序列中每一条的C末端的至少4个(例如，5或6)残基处的两对残基之间 的一对交联键而实现。交联方法包括半胱氨酸之间的二硫键，或通过一条序列中 2.3-丙酸残基的3-氨基与另一序列中残基侧链的羧基之间的酰胺键，或通过双氨基 酸HOOCCH(NH2)(CH2)1-6CH(NH2)COOH形成的-(CH2)1-6-键，其末端在每条序列中 形成残基。
通过一根二硫键交联的(c)型激动剂的例子是：
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：7)
然而，二聚体的两个C-末端Y4受体识别氨基酸序列不一定要相同。因此， 通过一根二硫键交联的(c)型激动剂的另一例子是：
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：8)
(c)型Y4激动剂杂二聚体的另一例子是：
S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基]-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：29)。
在该肽中，Lys残基作为血清白蛋白结合基序的连接侧(在该情况中)引入肽单 元之一的“31”位。
C-末端Y4受体识别序列((a)、(b)和(c)型激动剂)
就Y4选择而言，本发明考虑的所有3种类型激动剂具有C-末端Y4受体识别 氨基酸序列，该识别序列可由本文所述的亲和力和效力试验证实。一组优选的以本 发明的(a)、(b)或(c)型激动剂存在的C-末端Y4受体识别氨基酸序列以-X-Thr- Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中X和X3如上定义，R1和R2各自是氢。 也优选残基X3不是Asn，Lys、Arg、Asp或Glu优选不是X3残基。当前优选 X3是Pro，但X3也可以是His，或选自4-羟脯氨酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、氮杂 环丁烷-3-羧酸、氮杂脯氨酸(azaproline)和1-氨基环丁烷羧酸的非天然脯氨酸类似 物。在激动剂的C-末端Y4受体识别氨基酸序列中，残基X优选Leu。
在本发明考虑的激动剂中，以上定义的6个残基的C-末端Y4识别序列可以 是以-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端七肽的最终残基，其 中残基XA是非碱性和非酸性，序列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上定 义。在这种情况中，所述非碱性和非酸性氨基酸残基XA可以是，例如Leu或Met。
此外，前段所述的C-末端七肽序列本身可以是以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr- Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽的最终残基，其中序列-XA-X- Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上段所述，其中XC是Arg或Lys，XB是Ile、 Leu或Val。这种十一肽序列的例子包括-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Leu或Met)-Leu-Thr- Arg-(Pro或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
存在于本发明所考虑的激动剂中的C-末端十一肽的另一例子以-XC-Tyr-XB- Asn-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3- Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如以上倒数第二段所述，XC是His、Asn或Gln，XB是Ile、 Leu或Val。这种序列的例子是-His-Tyr-(Ile或Leu)-Asn-Leu-(Val/Ile)-Thr-Arg-(Pro 或His)-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在一组本发明考虑的(a)或(b)型PP-折叠模拟激动剂中，含有Y4受体识别氨基 酸序列的C-末端序列可以在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域融合，该结构域 含有毗邻所述表位N-末端的至少一个α螺旋转角和至少两个氨基酸的N-末端序列， 所述C-和N-末端氨基酸序列通过肽键与接头基团相连，该基团可以是任选含有一 个或多个双键或三键的直链或支链亚烷基。例如，接头基团可以分别与式 NH2(CH2)nCO2H所示氨基酸的羧基和氨基形成肽键，其中n是2-12，特别是6、7、 8、9或10。因此，激动剂可以是具有上述Cys-Cys键的NPY、PPY或PP的类似 物，但对应于天然肽的5-24的氨基酸残基被具有6-10个碳原子，选自6-氨基己酸 (ε-氨基己酸)、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸和氨基癸酸的氨基羧酸替代。 在特定的实施方案中，优选8-氨基辛酸(本文有时缩写为“Aoc”)。这种激动剂的 例子是[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No：9)。
N-末端Y4受体识别序列((a)和(b)型激动剂)
在本发明的(a)和(b)型激动剂的N-末端Y4受体识别氨基酸序列中，残基X1 优选是Ala或不存在。此外，在激动剂的N-末端Y4受体识别氨基酸序列中，当前 残基X2优选是Leu、Ile或Ser。
这种N-末端序列的特定例子是H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-和H2N-Pro-Leu-Glu-。
本发明关注的(a)和(b)型Y4激动剂了在它们的N-末端酰化以赋予抗氨肽酶活 性。例如可用具有2-24个碳原子的碳链进行酰化，具体的例子是N-末端酰化。
本发明所用的特定激动剂
以下是本发明所用的激动剂的特定例子：
[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No：4)
[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No：5)
[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No：6)
[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No：9)
PP2-36(SEQ ID.No：10)
[His34]-PP(SEQ ID.No：11)
[Alal，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：12)
[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：13)
[Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：14)
[Arg26，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：15)
[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：16)
[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：17)
[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No：25)
[Nle17]PP(SEQ ID.No：32)
[Nle30]PP(SEQ ID. No：33)
[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No：34)
[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No：37)
[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No：38)
[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No：41)
[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：42)
[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：43)
[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：46)
[Leu34]-PP(SEQ ID.No：51)
[Ile34]-PP(SEQ ID.No：52)
[Phe34]-PP(SEQ ID.No：53)
[Lys13]PP2-36(SEQ ID No：54)
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：7)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：18)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：19)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：49)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：50)
N-乙酰基-PP(SEQ ID.No：30)
N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-PP(SEQ ID No：31)
[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No：35)
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：39)
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，His34]-PP(SEQ ID No：44)
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID No：47)
[Cys2，N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No：48)
[N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No： 55)
S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基]-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：29)
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No：36)
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：40)
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No：45)
和它们保守性取代的类似物。
本发明所用的特别优选的Y4选择性激动剂是PP2-36、[His34]-PP(SEQ ID. No：10)或[Cys2，DCys27]-PP(SEQ ID.No：4)和它们保守性取代的类似物。
本发明所用的合适激动剂
到目前为止，本发明所用的基础Y4-选择性激动剂已得到总体描述并提供了这 种激动剂的具体例子。然而，为改善它们的药代动力学、药效学和代谢性能，可对 这种激动剂，包括特别鉴定的激动剂作出各种修饰。这种修饰可涉及将该激动剂与 本身为肽或蛋白质药物领域已知的功能基团(也称为基序)相连。无论(a)、(b)或(c) 型，在本发明考虑的激动剂的情况中，有具体益处的三种特定修饰是与血清白蛋白 结合基序或糖胺聚糖(GAG)相连，或PEG化。
虽然PP排除在本发明的用途之外，也可采用具有这种修饰的PP。
血清白蛋白结合基序
血清白蛋白结合基序一般是亲脂性基团，将其引入能延长给药后(药物)在体内 的驻留时间，或出于其它原因可用各种已知的方法将其与肽或蛋白质分子偶联，例 如i)通过共价键，例如侧链氨基酸残上的功能基团，ii)通过插入该肽中的或适当衍 生肽中的功能基团，iii)作为该肽的一种整合部分。例如，WO 96/29344(Novo Nordisk A/S)、P.Kurtzhals等，1995 Biochemical J.312：725-31和L.B.Knudsen 等，2000 J.Med.Chem.43：1664-69描述了许多可用于本发明所考虑激动剂的合适 亲脂性修饰。
合适的亲脂性基团包括任选取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的10-24 个碳原子的烃基团。这种基团可形成该激动剂骨架的侧链或其一部分，例如通过醚、 硫醚、氨基、酯或酰胺键与骨架中氨基酸残基的侧链相连，或与PP-折叠模拟激动 剂骨架中的非肽接头基团的骨架碳或骨架碳的支链相连。连接亲脂性基团的化学方 法不是关键性的，但包含亲脂性基团的以下侧链是可与该激动剂的骨架碳相连的例 子，或是其合适的支链：
CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一个整数，
CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一个整数，
CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一个整数，
-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16之间的一个整 数，
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中 p是10-16的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中 q是10-16的一个整数，和
部分或完全氢化的环戊菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。
在一个化学合成方案中，含有亲脂性基团的侧链是酰化存在于激动剂骨架 残基的侧链中的氨基的C12、C14、C16或C18酰基，例如十四烷酰基。
如上所述，对用于提供血清结合特性提高的激动剂进行修饰是一种通用方 案，特别适用于以上列出的特定激动剂。因此，经合适修饰的激动剂包括[十四 烷酰基-Ala1]-PP(SEQ ID No：20)或[十四烷酰基-Ala1，His34]-PP(SEQ ID No：21) 或它们保守性取代的类似物。
GAG结合
在上述亲脂性血清结合基序例子中，可通过加入作为该激动剂骨架侧链(或 其一部分)的GAG结合基序来修饰本发明考虑的激动剂。已知可以该方式加入 的GAG-结合基序包括氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱 性氨基酸残基，X是任何氨基酸残基。可将多条，例如3条这种序列以多联体(直 链)或枝状体(支链)的方式加入。具体的多联体GAG基序包括Ala-Arg-Arg- Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，和Ala-Arg-Arg-Arg- Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala- Arg-Ala，二者可以通过，例如多联体GAG-结合基序的C-末端与激动剂骨架氨 基酸侧链的氨基之间形成酰胺键相偶连，所述氨基例如有[Lys18，His34]PP (SEQ ID No：22)或[Lys18]PP(SEQ ID No：23)的ε氨基。
GAG基序可直接或经接头基团与激动剂的C-或N-末端(优选)共价连接，而不 是与激动剂相连或作为骨架残基侧链的一部分。GAG结合基序也可含有氨基酸序 列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸 残基，例如序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是碱性氨基酸残基，X是任 何氨基酸残基。当这些多联体重复序列结合GAG时，它们倾向于形成α螺旋， 因此当它们与C-末端六肽/最后的α螺旋转角融合时，可稳定该转角从而以最佳 方式提供Y2受体识别的组合结构。该型激动剂的具体例子是[XBBBXXBX- XBBBXXBX]PP或[XBBBXXBX-XBBBXXBX-XBBBXXBX]PP，其中B是碱性 氨基酸残基，X是任何氨基酸残基，具体是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala- Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP(SEQ ID No：24)。
