发明领域

本发明涉及给哺乳动物例如人输送或施用治疗化合物和组合物的 材料和方法。

背景

医疗保健不可否认地是现代社会和个体的根本关注问题之一，大 量金钱和努力被用于确保持续发展。结果已经稳定地发展，发达国家 引导着提供日益增多种类的治疗化合物的潮流，以治疗永远增加数量 的被视作一种生命形式或另一种(包括人类)的痛苦的疾病、障碍和 状况。但是，随着我们对健康的理解的增加，保健职业已经逐渐意识 到由需要保健的生命形式强加的限制。例如，哺乳动物具有内部器官 系统、器官和组织，各自具有特征大小、位置和组构。该复杂的内部 解剖学会限制向需要的细胞输送有效量的活性治疗剂的能力。对健康 细胞的毒害作用和经济学典型地会排除全身输送大量的治疗剂。结果， 已经付出了大量的努力，来开发输送治疗剂的靶向方案。现在，这些 方案已经产生了多功能的、成本经济的治疗化合物的靶向作用。另外， 靶向药物输送的许多方案不能克服这样的药物为达到它们在待治疗的 生物体积内的靶位所必须进行的内部行程产生的危害。即使当适当地 靶向时，不稳定的药物也会在血流、胃肠道、淋巴系统和身体的细胞 外间隙中丧失效力。

对于许多治疗剂，尤其是基于蛋白的治疗剂，基本形式的保护是 提供保护，通过输送更稳定的在体内激活的前药化合物，或通过稳定 含有治疗剂的溶液的pH。前药方法需要昂贵的且不可预知的研究，以 在个案的基础上鉴别候选化合物。稳定实际的治疗剂，例如通过pH 稳定化，已经导致了许多种类缓冲系统的开发，多种这样的缓冲剂能 与治疗的生物的体内环境相容。通过包含稳定化合物，例如牛血清白蛋 白、酪蛋白等，也能促进稳定化。但是，这些方法需要开发能与给定 的治疗剂相容且有效的缓冲剂，而稳定剂的加入会增加成本，并需要 探索以确保稳定剂不会妨碍希望的治疗活性或具有其它毒害后果(例 如，免疫原性)。

另一种类型的稳定剂被共价地结合到治疗剂例如蛋白治疗剂上。 例如，已经报道，通过将聚乙二醇分子(例如，1-20kD，典型地3-5kD) 共价结合到蛋白上而使蛋白PEG化，会提高这些治疗剂的稳定性。 Cantin等，Am.J.27：659-665(2002)；Specialty Chemicals Magazine，news article ID 7430(March 25，2004)；Goldenberg， P & T 27(12)：619-621(2002)。但是，这些改进需要技巧，会增加 治疗剂的成本，并需要小心的测试，以确保能保持有意义的治疗活性， 而不导入有害的体内继发效应。稳定化合物例如PEG(3-5kD，例如， GoLytely)也已经用在含有治疗剂的溶液中。还已经将GoLytely (3,340kD)本身用作例如缓泻药。低分子量PEG(例如，3-12kD)的 加入，并不总能达到医学界寻求的结果。因而，LMW PEG向含有治疗 剂的溶液中的添加，包含着附加的成本，必须进行测试，以确保其功 效和无毒性，并缺少确信可将其应用扩展至新治疗剂所需的多能性。

关于高分子量PEG组合物(例如，20kD)，Hauet等，Kidney Int. 62(2)：654-667(2002)已经报道了含有20kD PEG的溶液在移植前保 藏供体肾的应用，产生报道的局部缺血/再灌注损伤的减少。但是，未 在体内施用20kD PEG的溶液。还已经将HMW PEG共价地结合到若干 生物相容的化合物中的任一种上，以合成用于形成可生物降解的纳米 球的双嵌段聚合物。Gref等，Science 263：1600-1603(1994)。预 期纳米球会用于体内用途，但是这样的纳米球仅仅含有共价结合到生 物相容的化合物上的HMW PEG，所述生物相容的化合物是确保该球可 生物降解所必需的。纳米球，与其它潜在的体内分子载体(例如，脂质 体，粘性塑料，多糖水凝胶)一样，典型地通过将治疗剂隔离在载体内 部，稍微从被治疗的生物的体内环境移出，为治疗剂提供稳定性和保 护的措施。但是，基于载体的稳定治疗剂的方法包含相当大的开发成 本，这必须获得回报，以及在制备和输送含有治疗剂的载体时可观的 支出。基于载体的方法还会牺牲治疗剂本身的任何靶向功能，尚未解 决这些技术的靶向组织。而且，载体的使用，会增加载体处理的附加 问题，其必须设计成可被清除或降解，但是必须直到已经输送了治疗 剂负荷才发生。因而，本领域仍然存在对输送治疗剂的多功能方法的 需要，其能保留功效，或稳定甚至不稳定的药物，允许这样的化合物 在丧失它们的治疗价值之前达到它们的预期作用部位。

在大多数(如果不是全部)情况下，输送活性治疗剂的目的在于 治疗、改善或预防生物中的机能障碍(例如，疾病、障碍或状况)。癌 症、细胞变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)，和细菌性脓毒病是这些类 型的机能障碍中的代表，其可以(且经常)上升到重大健康关注问题 的水平。不希望受理论的约束，在机能障碍之前的时间稳定细胞的直 接环境，可能在延迟、改善或预防这样的疾病、障碍或状况的产生方 面具有积极的治疗作用。因而，除了本领域前述的对输送活性治疗剂 的多功能系统的需要外，本领域仍然需要能稳定处于机能障碍危险中 的细胞的体内环境的组合物、方法和系统。

微生物-介导的上皮障碍或异常状况，呈现出对人类和动物的健康 的显著威胁，造成全世界医疗保健系统的负担。这样的障碍的一个实 例，肠-衍生的脓毒病，是生物(例如人患者)中死亡率的主要原因， 所述生物患有多种疾病、障碍或痛苦中的任一种，例如烧伤，新生儿 小肠结肠炎，严重的嗜中性粒细胞减少症，炎性肠病，和移植后的器官 排斥。长期以来将肠道病原体库公认为细菌-介导的脓毒病的潜在致死 病灶，例如在病危的住院患者中。微生物病原体例如假单胞菌(例如， 铜绿假单胞菌)扰乱肠上皮屏障的调节功能的能力，可能是能造成肠- 衍生的脓毒病的条件致病微生物中的限定特征。在许多这样的感染中， 已经将铜绿假单胞菌鉴别为成因病原体。重要的是，已经证实肠道是 条件致病菌例如铜绿假单胞菌定殖的主要部位。

预防或治疗微生物-介导的上皮障碍例如肠-衍生的脓毒病的常规 治疗方法已经遇到不完全的成功。基于抗生素的方法因难以以不会影 响剩余的肠道菌群的方式使抗生素特别针对肠病原体而受到削弱。另 外，许多肠病原体，如铜绿假单胞菌所示例的，经常变得对抗生素攻 击耐受，导致昂贵的、进行的和不完全成功的预防或治疗方法。免疫 治疗方法也存在问题，特别是，许多肠病原体例如铜绿假单胞菌是免 疫逃避的，导致这样的方法效力极低。

预防或治疗障碍例如肠-衍生的脓毒病的另一种方法是肠道清洗。 在过去的几年中，已经尝试了使用聚乙二醇(PEG)溶液的肠道清洗， 有些无对照的报道表明，PEG可能在许多临床的和实验的环境下，表 现出治疗肠-衍生的脓毒病的一定前途。这些溶液中的PEG具有3,500 道尔顿的平均分子量，且溶液是市场上可得到的(例如，Golytely)。 尚不清楚这些相对较低分子量(LMW)的PEG溶液提供治疗或预防肠-衍 生的脓毒病的治疗益处的机理。典型地，这些溶液用于洗涤或冲洗罹 患肠-衍生的脓毒病或处于其发生危险中的生物的肠道。作为向肠道施 用这些LMW PEG溶液的结果，根据浓缩方法和使用的化合物的分子量， 经处理的肠中的菌群组成发生可变的变化。例如，具有超过约20％的 PEG浓度的溶液，可以产生杀死微生物的作用，导致逆境宿主肠道中 潜在保护性微生物的消除。并且，低分子量PEG的溶液，会丧失它们 的减弱某些生物的毒力能力的功效，尽管保留这些生物。因此，本领 域需要一种溶液，它能抑制微生物的毒力表达(微生物的有害性质)， 而不杀死该微生物或附近的微生物，从而提供保存肠道微生物群的天 然生态系统的益处。例如，天然菌群组成的保存，会提供与否则会在 肠内定殖的条件致病菌的竞争。

伴随着菌群组成的变化，生物的生理学也变化。通过测定任意数 目的特征酶活性，例如乳酸脱氢酶水平，可以监测这些生理学变化。 结果，对肠的LMW PEG处理，会在经处理的生物中产生生理学的显著 变化，对经处理的生物的健康和康乐具有不可预知的、且因而潜在有 害的长期后果。而且，这样的处理会在病危的生物例如住院的人类患 者中引起大量肠排泄形式的体力要求高的反应。

因而，本领域仍然还需要提供一种组合物，其能有效地预防或治 疗微生物-介导的上皮障碍(例如，肠-衍生的脓毒病)和/或与这样的障 碍有关的症状，以及通过显著改变经治疗的生物的生理学，实现这样 的益处而不产生其它并发症的可能性的方法。

发明概述

通过提供高分子量(HMW)聚乙二醇-样组合物，其能提供输送活性 治疗剂的稳定环境，或者它自身能提供针对特征在于处于发生微生物- 介导的障碍的危险中的上皮表面的异常状况的有效保护，本发明满足 了至少一个上述的本领域的需要。适用于在HMW PEG-样化合物中稳定 输送的示例性的治疗剂包括蛋白和肽治疗剂以及小分子治疗剂。HMW PEG-样化合物为其提供治疗益处的示例性的异常状况包括肠-衍生的 脓毒病，与肠内菌群有关的其它肠障碍/疾病，其归因于肠病原体，包 括但不限于铜绿假单胞菌，和哺乳动物例如人类的上皮细胞的多种疾 病、障碍和状况。示例性的HMW PEG-样化合物是HMW PEG。HMW PEG 能抑制或阻止铜绿假单胞菌等病原体接触肠上皮表面。另外，高分子 量PEG会抑制对多种信号(可能涉及数量(quorum)-感知信号传递网 络)作出响应的这些病原体(例如，铜绿假单胞菌)中的毒力表达。HMW PEG-样化合物(例如，HMW PEG)限制肠病原体和肠上皮之间的感染界 面的能力，会提供预防或治疗肠-衍生的脓毒病的替代方法，例如在分 解代谢应激后。重要的是，使用HMW PEG-样化合物的治疗，是节省成 本的，且能相对简单地在人患者以及多种其它生物例如农业上重要的 家畜(例如，牛，猪，绵羊，山羊，马，鸡，火鸡，鸭，鹅，等)、宠 物和动物园动物上进行。

本发明的一个方面提供了一种产品，其包含标签包装材料和有效 量的包含在包装材料中的高分子量聚乙二醇-样(HMW PEG-样)化合物， 其中所述包装材料包含标签或包装说明书，它指示HMW PEG-样化合物 可以用于治疗、改善或预防特征在于异常的上皮细胞的状况，例如发炎 的上皮或包含屏障机能障碍的上皮。HMW PEG-样化合物可以是多种高 分子量化合物中的任一种，例如阳离子型聚合物，聚链烷、聚烯烃或聚 烷撑二醇(例如，HMW聚丙二醇，HMW聚乙二醇(HMW PEG)，或其混 合物)，HMW PEG的衍生物，例如HMW聚甲氧基PEG，HMW单甲氧基 PEG，HMW聚丙二醇，或其混合物。另外，HMW PEG-样化合物可以是任 一种前述的化合物，其还包含至少一个共价结合的官能团，例如直链 C1-C10烷氧基(例如，甲氧基)，有支链的C1-C10烷氧基，C1-C10 芳氧基，或其混合物。所述产品的化合物还可以包含接头例如直链 C1-C10烷基，有支链的C1-C10烷基，芳基(例如，苯基)，或其混合 物。产品也可以包含在溶液中的HMW PEG-样化合物，例如水溶液，其 中HMW PEG-样化合物以至少5％(w/v)、或10％至20％(w/v)的浓度存 在。根据本发明的HMW PEG-样化合物的平均分子量大于12,000道尔 顿，或是至少15,000道尔顿，或大于15,000道尔顿且小于20,000道 尔顿。

根据权利要求1的本发明的产品的标签包装材料，其中所述标签 提供了施用化合物来治疗、改善或预防特征在于异常的上皮细胞的状 况例如上皮炎症或上皮屏障机能障碍的说明。更具体地，本发明包含 这样的状况：肠-衍生的脓毒病，炎性肠病，肠易激综合征，上皮的烧 伤，上皮的化学接触损伤，新生儿坏死性小肠结肠炎，免疫障碍，严 重的嗜中性粒细胞减少症，中毒性结肠炎，肠病，移植排斥，囊炎， pig belly，霍乱，粘膜炎症，皮肤炎症和其混合。另外，该状况可以 是免疫障碍例如白血病，淋巴瘤，AIDS，银屑病，炎性肠病，红斑狼 疮，硬皮病，类风湿性关节炎，化疗-诱导的免疫障碍，辐射-诱导的 免疫障碍，和其混合或组合。用于治疗、改善或预防炎性肠病的产品， 可以用于治疗、改善或预防溃疡性结肠炎，克罗恩病和其混合。

在另一个方面，本发明提供了如上所述的产品，其还包含治疗有 效量的治疗剂。更具体地，本发明包括任意的可以用于治疗、改善或 预防上皮细胞的疾病、障碍或状况的治疗剂，这样的治疗剂包括但不 限于，益生微生物制剂，源自至少一种益生微生物的组合物，镇痛化合 物，抗炎化合物，免疫系统的调节剂，抗生素，抗癌剂，抗溃疡剂，生 长因子，细胞因子，蛋白激素，三叶蛋白和其混合。示例性的治疗剂包 括5-氨基水杨酸，包含5-氨基水杨酸部分的化合物，皮质类甾醇，甲 氨蝶呤，6-巯基嘌呤，环孢菌素，万古霉素，甲硝唑，头孢菌素，紫 杉烷，包含紫杉烷部分的化合物，喜树碱，包含喜树碱部分的化合物， 5-氟尿嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌 激素化合物，表皮生长因子，肠三叶因子，胰岛素，生长抑素，干扰 素和其混合。在有些实施方案中，治疗剂是益生乳酸菌，例如，乳杆 菌GG(LGG)，唾液链球菌嗜热亚种，干酪乳杆菌，植物乳杆菌，嗜酸 乳杆菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，长双歧杆菌，婴儿双岐杆菌，或 短双歧杆菌，和其混合或组合(例如，VSL#3)，或源自任一种这样的细 菌的化合物或组合物。

