靶向STAT3的溶瘤病毒
阅读：995发布：2021-08-23
专利汇可以提供靶向STAT3的溶瘤病毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及修饰的病毒，例如，溶瘤苗痘病毒，其已经修饰以含有表达调节STAT3活性的 蛋白质 的外源核酸。其至少部分基于以下发现，即经修饰以含有编码PIAS3的核酸并表达PIAS3或其 片段 的苗痘病毒可抑制STAT3活性并增强苗痘病毒的抗癌活性。因此，本公开提供了溶瘤苗痘病毒以及使用它们 治疗 癌症的方法。，下面是靶向STAT3的溶瘤病毒专利的具体信息内容。
1.一种包含外源核酸的溶瘤苗痘病毒，其中所述外源核酸编码调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段。
2.如权利要求1所述的溶瘤苗痘病毒，其中所述外源核酸编码所述蛋白质。
3.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸编码所述片段。
4.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述蛋白质或其片段包含STAT3识别结构域或所述识别结构域内的阻断片段。
5.如权利要求4所述的溶瘤痘苗病毒，包含所述阻断片段，其中所述阻断片段调节STAT3介导的基因活化。
6.如权利要求1-5中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述蛋白质或其片段为SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，或显性负突变体STAT3蛋白或其片段。
7.如权利要求1-5中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述蛋白质或其片段是PIAS3蛋白或其片段。
8.如权利要求7所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸经密码子优化以增加PIAS3蛋白或其片段的表达。
9.如权利要求7或8所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中外源核酸与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。
10.如权利要求7-9中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸包含选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列。
11.如权利要求7-9中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中外源核酸与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。
12.如权利要求7-9中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中外源核酸与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。
13.如权利要求7或8所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白片段的外源核酸，其中所述外源核酸与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的核酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。
14.如权利要求7、8或13所述的溶瘤痘苗病毒，其包含编码PIAS3蛋白片段的外源核酸，其中所述外源核酸包含选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的核酸片段。
15.如权利要求13或14所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述核酸片段包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的连续核苷酸段。
16.如权利要求15所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述连续核苷酸段具有3个核苷酸至552个核苷酸的长度。
17.如权利要求13或14所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述核酸片段包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的非连续核苷酸。
18.如权利要求7-17中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的氨基酸序列。
19.如权利要求7-18中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。
20.如权利要求7-19中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。
21.如权利要求7-20中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。
22.如权利要求7-17中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。
23.如权利要求7-17和22中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白包含与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的氨基酸序列。
24.如权利要求7-21和22-23中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白片段的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白片段包含与来自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代中任一个的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。
25.如权利要求7-17和22-24中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码PIAS3蛋白片段的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白片段包含与来自SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约
99％或100％同源的氨基酸序列。
26.如权利要求7所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述PIAS3蛋白或其片段包含SEQ ID NO：6及其保守取代物的氨基酸序列的400-523位氨基酸。
27.如权利要求1-6中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3活性的蛋白质或其片段是SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。
28.如权利要求27所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述SOCS3蛋白或其片段包含人SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。
29.如权利要求27或28所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述SOCS3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
30.如权利要求27或28所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述SOCS3蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：28及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
31.如权利要求27-30中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述SOCS3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。
32.如权利要求27-30中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述SOCS3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
33.如权利要求1-6中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3活性的蛋白质或其片段是TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。
34.如权利要求33所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述TCPTP蛋白或其片段是人TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。
35.如权利要求33或34所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述TCPTP蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