本发明考虑的Y4选择性激动剂可用于需要延长接触时间的适应症。就该具体 适应症而言，激动剂优选包含上述糖胺聚糖(GAG)结合基序。这种基序能确保该激 动剂在胞外基质中与GAG结合，从而确保Y2受体在该组织中的局部接触时间延 长。生长因子，趋化因子等可通过能与GAG的酸性糖相互作用的碱性氨基酸斑 (patch)与GAG结合。生长因子上这些带正电荷表位通常由碱性残基的侧链构成， 这些残基不一定连续地位于序列中但往往通过二级结构元件，例如a-螺旋或转角或 通过该蛋白质的整个三维结构存在于邻近区域。某些上述GAG-结合性线形序列已 有描述，例如XBBXBX和XBBBXXBX，其中B代表碱性残基(Hileman等， Bioassays 1998，20：156-67)。圆二色性显示这些区段与GAG结合后形成α-螺 旋。当存在例如三条这样的序列(例如每条是ARRRAARA序列)时，如果使这 种序列位于例如多联体或枝状体构建物中，得到的24-单体肽，例如 ARRRAARA-ARRRAARA-ARRRAARA可确保其在胞外基质中的保留(时间)类 似于高分子量聚赖氨酸，即在4小时输注期间不会被洗掉(Sakharov等，FEBS Lett 2003，27：6-10)。
因此天然构建的生长因子和趋化因子有两类结合基序：一类受体的结合基序， 通过它实现信号转导，而一类GAG的结合基序，通过它实现结合与持久的局部活 性。诸如PYY和NPY等肽是神经肽和神经激素，它们可从组织中相当快速地洗掉， 这对持久的局部作用而言不是最佳的。使GAG-结合基序与本发明的Y4选择性激 动剂或已知的典型肽激动剂PYY3-36结合，构建了一种具有PP-折叠肽部分的受体 结合表位和GAG-结合基序的类似于生长因子和趋化因子的双功能分子。
如上所述，在本发明优选的实施方案中，GAG-结合基序，例如安置上述的多 联体24-聚序列作为Y4-选择性激动剂的N-末端延伸段。这种安置(方式)对N-末端 截短的PP-折叠模拟激动剂特别有意义。虽然本文所述的激动剂是Y4选择性的， 但它们与天然PP相比，在一定程度上对Y4受体的亲和力或效力降低。由于和GAG 结合可形成能有助于稳定螺旋部分从而有助于以正确方式提供远端C-末端区段的 α-螺旋，采用这种截短的PP-折叠模拟激动剂和多联体GAG-结合基序有利于延长 (接触时间)。
就NPY肽及其类似物而言，引入PP-折叠肽的GAG结合基序(例如碱性多联 体或枝状体构建物)的另一合适位置是14位，就PYY和PP肽及它们的类似物而言 是13位。然而，如上所述，可将含有GAG-结合基序的残基引入激动剂中的任何 位置，前提是这种引入与保留本发明考虑的(a)、(b)和(c)型激动剂中所需的PP-折 叠结构和C-末端Y2-识别序列所需的(结构)相一致。因此，可将GAG-结合基序作 为类似物中的间隔构建物部分安置，所述类似物的PP-折叠部分可用非肽间隔物替 代。
PEG化
在PEG化过程中，将一个或多个聚环氧烷基团共价偶联于肽或蛋白质药物以 提高给药后在体内的有效半衰期。该术语得自该方法所用的优选聚环氧烷，即得自 乙二醇-聚乙二醇或“PEG”。
合适的PEG基团可通过任何方便的化学方法与激动剂相连，例如通过激动剂 的骨架氨基酸残基。例如，就PEG样的分子而言，常用的连接基团是赖氨酸的ε- 氨基或N-末端氨基。其它连接基团包括游离羧基(例如，C-末端氨基酸残基或天冬 氨酸或谷氨酸残基的羧基)、适当活化的羰基、巯基(例如，半胱氨酸的巯基)、芳香 族氨基酸残基(例如，Phe、Tyr、Trp)、羟基(例如，Ser、Thr或OH-Lys的羟基)、 胍基(例如，Arg)、咪唑基(例如，His)和氧化的碳水化合物部分。
当激动剂PEG化后，它通常包含1-5个聚乙二醇(PEG)分子，例如1、2或3 个PEG分子。每个PEG分子的分子量可以是约5kDa(千道尔顿)-100kDa，例如 约10kDa-40kDa的分子量，如约12kDa或优选不超过约20kDa。
合适的PEG分子可购自Shearwater Polymers，Inc.和Enzon，Inc.，并且可 选自SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、 SC-PEG、分枝mPEG(US 5,880,255)，或氧基羰基-氧基-N-二羧基酰亚胺-PEG (US 5,122,614)。
血清白蛋白、GAG和PEG
无论对激动剂的修饰是与某基团连接以促进血清结合、GAG结合还是通过 PEG化提高其稳定性，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团可以是 激动剂碳骨架的侧链或者可以形成激动剂碳骨架侧链的一部分，所述骨架碳对应于 以下PYY或PP的任一位置：1、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16、17、 18、19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或对应于以下NPY的任一位 置：1、3、4、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、 26、28、29、30和32。
特别是当激动剂是(b)型时，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基 团也可以是或可形成碳骨架侧链的一部分，对应于以下PYY、NPY或PP的任一 位置：2、5、8、9、13、14、20和24。
与较大生物分子的偶联
如上所述，可在PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的各种位置连接某些基序而不 削弱它们对Y受体的高亲和力(见实施例)。以类似方式，选择性Y4受体激动剂可 作为与例如白蛋白或另一种蛋白质或运载体分子相连的融合蛋白使用，从而提供有 益的药代动力学或其它类型性能，例如减少肾排除。如同可采用多种蛋白质或运载 体那样，本领域已知这种共价结合可采用多种化学修饰基团和接头。特别优选将选 择性Y4肽激动剂与白蛋白共价结合于PP-折叠结构中，本文其它地方已指出的可 用各种基序修饰的有关位置。这种融合蛋白可以通过各种半合成技术产生，其中肽 可通过本文所述的肽合成技术制备，和通过重组技术制备生物分子。该融合蛋白也 可整体作为表达的重组分子来制备，例如含有延伸序列Gly-Lys-Arg的前体分子， 当该分子在真核细胞中表达为分泌型蛋白时将被生物合成酶切割，C-末端Y4受体 识别序列的C末端Tyr残基上的Gly转变为羧酰胺。
稳定化
如本文各处提及的那样，可以各种方法稳定本发明的许多选择性Y4激动 剂，例如通过N-末端酰化或通过用非肽接头替换激动剂部分骨架，或通过内部 环化交连来稳定PP-折叠结构。在大多数情况中，该稳定作用有两个目的，一 是通过保留PP-折叠以最佳方式提供Y4受体的受体识别表位，另一是稳定此肽 以抵抗降解，即特别是蛋白酶解的降解。当也通过连接上述各种基序来修饰选 择性Y4激动剂以获得延长的半衰期、缓释和/或长时间组织接触时，这点特别 重要。如通常的和与选择性Y4激动剂肽，例如PP-折叠稳定化，环形[Cys， D-Cys27]PP及其各种类似物相关的具体例子所述，通常此肽激动剂主要通过肾 脏相对快速地排出，因此蛋白质稳定性可能不重要，然而，当要求此肽以一种 或多种方式在各种体液中延长存在数小时时，保持该肽的生物活性完整就特别 重要，即其稳定形式应能耐受蛋白酶解攻击。因此，在本发明优选的实施方案 中，Y4选择性激动剂均是结构稳定的(通过结构改变，一些在以下实施例中具 体指出)，它们用各种基序修饰和/或与生物分子融合和/或以药学方式制备以获 得缓释等或延长的受体接触(时间)。
螺旋诱导肽
已提及本发明考虑该激动剂N-末端的酰化可作为稳定该激动剂抵抗氨肽 酶作用的一种方法。另一种稳定性修饰包括将4-20个氨基酸残基的稳定性肽序 列共价连接于N-和/或C-末端，优选N-末端。此稳定性肽中的氨基酸残基选自 Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met等。 在一令人感兴趣的实施方案中，N-末端肽连接包含4、5或6个Lys残基，例 如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP或Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP。这些稳 定性肽可连接在PP-折叠肽激动剂的N-末端或者可将它们置于N-末端截短的 PP-折叠模拟激动剂或N-末端缩短的PP-折叠模拟激动剂的N-末端，其中将间 隔肽引入新的N-末端和稳定性肽之间。由于Lys残基链倾向于形成α螺旋结构 并在随后的残基中诱导这种结构，如上所述这有益于由本发明选择性Y2激动 剂肽最后螺旋转角和C-末端Y2受体识别氨基酸序列的受体呈递，这种修饰特 别令人感兴趣。这种稳定性肽延伸物的常规描述见纳入本文作为参考的WO 99/46283(Zealand Pharmaceuticals)。
本发明考虑的受体激动剂可通过熟知的方法制备，例如合成、半合成和/ 或重组方法。这些方法包括标准肽制备技术，例如溶液合成和固相合成。为获 得激动剂和它们的衍生物或修饰物，本领域技术人员根据本领域的教材和常规 知识知晓如何操作。
下文结合分子药理学特性以及肽化学和稳定特性描述本发明特定的激动 剂。
N-乙酰基-PP(SEQ ID.No：30)，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-PP(SEQ ID No：31)，[Nle17]PP(SEQ ID.No：32)，[Nle30]PP(SEQ ID.No：33).
[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No：34)，[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基- Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No：35)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}- Lys13]PP(SEQ ID No：36)
这些肽描述了内源性Y4激动剂PP的有用的变体或类似物。N-乙酰基-PP和 N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-PP是在α-氨基处修饰以提供抗氨肽酶的蛋白酶解降 解保护的PP类似物。在N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-PP情况中，(N’-十四烷酰 基)-γ谷氨酰基基序同时构成确保延长有效的T的血清白蛋白基序。[Nle17]PP、 [Nle30]PP、[Nle17，Nle30]PP代表了其中PP2-36中的Met残基被不可氧化的残基 (在该情况中是非天然的正亮氨酸(Nle)残基)取代的类似物。由于Met和Nle之间的 结构高度相似，这种取代不改变Y4受体的高亲和力和选择性。[N-(N’-十四烷酰 基)-γ谷氨酰基-Lys13]-PP和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP代 表了PP类似物，其中为与血清白蛋白等结合从而延长有效的T，为与GAG结合 从而(实现)自注射位点的缓释和/或因在组织中的存在时间延长而获得持久的局部 Y4受体接触，这些类似物连接有基序，在两种情况中，基序与引入17位的Lys 残基相连。由于Lys残基(从而也包括各种基序)引入结构中远离肽被Y受体识别之 处，这些修饰不影响基础肽的高度Y4亲和力和选择性。如本文其它地方所述，另 一种有用的取代可以是，例如PEG化。这些PP类似物是本发明所述许多不同组的 对Y4具有超过对Y1和Y2的高度选择性激动剂的一组成员(在该情况中，除了引 入各种基序的连接位点之外的地方保留了基础PP结构)，治疗对Y4激动剂起反应 的疾病，例如肥胖症、分泌性腹泻、应激性肠病等的化合物可从本发明中选择。这 些是新的化合物。
PP2-36(SEQ ID No：10)
该肽是(a)型，代表了含有其中1号残基不存在的N-末端Y4受体识别氨基酸 序列的PP类似物。与PP1-36相比，PP2-36是稳定性改善的高度选择性Y4受体激 动剂。由于PP在2位具有Pro，其通常是DPP-IV降解的底物。因此，通过除去 PP的第一个残基，产生了未危及PP折叠结构的肽，因为残基1(Ala1)不与反平行 的螺旋有任何相互作用(该作用由Pro2负责)并且因为PP2-36不再像野生肽是 DPP-IV的底物。重要的是，与Y1受体依赖于1位中存在残基相反，Y4受体不依 赖于1位中存在残基。因此，PP2-36既是更稳定的肽，又是对Y1受体的选择窗 (selective window)提高的选择性Y4受体激动剂。
受体识别情况-PP2-36以IC50＝0.64nM的亲和力与Y4受体结合，该亲和 力类似于PP的亲和力，IC50＝0.41。PP2-36对Y1和Y2受体的亲和力＞1000nM(表 1)。在实验部分所述的转染COS-7细胞中进行的磷酸肌醇酯转化试验中测定到 PP2-36作为激动剂以0.64nM(EC50)的效力对Y4受体起作用，该效力非常类似于 PP的效力(EC50＝0.85nM)(表2)。PP2-36和PP均是Y2受体的低亲和力配体，即 EC50值＞1000nM。然而，PP2-36对Y1受体的效力比PP的低3-4倍，EC50值 是297对83nM(表2)。因此，如在体外功能试验中所测定的，PP2-36是对Y1和 Y2受体的选择窗大于300倍的高度选择性Y4激动剂。
蛋白质稳定性-与PP1-36相比，PP2-36的优点在于它更稳定，因此是更好的 生物药物，因为它不是DPP-IV的底物(由于在2位存在Pro残基，PP是其底物)并 且PP2-36中新颖的N-末端Pro残基保护其免遭大多数其它氨肽酶降解。这些稳定 特性在通过各种方法，例如修饰肽或通过各种形式的药学方法，例如缓释制剂延长 该肽在体液中的存在时间的场合特别有用。
急性食物摄入的体内作用-禁食16小时后，通过皮下注射将盐水或PY2-36 以每只动物1或10μg的剂量给予各组小鼠(每组8只)。图2显示了小鼠在8 小时期间累积的食物摄入量。选择性Y4受体激动剂PP2-36在开始进食后的最 初20分钟将食物摄入抑制到接受盐水的小鼠所摄入的约50％。当在整个第一 小时测定时，也观察到对食物摄入的50％抑制作用。1μg和10μg的PP2-36 的作用相当类似。PP2-36的抑制作用维持于一次皮下注射后的整个8小时期间 (图2)。因此，如以前对PP所证实的，对Y4具有超过对Y1和Y2受体的高度 选择性PP2-36是小鼠食物摄入的有效抑制剂(Asakawa等，1999 Peptides 20： 1445-48，Asakawa 2003 Gastroenterology 124：1325-36)。已经证实PP的这种作 用也在正常的人对象(Batterham等，2003 Clin.Endocrinol.Metab.88：3989-92)和 肥胖症患者(Berntson等，1993 Peptides 14：497-503)中观察到。
[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No：37)，[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No：38)，[N-(N’- 十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：39)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg- Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：40)
这些肽阐明了(a)型PP2-36的高选择性Y4受体激动剂的一个例子的有用变体 或类似物。[Nle17]PP2-36和[Nle30]PP2-36代表了PP2-36中的Met残基被不可氧 化的残基(在该情况中是非天然的正亮氨酸(Nle)残基)取代的类似物。由于Met和 Nle之间的结构高度相似，这种取代不改变Y4受体的高亲和力与选择性。[N-(N’- 十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13]-PP2-36和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg- Ala)3}-Lys13]PP2-36代表了PP2-36的类似物，其中为与血清白蛋白等结合从而延 长有效的T，和为与GAG结合从而(实现)自注射位点的缓释和/或因在组织中的 存在时间延长而获得持久的局部Y4受体接触，这些类似物连接有基序，在两种情 况中，基序与引入17位的Lys残基相连。由于Lys残基(从而也包括各种基序)引 入结构中远离肽被Y受体识别之处，这些修饰不影响基础肽的高度Y4亲和力和选 择性。如本文其它地方所述，另一种有用的取代可以是，例如PEG化。这些PP2-36 类似物是本发明所述许多不同组的对Y4具有超过对Y1和Y2的高度选择性激动 剂的一组成员，治疗对Y4激动剂起反应的疾病，例如肥胖症、分泌性腹泻、应激 性肠病等的化合物可从本发明中选择。这些均是新的化合物。
[His34]-PP(SEQ ID No：11)，[Leu34]-PP(SEQ ID.No：51)，[Ile34]-PP (SEQ ID.No：52)，[Phe34]-PP(SEQ ID.No：53).