本发明的另一个方面涉及给需要的对象的上皮施用治疗组合物的 方法，包括施用包含HMW PEG-样化合物和有效量的治疗剂的组合物。 关于根据本发明的产品，适用于该方法的治疗剂包括但不限于，益生 微生物制剂，源自至少一种益生微生物的组合物，镇痛化合物，抗炎 化合物，免疫系统的调节剂，抗生素，抗癌剂，抗溃疡剂，生长因子， 细胞因子，蛋白激素，三叶蛋白和其混合。示例性的治疗剂包括5-氨 基水杨酸，包含5-氨基水杨酸部分的化合物，皮质类甾醇，甲氨蝶呤， 6-巯基嘌呤，环孢菌素，万古霉素，甲硝唑，头孢菌素，紫杉烷，包 含紫杉烷部分的化合物，喜树碱，包含喜树碱部分的化合物，5-氟尿 嘧啶，包含5-氟尿嘧啶部分的化合物，抗雄激素化合物，抗雌激素化 合物，表皮生长因子，肠三叶因子，胰岛素，生长抑素，干扰素和其 混合。在根据本发明的方法的一个实施方案中，HMW PEG-样化合物是 HMW PEG(例如，HWM PEG 15-20kD)。可以向其施用治疗剂的上皮包 括但不限于，肠粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，食道粘膜，口腔 粘膜和皮肤。在有些实施方案中，向其施用治疗剂的对象是哺乳动物， 例如人。本发明的该方面包含本领域已知的任何施用方法，包括经口 施用，直肠施用，肠道清洗，局部施用，静脉内注射，腹膜内注射， 尿道内施用，阴道施用，套管插入术和辅助的或无辅助的呼吸。在本 发明的该方面的多种实施方案中，治疗剂是蛋白性的化合物。该方法 也可以包括施用有效量的PA-I凝集素/粘附素，例如，铜绿假单胞菌 PA-I凝集素/粘附素；对于包括施用蛋白性的治疗剂的方法，特别地 预期PA-I凝集素/粘附素的施用。

本发明的另一个方面涉及治疗对象中微生物-介导的上皮状况的 方法，其包括给需要的对象施用有效量的HMW PEG-样化合物，其中所 述HMW PEG-样化合物是HMW PEG，其还包含至少一个共价结合的选自 下述的官能团：直链C1-C10烷氧基，有支链的C1-C10烷氧基， C1-C10芳氧基和其混合。HMW PEG-样化合物可以在包含至少10％且 小于20％HMW PEG-样化合物(w/v)的水溶液中。对象可以是哺乳动物， 例如人。上皮可以是肠粘膜，肺粘膜，鼻粘膜，尿道粘膜，阴道粘膜， 食道粘膜，口腔粘膜或皮肤。在实施本发明的该方面时，可以通过本 领域已知的任何途径，包括经口施用，直肠施用，阴道施用，向肠施 用，局部施用，静脉内注射，腹腔内注射，套管插入术和辅助的或无 辅助的呼吸，施用HMW PEG-样化合物。适于通过本发明的该方面治疗 的状况包括但不限于，肠-衍生的脓毒病，炎性肠病，肠易激综合征， 上皮的烧伤，上皮的化学接触损伤，新生儿坏死性小肠结肠炎，免疫 障碍，严重的嗜中性粒细胞减少症，中毒性结肠炎，肠病，移植排斥， 囊炎，pig belly，霍乱，粘膜炎症，皮肤炎症和其混合。在一个有关 的方面，本发明包括向需要的对象施用有效量的HMW PEG-样化合物的 方法，以治疗这样的状况：如白血病，淋巴瘤，AIDS，银屑病，炎性 肠病，红斑狼疮，硬皮病，类风湿性关节炎，化疗-诱导的免疫障碍， 辐射-诱导的免疫障碍，和其混合或组合。在本发明的这两个方面，HMW PEG-样化合物可以是HMW PEG，其还包含至少一个共价结合的官能团 例如直链C1-C10烷氧基，有支链的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基 和其混合。无论是否由微生物诱发，适于治疗的状况包括肠-衍生的脓 毒病，炎性肠病，肠易激综合征，上皮的烧伤，上皮的化学接触损伤， 新生儿坏死性小肠结肠炎，免疫障碍，严重的嗜中性粒细胞减少症， 中毒性结肠炎，肠病，移植排斥，囊炎，pig belly，霍乱，粘膜炎症， 皮肤炎症和其混合或组合。特别地包括对例如下述状况的治疗：白血 病，淋巴瘤，AIDS，银屑病，炎性肠病，红斑狼疮，硬皮病，类风湿 性关节炎，化疗-诱导的免疫障碍，辐射-诱导的免疫障碍和其混合。

在另一个方面，本发明提供了改善任一种上述状况的症状的方法， 包括给需要的对象施用有效量的HMW PEG-样化合物，其中所述HMW PEG-样化合物是HMW PEG，其还包含至少一个共价结合的选自下述的 官能团：直链C1-C10烷氧基，有支链的C1-C10烷氧基，C1-C10芳 氧基和其混合。

本发明的另一个方面涉及预防状况的方法，包括给需要的对象施 用有效量的HMW PEG-样化合物，其中所述HMW PEG-样化合物是HMW PEG，其还包含至少一个共价结合的选自下述的官能团：直链C1-C10 烷氧基，有支链的C1-C10烷氧基，C1-C10芳氧基和其混合。本发明 包括预防例如下述状况的方法：肠-衍生的脓毒病，炎性肠病，肠易激 综合征，上皮的烧伤，上皮的化学接触损伤，新生儿坏死性小肠结肠 炎，免疫障碍，严重的嗜中性粒细胞减少症，中毒性结肠炎，肠病， 移植排斥，囊炎，pig belly，霍乱，粘膜炎症，皮肤炎症和其混合或 组合。

本发明的另一个方面涉及如上所述的HMW PEG-样化合物在制备用 于治疗诸如下述状况的药物中的应用：炎性肠病，肠易激综合征，上 皮的烧伤，上皮的化学接触损伤，新生儿坏死性小肠结肠炎，免疫障 碍，严重的嗜中性粒细胞减少症，中毒性结肠炎，肠病，移植排斥， 囊炎，pig belly，霍乱，粘膜炎症，皮肤炎症和其混合或组合。特别 地包括用于制备治疗与下述疾病有关的状况的药物的化合物：免疫障 碍，例如白血病，淋巴瘤，AIDS，银屑病，炎性肠病，红斑狼疮，硬皮 病，类风湿性关节炎，化疗-诱导的免疫障碍，辐射-诱导的免疫障碍 和其混合或组合。

本发明的另一个方面提供了减小具有异常状况、包括疾病状况的 动物的死亡可能性的方法，所述状况包括处于发生选自下述的微生物- 介导的障碍的危险中的上皮表面：肠-衍生的脓毒病，烧伤，新生儿坏 死性小肠结肠炎，严重的嗜中性粒细胞减少症，中毒性结肠炎，炎性 肠病，肠病，移植排斥，囊炎，和pig belly，该方法包括给需要的动 物施用有效剂量的聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5,000道 尔顿的平均分子量。合适的动物包括但不限于，狗，猫，绵羊，山羊， 牛，猪和人。在前述的方法中，PEG优选地具有至少15,000道尔顿的 平均分子量，优选5,000至20,000道尔顿，或15,000至20,000道 尔顿。还优选地，PEG具有6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、 11,000、12,000、13,000、14,000和25,000道尔顿的平均分子量。 而且，PEG可以在包含5-20％PEG、优选10-20％PEG(例如，10％PEG) 的水溶液中。在该方法的一个实施方案中，所述状况与肠中存在铜绿 假单胞菌生物有关，且这样的铜绿假单胞菌的细胞膜完整性无可检测 到的改变。在该方法的另一个实施方案中，铜绿假单胞菌的生长模式 无可检测到的改变。

本发明的另一个方面是抑制肠-衍生的脓毒病的方法，包括使哺乳 动物上皮例如肠接触聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG具有至少5,000 道尔顿、优选至少15,000道尔顿的平均分子量。在该方法的一个实 施方案中，哺乳动物的肠接触PEG至少30分钟。

本发明的其它方面包括抑制上皮病原体(例如，肠病原体)中的 PA-I凝集素/粘附素表达的方法，包括给有此需要的动物施用有效剂 量的聚乙二醇；抑制上皮-诱导的(例如，肠上皮-诱导的)PA-I凝集 素/粘附素的激活的方法，包括给有此需要的动物施用有效剂量的聚乙 二醇；抑制C4-HSL-诱导的上皮病原体(例如，肠病原体)的形态学变 化的方法，包括给有此需要的动物施用有效剂量的聚乙二醇；减少上 皮病原体(例如，肠病原体)中的毒力表达的方法，包括给有此需要的 动物施用有效剂量的聚乙二醇；减少或预防上皮表面与微生物毒力因 子相互作用的方法，包括给有此需要的动物施用有效剂量的聚乙二醇； 通过预防致病性的数量-感知激活的形成，改善上皮(例如，肠)发病的 方法，包括给有此需要的动物施用有效剂量的聚乙二醇；和抑制脊椎动 物上皮(例如，肠上皮)和细菌例如假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)之 间的相互作用的方法，包括使上皮接触聚乙二醇。在本发明的所有这 些方面，PEG具有至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的平 均分子量。

本发明的另一个方面是抑制铜绿假单胞菌-诱导的哺乳动物上皮 层(例如肠上皮层)的跨上皮电阻的减小的方法，包括使(肠)上皮层 接触聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿、优选至少15,000 道尔顿的平均分子量。优选地，PEG具有15,000至20,000道尔顿的 平均分子量。在一个优选的实施方案中，微生物(例如，铜绿假单胞菌) 的膜的完整性无可检测到的改变。

本发明的另一个方面是抑制细菌细胞向哺乳动物上皮(例如哺乳 动物的肠)的粘附的方法，包括使肠接触聚乙二醇，其中所述PEG具 有至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的平均分子量。同样 对于该方法，PEG优选地具有15,000至20,000道尔顿的平均分子量。 PEG可以在包含5-20％PEG、优选5-10％PEG的水溶液中。预期适于通 过该方法抑制粘附的示例性的细菌细胞是假单胞菌，例如铜绿假单胞 菌。

本发明的另一个方面是减少细菌细胞中PA-I凝集素/粘附素的 表达的方法，包括使细菌细胞接触聚乙二醇，其中所述PEG具有至少 5,000道尔顿、优选15,000道尔顿的平均分子量，且优选地为15,000 至20,000道尔顿。另外，PEG可以在包含5-20％PEG、优选5-10％PEG 的水溶液中。

在另一个方面，本发明提供了减小动物死亡的可能性的方法，所 述动物表现出微生物-介导的选自下述的上皮障碍：肠-衍生的脓毒病， 烧伤，新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)，严重的嗜中性粒细胞减少症， 中毒性结肠炎，炎性肠病，肠病(例如，在危重病中)，移植排斥，囊 炎和pig belly，包括施用有效量的化合物(例如，PEG)，其能粘附 到选自哺乳动物肠上皮细胞和肠细菌细胞的细胞上，其中所述化合物 以地形学上不匀称的方式粘附到细胞上，从而抑制哺乳动物肠上皮细 胞和细菌细胞的相互作用。优选的化合物是表面活性剂。在该方法的 一个实施方案中，化合物是PEG，优选地具有至少15,000道尔顿的平 均分子量。在该方法的另一个实施方案中，通过原子力显微镜测定抑 制。在该方法的另一个实施方案中，细菌细胞是肠病原体，它的生长 特征没有可检测的变化。在一个有关的方面，该方法还包括将有效量 的葡聚糖导入动物肠内，和/或将有效量的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被 的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，一种或多 种低聚果糖，N-乙酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖和半乳糖， 乳果糖和本领域已知的平衡缓冲剂和稳定剂，导入动物肠内。当一起 作为单一组合物施用时，该多组分单溶液给药将处理和准备预期破坏 肠道菌群和肠屏障功能的肠道，例如发生在严重的分解代谢-、手术- 和外伤-型应激后。

本发明的另一个方面是改善与源自上皮的异常状况或其特征性的 任何疾病或状况(例如肠-衍生的脓毒病)有关的症状的方法，包括给 肠施用聚乙二醇，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿、优选至少 15,000道尔顿的平均分子量，优选地为15,000至20,000道尔顿。 PEG可以在包含5-20％PEG、优选5-10％PEG的水溶液中。本发明包括 改善与本文公开的任何疾病或状况有关的症状。

本发明的另一个方面是预防动物丧失泌乳能力的方法，所述动物 表现出处于发生微生物-介导的影响乳汁输出的障碍危险中的乳腺上 皮表面形式的异常状况，包括给乳腺的上皮表面施用(例如，局部地) 有效剂量的至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的聚乙二醇。 示例性的动物包括哺乳动物，例如绵羊，山羊，母牛，猪，马和人。在 一个有关的方面，本发明提供了治疗动物丧失泌乳能力的方法，所述 动物的特征在于微生物-介导的影响乳汁输出的乳腺上皮表面的障碍， 包括给乳腺施用(例如，局部地)有效剂量的至少5,000道尔顿、优 选至少15,000道尔顿的聚乙二醇。在另一个有关的方面，本发明提 供了预防哺育年龄的动物发生微生物-介导的上皮障碍的方法，包括给 动物施用有效剂量的至少5,000道尔顿、优选至少15,000道尔顿的 聚乙二醇。合适的动物包括哺乳动物，例如人，家畜，家养的宠物，和 动物园动物。在一个实施方案中，将PEG与本领域已知的任意婴儿配 方相混合。

本发明的一个有关的方面是包含婴儿配方和聚乙二醇(PEG)的组 合物，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量。同样，可 以使用本领域已知的任意的婴儿配方，包括基于哺乳动物奶(例如牛 奶、羊奶等)的配方，以及基于豆浆的配方。配方还可以富含任意的 维生素和/或元素，包括强化铁。PEG优选地具有至少15,000道尔顿 的平均分子量，优选地在婴儿或幼儿配方的重配或水合后，以5-20％ 的范围存在。本发明还提供了给动物(优选地为哺育年龄)提供营养 的方法，包括给动物施用有效剂量的包含婴儿配方和PEG的组合物。

本发明的另一个方面是药物组合物，其包含平均分子量为至少 5,000道尔顿、优选15,000道尔顿的聚乙二醇，和合适的佐剂，载体 或稀释剂。在一个有关的方面，组合物还包含选自下述的化合物：葡 聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸， 一种或多种低聚果糖，N-乙酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖 和半乳糖，乳果糖和本领域已知的平衡缓冲剂和稳定剂。

本发明的另一个方面是用于治疗性治疗或预防特征在于处于发生 微生物-介导的障碍(例如肠-衍生的脓毒病)危险中的上皮表面的异 常状况的试剂盒，其包含上述的药物组合物之一和描述该组合物在治 疗性治疗或预防该异常状况中的应用的说明书。适于包含在试剂盒中 的说明书描述了任一种本文公开的治疗或预防方法。

