PP-折叠肽家族—NPY(神经肽Y)(人序列-SEQ ID.No：1)、PYY(肽YY)(人 序列-SEQ ID.No：2)和PP(胰腺多肽)(人序列-SEQ ID.No：3)是天然分泌的同源 性，36个氨基酸，C-末端酰胺化的肽，这些肽的特征为有共同的三维结构—PP- 折叠，该结构即使在稀释的水溶液中也出人意料地稳定并且对这些肽的受体识 别很重要。
首先，通过下调分辨率至的X-射线晶体图分析和该肽获得名称的独特 结构详细鉴定了禽类PP的X-射线结构特征(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78：4175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142：379-85)。然后，特别 通过NMR图谱分析分析了该家族其它成员的PP-折叠结构。X-射线和NMR分析 显然要在高度浓缩的或固体条件下进行；然而，详细的圆二色性分析提示NPY和 PP即使在水溶液中仍采取PP-折叠结构，这对此种小肽是罕见的(Fuhlendorff等， 1990 J.Biol.Chem.265：11706-12)。重要的是，对这些肽以及它们的片段和类似物 的蛋白酶水解稳定性分析表明，例如全长PP1-36即使为稀释的水溶液也保持折叠 构型从而保护其免遭某些酶的降解，所述酶能容易且快速地降解因少许取代而不能 采取PP-折叠结构的类似物(Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.611：35-47)。
NPY、PYY和PP共有的PP-折叠结构由以下部分组成：1)N-末端聚脯氨酸样 螺旋(对应于含Pro2、Pro5和Pro8的残基1-8)，其后是2)I型β-转角区(对应 于残基9-12)，然后是3)与聚脯氨酸螺旋反平行的具有152°角度的两亲性α- 螺旋(残基13-30)，和4)C-末端六肽(残基31-36)。与3个疏水性脯氨酸残基 紧密相互交叉的两亲性α-螺旋侧链之间的疏水相互作用稳定了此折叠结构 (Schwartz等，1990)。除了受体识别C-末端六肽中的关键残基外，稳定PP-折 叠结构的核心疏水残基在PP-折叠肽家族中也是保守的。图1A描述了NPY、 PYY和PP中保守的NPY序列和残基，以黑底白字表示。图1A也说明了上述 PP-折叠结构的元件。通常认为，对受体识别重要的C-末端六肽是非结构性的 (unstructured)，但PP折叠提供了将C-末端六肽提供给受体的稳定支架(见图1B 描述)，就变化程度而言，这些受体也依赖于或不依赖于这些肽的N-末端部分。 NMR图谱分析证明，例如NPY的远处C-末端和N-末端部分颇可移动，这意 味着PP-折叠经常处于游离末端被“拉开”的危险中。
NPY是在中枢和外周神经系统各部分中具有多种作用的分布极广的神经肽， 通过人体中许多不同的受体亚型，Y1、Y2、Y4和Y5起作用。主要的NPY受体 是Y1受体和Y2受体，Y1受体一般是传输NPY神经元“冲动”的突触后受体， Y2受体一般是突触前抑制性受体。该情况也见于下丘脑，下丘脑中也表达黑皮素 受体拮抗剂/反向激动剂AgRP(野灰相关肽)的NPY神经元在弓形核的刺激(传入) 支中起基础“传感”神经元作用。因此，在该控制食欲和能量消耗的“传感核”中， NPY/AgRP神经元与抑制性POMC/CART神经元一起监控机体的激素和营养状 态，因为这些神经元是长期调节剂如瘦蛋白和胰岛素，和短期调节剂如生长素 释放肽和PYY(见下文)的靶点。刺激性NPY/AgRP神经元也凸入例如下丘脑的 室旁核中，认为该处其突触后靶受体是Y1和Y5受体。就增进食物摄入而言， NPY是已知最强效化合物，因为啮齿类动物经脑室内(ICV)注射NPY后将不断 进食直至饱撑。NPY/AgRP神经元的AgRP作用主要是作为4型黑皮素受体 (MC-4)的拮抗剂，能阻断POMC衍生肽(主要是aMSH)对该受体的作用。由于 MC4受体信号起到进食抑制剂作用，AgRP的作用与NPY的一样是一种进食刺 激信号(即，对抑制作用的抑制)。在NPY/AGRP神经元上发现了抑制性突触前 Y2受体，该受体是局部释放的NPY以及肠激素PYY(另一种PP-折叠肽)的靶 点。
PYY在进食期间从小肠末端和结肠部位的肠道-内分泌细胞释放(与食物中的 卡路里含量成比例)，作用于胃肠道外周(神经)功能和中枢(神经)，是一种饱食信号。 就外周(神经)而言，认为PYY的功能是上部胃肠道运动性、胃酸和胰腺外分泌的 抑制剂(回肠中断(illeal break))。就中枢(神经)而言，认为PYY主要作用于弓形核 NPY/AgRP神经元的突触前抑制性Y2受体，认为其可通过血液接近该受体 (Batterham等，2002 Nature 418：650-4)。该肽以PYY1-36释放，但是其一部分(约 50％)以PYY3-36在血中循环，PYY3-36是二肽基肽酶-IV的降解产物，该酶切除 此肽的N-末端二肽，前提是如所有三种PP-折叠肽—PP、PYY和NPY那样，在二 位发现Pro或Ala(Eberlein等，1989 Peptides 10：797-803)。因此，血循环中的 PYY是作用于Y1和Y2受体的PYY1-36和对Y1、Y4和Y5受体的亲和力低于 Y2受体的PYY3-36的混合物。
PP是一种胰岛内分泌细胞释放的激素，几乎完全受特别是食物摄入引起的迷 走神经胆碱能刺激的控制(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。PP对胃 肠道有各种作用，但是通常在大多数分离的细胞和器官中未观察到PP，并且似乎 依赖于完整的迷走神经供应(supply)(Schwartz 1983 Gastroenterology 85：1411-25)。鉴于此，称为Y4受体的PP受体位于脑干的postrema区域，在迷走 神经运动神经元(vagal motor neurones)(其激活导致PP的外周作用)和单生核束 (NTS)(其激活导致PP作为饱食激素的作用)中有强烈表达(Whitecomb等，1990 Am.J.Physiol.259：G687-91，Larsen & Kristensen 1997 Brain Res.Mol.Brain Res 48：1-6)。应理解，由于在血脑屏障的感觉性外周(神经)区域各种激素对该区域是 “可渗入的”，血液中的PP可进入大脑的该区域。近年来，有争论说PP对食物 摄入的部分作用是通过对神经元，特别是弓形核中的POMC/CRAT神经元起作用 而介导的(Batterham等，“Coimbra国际NPY研讨会2004摘要3.3”(2004 Abstract 3.3 International NPY Symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP通过Y4受体起作用， 与PYY和NPY对Y4受体的亲和力为纳摩尔(nanomolar)级，PP对该受体的亲和 力为亚纳摩尔(subnanomolar)级(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50：143-150)。 PP对Y5受体也具有相应的亲和力，但由于无法接近CNS中专门表达该受体的细 胞和(该受体)对PP的亲和力较低，PP的生理学重要性不可能与循环PP有相关。
PP-折叠肽受体
熟知人体中有四种类型以相似亲和力识别NPY1-36和PYY1-36的PP-折叠肽 受体：Y1、Y2、Y4和Y5。曾提出过对NPY的亲和力超过PYY的Y3受体类型， 但现在不接受其为真正的受体亚型(Michel等，1998 Pharmacol.Rev.50： 143-150)。Y6受体亚型已得到克隆，然而它在人体内表达为缺乏TM-VII以及受体 尾部的截短形式，因此看来至少其本身不能形成功能性受体分子。
Y1受体-亲和力研究提示Y1能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上不结 合PP。对Y1的亲和力取决于PP-折叠分子(NPY/PYY)的两末端序列(例如，残基 Try1和Pro2是必须的)和此肽两末端能否以正确方式呈递。在含几个必需残基侧链 的C-末端，Y1受体(像Y5和Y4受体而不是Y2受体那样)可耐受34位(通常是Gln) 的某些取代，例如Pro(Fuhlendorff等，1990 J.Biol.Chem.265：11706-12；Schwartz 等，1990 Annals NY Acad.Sci.61：35-47)。关于Y1和Y2受体必须的某些结构- 功能研究已见报道(Beck-Sickinger等，1994 Eur.J.Biochem.225：947-58； Beck-Sickinger和Jung，1995 Biopolymers 37：123-42；等，2001 Eur.J.Biochem.268：2828-37)。
Y2受体-亲和力研究提示Y2受体能同样良好地结合NPY和PYY，但基本上 不结合PP。该受体特别需要PP-折叠肽(NPY/PYY)的C-末端。因此，长的C- 末端片段(下至例如NPY13-36(整个α螺旋加上C-末端六肽))识别亲和力较高， 即该全长肽的亲和力的10倍之内(Sheikh等，1989 FEBS Lett.245：209-14； Sheikh等，1989 J.Biol.Chem.264：6648-54)。所以，各种不能结合Y1受体的 N-末端缺失(片段)在一定程度上仍能结合Y2受体。然而，即使较长的C-末端 片段的亲和力与NPY/PYY相比降低了约10倍。NPY和PYY的34位Gln残基 对Y2受体的配体识别极其重要(Schwartz等，1990 Annals NY Acad.Sci.611： 35-47)。
Y4受体-亲和力研究提示对应于血浆中发现的浓度，Y4以亚纳摩尔亲和力结 合PP，而以低得多的亲和力结合NPY和PYY。这种研究提示Y4受体高度依赖于 PP-折叠肽的C-末端，较短的N-末端缺失将损伤对配体的亲和力。关于Y4受体的 几项结构活性研究已见报道(Gehlert等，1996 Mol.Pharmacol.50：112-18；Walker 等，1997 Peptides 18：609-12)。
Y5受体-亲和力研究提示Y5能同样良好地结合NPY和PYY，也以较低的亲 和力结合PP，然而亲和力低于该激素的正常血循环水平。Y5受体也能良好地识别 PYY3-36，然而该受体在CNS中也有很大程度的表达，当将PYY3-36施用于外周 (神经)中时，不易接近CNS中的此受体。
根据这些肽中的某些在动物模型和人体中所显示的作用和肥胖人的PYY和 PP基础水平低以及对这些肽的进食反应较低，已提出PP-折叠肽及其类似物可用 于治疗肥胖和相关疾病，包括例如普-韦综合征(Holst JJ等，1983 Int.J.Obes.7： 529-38；Batterham等，1990 Nature)。给普-韦综合征患者输注PP早已显示能降 低食物摄入(Berntson等，1993 Peptide 14：497-503)，该作用通过在正常人对象中 输注PP得到证实(Batterham等，Clin.Endocrinol.Metab.88：3989-92)。也有人提 出PP-折叠肽可用于例如治疗新血管生成(Zukowska等，2003 Trends Cardiovasc Med.13：86-92)和炎性肠病(参见，例如WO 03/105763)。
然而，天然PP-折叠肽用作生物药物不是最佳。例如，全长肽PYY1-36和 NPY1-36肽与所有的Y2受体类型有广泛反应，因此会导致心血管副作用，例如呕 吐。此外，天然肽的蛋白质稳定性未经优化，因为它们作为神经肽或神经激素的作 用时间通常较短。例如，天然产生的Y2选择性更强的肽PYY3-36的缺点在于其 PP-折叠结构因缺乏聚脯氨酸螺旋的重要Pro2残基而受损，因为在全长肽中Pro2 与该分子两亲性螺旋区域中的Tyr27相互作用。
因此，为治疗对Y受体调节起反应的疾病，需要采用Y受体PP-折叠肽或PP- 折叠肽模拟物，这些肽或模拟物对选作靶点的Y受体应是特异性的并稳定地保留 了对受体结合很重要的PP-折叠结构元件。特别是更需要采用对Y2和Y4受体的 选择性超过Y1受体的这类药物。在几种疾病例如肥胖症和分泌性腹泻中，使用对 Y2和Y4受体(均有选择性)的激动剂是有益的。因此，同时具有这些特性(Y2和 Y4激动作用)的一种化合物极其有益。然而，在临床实践(setting)中重要的是这种 化合物不能也对Y1受体有明显的激动作用，因为刺激Y1受体导致有害的副作用， 例如心血管副作用(如血压升高)以及肾脏副作用(如尿钠排泄)。相对于Y1受体， 天然化合物，例如PYY3-36是Y2受体的选择性激动剂，有提示说其可用于治疗 例如肥胖症。相对于Y1受体，化合物，例如天然肽PP也是Y4受体的选择性激 动剂，有提示说其也可用于治疗肥胖症。也存在是Y1和Y2受体组合激动剂的化 合物，例如天然肽PYY和NPY。然而，此前没有已知的化合物报道为同时对Y2 和Y4受体高度有效的激动剂。此外，以前也未有暗示说可使用对Y1受体具有选 择性的Y2和Y4组合激动剂来治疗性干预。
本说明书中所用的一些共同术语
亲和力：肽与特异性受体的亲和力以例如IC50值或Kj或Kd值给出，在具体的 非限制性例子中，这些值可用试验，例如竞争性结合试验测定。IC50值对应于取代 所用的与给定受体相关的放射性配体50％的肽浓度，其用量远低于该放射性配体 的Kd。
食欲：对食物的自然欲望或渴求。食欲增加通常导致进食行为的增加。
食欲抑制剂：能降低对食物需求的化合物。
结合：两种分子之间的特异性相互作用，可使得该两种分子相互作用。与受 体的结合可以是特异性和选择性的，所以与另一种分子相比，可优先结合某种分子。 可通过解离常数(Kd)鉴定特异性结合。其值取决于对测试化合物的选择性。例如， 通常认为Kd小于10nM的化合物是优秀的候选药物。然而，亲和力较低但对具体 受体具有选择性的化合物也可以是良好的候选药物。
体重指数(BMI)：一种衡量体重的数学式，有时也称为Quetelet指数。通过体 重(以千克计)除以身高2(以米计)来计算BMI。目前，所接受的男性和女性的“正 常”标准为BMI约20kg/m2。在一个实施方案中，超过25kg/m2的BMI可用于鉴 定肥胖对象。I级肥胖对应的BMI是25kg/m2。II级肥胖对应的BMI是30-40kg/m2； III级肥胖对应的BMI是40kg/m2以上(Jequier 1987 Ain.J Clin.Nutr.45：1035-47)。 按照身高、身体构成、骨架结构和性别，不同人种和个体的理想体重有所不同。
热量摄入或卡路里摄入：个体所消耗的卡路里(能量)数量。在本文中该术语等 同于“能量摄入”。
美容治疗：该术语表示不是为医学目的，而是为改善对象的幸福程度，例如 与对象外貌有关的治疗。该术语包括治疗想要降低体重，但不一定是超重或肥胖的 对象。