36.如权利要求33-35中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述TCPTP蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：32及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
37.如权利要求33-36中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述TCPTP蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。
38.如权利要求33-36中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述TCPTP蛋白或其部分包含与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
39.如权利要求1-6中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3活性的蛋白质或其片段是显性负突变体STAT3蛋白质或其片段及其保守取代物。
40.如权利要求39所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述显性负突变体STAT3蛋白或其片段是人显性负突变体STAT3蛋白或其片段及其保守取代物。
41.如权利要求39或40所述的溶瘤痘苗病毒，其中显性负突变体STAT3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。
42.如权利要求39-41中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述显性负突变体STAT3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。
43.如权利要求39-42中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述显性负突变体STAT3蛋白或其片段包含与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
44.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸还编码细胞穿透蛋白。
45.如权利要求44所述的溶瘤痘苗病毒，包含还编码细胞穿透蛋白的外源核酸，其中所述细胞穿透蛋白包含HIV-1的TAT蛋白或其片段，YopM，转运肽，穿透肽，聚精氨酸，或其任何组合。
46.如权利要求44或45所述的溶瘤痘苗病毒，包含还编码所述细胞穿透蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸还包含与SEQ ID NO：12、13、15、17、19、21和23或其片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。
47.如权利要求44-46中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含还编码所述细胞穿透蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸还包含与SEQ ID NO：12、13、15、17、19、21和23的全长至少约
85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。
48.如权利要求44-47中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含还编码细胞穿透蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸还包含与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23的长度的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的序列。
49.如权利要求44-48中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，包含编码TAT蛋白或其片段的外源核酸，其中所述TAT蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：11、14、16、18、20和22及其保守取代物，或其片段及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约
97％，至少约98％，至少约99％或100％相同的序列。
50.如权利要求1-49中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3活性的蛋白质或其片段偶联于与氨基酸序列SEQ ID NO：11至少约85％同源的氨基酸。
51.如权利要求1-49中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3活性的蛋白质或其片段与包含氨基酸序列SEQ ID NO：11的细胞穿透肽偶联。
52.如权利要求4所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述蛋白质或其片段包含阻断片段，其中所述阻断片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸126-176。
53.如权利要求52所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述蛋白质或其片段包含PIAS3蛋白或其片段，其中所述PIAS3蛋白或其片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸129-316、133-316、132-177、
126-176或400-528。
54.如权利要求1-53中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中外源核酸插入痘苗病毒基因组中。
55.如权利要求54所述的溶瘤痘苗病毒，其中外源核酸插入痘苗病毒基因组的胸苷激酶基因座中。
56.如权利要求1-55中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒是细胞外包膜病毒(EEV)。
57.如权利要求1-56中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制。
58.如权利要求1-57中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制以产生主要包含细胞外包膜病毒(EEV)的病毒群。
59.如权利要求57或58所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述病毒通过在M2巨噬细胞内复制而部分避免免疫抑制。
60.一种药物组合物，包含如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒和赋形剂。
61.如权利要求60所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括以下的一种或多种：缓冲剂，稳定剂，抗氧化剂，粘合剂，稀释剂，分散剂，速率控制剂，润滑剂，助流剂，崩解剂，增塑剂，防腐剂，或其任意组合。
62.如权利要求61所述的药物组合物，其中所述赋形剂包括二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，肌醇，山梨糖醇，或其任意组合。
63.如权利要求60-62中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物不包含防腐剂。
64.如权利要求60-63中任一项所述的药物组合物，还包含以下的一种或多种：防腐剂，稀释剂和运载体。
65.如权利要求60-64中任一项所述的药物组合物，还包含其他活性成分或其盐。
66.如权利要求65所述的药物组合物，包含其他活性成分，其中该其他活性成分是另一种溶瘤痘苗病毒。
67.一种生产如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒的方法，所述方法包括：
(i)通过将痘苗病毒基础核酸序列与如权利要求1-59中任一项所述的外源核酸序列可操作地连接，产生修饰的痘苗病毒DNA载体；(ii)用修饰的痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；
(iii)在适于病毒复制的条件下培养哺乳动物细胞；和(iv)收获病毒颗粒。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述哺乳动物细胞包括HeLa细胞，293细胞或Vero细胞。
69.如权利要求67或68所述的方法，其中如权利要求1-59中任一项所述的外源核酸在修饰的痘苗病毒DNA载体中促进主要含有细胞外包膜病毒(EEV)的病毒颗粒群。
70.一种治疗癌症的方法，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物。
71.如权利要求70所述的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症是实体瘤，白血病或淋巴瘤。
72.一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物。