本发明的其它方面涉及预防特征在于处于微生物-介导的障碍(包 括疾病)危险中的上皮表面的异常状况的方法。例如，本发明包括预 防疾病或异常状况的方法，包括给动物施用包含有效剂量的聚乙二醇 (PEG)的组合物，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量。 本发明的预防方法适用的合适的疾病或异常状况选自游泳耳病，急性 中耳炎，慢性中耳炎，呼吸器相关性肺炎，肠-衍生的脓毒病，坏死性 小肠结肠炎，抗生素-诱导的腹泻，假膜性结肠炎，炎性肠病，易激性 肠病，中性粒细胞减少性小肠结肠炎，胰腺炎，慢性疲乏综合征，生 态失调综合征，镜下结肠炎，慢性泌尿道感染，性传播疾病，和感染。 适合作为这样的预防方法的对象的动物选自狗，猫，绵羊，山羊，牛， 猪，鸡，马和人。PEG优选地具有至少15,000道尔顿的平均分子量； 还优选地是具有15,000至20,000道尔顿的平均分子量的PEG。而且， PEG可以在包含10-20％PEG、优选10％PEG的水溶液中。施用的组合 物还可以包含选自下述的介质：液体溶液，局部的凝胶，和适用于喷雾 的溶液。另外，组合物还可以包含选自下述的化合物：葡聚糖-包被的 L-谷氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖， N-乙酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。在 一个实施方案中，组合物包含PEG，葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚 糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖，N-乙酰基-D-半乳糖 胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。

本发明的另一个方面是预防皮肤感染的方法，包括给动物应用包 含有效量的聚乙二醇(PEG)的组合物的步骤，其中所述PEG具有至少 5,000道尔顿的平均分子量。组合物还可以包含选自下述的介质：软 膏剂，乳霜剂，凝胶和洗剂。本发明预期，造成感染的因子选自：炭 疽芽孢杆菌，天花病毒，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，肠出血性大肠杆 菌(EHEC)，肠聚集性大肠杆菌(EAEC)，艰难梭菌，轮状病毒，铜绿假 单胞菌，粘质沙雷菌，产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytocia)，阴 沟肠杆菌，白色念珠菌和Candida globrata。

本发明的另一个方面是预防呼吸道感染的方法，包括给动物施用 有效量的聚乙二醇(PEG)的步骤，其中所述PEG具有至少5,000道尔 顿的平均分子量。本发明的预防方法适用的呼吸道感染可能起因于通 过本领域已知的任何途径与感染因子的接触，包括与呼吸器有关的肺 炎(例如，呼吸器相关性肺炎)，空气传播的感染因子，在雾状液体中 (例如通过喷嚏)分散的感染因子等。在有些实施方案中，该方法能 预防选自炭疽芽孢杆菌和天花病毒的因子造成的呼吸道感染。

本发明的另一个方面是为预防慢性泌尿道感染而冲洗泌尿道的至 少一部分的方法，包括给尿道输送有效量的包含PEG的组合物的步骤， 其中所述PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量。在一个实施方案 中，将组合物施用给至少包括膀胱的泌尿道的一部分。

本发明的另一个方面是预防性传播疾病的方法，包括向避孕套应 用聚乙二醇(PEG)的步骤，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿的平 均分子量。本发明的一个有关的方面是包含至少部分PEG涂层的避孕 套，所述PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量。另一个有关的方 面是试剂盒，其包含避孕套和具有至少5,000道尔顿的平均分子量的 聚乙二醇(PEG)。

本发明也包括预防消化道障碍的方法，包括给有此需要的动物施 用有效剂量的包含聚乙二醇(PEG)的组合物，其中所述PEG具有至少 5,000道尔顿的平均分子量。本发明的预防方法适用的示例性的消化 道障碍可以选自：新生儿坏死性小肠结肠炎，抗生素-诱导的腹泻，假 膜性结肠炎，炎性肠病，易激性肠病，中性粒细胞减少性小肠结肠炎， 胰腺炎，生态失调综合征和镜下结肠炎。

本发明的另一个方面是监测向有此需要的动物施用聚乙二醇(PEG) 的方法，包括给有此需要的动物施用有效量的包含标记的PEG的组合 物，其中所述PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量，并检测标记 的PEG，标记的PEG(例如，结合有微生物)的数量和/或位置由此提供 用于评价施用功效的信息。在监测方法的一个实施方案中，标记是荧 光团(例如，荧光素，罗丹明，Cy3，Cy5)。在该方法的另一个实施方 案中，对标记的PEG的检测包含内窥镜检查。监测方法也包括，在粪 便样品中检测标记的PEG(即标记的PEG结合有来源于粪便样品的组 分，例如微生物)。另外，监测方法还可以包括施用对微生物特异性的 第二标记，并检测第二标记。如在此上下文中使用的“特异性”意味 着，该标记可检测地与至少一个微生物有关。

本发明的另一个方面是监测向有此需要的动物施用聚乙二醇(PEG) 的方法，包括从接受聚乙二醇的动物得到样品，其中所述PEG具有至 少5,000道尔顿的平均分子量，使样品接触上皮细胞，并测量样品中 的微生物向上皮细胞的粘附，PEG的数量和/或位置由此提供用于评价 施用功效的信息。通过显微镜检查，可以完成测量。

根据本发明的另一种监测方法是，监测向有此需要的动物施用聚 乙二醇(PEG)的方法，包括从接受聚乙二醇的动物得到样品，其中所述 PEG具有至少5,000道尔顿的平均分子量，使上皮细胞层接触样品， 并测量上皮层的跨-上皮电阻，跨-上皮电阻相对于对照值降低的减少， 指示着有效的施用。对照值可以是内部的(即在PEG施用前测量TEER) 或外部的(即可靠地用于对比的在其它研究中形成的值)。

本发明的另一种监测方法是监测向有此需要的动物施用聚乙二醇 (PEG)的方法，包括从接受聚乙二醇的动物得到样品，其中所述PEG 具有至少5,000道尔顿的平均分子量，从该样品分离微生物，并测量 微生物细胞表面的疏水性，样品中的任何微生物的疏水性由此提供用 于评价施用功效的信息。如在此上下文中使用的“分离”指与样品中 的其它组分(例如，固体物质)分离，足以允许疏水性测量，如本领域 会理解的。

本发明的一个有关的方面是监测聚乙二醇的施用的试剂盒，其包 含标记的PEG和描述标记的PEG在监测其施用中的应用的方案说明书。 合适的方案说明书包括本文公开的或本领域已知的与PEG的施用、输 送或应用有关的任意的方法。在本发明的该方面的有些实施方案中， 试剂盒还包含游离标记。

本发明的另一种监测方法是监测向有此需要的动物施用聚乙二醇 (PEG)的方法，包括从接受聚乙二醇的动物得到样品，其中所述PEG 具有至少5,000道尔顿的平均分子量，和检测样品中的PA-I凝集素/ 粘附素活性，PA-I凝集素/粘附素活性由此提供用于评价施用功效的 信息。在该方法的一个实施方案中，通过结合PA-I凝集素/粘附素结 合配偶体，例如凝集素/粘附素能特异性地结合的任意已知形式的特异 性的抗-PA-1凝集素/粘附素抗体或碳水化合物，检测PA-I凝集素/ 粘附素。本发明的一个有关的方面是用于监测聚乙二醇(PEG)的施用 的试剂盒，其包含PA-I凝集素/粘附素结合配偶体和描述结合配偶体 在检测样品中的PA-I凝集素/粘附素中的应用的方案说明书。合适的 方案说明书包括本文公开的或本领域已知的与PEG的使用有关的任意 的方法。

参考下面的详细描述，包括附图和实施例，可以更好地理解本发 明的其它特征和优点。

附图简述

图1提供了进行假剖腹术或30％手术肝切除、然后将铜绿假单胞 菌PA27853直接注射进盲肠的小鼠在48小时时的死亡率。小鼠接受 30％不流血的左叶肝切除，随后立即直接盲肠注射1×107cfu/ml PA27853。每组含有7只小鼠。对照小鼠接受假剖腹术，然后将等量的 PA27853注射进盲肠。对于PEG组的小鼠，在盲肠注射前，将1×107 cfu/ml PA27853悬浮在PEG 3.35(LMW PEG 3,350)或PEG 15-20(HMW PEG 15,000至20,000道尔顿)中。PEG 15-20的剂量效应曲线见小图 b。a.通过Fisher Exact检验，确定了PEG 15-20的统计学上显著 的保护作用(P＜0.001)。b.测得PEG 15-20的最小保护浓度为5％ (P＜0.05)。c.在30％手术肝切除和直接盲肠注射1×107cfu/ml PA27853后24小时，盲肠内容物(粪便)、洗过的盲肠粘膜、肝和血液 的定量细菌培养。单向ANOVA证实了肝切除后小鼠盲肠内容物、粘膜、 肝和血液中细菌计数的统计学上显著的增加(P＜0.001)。对于PEG 3350，观察到肝和血液细菌计数的显著减少(P＜0.05)，而PEG 15-20 完全阻止了PA27853向小鼠的肝和血液播散。

图2显示了PEG 15-20对PA27853-诱导的上皮屏障机能障碍的保 护作用，如通过跨上皮电阻(TEER)所评估的。a.数据代表着在顶端 暴露于1×107cfu/ml PA278538小时过程中观察到的一式三份培养 物(n＝7)的TEER自基线％最大下降的平均值±SEM。在暴露于PA27853 的Caco-2细胞中，证实了TEER的统计学上显著的降低(单向ANOVA (P＜0.001))。对于PEG 15-20，证实了对PA27853诱导的TEER下降 的统计学上显著的保护作用(P＜0.001)。b.在有PEG 3.35存在且顶 端暴露于PA27853的情况下，Caco-2细胞的图像。共培养4小时后拍 摄的图像，证实了具有漂浮在细胞支架以上30-40微米的细胞的单层 完整性的丧失，展示了PA27853向细胞膜的粘附。c.在有PEG 15-20 存在下4小时后顶端暴露于PA27853的Caco-2细胞，在任何检查的 平面中没有表现出漂浮细胞的迹象。

图3例示了PEG对PA27853中的PA-I表达的抑制作用。a.蛋白 印迹分析。PA27853向1mM数量-感知信号传递分子C4-HSL的暴露， 导致了PA-I蛋白表达的统计学上显著的增加(P＜0.001单向ANOVA)， 该PA-I蛋白表达在有10％PEG 3.35存在下受到部分抑制，且受到 10％PEG 15-20更大得多的抑制。a′.PEG 15-20对C4-HSL-诱导的 PA-I表达的最小抑制浓度是5％(P＜0.01)。b.在有和没有PEG的情况 下暴露于C4-HSL的各细菌细胞的电子显微镜检查法证实，C4-HSL造 成铜绿假单胞菌的形状和菌毛表达的形态学变化。在有PEG 15-20的 情况下，完全消除了C4-HSL-诱导的形态学作用，但是PEG 3.35不能。 在暴露于PEG 15-20的PA27853周围，可以看到晕圈-型效应。c.RNA 印迹杂交。PA27853向0.1mM C4-HSL的暴露，导致PA-I mRNA表达 的统计学上显著的增加(P＜0.001单向ANOVA)，该表达受到10％PEG 15-20的极大抑制。d.在有PEG 15-20存在下，通过暴露于Caco-2 细胞4小时诱导的PA-I mRNA的增加受到抑制，但是PEG 3.35不能 (P＜0.001单向ANOVA)。

图4显示了PEG溶液对PA27853的细菌膜完整性和生长模式的作 用。a.通过由SYTO 9和碘化丙啶组成的染色方法，评价了2种PEG 溶液对细菌膜完整性的作用。两种PEG溶液对细菌膜渗透性都没有任 何作用。b.与不含PEG的TSB培养基(对照)相比，两种PEG溶液中的 PA27853生长模式表现相同。

图5显示了暴露于PEG的Caco-2细胞和细菌细胞的原子力显微镜 (AFM)图像。a-c.在只有培养基(a)、含有PEG 3.35的培养基(b)和 含有PEG 15-20的培养基(c)存在下，Caco-2细胞的AFM图像。观察 到PEG 3.35在Caco-2细胞上形成光滑的覆盖物(b)，而PEG 15-20 形成地形学上更限定的覆盖物(c)。d-f.PEG 3.35和PEG 15-20中的 PA27853的AFM图像。PEG 3.35在各细菌细胞周围形成光滑的外膜(e)， 而PEG 15-20不但紧抱着各细胞(f)，而且增加聚合物/细菌直径 (g，h)，从而使各细菌彼此远离。

图6显示了PEG溶液对PA27853的分散/成团模式的作用。以63X 物镜放大率，使用具有DIC和GFP荧光滤光镜的Axiovert100 TV荧 光倒置显微镜，直接观察dTC3培养皿中的细菌细胞的分散模式。用 Bioptechs恒温温度控制系统，调节温度。钨丝灯(100V)用于DIC 和GFP激发。使用GFP滤光镜，使用来自Intelligent Imaging Innovations的3D成像软件(Slldebook)，对Z平面中的细菌细胞分 散模式成像。在DIC图像(6a1)和Z平面重建(6a2)上，观察到没有 Caco-2细胞的培养基中的均匀分散的浮游铜绿假单胞菌细胞。在有 Caco-2细胞存在下，细菌细胞形成团块外观(6b1)，并发现其粘附到 Caco-2细胞上(6b2)。10％PEG 3350减少细菌的运动性，并诱导粘附 到孔底部(6c2)的蘑菇状细菌小菌落(6c1)的立即形成。在有Caco-2 细胞存在下，细菌小菌落是在上皮细胞平面以上8微米的量级 (6d1，2)。10％PEG 15-20极大地减少铜绿假单胞菌细胞的运动性。然 而，对于在含有PEG 15-20的培养基中温育的前0.5-1小时，细菌细 胞形成蜘蛛状的小菌落，其接近孔的底部(6e1，2)。在几小时内，蜘蛛 腿状的小菌落占据培养基的整个空间/体积(未显示)。在有Caco-2细 胞存在下，铜绿假单胞菌细胞丧失蜘蛛样结构，并发现其升高到上皮 平面以上(30-40微米)(6f1，2)。

图7显示了用益生治疗剂(LGG)处理肠上皮细胞的作用，所述治疗 剂在包含HMW PEG-样化合物(即HMW PEG 15-20kD)的溶液或缺少该 HMW PEG-样化合物的溶液中。对年轻的成年小鼠结肠(YAMC)细胞进行 多种处理(见下面的凝胶泳道标示)，然后收获，并通过蛋白印迹分析， 评价热休克蛋白表达。泳道1-未处理的细胞(阴性对照)；泳道2- 只有高分子量PEG，加入了600ul；泳道3-只有乳杆菌GG(LGG)条 件培养基，加入了600ul；泳道4-先给细胞添加600ul PEG，再在 2小时后加入600ul LGG；泳道5-先加入LGG，再在2小时后加入 PEG(与泳道4中相同的体积)；泳道6-加入300ul LGG和600ul PEG 的混合物；泳道7-1∶1比例的混合物(600ul LGG和600ul PEG)；泳 道8-900ul LGG和600ul PEG的混合物；泳道9-600ul LGG和300ul PEG的混合物；泳道10-600ul LGG和900ul PEG的混合物；和泳道 11-遭受热应激的细胞(HS＝热休克，阳性对照)。进行蛋白印迹，以 评价上面列出的各种处理对诱导型热休克蛋白hsp72(上图)和hsp25 (中图)的诱导。Hsc73(下图)用作上样对照，以确保在所有的泳道中 上样等量的蛋白。