食物摄入：个体消耗的食物量。食物摄入可通过体积或重量来衡测。包括：I) 食物摄入是个体消耗的食物总量，和ii)食物摄入指个体的蛋白质、脂肪、碳水化 合物、胆固醇、维生素、矿物质或其它食物成分的摄入量。因此，本文使用的术语 食物摄入类似于术语“能量摄入”。
每日正常饮食：给定人种的个体平均食物摄入。每日正常饮食可以卡路里摄 入、蛋白质摄入、碳水化合物摄入和/或脂肪摄入表达。人的每日正常饮食一般含 有：约2,000、约2,400或约2,800到明显更多的卡路里。此外，人的每日正常饮 食一般含有约12g-45g蛋白质、约120g-610g碳水化合物和约11g-90g脂肪。 低卡路里饮食的卡路里摄入不超过个人的正常卡路里摄入的约85％、优选不超 过约70％。在动物中，卡路里和营养需求随动物的种类和体积而不同。例如， 在猫中，每kg的总卡路里摄入以及蛋白质、碳水化合物和脂肪的分布百分比 随猫的年龄和生殖状态而不同。
肥胖：过多的身体脂肪使人们处于健康危险之中的状况(参见Barlow和Dietz， Pediatrics 102：E29，1998；国家卫生研究院，国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI)，Obes.Res.6(增刊2)：59 S209S，1998)。过多的身体脂肪是能量摄入 和能量消耗失衡的结果。在一个实施方案中，用体重指数(BMI)评估肥胖。在一个 实施方案中，BMI为约22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2，特别是 约25.0kg/m2-30kg/m2认为是超重，BMI为30kg/m2或更高是肥胖。
超重：体重超过其理想体重的个体。超重的个体可以是肥胖，但不一定是肥 胖。在一个实施方案中，超重的个体是需要降低他们体重的任何个体。在另一实施 方案中，认为超重个体是BMI约为22kg/m2(即，高于正常值约10％)-约30kg/m2， 特别是从约25.0kg/m2-30kg/m2的个体。应注意BMI略微高于正常值的个体(例 如约22kg/m2-25kg/m2)经常想减轻体重，虽然仅是为美容目的。
效力：化合物的体外效力定义为EC50值，即在给定受体相关的信号转导试验 中测定的导致最大可达到作用的50％的浓度。
对象：对象可以是任何对象，包括人和兽医哺乳动物对象。因此，所述对象 可以是人或者可以是非人灵长类，农业动物，例如猪、牛、绵羊和家禽，运动动物 (sport animal)或宠物，例如狗、猫、马、仓鼠和啮齿类动物。
治疗有效量：足以预防、治疗或缓解特定病症或疾病和/或缓解特定病症或疾 病的特定体征或症状的剂量。该术语包括足够的或能预防疾病发展，或导致疾病衰 退，或能减轻疾病的体征或症状，或能实现所需结果的剂量。在涉及美容治疗或超 重或肥胖治疗的实施方案中，受体激动剂的治疗有效量是足以抑制或停止体重的增 加，或足以降低食欲的量，或足以减少能量或食物摄入或增加能量消耗的量。术语 “美容有效量”指足以治疗对象以实现所需效果的剂量。
发明详述
在最广义方面，本发明提供了对Y2和Y4受体的选择性超过Y1受体的Y受 体激动剂在制备治疗对Y2和/或Y4受体激活起反应的疾病的组合物中的应用，
(a)所述激动剂是具有以下序列的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物
(i)以-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y受体识别氨基酸 序列，其中R1和R1独立为氢或C1-C6烷基，X是Val、Ile、Leu或Ala，X3是 Gln或Asn，或它们保守取代的变体，其中Thr被His或Asn取代和/或Tyr被 Trp或取代；和/或Arg被Lys取代，和
(ii)以H2N-X1-Pro-X2-(Glu或Asp)-表示的N-末端Y受体识别氨基酸序列， 其中X1不存在或是任何氨基酸残基，X2是Leu或Ser或者Leu或Ser的保守性 取代，或者
(b)所述激动剂含有
如以上(i)所定义的C-末端Y受体识别氨基酸序列，
所述Y受体识别序列与包含至少一个毗邻所述六肽序列N-末端的α螺旋转角 的两亲性氨基酸序列结构域相融合，
所述转角因分子内共价键而束缚于螺旋构型中，和任选的
始于以上(ii)所定义的Y受体识别氨基酸序列的N-末端序列。
发明相关的特定术语
本发明所考虑的激动剂是对Y2和Y4受体的选择性超过Y1受体的激动剂。 在本文中，当激动剂用本文所述亲和力试验测定时，对Y2和Y4受体的IC50值比 Y1受体的至少低10倍，则符合该条件。总体上，就效力而言，本发明的激动剂用 本文所述效力试验测定时，对Y2和Y4受体的EC50值比Y1受体的至少低10倍。 一些本发明优选的激动剂对Y2和Y4受体的亲和力和效力比Y1受体的至少高1000 倍。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽是具有3-D结构的分子，当用X-射线晶体图 测定禽类PP的原始3-D结构(Blundell等，1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78： 4175-79；Glover等，1984，Eur.J Biochem.142：379-85)作图时，该结构的结构 域相当于(和基本上这样排列的)所述NPY、PYY和/或PP的N-末端聚脯氨酸样螺 旋、I型β转角区域、两亲性α-螺旋和C-末端六肽结构域(图1)。因此，本文所用 的PP-折叠肽不同结构域的描述可参见禽类PP的原始X-射线结构(Blundell等， 1981 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：4175-79；Glover等，1984，Eur.J.Biochem.142： 379-85；Schwartz等，1990)。
出于本说明书的目的，PP-折叠肽模拟物是具有3-D结构的分子，当对禽类PP 的原始3-D结构作图时，该结构的结构域相当于(和基本上这样排列的)所述PP两 亲性α-螺旋最后一个转角和C-末端六肽结构域。当如上述作图时，PP-折叠肽模拟 物的结构域也相当于两亲性α螺旋的一个或多个其余的转角(remaining turn)、N-末 端聚脯氨酸样螺旋和I型β转角区域。肽模拟物无需完全由经典肽键相连的α氨基 酸序列构成。这种序列中的一个或多个键可被肽模拟物键，例如反酰胺(reverse amide)和还原的肽键替代，因而可将该肽模拟物视为拟肽序列。这类键替代能赋予 该分子抵抗内肽酶的降解和改善其药代动力学特性。
可根据原子坐标通过构建比较分子模型，或利用一种或多种计算机程序来比 较以上“PP-折叠肽”和“PP-折叠肽模拟物”定义的3-D结构，所述原子坐标可通 过例如X-射线衍射方法测定，所述计算机程序可购得以便从其分子结构式目测其 预期的3-D结构，例如： Inc(1500 S.W.，First Avenue，Suite 1180， Portland，OR 97201)的“Maestro Modelling Environment”；Accelrys Inc.(San Diego)的“InsightII Modeling Environment”，Release 4.0；和Tripos Inc.(1699 South Hanley Rd.，St.Louis，Missouri，63144，USA)的“SYBYL 7.0”。应注 意本发明的PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的3-D结构与天然的NPY、POY或 PP无需和一般不具有精确的对应关系。PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的表观 3-D结构视用于研究该结构的实验条件而不同，特别是较小的肽在某些条件下 可呈现或多或少的非折叠结构。然而，以下条件是充分的：PP-折叠肽或PP-折 叠肽模拟物应具有对应于上述那些PP-折叠结构域的结构域，具有使之采取类 似于天然肽总体形状的结构元件，其中C-末端序列和N-末端序列(如果存在的 话)是正常取向。
本发明考虑的激动剂具有C-末端Y受体识别序列。该序列是位于激动剂的 C-末端，通常约5-7个残基长的序列，特别是六肽序列，当存在于PP-折叠肽或PP- 折叠肽模拟物中时，该序列结合Y受体并通过该单独的结合相互作用或作为该结 合作用与和存在于激动剂中的N-末端Y受体序列的Y受体结合的结果而激活该受 体。N-末端Y受体识别序列是位于激动剂的N-末端，通常约3-5个残基长的序列， 特别是4个残基的序列，当存在于PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物中时，该序列结 合Y受体并通过该结合作用联合与存在于激动剂中的N-末端Y受体序列的Y受体 结合而激活该受体。典型的C-末端和N-末端Y受体识别序列在天然PP、NPY和 PYY肽序列中发现，但是从本文将明白，这些典型的序列可经修饰以识别Y2和 Y4但降低Y1识别(能力)。
在本说明书中，诸如“对应于NPY的N位的残基”的术语指该激动剂的3-D 结构对NPY的3-D结构作图时，图中最接近NPY的N号残基的氨基酸残基。由 于有与天然肽相关的例如特定肽中缺失发生，特定肽中具体残基的实际编号可能与 N不同。
总体上，本发明考虑的PP-折叠或PP-折叠模拟物激动剂通常具有肽骨架或部 分是肽的骨架，至少具有C-末端氨基酸序列和经常具有N-末端氨基酸序列，虽然 骨架的其余部分可以是非肽接头基团，例如直链或支链亚烷基链。存在于该激动剂 的肽(peptidic)部分，特别是与Y2和Y4受体相互作用的C-和N-末端序列中的氨基 酸通常是天然产生的，但也可存在保留了PP-折叠但不阻止Y2和Y4受体结合的 非天然α氨基酸。
当本发明考虑的激动剂具有C-或N-末端氨基酸序列时，可以酰胺化C-末端和 /或可以酰化N-末端以赋予对羧肽酶和/或氨肽酶的抗性。事实上，天然NPY、PYY 和PP肽的C-末端是酰胺化的，所以本发明激动剂的C-末端氨基酸也可酰胺化。
在本说明书中，提及氨基酸时可用其通用名或缩写，例如缬氨酸(Val)、亮 氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、天冬酰胺(Asn)、 谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、 天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、 酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)。当用通用名或 缩写提到氨基酸而未明确说明其立体异构形式时，应理解所述氨基酸是L-形。 在提到D-形时会特别指明D-形氨基酸。有时，在本文想要这样做时，特指L- 形而非推断。
本文所用的术语“保守取代”表示一个或多个氨基酸被另一个生物学类似的 残基取代。例子包括用性质相似的氨基酸残基，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性 氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸取代。适用于本发明的保守氨 基酸取代的非限制性例子包括用下表中性质相似的非天然α氨基酸的原来残基进 行类似取代。例如，在本发明优选的实施方案中，Met残基可用正亮氨酸(Nle)取代， 正亮氨酸是Met的生物等构物但(与Met相反)不易氧化。用通常在哺乳动物内源性 肽和蛋白质中未发现的残基进行保守性取代的另一例子是用例如鸟氨酸、刀豆氨 酸、氨基乙基半胱氨酸或其它碱性氨基酸保守性取代Arg或Lys。关于肽和蛋白质 中表型沉默取代的其它信息可参见，例如Bowie等，Science 247，1306-1310，1990。
  原始残基 保守取代 Ala Gly Arg Lys Asn Gln、His、Thr Asp Glu Gln Asn、His Glu Asp His Asn、Gln Ile Leu、Val Leu Ile、Val Lys Arg Met Leu、Ile Phe Tyr、Trp、His Ser Thr、Asn Thr Ser、Asn、Gln Trp Tyr、Phe、His Tyr Trp、Phe、His Val Ile、Leu
除非本文另有指明，应用于本文任何部分的术语“取代的”指用多达4个 相容性取代基取代，其中每个独立为，例如(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、羟基、 羟基(C1-C6)烷基、巯基、巯基(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷硫基、卤素(包括氟、溴 和氯)、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、腈基(-CN)、氧代、苯基、-COOH、-COORA、 -CORA、-SO2RA、-CONH2、-SO2NH2、-CONHRA、-SO2NHRA、-CONRARB、 -SO2NRARB、-NH2、-NHRA、-NRARB、-OCONH2、-OCONHRA、-OCONRARB、 -NHCORA、-NHCOORA、-NRBCOORA、-NHSO2ORA、-NRBSO2OH、-NRBSO2ORA、 -NHCONH2、-NRACONH2、-NHCONHRB、-NRACONHRB、-NHCONRARB或 -NRACONRARB，其中RA和RB独立为(C1-C6)烷基。“任选的取代基”可以是 任一上述取代基团。
除非本文另有规定，本文提及的NPY、PYY和PP肽和它们的序列涉及那 些肽的人形式和它们的序列。然而，如本文所用的那些术语一样，其它哺乳动 物的NPY、PYY和PP常可构成人NPY、PYY和PP的PP-折叠肽模拟物，或 保守取代的人NPY、PYY或PP。
本发明使用的(a)型激动剂
总体上，(a)型激动剂是NPY、PYY或PP的PP-折叠类似物，或NPY、PYY 或PP的PP-折叠模拟物，其具有修饰以确保相对于Y1受体的Y2和Y4受体亲和 力和效力。这种PP-折叠类似物和模拟物包括具有PP-折叠性质的全部补体的肽(N- 末端聚脯氨酸样螺旋、β转角、两亲性α螺旋和C-末端六肽)、部分骨架(例如β转 角残基和毗邻的残基)被非肽间隔链替代的肽类似物和拥有C-末端六肽和两亲α螺 旋的最后一个转角但缺乏所有或部分聚脯氨酸样螺旋和/或β转角的截短的肽。
在本发明考虑的C-末端Y受体识别氨基酸序列中，R1和R2优选是氢。残基 X也优选是Val或Ile。当本发明的激动剂是含有本发明所述C-末端修饰的PP 序列时，残基X可以是例如Leu、Val或Ile。当本发明的激动剂是含有本发明 所述C-末端修饰的PYY或NPY序列时，残基X可以是例如Val或Ile。