73.如权利要求72所述的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述肿瘤是实体瘤，白血病或淋巴瘤。
74.一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括给予有此需要的对象治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，并与其他疗法组合。
75.如权利要求74所述的方法，包括给予其他疗法，其中所述其他疗法包括化疗，放射，用另外的病毒进行的溶瘤病毒治疗，用免疫调节蛋白治疗，STAT3抑制剂，抗癌剂或其任意组合。
76.如权利要求74或75所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法同时或顺序给予。
77.如权利要求74、75或76所述的方法，包括顺序给予所述其他疗法，其中所述其他疗法在给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物之前给予。
78.如权利要求74、75或76所述的方法，包括顺序给予所述其他疗法，其中所述其他疗法在给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物后给予。
79.一种至少部分地使癌症患者对癌症治疗再敏感的方法，所述方法包括向有此需要的对象给予治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-
66中任一项所述的药物组合物，并与增强痘苗病毒在肿瘤细胞内复制的药物组合。
80.如权利要求79所述的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1-59中任一项的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述癌症疗法可包括化疗，辐射，病毒治疗，用免疫调节蛋白治疗或其任意组合。
81.一种在癌细胞中产生毒性作用的方法，所述方法包括给予癌细胞群治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物。
82.如权利要求81所述的方法，包括给予治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中不是癌细胞群中的每个癌细胞都被溶瘤痘苗病毒感染。
83.如权利要求82所述的方法，其中在没有直接感染的情况下未感染的癌细胞的生长受到抑制。
84.一种确定溶瘤痘苗病毒感染性的方法，所述方法包括(i)从对象收集第一生物样品并测定第一生物样品中STAT3的水平；(ii)单独或与其他疗法组合给予对象治疗有效量的如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物；(iii)在步骤(ii)给药后约2小时至约72小时后从对象收集第二生物样品，并检测第二生物样品中STAT3蛋白的水平。
85.如权利要求84所述的方法，包括给予其他疗法，其中所述其他疗法包括化疗，放射，用另外的病毒进行的溶瘤病毒治疗，用免疫调节蛋白治疗，STAT3抑制剂，抗癌剂或其任意组合。
86.如权利要求84或85所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法同时或顺序给予。
87.如权利要求84、85或86所述的方法，包括顺序给予所述其他疗法，其中所述其他疗法在给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物之前给予。
88.如权利要求84、85或86所述的方法，包括顺序给予所述其他疗法，其中所述其他疗法在给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物后给予。
89.如权利要求84-88中任一项所述的方法，包括在单独或与其他疗法组合给予所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物之前(步骤i)和之后(步骤iii)确定STAT3水平，其中当步骤(iii)中STAT3的水平低于步骤(i)中STAT3水平时，确定所述溶瘤痘苗病毒是感染性的。
90.如权利要求70-89中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以包含约106PFU/mL至约108PFU/mL的溶瘤痘苗病毒的剂量给予。
91.如权利要求70-90中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物独立地以初始剂量给予第一段时间，以中间剂量给予第二段时间，并且以高剂量给予第三段时间。
92.如权利要求91所述的方法，包括独立地给予初始剂量，中间剂量和高剂量，其中初始剂量低于中间剂量，并且中间剂量低于高剂量。
93.如权利要求91或92所述的方法，其中所述第一，第二和第三段时间各自为约1周至约3周。
94.如权利要求70-93中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒和所述药物组合物独立地包含液体剂型，所述液体畸形以约1mL至约5mL，约5mL至10mL，约
15mL至约20mL，约25mL至约30mL，约30mL至约50mL，约50mL至约100mL，约100mL至150mL，约
150mL至约200mL，约200mL至约250mL，约250mL至约300mL，约300mL至约350mL，约350mL至约
400mL，约400mL至约450mL，约450mL至500mL，约500mL至750mL，或约750mL至1000mL的体积给予。
95.如权利要求70-94中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任何组合给予。
96.如权利要求70-95中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。
97.如权利要求70-96中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物每日一次，每日两次，每周一次，每两周一次或每三周一次给予。
98.如权利要求70-97中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物经静脉注射或通过肿瘤内注射给药。
99.如权利要求70-98中任一项所述的方法，包括给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物在第一剂量给药后约1小时至约3天后产生第一峰值病毒载量，并在约3天至约7天后产生第二峰值病毒载量。
100.如权利要求74-99中任一项所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。
101.如权利要求73-100中任一项所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法每天给予一次，每周给予一次，每两周给予一次，或每三周给予一次。
102.如权利要求73-101中任一项所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任何组合给予。
103.如权利要求73-102中任一项所述的方法，包括给予所述其他疗法，其中所述其他疗法通过口服，静脉内，瘤内注射或通过放射给予。
104.如权利要求70-103中任一项所述的方法，包括将如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物给予有需要的对象，其中所述对象是人。
105.如权利要求104所述的方法，包括从所述对象收集所述第一和第二生物样品，其中所述第一和第二生物样品是人组织样品。
106.如权利要求105所述的方法，包括从所述对象收集所述第一和第二生物样品，其中所述对象是人，并且所述第一和第二生物样品是来自所述人对象的血液或血浆。
107.如权利要求70-106中任一项所述的方法，包括向有此需要的对象给予如权利要求
1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中在给予所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象已被诊断患有癌症或肿瘤。
108.如权利要求70-107中任一项所述的方法，包括向有此需要的对象给予如权利要求
1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物，其中在给予所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象被诊断患有癌症或肿瘤。
109.如权利要求70-108中任一项所述的方法，包括与其他疗法组合将如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物给予有此需要的对象，其中在给予所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物或其他疗法之前，对象已被诊断患有癌症或肿瘤。
110.如权利要求70-109中任一项所述的方法，包括与其他疗法组合将如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物给予有此需要的对象，其中在给予所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象被诊断患有癌症或肿瘤。
111.一种包含外源核酸的病毒，其中所述外源核酸编码调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段。
112.如权利要求111所述的病毒，包含所述外源核酸序列，其中所述病毒是痘苗病毒。