该肽代表了作为PP类似物的一组(a)型高选择性Y4激动剂，其在C-末端Y4 受体识别氨基酸序列中具有取代，在这些情况中，优选在通常是Pro残基的34位 发生单独取代。34位取代的PP类似物构成了本发明所述许多不同组的对Y4具有 超过对Y1和Y2的高度选择性激动剂的一组，治疗对Y4激动剂起反应的疾病， 例如肥胖症、分泌性腹泻、应激性肠病等的化合物可从本发明中选择。这些是新的 化合物。
受体识别情况-如图1所示，用例如[His34]PP的另一残基取代天然的Pro34 不损害对Y4受体的亲和力，因为[His34]PP以类似于PP(IC50＝0.41nM)的高 亲和力(IC50＝0.48nM)与Y4受体结合。重要的是，[His34]PP对Y1和Y2受 体的亲和力不可测定(IC50＞1000nM)。因此，与Y1和Y2受体相反，这是高 度选择性Y4受体配体。在磷酸肌醇酯转化试验中检测到作为Y4受体激动剂的 [His34]-PP以极其类似于PP的效力(EC50＝0.64nM)的1.2nM(EC50)效力起作 用(表2)。因为PP、[His34]-PP对Y2受体显示低效力，即EC50值＞1000nM。 然而，[His34]-PP对Y1受体的效力远低于PP的，[His34]-PP的EC50值为＞1000 nM而PP的为83nM(表2)。因此，如在体外功能试验中所测定的，[His34]-PP 是对Y1和Y2受体的选择窗大于1000倍的高度选择性Y4激动剂。
蛋白质稳定性-[His34]-PP具有类似于PP的蛋白质稳定性。
[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No：41)，[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：42).
[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：43)，[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基- Lys13，His34]-PP(SEQ ID No：44)，[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3} -Lys13，His34]PP(SEQ ID No：45)
这些肽阐明了(a)型的高选择性Y4受体激动剂的一个例子的有用变体或类似 物，其特征在于，在C-末端Y4受体识别氨基酸序列中具有取代，在这种情况中是 34位，在这种具体的情况中是[His34]PP。[Nle17，His34]-PP、[Nle30，His34]-PP 和[Nle17，Nle30，His34]-PP代表了[His34]PP中的一个或两个Met残基被不可氧 化的残基(在该情况中是非天然的正亮氨酸(Nle)残基)取代的类似物。由于Met 和Nle之间的结构高度相似，这种取代不改变高度Y4受体亲和力与选择性。[N-(N’- 十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，His34]-PP和[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg- Ala)3}-Lys13，His34]PP代表了[His34]PP的类似物，其中连接有基序以便与血清白 蛋白等结合从而延长有效的T，以及与GAG结合从而(实现)自注射位点的缓释和 /或因在组织中的存在时间延长而获得持久的局部Y4受体接触，在两种情况中，基 序与引入17位的Lys残基相连。由于Lys残基(从而也包括各种基序)引入结构中 远离肽被Y受体识别之处，这些修饰不影响基础肽的高度Y4亲和力和选择性。如 本文其它地方所述，另一种有用的取代可以是，例如PEG化。这些[His34]PP类似 物是本发明所述许多不同组的对Y4具有超过对Y1和Y2的高度选择性激动剂的 一组成员，治疗对Y4激动剂起反应的疾病，例如肥胖症、分泌性腹泻、应激性肠 病等的化合物可从本发明中选择。这些均是新的化合物。
[Ala1，Pro34]-PYY(SEQ ID No：12)，[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID No：13)， [Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No：14)，[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY(SEQ ID No：25)
这些肽是代表PYY类似物的(a)型选择性Y4受体激动剂，其中C-末端Y4受 体氨基酸序列通过Pro34取代引入PYY的C-末端并且通过N-末端Y4受体识别氨 基酸序列中的取代，即Ala1取代Tyr，Ala2取代Pro或Glu4取代Lys增加了对 Y1受体的选择性。在[Ala1，Glu4，Pro34]-PYY的N-末端区段中进行两种取代。 [DesTyr1，Pro34]-PYY也是对Y1受体的选择性增加的另一种肽。这些[Pro34]PYY 类似物是本发明所述许多不同组的对Y4具有超过对Y1和Y2的高度选择性激动 剂的一组成员，治疗对Y4激动剂起反应的疾病，例如肥胖症、分泌性腹泻、应激 性肠病等的化合物可从本发明中选择。这些肽均是新的化合物。
受体识别情况-例如，与Y2受体(IC50＞1000nM)和Y1受体(IC50＝176nM) 相反，[Ala1，Pro34]-PYY以高亲和力结合Y4受体(IC50＝4.4nM)(表1)。因此， PYY中的Ala1和Pro34取代增加了对Y4受体的亲和力(从30到4.4nM)并降 低了对Y1受体(从16到176nM)和Y2受体的亲和力(从0.22nM到＞1000nM)。 例如[Glu4，Pro34]-PYY的受体识别情况颇为相似，对Y4受体的亲和力为2.4 nM，对Y1受体的亲和力为99nM(表1)。
[Arg26，Pro34]-PYY(SEQ ID No：15)，[Ile28，Pro34]-PYY(SEQ ID No： 16)，[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID No：17)
这些肽也是代表PYY类似物的(a)型选择性Y4受体激动剂，其中C-末端Y4 受体氨基酸序列通过Pro34取代引入PYY的C-末端并且通过PYY序列中的C-末 端区段的单独取代，即Arg26取代His，Ile28取代Leu或Met30取代Leu增加 了对Y1受体的选择性。这些[Pro34]PYY类似物是本发明所述许多不同组的对Y4 具有超过对Y1和Y2的高度选择性激动剂的一组成员，治疗对Y4激动剂起反应 的疾病，例如肥胖症、分泌性腹泻、应激性肠病等的化合物可从本发明中选择。这 些均是新的化合物。
受体识别情况-例如，与Y2受体(IC50＝177nM)和Y1受体(IC50＝15nM) 相反，[Arg26，Pro34]-PYY以高亲和力结合Y4受体(IC50＝0.43nM)(表1)。例 如[Arg30，Pro34]-PYY的受体识别情况颇为相似，但对Y1受体具有更高的选择 窗，因为其对Y4受体的亲和力为0.99nM，对Y1受体的为173nM，对Y2受 体的为＞1000nM。第三实施例，[Met30，Pro34]PYY的相应数据见表1。
[Cys2，D-Cys27]PP(SEQ ID No：4)
该肽代表了设计为具有受体选择性和高度稳定性的(b)型高度选择性Y4激动 剂。[Cys2，D-Cys27]PP代表了一组选择性Y4激动剂，其中为稳定其PP-折叠结构， 在该具体情况中，在全长PP分子的取代2位Pro的Cys和取代27位Tyr的D-Cys 之间引入接头，在该情况中是分子内二硫键。[Cys2，D-Cys27]PP也受保护免遭 DPP-IV降解，因为它在2位不再具有Pro。N-末端乙酰化修饰也使该肽具有活 性，这种修饰进一步防止该肽受氨肽酶降解。游离肽和例如乙酰化形式是新的 化合物。
受体识别情况-[Cys2，D-Cys27]PP以一位纳摩尔(single digit nanomolar)亲 和力与Y4受体结合，IC50＝8.2nM。它对Y4受体具有高度选择性，因为 [Cys2，D-Cys27]PP对Y1和Y2受体的亲和力＞1000nM(表1)。在转染的COS-7 细胞中进行的磷酸肌醇酯转化试验中测定到[Cys2，D-Cys27]PP作为激动剂以4.6 nM(EC50)的效力对Y4受体起作用，仅比PP的低7倍(EC50＝0.64nM)(表2)。 [Cys2，D-Cys27]PP是Y2受体的低效力配体，即EC50值＞1000nM。重要的是， 与PP相反，[Cys2，D-Cys27]PP对Y1受体的效力非常低，即PP的EC50值是 83nM而[Cys2，D-Cys27]PP的不可测(表2)。因此，[Cys2，D-Cys27]PP是对Y1 和Y2受体的选择窗改善的高度选择性Y4激动剂。
蛋白质稳定性-与PP相比，[Cys2，D-Cys27]PP的优点在于它更稳定，因此 是更好的生物药物，因为它不是DPP-IV的底物并且分子内二硫键稳定了其PP-折 叠。这些稳定特性在通过各种方法，例如修饰肽或通过各种形式的药学方法，例如 缓释制剂延长该肽在体液中的存在时间的场合特别有用。
[Cys2，N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No：48).