在一个实施方案中，本发明所考虑的激动剂含有以-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg- Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端Y受体识别序列，其中残基XA是非碱性和非酸性 的，序列-X-Thr-Arg-X3-Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上定义。在该情况中，非碱性和 非酸性氨基酸残基XA可以是例如Leu、Met或Nle、Ile、Val或Ala。
在另一实施方案中，该激动剂含有以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3- Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽，其中序列-XA-X-Thr-Arg-X3-Arg- Tyr-C(＝O)NR1R2如上定义，XC是Arg或Lys，XB是Ile、Leu或Val。在该类激 动剂中，C-末端十一肽序列是-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Leu或Met)-Val-Thr-Arg-Gln- Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在不同的实施方案中，该激动剂含有以-XC-Tyr-XB-Asn-XA-X-Thr-Arg-X3- Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2表示的C-末端十一肽序列，其中序列-XA-X-Thr-Arg-Gln- Arg-Tyr-C(＝O)NR1R2如上定义，XC是His、Asn或Gln，XB是Ile、Leu或Val。 在该类激动剂中，C-末端十一肽序列是-His-Tyr-(Ile或Leu)-Asn-Met-Leu- Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-C(＝O)NH2。
在该激动剂的C-末端Y受体识别氨基酸序列中，当前优选X3是Gln。
在本发明考虑的(a)型激动剂的N-末端Y受体识别氨基酸序列中，残基X1优 选Ala或可以不不存在，残基X2优选Leu、Ile或Ser。因此，优选的N-末端序 列是H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-。另一优选的N-末端序列是H2N-Pro-Leu-Glu-。
本发明使用的(b)型激动剂
总体上，(b)型激动剂可以认为是(a)型PP-折叠肽类似物或PP-折叠模拟物，它 们的最小PP-折叠结构特性(C-末端Y受体识别序列和α螺旋的最后一个转角)通过 特定的分子内共价键得到稳定。
本发明考虑的(b)型激动剂可以是具有以上(a)型激动剂相关所述的N-末端Y 受体识别序列的PP-折叠模拟物，或者它们可以是不具有(a)型激动剂所定义类型的 N-末端Y受体识别序列的N-末端截短PP-折叠模拟物(虽然它们可具有其它N-末端 氨基酸序列)。因此，(a)型激动剂所定义的N-末端受体识别序列任选处于该(b)型激 动剂中。
该型激动剂的特征在于分子内连接键，这些键或在天然NPY、PYY或PP肽 中无等价物，或对应于或用共价键替代非共价相互作用，例如[Cys2，DCys27， Gln34]PP(SEQ ID No：22)中Cys2和D-Cys27之间的共价二硫键。如上所述，这 种键可用于稳定PP-折叠结构的基本元件，特别是可活动的C-末端Y2识别序列和 α螺旋的最后一个转角，和/或提供N-末端。在全长或接近全长的肽中，这种键可 稳定此类天然PP-折叠结构。这有利于两方面，首先，可稳定两亲性α螺旋的C-末 端部分从而可以最佳方式提供C-末端Y受体识别氨基酸序列进而提高对Y受体的 效力；第二，通过稳定整个PP-折叠结构使这类肽不易受蛋白酶解降解，因为这种 酶往往需要它们的靶序列为非折叠形式(Schwartz等，1990)。分子内连接键也能使 Y2/Y4-选择性激动剂相对于天然肽的结构有更多修饰，例如激动剂可缺乏天然肽 中发现的一个或多个结构域或部分结构域。
一组(b)型激动剂具有PP-折叠结构，此结构中束缚螺旋转角的分子内连接键从 两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至该激动剂的N-末端部分的连接点，该N-末 端部分对应于反平行延伸至两亲性结构域的PP-折叠肽的聚脯氨酸结构域。束缚螺 旋转角的分子内连接键，例如二硫键或内酰胺键可从两亲性结构域的一个氨基酸残 基延伸至4个N-末端残基之一。当该激动剂是前4个氨基酸残基作肽图对应于PP、 NPY或PYY的N-末端位置的PP-折叠模拟物时，束缚螺旋转角的分子内连接键， 例如二硫键或内酰胺键可从两亲性结构域的一个氨基酸残基延伸至那4个N-末端 残基之一，例如[Cys2，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：22)中的。
在另一组(b)型激动剂中，束缚螺旋转角的分子内连接键在α螺旋结构域的最后 一个螺旋转角的残基间延伸，例如在螺旋转角的Lys和Glu残基之间，或在C-末 端Y2识别氨基酸序列的残基和α螺旋结构域的最后一个螺旋转角的残基之间形成 的内酰胺键，例如[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID No：28)的Lys28和Glu32之 间的内酰胺键。
(a)和(b)型激动剂
在本发明考虑的一组同时具有C-末端和N-末端Y受体识别序列的(a)或(b)型 PP-折叠模拟激动剂中，C-末端序列可以在其N-末端与两亲性氨基酸序列结构域融 合，该结构域含有至少一个毗邻C-末端六肽序列N-末端的α螺旋转角，所述C-和 N-末端氨基酸序列通过接头基团相连，所述接头基团可以是任选含有一个或多个 双键或三键的直链或支链亚烷基。例如，激动剂的C-和N-末端氨基酸序列可以通 过肽键分别与式NH2(CH2)nCO2H所示氨基酸的羧基和氨基相连，其中n是2-12， 特别是6、7、8、9或10。因此，激动剂可以是具有以上定义的含所述Cys-Cys键 的C-末端和N-末端Y识别序列的NPY、PPY或PP类似物，但对应于天然肽的5-24 的氨基酸残基被具有6-10个碳原子的碳链，选自6-氨基己酸(ε-氨基己酸)、7-氨基 庚酸、8-氨基辛酸、9-氨基壬酸和氨基癸酸的氨基羧酸替代。在特定的实施方案中， 优选8-氨基辛酸(本文有时缩写为“Aoc”)。这种激动剂的例子是[Cys2，Aoc5-24， Dcys27，Gln34]-PP(SEQ ID.No：23)。
一些本发明考虑的该类型激动剂可认为是1)NPY或PYY肽的类似物，其中 在PP的某些关键位置而非NPY或PYY的相应位置中发现的残基被那些相应的PP 残基或与那些相应的PP残基结构相似(保守性取代)的天然或非天然残基取代，或 2)PP类似物，其中在NPY或PYY的某些关键位置而非PP的相应位置中发现的残 基被那些相应的NPY或PYY残基或与那些相应的NPY或PYY残基结构相似的天 然或非天然残基取代。如上所述以及图1所示，Y受体识别位于由PP-折叠或PP- 折叠模拟呈递的肽的组合C-和N-末端的残基。通常，Y2受体不识别PP肽，因为 特别在PP的C-末端存在与对Y2受体具有高亲和力激活与效力的肽不相容的残基。 然而，通过用相应的NPY或PYY的残基取代PP分子中或PP的PP-折叠模拟物中 的一个或多个残基，可能增加该肽对Y2受体的亲和力而不丧失对Y4受体的亲和 力与效力或对Y4受体的亲和力与效力只有程度较轻的降低。
下表给出了PP、NPY和PYY在N-末端和C-末端，即位置1、3、4、26、28、 30、31和34之间不同的残基。通过在一个或多个这些位置进行上述同源取代可得 到所需的组合Y2和Y4高亲和力。然而，在PP中获得对Y2受体的高亲和力和效 力而不丧失对Y4受体的亲和力和效力的优选取代是用Gln或具有相似理化性质的 非天然残基取代Pro34。因此，如同其中Gln34与用相应或理化相似的残基或用 具有相似特性的非天然氨基酸取代PP中一个或多个其它非NPY/非PYY残基 相组合的PP类似物或模拟物一样，[Gln34]PP是高度优选的肽。
然而，应该注意的是，本发明允许的同源取代是导致本文定义的激动剂的 取代，因为提供肽所需特性的不都是该表所提示的所有可能的取代。例如，就 本发明可用的类似物而言，在PYY或NPY的34位引入Pro虽然提供了对Y4 受体的高亲和力，但极大损害了肽对Y2受体的亲和力。
  位置 1 3 4 26 28 30 31 34 PP Ala Leu Glu Arg Ile Met Leu Pro NPY Tyr Ser Lys His Ile Leu Ile Gln PYY Tyr Ile Lys His Leu Leu Val Gln
本发明所用的具体激动剂
以下是本发明所用激动剂的具体例子：
[Gln34]PP(SEQ ID No：4)
[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：34)
[N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys18，Gln34]PP(SEQ ID No：35)
[N-PEG5000-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：36)
[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)
[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)
[Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No：7)
[Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No：8)
[Leu28，Gln34]PP(SEQ ID No：9)
[His26，Gln34]PP(SEQ ID No：10)
[Ile3，Gln34]PP(SEQ ID No：11)
[Ala1，Glu4，Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：12)
[Ala1，Glu4，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：37)
[Ala1，Glu4，N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys13，Arg26，Nle30]PY Y(SEQ ID No：38)
[Ala1，Glu4，N-PEG5000-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：39)
[Ala1，Glu4，Arg26(Met30或Nle30)]NPY(SEQ ID No：13)
[Ala1，Glu4]PYY(SEQ ID No：14)和[Ala1，Glu4]NPY(SEQ ID No：15)
[Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：16)和[Arg26，(Met30或 Nle30)]NPY(SEQ ID No：17)
[Glu4，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：18)和[Glu4，(Met30或 Nle30)]NPY(SEQ ID No：19)
[Glu4，Arg26]PYY(SEQ ID No：20)和[Glu4，Arg26]NPY(SEQ ID No：21)
[Cys2，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：22)
[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：23)
[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：30)
[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰 基)-Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：31)
[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(S EQ ID No：32)
[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酰基 (hexaoxaheneicosanoyl))}-γ谷氨酰基-Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：33)
和它们保守取代的类似物。
本发明所用的特别优选的Y2/Y4选择性激动剂是[Gln34]-PP(SEQ ID No：4) 和[Ala1，Glu4，Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：12)或它们保守取代的 类似物。
本发明所用的合适激动剂
到目前为止，本发明所用的基础Y2/Y4-选择性激动剂已得到总体描述并提供 了这种激动剂的具体例子。然而，为提高它们的药代动力学、药效学和代谢性能， 可对这种激动剂，包括特别鉴定的激动剂作出各种修饰。这种修饰可涉及将该激动 剂与本身为肽或蛋白质药物领域已知的功能基团(也称为基序)相连。无论(a)、(b) 或(c)型，在本发明考虑的激动剂的情况中，有具体益处的三种特定修饰是与血清 白蛋白结合基序或糖胺聚糖(GAG)相连，或PEG化。
血清白蛋白结合基序
血清白蛋白结合基序一般是亲脂性基团，将其引入能延长给药后(药物)在体内 的驻留时间，或出于其它原因可用各种已知的方法将其与肽或蛋白质分子偶联，例 如i)通过共价键，例如侧链氨基酸残上的功能基团，ii)通过插入该肽中的或适当衍 生肽中的功能基团，iii)作为该肽的一种整合部分。例如，WO 96/29344(Novo Nordisk A/S)、P.Kurtzhals等，1995 Biochemical J.312：725-31和L.B.Knudsen 等，2000 J.Med.Chem.43：1664-69描述了许多可用于本发明所考虑激动剂的合适 亲脂性修饰。
合适的亲脂性基团包括任选取代的、饱和或不饱和的、直链或支链的10-24 个碳原子的烃基团。这种基团可形成该激动剂骨架的侧链或其一部分，例如通过醚、 硫醚、氨基、酯或酰胺键与骨架中氨基酸残基的侧链相连，或与PP-折叠模拟激动 剂骨架中的非肽接头基团的骨架碳或骨架碳的支链相连。连接亲脂性基团的化学方 法不是关键性的，但包含亲脂性基团的以下侧链是可与该激动剂的骨架碳相连的例 子，或是其合适的支链：
CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CONH-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CONH-，其中r是9-15的一个整数，
CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CONH-，其中s是9-15的一个整数，
CH3(CH2)mCONH-，其中m是8-18的一个整数，
-NHCOCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中p是10-16之间的一个整 数，
-NHCO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中q是10-16的一个整数，
CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO-，其中n是9-15的一个整数，
CH3(CH2)pNHCO-，其中p是10-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3，其中m是8-18的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)pCH3，其中 p是10-16的一个整数，
-CONHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3，其中 q是10-16的一个整数，和
部分或完全氢化的环戊菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。
在一个化学合成方案中，含有亲脂性基团的侧链是酰化存在于激动剂骨架 残基的侧链中的氨基的C12、C14、C16或C18酰基，例如十四烷酰基。
如上所述，用于改善血清蛋白结合性质的激动剂的修饰是可通用的策略，特 别是在以上列出的特定激动剂的情况中。因此，可以上述方式修饰例如 [Lys11，Gln34]-PP及其保守取代的类似物，例如通过十六烷酰基酰化Lys11，或 者可修饰[Lys13，Gln34]PP以形成[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基 -Lys13，Gln34]PP，或者可修饰[Ala1，Glu4，Lys13，Arg26，Nle30]PYY以形成 [Ala1，Glu4，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Arg26，Nle30]PYY。
GAG结合
在上述亲脂性血清结合基序例子中，可通过加入作为该激动剂骨架侧链(或其 一部分)的GAG结合基序来修饰本发明考虑的激动剂。已知可以该方式加入的 GAG-结合基序包括氨基酸序列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基 酸残基，X是任何氨基酸残基。可将多条，例如3条这种序列以多联体(直链)或枝 状体(支链)的方式加入。具体的多联体GAG基序包括Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala- Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala和Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala- Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala，二者可以通 过，例如，多联体GAG-结合基序的C-末端与和激动剂骨架氨基酸侧链中的氨基之 间形成酰胺键相偶连，例如和激动剂[Lys18，Gln34]PP(SEQ ID No：24)中Lys18的ε 氨基形成的[N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys18，Gln34]PP或者和激动剂 [Ala1，Glu4，Lys13，Arg26，Nle30]PYY中Lys13的ε氨基形成的[Ala1，Glu4，N-(Ala- Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys13，Arg26，Nle30]PYY。
GAG基序可直接或经接头基团与激动剂的C-或N-末端(优选)共价连接，而不 是与激动剂相连或作为骨架残基侧链的一部分。GAG结合基序也可含有氨基酸序 列XBBXBX和/或XBBBXXBX，其中B是碱性氨基酸残基，X是任何氨基酸 残基，例如序列[XBBBXXBX]n，其中n是1-5，B是碱性氨基酸残基，X是任 何氨基酸残基，特别是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala- Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-[Gln34]PP(SEQ ID No：26)。
本发明考虑的Y2/Y4选择性激动剂特别可用于治疗性血管生成。就该具体用 途而言，该激动剂优选包含上述糖胺聚糖(GAG)结合基序。这种基序能确保该激动 剂在胞外基质中与GAG结合，从而确保Y2受体在该组织中的局部接触时间延长。 生长因子，趋化因子等可通过能与GAG的酸性糖相互作用的碱性氨基酸斑(patch) 与GAG结合。生长因子上这些带正电荷表位通常由碱性残基的侧链构成，这些残 基不一定连续地位于序列中但往往通过二级结构元件，例如a-螺旋或转角或通过该 蛋白质的整个三维结构存在于邻近区域。某些上述GAG-结合性线形序列已有描 述，例如XBBXBX和XBBBXXBX，其中B代表碱性残基(Hileman等，Bioassays 1998，20：156-67)。圆二色性显示这些区段与GAG结合后形成α-螺旋。当存在 例如三条这样的序列(例如每条是ARRRAARA序列)时，如果使这种序列位于 例如多联体或枝状体构建物中，得到的24-单体肽，例如ARRRAARA- ARRRAARA-ARRRAARA可确保其在胞外基质中的保留(时间)类似于高分子 量聚赖氨酸，即在4小时输注期间不会被洗掉(Sakharov等，FEBS Lett 2003， 27：6-10)。
因此天然构建的生长因子和趋化因子有两类结合基序：一类受体的结合基序， 通过它实现信号转导，而一类GAG的结合基序，通过它实现结合与持久的局部活 性。诸如NPY和PP等肽是神经肽和神经激素，它们可从组织中相当快速地洗掉， 这对持久的局部作用而言不是最佳。使GAG-结合基序与本发明的Y2/Y4选择性激 动剂结合后，构建了一种同时具有PP-折叠肽部分的受体结合表位和GAG-结合基 序的类似于生长因子和趋化因子的双功能分子。此外，通过包含GAG-结合基序， 当修饰的肽注射时，例如通过皮下或肌肉内或透皮或以类似的方式递送入同样的组 织时，其也具有在组织中更长时间驻留的特性。因此，GAG修饰的肽也构成极其 有益于获得缓慢释放入循环(系统)和延长作用方式的缓释制剂。
就NPY肽及其类似物而言，引入PP-折叠肽的GAG结合基序(例如碱性多联 体或枝状体构建物)的另一合适位置是14位，就PYY和PP肽及它们的类似物而言 是13位。就NPY、PYY和PP类肽而言，其它优选位置是11位和18位。然而， 如上所述，可将含有GAG-结合基序的残基引入激动剂中的任何位置，前提是这种 引入与保留本发明考虑的(a)、(b)和(c)型激动剂中所需的PP-折叠结构和C-末端Y2- 识别序列所需的(结构)相一致。因此，可将GAG-结合基序作为类似物中的间隔构 建物部分安置，所述类似物的PP-折叠部分可用非肽间隔物替代。
PEG化
在PEG化过程中，将一个或多个聚环氧烷基团共价偶联于肽或蛋白质药物以 提高给药后在体内的有效半衰期。该术语得自该方法所用的优选聚环氧烷，即得自 乙二醇-聚乙二醇或“PEG”。
合适的PEG基团可通过任何方便的化学方法与激动剂相连，例如通过激动剂 的骨架氨基酸残基。例如，就PEG样的分子而言，常用的连接基团是赖氨酸的ε- 氨基或N-末端氨基。其它连接基团包括游离羧基(例如，C-末端氨基酸残基或天冬 氨酸或谷氨酸残基的羧基)、适当活化的羰基、巯基(例如，半胱氨酸的巯基)、芳香 族氨基酸残基(例如，Phe、Tyr、Trp)、羟基(例如，Ser、Thr或OH-Lys的羟基)、 胍基(例如，Arg)、咪唑基(例如，His)和氧化的碳水化合物部分。
当激动剂PEG化后，它通常包含1-5个聚乙二醇(PEG)分子，例如1、2或3 个PEG分子。每个PEG分子的分子量可以是约5kDa(千道尔顿)-100kDa，例如 约10kDa-40kDa的分子量，如约12kDa或优选不超过约20kDa。
合适的PEG分子可购自Shearwater Polymers，Inc.和Enzon，Inc.，并且可 选自SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、 SC-PEG、分枝(tresylated)mPEG(US 5,880,255)，或氧基羰基-氧基-N-二羧基酰 亚胺-PEG(US 5,122,614)。
在具体的实施方案中，上述激动剂[Lys13，Gln34]PP可以在Lys13处PEG 化以形成[N-PEG5000-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：40)，或者[Ala1，Glu4，Lys18， Arg26，(Met30 or Nle30)]PYY(SEQ ID No：25)可以在Lys18处PEG化。
血清白蛋白、GAG和PEG
无论对激动剂的修饰是与某基团连接以促进血清结合、GAG结合还是通过 PEG化提高其稳定性，血清白蛋白结合基序或GAG结合基序或PEG基团可以是 激动剂碳骨架的侧链或者可以形成激动剂碳骨架侧链的一部分，所述骨架碳对应于 以下PYY或PP的任一位置：1、3、6、7、10、11、12、13、15、16、17、18、 19、21、22、23、25、26、28、29、30和32，或对应于以下NPY的任一位置： 1、3、6、7、10、11、12、14、15、16、17、18、19、21、22、23、25、26、 28、29、30和32。
与较大生物分子的偶联
如上所述，可在PP-折叠肽或PP-折叠肽模拟物的各种位置连接某些基序而不 削弱它们对Y受体的高亲和力(见实施例)。以类似方式，组合的选择性Y2-Y4受 体激动剂可作为与例如白蛋白或另一种蛋白质或运载体分子相连的融合蛋白使用， 从而提供有益的药代动力学或其它类型性能，例如减少肾排除。如同可采用多种蛋 白质或运载体那样，本领域已知这种共价结合可采用多种化学修饰基团和接头。特 别优选将选择性Y2-Y4肽激动剂与白蛋白共价结合于PP-折叠结构的位置之一，本 文其它地方已指出的可用各种基序修饰的有关位置。这种融合蛋白可以通过各种半 合成技术产生，其中肽可通过本文所述的肽合成技术制备，和通过重组技术制备生 物分子。该融合蛋白也可整体作为表达的重组分子来制备，例如含有延伸序列 Gly-Lys-Arg的前体分子，当该分子在真核细胞中表达为分泌型蛋白时将被生物合 成酶切割，C-末端Y2受体识别序列的C末端Tyr残基上的Gly转变为羧酰胺。
稳定化
如本文各处提及的那样，可以各种方法稳定本发明的许多选择性Y2-Y4激 动剂，例如通过N-末端酰化或通过用非肽接头替换激动剂部分骨架，或通过内 部环化交连来稳定PP-折叠结构。在大多数情况中，该稳定作用有两个目的， 一是通过保留PP-折叠以最佳方式提供Y2和Y4受体的受体识别表位，另一是 稳定此肽以抵抗降解，即特别是蛋白酶解的降解。当也通过连接上述各种基序 来修饰选择性Y2-Y4激动剂以获得延长的半衰期、缓释和/或长时间组织接触 时，这点特别重要。如通常的和与选择性Y2-Y4激动剂肽，例如PP-折叠稳定 化，环形[Cys，D-Cys27]PP及其各种类似物相关的具体例子所述，通常此肽激 动剂主要通过肾脏相对快速地排出，因此蛋白质稳定性可能不重要，然而，当 要求此肽以一种或多种方式在各种体液中延长存在数小时时，保持该肽的生物 活性完整就特别重要，即其稳定形式应能耐受蛋白酶解攻击。因此，在本发明 优选的实施方案中，Y2-Y4选择性激动剂均是结构稳定的(通过结构改变，一些 在以下实施例中具体指出)，它们用各种基序修饰和/或与生物分子融合和/或以 药学方式制备以获得缓释等或延长的受体接触(时间)。
螺旋诱导肽
已提及本发明考虑该激动剂N-末端的酰化可作为稳定该激动剂抵抗氨肽 酶作用的一种方法。另一种稳定性修饰包括将4-20个氨基酸残基的稳定性肽序 列共价连接于N-和/或C-末端，优选N-末端。此稳定性肽中的氨基酸残基选自 Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met等。 在一令人感兴趣的实施方案中，N-末端肽连接包含4、5或6个Lys残基，例 如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-PYY25-36(SEQ ID No：29)。这些稳定性肽可连接 在PP-折叠肽激动剂的N-末端或者可将它们置于N-末端截短的PP-折叠模拟激 动剂或N-末端缩短的PP-折叠模拟激动剂的N-末端，其中将间隔肽引入新的 N-末端和稳定性肽之间。由于Lys残基链倾向于形成α螺旋结构并在随后的残 基中诱导这种结构，这种稳定性肽延伸物的常规描述见纳入本文作为参考的 WO 99/46283(Zealand Pharmaceuticals)。
本发明考虑的受体激动剂可通过熟知的方法制备，例如合成、半合成和/ 或重组方法。这些方法包括标准的肽制备技术，例如液态合成和固相合成。本 领域技术人员根据本领域的教材和常规知识知晓如何获得激动剂和它们的衍 生物或修饰物。
下文描述了本发明的具体激动剂和相关的分子药理学特性以及肽的化学 和稳定特性。
[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)
该肽是通过在31位引入Ile和在34位引入Gln而设计的对Y2受体具有高亲 和力的PP类似物，这些残基对应于NPY中在这些位置发现的残基(Fuhlendorff等， JBC 1990，265：11706-12)。