图8显示了用益生治疗剂(VSL#3)处理肠上皮细胞的作用，所述治 疗剂在包含HMW PEG-样化合物(即HMW PEG 15-20kD)的溶液或缺少 该HMW PEG-样化合物的溶液中。对年轻的成年小鼠结肠(YAMC)细胞再 次进行如下所列的多种处理，然后在16小时后收获，并通过蛋白印迹 分析，评价热休克蛋白表达。泳道1-VSL#3条件培养基批次A，将 600ul加给细胞，并放置16小时；泳道2-VSL#3条件培养基批次A， 将1200ul加给细胞，并放置16小时；泳道3-VSL#3培养基批次A， 将600ul与600ul PEG相混合，加给细胞16小时；泳道4-VSL#3A/PEG 混合物，放置10分钟，然后去除(更换培养基)；泳道5-VSL#3条件 培养基批次B，将600ul加给细胞，并放置16小时；泳道6-VSL#3 条件培养基批次B，将1200ul加给细胞，并放置16小时；泳道7- VSL#3培养基批次B，将600ul与600ul PEG相混合，加给细胞16小 时；泳道8-VSL#3 B/PEG混合物，放置10分钟，然后去除(更换培 养基)；泳道9-VSL#3条件培养基批次H，将600ul加给细胞，并 放置16小时；泳道10-VSL#3条件培养基批次H，将1200ul加给细 胞，并放置16小时；泳道11-VSL#3培养基批次H，将600ul与600ul PEG相混合，加给细胞16小时；泳道12-VSL#3 H/PEG混合物，放 置10分钟，然后去除(更换培养基)；泳道13-未处理的细胞(阴性 对照)；和泳道14-遭受热应激的细胞(HS＝热休克，阳性对照)。

发明详述

本发明提供了产品、方法和系统，其集中地代表着简单且经济的 实现稳定化的和有活性的治疗剂的输送的途径，以及提供了对多种上 皮障碍(例如，微生物-介导的上皮障碍)的治疗和/或预防，所述上皮 障碍即影响许多哺乳动物(包括人)的异常状况和疾病。通过给需要 的动物施用高分子量极性聚合物例如HMW聚乙二醇-样化合物，例如， HMW PEG-样化合物例如HMW PEG，所述动物包括处于危险中的那些， 可以用最小的成本和最少的执业培训，治疗众多威胁健康或生命的异 常状况中的任一种，即上皮障碍和疾病，包括肠-衍生的脓毒病。典型 地作为溶液施用的HMW PEG-样化合物的体积，取决于要输送的治疗剂 和治疗剂的目标靶位，例如，如果治疗剂在整个或部分肠道中是有活 性的，则需要足以有效地用溶液包被肠道或其相关部分的HMW PEG-样 溶液。如果治疗剂在例如肠中具有远离输送点的作用位点，且简单地 旨在由其摄入，则HMW PEG-样溶液仅仅需要预防治疗剂在肠腔中的稀 释，如本领域会理解的。不希望受理论的约束，本发明提供的益处与 下述原则相一致，即通过建立有助于这样的微生物存活的环境，可以 成功地预防、改善或治疗微生物-介导的上皮障碍。建立在本说明书中 使用的术语的下述含义，并通过考虑共有的2004年2月6日提交的临 时美国专利申请号60/542,725；2004年4月20日提交的名称为 “Cytoprotective and Anti-Inflammatory Factors Derived From Probiotic And Commensal Flora Microorganisms”、发明人为Eugene Chang和Elaine Petrof的临时美国专利申请号__________(代理人卷 号27373/40027)；和2004年4月20日提交的名称为“Cytoprotective Factors Derived From Probiotic And Commensal Flora Microorganisms”、发明人为Eugene Chang和Elaine Petrof的临 时美国专利申请号___________(代理人卷号27373/40049)，有助于理 解下面对本发明的更详细描述，这三件申请中的每一篇都在本文整体 引作参考。

将″异常状况″广义地定义为包括哺乳动物疾病，哺乳动物障碍和 哺乳动物健康的任何异常的状态，其特征在于处于发生微生物-介导的 障碍的危险中的上皮表面。特征在于处于发生微生物-介导的障碍危险 中的上皮表面的异常状况包括其中上皮表面已经发生微生物-介导的 障碍的状况。示例性的状况包括需要医学干预或由医学干预引起的人 疾病和人障碍，例如烧伤，新生儿小肠结肠炎，严重的嗜中性粒细胞 减少症，炎性肠病，肠病(例如，危重病中的)和移植(例如，器官) 排斥。

″烧伤″指由组织暴露于热引起的哺乳动物组织损伤，所述热例如 开放的火焰、蒸汽、热流体和热表面的形式。

″化学接触″损伤指与化学试剂直接接触造成的损伤，且可以包含 化学灼伤或其它损伤。

″严重的″嗜中性粒细胞减少症被赋予循环嗜中性粒细胞数目显 著减少的其普通且惯用的含义。

″移植排斥″指被认为与宿主生物对移植物(例如，器官)的最终排 斥有关的该移植物的任何发展。

″施用″被赋予通过本领域公认的任何合适的方式输送的其普通且 惯用的含义。示例性的施用形式包括经口输送，肛门输送，直接穿刺 或注射，包括静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、皮下的和其它形式的 注射，局部应用，和喷雾剂(例如，喷雾)，凝胶或流体应用于眼、耳、 鼻、嘴、肛门或尿道口，和套管插入术。

″有效剂量″是能为接受该剂量的生物提供有益效果的物质量，且 可以取决于下述因素而变化：施用该剂量的目的，接受该剂量的生物 的大小和状况，和本领域公认的与有效剂量的确定有关的其它变量。 确定有效剂量的过程包括属于本领域知识范围内的常规优化程序。

″动物″被赋予非植物、非原生生物的其常规含义。优选的动物是 哺乳动物，例如人。

在本说明书的上下文中，“需要”是能从给特征在于该状态的生 物施用有效剂量获益的生物、器官、组织或细胞状态。例如，处于发 生肠-衍生的脓毒病的危险中或表现出其症状的人，是需要有效剂量的 根据本发明的产品(例如药物组合物)的生物。

″平均分子量″被赋予组合物组分(例如，分子)的分子量的算术平 均值的其普通且惯用的含义，不管确定该平均值的准确度如何。例如， 具有3.5千道尔顿的平均分子量的聚乙二醇或PEG，可以含有不同分 子量的PEG分子，条件是在一定的准确度水平下测得这些分子量的算 术平均值是3.5千道尔顿，所述准确度水平可以反映算术平均值的估 计值，如本领域所理解的。类似地，PEG 15-20指其分子量会产生15 至20千道尔顿的算术平均值的PEG，该算术平均值受上述条件的限制。 这些PEG分子包括，但不限于，简单的PEG聚合物。例如，任选地利 用接头分子例如苯酚，可以将多个相对较小的PEG分子(例如，7,000 至10,000道尔顿)连接成具有更高平均分子量(例如，15,000至 20,000道尔顿)的单个分子。

“细胞膜完整性”指作为活细胞的功能组分的细胞膜的功能上显 著的修饰的相对缺乏，如本领域会理解的。

″可检测地改变″被赋予使用适于情形的检测手段可察觉的变化的 其普通且惯用的含义，如本领域会理解的。

″生长模式″统指在本领域被视作能表征细胞生长的细胞或细胞组 (例如，一群细胞)的那些性质的值，例如细胞增殖或倍增时间，新生 细胞群的地形学外观，和本领域认为有助于理解细胞或细胞群的生长 模式的其它变量。

″抑制″具有抑制、减少或阻止的其普通且惯用的含义。例如，抑 制形态学变化指使形态学变化更困难或完全阻止。

“PA-I，或PA-I凝集素/粘附素，表达”指PA-I凝集素/粘附素 的活性特征的生成或产生。典型地，PA-I凝集素/粘附素表达涉及编 码PA-I凝集素/粘附素的mRNA的翻译，以生产具有PA-I凝集素/粘 附素特征性的至少一种活性的PA-I凝集素/粘附素多肽。任选地， PA-I凝集素/粘附素还包括编码PA-I凝集素/粘附素的DNA的转录， 以生产前述的mRNA。

″上皮-诱导的激活″指通过上皮细胞直接或间接影响，增加给定靶 物(例如，PA-I凝集素/粘附素)的活性。在本发明的上下文中，例如， 上皮-诱导的PA-I凝集素/粘附素的激活指该多肽活性的增加，该增 加可归因于通过一个或多个上皮细胞直接接触肠病原体而表现出来的 上皮的间接影响。

″形态学变化″具有形式改变的其普通且惯用的含义。

″肠病原体″指能全部或部分地造成动物例如人的肠-衍生的脓毒 病的病原微生物。该定义包括本领域已知的肠病原体，包括革兰氏阴 性细菌例如假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)。

″改善″指疾病的程度或严重性的减轻，这与它的普通且惯用的含 义相一致。

″致病数量″指足以启动或维持数量感知信号或通讯的数目的病原 生物(例如，铜绿假单胞菌)的聚集或联合，存在生物(例如，肠病原体) 的阈值浓度或数目，如本领域已知的。

″相互作用″具有相互影响的其普通且惯用的含义，如两种或多种 生物产物(例如分子，细胞，等)之间的相互影响。

″跨上皮电阻″或TEER，具有本领域已经接受的该短语的含义，它 指跨上皮组织的电阻测量值，它非排它地用于评价上皮组织中的上皮 细胞之间的紧密连接状态。

″粘附″具有物理上结合超过瞬时时间段的其普通且惯用的含义。

″地形学上不匀称的″指不对称的三维物体(例如，细胞)表面的图 像、地形或其它表现。

″原子力显微镜″也称作扫描力显微镜，是一种使悬臂探头以光栅 扫描横贯样品的表面，并使用高敏感度手段检测探头偏转，获取物质 的高分辨率地形图的技术，如本领域会理解的。

″药物组合物″指适用于治疗性施用给活动物例如人患者的化合物 制剂。优选的根据本发明的药物组合物包含粘度、电解质谱和渗透压 浓度平衡的溶液，其包含电解质，葡聚糖-包被的L-谷氨酰胺，葡聚 糖-包被的菊粉，乳果糖，D-半乳糖，N-乙酰基D-半乳糖胺和5-20％PEG (15,000-20,000)。

“佐剂”，“载体”或“稀释剂”每个都具有本领域已经接受的 这些术语的含义。佐剂是用于延长共同施用的免疫原的免疫原性的一 种或多种物质。载体是有利于操作的一种或多种物质，例如通过携带 的物质的移位。稀释剂是会降低暴露于该稀释剂的给定物质(稀释物) 的浓度的一种或多种物质。

″HMW PEG-样化合物″指相对高分子量PEG化合物，定义为具有超 过3.5千道尔顿(kD)的平均分子量。优选地，HMW PEG具有超过5千 道尔顿的平均分子量，在特定的实施方案中，HMW PEG具有至少8千 道尔顿、超过12千道尔顿、至少15千道尔顿和15至20千道尔顿的 平均分子量。另外，“HMW PEG-样化合物”包括HMW PEG衍生物，其 中每种这样的衍生物是含有至少一个另外的官能团的HMW PEG。优选 的HMW PEG衍生物是阳离子型聚合物。示例性的官能团包括烷氧基系 列中的任一种，优选C1-C10，芳氧基系列中的任一种，苯基和取代的 苯基。这样的官能团可以在任意的位点结合到HMW PEG分子上，包括 在任一末端或在中间；也包括用于将较小的PEG分子或其衍生物连接 成单个HMW PEG-样化合物的官能团，例如，苯基和它的取代物。而且， 具有另外的官能团的HMW PEG-样分子可以具有一个这样的基团或超过 一个这样的基团；每个分子还可以具有另外的官能团的混合物，只要 这样的分子能用于在输送过程中稳定至少一种治疗剂，或用于治疗、 改善或预防上皮细胞的疾病、障碍或状况。

“培养基”用于指本申请中的一种或多种细胞培养基。可以从每 次使用的上下文中看出该名词的单数或复数。

总的来说，通过适合于待治疗的状况的任何方式，可以施用单独 的或与治疗剂相组合的HMW PEG-样化合物。可以以下述方式输送化合 物：经口服，例如以片剂、胶囊、颗粒、粉末的形式，或用液体制剂， 包括糖浆；通过舌下的、口含的或透皮的输送；通过肠胃外的、皮下 的、静脉内的、肌肉内的或胸骨内的注射或输注(例如，作为无菌注射 含水或非水溶液或悬浮液)；经鼻地，例如通过吸入喷雾剂；直肠地， 例如以栓剂形式；阴道地或尿道地，通过栓剂或灌输，例如，通过套 管插入术，或通过脂质体。可以施用含有无毒的、药学上可接受的介质 或稀释剂的剂量单位制剂。可以以适于立即释放或延迟释放的形式， 施用化合物。利用本领域已知的合适的药物组合物，可以实现立即释 放或延迟释放。

示例性的经口施用的组合物包括：悬浮液，其可以含有例如，用 于成形的微晶纤维素，作为助悬剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增 强剂的甲基纤维素，甜味剂或矫味剂，例如本领域已知的那些；和立 即释放的片剂，其可以含有例如，微晶纤维素，磷酸二钙，淀粉，硬 脂酸镁和/或乳糖和/或其它赋形剂，粘合剂，填充剂，崩解剂，稀释 剂和润滑剂，例如本领域已知的那些。通过舌下和/或口腔施用，例如， 利用模制的、压制的或冷冻干燥的片剂，可以经口输送本发明的化合 物。示例性的组合物可以包含速溶稀释剂例如甘露醇，乳糖，蔗糖， 和/或环糊精。这样的制剂还可以包含赋形剂，例如相对高分子量纤维 素(AVICEL)或聚乙二醇(PEG；GoLytely，3.34kD)；用于辅助粘膜 粘附的赋形剂，例如羟丙基纤维素(HPC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)， 羧甲基纤维素钠(SCMC)，和/或马来酸酐共聚物(例如，GANTREZ)。也 可以加入润滑剂，助流剂、矫味剂、着色剂和稳定剂，以便于制造和 使用。

示例性的经鼻气雾剂或吸入施用的组合物包括溶液，其可以含有 例如，苯甲醇或其它合适的防腐剂，用于增强吸收和/或生物利用度的 吸收促进剂，和/或其它增溶剂或分散剂，例如本领域已知的那些。