113.如权利要求112所述的病毒，包含外源核酸，其中所述溶瘤痘苗病毒是溶瘤痘苗病毒。
114.如权利要求111-113中任一项所述的病毒，其中所述蛋白质或其片段是PIAS3蛋白或其片段。
115.如权利要求114所述的病毒，包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述外源核酸与选自SEQ ID NO：8-10的核酸序列或其片段至少约85％，约90％，约95％，约
96％，约97％，约98％，约99％或100％同源。
116.如权利要求111-115中任一项所述的病毒，其包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白或其片段包含与SEQ ID NO：1-7和24-27中任一个的氨基酸片段或其片段至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。
117.如权利要求111-116中任一项所述的病毒，其中所述外源核酸还编码HIV-1的TAT蛋白或其片段。
118.如权利要求117所述的病毒，包含还编码TAT蛋白的外源核酸，其中所述外源核酸还包含与SEQ ID NO：12或其片段约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的序列。
119.如权利要求111-118中任一项所述的病毒，包含还编码TAT蛋白或其片段的外源核酸，其中所述TAT或其片段蛋白质包含与SEQ ID NO：11或其片段约85％，约90％，约95％，约
96％，约97％，约98％，约99％或100％相同的序列。
120.如权利要求111-119中任一项所述的病毒，包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白或其片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸129-316、133-316、132-177、
126-176或400-528。
121.如权利要求111-120中任一项所述的病毒，包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述PIAS3蛋白或其片段包含SEQ ID NO：1的氨基酸126-176。
122.如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒，其中调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段是STAT3抑制剂。
123.如权利要求111-122中任一项所述的病毒，其中调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段是STAT3抑制剂。
124.如权利要求70-89中任一项所述的方法，其中在给予如权利要求1-59中任一项所述的溶瘤痘苗病毒或如权利要求60-66中任一项所述的药物组合物之前，同时或之后向对象给予生酮饮食。
125.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核酸片段，所述核酸片段包含来自选自SEQ ID NO：8-10、29、31、33、35、37和39-43的核苷酸序列的非连续核苷酸段。
126.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：8。
127.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：9。
128.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：10。
129.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：29。
130.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：31。
131.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：33。
132.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：35。
133.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：37。
134.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：39。
135.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：40。
136.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：41。
137.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：42。
138.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒，其中所述外源核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO：43。
靶向STAT3的溶瘤病毒
[0001] 资助信息
[0002] 本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA178766下于政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
[0003] 援引纳入
[0004] 本说明书中提到的所有发表物、专利、专利申请和NCBI登录号通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文，如同它们的全文单独纳入那样。如果本文使用的术语与并入的参考文献中定义的术语之间存在冲突，则以本公开的定义为准。
[0005] 相关申请的交叉引用
[0006] 本申请要求2016年7月19日提交的美国临时申请号62/364,095的权益，该申请通过引用全文纳入本文。
[0007] 介绍
发明内容
[0009] 本文在一个实施方式中提供了一种溶瘤痘苗病毒，其可以包含外源核酸，其中所述外源核酸可以编码可以调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段。在某些实施方式中，外源核酸可以编码蛋白质。在某些实施方式中，外源核酸可以编码片段。
[0010] 在某些实施方式中，蛋白质或其片段可包含STAT3识别结构域或所述识别结构域内的阻断片段。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可包含阻断片段，其中阻断片段可调节STAT3介导的基因活化。
[0011] 在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以是PIAS3蛋白质或其片段。在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以是SOCS3蛋白质或其片段，TCPTP蛋白质或其片段，或STAT3蛋白质或其片段。
[0012] 在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以是PIAS3蛋白质或其片段。在某些实施方式中，可以对外源核酸进行密码子优化以增加PIAS3蛋白或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，或显性负突变体STAT3蛋白或其片段的表达。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中外源核酸可以包含选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约
98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白片段，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的核酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中外源核酸包含选自SEQ ID NO：8-10和
40-43的核苷酸序列的核酸片段。在某些实施方式中，核酸片段可包含来自选自SEQ ID NO：
8-10和40-43的核苷酸序列的连续核苷酸段。在某些实施方式中，连续核苷酸段可具有3个核苷酸至552个核苷酸的长度。在某些实施方式中，核酸片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-
10和40-43的核苷酸序列的非连续核苷酸。
98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白片段，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的核酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中外源核酸包含选自SEQ ID NO：8-10和
40-43的核苷酸序列的核酸片段。在某些实施方式中，核酸片段可包含来自选自SEQ ID NO：
8-10和40-43的核苷酸序列的连续核苷酸段。在某些实施方式中，连续核苷酸段可具有3个核苷酸至552个核苷酸的长度。在某些实施方式中，核酸片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-
10和40-43的核苷酸序列的非连续核苷酸。