受体识别情况—[Ile31，Gln34]PP对人Y4受体具有一位数纳摩尔(single digit nanomolar)亲和力(IC50＝1.2nM)，这非常类似于PP的(IC50＝0.49nM)， [Ile31，Gln34]PP对Y2受体的亲和力为IC50＝54nM，但对Y1受体的IC50超 过1000nM，因此，与Y1受体相比，[Ile31，Gln34]PP是选择性Y2-Y4激动剂(表 1)。以前只在有大鼠Y4受体可用之时报道了对Y受体的亲和力，[Ile31，Gln34]PP 显示对大鼠Y4受体有约50nM的亲和力，这比PP的亲和力低约100倍 (Fuhlendorff等，JBC 1990，265：11706-12；Schwartz等，NYAC，1990，611： 35-47)。就效力而言，[Ile31，Gln34]PP在体外显示对Y4受体效力是0.91nM (EC50值)，对Y2受体的EC50是6.5nM，对Y1受体的EC50值是48nM(表 2)。因此，与以前公布的亲和力数据相比(Fuhlendorff等，JBC 1990，265： 11706-12；Schwartz等，NYAC，1990，611：35-47)，相对于[Ile31，Gln34]PP对 Y1受体具有两位数的效力，其在事实上对Y2和Y4受体具有一位数的效力是 令人吃惊的。
蛋白质稳定性—类似于PP1-36。
[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)
与[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)相似，该肽是经设计对Y2受体具有高亲 和力当保留了对Y4受体的高亲和力的PP类似物，然而，在该情况中，是通过 在31位引入对应于PYY中于此位置发现的残基的Val，在34位再次引入对应 于NPY和PYY中于此位置均发现的残基的Gln。这是新颖的化合物。
受体识别情况—[Val31，Gln34]PP对Y4受体的亲和力是0.93nM，对Y2受 体为69nM，而即使使用>1000nM其对Y1受体的亲和力亦未检测到(表1)- 因此，[Val31，Gln34]PP是Y2-Y4选择性配体。就体外效力而言，[Val31，Gln34]PP 对Y4受体的EC50值为1.0nM，对Y2受体的为9.9nM，而其对Y1受体的效 力为99nM(表2)。
蛋白质稳定性—类似于PP1-36。
[Gln34]PP(SEQ ID No：4)
与[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)和[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)相似， 该肽是设计为对Y2受体具有高亲和力的PP类似物，然而在该情况中，是通过 在34位引入对应于NPY和PYY中于此位置均发现的残基的Gln。由于34位 对PP识别Y4受体不重要，该肽对Y2和Y4受体具有双重的高亲和力。在牛 PP中，Gln引入34位，发现其对Y4受体的亲和力非常类似于牛PP本身，但 该肽未对Y2受体进行测试(Gehlert等，1996 Mol Pharmacol.1996 50：112-8)。 在本发明中，在人PP1-36中用Gln取代Pro，证实[Gln34]PP与NPY和PYY 相似对Y2受体具有出乎意料的高亲和力，并且它不结合Y1受体。因此， [Gln34]PP(即[Gln34]人PP1-36)是对Y2和Y4受体具有相对于Y1受体的选择 性的新颖化合物。
受体识别情况—[Gln34]PP以1.2nM的亲和力结合Y4受体，以9.0nM的 亲和力结合Y2受体，而即使使用>1000nM的该肽，其对Y1受体的亲和力亦 未检测到(表1)。就体外效力而言，[Gln34]PP显示对Y4受体的EC50值为1.1 nM，对Y2受体的为3.0nM，而其对Y1受体的为388nM(表2)。
蛋白质稳定性—类似于PP1-36。
体内受体选择性—在剂量渐增研究中，[Gln34]PP在30分钟输液时间内，以 剂量0.3、1、3、10、30和100μg/kg经静脉内输液给予麻醉的狗。通过放射免疫 测定检测[Gln34]PP的血浆水平，显示线性剂量关系。在最高剂量处，在狗中获 得100nM的血浆水平。然而未观察到对血压和心率的剂量依赖作用。作为Y1 和Y2受体激动剂的PYY和NPY在很低的血浆水平可升高血压是熟知的。因 此，这些实验表明[Gln34]PP在体内也是无可测的Y1受体或活性的高度选择性 肽。
对小鼠的急性食物摄入的体内作用—在禁食16小时后，通过皮下注射将 PYY3-36、[Gln34]PP或盐水以每只动物3或30μg(PYY3-36)的剂量或1-10μg ([Gln34]PP)的剂量给予各组8只小鼠。图2显示小鼠的累积食物摄入情况。剂 量为30μg的PYY3-36在最初两小时期间时抑制食物摄入，但在随后的2到6 小时中该作用逐渐消退。[Gln34]PP对食物摄入具有比PYY3-36更明显且持久 的抑制作用。因此，即使在1μg的剂量也观察到对食物摄入更有效的抑制作用 并且该作用持续超过8小时(图2)。所以，虽然[Gln34]PP在体外试验中检测到 对Y2受体的效力低10倍(EC50值为3.0，PYY3-36为0.24，表2)，但由于其 也是Y4激动剂，相信其在体内对小鼠的急性食物摄入更有效且具有更长的作 用时间。
可进一步修饰[Gln34]PP(类似于本文提供的其它肽例子)以获得各种例如 药代动力学或其它目的，同时仍保留其超过Y1的组合Y2-Y4选择性。例如， 可用如Leu或Nle取代17和/或30位的Met残基，可将一个或多个Lys或其它 连接倾向残基引入各种位置以连接各种基序等。据此可得到一组选择性Y2-Y4 激动性肽，从而可从中选择治疗如本文其它地方所述肥胖症等的药物。
[Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No：7)、[Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No：8)、 [Leu28，Gln34]PP(SEQ ID No：9)、[His26，Gln34]PP(SEQ ID No：10)
与[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)和[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)相似， 这些肽是经设计为对Y2受体具有高亲和力的PP类似物，然而在这些情况中， Pro34取代为Gln与PPC-末端中的其它非NPY/非PYY残基的取代：即Met30 取代为Leu(均在NPY和PYY中)或Ile28取代为Leu(在PYY中，NPY中是与 PP一样的Ile)或Arg26取代为His(均在NPY和PYY中)相组合。例如，用Leu 或Nle取代Met30的优点在于消除了天然存在的Met残基氧化的可能性。 [Leu30，Gln34]PP、[Nle30，Gln34]PP、[Leu28，Gln34]PP和[His26，Gln34]PP是新 颖的化合物。
[Ile3，Gln34]PP(SEQ ID No：11)
[Ile3，Gln34]PP代表了同时在PP支架背景的C和N末端进行修饰从而获得 所需相对于Y1的组合Y2-Y4选择性的肽。与例如[Ile31，Gln34]PP和 [Val31，Gln34]PP相似，该肽是经设计对Y2受体具有高亲和力的PP类似物， 然而在此情况中，Pro34取代为Gln与此情况中PP的N-末端中另一非NPY/非 PYY残基的取代：即Leu3取代为Ile(在PYY中，在NPY中是Ser)相组合。 [Ile3，Gln34]PP是新颖的化合物。
[Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY(SEQ ID No：12)
该肽代表了一组PYY和NPY类似物，其中N-和/或C-末端中的一个或多个非 PP残基被PP中发现的残基所取代以获得所需相对于Y1的组合Y2-Y4选择性。通 过在C-末端和N-末端引入总共4个PP-样残基将[Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY 设计为对Y4受体具有高亲和力。避免在34位引入Pro，因为这样严重影响了 这些肽对Y2受体的亲和力，虽然它增加了这些肽对Y4受体的亲和力。 [Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY是新颖的化合物。
受体识别情况—[Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY对刺激人Y2受体(EC50＝1.0 nM)和人Y4受体(EC50＝1.4nM)显示高效力，而其对人Y1受体的效力只有87 nM(表2)。
蛋白质稳定性—类似于PP1-36。
可进一步修饰[Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY(类似于本文提供的其它肽例 子)以获得各种例如药代动力学或其它目的，同时仍保留其超过Y1的组合 Y2-Y4选择性。例如，可用如Leu或Nle取代17和/或30位的Met残基，可将 一个或多个Lys或其它连接倾向残基引入各种位置以连接各种基序等。据此可 得到一组选择性Y2-Y4激动性肽，从而可从中选择治疗如本文其它地方所述肥 胖症等的药物。
[Ala1，Glu4]PYY(SEQ ID No：14)、[Arg26，Met30]PYY(SEQ ID No：16)、 [Glu4，Met30]PYY(SEQ ID No：18)、[Glu4，Arg26]PYY(SEQ ID No：20)
这些新颖的肽和[Ala1，Glu4，Arg26，Met30]PYY代表了基于PYY或NPY的 肽激动剂，其中C-和/或N-末端的残基被取代以获得相对于Y1受体的Y2加 Y4选择性。据此并结合其它基于PP的肽得到了一组肽，从而可从中选择具有 高度Y2和Y4亲和力之间的最佳平衡以及可变的Y1效力以用作抗肥胖等药物 的肽。
受体识别情况—表1的例子显示，[Arg26，Met30]PYY对Y1和Y4受体的亲 和力分别是是0.13nM和2.3nM，相对而言对Y1受体的亲和力是65nM。在 另一例子中，通过在[Glu4，Arg26]PYY中用Glu取代4位的Lys和用Arg取代 26位的His，PYY对Y1受体的亲和力从16nM降至367nM，通过这两种取代 此肽对Y4受体的亲和力从30nM(PYY)升至3.3nM([Glu4，Arg26]PYY)，从而 得到超过100倍的选择窗(selectivity window)(表1)。
[Cys2，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：22)
在本文中，该PP类似物代表了一组Y2-Y4选择性激动剂，其中环形 [Cys2，D-Cys27]PP肽的增加的蛋白质稳定性与[Gln34]PP的对比Y1受体双重 Y2和Y4受体选择性相组合。这是新颖的化合物。从以上给出的肽可明显知道， 可进一步修饰该肽以获得各种例如药代动力学或其它目的，同时仍保留其超过 Y1的组合Y2-Y4选择性。例如，可用如Leu或Nle取代17和/或30位的Met 残基，可将一个或多个Lys或其它连接倾向残基引入各种位置以连接各种基序 等。据此可得到一组选择性Y2-Y4激动性肽，从而可从中选择治疗如本文其它 地方所述肥胖症等的药物。
[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：23)
在该PP类似物中，将[Gln34]PP的双重受体特异性构建入PP的小而方便的 [Cys2，Aoc5-24，D-Cys27]PP型类似物。这是新颖的化合物。
临床适应症
本发明考虑的Y2/Y4-特异性激动剂可用于治疗对Y2和/或Y4受体激活起反 应的疾病。这种疾病包括显示需要调节能量摄入或能量代谢或控制肠液分泌或诱导 血管生成的疾病。就这种用途而言，该激动剂可包含能赋予对肽酶的稳定性、血清 蛋白质结合性能或PEG化以延长血清和/或组织半衰期的修饰或基序。特别是诱导 血管生成，该激动剂可包含GAG-结合基序以延长组织半衰期和Y受体接触(时间)。
显示需要调节能量摄入或能量代谢的疾病或病症包括肥胖和超重，与肥胖和 超重认为是影响因素的疾病，例如食欲过胜、神经性贪食、X综合征(代谢综合征)、 糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、 葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高血压、动脉粥样硬化、冠状动脉病、心肌梗 塞、周围血管病、中风、血栓栓塞性疾病、高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾 病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病如多囊性卵巢综合征，或乳腺癌、 前列腺癌或结肠癌。
显示需要调节肠分泌的疾病或病症包括各种形式的腹泻或患肠造口术的过度 分泌(hyper-secretion from intestinal stomia)的患者。
诱导血管生成的适应症疾病或病症包括：周围血管疾病、冠状血管病、心肌 梗塞、中风和认为任一上述情况是影响因素的病症、创伤愈合与组织修复。
1.肥胖和超重
当外周给药时，PYY3-36显示能降低各种啮齿类动物的食欲、食物摄入和体 重(Batterham等，Nature 2002，418：595-7；Challis等，BBRC Nov.2003，311：915-9) 以及在人中降低食欲和食物摄入(Batterham等，2002)。包括受体敲除动物研究的 动物数据强烈表明PYY3-36的这种作用是通过Y2受体和弓形核中的NPY/AgRP 和POMC神经元介导的。经常有报道说肥胖对象的PYY水平和PYY食物反应较 低并与他们的BMI逆相关。重要的是，肥胖对象不耐受PYY的作用，因为PYY3-36 输液90分钟以相似的持久方式降低了食物摄入(Batterham等，2003，NEJM 349： 941-48)。
啮齿类动物研究积累的许多证据显示，事实上当PP外围给药时其是强有力且 有效的食欲减退肽(Askawa等，Peptides 1999，20；Gastroenterology 2003，124： 1325-36)。由于PP在Y4敲除动物中对食欲、食物摄入等无影响，PP非常可能通 过Y4受体起到降低食欲和食物摄入的作用(Batterham等，“Coimbra国际NPY 研讨会2004摘要S3.3”(2004 abstract S3.3 from International NPY symposium in Coimbra)，葡萄牙)。PP在饮食诱导的肥胖动物中对食物摄入也有作用。PP受体 尤其在血脑屏障无效区域的脑干中和迷走神经运动神经元上发现，，循环激素例如 PP可接近神经元。因此，脑干中NTS的Y4受体很可能是PP起到抑制食欲和食 物摄入的主要靶位。然而，近来的证据也指出PP也可能通过POMC上可能的弓形 核，也可能是NPY/AgRP神经元中的Y受体起作用(Batterham等，“Coimbra NPY 大会摘要S3.3”(Coimbra NPY meeting abstract S3.3))。在肥胖对象，特别是患普 -韦综合征的对象中发现PP的水平低(Zipe等，J.C.E.M.1981，52：1264-6；Holst 等，1983，INT.J.OBES.7：529-38；Glaser等，Horm.Metab.1988，20：288-92)， 在神经性厌食患者中发现PP水平高。重要的是，在人中输注PP降低食欲和食物 摄入达24小时(Batterham等，JCEM 2003，88：3989-92)。因此，循环(系统)中PP 回复正常水平后仍观察到PP对食物摄入的作用。也熟知特别是ICV注射AgRP对 食欲有这种持久的作用。重要的是，输注PP显示在患普-韦综合征的病态肥胖患者 中降低食物摄入(Berntson等，1993 Peptides 14：497-503)。