示例性的经肠施用的组合物包括溶液或悬浮液，其可以含有例如， 合适的无毒的稀释剂或溶剂，例如甘露醇，1，3-丁二醇，水，林格溶 液，等渗氯化钠溶液，或其它合适的分散剂或润湿剂和助悬剂，包括合 成的单-或二酸甘油酯和脂肪酸，包括油酸。在本上下文中还包括栓剂， 其可以含有例如，合适的无刺激的赋形剂，例如可可脂，合成的甘油酯 或聚乙二醇(例如，GoLytely)。

本领域的普通技术人员，可以确定本发明的化合物的有效量。任 意特定对象的特定剂量水平和给药频率可以变化，且取决于多种因素， 包括使用的特定化合物的活性，代谢稳定性和该化合物的作用长度， 对象的物种、年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，给药模式和 时间，排泄速度，药物联合，和特定状况的严重性。优选的治疗对象 包括处于发生微生物-介导的上皮状况或疾病(例如肠-衍生的脓毒病) 的危险中的动物，最优选哺乳动物例如人，和驯养的动物例如狗，猫， 马等。

下面的实施例例示了本发明的实施方案。实施例1描述了高分子 量PEG提供给肝切除小鼠的对抗肠-衍生的脓毒病的保护。实施例2公 开了HMW PEG如何预防病原体粘附到肠上皮细胞。实施例3揭示了HMW PEG如何总体抑制病原体毒力表达，和更具体地抑制PA-I凝集素/粘 附素表达。实施例4显示，PEG不影响病原体的生长或细胞膜完整性。 实施例5使用原子力显微镜解释了HMW PEG-包被的病原体的独特的地 形学构象。实施例6描述了受HMW PEG影响的细胞-细胞相互作用。 实施例7描述了使用本发明的组合物的预防方法。实施例8公开了监 测HMW PEG的施用的方法，例如在本发明的治疗方法中，和对应的试 剂盒。实施例9描述了在30％肝切除后，HMW PEG-样化合物对抗肠- 衍生的脓毒病的保护作用。实施例10和11公开了HMW PEG-样化合物 在稳定益生治疗剂乳杆菌GG，或LGG(实施例10)和VSL3(实施例11) 的输送中的应用。实施例12解释了使用HMW PEG-样化合物对化学或 生物治疗剂的施用。

实施例1

在30％肝切除后，HMW PEG保护对抗肠-衍生的脓毒病

使用常规方案，麻醉雄性Ba1b/c小鼠，并进行肝切除。沿着松软 下垂的左叶，进行30％不流血的肝切除。对照小鼠接受无肝切除的肝 操作。实验组和对照组各含有7只小鼠。在所有的小鼠中，通过直接 针穿刺，将在盐水、PEG 3.350或PEG 15-20(PEG)中稀释的体积为 200ul的107cfu/ml铜绿假单胞菌PA27853注射进盲肠基部。相对 低分子量PEG可从市场上得到；具有15,000至20,000道尔顿的平均 分子量的PEG 15-20，是共价结合到苯酚环上的PEG 7-8和PEG 8-10 的组合。PEG 7-8具有7,000至8,000道尔顿的平均分子量,PEG 8-10 具有8,000至10,000道尔顿的平均分子量。本领域的技术人员能认 识到，HMW PEG包括具有多种PEG亚基中任何亚基的化合物，其中具 有多种平均分子量中的任一种的每个亚基彼此相连接(优选共价地) 或连接到一种或多种接头分子上，后者是具有适用于PEG分子的连接 的官能团的相对小分子。合适的接头会基本上保留HMW PEG的生物学 活性(保留足够的生物学活性，以实现如本文所公开的有益的预防或治 疗作用)。

为了给持续48小时的实验提供恒定的PEG来源，将针头导入小肠 (回肠)，将1ml盐水、PEG 3.35或PEG 15-20逆行性地注射入近端 的肠中。用缝合丝线系紧穿刺位点，用醇擦洗盲肠。将小鼠返回它们 的笼子，在接下来的48小时只给予H2O。

在图1的小图b中，可以看到PEG 15-20的剂量效应曲线。a.通 过Fisher Exact检验，测定了PEG 15-20的统计学上显著的保护作用 (P＜0.001)。b.测得PEG 15-20的最小保护浓度为5％(P＜0.05)。c. 在30％手术肝切除和直接盲肠注射1×107cfu/ml PA27853后24小 时，盲肠内容物(粪便)、洗过的盲肠粘膜、肝和血液的定量细菌培养。 单向ANOVA证实了肝切除后小鼠盲肠内容物、粘膜、肝和血液中细菌 计数的统计学上显著的增加(P＜0.001)。对于PEG 3350，观察到肝和 血液细菌计数的显著减少(P＜0.05)，而PEG 15-20完全阻止PA27853 向小鼠的肝和血液播散。

铜绿假单胞菌株ATCC 27853(PA27853)是来自血液培养物的非粘 液的临床分离株。在先前进行30％不流血的手术肝切除的小鼠中直接 盲肠注射菌株PA27853，导致临床脓毒病状态，在48小时时没有存活 者。类似地注射了铜绿假单胞菌的接受无肝切除的假剖腹术的小鼠(对 照)，全部存活，没有任何脓毒病的临床征象(图1a)。为了检测PEG 溶液在该模型中预防或降低死亡率的能力，将浓度为1×107cfu/ml 的200ul PA27853，悬浮在两种10％(w/v)聚乙二醇(PEG-3.35和 PEG-15-20)溶液之一中。选择PEG-3.35，因为它代表着在过去25年 中已经用于临床用途的PEG的分子量(Golytely)。相比之下，使用的 根据本发明的PEG溶液具有在15-20kD之间变化的分子量。通过直接 穿刺，将悬浮的菌株导入盲肠。PEG3.35对肝切除后的小鼠的死亡率 没有作用，而PEG 15-20是完全保护性的。实际上，PEG 15-20具有 统计学上显著的保护作用，如通过Fisher Exact检验所测得的 (P＜0.001)。剂量效应实验证实，5％溶液是完全保护性的PEG 15-20 的最小浓度(P＜0.05；见图1b)，尽管本领域的技术人员能认识到，预 期低于5％的HMW PEG溶液会提供一些保护，因而也在本发明的范围内。 关于在实验小鼠和对照小鼠中的细菌计数，单向方差分析(ANOVA)证实 了肝切除后小鼠的盲肠内容物、粘膜、肝和血液中的细菌计数的统计 学上显著的增加(P＜0.001)。对于PEG 3350，观察到肝和血液细菌计 数的显著减少(P＜0.05)，而PEG 15-20完全阻止PA27853向小鼠的肝 和血液播散。PEG 15-20完全抑制了肠PA27853向小鼠的肝和血液的 播散(图1c)。数据表明，PEG溶液的作用涉及非-杀微生物的机理。在 对哺乳动物细胞无毒的PEG浓度(即≤约10％)下，没有表现出对细 菌生长模式的作用。

该实施例证实，HMW PEG能降低接受部分肝切除形式的手术干预 的小鼠中可归因于肠-衍生的脓毒病的死亡率。该小鼠模型指示着，HMW PEG疗法可以用于降低遭受生理应激例如侵入手术(例如，部分肝切除) 的动物物种的死亡率(即降低任何给定生物中的死亡可能性)，例如哺 乳动物，如人。预期当在生理应激后(例如，在术后护理过程中)实施 时，HMW PEG疗法在预防与脓毒病有关的死亡或严重疾病的方法中将 是有效的。而且，可以在生理应激前(例如，术前护理)，在其中应激 的引入是可预测的情况下，使用HMW PEG疗法，以降低严重疾病或死 亡的危险。HMW PEG疗法也可以用于改善与疾病或与肠-衍生的脓毒病 有关的异常状况相关的症状。

实施例2

HMW PEG预防病原体向肠上皮的粘附

紧密连接是在哺乳动物肠道的屏障功能中起关键作用的上皮细胞 细胞骨架的动态成分。铜绿假单胞菌会导致紧密连接通透性的显著改 变，如通过Caco-2细胞和T-84细胞的跨上皮电阻(TEER)所测得的。 Caco-2细胞是被充分表征的人结肠上皮细胞，其在培养中维持稳定的 TEER，且该细胞系能提供肠病原体的体内行为的公认的体外模型。为 了确定PEG对铜绿假单胞菌PA27853-诱导的培养的Caco-2细胞单层 的TEER降低的保护作用，在有10％PEG 3.35或10％PEG 15-20存在 下，将1×107cfu/ml PA27853从顶端接种到2个Caco-2细胞单层 上。连续测量TEER 8小时，记录TEER的最大下降。

只有PEG 15-20显著保护对抗铜绿假单胞菌-诱导的TEER的降低 (图2a)。图2中的数据代表着在顶端暴露于1×107cfu/ml PA27853 的8小时过程中观察到的一式三份培养物(n＝7)的TEER自基线％最大 下降的平均值±SEM。通过单向ANOVA，揭示了TEER的统计学上显著 的降低，如在暴露于PA27853的Caco-2细胞中所证实的(P＜0.001)。 对于PEG 15-20，证实了对PA27853诱导的TEER下降的统计学上显著 的保护作用(P＜0.001)。图2b显示了在有PEG 3.35存在且顶端暴露于 PA27853的情况下的Caco-2细胞。在有PEG 3.35存在下共培养4小 时后，观察到Caco-2细胞单层的破裂，表现出局灶粘附的细菌，细胞 漂浮在单层支架以上30-40微米(图2b)。相比之下，图2c显示了在 有PEG 15-20存在下顶端暴露于PA278534小时的Caco-2细胞的图像， 其在任何检查的平面中没有表现出漂浮细胞的迹象。PEG 15-20对 Caco-2细胞完整性的保护作用，与较少的细菌粘附有关，后者由暴露 于1×106cfu/ml PA278534小时后细胞上清液中的细菌15-倍更高 的回收率所反映。

PEG-培养的人肠上皮细胞对铜绿假单胞菌的屏障破坏作用的抵 抗，如通过TEER的维持所判断的，能提供在面临来自侵入病原体的攻 击时稳定紧密连接的屏障功能的实践途径。PEG 15-20的治疗价值的 其它证据是，该化合物不会影响上皮转换功能(Na+/H+交换，葡萄糖转 运)。

因而，HMW PEG对于肠上皮屏障而言是相对惰性的，且对其具有 稳定作用。本发明包括通过将HMW PEG施用给动物，例如哺乳动物， 且优选人，治疗与肠病原体例如铜绿假单胞菌有关的肠屏障异常的方 法。通过本领域已知的任何诊断技术或其它手段，可以揭示肠屏障异 常。但是，不必需在HMW PEG治疗前鉴别肠屏障异常。与HMW PEG治 疗有关的低成本和高度安全性，使得该方法适用于预防性应用，优选 地针对处于危险中的生物，以及适于应用于表现出肠屏障异常特征性 的至少一种症状的动物的治疗方法。HMW PEG治疗方法能改善与肠屏 障异常有关的症状；优选地，该方法能减少或消除治疗的生物的肠- 衍生的脓毒病的影响。

实施例3

HMW PEG抑制病原体的毒力表达

在肝切除后小鼠的盲肠中，铜绿假单胞菌PA27853中的PA-I凝 集素/粘附素的表达有所增加，且在小鼠肠中铜绿假单胞菌的致死效应 中起关键作用。通过促进PA27853向上皮的粘附，以及通过建立显著 的对细胞毒素(外毒素A和弹性蛋白酶)的屏障缺陷，PA-I在小鼠肠 中起显著的毒力决定因素的作用。转录调节剂RhIR和它的同源激活剂 C4-HSL能调节铜绿假单胞菌中的PA-I表达。不但通过暴露于C4-HSL， 而且通过接触Caco-2细胞，Caco-2细胞膜制品，和来自Caco-2细胞 培养物的上清液，都会增加PA-I在PA27853中的表达。

RNA印迹杂交用于在转录水平分析PA-I的表达。通过改进的三- 去污剂方法，分离铜绿假单胞菌的总RNA。使用PA-I引物： F(ACCCTGGACATTATTGGGTG)(SEQ ID NO：1)，R(CGATGTCATTACCATCG- TCG)(SEQ ID NO：2)和16S引物：F(GGACGGGTGAGTAATGCCTA)(SEQ ID NO：3)，R(CGTAAGGGCCATGATGACTT)(SEQ ID NO：4)，通过PCR产生 了探针，并克隆进pCR2.1载体(Invitrogen，Inc.)。插入物是与PA-I 或16S的序列相匹配的序列。用α32P-dCTP放射性标记了对PA-I和16S 特异性的cDNA探针。通过Storm 860 phosphorimager(Molecular Dynamics，CA)，测量比放射活性，并在PA-I和16S的强度比的基础 上，计算与对照相比的相对百分比变化。使用兔亲和-纯化的多克隆抗 -PA-I抗体，将蛋白印迹用于PA-I蛋白分析。用PBS洗涤1ml铜 绿假单胞菌细胞，并在100℃，在裂解缓冲液(4％SDS，50mM Tris-HCl， pH6.8)中加热；Tricine SDS-PAGE后，通过蛋白的电转移，进行免 疫印迹分析。通过ECL试剂(Amersham，NJ)，检测PA-I凝集素。

铜绿假单胞菌PA27853向1mM数量-感知信号传递分子C4-HSL 的暴露，导致PA-I蛋白表达的统计学上显著的增加(P＜0.001，单向 ANOVA)，后者在有10％PEG 3.35存在下，受到部分抑制，且受到10％ PEG 15-20更大程度的抑制(图3)。PEG 15-20对C4-HSL-诱导的PA-I 表达的最小完全抑制浓度是5％(P＜0.01，单向ANOVA)。对在有和没 有PEG存在下暴露于C4-HSL的各细菌细胞的电子显微镜检查证实， C4-HSL造成了铜绿假单胞菌的形状和菌毛表达的形态学变化(图3b)。 在有PEG 15-20的情况下，完全消除C4-HSL-诱导的形态学作用，但 是在有PEG 3.35存在下不能彻底消除。在暴露于PEG 15-20的PA27853 周围，可以看到晕圈-型效应(图3b)。PA27853向0.1mM C4-HSL的暴 露，导致PA-I mRNA表达的统计学上显著的增加(P＜0.001单向 ANOVA)，如使用RNA印迹所评价的。PA-I表达受到10％PEG 15-20 的极大抑制。图3d表明，PEG 15-20抑制通过暴露于Caco-2细胞4 小时诱导的PA-I mRNA的增加，但是PEG 3.35不能(P＜0.001单向 ANOVA)。