该肽代表了一组(b)型高度选择性Y4激动剂，其设计为具有受体选择性和通 过上述分子内连接键而具有高度稳定性，并且通过与结合基序相连而得到修饰，在 该情况中例如将血清白蛋白结合基序与[Cys2，D-Cys27]PP中引入的Lys13残基相 连。因为连接位点的位置，它具有类似于[Cys2，D-Cys27]PP的结合Y受体的特 性。
[Cys2，Aoc5-24，DCys27]-PP(SEQ ID No：9)
[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP是(b)型选择性Y4激动剂，它代表了中心截短 二硫键稳定的PP肽模拟物，其对Y4受体具有选择性，相比于PP的优点在于 更小(与36个残基相比，只有16个残基)且稳定。[Cys2，Aoc5-24，DCys27]-PP 是新的化合物。
受体识别情况-[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP以286 nM的亲和力与Y4受体 结合，对Y1和Y2受体的亲和力不可测(表1)。
[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID No：5)和[Glu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID No：6)
这些是(b)型选择性Y4受体激动剂，代表了通过分子内内酰胺键稳定的环形 PP类似物。在这些情况中，PP的Ile28(在实际十二肽的4位)被Lys或Glu残 基取代，Thr32(在实际十二肽的8位)被Glu或Lys残基取代，28位和32位的 这些残基侧链的氨基和羧基通过内酰胺化相连。这些肽的新的化合物。
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No：7)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No：18)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No：26)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：49)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2 (SEQ ID.No：50)。
这些是(c)型选择性Y4受体激动剂，代表了其中两条C-末端Y4受体识别氨基 酸序列相连(在这些情况中是通过两个Cys残基之间的二硫键)的二聚体构建物。这 些肽的优点在于小但具有高效力，是选择性Y4受体配体。这些是新的化合物。
受体识别情况-例如，[CTRPRY-酰胺]×2均-二聚体(SEQ ID No：18)以29 nM的亲和力结合Y4受体，对Y1和Y2受体的亲和力不可测(表1)，而较长的 [CLTRPRY-酰胺]×2均-二聚体(SEQ ID No：26)对Y4受体的亲和力甚至更高 (IC50＝1.3nM)并且对Y1和Y2受体的亲和力仍不可测(表1)。因此，该(c)型 化合物在高亲和力的Y4结合与低亲和力的Y1和Y2受体结合之间具有广泛的 选择窗，即在本文给出的[CLTRPRY-酰胺]×2均-二聚体例子之间具有＞1000 倍的差异。
S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基]-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
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S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：29)
该肽代表了一组(c)型选择性Y4受体化合物，它是其中两条C-末端Y4受体识 别氨基酸序列相连(在这些情况中是通过两个Cys残基之间的二硫键)并且被结合基 序(在该情况中是与取代“31”位Leu的Lys相连的血清白蛋白结合基序)修饰的二 聚体构建物。因此，尽管该基础肽的体积小，该类型的Y4选择性化合物在肾脏中 不被快速洗出从而具有延长的T。结合基序的连接位点接近对Y4受体识别影 响最小的二硫键处，该“31”位残基缺失的以上较短的[CTRPRY-酰胺]×2的 高亲和力结合说明了该情况。
临床适应症
本发明考虑的Y4-特异性激动剂可用于治疗对Y4受体激活起反应的疾病。这 种疾病包括显示需要调节能量摄入或能量代谢或诱导血管生成的疾病。就这种用途 而言，该激动剂可包含能赋予对肽酶的稳定性、血清蛋白质结合性能、PEG化或 GAG-结合基序以延长血清和/或组织半衰期的修饰或基序。
显示需要调节能量摄入或能量代谢的疾病或病症包括肥胖和超重，与肥胖和 超重认为是影响因素的疾病，例如食欲过胜、神经性贪食、X综合征(代谢综合征)、 糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、 葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉病、心肌梗 塞、周围血管病、中风、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾 病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，或乳腺癌、 前列腺癌或结肠癌。
Y4选择性激动剂在治疗腹泻或肠造口术的过度分泌(hyper-secretion from intestinal stomia)、治疗恶心或呕吐、或作为抗恶心或止吐药或与易于导致恶心和/ 或呕吐的药物共同治疗中也有价值。
1.肥胖和超重
在17世纪已有暗示，PP可能涉及对食物摄入的控制。近来，啮齿类动物研究 积累的许多证据非常清楚地显示事实上当PP外围给药时，其是强有力且有效的食 欲减退肽(Askawa等，Peptides 1999，20；Gastroenterology 2003，124：1325-36)。 由于PP在Y4敲除动物中对食欲、食物摄入等无影响，PP非常可能通过Y4受体 起到降低食欲和食物摄入的作用(Batterham等，“Coimbra国际NPY研讨会2004 摘要S3.3”(2004 abstract S3.3 from International NPY symposium in Coimbra)， 葡萄牙)。PP在饮食诱导的肥胖动物中对食物摄入也有作用。PP受体尤其在血脑 屏障无效的postreama区域的脑干中和迷走神经运动神经元上发现，循环激素例如 PP可接近神经元。因此，脑干中NTS的Y4受体很可能是PP起到抑制食欲和食 物摄入的主要靶位。然而，近来的证据也指出PP也可能通过POMC上可能的弓形 核，也可能是NPY/AgRP神经元中的Y受体起作用(Batterham等，“Coimbra NPY 大会摘要S3.3”(Coimbra NPY meeting abstract S3.3))。在肥胖对象，特别是患普 -韦综合征的对象中发现PP的水平低(Zipe等，J.C.E.M.1981，52：1264-6；Holst 等，1983，INT.J.OBES.7：529-38；Glaser等，Horm.Metab.1988，20：288-92)， 在神经性厌食患者中发现PP水平高。重要的是，在人中输注PP降低食欲和食物 摄入达24小时(Batterham等，JCEM 2003，88：3989-92)。因此，循环(系统)中PP 回复正常水平后仍观察到PP对食物摄入的作用。也熟知其它化合物，例如ICV注 射AgRP对食欲有这种持久的作用。重要的是，输注PP显示在患普-韦综合征的病 态肥胖患者中降低食物摄入(Bemtson等，1993 Peptides 14：497-503)。
因此，为调节能量摄入，本发明考虑的Y4选择性激动剂适用于包括人的哺乳 动物对象。所以，本发明涉及调节能量摄入、食物摄入、食欲和能量消耗的方法。 本文公开了通过给予对象美容或治疗有效量的这种激动剂来减少能量或食物摄入 的方法。在一个实施方案中，给予该受体激动剂导致(摄入的)食物总量或总体积或 卡路里含量减少。在另一实施方案中，(给予受体激动剂)可导致食物成分的摄入减 少，例如脂质、碳水化合物、胆固醇或蛋白质的消化降低。在本文公开的任何方法 中，可以给予本文详述的优选化合物。在其它实施方案中，本文公开了通过给予治 疗有效量的这种激动剂来降低食欲的方法。食欲可通过本领域技术人员已知的任何 方法测定。可用本领域技术人员已知的任何方法测定食欲。
例如，可通过生理评估来评价食欲降低。在这种实施方案中，给予该受体激 动剂可导致对饥饿的感知、过饱的感觉和/或饱帐感的变化。可用本领域技术人员 已知的任何方法来评估饥饿。在一个实施方案中，用生理试验评估饥饿，例如利用 调查表来评估饥饿感和感官感知。
在另一实施方案中，本文公开了降低上胃肠(GI)道能动性，例如降低胃排空的 方法。已知PP(原型Y4激动剂)可降低胃排空。该方法包括给予对象治疗有效量的 这种Y4选择性激动剂，从而降低胃肠道能动性。降低胃排空的化合物也熟知在降 低食物摄入中具有有益作用，因为对象感觉到过饱或饱胀感。
在其它实施方案中，本文公开了改变对象的能量代谢的方法。该方法包括给 予对象治疗有效量的这种激动剂而改变能量消耗。所有生理过程均消耗能量。机体 可通过调节那些过程的效率或者改变正发生过程的数量和性质来直接改变能量消 耗率。例如，在消化期间，机体消耗能量便食物通过肠道移动并消化食物，在细胞 中，细胞代谢效率的改变会产生或多或少的热量。在其它实施方案中，本文公开了 本申请所述弓形线路(arcuate circuitry)的所有调节方法，该方法协同改变了食物摄 入并回应性改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和利用卡 路里的结果。因此，在该实施方案中，外周给药导致能量消耗增加和卡路里利用率 降低。在一个实施方案中，给予对象治疗有效量的本发明受体激动剂从而增加了能 量消耗。
在治疗应用和美容应用相关的几个实施方案中，可用Y4选择性激动剂控制体 重和治疗、减轻或预防肥胖，特别是以下一种或多种用途：预防和减轻体重增加； 诱导和促进体重降低；减轻体重指数所测定的肥胖症。如上所述，本发明还涉及 Y4选择性激动剂在控制食欲、饱胀和饥饿中的应用，特别是以下一种或多种应用： 降低、压制和抑制食欲；诱导、增加、提高或促进饱胀和饱胀感；降低、抑制和压 制饥饿和饥饿感。该内容还涉及Y4选择性激动剂的以下一种或多种应用：维持所 需体重、所需体重指数、所需外貌和良好的健康状况。
在另一方面，本发明涉及治疗和/或预防能量代谢降低、进食障碍疾患(feeding disorder)、食欲紊乱、超重、肥胖、食欲过胜、神经性贪食、X综合征(代谢综合 征)或与它们相关的并发症或风险，包括糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型 糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高 血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、心肌梗塞、血栓栓塞性疾病、 高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病 如多囊性卵巢综合征，乳腺癌、前列腺癌或结肠癌，该方法包括给予对象，例 如包括人的哺乳动物有效剂量的一种或多种本文所述Y4选择性激动剂。
2.肠分泌过多已知PP对小肠和大肠具有强烈的抗分泌作用，该作用显示受位 于上皮细胞中的Y4受体介导(Cox和Tough，2001 Br.J.Pharmacol.135：1505-12)。 外周给予PYY(另一种激活Y1和Y2受体的PP-折叠肽)在体内显示持久降低经回 肠造口术的人对象中各种肠内多肽诱导的肠分泌(Playford等，1990 Lancet 335： 1555-57)。结论是，PYY可以是抗腹泻的治疗性药物。然而，例如联用Y1和Y2 激动剂，NPY和PYY的利尿钠和高血压作用阻止了这种作用。这种副作用与本 发明的选择性Y4受体激动剂无关。因此，本发明的选择性Y4激动剂特别可用 于治疗或保护以抵御胃肠道过度分泌，包括各种形式的腹泻，而无论它们是否 直接由过度分泌导致，因为抑制肠液过度分泌既消除了腹泻的诱因又消除了症 状。一种特别感兴趣的适应症是在经常丧失大量液体的经回肠造口术的患者中观 察到的过度分泌。本发明的选择性Y4激动剂特别可用于治疗或保护以抵御小肠回 肠造口术相关的过度分泌。
3.呕吐与恶心