由于PYY通过相信主要在弓形核中的Y2受体起作用(抑制刺激性NPY/AgRP 神经元)和PP通过主要在脑干中的postreama区域和NTS中，但也存在于弓形核 中的Y4受体起作用(但明显是刺激抑制性POMC神经元)(Batterham等，“2004国 际NPY论坛，Coimbra摘要S3.3”(2004 International NPY symposium，Coimbra abstract S3.3))，Y2激动剂和Y4激动剂的组合作用可具有附加甚至协同作用，即 组合治疗可实现比两种治疗本身各自的作用更有效的作用。
当PYY外周给药时，已知其本身极端催吐，事实上在1989年在肠提取物的 层析组分中发现PYY(“第二次”)作为生物活性实体导致狗呕吐(Harding和 McDonald，1989 Peptides 10：21-24)。结论是，PYY是鉴定到的最有效的循环催 吐肽，该作用通过已知具有渗漏血脑屏障的postreama区域介导。也有报道说，当 将PYY3-36外周给予人对象时可导致恶心(Nastech press release 29th of June 2004)。从生理学的角度看，通常首先在大量进食期间或当食物因各种外科方法而 进入较低的肠中时大量分泌的PYY(及其生物学活性转化产物)能导致呕吐从而缓 解对象的吃得过饱状况是符合逻辑的。令人感兴趣的是，在该篇论文中注意到以相 似剂量给药的PP不导致这些狗呕吐(Harding和McDonald，1989)。PP通过也位 于脑干的postreama区域的Y4受体起作用，但不导致呕吐。可给予动物，例如弥 猴(cyno monkey)大剂量的组合Y2-Y4激动剂肽(例如[Gln34]PP)，达到12-13.000 nM的血浆水平而未观察到任何动物呕吐或胃肠道副作用的证据。由于[Gln34]PP 对Y2受体的效力较高，而PYY3-36对Y2受体有完全选择性，这出乎意料。因此， 组合的Y2-Y4选择性激动剂未导致呕吐的情况出乎意料地与选择性Y2激动剂 (PYY3-36化合物)一样。明显，Y4受体激活(相信在postreama区域)阻止了同一化 合物激活Y2的催吐作用。组合Y2-Y4选择性激动剂的这种特性对治疗肥胖症及相 关疾病很有益，
因此，为调节能量摄入，本发明考虑的Y2/Y4选择性激动剂适用于包括人的 哺乳动物对象。所以，本发明涉及调节能量摄入、食物摄入、食欲和能量消耗的方 法。本文公开了通过给予对象美容或治疗有效量的这种激动剂来减少能量或食物摄 入的方法。在一个实施方案中，给予该受体激动剂导致(摄入的)食物总量或总体积 减少。在另一实施方案中，(给予受体激动剂)可导致食物成分的摄入减少，例如脂 质、碳水化合物、胆固醇或蛋白质的消化降低。在本文公开的任何方法中，可以给 予本文详述的优选化合物。在其它实施方案中，本文公开了通过给予治疗有效量的 这种激动剂来降低食欲的方法。食欲可通过本领域技术人员已知的任何方法测定。 可用本领域技术人员已知的任何方法测定食欲。
例如，可通过生理评估来评价降低的食欲。在这种实施方案中，给予受体激 动剂导致对饥饿的感知、过饱的感觉和/或饱满感的改变。可通过本领域技术人员 已知的任何方法来评价饥饿。在一个实施方案中，使用生理试验评价饥饿，例如通 过使用诸如调查表来评价饥饿感和感官感知。
在另一实施方案中，本文公开了降低上胃肠(GI)道能动性，例如降低胃排空的 方法。该方法包括给予对象治疗有效量的这种激动剂，从而降低胃肠道能动性。降 低胃排空的化合物也熟知在降低食物摄入中具有有益作用，因为对象感觉到过饱或 饱胀感。已知PYY3-36(原型Y2激动剂)和PP(原型Y4激动剂)可降低胃排空。组 合Y2-Y4激动剂具有附加或甚至协同的抑制上胃肠道能动性作用。
在其它实施方案中，本文公开了改变对象的能量代谢的方法。该方法包括给 予对象治疗有效量的这种激动剂而改变能量消耗。所有生理过程均消耗能量。机体 可通过调节那些过程的效率或者改变正发生过程的数量和性质来直接改变能量消 耗率。例如，在消化期间，机体消耗能量使食物通过肠道移动并消化食物，在细胞 中，细胞代谢效率的改变会产生或多或少的热量。在其它实施方案中，本文公开了 本申请所述弓形线路(arcuate circuitry)的所有调节方法，该方法协同改变了食物摄 入并回应性改变能量消耗。能量消耗是细胞代谢、蛋白质合成、代谢速率和利用卡 路里的结果。因此，在该实施方案中，外周给药导致能量消耗增加和卡路里利用率 降低。在一个实施方案中，给予对象治疗有效量的本发明受体激动剂从而增加了能 量消耗。
在治疗应用和美容应用相关的几个实施方案中，可用Y2/Y4选择性激动剂控 制体重和治疗、减轻或预防肥胖，特别是以下一种或多种用途：预防和减轻体重增 加；诱导和促进体重降低；减轻体重指数所测定的肥胖症。如上所述，本发明还涉 及Y2/Y4选择性激动剂在控制食欲、饱胀和饥饿中的应用，特别是以下一种或多 种应用：降低、压制和抑制食欲；诱导、增加、提高或促进饱胀和饱胀感；降低、 抑制和压制饥饿和饥饿感。该内容还涉及Y2/Y4选择性激动剂的以下一种或多种 应用：维持所需体重、所需体重指数、所需外貌和良好的健康状况。
在另一方面，本发明涉及治疗和/或预防能量代谢降低、进食障碍疾患(feeding disorder)、食欲紊乱、超重、肥胖、食欲过胜、神经性贪食、X综合征(代谢综合 征)或与它们相关的并发症或风险，包括糖尿病、2型糖尿病或非胰岛素依赖型 糖尿病(NIDDM)、高血糖、胰岛素耐受、葡萄糖耐受不良、心血管疾病、高 血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、中风、心肌梗塞、血栓栓塞性疾病、 高胆固醇血症、高脂血症、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、生殖性疾病 如多囊性卵巢综合征，乳腺癌、前列腺癌或结肠癌，该方法包括给予对象，例 如包括人的哺乳动物有效剂量的一种或多种本文所述Y2/Y4选择性激动剂。
2.肠分泌过多(intestinal hypersecretion)
NPY和PYY已知对小肠和大肠具有抗分泌作用。对分离的人结肠组织的研究 证实该作用通过Y1和Y2受体介导，通过使用TTX显示Y2成分(component)的主 要部分受神经元成分介导(Cox & Tough 2001 Br.J.Pharmacol.135：1505-12)。PP 也具有抗分泌作用，这显示通过位于上皮细胞的Y4受体而非通过神经元机理 介导(Cox和Tough，2001)。因此，由于作用相似但通过不同机理介导，组合 Y2-Y4激动剂对胃肠道可具有附加或甚至协同的抗分泌作用。外周给予PYY 在体内显示可导致经回肠造口术的人对象中血管活性肠多肽诱导的肠液分泌持 久减少(Playford等，1990 Lancet 335：1555-57)。结论是，PYY可以是抵御腹泻 的治疗性药物，然而，例如该肽的组合Y1和Y2激动性作用的利尿钠和高血压 作用阻止了该作用。本发明的组合选择性Y2-Y4激动剂特别可用于治疗或保护 以抵御胃肠道过度分泌，包括各种形式的腹泻，而无论它们是否直接由过度分 泌导致。一种特别感兴趣的适应症是在经常丧失大量液体的经回肠造口术的患者 中观察到的过度分泌。
3.治疗性血管生成
对血管平滑肌细胞的生长、心室心肌细胞肥厚以及内皮细胞增殖和迁移的许 多体外研究表明NPY可能起血管生成因子的作用(Zukowska-Grojec等，1998 Circ.Res.83：187-95)。重要的是，利用小鼠角膜微袋(micropocket)模型和雏鸡绒毛 尿囊膜(CAM)试验的体内研究证实NPY是一种强效血管生成因子，导致只用成纤 维细胞生长因子-2(FGF-2)时观察到的显示血管舒张(作用)的血管树样结构而不是 例如血管内皮生长因子(VEGF)所致的血管生成结构(Ekstrand等，2003 PNAS 100： 6033-38)。在发育期间，雏鸡胚胎NPY诱导已存在的血管产生血管萌芽。在Y2 受体敲除动物中未观察到NPY的这种作用，表明Y2受体负责NPY的血管生成作 用(Ekstrand等，2003)。观察到Y2受体在局部缺血血管中高度上调和产生内源性、 选择性Y2配体PYY3-36的酶，二肽基肽酶-IV也高度上调也支持该观点。本发明 的肽均是Y2激动剂，其至少也具有成为Y4激动剂的附加特性和就不佳的Y1激 动剂而言的选择性。因此，这些肽的Y2激动剂特性使得它们可用作治疗性血管生 成药物，Y4激动作用有益于降低或消除已知与Y2激动剂高血浆水平相关的有害 的催吐或恶心的作用。
在各种心血管疾病如动脉粥样硬化中，考虑在外周血管以及冠状血管中诱导 血管生成将是有益的。据信诱导血管生成也有利于确保心肌梗塞后的再灌注。特别 是提出FGF-2是诱导心血管疾病患者的血管生成的有效药物。然而，与大多数其 它血管生成因子一样，FGF-2是一种生长因子，也可能通过提供血管生成而刺激肿 瘤生长。如上所述，通过Y2受体起作用的NPY以与FGF-2相似的诱导形式诱导 了新血管生成，虽然NPY是神经肽，不是典型的生长因子，因而不涉及诱导肿瘤 生长。因此，Y2激动剂是治疗性血管生成的一种有用药物。然而，对该用途特别 重要的是，该激动剂不显示Y1激动作用，因为会带来有害的心血管作用。这意味 着本发明关注的肽，无论是Y2选择性激动剂或是特别有用的治疗药物均与诱导血 管生成有关。如上所述，这些肽经修饰而与GAG-结合基序相连时特别有用。为进 一步描述：与大多数其它典型的生长因子一样，FGF-2的作用部分通过它们与胞外 基质中的糖胺聚糖(GAG)结合而介导或受其控制。与GAG的这种结合确保了血管 生成因子以合适的空间和瞬时方式起作用而不会从组织中被快速洗掉。对于本发明 所述的小肽和肽模拟物在治疗性血管生成中的应用，这点尤其重要。因此，在本发 明的优选实施方案中，为在给药后诱导最佳的血管生成，给这些肽掺一个或多个 GAG-结合基序以确保它们与胞外基质中的GAG结合。为在冠状血管疾病和/或急 性心肌梗塞后诱导心脏血管生成，可静脉内或动脉内给药或直接施用入冠状动脉。 类似地，这种化合物可通过股动脉内注射给药来治疗周围血管疾病。也可以对皮肤 损伤处局部给药以促进伤口愈合。也可用血清白蛋白结合基序修饰的本发明肽来获 得能有效诱导血管生成的延长时间Y受体接触。
因此，在本发明优选的实施方案中，Y2/Y4选择性激动剂含有的GAG-结合基 序位于不会损伤肽的稳定性或所述该肽效力和选择性的位置。因此，在一个实施方 案中，本发明涉及Y2选择性受体激动剂在改进血管生成系统紊乱，特别是诱导血 管生成，例如疾病相关的血管生成中的应用，所述疾病或病症例如有心血管疾病， 包括具有cladicatio intermitten症状的周围血管疾病、冠状动脉疾病和心肌梗塞； 组织修复过程，包括皮肤伤口愈合；炎性疾病，包括胃肠道炎性疾病，例如溃疡、 结肠炎、炎性肠病、克罗恩病等。
一个具体的实施方案是利用该受体激动剂诱导心脏或血管，或组织，例如包 括胃肠道粘膜等粘膜组织和皮肤的血管生成。
3.伤口愈合
在通过删除Y2受体基因来选择性去除Y2受体的动物中，据报道伤口愈合与 相关的新血管生成受影响(Ekstrand等，2003 PNAS 100：6033-38)。因此，本发明 的选择性Y2-Y4激动剂可通过它们的Y2激动剂性能改善伤口愈合。对于该适应症， 这些肽可以各种方式包括胃肠外给药给予。然而优选的给药途径是局部应用，例如 以溶液、分散液、粉末、药棒(stick)、霜剂、软膏、洗液、凝胶、水凝胶、包括贴 片和膏剂等透皮递送系统。对于局部给药，它们可如此使用。然而，在本发明一 优选的实施方案中，用一个或多个本文所述GAG-结合基序修饰这些肽以通过 该肽与组织中的GAG结合而确保该肽的持久局部作用。
4.炎性肠病
PYY先前已描述为可用于预防和/或治疗炎性肠病；参见纳入本文作为参考的 Amylin Pharmaceuticals，Inc的WO 03/105763。因此，本发明关注的激动剂在 治疗或预防炎性肠病中也有效。所以，本发明也涉及本文所述激动剂在这种医 学应用中的用途。在一令人感兴趣的实施方案中，这些肽含有一个或多个上述 GAG-结合基序。
给予Y2/Y4激动剂治疗或防止肥胖和相关疾病的其它评价
在进食过程中，各种胃肠道激素和神经递质系统以仔细协调、依次和重叠的 方式激活。此外，食物成分在吸收后不仅直接影响胃肠道激素的分泌和各种传入神 经元途径的激活，也影响各种激素和CNS中心。因此，调节食物摄入和能量消耗 是一高度复杂和多层面的过程。鉴于此，当某些激素，例如Y2激动剂仅以导致例 如进食期间达到的血浆水平的3-4倍的方式给药时，事实上可基本影响该系统是出 乎意料的。
部分问题在于如果这种化合物(组合Y2-Y4激动剂)在禁食期间以上述有效剂 量给予，则其给药具有最佳作用。如果Y2-Y4激动剂在各种激素和神经元系统因 在胃肠道中存在食物成分或期望进食而激活的情况下给予，该作用未观察到或较 低。因此，在本发明优选的实施方案中，组合Y2-Y4激动剂在禁食状态下以有效 剂量通过皮下、鼻部或通过本文其它地方所述的其它方式给予。本文的术语“禁食 的状态”指对象在给予Y2-Y4受体激动剂前至少最近2小时内未吃任何食物或饮 水，例如给药前至少最近3小时内、至少最近4小时内、至少最近5小时内、至少 最近6小时内、至少最近7小时内、至少最近8小时内、至少最近9小时内、至少 最近10小时内、至少最近11小时内或至少最近12小时内。
在种群的一个亚组中，组合Y2-Y4激动剂因遗传变异，例如Y4基因中的多 态性而可能不具有所期望的作用。这些受体中丧失功能的突变可能与肥胖相关。因 此，在本发明一优选实施方案中，为检测这些基因中的多态性/突变和鉴定这种多 态性，对待治疗对象的Y4基因进行分析。根据这种分析可得到这些对象的最佳治 疗方案。例如，只有具有不影响Y4激动剂，包括Y2-Y4组合激动剂的功能的正常 基因型或多态性的对象应该用这种激动剂治疗。为确保药物的最佳效果，另一种可 能性是提高表达受损伤受体对象的组合Y2-Y4激动剂用量。在Y2受体功能受损导 致对象肥胖的情况中，例如在杂合子患者(前提是至少保留了一些相关受体功能)中 用替代疗法形式的Y2激动剂(例如大剂量)治疗可能有争议。当不可能或经济上不 适合进行这种遗传分析时，利用选择性组合Y2-Y4激动剂尤其有用，因为它(因其 对两种不同靶位的双重作用)即使在一种靶位因遗传多态性而无功能或功能降低的 情况下也有效。在开始慢性治疗之前可进行急性测试以确保这些化合物在对象 中具有所需作用，从而确保只有对治疗敏感的对象得到治疗。