[0013] 在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白包含可以与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可以包含可与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列及其保守取代物的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列及其保守取代物的全长至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可以包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可包含可与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白片段，其中PIAS3蛋白片段可以包含可与选自SEQ ID NO：
1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约
96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白片段，其中PIAS3蛋白片段可以包含可与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，由本文公开的外源核酸编码的PIAS3蛋白或其片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸400-528及其保守取代物。在某些实施方式中，由本文公开的外源核酸编码的PIAS3蛋白或其片段可包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸400-523及其保守取代物。
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可以包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸可以编码PIAS3蛋白，其中PIAS3蛋白可包含可与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白片段，其中PIAS3蛋白片段可以包含可与选自SEQ ID NO：
1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约
96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，外源核酸编码PIAS3蛋白片段，其中PIAS3蛋白片段可以包含可与SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，由本文公开的外源核酸编码的PIAS3蛋白或其片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸400-528及其保守取代物。在某些实施方式中，由本文公开的外源核酸编码的PIAS3蛋白或其片段可包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸400-523及其保守取代物。
[0014] 在某些实施方式中，调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段是SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含人SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与SEQ ID NO：28及其保守取代物至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
[0015] 在某些实施方式中，调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可以是人TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与SEQ ID NO：32及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其部分可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
[0016] 在某些实施方式中，调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是显性负突变体STAT3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可以是人显性负突变体STAT3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约
85％同源的氨基酸序列。
85％同源的氨基酸序列。
[0017] 在某些实施方式中，可以将外源核酸插入痘苗病毒基因组中。
[0018] 在某些实施方式中，可以将外源核酸插入痘苗病毒基因组的胸苷激酶基因座中。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可以是胞外包膜病毒(EEV)。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制，以产生主要包含胞外包膜病毒(EEV)的病毒群。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可通过在M2巨噬细胞内复制而部分地避免免疫抑制。
[0019] 本公开进一步提供了药物组合物，其可包含如本文所述的溶瘤痘苗病毒和赋形剂。在某些实施方式中，赋形剂可包含缓冲剂，稳定剂，抗氧化剂，粘合剂，稀释剂，分散剂，速率控制剂，润滑剂，助流剂，崩解剂，增塑剂，防腐剂中的一种或多种或其任意组合。在某些实施方式中，赋形剂可包含二水合磷酸氢二钠，二水合磷酸二氢钠，氯化钠，肌醇，山梨糖醇或其任意组合。在某些实施方式中，药物组合物可以不包含防腐剂。在某些实施方式中，药物组合物可进一步包含防腐剂，稀释剂和运载体中的一种或多种。在某些实施方式中，药物组合物可进一步包含另外的活性成分或其盐。在某些实施方式中，药物组合物可包含另外的活性成分，其中另外的活性成分可以是另外的溶瘤痘苗病毒。
[0020] 本发明还提供了产生如本文所述的溶瘤痘苗病毒的方法，其中该方法可包括以下步骤：(i)通过将痘苗病毒基础核酸序列与如上所述的外源核酸序列可操作地连接而产生修饰的痘苗病毒DNA载体；(ii)用修饰的痘苗病毒DNA载体转染哺乳动物细胞；(iii)在适于病毒复制的条件下培养哺乳动物细胞；和(iv)收获病毒颗粒。在某些实施方式中，哺乳动物细胞包括HeLa细胞，293细胞，或Vero细胞。在某些实施方式中，修饰的痘苗病毒DNA载体中的外源核酸可以促进主要含有胞外包膜病毒(EEV)的病毒颗粒群。
[0021] 本公开内容提供了通过给予一种或多种所公开的痘苗病毒进行治疗的方法。在某些实施方式中，治疗癌症的方法可包括向有此需要的对象给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，该方法可包括给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述癌症可以是实体瘤，白血病或淋巴瘤。
[0022] 一个非限制性实施方式提供治疗肿瘤的方法，其中所述方法可包括向有需要的对象给予治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物。在某些实施方式中，该方法可包括给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述肿瘤可以是实体瘤，白血病或淋巴瘤。
[0023] 一个非限制性实施方式提供与其他疗法组合的治疗癌症或肿瘤的方法，其中所述方法可包括向有需要的对象给予治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可包括化疗，放射，使用另外的病毒的溶瘤病毒治疗，用免疫调节蛋白治疗，STAT3抑制剂，抗癌剂或其任意组合。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以同时或顺序给予。在某些实施方式中，该方法可以包括顺序给予其他治疗，其中可以在给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物之前给予其他治疗。在某些实施方式中，该方法可以包括顺序给予其他治疗，其中可以在给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物之后给予其他治疗。
[0024] 一个非限制性实施方式提供了至少部分地使癌症患者对癌症治疗再敏感的方法，其中该方法可以包括向有需要的对象给予治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物与可以增强痘苗病毒在肿瘤细胞内复制的药物组合。在某些实施方式中，该方法可包括给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中癌症疗法可包括化疗，放射，病毒疗法，用免疫调节蛋白治疗，或其任意组合。
[0025] 一个非限制性实施方式提供治在癌细胞中产生毒性作用的方法，其中所述方法可包括向癌细胞群给予治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物。在某些实施方式中，该方法可包括给予治疗有效量的根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中不是癌细胞群中的每个癌细胞都可以被溶瘤痘苗病毒感染。在某些实施方式中，可以在没有直接感染的情况下抑制未感染的癌细胞的生长。