已有提示可作为控制食欲的药物的许多肽和其它类型的化合物，例如PYY和 CB1拮抗剂是会引起呕吐的。例如，事实上在1989年在肠提取物中发现PYY(“第 二次”)作为生物活性实体导致狗呕吐(Harding和McDonald，1989 Peptides 10： 21-24)。结论是，PYY是鉴定到的最有效的循环催吐肽，该作用通过已知具有渗 漏血脑屏障的postreama区域介导。也有报道说，当将PYY3-36外周给予人对象 时可导致恶心(Nastech press release 29th of June 2004)。令人感兴趣的是，注意到 以相似剂量给药的PP不导致这些狗呕吐(Harding和McDonald，1989)。因此，通 过也位于脑干的postreama区域的Y4受体起作用的PP不导致呕吐。重要的是， 可给予动物例如弥猴(cyno monkey)大剂量的组合Y2-Y4激动剂肽(对Y2受体具有 与PYY相似的体外效力)，达到12-13.000nM的极高血浆水平而未观察到任何动 物呕吐或胃肠道副作用的证据。由于当对Y2受体具有相似效力的PPY3-36以很低 的剂量给予时在人和可能的动物中未导致呕吐，这是出乎意料的。因此，组合的 Y2-Y4选择性激动剂未导致呕吐的情况出乎意料地与选择性Y2激动剂(PYY3-36 化合物)一样。明显，Y4受体激活(可能在postreama区域)阻止了Y2激活的催吐作 用(在该情况中是作用于Y2受体的同一化合物导致的作用)。因此，本发明的Y4 选择性化合物特别可用于治疗或保护以抵御呕吐与恶心。这可以是与例如另一种经 常导致呕吐与恶心的食欲抑制药物如Y2激动剂型、CB1拮抗剂/反向拮抗剂型或 其它类型的食欲抑制药物进行治疗相关的呕吐与恶心。应该注意的是，Y4选择性 化合物的食欲抑制作用很可能同时是附加或者甚至是协同的。因此，共同给予本发 明的Y4选择性激动剂和另一种食欲抑制或其它类型的抗肥胖药物可达到两个目 的：1)获得全部或部分的附加抗肥胖作用的有益作用，2)Y4选择性化合物消除或 降低其它抗肥胖药物的催吐作用的有益作用。
本发明的Y4选择性化合物和PP本身特别可用于治疗或保护以抵御妊娠相关 的呕吐和恶心。就该具体适应症而言，重要的是Y4选择性化合物是天然PP-折叠 肽的相近类似物，通常期望它们具有可忽略的副作用。这些肽在胎盘中不穿过母体 循环(系统)进入胎儿循环(系统)的事实尤其重要，因为这使得与胎儿的接触时间最 短从而使导致发育性副作用的风险很低。
本发明的Y4选择性化合物和PP本身也可用于治疗或保护以抵御酒精不耐受 相关的呕吐和恶心。
4.应激性肠病
Y4受体的天然配体，PP的分泌和功能与自发神经系统的活性高度相关 (Schwartz，1983，Gastroenterology 85：1411-25)。因此，例如PP血浆水平的起 伏与胃肠道能动性和分泌的起伏以及激素/或神经递质促胃动素的分泌极其相 关。已知PP通过副交感神经系统和中心迷走神经控制中心，例如脑干中的迷 走神经运动神经元起作用，从而控制传出迷走神经纤维到胃肠道的活性。由于 据信应激性肠病与特别是胃肠道能动性和导致疼痛等的功能失常和通过自发 神经系统控制该作用的功能失常相关，利用选择性Y4激动剂治疗应激性肠病 是本发明的优选实施方案。
给予Y4激动剂治疗或防止肥胖和相关疾病的其它评价
在进食过程中，各种胃肠道激素和神经递质系统以仔细协调、依次和重叠的 方式激活。此外，食物成分在吸收后不仅直接影响胃肠道激素的分泌和各种传入神 经元途径的激活，也影响各种激素和CNS中心。因此，调节食物摄入和能量消耗 是一高度复杂和多层面的过程。鉴于此，当某些激素，例如PP仅以导致例如进食 期间达到的血浆水平的3-4倍的方式给药时，事实上可基本影响该系统是出乎意料 的。
如果这种化合物-Y4选择性激动剂—在禁食期间以上述有效剂量给予，则其 给药明显主要具有预期的作用。如果Y4激动剂在各种激素和神经元系统因在胃肠 道中存在食物成分或期望进食而激活的情况下给予，该作用未观察到或较低。因此， 在本发明优选的实施方案中，选择性Y4激动剂在禁食状态下以有效剂量通过皮下、 鼻部或通过本文其它地方所述的其它方式给予。本文的术语“禁食的状态”指对象 在给予Y2受体激动剂前至少最近2小时内未吃任何食物或饮水，例如给药前至少 最近3小时内、至少最近4小时内、至少最近5小时内、至少最近6小时内、至少 最近7小时内、至少最近8小时内、至少最近9小时内、至少最近10小时内、至 少最近11小时内或至少最近12小时内。
在种群的一个亚组中，Y4激动剂因遗传变异，例如Y4基因中的多态性而可 能不具有所期望的作用。这些受体中丧失功能的突变可能与肥胖相关。因此，在本 发明一优选实施方案中，为检测这些基因中的多态性/突变和鉴定这种多态性，对 待治疗对象的Y4基因进行分析。根据这种分析可得到这些对象的最佳治疗方案。 例如，只有具有不影响Y4激动剂功能的正常基因型或多态性的对象应该用这种激 动剂治疗。为确保药物的最佳效果，另一种可能性是提高表达受损伤受体对象的 Y4激动剂用量。在Y4受体功能受损导致对象肥胖的情况中，例如在杂合子患者(前 提是至少保留了一些相关受体功能)中用替代疗法形式的Y4激动剂(例如大剂量) 治疗可能有争议。
在本发明的一个实施方案中，在长期治疗开始前可进行给予Y4激动剂以确保 这些化合物在待治疗对象中具有所期望作用的急性测试。通过这些方法确保了只有 对用Y4激动剂治疗敏感的对象才可用这些化合物治疗。
联用Y4-选择性激动剂和Y2-选择性激动剂与其它药物
我们在同一天提交的待批国际专利申请公开了Y2-选择性激动剂和它们在治 疗中的应用。本申请的附录简明地总结了该申请的Y2激动剂所需的结构特性，并 且给出了Y2选择性激动剂的具体例子。如下文简单所述，本发明的Y4-激动剂可 与Y2的特异性激动剂联用来治疗。
通过用两种化合物(分别是选择性Y4激动剂和选择性Y2激动剂)联合治疗， 可以用低于每种化合物各自单独使用时的剂量而获得最大的有益作用，。即可给予 亚最高剂量的选择性Y2化合物而确保只有最小的副作用(例如通过周围心血管Y2 受体产生最小副作用或产生呕吐)，同时给予最高剂量或者甚至超高剂量的Y4激 动剂而确保通过具有更广泛治疗窗(window)的Y4受体途径在所有对象中产生极强 作用。Y2受体途径的伴随(部分)刺激可确保对食欲调节和能量消耗的作用比Y4激 动剂单独刺激更有效。例如，Y2激动剂对胃排空的作用比Y4激动剂更明显。并 且，Y4受体的伴随刺激可允许使用较低而更安全剂量的单用无效的Y2激动剂。
当单独用两种化合物获得对Y4和Y2受体的联合刺激时，可如上所述调整给 药方案。因此，在本发明的具体实施方案中，Y2激动剂和Y4激动剂联合给药时， Y2和Y4之间的剂量比为约0.1∶10-约10∶0.1，例如约0.1∶1-约1∶0.1、约0.2∶1- 约1∶0.2、约0.3∶1-约1∶0.3、约0.4∶1-约1∶0.4或约0.5∶1-约1∶0.5，例如1∶1、 1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6等。如上所述，一个令人感兴趣的实施方案是Y2 和Y4激动剂联用，其中调整Y2与Y4用量之间的平衡可获得最大疗效和最小 的副作用(如果有的话)。因此，可以考虑在这种组合中Y2激动剂的浓度低于 Y4激动剂的浓度。为此，上述浓度和比例分别为摩尔浓度和摩尔比。
因此，在本发明的优选实施方案中，选择性Y4激动剂与选择性Y2激动剂联 合给药来治疗肥胖症。
这些化合物可通过相同或不同的给药途径给予。原则上，给药途径可以是任 何途径，如本文所述，胃肠外和局部途径最令人感兴趣。因此，在本发明的一个实 施方案中，Y4和Y2激动剂均通过局部途径给药，例如鼻部给药或皮下注射，在 其它实施方案中，Y4激动剂经鼻部给药给予而Y2激动剂经皮下注射给予，或反 之亦然。其它合适的组合或给药途径也属于本发明范围内。
用于联合治疗的Y4和Y2激动剂可以装在同一药物组合物中(例如，掺合在药 物组合物中)，或者可存在于不同药物组合物中以同时、依次或分别给药并装有具 体的使用说明书。因此，这种组合物可以试剂盒的形式提供，该试剂盒中在同一或 分开的容器中装有Y4激动剂和Y2激动剂，任选附有使用说明书。
本发明的Y4特定激动剂可与各种靶向食欲和能量消耗的其它药物联用来治 疗肥胖、糖尿病和相关疾病，包括但不限于胃肠道酯酶抑制剂、神经递质再摄取抑 制剂、大麻素受体拮抗剂和反向激动剂以及其它类型的神经递质(包括但不限于 5HT受体)和/或神经激素(包括但不限于GLP-1、MC4、MC3受体激动剂或拮抗剂)。 由于Y4选择性激动剂靶向联系胃肠道和CNS的稳态调节机理(即，饱胀感介导胰 腺分泌的激素PP通常靶向Y4受体)，特别优选联用Y4选择性激动剂和靶向食欲 和能量消耗调节中枢快感机理(例如作为应答系统(reward system)一部分的CB1受 体)的药物治疗。因此，在治疗肥胖症和相关疾病中联用Y4激动剂与CB1拮抗剂 是本发明的一种优选实施方案。
剂量
本发明Y4受体激动剂的治疗有效量取决于所用的具体激动剂、所治疗对象的 年龄、体重和状况、所治疗病症或疾病的严重性和类型、给药方式和所用组合物的 强度。
例如，Y4受体激动剂的治疗有效量可在约0.01μg/公斤体重-约1g/公斤体重 范围内变动，例如约1μg-约5mg/公斤体重，或约5μg-约1mg/公斤体重。在另 一实施方案中，给予对象0.5-135皮摩尔(pmol)/kg体重，或约72pmol/kg体重的 受体激动剂。
在一具体的非限制性例子中，皮下注射给予约5-约50nmol，例如约2-约20 nmol，或者皮下注射给予约1.0nmol。本领域技术人员根据所用具体特定化合物的 效力、对象的年龄、体重、性别和生理情况不难确定精确的剂量。激动剂的剂量可 以是治疗有效剂量的PYY3-36的摩尔当量。
这些用量可分为一次或数次剂量，以每日、每两日、每周、每两周、每月或 以任何其它适当的频率给药。给药一般是每日一次或每日两次。
给药方法
本发明的Y4激动剂以及美容或药物组合物可经任何途径给予，包括肠内(例 如，口服给药)或胃肠外途径。在一具体实施方案中，优选胃肠外途径，包括：静 脉内、关节内、腹膜内、皮下、肌肉内、胸骨内注射和输液，以及通过舌下、透皮、 局部、经粘膜(包括鼻部途径)给药，或者通过吸入，例如肺部吸入给药。在具体实 施方案中，优选皮下和/或鼻部给药途径。
与脑室内给药的NPY和PYY一样，当天然Y4选择性肽PP中枢给药时，可 以诱导进食(可能是因为循环激素或外周给药的肽化合物一般达不到的中枢受体激 活)。因此，为避免增加进食，本发明的Y4选择性激动剂优选外周给药。
这些受体激动剂可以分散在合适的运载体中给药，或者它们可以合适的药物 或化妆品组合物形式给药。这种组合物也属于本发明的范围内。下文描述了合适的 药物组合物。本领域技术人员熟知这种组合物也适用于美容用途，或者知道通过利 用合适的美容上可接受的赋形剂将这些组合物调整为化妆品组合物。
药物组合物
用于药品或化妆品中的本发明受体激动剂(也称为“化合物”)通常以药物组合 物形式存在，所述药物组合物含有特定的化合物或其衍生物和一种或多种生理学或 药学上可接受的赋形剂。
这些化合物可通过任何常规给药途径，例如口服、含服、鼻部、眼部、肺部、 局部经皮、阴道、直肠、眼部、胃肠外(包括上述皮下、肌肉内和静脉内等)途径以 各个体有效的剂量给予动物，包括哺乳动物，例如人。本领域技术人员知道如何选 择合适的给药途径。如上所述，优选胃肠外给药途径。在一具体实施方案中，这些 受体激动剂皮下给药和/或鼻部给药。本领域熟知皮下注射易于自行实施。
医生不难为每位患者单独确定适合具体给药途径的组合物。标准制剂的专题 论文描述了各种药学上可接受的运载体及它们的制剂，例如E.W.Martin的《雷明 顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
含有本发明化合物的药物组合物可以是固体、半固体或液体组合物形式。就 胃肠外应用而言，这些组合物通常是液体组合物形式或是用于植入的半固体或固体 形式。
可通过静脉内、肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内或皮下注射或输液给予作为 无菌溶液或分散体的液体组合物。可将这些化合物制备成无菌固体组合物，在给药 前或给药时用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质溶解或分散。
组合物的液体形式可以是溶液、乳液(包括纳米乳液)、悬液、分散液、脂质体 组合物、混合物、喷剂或气溶胶(后两种类型特别适用于鼻部给药)。
溶液或分散液的合适的介质通常是水或药学上可接受的溶剂，例如油(如芝麻 油或花生油)或有机溶剂，例如丙醇或异丙醇。本发明的组合物可含有其它药学上 可接受的赋形剂，例如pH调节剂、渗透压活性物质(例如为了将组合物的等渗性 调节到生理上可接受的水平)、粘度调节剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、 抗氧化剂等。优选的介质是水。
鼻部给药的组合物也可含有本领域技术人员熟知的合适的无刺激性运载体， 例如聚乙二醇、乙氧基化四氢糠醇(glycofurol)等以及吸收增强剂(例如参见《雷明 顿药物科学》)。
就胃肠外给药而言，在一个实施方案中，一般通过将所需纯度、单位剂量可 注射形式(溶液、悬液或乳液)的受体激动剂与药学上可接受的赋形剂或运载体，即 在所用剂量和浓度时对受者无毒并且与组合物的其它成分相容的物质相混合来配 制。
总体上，通过使受体激动剂与液体运载体或精细分级的固体运载体或二者均 匀紧密地接触来制备制剂。然后视需要将产品做成所需制剂的外形。运载体优选胃 肠外运载体，更优选与受者血液等渗的溶液。这种运载体的例子包括水、盐水、林 格溶液和葡萄糖溶液。非水性运载体，例如不易挥发的油和油酸乙酯以及脂质体也 可用于本发明。由于本文所述肽的两亲性质，合适的剂型也包括胶束制剂、脂质体 和包含一种或多种合适脂质如磷脂的其它类型制剂。
优选将这些受体激动剂悬浮在水性运载体中，例如pH约3.0-约8.0、优选pH 约3.5-约7.4、3.5-6.0或3.5-约5的等渗缓冲溶液。有用的缓冲物质包括乙酸盐、 柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐，例如柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