本发明的选择性Y2-Y4激动剂可与各种靶向食欲和能量消耗的其它药物联用 来治疗肥胖、糖尿病和相关疾病，包括但不限于胃肠道酯酶抑制剂、神经递质再摄 取抑制剂、大麻素受体拮抗剂和反向激动剂以及其它类型的神经递质(包括但不限 于5HT受体)和/或神经激素(包括但不限于GLP-1、MC4、MC3受体激动剂或拮抗 剂)。由于选择性Y2-Y4激动剂靶向联系胃肠道和CNS的稳态调节机理(即，饱胀 感介导肠道分泌的激素PYY和胰腺分泌的PP通常靶向Y2和Y4受体)，特别优选 联用Y2-Y4选择性激动剂和靶向食欲和能量消耗调节中枢快感机理(例如作为应答 系统(reward system)一部分的CB1受体)的药物治疗。因此，在治疗肥胖症和相关 疾病中联用选择性Y2-Y4激动剂与CB1拮抗剂是本发明的一种优选实施方案。
剂量
本发明Y2/Y4受体激动剂的治疗有效量取决于所用的具体激动剂、所治疗对 象的年龄、体重和状况、所治疗病症或疾病的严重性和类型、给药方式和所用组合 物的强度。例如，Y2/Y4受体激动剂的治疗有效量可在约0.01μg/公斤体重-约1g/ 公斤体重范围内变动，例如约1μg-约5mg/公斤体重，或约5μg-约1mg/公斤体 重。在另一实施方案中，给予对象0.5-135皮摩尔(pmol)/kg体重，或约72pmol/kg 体重的受体激动剂。在一具体的非限制性例子中，皮下注射给予约5-约50nmol， 例如约2-约20nmol，或者皮下注射给予约1.0nmol。本领域技术人员根据所用具 体特定化合物的效力、对象的年龄、体重、性别和生理情况不难确定精确的剂量。 激动剂的剂量可以是治疗有效剂量的PYY3-36的摩尔当量。这些用量可分为一次 或数次剂量，以每日、每两日、每周、每两周、每月或以任何其它适当的频率给药。 给药一般是每日一次或每日两次。
给药方法
这些激动剂以及美容或药物组合物可经任何途径给予，包括肠内(例如，口服 给药)或胃肠外途径。在一具体实施方案中，优选胃肠外途径，包括：静脉内、关 节内、腹膜内、皮下、肌肉内、胸骨内注射和输液，以及通过舌下、透皮、局部、 经粘膜(包括鼻部途径)给药，或者通过吸入，例如肺部吸入给药。在具体实施方案 中，优选皮下和/或鼻部给药途径。
这些受体激动剂可以分散在合适的运载体中给药，或者它们可以合适的药物 或化妆品组合物形式给药。这种组合物也属于本发明的范围内。下文描述了合适的 药物组合物。本领域技术人员熟知这种组合物也适用于美容用途，或者知道通过利 用合适的美容上可接受的赋形剂将这些组合物调整为化妆品组合物。
药物组合物
用于药品或化妆品中的本发明受体激动剂(也称为“化合物”)通常以药物组合 物形式存在，所述药物组合物含有特定的化合物或其衍生物和一种或多种生理学或 药学上可接受的赋形剂。
这些化合物可通过任何常规给药途径，例如口服、含服、鼻部、眼部、肺部、 局部经皮、阴道、直肠、眼部、胃肠外(包括上述皮下、肌肉内和静脉内等)途径以 各个体有效的剂量给予动物，包括哺乳动物，例如人。本领域技术人员知道如何选 择合适的给药途径。如上所述，优选胃肠外给药途径。在一具体实施方案中，这些 受体激动剂皮下给药和/或鼻部给药。本领域熟知皮下注射易于自行实施。
医生不难为每位患者单独确定适合具体给药途径的组合物。标准制剂的专题 论文描述了各种药学上可接受的运载体及它们的制剂，例如E.W.Martin的《雷明 顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)。
含有本发明化合物的药物组合物可以是固体、半固体或液体组合物形式。就 胃肠外应用而言，这些组合物通常是液体组合物形式或是用于植入的半固体或固体 形式。
可通过静脉内、肌肉内、鞘内、硬膜外、腹膜内或皮下注射或输液给予作为 无菌溶液或分散体的液体组合物。可将这些化合物制备成无菌固体组合物，在给药 前或给药时用无菌水、盐水或其它合适的无菌可注射介质溶解或分散。
组合物的液体形式可以是溶液、乳液(包括纳米乳液)、悬液、分散液、脂质体 组合物、混合物、喷剂或气溶胶(后两种类型特别适用于鼻部给药)。
溶液或分散液的合适的介质通常是水或药学上可接受的溶剂，例如油(如芝麻 油或花生油)或有机溶剂，例如丙醇或异丙醇。本发明的组合物可含有其它药学上 可接受的赋形剂，例如pH调节剂、渗透压活性物质(例如为了将组合物的等渗性 调节到生理上可接受的水平)、粘度调节剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、 抗氧化剂等。优选的介质是水。
鼻部给药的组合物也可含有本领域技术人员熟知的合适的无刺激性运载体， 例如聚乙二醇、乙氧基化四氢糠醇(glycofurol)等以及吸收增强剂(例如参见《雷明 顿药物科学》)。
就胃肠外给药而言，在一个实施方案中，一般通过将所需纯度、单位剂量可 注射形式(溶液、悬液或乳液)的受体激动剂与药学上可接受的赋形剂或运载体，即 在所用剂量和浓度时对受者无毒并且与组合物的其它成分相容的物质相混合来配 制。
总体上，通过使受体激动剂与液体运载体或精细分级的固体运载体或二者均 匀紧密地接触来制备制剂。然后视需要将产品做成所需制剂的外形。运载体优选胃 肠外运载体，更优选与受者血液等渗的溶液。这种运载体的例子包括水、盐水、林 格溶液和葡萄糖溶液。非水性运载体，例如不易挥发的油和油酸乙酯以及脂质体也 可用于本发明。由于本文所述肽的两亲性质，合适的剂型也包括胶束制剂、脂质体 和包含一种或多种合适脂质如磷脂的其它类型制剂。
优选将这些受体激动剂悬浮在水性运载体中，例如pH约3.0-约8.0、优选pH 约3.5-约7.4、3.5-6.0或3.5-约5的等渗缓冲溶液。有用的缓冲物质包括乙酸盐、 柠檬酸盐、磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐，例如柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
这些组合物也可设计为在给药后受控递送或持续递送所述受体激动剂以获得 频率更低的给药方案。通常认为每日1-2次的剂量方案可接受，但是本发明也包括 其它给药方案，例如频率更高或更低。为实现持续递送该受体激动剂，可采用含有 例如脂质或油的合适运载体从而在给药部位形成长效形式而将受体激动剂缓慢释 放入循环系统，或者可采用植入物。该方面合适的组合物包括掺有受体激动剂的脂 质体和生物可降解颗粒。
在需要固体组合物的情况中，该固体组合物可以是片剂形式，例如常规药片、 泡腾片、包衣片、融解片或舌下片、药丸、粉末、粒剂、颗粒、颗粒材料、固体分 散体或固体溶液。
该组合物的半固体形式可以是咀嚼胶、软膏、乳膏、涂抹剂、糊剂、凝胶或 水凝胶。
本发明的药物组合物的其它合适剂型可以是阴道栓(vagitories)、栓剂、膏剂、 贴片、片剂、胶囊、小囊、锭剂、装置等。
剂型可设计为以化合物自由或受控方式释放，例如带有合适包衣的片剂。
该药物组合物可含有治疗有效量的本发明化合物。
本发明组合物中本发明化合物的含量是，例如占该药物组合物的约 0.1-100％w/w。
药物制剂配制的技术人员可用熟知的方法制备这些药物组合物。
在这些药物组合物中，所述化合物通常与药学赋形剂，即治疗上惰性物质或 运载体相混合。
所述运载体根据所需剂型和给药途径可采取各种形式。
药学上可接受的赋形剂可以是，例如填充剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、润 滑剂、溶剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、增强剂、调味剂、色素、pH调节剂、滞 留剂、润湿剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。详见药物手册，例如《雷明 顿药物科学》或《药物赋形剂手册》(Pharmaceutical Excipient Handbook)。
合成
可通过固相肽合成采用自动肽合成仪或传统的分步合成(bench synthesis)来合 成本发明的肽激动剂。固体支持物可以是，例如氯三苯甲基(Cl)或Wang(OH)树脂， 二者均不难购得。这些树脂的活性基团易于和N-Fmoc氨基酸的羧基反应，从而使 其与聚合物共价结合。可通过与哌啶接触使结合在树脂上的胺去保护。然后将第二 种N-保护的氨基酸偶联于树脂-氨基酸。重复这些步骤直至获得所需序列。合成结 束时，结合在树脂上的受保护肽可去保护并用三氟乙酸(TFA)从树脂上切下。有助 于将新的氨基酸偶联于结合在树脂上的氨基酸链的试剂例子有：六氟磷酸四甲基 脲鎓(HATU)、六氟磷酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(HBTU)， 四氟硼酸O-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓(TBTU)、1H-羟基苯并 三唑(HOBt)。
除固相化学方法外，通过溶液化学方法肽合成也是可行的。
例如，修饰肽链中氨基酸的侧链氨基或羧基以引入上述GAG-结合基序或其它 基序是不涉及此反应的其它反应活性侧链基团的选择性保护和去保护的简单方法。
实施例
为说明用于合成本发明激动剂的方法，描述了序列[Gln34]PP的制备过程：
合成概述：

化学物质
利用了以下材料和试剂：
起始物质
Fmoc-Rink-TentaGel-树脂
Fmoc-Ala-OH.H2O
Fmoc-Arg(Pbf)-OH
Fmoc-Asn(Trt)-OH
Fmoc-Asp(OtBu)-OH
Fmoc-Gln(Trt)-OH
Fmoc-Glu(OtBu)-OH
Fmoc-Gly-OH
Fmoc-Ile-OH
Fmoc-Leu-OH
Fmoc-Met-OH
Fmoc-Pro-OH
Fmoc-Thr(tBu)-OH
Fmoc-Tyr(tBu)-OH
Fmoc-Val-OH
用于合成与纯化的溶剂和试剂
乙酸                                  溶剂
乙酸酐                                试剂
乙酸铵                                试剂
碘化铵                                试剂
二异丙基碳二亚胺(DIC)                 试剂
二甲基甲酰胺(DMF)                     溶剂
二硫苏糖醇(DTT)                       试剂
乙醇                                  溶剂
1-羟基苯并三唑(HOBt)                  试剂
异丙醇                                溶剂
N-甲基吗啉(NMM)                       试剂
哌啶                                  试剂
三氟乙酸(TFA)                         溶剂
所需产物在Rink-TentaGel-树脂上通过Fmoc-SPPS装配。具有侧链保护的氨 基酸是：Arg(Pbf)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。
利用用于活化的DIC和HOBt和各种氨基酸等价物在DMF中进行偶联(反应)。 每步偶联后用乙酸酐和NMM进行加帽。用Kaiser/茚三酮或氯醌测试来监测每步 偶联。每个偶联周期之间，用DMF配制的哌啶除去Fmoc基团。
用TFA从支持物上切下受保护的肽-树脂，在乙酸铵水溶液中中和，得到粗产 物。处理后，过滤除去树脂。
通过制备型HPLC利用基于二氧化硅或聚苯乙烯的反向材料纯化粗产物。然 后通过反向层析对肽脱盐。在通过冻干分离之前，蒸发浓缩肽溶液并过滤。
通过碰撞诱导解离质谱/质谱(CID MS/MS)、氨基酸分析、LC-MS和手性 纯度确定结构。通过HPLC评价纯度，手性纯度。
肽的化学分析
为了描述所用的方法和达到的结果，下文列出了通过上述方法合成的本发明 一些肽的分析数据：
数据
  肽 分子式 分子量 理论值 m/z    测量值 M/z    Rt   分钟 纯度 HPLC 方法 [Gln34]PP C185H288 N54O55S2  4212.8 4212 20.8 94.8 C Ile31，Gln34]PP C185H288 N54O55S2  4212.8 4211.6 20.5 97.1 C [Val31，Gln34]PP C184H286 N54O55S2  4198.8 4197.2 25.0 96.3 C Leu30，Gln34]PP C186N289 N53O56S   4195.8 840.2  [M+5H] 840.0  [M+5H] 19.7 96.5 B His26，Gln34]PP C185H282 N52O56S2  4194.8 839.9  [M+5H] 839.9  [M+5H] 19.1 95.0 B [Ala1，Glu4，Arg2 6，Met30]PYY    C186H288 N54O59S   4256.8 710.4  [M+6H] 710.4  [M+6H] 19.4 96.4 B [Arg26，Met30]P YY              C193H298 N56O57S1  4346.9 870.7  [M+5H] 870.7  [M+5H] 20.2 91.3 B
  Glu4，Arg26]PYY C193H295 N55O59    4329.8 867.5  [M+5H] 867.5  [M+5H] 17.4 95.3 B
分析性HPLC方法A
柱＝Vydac C18肽-蛋白质柱，250×4.6mm
缓冲液A＝水配制的0.05％ TFA
缓冲液B＝100％ MeCN配制的0.05％ TFA
梯度＝20分钟内从0％ B到60％ B
流速＝1.00mL/分钟
波长＝215nm
质谱＝用龙胆酸或口氰基羟基肉桂酸作为基质的MALDI-TOF
分析性HPLC方法B
柱＝Hypersil ODS-2，250×4.6mm
缓冲液A＝100％ MeCN配制的0.1％ TFA
缓冲液B＝100％水配制的0.1％ TFA
梯度＝25分钟内从24％ A到35％ A
流速＝1.00mL/分钟
波长＝220nm
质谱＝ESI[雾化器气体流速：1.5L/分钟；CDL-20.0v；CDL温度：250 ℃；阻断温度(block temp)：200℃；探针偏置(probe bias)：+4.5kv；检测器：1.5 kv；T.流速：0.2mL/分钟；B.浓度：50％ H2O/50％ CAN.]