本文所呈现的数据表明，当用10％PEG 15-20预处理细菌时，观 察到100uM-1mM C4-HSL诱导的PA27853中的PA-I表达(蛋白和mRNA) 的显著弱化(3-4倍减少)。用PEG 3.35没有观察到该作用(图3a)。对 于10％PEG 3.35，也观察到C4-HSL-诱导的PA-I表达的弱化，尽管 弱化程度显著低于10％PEG 15-20。能抑制C4-HSL诱导的PA-I蛋白 表达的PEG 15-20的最小浓度是5％(图3b)。对暴露于C4-HSL的各细 菌细胞的电子显微镜检查法证实，C4-HSL造成了PA27853的形状和菌 毛表达的形态学变化(图3b)。在有PEG 15-20存在下，完全消除了 C4-HSL-诱导的形态学作用，但是PEG 3.35不能(图3b)。在有PEG 15-20 存在下，抑制了通过暴露于Caco-2细胞4小时诱导的PA-I表达 (mRNA)，但是PEG 3.35不能(图3b)。在过夜暴露实验中，PEG 15-20 仍然维持对Caco-2细胞-诱导的PA-I表达的保护作用。

HMW PEG也会影响响应已知刺激引起的铜绿假单胞菌的毒力表达。 PA27853中C4-HSL-诱导的PA-I表达的弱化，可能是PEG 15-20的主 要保护作用，鉴于数量-感知信号传递是该病原体毒力表达的确立机 理。预期PEG 15-20-诱导的对Caco-2细胞-诱导的PA-I表达的干扰， 是PEG 15-20的保护作用的重要方面。发现PEG 15-20对宿主动物具 有保护作用，这是通过来自30％肝切除小鼠的滤过的盲肠内容物(粪 便)引起的铜绿假单胞菌(PA27853)PA-I表达的弱化。预期PEG 15-20 防护铜绿假单胞菌免受增加它的毒力表达的宿主因子影响的能力，是 保护生物免于肠-衍生的脓毒病的另一种机理。

因此，本发明包括试剂盒形式的材料和相应的给动物施用HMW PEG 的方法，以预防或治疗特征在于肠病原体(例如一种假单胞菌)表达 毒力因子或决定因素的状况。毒力决定因素可能直接或间接地促成毒 力。间接贡献的实例是，铜绿假单胞菌的PA/I凝集素/粘附素对肠病 原体向肠上皮的粘附的作用，和/或生成对细胞毒素(外毒素A和弹性 蛋白酶)的屏障缺陷。

实施例4

PEG不会影响病原体的细胞生长或细胞膜完整性

通过由SYTO 9和碘化丙啶组成的染色方法，评价了2种PEG溶液 (PEG 3.35和PEG 15-20)对细菌膜完整性的作用。两种PEG溶液对细 菌膜通透性都没有任何作用(图4a)。使用活/死细菌生存力试剂盒 L-3152(Molecular Probes)，测定膜完整性。通过涂布在不同的培养 时间取的样品的10-倍稀释液，对细菌定量，并将计数表达为cfu/ml； 在含有两种PEG溶液之一的TSB培养基中过夜生长的铜绿假单胞菌的 生长曲线，证实两种PEG溶液对细菌数量都没有抑制作用(图4b)。实 际上，在每种含有PEG的培养基中的生长模式，与在没有PEG的TSB 培养基中的生长模式不可区分。在生长的指数期和静止期过程中的不 同时间点，测量参与能量代谢的持家酶-乳酸脱氢酶(LDH)的活性。使 用来自CytoTox 96(Promega)的底物混合物，在偶联的黄递酶酶测定 中，测量LDH活性。使用BCA蛋白测定(Pierce)，检测蛋白浓度。没 有观察到在有PEG存在下生长的铜绿假单胞菌的无细胞上清液中LDH 活性的变化。该实验的结果表明，HMW PEG对细菌生长模式具有可忽 略的作用。

本发明的方法，和对应的产品(例如，试剂盒)，能提供预防或治 疗与肠-衍生的脓毒病有关的疾病或异常状况的益处，而不显著影响肠 内菌群的组成。类似地，本发明的方法和产品可以用于改善与这样的 疾病或异常状况有关的症状，而不显著改变肠的微生物组成。本领域 的技术人员会认识到，不显著扰乱肠菌群的组成的方法(和试剂盒)是 合乎需要的，因为预期这样的方法不会导致由这样的扰乱引起的继发 健康并发症。

实施例5

PEG-包被的病原体的原子力显微镜检

在有或没有10％HMW PEG的情况下，在37℃，在胰胨豆胨培养液 (TSB)中，继代培养过夜生长的PA27853培养物的1％等分试样4小时。 每种继代培养物取一滴，用PBS充分洗涤铜绿假单胞菌PA27853细胞， 在吹风中在云母上干燥10分钟，并立即成像。使用多模式纳秒示波 器IIIA扫描探头显微镜(MMAFM，Digital Instruments)，在空气中 用轻打-模式AFM进行干燥细菌的成像。用10％HMW PEG处理亚汇合 的Caco-2细胞4小时，并用PBS充分洗涤。不使用O-形环，在PBS 中进行细胞的AFM成像。对于电子显微镜检查法，将PA27853接种到 含有或没有1mM C4-HSL和10％HMW PEG的TSB中，过夜培养。用醋 酸双氧铀将一滴1％铜绿假单胞菌染色，并用0.5M NaCl洗涤，然后 在电子显微镜下检查。

Caco-2细胞的原子力显微镜检证实了具有刷状缘微绒毛的经典 的不均匀的表面，而暴露于PEG 3.35的Caco-2细胞表现出上皮细胞 表面上的光滑平面外观(图5a，c)。通过填充沿着地形学上限定的平 面的不对称，PEG 15-20似乎覆盖Caco-2细胞(图5e)，产生更复杂的 地形学上限定的覆盖物。以几分类似的方式，暴露于PEG 3.35的 PA27853细胞表现出聚合物以弥散扁平模式光滑包被到细菌细胞的模 式(图6d)，而PEG 15-20似乎以地形学上更不匀称的方式，在周围围 绕和紧抱细菌。PEG 15-20中的细菌直径的原子力测量的横断面分析 证实了PEG溶液中细菌/PEG外膜的显著增加(图5e，f)。换而言之， PEG 3.35在各细菌细胞周围形成光滑的外膜(图5e)，而PEG 15-20 紧拥各细胞(图5f)，并增加聚合物/细菌直径(图5g，5h)，从而使各 细菌细胞彼此远离。

不希望受理论的约束，HMW PEG可以仅仅通过使铜绿假单胞菌物 理上远离肠上皮而发挥它的有益作用。或者，HMW PEG可以通过阻止 由病原细胞的细胞-细胞相互作用引起的致病性数量-感知激活信号的 形成而提供益处。同样不希望受理论的约束，用HMW PEG包被生物学 表面，可能导致包被PEG链的构象自由度的丧失和接近蛋白的排斥。 HMW PEG和Caco-2细胞之间的极性-极性相互作用，可影响PEG链的 弹性，将某些HMW PEG侧链限制为排斥蛋白的分子结构。本文所示的 数据支持下述结论，即HMW PEG-包被的Caco-2细胞比未包被的Caco-2 细胞更排斥铜绿假单胞菌，可能是由于HMW PEG与Caco-2细胞的一些 动态相互作用导致的″构象熵″的丧失。

该实验的结果确立了，HMW PEG处理对经处理的细胞有作用，显 著地影响这样的细胞的表面拓扑学。而且，HMW PEG暴露对这样的细 胞的作用，不同于PEG 3.35对这样的细胞的作用。尽管不希望受理论 的约束，本文公开的结果确实提供了HMW PEG与低分子量PEG(例如 PEG 3.35)相比表现出的对细胞的显著不同的作用的物理关联。

实施例6

HMW PEG影响细胞-细胞相互作用

为了直接观察PEG溶液对铜绿假单胞菌的空间定向的作用，用携 带编码绿色荧光蛋白的egfp基因的铜绿假单胞菌PA27853/EGFP的活 菌株，进行实验。在有和没有Caco-2细胞的情况下，进行实验。为了 将PEG对细菌和它们与培养的上皮的相互作用的影响显像，使用差动 干扰对比(DIC)显微镜和GFP成像。

使用pBI-EGFP质粒(Clontech)作为模板，扩增编码绿色荧光蛋白 的EGFP基因。使用引物TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(SEQ ID NO： 5)和GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(SEQ ID NO：6)，导入XbaI和 PstI限制位点。使用TA-克隆试剂盒(Invitrogen)，将PCR产物直接 克隆进pCR2.1载体，然后将pCR2.1/EGFP构建体转化进大肠杆菌 DH5a。通过XbaI和PstI消化，将EGFP基因切离该构建体，并将含有 切离的基因的片段克隆进已经用相同限制酶消化的大肠杆菌-铜绿假 单胞菌穿梭载体pUCP24。在25uF和2500V，将得到的在穿梭载体 中含有EGFP基因的构建体(即pUCP24/EGFP)，电穿孔进PA27853电- 感受态细胞。在含有100ug/ml庆大霉素(Gm)的LB-琼脂平板上，选 择含有PA27853/EGFP的细胞。

在含有100ug/ml Gm的LB中，过夜培养携带PA27853/EGFP的细 胞，使用1％培养物，接种含有50ug/ml Gm的新鲜LB。生长3小时 后，将异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)加至0.5mM的终浓度， 将培养物另外培养2小时。将100ul细菌培养物与1ml含有10％胎 牛血清(HDMEM HF)和10％HMW PEG且用HEPES缓冲的HDMEM培养基 (Gibco BRL)相混合。将1ml细菌悬液倒入0.15 mm-厚dTC3培养皿 (Bioptech)。在含有或没有HMW PEG的HDMEM HF中，将在0.15mm- 厚dTC3培养皿(Bioptech)中在HDMEM HF中生长的4天龄的Caco-2 细胞(p10-p30)洗涤1次。将1ml如上制备的细菌悬液加入含有 Caco-2细胞的dTC3培养皿。以63X物镜放大率，使用具有DIC和GFP 荧光滤光镜的Axiovert 100 TV荧光倒置显微镜，直接观察dTC3培 养皿中细菌细胞的分散模式。用Bioptechs恒温温度控制系统，调节 温度。钨丝灯(100V)用于DIC和GFP激发。使用GFP滤光镜，使用来 自Intelligent Imaging Innovations的3D成像软件(Slidebook)， 对Z平面中的细菌细胞分散模式成像。在DIC图像(图6a1)和Z平面 重建(图6a2)上，观察到没有Caco-2细胞的培养基中均匀分散的浮游 铜绿假单胞菌细胞。在有Caco-2细胞存在下，细菌细胞形成成团外 观(图6b1)，并发现其粘附到Caco-2细胞上(图6b2)。10％PEG 3350 的溶液减少细菌的运动性，并诱导粘附到孔底部(图6c2)的蘑菇状的 细菌小菌落(图6c1)立即形成。在有Caco-2细胞存在下，细菌小菌落 是在上皮细胞平面以上约8微米(图6d1，2)。10％PEG 15-20的溶液 极大地减少铜绿假单胞菌细胞的运动性。然而，对于在含有PEG 15-20 的培养基中温育的前0.5-1小时，细菌细胞形成蜘蛛腿状的小菌落， 其接近孔的底部(图6e1，2)。在几小时内，蜘蛛腿状的小菌落占据培 养基的整个空间/体积。在有Caco-2细胞存在下，铜绿假单胞菌细胞 丧失蜘蛛腿样结构，发现其升高高于上皮平面以上(30-40微米)(图 6f1，2)。

为了确定细菌-上皮细胞相互作用的三维空间定向，进行Z平面重 建。图像证实，取决于Caco-2细胞的存在与否，两种PEG溶液对铜绿 假单胞菌的成团行为具有不同的作用，且有差别地影响细菌的空间定 向。在只有培养基的实验中，观察到铜绿假单胞菌显示出均匀分散的 模式(图6a)。但是，在有Caco-2细胞存在下检查的细菌细胞形成了 成团的外观，且发现其在孔底部邻近上皮细胞平面(图6b)。在只有PEG 3.35存在下检查的细菌细胞形成了大块聚集体，并保留在培养孔的底 部(图6c)，而在含有PEG 3.35的培养基中有Caco-2细胞检查的细菌 细胞，保持悬浮在上皮细胞平面以上(约8微米)，维持它们成团的外 观(图6 d)。在只有PEG 15-20存在下检查的细菌细胞表现出均匀的 微团模式(图6e)，而在含有PEG 15-20的培养基中在Caco-2存在下 检查的细菌细胞以成团的结构悬浮在高于上皮平面以上(约32微米) (图6f)。在同步实验中，观察到PEG 3.35减少细菌运动性，PEG 15-20 程度更大。

以与实施例5公开的实验相类似的方式，本实施例提供了观察到 的HMW PEG对细胞-细胞相互作用的影响的物理关联，这与本文公开的 它的有益的预防和治疗活性相一致。预期HMW PEG的应用会减少或消 除肠中有害的细胞-细胞相互作用(例如，肠上皮细胞和肠病原体例如 假单胞菌之间)，降低与肠-衍生的脓毒病有关的疾病和/或异常状况的 危险。

实施例7

预防疾病/异常状况的方法

本发明还提供了预防人和其它动物尤其是其它哺乳动物的多种疾 病和/或异常状况的方法。在这些方法中，将有效量的HMW PEG施用给 有此需要的人患者或动物对象。可以使用通过本领域已知的常规优化 程序确定的施用方案，施用PEG。优选地，PEG具有5,000-20,000道 尔顿的平均分子量，更优选地，10,000-20,000道尔顿。预期施用至 少5％HMW PEG。可以以任何合适的形式，例如，作为溶液，作为凝胶 或乳霜剂，作为适用于喷雾的溶液(例如，用于吸入应用)，在包含 HMW PEG的药物组合物中，和在适于注射进动物的无菌等渗溶液中， 施用HMW PEG。可以使用任何常规途径，完成施用；特别地预期，经 口地或局部地(例如，透皮地)施用HMW PEG。在有些实施方案中，施 用的HMW PEG组合物还包含选自下述的化合物：葡聚糖-包被的L-谷 氨酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，低聚果糖，N-乙 酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。在另一 个实施方案中，施用的HMW PEG组合物还包含葡聚糖-包被的L-谷氨 酰胺，葡聚糖-包被的菊粉，葡聚糖-包被的丁酸，一种或多种低聚果 糖，N-乙酰基-D-半乳糖胺，葡聚糖-包被的甘露糖，半乳糖和乳果糖。