这些组合物也可设计为在给药后受控递送或持续递送所述受体激动剂以获得 频率更低的给药方案。通常认为每日1-2次的剂量方案可接受，但是本发明也包括 其它给药方案，例如频率更高或更低。为实现持续递送该受体激动剂，可采用含有 例如脂质或油的合适运载体从而在给药部位形成长效形式而将受体激动剂缓慢释 放入循环系统，或者可采用植入物。该方面合适的组合物包括掺有受体激动剂的脂 质体和生物可降解颗粒。
在需要固体组合物的情况中，该固体组合物可以是片剂形式，例如常规药片、 泡腾片、包衣片、融解片或舌下片、药丸、粉末、粒剂、颗粒、颗粒材料、固体分 散体或固体溶液。
该组合物的半固体形式可以是咀嚼胶、软膏、乳膏、涂抹剂、糊剂、凝胶或 水凝胶。
本发明的药物组合物的其它合适剂型可以是阴道栓(vagitories)、栓剂、膏剂、 贴片、片剂、胶囊、小囊、锭剂、装置等。
剂型可设计为以化合物自由或受控方式释放，例如带有合适包衣的片剂。
该药物组合物可含有治疗有效量的本发明化合物。
本发明组合物中本发明化合物的含量是，例如占该药物组合物的约0.1- 100％w/w。
药物制剂配制的技术人员可用熟知的方法制备这些药物组合物。
在这些药物组合物中，所述化合物通常与药学赋形剂，即治疗上惰性物质或 运载体相混合。
所述运载体根据所需剂型和给药途径可采取各种形式。
药学上可接受的赋形剂可以是，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、润 滑剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、增强剂、调味剂、色素、pH调节剂、滞 留剂、润湿剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。详见药物手册，例如《雷明 顿药物科学》或《药物赋形剂手册》(Pharmaceutical Excipient Handbook)。
以下实施例描述了本发明一些具体激动剂的制备方法与活性。
合成
可通过固相肽合成采用自动肽合成仪或传统的分步合成(bench synthesis)来合 成本发明的肽激动剂。固体支持物可以是，例如氯三苯甲基(Cl)或Wang(OH)树脂， 二者均不难购得。这些树脂的活性基团易于和N-Fmoc氨基酸的羧基反应，从而使 其与聚合物共价结合。可通过与哌啶接触使结合在树脂上的胺去保护。然后将第二 种N-保护的氨基酸偶联于树脂-氨基酸。重复这些步骤直至获得所需序列。合成结 束时，结合在树脂上的受保护肽可去保护并用三氟乙酸(TFA)从树脂上切下。有助 于将新的氨基酸偶联于结合在树脂上的氨基酸链的试剂例子有：四甲基脲六氟磷 酸(HATU)、O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)，O-(1H- 苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、1H-羟基苯并三唑 (HOBt)。
除固相化学方法外，通过溶液化学方法肽合成也是可行的。
例如，修饰肽链中氨基酸的侧链氨基或羧基以引入上述GAG-结合基序或其它 基序是不涉及此反应的其它反应活性侧链基团的选择性保护和去保护的简单方法。
本文所称的肽可用Fmoc化学方法用超过5倍量的试剂在PAL Peg-PS树脂(酰 胺树脂(amide resin Applied Bioscience，Warrington，UK GEN913401)上通过固 相合成来制备。整个偶联过程通过HCTU，用DMF作为溶剂进行。用DMF配制 的20％哌啶处理10-15分钟以除去Fmoc。然而，这些肽也可用各种其它标准的肽 合成方法来合成，例如除固相方法以外的tBOC化学法和溶液化学法。下文说明了 合成方法，但本发明考虑的其它肽可通过类似的方法制备；
合成[Cys2，D-Cys27]PP
总体上，侧基保护是标准的Fmoc(方法)，除了：
Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基
Lys＝Fmoc Lys(tBoc)-OH
Ala-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer拟脯氨酸(pseudoproline)
在[Cys2，D-Cys27]PP例子中，采用以下特定的保护基团以获得选择性去保 护：
Cys27＝Fmoc DLys(Trt)-OH
采用Fmoc化学方法用超过5倍摩尔量的试剂在PAL Peg-PS树脂(切割后可 产生生物学上重要的羧酰胺基团的树脂)上进行肽的固相合成。整个偶联过程通 过HCTU，用DMF作为溶剂进行。每步偶联后，用DMF配制的20％哌啶处理10-15 分钟以除去Fmoc。每步后通过定量茚三酮试验核查偶联情况。在某些例子中可进 行双重偶联。
然后将树脂分为不同的批次以产生肽。
为进一步说明可用于制备本发明考虑的Y4选择性激动剂的合成方法，给出了 以下仅作为例子的方案：
合成[Lys13]PP2-36(SEQ ID No：54)及其类似物
下文描述了Y4选择性肽[Lys13]PP3-36与其在Lys13的ε氨基上连有GAG- 结合基序、血清蛋白结合基序或聚乙二醇部分的类似物的合成方法。
总体上，侧基保护是标准的Fmoc(方法)，除了：
Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基
Ala-Ser22-23＝Fmoc AlaSer拟脯氨酸 在[Lys13]PP2-36的情况中，为获得选择性去保护，采用以下特定的保护基团： Lys13＝Fmoc Lys(Dde)-OH
肽采用Fmoc化学方法用超过5倍摩尔的试剂在PAL Peg-PS树脂(切割后可 产生生物学上重要的羧酰胺基团的树脂)上进行固相合成。整个偶联过程通过 HCTU，用DMF作为溶剂进行。每步偶联后，用DMF配制的20％哌啶处理10-15 分钟以除去Fmoc。每步后通过定量茚三酮试验检查偶联情况。在特定的情况中可 以进行双重偶联。
全长肽合成后，通过用DMF配制的2％肼处理15-20分钟除去Lys13的ε氨 基上的保护基团，而肽仍连接在树脂上。
然后将树脂分为不同的批次以产生未衍生的肽以及3种不同的基序修饰肽：
1.将[Lys13]PP2-36(“母体肽”)从树脂上切下并通过95％三氟乙酸∶2.5％ 水∶2.5％三丙基硅烷处理2-3小时去保护。
通过反向HPLC纯化肽：Vydac300柱，在250mm×10mm柱中用30-80％ 缓冲液B梯度(缓冲液A＝用水配制的0.05％TFA；缓冲液B＝60％MeCN∶40％ 水∶0.05％TFA)洗脱20分钟，流速2ml/分钟。测定OD 215nm，收集含有特定 肽的洗脱液并冻干。
通过质谱、氨基酸分析，如果需要也通过氨基酸序列分析来确认肽结构。
2.[N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No：55)-为连接血清白蛋白结合基序，除去保护性Dde基团，肽仍连接在树脂 上，用受保护的氨基辛酸(处理)两次然后用受保护的γ谷氨酸(处理)，从而通过 肽合成将8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基基团连接到Lys13的游离ε 氨基上。
按上文对“母体肽”的描述从树脂上切下基序修饰的肽、去保护并纯化。
3.荧光素-[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-[Lys13]PP2-36 (SEQ ID No：39)-为了连接GAG-结合基序，在除去Dde基团后，用上述标准的 Fmoc化学试剂，在仍连在树脂上的肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合成逐 步构建该基序：以此方式连接的GAG结合序列是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala- Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。 为体外和体内分析的目的，给最终的GAG-结合序列的N-末端加入荧光素标记 基团的5，6异构体(NHS酯，超过10倍，72小时)。
按上文对“母体肽”的描述从树脂上切下GAG结合基序修饰的肽、去保 护并纯化。
4.[N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酰基)}-γ谷氨酰 基-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：40)
-为了连接聚乙二醇部分与Y4选择性肽，除去Dde基团后，在仍连在树脂 上的肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合成，然后通过受保护的γ-谷氨酸连接 受保护的21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酸。
按上文对“母体肽”的描述从树脂上切下PEG化的肽、去保护并纯化。
结构              分子式      分子量     理论值    测量值    保留时间    纯度    分析
                                           m/z       m/z       分钟       ％     方法
PP2-36            C182H282N   4110.7               4109.2      18.1       96.2     C
                  52O53S2
[His34]-PP        C186H286N   4222.1     704.7     704.6       14.7       95.6     B
                  54O55S2                [M+6H]    [M+6H]
[Pro34]-PYY       C195H294N   4306.7               4279.6      13.5       91.6     A
                  54O57                            [M+H]
[Ala1，Pro34]-    C189H290N   4214.7               4188.3      13.1       95.0     A
PYY               54O56                            [M+H]
[Ala30，Pro34]-   C192H288N   4264.7               4239.0      13.7       90.0     A
PYY               54O57                            [M+H]
[Glu4，Pro34]     C194H290N   4306.7               4281.8      13.2       100      A
PYY               54O58
[Arg26，Pro34]P   C194H298N   4298.8               4300.1      13.4       98.9     A
YY                54O57
[Ile28，Pro34]PY  C195H294N   4306.8               4281.2      13.6       97.0     A
Y                 54O57
Met30，Pro34]PY   C194H292N   4324.8               4298.5      13.2       96.9     A
Y                 54O57S
[Cys2，D-     C177H279N    4125.8    4124.4    17.9    98.7    C
Cys27]-PP     53O53S4
[CLTRPRY-酰   C80H130N2    1868.2    1812.1    10.0    99.3    A
胺]×2(SEQ ID 8O20S2
No：18)
[CTRPRY-酰胺] C68H108N2    1641.9    1584.9     8.9    100     A
×2(SEQ ID    6O18S2
No：7)
分析性HPLC方法A
柱＝Vydac C18肽-蛋白质柱，250×4.6mm
缓冲液A＝水配制的0.05％TFA
缓冲液B＝100％MeCN配制的0.05％TFA
梯度＝20分钟内从0％B到60％B
流速＝1.00mL/分钟
波长＝215nm
质谱＝用龙胆酸或□氰基羟基肉桂酸作为基质的MALDI-TOF
分析性HPLC方法B
柱＝Hypersil ODS-2，250×4.6mm
缓冲液A＝100％MeCN配制的0.1％TFA
缓冲液B＝100％水配制的0.1％TFA
梯度＝25分钟内从24％A到35％A
流速＝1.00mL/分钟
波长＝220nm
质谱＝ESI[雾化器气体流速：1.5L/分钟；CDL-20.0v；CDL温度：250 ℃；阻断温度(block temp)：200℃；探针偏置(probe bias)：+4.5kv；检测器：1.5 kv；T.流速：0.2mL/分钟；B.浓度：50％H20/50％CAN.]