[0026] 一个非限制性实施方式提供了一种确定溶瘤痘苗病毒的感染性的方法，其中该方法可以包括：(i)从对象收集第一生物样品并测定第一生物样品中STAT3的水平；(ii)单独或与其他疗法组合向对象给予有效治疗有效量的本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物；(iii)在步骤(ii)给药后约2小时至约72小时后从对象收集第二生物样品，并检测第二生物样品中STAT3蛋白的水平。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可包括化疗，放射，使用另外的病毒的溶瘤病毒治疗，用免疫调节蛋白治疗，STAT3抑制剂，抗癌剂或其任意组合。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以同时或顺序给予。在某些实施方式中，该方法可以包括顺序给予其他治疗，其中可以在给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物之前给予其他治疗。在某些实施方式中，该方法可以包括顺序给予其他治疗，其中可以在给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物之后给予其他治疗。
[0027] 在某些实施方式中，该方法可包括在单独或与另外的疗法组合给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前(步骤i)和之后(步骤iii)确定STAT3的水平，其中在当步骤(iii)中的STAT3水平低于步骤(i)时，溶瘤痘苗病毒可以被确定为感染性。
[0028] 在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述6
的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物能以可包含约10 PFU/mL至约
108PFU/mL的溶瘤痘苗病毒的剂量给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量给予持续第一时间段，以中间剂量给予持续第二时间段，并且以高剂量给予持续第三时间段。在某些实施方式中，该方法可以包括独立地给予初始剂量，中间剂量和高剂量，其中初始剂量可以低于中间剂量并且中间剂量低于高剂量。在某些实施方式中，第一，第二和第三时间段可各自为约1周至约3周。在某些实施方式中，该方法可以包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒和药物组合物可以独立地包含液体剂型，其可以约1mL至约5mL，约5mL至10mL，约15mL至约20mL，约25mL至约
30mL，约30mL至约50mL，约50mL至约100mL，约100mL至150mL，约150mL至约200mL，约200mL至约250mL，约250mL至约300mL，约300mL至约350mL，约350mL至约400mL，约400mL至约450mL，约450mL至500mL，约500mL至750mL，或约750mL至1000mL的体积给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任意组合给予。在某些实施方式中，该方法可以包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以每天一次，每天两次，每周一次，每两周一次，或每三周一次给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以静脉内给予或通过瘤内注射给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物的给予可在给予第一剂量后约1小时至约3天产生第一峰值病毒载量并在给予第一剂量后约3天至约7天产生第二峰值病毒载量。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以每天给予一次，每周给予一次，每两周给予一次，或每三周给予一次。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型，或其任意组合给予。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以口服，静脉内，通过肿瘤内注射或通过辐射给予。在某些实施方式中，该方法可包括将根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物给予有需要的对象，其中对象可以是人。在某些实施方式中，该方法可包括从对象收集第一和第二生物样品，其中第一和第二生物样品可以是人组织样品。在某些实施方式中，该方法可包括从对象收集第一和第二生物样品，其中对象可以是人，第一和第二生物样品可以是来自人对象的血液或血浆。在某些实施方式中，该方法可包括向有此需要的对象给予根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法可包括向有此需要的对象给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象可被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法可包括将本发明的溶瘤痘苗病毒或本文所述的药物组合物与其他治疗组合给予有需要的对象，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物或其他治疗之前，对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法包括将本发明的溶瘤痘苗病毒或本文所述的药物组合物与其他治疗组合给予有需要的对象，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。
的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或所述药物组合物能以可包含约10 PFU/mL至约
108PFU/mL的溶瘤痘苗病毒的剂量给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量给予持续第一时间段，以中间剂量给予持续第二时间段，并且以高剂量给予持续第三时间段。在某些实施方式中，该方法可以包括独立地给予初始剂量，中间剂量和高剂量，其中初始剂量可以低于中间剂量并且中间剂量低于高剂量。在某些实施方式中，第一，第二和第三时间段可各自为约1周至约3周。在某些实施方式中，该方法可以包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒和药物组合物可以独立地包含液体剂型，其可以约1mL至约5mL，约5mL至10mL，约15mL至约20mL，约25mL至约
30mL，约30mL至约50mL，约50mL至约100mL，约100mL至150mL，约150mL至约200mL，约200mL至约250mL，约250mL至约300mL，约300mL至约350mL，约350mL至约400mL，约400mL至约450mL，约450mL至500mL，约500mL至750mL，或约750mL至1000mL的体积给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任意组合给予。在某些实施方式中，该方法可以包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以每天一次，每天两次，每周一次，每两周一次，或每三周一次给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中所述溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以静脉内给予或通过瘤内注射给予。在某些实施方式中，该方法可包括给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中溶瘤痘苗病毒或药物组合物的给予可在给予第一剂量后约1小时至约3天产生第一峰值病毒载量并在给予第一剂量后约3天至约7天产生第二峰值病毒载量。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以给予持续约1周，约2周，约3周，约4周，约6周，约7周，约8周，约9周，约10周，或约12周。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以每天给予一次，每周给予一次，每两周给予一次，或每三周给予一次。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以液体剂型，固体剂型，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型，或其任意组合给予。在某些实施方式中，该方法可以包括给予其他治疗，其中其他治疗可以口服，静脉内，通过肿瘤内注射或通过辐射给予。在某些实施方式中，该方法可包括将根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物给予有需要的对象，其中对象可以是人。在某些实施方式中，该方法可包括从对象收集第一和第二生物样品，其中第一和第二生物样品可以是人组织样品。在某些实施方式中，该方法可包括从对象收集第一和第二生物样品，其中对象可以是人，第一和第二生物样品可以是来自人对象的血液或血浆。在某些实施方式中，该方法可包括向有此需要的对象给予根据本发明的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法可包括向有此需要的对象给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前，对象可被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法可包括将本发明的溶瘤痘苗病毒或本文所述的药物组合物与其他治疗组合给予有需要的对象，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物或其他治疗之前，对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。在某些实施方式中，该方法包括将本发明的溶瘤痘苗病毒或本文所述的药物组合物与其他治疗组合给予有需要的对象，其中在给予溶瘤痘苗病毒或药物组合物之前对象可能已被诊断患有癌症或肿瘤。