本发明提供了预防多种疾病和异常状况的方法，例如游泳耳病， 急性或慢性中耳炎，呼吸器相关性肺炎，肠-衍生的脓毒病，坏死性小 肠结肠炎，抗生素-诱导的腹泻，假膜性结肠炎，炎性肠病，易激性肠 病，中性粒细胞减少性小肠结肠炎，胰腺炎，慢性疲乏综合征，生态 失调综合征，镜下结肠炎，慢性泌尿道感染，性传播疾病，和感染(例 如，暴露于被生物恐怖因子污染的环境，所述生物恐怖因子例如炭疽 芽孢杆菌，天花病毒，肠致病性大肠杆菌(EPEC)，肠出血性大肠杆菌 (EHEC)，肠聚集性大肠杆菌，(EAEC)，艰难梭菌，轮状病毒，铜绿假 单胞菌，粘质沙雷菌，产酸克雷伯氏菌，阴沟肠杆菌，白色念珠菌， Candida globrata，等)。在预防慢性泌尿道感染或治疗这样的感染的 方法的一个优选的实施方案中，以膀胱冲洗剂的形式，输送HMW PEG。 对于性传播疾病预防，本发明的组合物优选地用于润滑避孕套。在预 防生物恐怖因子感染的方法的一个优选的实施方案中，以凝胶或乳霜 剂、适于局部应用的形式，提供根据本发明的组合物。预期这样的局 部应用可以用于预防与任何生物恐怖因子有关或与威胁人或动物的存 活、健康或舒适的多种化学的或物理化学的因子有关的多种疾病/异常 状况。这样的化学的或物理化学的因子包括能烧灼或以其它方式伤害 皮肤的那些因子，其在本发明的组合物中变得无活性或微溶。

在预防方法的一个实施方案中，麻醉雄性Ba1b/c小鼠，通过直接 针穿刺，将水性的5％PEG 15-20溶液注射进盲肠基部。为了给持续 48小时的实验提供恒定的PEG来源，将针头导入小肠(回肠)，将1ml PEG 15-20逆行性地注射进近端的肠中。用缝合丝线系紧穿刺位点， 用醇擦洗盲肠。将小鼠返回它们的笼子，只给予H2O。48小时后，对 小鼠进行常规的肝切除操作，包含沿着松软下垂的左叶行30％不流血 的肝切除。对照小鼠经历无肝切除的肝操作。预期包含HMW PEG的施 用的预防性治疗，会减少或消除小鼠中手术-有关的肠-衍生的脓毒病 的发生率。

这些方法不仅仅适用于小鼠、豚鼠、狗和猫等宠物和牛、马、山 羊、绵羊、猪、鸡、火鸡、鸭、鹅等农业上重要的动物和任何其它家 养的动物的预防性护理。而且，预期这些预防方法还适用于人，提高 许多患者或处于发生疾病和/或异常状况的危险中的候选者的健康和 预期寿命，例如游泳耳病，急性或慢性中耳炎，呼吸器相关性肺炎， 肠-衍生的脓毒病，坏死性小肠结肠炎，抗生素-诱导的腹泻，假膜性 结肠炎，炎性肠病，易激性肠病，中性粒细胞减少性小肠结肠炎，胰 腺炎，慢性疲乏综合征，生态失调综合征，镜下结肠炎，慢性泌尿道 感染，性传播疾病，和感染因子(例如，生物恐怖组合物)，其包括但不 限于，炭疽和天花。如上所述，预防方法包括，通过任何已知的或常 规的施用途径，将包含至少5％HMW PEG(5-20kD)的组合物施用给人 或另一种动物。优选地，对处于发生一种或多种前述疾病和/或异常状 况的危险中的那些个体，实施该预防方法，但是预期本发明的组合物 和方法可以用于预防或治疗用途，以广泛地治疗或预防人或其它动物 的整个种群或亚种群的这样的疾病或异常状况。

实施例8

监测HMW PEG的施用的方法。

本发明也包括监测HMW PEG的施用的方法，例如，在治疗方法中。 在这样的监测方法中，单独地或与未标记的HMW PEG相组合，施用标 记的HMW PEG，在连续的或间歇的治疗方案过程中，检测该标记，包 括简单的终点测定。术语“标记的”HMW PEG指，标记或可检测的化 合物直接或间接结合到HMW PEG上，或HMW PEG结合到能将标记与HMW PEG相关联的报告化合物上(当然，本发明也包括未结合HMW PEG或设 计用于与其相关联的标记，如下所述)。使用本领域已知的任何可检测 的标记，标记HMW PEG，并将PEG标记至足以检测它的水平。本领域 的技术人员能认识到，该水平随标记和检测方法而异。使用常规优化 方案，本领域的技术人员能优化标记程度。通过在使用中和优选地在 保藏中稳定的非共价键或共价键，将标记化学结合到HMW PEG上。优 选共价结合到HMW PEG上的标记。调节标记结合的密度，以基本上保 持HMW PEG的生物学活性(保持足以实现本文公开的有益的预防或治疗 作用的生物学活性)。典型地，这通过调节HMW PEG：标记比来实现， 如本领域已知的。鉴于HMW PEG平均分子的相对大小，预期多种标记 适用于结合到HMW PEG上，且基本上保持其生物学活性。

本发明预期本领域已知的那些标记，包括放射性标记、生色团、 荧光团和报告分子(包括能催化可检测的化合物的生成的酶，和结合配 偶体例如能将可检测的化合物定位在报告分子附近的抗体)。示例性的 酶报告分子包括发光系统的酶组分和比色反应的催化剂。更具体地， 示例性的报告分子包括生物素，抗生物素蛋白，抗生物素蛋白链菌素， 和酶(例如，辣根过氧化物酶，萤光素酶，碱性磷酸酶包括分泌的碱性 磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶；β-葡糖醛酸糖苷酶；氯霉素乙酰 基转移酶)。这样的报告分子的使用，是本领域的技术人员众所周知的， 且记载在，例如，美国专利号3,817,837，美国专利号3,850,752，美 国专利号3,996,345，和美国专利号4,277,437。示例性的可以被报告 酶转化成可检测的化合物的酶底物，包括5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D- 吡喃半乳糖苷或Xgal，和Bluo-gal。酶底物，作为能转化成可检测的 化合物的化合物，在某些实施方案中也可以是标记，如本领域会理解 的。教导标记和它们的应用的美国专利包括美国专利号3,817,837； 美国专利号3,850,752；美国专利号3,939,350和美国专利号 3,996,345。示例性的放射性标记是3H，14C，32P，33P，35S，和125I；示 例性的荧光团是荧光素(FITC)，罗丹明，Cy3，Cy5，水母发光蛋白， 和绿色荧光蛋白。优选的标记是荧光团例如荧光素。

本发明的监测方法也可以包含超过一种标记。在一个实施方案中， 一种标记用于鉴别处理后或处理过程中HMW PEG的位置，而第二种标 记是对一种或多种微生物特异性的，其程度是该标记可检测地与至少 一种微生物相关联。例如，监测方法可以包括以基本上保持HMW PEG 的生物学活性的方式结合到HMW PEG上的荧光素，和用于检测原核生 物-特异性的β-半乳糖苷酶活性的游离的(即未结合的)Xgal或 bluo-gal。荧光素会定位HMW PEG，而有色的(蓝色)产物指示着代谢 乳糖的原核微生物例如假单胞菌的存在。本发明也包括监测方法，其 中单个标记提供该信息(即HMW PEG的位置和指示微生物的存在)。

在本发明的监测方法中，可以使用本领域已知的任何检测技术。 几个因素会影响选择的检测技术，包括标记的类型，进行监测的生物 材料(例如，皮肤的表皮细胞、耳道或肠；粪便，粘液或组织样品)， 需要的分辨水平，是否需要定量等。合适的检测技术包括简单地用肉 眼目检，用装置目检，所述装置例如内窥镜，其任选地配有合适的光 源和/或记录摄像机；盖氏计数器的常规应用，x-射线底片，闪烁计数 器等，和本领域已知的任何其它检测技术。

技术人员能认识到，本发明的监测方法可以用于优化治疗方法。 例如，监测方法可以用于优化输送给上皮细胞的HMW PEG的数量和/ 或浓度(例如，以达到需要的HMW PEG溶液或混合物的粘度)，所述上 皮细胞例如耳道的上皮细胞，以预防或治疗游泳耳病。作为其它实例， 通过内窥镜检查暴露于标记的HMW PEG的肠道或通过监测粪便样品， 可以促进对肠治疗的优化。

本发明的监测方法包括检测能粘附到肠上皮细胞上的微生物的粪 便测定，包括接触微生物和肠上皮细胞，并使用本领域已知的任何技 术，检测微生物向上皮细胞的粘附。在一个优选的实施方案中，将肠 上皮细胞固定化在合适的表面上，例如微量滴定孔的底部和/或侧面。 在另一个优选的实施方案中，在检测步骤之前或过程中，加入直接标 记或间接标记，例如能产生可检测的产物的报告分子。监测方法还可 以包括游离标记的加入。例如，将游离的Bluo-gal加入怀疑含有代谢 乳糖的原核微生物的样品中；如果存在，微生物酶β-半乳糖苷酶会剪 切Bluo-gal，产生可检测的蓝色产物。

在一个实施方案中，使用常规技术，将商业上可得到的肠上皮细 胞(例如，Caco-2细胞，ATCC HTB 37，和/或IEC-6细胞，ATCC CRL 1952) 固定到微量滴定培养皿的孔中。收集粪便样品，并与液体例如磷酸盐 缓冲盐水相混合。得到含有悬浮微生物的混合物液相(例如，通过合适 的过滤(即将流体悬浮液中的大固体与细菌相分离)，倾析等)，并在 PBS中1∶100稀释。将Bluo-gal加入活微生物悬浮液。在24℃，将微 生物悬浮液加入微量滴定孔1小时，然后用合适的流体(例如，PBS) 洗涤孔，以去除未结合的微生物。检测未结合的和/或结合到固定化的 上皮细胞上的微生物，例如，通过偏振光显微镜检查计数。在替代实 施方案中，使用免疫测定来检测粘附，其中合适的免疫学试剂是微生 物-特异性的单克隆或多克隆抗体，其任选地结合到标记上，例如放射 性标记，荧光团或生色团。

本领域的技术人员能认识到肠上皮细胞和微生物都不需要固定 化，尽管这样的固定化可能有利于精确检测微生物向上皮细胞的粘附。 例如，在一个实施方案中，使固定化的粪便微生物接触未固定化的肠 上皮细胞。而且，技术人员能认识到，可以使用本领域已知的任何合 适的流体，来得到微生物悬浮液，其中优选的流体是任何已知的等渗 缓冲液。另外，如上所述，可以用任何已知的标记来检测细胞粘附。

在一个有关的方面，本发明提供了用于测定微生物细胞粘附的试 剂盒，其包含上皮细胞和关于测定微生物细胞向上皮细胞的粘附的方 案说明书。该方案说明书描述了已知的检测微生物的方法。优选的试 剂盒包含肠上皮细胞。本发明的其它试剂盒还包含标记，例如荧光团 或报告分子。

本发明包括的另一种监测方法是关于微生物疏水性的测定。在该 方法中，使用任一种常规技术，测定微生物细胞的相对或绝对疏水性。 示例性的技术包含将任何微生物暴露于疏水相互作用色谱，如本领域 已知的。Ukuku等，J.Food Prot.65：1093-1099(2002)，其在本 文中整体引作参考。另一种示例性的技术是任何微生物的非极性∶极性 流体分配(例如，1-辛醇∶水或二甲苯∶水)。见Majtan等，Folia Microbiol(Praha)47：445-449(2002)，其在本文中整体引作参考。

在用于监测PEG施用的疏水性测定的一个实施方案中，将粪便样 品悬浮在含有0.15M NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)中。通 过离心收集悬浮液中的微生物，并重新悬浮在相同的缓冲液中，重复 该离心-重新悬浮循环。如果可行，将微生物重新悬浮在相同的缓冲液 中，至在660nm为0.4的吸光度，这允许通过分光光度计监测，无需 使用标记的PEG。用二甲苯处理微生物悬浮液(2.5∶1，v/v，Merck)， 激烈搅拌悬浮液2分钟，将悬浮液在室温静置沉降20分钟。然后测定 水相中是否存在微生物，例如通过分光光度计测定在660nm的吸光度。 使用含有磷酸钠缓冲液的空白消除背景。

在从粪便样品得到在这些方法中使用的微生物细胞时，优选地， HMW PEG相对不溶于用于得到微生物悬浮液的流体和用于稀释微生物 悬浮液的任何流体。

本发明还提供了用于执行包含测定微生物疏水性的监测方法的试 剂盒，其包含肠上皮细胞和描述微生物疏水性的测定的方案说明书。 优选的试剂盒包括肠上皮细胞。相关的试剂盒还包含标记，例如荧光 团或报告分子。

此外，本发明提供了监测方法，其包含得到肠菌群的样品和检测 PA-I凝集素/粘附素活性。可以使用本领域已知的检测PA-I凝集素/ 粘附素活性的任何技术。例如，可以使用能特异性地识别PA-I凝集 素/粘附素的抗体(多克隆、单克隆、抗体片段例如Fab片段，单链， 嵌合体，人源化的或本领域已知的任何其它形式的抗体)，检测PA-I 凝集素/粘附素。免疫测定采取本领域已知的任何免疫测定格式的形 式，例如，ELISA，蛋白印迹，免疫沉淀等。或者，可以检测PA-I凝 集素/粘附素的碳水化合物-结合能力，或可以测量PA-I凝集素/粘附 素的肠上皮屏障攻破活性，例如，通过在暴露于样品之前和/或过程中， 监测上皮层的跨-上皮电阻或TEER。在有关的试剂盒中，本发明提供了 PA-I凝集素/粘附素结合配偶体和关于检测PA-I凝集素/粘附素活 性(例如，结合活性)的方案说明书。根据本发明的其它试剂盒包括已 知能结合PA-I凝集素/粘附素的任何碳水化合物和关于检测PA-I凝 集素/粘附素活性(例如，结合活性)的方案说明书。

实施例9

使用HMW PEG-样化合物治疗肠-衍生的脓毒病

麻醉雄性Ba1b/c小鼠，进行30％手术肝切除，并通过直接针穿 刺，将在盐水、PEG 3.350(10％w/v)或单甲氧基PEG 15-20(mPEG)(10％ w/v)中稀释的200ul 107cfu/ml铜绿假单胞菌PA27853注射进盲肠 基部，进行攻击，都如实施例1所述。通过将相关的针头导入小肠(回 肠)提供盐水、LMW PEG和HMW mPEG的恒定来源，将1ml盐水、PEG 3.35或HMW mPEG逆行性地注射进近端的肠中。用缝合丝线系紧穿刺 位点，用醇擦洗盲肠。将小鼠返回它们的笼子，在接下来的48小时只 给予H2O，所有都根据以上实施例1所述的方法。

预期结果与使用HMW PEG(15-20kD)得到的结果类似，见图1 和实施例1。使用Fisher Exact检验，确定任何保护作用的统计学显 著性(P＜0.001)。