分析性HPLC方法C
柱＝Vydac C18 218TP54，250×4.6mm
缓冲液A＝20mL MeCN和2mL水配制的TFA(总体积2000mL)
缓冲液B＝2mL水配制的TFA(总体积2000mL)
梯度＝27分钟从25％B到75％B
流速＝1.00mL/分钟
波长＝215nm
注射体积＝10μL
生物试验和结果
I.测定肽亲和力和效力的体外试验
人Y2受体亲和力试验
在竞争性结合试验中利用结合于COS-7细胞中的125I-PYY来测定测试化合 物对人Y2受体的亲和力，所述COS-7细胞采用标准磷酸钙转染方法用人Y2受体 瞬时转染。
转染1天后，转染的COS-7细胞以40×103细胞/孔的密度转移至培养板，目 标为结合5-8％的放射性配体。转染两天后，利用25pM的125I-PYY(Amersham， Little Chalfont，UK)在4℃进行竞争性结合试验3小时。结合试验在0.5mL补充 了以下成分的50mM Hepes缓冲液，pH7.4中进行：1mM CaCl2、5mM MgCl2 和0.1％(w/v)牛血清白蛋白和100μg/ml杆菌肽。由于是在含有1μM未标记的 PYY时(进行)结合，测定了非特异性结合。细胞用0.5ml冰冷却的缓冲液洗涤 两次，加入0.5-1ml裂解缓冲液(8M脲，3M乙酸配制的2％NP40)，用γ计数 器计算结合的放射活性。测定按一式两份进行。用放射性配体在这些条件下达 到稳态结合。
利用标准的药理学数据处理软件，Prism3.0(graphPad Sofware，San Diego， USA)计算EC50值。
人Y4受体亲和力试验
除了利用人Y4-转化的COS-7细胞，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试 验采用125I-PP，而PP用于非特异性结合的测定。
人Y1受体亲和力试验
除了采用人Y1-转化的COS-7细胞和以1.5×106细胞/孔的密度转移至培养板 外，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-NPY，而NPY用于非特 异性结合的测定。
人Y5受体亲和力试验
除了采用人Y5-转化的COS-7细胞和以5×105细胞/孔的密度转移至培养板 外，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-NPY，而NPY用于测定 非特异性结合。
在以上亲和力试验中测试NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明的其它一些 激动剂的结果见表1：
表1
 激动剂     Y2     Y1     Y4 IC50 Nm   SEM     n   IC50   nm     SEM   n  IC50  nm     SEM   n  NPY 0.30   0.07     4   2.3     0.3   4  26     5   4  PYY 0.22   0.02     2   16     1   2  30     8   2  PYY(3-36) 0.20   0.03     10   ＞1000   2  343     42   4  PP ＞1000     4   ＞1000   1  0.41     0.05   11  PP2-36 ＞1000     3   2  0.64     0.04   4  [Cys2，D-Cys27]PP ＞1000     3   ＞1000   2  8.2     1.1   4  [Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP ＞1000     4   ＞1000   2  286     30   4  [His34]PP ＞1000     2   ＞1000   2  0.48     0.03   2  [Ala1，Pro34]PYY ＞1000     2   176   1  4.4     1.6   2  [Glu4，Pro34]PYY ＞1000     2   99     23   2  2.4     1.2   2  [Arg26，Pro34]PYY 177   9     2   15   1  0.43     0.09   2  [Met30，Pro34]PYY 969   18     2   88     27   2  2.3     1.0   2  [Ala30，Pro34]PYY ＞1000     1   173   1  0.99   1  [CTRPRY-酰胺]×2 ＞1000     1   ＞1000   1  29   1  [CLTRPRY-酰胺]×2 ＞1000     1   ＞1000   1  1.3   1
人Y2受体效力试验
在COS-7细胞中进行剂量-反应实验以测定测试化合物对人Y2受体的效力， COS-7细胞用人Y2受体以及能确保Y2受体经导致磷酸肌醇酯转化增加Gq途径 偶联的混杂G蛋白Gqi5瞬时转染。
磷脂酰肌醇转化-转染一天后，将COS-7细胞与5μCi的[3H]-肌醇 (Amersham，PT6-271)在补加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.01mg/ml 庆大霉素/孔的1ml培养基中培育24小时。细胞用补加了140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mM葡萄糖、0.05％(w/v)牛血清的20mM HEPES，pH7.4的缓冲液洗涤两次；用补加了10mM LiCl的0.5ml缓冲液37℃ 培育30分钟。在37℃用各种浓度的肽刺激45分钟后，用10％冰冷却的高氯酸 提取细胞，然后在冰上培育30分钟。用HEPES缓冲液配制的KOH中和得到 的上清液，在Bio-Rad AG 1-X8阴离子交换树脂上纯化产生的[3H]-磷酸肌醇酯 并用β计数器计数。测定按一式两份进行。利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)计算EC50值。
人Y4受体效力试验
除了采用人Y4-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y1受体效力试验
除了采用人Y1-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y5受体效力试验
除了采用人Y5-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
在以上效力试验中测定NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明四种激动剂的 结果见表2：
表2
  激动剂   Y2     Y1     Y4   EC50   nm   SEM   n   EC50   nm   SEM   n   EC50   nm     SEM   n   NPY   1.5   0.5   11   1.7   0.4   11   167     56   7   PYY   0.23   0.06   8   0.6   1.11   5   34     5   6   PYY(3-36)   0.36   0.07   16   74   5   7   ＞1000   8   PP   ＞1000   8   83   13   5   0.64     0.07   17   PP(2-36)   ＞1000   4   297   45   3   0.88     0.12   5   [Cys2，D-Cys27]-PP   ＞1000   5   ＞1000   3   4.6     0.6   5   [His34]-PP   ＞1000   4   ＞1000   4   1.2     0.0   4
II.测定蛋白质稳定性的体外试验
本发明许多肽的重要量度是蛋白质稳定性，特别是例如对酶降解的稳定性， 因为与例如PYY3-36相比，设计的这些肽具有增加的稳定性，或者甚至与全长PYY 和PP相比，其稳定性增加。
PP-折叠的稳定性-测定了所述肽对在能切割例如环形区的内切肽酶降解的 稳定性，该区域如所述具有相对可弯曲性(O’Hare，M.和Schwartz，T.W.1990， 在《生物活性物质的降解：生理学和病理生理学》(Degradation of Bioactive Substances：Physiology and Pathophysiology)中所述，J.Henriksen编，CRC Press， Boca Raton，Fl.)。利用内切蛋白酶Asp-N(Pierce)作为模型酶。该酶在Asp残基 的N-末端侧，例如PP中残基9和10(Asp)之间切割。根据生产商的说明，将这 些肽于室温在0.01M Tris/HCl，pH7.5的缓冲液中与有效剂量的内切肽酶Asp-N 一起培育24小时以上不同时间段后取样。HPLC分析样品并跟踪这些肽随时间 推移的逐步降解情况。比较这些肽与PYY、PYY13-36和PP的稳定性。
对氨肽酶的稳定性-方法如上述内切肽酶测定的，但采用氨肽酶N和二肽基 肽酶IV。特别设计了能耐受这些氨肽酶的一些肽，例如PYY2-36、N-末端乙酰化 的肽衍生物和在N-末端含有白蛋白结合部分的烷基化肽衍生物。比较这些肽与 PYY、PYY3-36和PP的稳定性。
III.测定糖胺聚糖(GAG)结合的体外试验
在体外试验中利用固定的肝素，即肝素琼脂糖作为亲和基质，使用HiTrap 肝素-琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或肝素HPLC 柱监测测试化合物结合GAG的能力，用含2mM DTT和1mM MgEDTA的50 mM磷酸钠(pH7.3)配制的线性梯度0-0.5M NaCl洗脱50分钟，流速1ml/分钟。 用缓冲液A配制的1M NaCl洗涤此柱51-55分钟以再生。
IV.测定这些肽对食欲、食物摄入和体重作用的体内研究
Y4选择性激动剂对小鼠急性食物摄入的作用
采用ddy品系小鼠，34-37g和8-9周龄(Japan SLC，Shizuuoka，Japan)。 小鼠分别养在12-小时白天-黑夜周期，7 AM开始日照的受控环境中(22℃，55％ 湿度)。实验开始前(见下文)可随意吃食和饮水。在实验开始前的一星期中使小 鼠适应皮下注射。每只小鼠在实验中使用一次。给药之前用生理盐水稀释肽作 皮下注射，100μL体积。结果表示为平均值+/-SE。方差分析后用Bonferroni 试验评估各组间差异。
在实际测试前16小时，小鼠不许进食但可随意饮水，实验在第二天上午 10时开始。采用标准饮食(CLEA Japan，Inc.，Tokyo，Japan)，给药后通过从 最初预先测量过的食物减去未吃的食物来测定食物摄入并检查食物的散落情 况。各组8只小鼠接受盐水、1μgPP2-36或10μgPP2-36测试化合物。
PP2-36(Seq ID No：10)作为测试化合物的结果见图2。
                            序列
NPY (SEQ ID No：1)
H2N-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg- Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PYY(SEQ ID No：2)
H2N-Tyr-Pro-e-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PP(SEQ ID No：3)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-A la-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2，DCys27]-PP SEQ ID. No：4)

[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID.No：5)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-A la-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Lys-Asn-Met-Leu-Glu-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[GIu28，Lys32]PP25-36(SEQ ID.No：6)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Glu-Asn-Met-Leu-Lys-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：7)
S-Cys-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：8)
[Cys2，Aoc5-24，Dcys27]-PP(SEQ ID.No：9)
S  ————————  S
|                  |
H2N-Ala-Cys-Leu-Glu-Aoc5-24-Arg-Arg-(D-Cys)--Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr -CONH2
PP2-36(SEQ ID.No：10)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[His34]-PP(SEQ ID.No：11)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：12)
H2N-Ala-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ala2，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：13)
H2N-Tyr-Ala-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-T yr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4，Pro34]-PYY (SEQ ID.No：14)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Arg26，Pro34]-PYY (SEQ ID.No：15)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ile28，Pro34]-PYY (SEQ ID.No：16)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Met30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：17)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Met-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：18)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：19)
[十四烷酰基-Ala1]-PP(SEQ ID No：20)
CH2(CH2)12CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln -Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[十四烷酰基-Ala1，His34r-PP(SEQ ID No：21)
CH2(CH2)12CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln -Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[Lys18，His34r-PP(SEQ ID No：22)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Lys-Gln-Tyr-Al a-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[Lys18]PP(SEQ ID No：23)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Lys-Gln-Tyr-Al a-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Al a-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-PP(SEQ ID No：24)
H2N-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Al a-Arg-Ala-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Al a-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，Pro34r-PYY(SEQ ID No：25)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr- Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID No：26)