[0029] 一个非限制性实施方式提供了包含外源核酸的病毒，其中所述外源核酸可编码可以调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段。在某些实施方式中，病毒可包含外源核酸序列，其中所述病毒可以是痘苗病毒。在某些实施方式中，病毒可包含外源核酸，其中溶瘤痘苗病毒可以是溶瘤痘苗病毒。在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以是PIAS3蛋白或其片段。在某些实施方式中，所述病毒可包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中外源核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列或其片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。在某些实施方式中，所述病毒可包含编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸，其中PIAS3蛋白或其片段可包含可与来自SEQ ID NO：1-7和24-27中任一个的氨基酸片段或其片段至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。
[0030] 在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，其可编码PIAS3蛋白或其片段，其可包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的氨基酸400-528及其保守取代物。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸序列，其可编码PIAS3蛋白或其片段，其可包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的氨基酸400-523及其保守取代物。
[0031] 在某些实施方式中，调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，外源核酸可包含SOCS3蛋白或其片段，其包含人SOCS3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与SEQ ID NO：28及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约
85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段包含可与选自SEQ ID NO：
28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段包含可与选自SEQ ID NO：
28和30及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
[0032] 在某些实施方式中，可编码调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段的外源核酸可以是TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，外源核酸可包含TCPTP蛋白或其片段，其中TCPTP蛋白或其片段是人TCPTP蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与SEQ ID NO：32及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约85％同源的氨基酸序列。
[0033] 在某些实施方式中，调节STAT3活性，例如，调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是显性负突变体STAT3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可以是人显性负突变体STAT3蛋白或其片段及其保守取代物。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长至少约85％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白或其片段可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列全长的部分至少约
85％同源的氨基酸序列。
85％同源的氨基酸序列。
[0034] 在某些实施方式中，外源核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中细胞穿透蛋白包含HIV-1的TAT蛋白或其片段，YopM，转运肽，穿透肽，聚精氨酸或其任意组合。在某些实施方式中，外源核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中外源核酸还包含与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23或其片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约
97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。在某些实施方式中，核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中外源核酸还可包含与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的序列。在某些实施方式中，外源核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中外源核酸还可包含可与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23的长度的部分至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。
在某些实施方式中，外源核酸可编码细胞穿透肽或其片段，其中细胞穿透肽或其片段可包含与SEQ ID NO：11、14、16、18、20和22及其保守取代物，或其片段及其保守取代物至少约
85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％相同的序列。在某些实施方式中，调节STAT3活性的蛋白质或其片段可以与具有氨基酸的细胞穿透肽偶联，所述氨基酸可以与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少约85％同源。
97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。在某些实施方式中，核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中外源核酸还可包含与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的序列。在某些实施方式中，外源核酸可以进一步编码细胞穿透蛋白，其中外源核酸还可包含可与SEQ ID NO：12、13、115、17、19、21和23的长度的部分至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的序列。
在某些实施方式中，外源核酸可编码细胞穿透肽或其片段，其中细胞穿透肽或其片段可包含与SEQ ID NO：11、14、16、18、20和22及其保守取代物，或其片段及其保守取代物至少约
85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％相同的序列。在某些实施方式中，调节STAT3活性的蛋白质或其片段可以与具有氨基酸的细胞穿透肽偶联，所述氨基酸可以与SEQ ID NO：11的氨基酸序列至少约85％同源。
[0035] 在某些实施方式中，调节STAT3活性的蛋白质或其片段可以与包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的细胞穿透肽偶联。在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以包含阻断片段，其中阻断片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸126-176。在某些实施方式中，蛋白质或其片段可包含PIAS3蛋白或其片段，其中PIAS3蛋白或其片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸129-316，133-316，132-177，126-176或400-528。
[0036] 在某些实施方式中，可以调节STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是STAT3抑制剂。
[0037] 在本公开的某些非限制性方法中，可以在给予根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物之前，同时或之后向对象给予生酮饮食。