本领域的技术人员能理解，任意的HMW PEG-样化合物都适用于测 定针对手术干预例如30％肝切除后发生的肠-衍生的脓毒病的保护作 用。可以将具有统计学上显著的保护作用的那些化合物，如通过 Fisher Exact检验(P＜0.0001)所揭示的，容易地鉴别为根据本发明的 化合物。作为对照，可以进行盲肠内容物、粘膜、肝和血液中的细菌 计数的单向ANOVA，以确保在没有HMW PEG-样化合物的情况下进行手 术和铜绿假单胞菌攻击的生物的盲肠内容物、粘膜、肝和血液中的细 菌计数表现出统计学上显著的增加(P＜0.001)。在测定中可以包含的 另一个对照是，对一些生物进行“假”操作，例如在经历肝切除的实 验生物的情况下的假剖腹术。预期根据本发明的HMW PEG-样化合物会 产生肝和血液细菌计数的统计学上显著的降低(P＜0.05)，优选地会预 防可检测水平的病原体的任何播散。而且，在这样的测定中，可以使 用对肠-衍生的脓毒病敏感的任何生物，且将生物置于发生肠-衍生的 脓毒病的危险中的事件，可以是已知与增加的肠-衍生的脓毒病危险相 关联的任何事件，例如包含或多或少肝丧失的手术肝切除，其它手术 操作或完全其它事件，只要已知这样的事件与增加的肠-衍生的脓毒病 危险相关联。预期在生理应激后(例如，在术后护理过程中)实施时， HMW PEG-样疗法在预防与脓毒病有关的死亡或严重病的方法中将有 效。而且，在应激的导入是可预见的情况下，可以在生理应激前(例如， 术前护理)，使用HMW PEG-样疗法，以降低严重病或死亡的危险。HMW PEG-样疗法也可以用于改善与肠-衍生的脓毒病有关的疾病、障碍或异 常状况的相关症状。

实施例10

HMW PEG-样化合物稳定乳杆菌GG(一种益生菌治疗剂)的输送

来自益生微生物乳杆菌GG(LGG)的条件培养基会诱导肠上皮细胞 中细胞保护性热休克蛋白hsp 25和hsp 72的表达。见2004年4月 20日提交的名称为“Cytoprotective Factors Derived from Probiotic and Commensal Flora Microorganisms”、发明人为Eugene Chang和Elaine Petrof的临时美国专利申请号___________(代理人卷 号27373/40049)，其在本文中整体引作参考。研究了治疗性条件培养 基的输送，以确定在有HMW PEG-样化合物存在下的施用是否会产生任 何改善。

为了本实施例所述的实验，将HMW PEG(15-20kD)用作HMW PEG- 样化合物，YAMC(年轻成年小鼠结肠)细胞是测定的对象。YAMC细胞 是一种有条件地永生化的小鼠结肠上皮细胞系，其源自在MHC II类启 动子的干扰素-γ敏感部分控制下表达温度敏感性SV40大T抗原 (tsA58)的转基因的Immortimouse。该细胞是R.Whitehead博士 (Vanderbilt University，Nashville，TN)的慷慨赠品。本领域的技 术人员能认识到，可以使用其它可容易地得到的非终末分化的肠细胞 替代YAMC细胞。在允许的条件(33℃)下，将YAMC细胞维持在添加了 ITS+Premix(BD Biosciences，Bedford，MA)的含有5％(v/v)胎牛 血清，5U/ml鼠干扰素-γ(IFN-γ；GibcoBRL，Grand Island，NY)， 50ug/ml链霉素，50U/ml青霉素的RPMI 1640培养基中。在非允许 的(非转化的)条件下，在37℃，在没有干扰素-γ(IFN-γ)的情况下， 这些细胞经历分化，并形成成熟的上皮细胞功能和性质，包括紧密连 接形成，极性，微绒毛顶膜，和运输功能。

以2.5×105/60mm组织培养皿的密度，平板接种细胞。在33℃ 生长24小时以允许细胞贴壁后，将培养基替换为没有IFN的培养基， 将细胞转移到37℃(非允许的条件)24小时，允许分化的结肠细胞 表型的形成。用LGG条件培养基(1∶10稀释，或600ul)处理细胞过夜， 或本文所述的其它条件，然后裂解，进行蛋白印迹分析。

处理后，洗涤细胞2次，然后在冰冷的HBS(150mM NaCl，5mM KCl， 10mM HEPES pH7.4)中刮擦。沉淀细胞(14,000xg，20秒，室温)， 然后重新悬浮在冰冷的裂解缓冲液[10mM Tris pH7.4，5mM MgCl2， 50U/ml DNA酶和RNA酶，加有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)]中。使用双金鸡纳 酸方法，确定蛋白浓度。加入3X Laemmli终止缓冲液后，将样品加热 至75℃5分钟，然后在-80℃保藏，在1周内使用。

为了蛋白印迹分析，在12.5％SDS-PAGE上分辨20微克蛋白/泳 道，并在1XTowbin缓冲液(组成：25mM Tris，192mM甘氨酸，pH8.8， 15％vol/vol甲醇)中，转到PVDF膜(Polyscreen，Perkin-Elmer NEN， Boston，MA)上，如本领域已知的。在室温，在TBS-Tween(含有0.05％ (v/v)Tween 20的Tris-缓冲的盐水(150mM NaCl，5mM KCl，10mM Tris， pH7,4))中的5％(w/v)脱脂乳中，封闭膜1小时。将一抗加入 TBS-Tween，并在4℃与特异性的抗-hsp 25抗体(SPA801，Stressgen， Victoria，BC，Canada)，抗-hsp 72抗体(SPA 810，Stressgen)，或 抗-hsc 73抗体(SPA 815，Stressgen)温育过夜。然后，在室温，在 TBS-Tween中洗涤印迹5次，每次10分钟，再在室温与过氧化物酶- 缀合的二抗(Jackson lmmunoresearch Labs，Inc.Fort Washington， PA)温育1小时。然后，在TBS-Tween中洗涤膜(5次×10分钟)， 最后在TBS(无Tween)中洗涤。根据生产商的说明书，用增强的化学 发光系统ECL试剂(Supersignal，Pierce，Rockford，IL)，使印迹 可视化，并显色。

初步的结果证实，单独的HMW PEG不能在肠上皮细胞中诱导热休 克蛋白表达(图7，泳道2)，且LGG处理之前的HMW PEG处理显示出会 阻断用LGG处理通常会看到的hsp表达的诱导，如果它在LGG之前施 用(比较图7的泳道3和4)。相反地，在HMW PEG之前施用LGG，导 致与单独的LGG无异的hsp表达(对比泳道3和5)，表明HMW PEG如 果在LGG之后施用则不抑制hsp表达的诱导。

然后，使用多种不同比例的LGG+HMW PEG混合物，处理肠上皮细 胞，以确定该组合是否会导致更强烈的热休克蛋白反应，并确定需要 的最佳组合。数据表明，1∶1比例的LGG∶HMW PEG(图7，泳道7)和1∶1.5 比例(图7，泳道10)，是能导致最强烈的热休克蛋白表达的2种组合。 实际上，后一种组合产生甚至比热应激更强烈的信号，所述热应激是 通常用于刺激热休克蛋白产生的金标准(对比图7的泳道9和10)。

本领域的技术人员能认识到，可以改变治疗剂(例如，LGG条件 培养基)与HMW PEG-样化合物的比例，且这样的变化在本发明的范围 内。当然，也可以改变特定的HMW PEG-样化合物，在使用前测定给定 的HMW PEG-样化合物的功效。尽管HMW PEG和HMW mPEG是目前优选 的化合物，预期许多种类的HMW PEG-样化合物可以用于本发明中。另 外，由于已经揭示LGG的细胞保护性化合物存在于条件培养基中，技 术人员可以使用众多常规技术中的任一种，取得活性化合物的更纯制 品，在本发明的范围内包括，HMW PEG-样化合物可以用于这样的制品 的施用。例如，本发明包含源自LGG的热-稳定的、酸-稳定的且大小小 于10kD的蛋白或肽治疗剂，其在有HMW PEG-样化合物存在下施用。 更一般地，预期HMW PEG-样化合物可以用于许多种类的益生治疗剂的 施用中，包括完整的微生物以及条件培养基，部分地纯化的制品，纯 化成均匀同质的制品，和化学合成的产物。根据本发明的HMW PEG-样 化合物也可以用于输送具有广泛范围的结构(例如，肽，蛋白，小分子 效应物等)和治疗作用的非-益生治疗剂。

实施例11

HMW PEG-样化合物稳定VSL#3(一种益生治疗剂)的输送

已经显示，来自益生微生物混合物VSL#3(VSL Pharmaceuticals，Inc.，Gaithersburg，MD)的条件培养基通过诱导 热休克蛋白hsp 25和hsp 72的表达，和通过抑制IκBα(包括磷酸化 的IκBα)的降解，可能是通过它对细胞例如上皮细胞内的某些蛋白酶 体活性的选择性作用(抑制胰凝乳蛋白酶-样活性，轻微抑制半胱天冬 酶-样活性，无可检测抑制胰蛋白酶-样活性)，影响肠上皮细胞。结果， VSL#3影响经受NFκB基因表达调控的基因的表达。见2004年2月6 日提交的临时美国专利申请号60/542,725和2004年4月20日提交的 名称为“Cytoprotective and anti-Inflammatory Factors Derived From Probiotic and Commensal Flora Microorganisms”、发明人 为Eugene Chang和Elaine Petrof的临时美国专利申请号 (代理人卷号27373/40027)，每一篇在本文中整体引作参考。研究了 治疗性条件培养基的输送，以确定在有HMW PEG-样化合物存在下的施 用是否会产生任何改善。

使用作为HMW PEG-样化合物的HMW PEG，来自VSL#3的条件培养 基和YAMC细胞，进行本文所述的实验。

YAMC细胞的生长，IFNγ的添加，在非允许的温度的温育，向含有 或没有HMW PEG-样化合物的VLS#3条件培养基的暴露，细胞裂解和蛋 白印迹分析，都如实施例11所述进行，用等量的VSL#3条件培养基 替代其中所述的LGG条件培养基。

VSL#3条件培养基以时间-依赖性的方式，丧失它的益生生物活 性，这似乎独立于它的保藏温度。将几批已经开始丧失它们的生物学 活性和诱导热休克蛋白的能力的VSL#3条件培养基，分别与HMW PEG 相组合，以尝试恢复它们的效力。通常，600ul条件培养基是用于诱 导肠上皮细胞的热休克反应的最佳量。这些减弱批次的VSL#3条件培 养基都需要观察到效应通常所需量的2倍，且仅能较弱地诱导反应(见 图8的泳道2，6，和10)。

将以前在LGG实验中确定的相同比例(见实施例10)保持作为益生 菌-HMW PEG混合物的最佳比例，将600ul减弱的VSL#3条件培养基与 600ul HMW PEG相混合，并应用于上皮细胞表面。尽管600ul单独的 VSL#3不能诱导任何热休克反应，(图8的泳道1，5，和9)，HMW PEG 的添加不但能增强热休克蛋白表达，还能完全恢复3个独立批次的减 弱的VSL3#条件培养基的效力(对比图8的泳道3，7，和11)。在批次H 的情况下，HMW PEG的添加，恢复了已经完全丧失的活性(即检测不到 的；将图8的泳道9和10与泳道11相对比)。

进行实验，以确定进行洗出研究是否能消除HMW PEG的增强作用， 即在细胞上应用VSL-HMW PEG混合物，并放置10分钟，然后吸掉， 并将培养基替换为新鲜的培养基。16小时后，收获细胞，评价热休克 蛋白表达。用单独的VSL#3减弱的条件培养基进行这样的处理，不产 生信号，但是对于VSL-HMW PEG混合物，对所有3个减弱的批次都观 察到了强烈的热休克蛋白诱导(图8的泳道4，8，和12)。这表明，向 益生混合物添加HMW PEG，不仅能增强它们的效力，还能延长它们的 半衰期。不希望受理论的约束，半衰期延长可能是由于HMW PEG的粘 附性质，这可能会使益生的生物活性因子保持接触上皮细胞，甚至在 洗出处理后。也作为非限制性的理论观察，可能HMW PEG也稳定益生 因子的结构。还显示了热休克的阳性对照细胞(图8，泳道14)和未处 理的阴性对照细胞(图8，泳道13)。

如实施例10所指出的，可以改变治疗剂(例如，VSL#3条件培养 基)与HMW PEG-样化合物的比例，且这样的变化是本发明可预期的， 如同使用的特定HMW PEG-样化合物的变化。另外，包括VSL#3条件培 养基中的活性化合物的更纯制品，且在本发明的范围内。例如，可以 对VSL#3条件培养基进行其它的纯化努力，以生产具有小于10kD的 平均分子量的酸稳定的且醚可提取的蛋白或肽的更纯制品，且这样的 治疗剂包含在本发明的方法和应用中。根据本发明的HMW PEG-样化合 物可以用于输送益生的和/或非-益生的治疗剂，其具有广范围的结构 (例如，肽，蛋白，小分子效应物等)，且表现出广范围的治疗作用。

实施例12

HMW PEG-样化合物在体内输送过程中稳定治疗剂的应用

广泛种类的化学和生物治疗剂和药物适于使用包含HMW PEG-样 化合物的输送系统输送给上皮细胞。预期根据本发明的化合物的保护 或稳定方面，能拓宽适于施用(例如施用给上皮粘膜例如肠)的治疗 剂的范围。突出的实例是治疗性蛋白胰岛素，其尚不适于经口输送， 对于许多糖尿病患者需要每日注射。合适的蛋白治疗剂的另一个实例 包含激素疗法。关于本发明的涉及输送系统在施用蛋白性的(例如，蛋 白，多肽或肽)治疗剂中的应用的方面，本发明包含以能有效地打开 上皮细胞(例如，肠的上皮细胞)的紧密连接的量另外添加PA-I凝 集素/粘附素，以促进蛋白性的治疗剂的摄取。

通过本发明的系统输送的治疗剂范围的示例是小分子治疗剂，例 如用于治疗癌性状况的小分子化疗剂。可以容易地测定该范围的化学 试剂中任一种使用本文公开的输送系统的合适性，包括本领域已知的 放射化学的和生物的包括蛋白性的治疗剂。预期大量的这样的治疗剂 可以使用该输送系统施用，打开新的输送途径，或增强已知的输送治 疗剂的途径。根据本文提供的说明，施用这样的治疗剂。见例如实施 例1，9，10和11。

本发明的该方面的其它示例性的实施方案是，使用本发明的HMW PEG-样输送系统，施用治疗剂，以预防、治疗或改善性传播疾病的症 状。例如，AIDS的治疗，包含通过阴道的、经口的或直肠的(例如， 作为栓剂)输送，施用在HMW PEG-样化合物(例如HMW PEG)的溶液中 的有效量的抗-HIV治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂是益生微生物 或源自它的活性组分；在其它实施方案中，治疗剂是任意的已知的抗 -HIV治疗剂。这样的治疗剂和实际上本文公开的或本领域已知的任何 治疗剂的有效量，可以由本领域的技术人员容易地确定，且取决于变 量如年龄、体重、一般健康等，如本领域会理解的。考虑到报道说为提 供临床用疫苗进行抗-HIV疫苗开发可能还需要十年，预期这些治疗输 送系统会提供显著的健康益处。

考虑上面的教导，本发明的许多改进和变化是可能的，且在本发 明的范围内。本文引用的所有出版物的完整内容，在这里引作参考。

根据国立卫生研究院的基金号DK47722，DK42086，T32 GM07019， 和K08 DK064840-01，联邦政府可享有本发明的权利。