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PP(SEQ ID No：27)
H2N-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysAla-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln- Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[His34]PP(SEQ ID No：28)
H2N-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-LysAla-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro -Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-T yr-CONH2
S-Cys-[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基]-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-TyrCONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：29)
       NHCOCH2CH(COOH)NHCO(CH2)14CH3
       |
S-CYs-Lys-Thr-Arg-Leu-Arg-TyrCONH2
|
S-Cys-Leu-Leu-Thr-Arh-Leu-Arg-Tyr-CONH2
N-乙酰基-PP(SEQ ID.No：30)
CH3CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln- Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-PP(SEQ ID No：31)
CH3(CH2)14CONHCH(COOH)CH2CH2CONH-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp- Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Th r-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17]PP(SEQ ID.No：32)
H2N-A1a-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle30]PP(SEQ ID.No：33)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17，Nle30]PP(SEQ ID.No：34)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Nle30]PP(SEQ ID No：35)
CH3(CH2)14CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
                            |
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP(SEQ ID No：36)
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
                                   |
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17]PP2-36(SEQ ID.No：37)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-Tyr-A la-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle30]PP2-36(SEQ ID.No：38)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13]PP2-36(SEQ ID No：39)
CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
                            |
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Assn-Ala-Lys-Pso-Glu-Glu-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13]PP2-36(SEQ ID No： 40)
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
                                  |
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17，His34]-PP(SEQ ID.No：41)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：42)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[Nle17，Nle30，His34]-PP(SEQ ID.No：43)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Nle-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-His-Arg-Tyr-CONH2
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，His34]-PP(SEQ ID No：44)
CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
                            |
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，His34]PP(SEQ ID No： 45)
(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3CONH
                                    |
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-A la-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID.No：46)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Ala30，Pro34]-PYY(SEQ ID No：47)
CH3(CH2)12CONHCH(COOH)CH2CH2CONH
                            |
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Lys-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-T yr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Ala-Val-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2，N-(N’-十四烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，DCys27]-PP(SEQ ID No：48)

S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：49)
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2
|
S-Cys-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2(SEQ ID.No：50)
[Leu34]-PP(SEQ ID.No：51)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Tyr-CONH2
[Ile34]-PP(SEQ ID.No：52)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Ile-Arg-Tyr-CONH2
[Phe34]-PP(SEQ ID.No：53)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Phe-Arg-Tyr-CONH2
[Lys13]PP2-36(SEQ ID No：54)
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-[Lys13]PP2-36(SEQ ID No： 55)
H2NCH(COOH)CH2CH2CONH(CH2)7CONH(CH2)7CONH
                                        |
H2N-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Lys-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr- Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
附录
我们的名为“用于治疗性干预的Y2选择性受体激动剂”的待批国际专利 申请描述了Y4选择性激动剂在各种治疗和美容中的应用，例如用于治疗肥胖 症和超重以及认为这些情况是影响因素的疾病。
该申请的Y2受体激动剂是以下的一种：
(a)选自PYY、NPY、PYY模拟物和NPY模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模 拟物，这些肽或肽模拟物具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列和
不具有对应于NPY的Tyr1的酪氨酸残基和/或
不具有对应于NPY的Pro2的脯氨酸残基和/或
不具有对应于NPY的Ser3的丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸残基
不具有对应于NPY的Lys4的赖氨酸或精氨酸残基和/或
在对应于NPY的Leu24位具有除亮氨酸以外的残基和/或
在对应于NPY的Arg25位具有除精氨酸以外的残基和/或
在对应于NPY的His26位具有除组氨酸以外的残基和/或
在对应于NPY的Ile28位具有除异亮氨酸以外的残基和/或
在对应于NPY的Asn29位具有天冬酰胺以外的残基和/或
在对应于NPY的Leu30位具有除亮氨酸或甲硫氨酸以外的残基；或
(b)是选自PP和PP-模拟物的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物，这些肽和肽模拟 物具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列以及
在对应于PP的Pro2位不具有脯氨酸残基和/或
在对应于PP的Ile3位不具有亮氨酸残基和/或
在对应于PP的Glu4位不具有谷氨酸残基；或
(c)(i)具有C-末端Y2受体识别氨基酸序列，该序列在N-末端与毗邻所述Y2 受体识别序列的N-末端处具有至少一个α螺旋转角的两亲性氨基酸序列结构域融 合，所述转角因分子内共价键而束缚于螺旋构型中，和(ii)，如果该激动剂具有类 似于NPY或PYY的N-末端结构，其具有一个或多个以上(a)所列出的修饰，以及 如果所述激动剂具有类似于PP的N-末端结构，其具有一个或多个以上(b)所列出 的修饰。
总体上，该申请的(a)型激动剂是NPT或PYY的PP-折叠类似物，或NPY或 PYY的PP-折叠模拟物，这些类似物或模拟物具有基本上降低它们对Y1受体效力 的修饰，包括：在对应于NPY的Tyr1位具有除Tyr、Trp或Phe以外的残基和/ 或在对应于NPY的Pro2位具有除Pro以外的残基和/或在对应于NPY的Ser3 位具有除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、Ser、Thr和Asn以外的残基和/或在 对应于NPY的Lys4位具有除赖氨酸或精氨酸以外的残基。这种激动剂包括具 有和人NPY相同的序列的肽，除了在1位是除Tyr、Trp或Phe以外的残基和/ 或在2位是除Pro以外的残基和/或在3位是除Ile、Leu、Val、Phe、Trp、Tyr、 Ser、Thr和Asn以外的残基和/或在4位是除赖氨酸或精氨酸以外的残基。
总体上，该申请的(b)型激动剂是PP的PP-折叠类似物，或PP的PP-折叠模拟 物，这些类似物或模拟物具有基本上降低它们对Y4受体效力和增加它们对Y2受 体效力的修饰。它们包括以下激动剂：在34位具有Gln或结构类似的残基和在 对应于PP的Pro2位具有除Pro、Tyr、Phe和Trp的残基/或在对应于PP的Ile3 位具有除Ile、Leu、Met和Val以外的残基和/或对应于PP的Glu4位具有除 Glu或Asp以外的残基。该类型的激动剂的一亚组由具有与人PP序列相同的序列 的肽构成，除了在34位是Gln残基和在2位是除Pro、Tyr、Phe和Trp以外的 残基和/或在3位是除Ile、Leu、Met和Val以外的残基和/在4位是除Glu或 Asp以外的残基。
该申请的(c)型激动剂的特征在于分子内连接键，它既在天然NPY、PYY或PP 肽中无等价物，又对应于或用共价键替代非共价相互作用，并且包括含有与人PYY 的序列的相同序列的那些激动剂，除了束缚螺旋转角的分子内连接键从两亲性结构 域的一个氨基酸残基延伸至聚脯氨酸结构域的N-末端部分的连接点。这种键可在5 位和20位或8位和16位，特别是2位和27位的残基之间，例如27位的D-Cys 和2位的Cys之间的二硫键。在另一组(c)型激动剂中，束缚螺旋转角的分子内连 接键在α螺旋结构域的最后一个螺旋转角中的残基之间延伸，例如在螺旋转角的 Lys和Glu残基之间形成的内酰胺键，或在C-末端Y2识别氨基酸序列中的残基和 α螺旋结构域的最后一个螺旋转角中的残基之间延伸。
该申请考虑的Y2选择性的所有3种类型的激动剂具有C-末端Y2受体识别氨 基酸序列。存在于本发明激动剂中的一组C-末端Y2受体识别氨基酸序列用-X- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示：其中X不是碱性或酸性残基，R1和R1 独立为氢或C1-C6烷基，或其保守取代的变体，其中Thr被His或Asn取代和/ 或Tyr被Trp或Phe取代；和/或Arg被Lys取代。本发明优选R1和R2可以均 是氢。具体的C-末端Y2受体识别氨基酸序列是-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr- C(＝O)NH2，另一序列是-Ala-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在所有的(a)、(b)或(c)三类中，含有Y2受体识别氨基酸序列的C-末端序列可 在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域融合，所述结构域含有毗邻所述表位N-末 端的至少一个α螺旋转角和至少两个氨基酸的N-末端氨基序列，所述C-和N-末端 氨基酸序列通过肽键与接头基团相连，该接头基团可以是任选含有一个或多个双键 或三键的直链或支链亚烷基基团。例如[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PYY。
该申请提及的Y2选择性激动剂的具体例子有：
PYY2-36
NPY2-36
[D-Ala1]PYY
[D-Ala2]PYY
[Ala28]PYY
[Ala30]PYY
[Ala31]PYY
[Lys4，Gln34]PP
[Cys2，D-Cys27]PYY
[Cys2，D-Cys27]NPY
[Cys2，Ile3，D-Cys27，Val31]NPY
[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]NPY
[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY
[Lys28，Glu32]PYY25-36
[Glu28，Lys32]PYY25-36
[D-Ala2]PYY2-36
[Lys4，Leu17，Gln34]PP
[Lys4，Leu17，Leu30，Gln34]PP
[Lys4，Nle17，Nle30，Gln34]PP
[Cys2，Ile3，D-Cys27，Leu28，Val31]NPY
[Cys2，Ile3，Nle17，D-Cys27，Nle28，Val31]NPY
[Cys2，Ile3，Aoc5-24，D-Cys27，Val31]NPY
[Cys2，Lys13，D-Cys27]PYY