分析性HPLC方法C
柱＝Vydac C18 218TP54，250×4.6mm
缓冲液A＝20mL MeCN和2mL水配制的TFA(总体积2000mL)
缓冲液B＝2mL水配制的TFA(总体积2000mL)
梯度＝27分钟从25％ B到75％ B
流速＝1.00mL/分钟
波长＝215nm
注射体积＝10μL
为进一步描述可用于制备本发明考虑的Y2/Y4选择性激动剂的合成方法，仅 出于举例目的给出以下方案：
合成[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：30)及其类似物
下文描述了环形Y2选择性肽[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No： 30)和在其Lys13的ε氨基连接有GAG-激活基序、血清蛋白激活基序或聚乙二 醇部分的类似物的合成方法。
总体上，侧基保护是标准方法，除了：
Arg＝Fmoc Arg(Pbf)-OH
Asn，Gln＝Fmoc Asn(Trt)-OH
Thr，Ser，Asp，Glu，Tyr＝叔丁基
Lys＝Fmoc Lys(tBoc)-OH
Ala-Ser 22-23＝Fmoc AlaSer拟脯氨酸(pseudoproline)
在[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP的情况中，为获得选择性去保护，采用以 下特定的保护基团：
Lys 13＝Fmoc Lys(Dde)-OH
Cys 27＝Fmoc DLys(Trt)-OH
肽采用Fmoc化学方法用超过5倍摩尔的试剂在PAL Peg-PS树脂(切割后可 产生生物学上重要的羧酰胺基团的树脂)上进行固相合成。整个偶联过程通过 HCTU，用DMF作为溶剂进行。每步偶联后，用DMF配制的20％哌啶处理10-15 分钟以除去Fmoc。每步后通过定量茚三酮试验检查偶联情况。在特定的情况中可 以进行双重偶联。
合成全长肽后，用DMF配制的2％肼处理15-20分钟以除去Lys13的ε氨基 上的保护基团，而肽仍连接在树脂上。
然后将树脂分为不同的批次以产生未衍生的肽以及3种不同的基序修饰肽：
1.通过用95％三氟乙酸:2.5％水:2.5％三丙基硅烷处理2-3小时将母体化合 物[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：30)从树脂上切下并去保护。
通过将肽溶解在pH8.5-9的乙酸铵溶液中，使之<1mg/ml并搅拌24-48小时直 至通过Ellman试验检测不到游离的巯基，从而经空气氧化在Cys2和D-Cys27之 间形成分子内稳定性二硫键。
通过反向HPLC纯化肽：Vydac 300柱，250mm×10mm的柱用30-80％ 的缓冲液B梯度(缓冲液A＝水配制的0.05％ TFA；缓冲液B＝60％MeCN:40％ 水:0.05％TFA)洗脱20分钟，流速为2ml/分钟。测定OD 215nM，收集含有特 定肽的洗脱液并冻干。
通过质谱、氨基酸分析，如果需要也通过氨基酸序列分析来确认肽结构。
2.[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27， Gln34]PP(SEQ ID No：31)-为连接血清白蛋白结合基序，除去保护性Dde基团 后而肽仍连接在树脂上时，用受保护的氨基辛酸(处理)两次然后用受保护的γ谷 氨酸(处理)，从而通过肽合成将8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基基团连 接到Lys13的游离ε氨基上。
如上文对“母体肽”的描述从树脂上切下基序修饰的肽、去保护、环化并 纯化。
3.荧光素-[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13， D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：32)-为连接GAG-结合基序，在除去Dde基团 后，使用大体如上所述的Fmoc化学方法，在仍连在树脂上的 [Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合成逐步构 建该基序：以此方式连接的GAG结合序列是Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala- Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala。为体外和 体内分析的目的，给最终的GAG-结合序列的N-末端加入荧光素标记基团的5，6 异构体(NHS酯，超过10倍，72小时)。
如上文对“母体肽”的描述从树脂上切下GAG结合基序修饰的肽、去保 护、环化并纯化。
4.[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酰基)}-γ 谷氨酰基-Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：40)
—为连接聚乙二醇部分和Y2-Y4选择性肽，在除去Dde基团后，在仍连在 树脂上的[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP肽上利用Lys13的游离ε氨基通过肽合 成，然后通过受保护的γ-谷氨酸连接上受保护的21-氨基-4，7，10，13，16，19- 六氧杂二十一烷酸。
如上文对“母体肽”的描述从树脂上切下PEG化的肽、去保护、环化并纯 化。
使用以上方法合成了作为例子的本发明以下激动剂：
[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：34)
[N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys18，Gln34]PP(SEQ ID No：35)
[N-PEG5000-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：36)
[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)
[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)
[Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No：7)
[Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No：8)
[Leu28，Gln34]PP(SEQ ID No：9)
[His26，Gln34]PP(SEQ ID No：10)
[Ile3，Gln34]PP(SEQ ID No：11)
[Ala1，Glu4，Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：12)
[Ala1，Glu4，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：37)
[Ala1，Glu4，N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys13，Arg26，Nle30]PY Y(SEQ ID No：38)
[Ala1，Glu4，N-PEG5000-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：39)
[Ala1，Glu4，Arg26(Met30或Nle30)]NPY(SEQ ID No：13)
[Ala1，Glu4]PYY(SEQ ID No：14)和[Ala1，Glu4]NPY(SEQ ID No：15)
[Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：16)和[Arg26，(Met30或 Nle30)]NPY(SEQ ID No：17)
[Glu4，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：18)和[Glu4，(Met30和 Nle30)]NPY(SEQ ID No：19)
[Glu4，Arg26]PYY(SEQ ID No：20)和[Glu4，Arg26]NPY(SEQ ID No：21)
[Cys2，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：22)
[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：23)
生物试验和结果
I.测定肽亲和力和效力的体外试验
人Y2受体亲和力试验
在竞争性结合试验中利用结合于COS-7细胞中的125I-PYY来测定测试化合 物对人Y2受体的亲和力，所述COS-7细胞采用标准磷酸钙转染方法用人Y2受体 瞬时转染。
转染1天后，转染的COS-7细胞以40×103细胞/孔的密度转移至培养板， 目标为结合5-8％的放射性配体。转染两天后，用25pM的125I-PYY(Amersham， Little Chalfont，UK)在4℃进行竞争性结合试验3小时。结合试验在0.5mL补充 了以下成分的50mM Hepes缓冲液，pH 7.4中进行：1mM CaCl2、5mM MgCl2 和0.1％(w/v)牛血清白蛋白和100μg/ml杆菌肽。由于是在含有1μM未标记的 PYY时(进行)结合，测定了非特异性结合。细胞用0.5ml冰冷却的缓冲液洗涤 两次，加入0.5-1ml裂解缓冲液(8M脲，3M乙酸配制的2％ NP40)，用γ计数 器计算结合的放射活性。测定按一式两份进行。用放射性配体在这些条件下达 到稳态结合。利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)计算EC50值。
人Y4受体亲和力试验
除了利用人Y4-转化的COS-7细胞，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试 验采用125I-PP，而PP用于非特异性结合的测定。
人Y1受体亲和力试验
除了采用人Y1-转化的COS-7细胞和以1.5×106细胞/孔的密度转移至培养 板外，其方案同Y2亲和力试验一样，竞争性试验采用125I-NPY，而NPY用于非 特异性结合的测定。
在以上亲和力试验中测试NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明的[Gln45]PP、 [Ile31，Gln34]PP、[Val31，Gln34]PP、[Arg26，Met30]PYY和[Glu4，Arg26]PYY激 动剂的结果见表1：

人Y2受体效力试验
在COS-7细胞中进行剂量-反应实验以测定测试化合物对人Y2受体的效力， COS-7细胞用人Y2受体以及能确保Y2受体经导致磷酸肌醇酯转化增加Gq途径 偶联的混杂G蛋白Gqi5瞬时转染。
磷脂酰肌醇转化—转染一天后，将COS-7细胞与5μCi的[3H]-肌醇 (Amersham，PT6-271)在补加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和0.01mg/ml 庆大霉素/孔的1ml培养基中培育24小时。细胞用补加了140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgSO4、1mM CaCl2、10mM葡萄糖、0.05％(w/v)牛血清的20mM HEPES，pH7.4的缓冲液洗涤两次；用补加了10mM LiCl的0.5ml缓冲液37℃ 培育30分钟。在37℃用各种浓度的肽刺激45分钟后，用10％冰冷却的高氯酸 提取细胞，然后在冰上培育30分钟。用HEPES缓冲液配制的KOH中和得到 的上清液，在Bio-Rad AG 1-X8阴离子交换树脂上纯化产生的[3H]-磷酸肌醇酯 并用β计数器计数。测定按一式两份进行。利用标准的药理学数据处理软件，Prism 3.0(graphPad Sofware，San Diego，USA)计算EC50值。
人Y4受体效力试验
除了采用人Y4-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
人Y1受体效力试验
除了采用人Y1-转化的COS-7细胞以外，其方案同Y2效力试验一样。
在以上效力试验中测试NPY、PYY、PYY3-36、PP和本发明的[Gln45]PP、 [Ile31，Gln34]PP、[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)、[Ala1，Glu4，Arg26，Met30] PYY、[Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No：7)和[His26，Gln34]PP(SEQ ID No：10)激动 剂的结果见表2：
表2

II.测定蛋白质稳定性的体外试验
本发明许多肽的重要量度是蛋白质稳定性，特别是例如对酶降解的稳定性， 因为与例如PYY3-36相比，设计的这些肽具有增加的稳定性，或者甚至与全长PYY 和PP相比，其稳定性增加。
PP-折叠的稳定性—测定了所述肽对在能切割例如环形区的内切肽酶降解的 稳定性，该区域如所述具有相对可弯曲性(O’Hare，M.和Schwartz，T.W.1990， 在《生物活性物质的降解：生理学和病理生理学》(Degradation of Bioactive Substances：Physiology and Pathophysiology)中所述，J.Henriksen编，CRC Press， Boca Raton，Fl.)。利用内切蛋白酶Asp-N(Pierce)作为模型酶。该酶在Asp残基 的N-末端侧，例如PP中残基9和10(Asp)之间切割。根据生产商的说明，将这 些肽于室温在0.01M Tris/HCl，pH 7.5的缓冲液中与有效剂量的内切肽酶 Asp-N一起培育24小时以上不同时间段后取样。HPLC分析样品并跟踪这些肽 随时间推移的逐步降解情况。比较这些肽与PYY、PYY13-36和PP的稳定性。
对氨肽酶的稳定性—方法如上述内切肽酶测定的，但采用氨肽酶N和二肽基 肽酶IV。特别设计了能耐受这些氨肽酶的一些肽，例如PYY2-36、N-末端乙酰化 的肽衍生物和在N-末端含有白蛋白结合部分的烷基化肽衍生物。比较这些肽与 PYY、PYY3-36和PP的稳定性。
III.测定糖胺聚糖(GAG)结合的体外试验
在体外试验中利用固定的肝素，即肝素琼脂糖作为亲和基质，使用HiTrap 肝素-琼脂糖柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)或肝素HPLC 柱监测测试化合物结合GAG的能力，用含2mM DTT和1mM MgEDTA的50 mM磷酸钠(pH 7.3)配制的线性梯度0-0.5M NaCl洗脱50分钟，流速1ml/分钟。 用缓冲液A配制的1M NaCl洗涤此柱51-55分钟以再生。
IV.测定这些肽对食欲、食物摄入和体重作用的体内研究
Y2/Y4选择性激动剂对小鼠急性食物摄入的作用超过Y1选择性激动剂
采用ddy品系小鼠，34-37g和8-9周龄(Japan SLC，Shizuuoka，Japan)。 小鼠分别养在12-小时白天-黑夜周期，7AM开始日照的受控环境中(22℃，55％ 湿度)。实验开始前(见下文)可随意吃食和饮水。在实验开始前的一星期中使小 鼠适应皮下注射。每只小鼠在实验中使用一次。给药之前用生理盐水稀释肽作 皮下注射，100μL体积。结果表示为平均值+/-SE。方差分析后用Bonferroni 试验评估各组间差异。
在实际测试前16小时，小鼠不许进食但可随意饮水，实验在第二天上午 10时开始。采用标准饮食(CLEA Japan，Inc.，Tokyo，Japan)，给药后通过从 最初预先测量过的食物减去未吃的食物来测定食物摄入并检查食物的散落情 况。各组8只小鼠接受盐水、3μg PYY3-36、30μg PYY3-36、10μg测试化合 物或100μg测试化合物。
[Gln34]PP(在图中称为TM30333)作为测试化合物的结果见图2。
本申请是国际申请号为PCT/EP2005/002982、国际申请日为2005年3月17 日、进入中国国家阶段的申请号为CN200580008666.0、发明名称为“用于治疗 性干预的Y2/Y4选择性受体激动剂”的中国专利申请的分案申请。
序列
NPY(SEQ ID No：1)
H2N-Tyr--Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg- Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PYY(SEQ ID No：2)
H2NTyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr -Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
PP(SEQ ID No：3)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
[Gln34]PP(SEQ ID No：4)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ile31，Gln34]PP(SEQ ID No：5)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Val31，Gln34]PP(SEQ ID No：6)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Leu30，Gln34]PP(SEQ ID No：7)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Leu-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Nle30，Gln34]PP(SEQ ID No：8)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Nle-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Leu28，Gln34]PP(SEQ ID No：9)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[His26，Gln34]PP(SEQ ID No：10)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ile3，Gln34]PP(SEQ ID No：11)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Ty r-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，Arg26，(Met30 or Nle30)]PYY(SEQ ID No：12)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr -Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met或Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，Arg26，(Met30 or Nle30)]NPY(SEQ ID No：13)
H2N-Ala-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-T yr-Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Met或Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4]PYY(SEQ ID No：14)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4]NPY(SEQ ID No：15)
H2N-Ala-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg- Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Arg26，(Met30 or Nle30)]PYY(SEQ ID No：16)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Lys-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr -Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met或Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Arg26，(Met30或Nle30)]NPY(SEQ ID No：17)
H2N-Tyr--Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-T yr-Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-(Met或Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：18)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr -Ala-Ser-Leu-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-(Met或Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4，(Met30或Nle30)]NPY(SEQ ID No：19)
H2N-Tyr-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg-Tyr-T yr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-(Met或Nle)-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4，Arg26]PYY(SEQ ID No：20)
H2N-Tyr-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Ty r-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Leu-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Glu4，Arg26]NPY(SEQ ID No：21)
H2N-Tyr-Pro-Ser-Glu-Pro-Asp-Asn-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Arg- Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Cys2，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：22)

[Cys2，Aoc5-24，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：23)

[Lys18，Gln34]PP(SEQ ID No：24)
H2N-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met-Lys-Gln-T yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，Lys11，Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：25)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Lys-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Asn-Arg-Tyr-Tyr -Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met或Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Al a-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-[Gln34]PP(SEQ ID No：26)
H2N-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Arg-Arg- Arg-Ala-Ala-Arg-Ala-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-Pro-Glu-Gln-Met -Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，Lys18，Arg26，(Met30或Nle30)]PYY(SEQ ID No：27)
H2N-Ala-Pro-Ile-Glu-Pro-Glu-Ala-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Ser-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr -Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-(Met或Nle)-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Lys28，Glu32]PP25-36(SEQ ID No：28)
H2N-Arg-Tyr-Lys-Asn-Met-Leu-Glu-Arg-Pro-Arg-Tyr-CONH2
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-[Gln34PP](SEQ ID No：29)
H2N-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Pro-Leu-Glu-Pro-Val-Tyr-Pro-Gly-Asp-Asn-Ala-Thr-P ro-Glu-Gln-Met-Ala-Gln-Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg -Tyr-CONH2
[Cys2，Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：30)

[Cys2，N-(8-(8-γ谷氨酰基氨基-辛酰基氨基)-辛酰基)-Lys13，D-Cys27， Gln34]PP(SEQ ID No：31)

[Cys2，N-{(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3}-Lys13，D-Cys27，Gln34]PP (SEQ ID No：32)

[Cys2，N-{N’-(21-氨基-4，7，10，13，16，19-六氧杂二十一烷酰基)}-γ谷氨酰基 -Lys13，D-Cys27，Gln34]PP(SEQ ID No：33)

[N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：34)
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No： 35)
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[N-PEG5000-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：36)
yr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-Tyr-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，N-(N’-十六烷酰基)-γ谷氨酰基-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：37)
yr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，N-(Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Ala-Arg-Ala)3-Lys13，Arg26，Nle30]P YY(SEQ ID No：38)
yr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[Ala1，Glu4，N-PEG5000-Lys13，Arg26，Nle30]PYY(SEQ ID No：39)
yr-Tyr-Ala-Ser-Leu-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Nle-Val-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2
[N-PEG5000-Lys13，Gln34]PP(SEQ ID No：40)
Tyr-Ala-Ala-Asp-Leu-Arg-Arg-D-Cys-Ile-Asn-Met-Leu-Thr-Arg-Gln-Arg-Tyr-CONH2