[0038] 在某些实施方式中，所述溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中所述外源核酸可包含核酸片段，所述核酸片段可包含来自核苷酸序列的非连续核苷酸段，所述核苷酸序列可以是选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：8-10、29、31、33、35、37和39-43。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：29的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒可包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：31的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：37的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：39的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：41的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒包含外源核酸，其中外源核酸可包含SEQ ID NO：43的核苷酸序列。
附图说明
附图说明
[0039] 图1显示了PIAS3的结构域。
[0040] 图2显示了表达PIAS3的不同痘苗病毒构建体的STAT3阻断功能。
[0041] 图3显示PIAS3或PIAS3结构域的表达增强了由痘苗介导的对人肿瘤细胞系的杀伤。
[0042] 图4显示使用表达PIAS3的痘苗病毒在正常细胞系中没有观察到额外的杀伤。
[0043] 图5显示PIAS3结构域的表达使肿瘤细胞(143b)中的病毒噬斑大小增大，但不增大正常细胞(HFF)中的病毒噬斑大小。
[0044] 图6显示当表达PIAS3或PIAS3的结构域时，肿瘤细胞中的病毒复制增加。
[0045] 图7显示当表达PIAS3结构域时，肿瘤中的病毒荧光素酶基因表达(复制)增加。
[0046] 图8显示了在小鼠RENCA肿瘤模型中表达PIAS3的不同痘苗病毒的治疗效果。
[0047] 图9显示表达hPIAS3126-176，mPIAS3400-523，mTCPTP或mSOCS3的痘苗病毒的表达导致肿瘤细胞系中细胞周期蛋白D表达降低。
具体实施方式
[0048] 虽然本文显示和描述了本公开的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。下列权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
[0049] 某些定义
[0050] 本文所用的术语仅仅用来描述特定情况的目的，而不是限制性的。
[0051] 如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，在说明书和/或权利要求书中使用术语“包含”，“含有”，“包括”，“含”，“具有”，“有”，“带有”或其变体旨在以类似于术语“包含”的方式涵盖在内。
[0052] 术语“约”或“大约”可表示在本领域普遍技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，“约”可按实践表示在给定值的1个标准偏差或大于1个标准偏差之内。在本申请和权利要求中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应假定为特定值的可接受误差范围，例如由术语“约”修饰的值的±10％。
[0053] 术语“个体”，“患者”或“对象”可互换使用。这些术语均不要求或仅限于以医疗工作者(例如医生，注册护士，执业护士，医师助理，勤务人员，或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇)为特征的情况。在某些实施方式中，患者，对象或个体可以在医疗工作者的监督下。
[0054] 如本文所用，与特定病毒有关的术语“异源核酸序列”或“外源核酸序列”可以指源自除特定病毒之外的来源的核酸序列。
[0055] 如本文所用，术语“突变”可以指缺失，异源核酸的插入，倒位或取代，包括本领域通常理解的开放阅读框消除突变。
[0056] 如本文所用，术语“基因”可以指编码单个蛋白质或RNA(也称为“编码序列”或“编码区”)的核酸区段，任选地与相关的调节区，例如启动子，操纵子，终止子等一起，它们可位于编码序列的上游或下游。
[0057] 在本文中可互换使用的术语“突变病毒”和“修饰的病毒”可以指在其基因组中包含一个或多个突变，包括但不限于缺失，异源核酸的插入，反转，取代或其组合的病毒。
[0058] 如本文所用，针对病毒的术语“天然存在”可表明该病毒可以在自然界中发现，即它可以从自然界中分离出来并且没有被有意修饰。
[0059] 本文提及的术语“抑制”，“减少”或“预防”或这些术语的任何变化可包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。
[0060] 本文所用的“启动子”是一种控制序列，其是核酸序列的一个区域，在该区域中控制转录的起始和速率。在某些实施方式中，启动子可包含遗传元件，其调节蛋白质和其它可能结合的分子，如RNA聚合酶和其它转录因子。术语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“控制下”和“转录控制下”表示启动子位于相对于核酸序列的正确功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。在某些实施方式中，启动子可与或可不与“增强子”联用，增强子是指参与核酸序列的转录活性的瞬时作用调控序列。
[0061] 如本文所用，术语“同源性”可以是两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的“同源性”或“百分比同源性”的计算，其可以通过比对序列用于最佳比较目的(例如，缺口可以引入第一序列的序列)来确定。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同源性＝相同位置的数量/位置的总数×100)。例如，第一序列中的位置可由与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置是相同的。考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两个序列之间的百分比同源性可以是序列共有的相同位置数的函数。在某些实施方式中，为比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％，40％，50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，
97％，98％或95％。 搜索可以确定两个序列之间的同源性。两个序列可以是基因，核苷酸序列，蛋白质序列，肽序列，氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过众所周知的方法完成，例如但不限于使用数学算法。这种数学算法的非限制性实例描述于Karlin，S.和Altschul，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90-5873-5877(1993)。这种算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中，如Altschul，S.等，Nucleic Acids Res.，25：3389-
3402(1997)中所述。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为得分＝100，字长＝12，或者可以改变(例如，W＝5或W＝20)。其他示例包括Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)，ADVANCE，ADAM，BLAT和FASTA。在另一个非限制性实施方式中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用例如GCG软件包(英国剑桥的阿克赛勒里公司(Accelrys))中的GAP程序完成。
97％，98％或95％。 搜索可以确定两个序列之间的同源性。两个序列可以是基因，核苷酸序列，蛋白质序列，肽序列，氨基酸序列或其片段。两个序列的实际比较可以通过众所周知的方法完成，例如但不限于使用数学算法。这种数学算法的非限制性实例描述于Karlin，S.和Altschul，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90-5873-5877(1993)。这种算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)中，如Altschul，S.等，Nucleic Acids Res.，25：3389-
3402(1997)中所述。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(如NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可以设置为得分＝100，字长＝12，或者可以改变(例如，W＝5或W＝20)。其他示例包括Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)，ADVANCE，ADAM，BLAT和FASTA。在另一个非限制性实施方式中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用例如GCG软件包(英国剑桥的阿克赛勒里公司(Accelrys))中的GAP程序完成。
[0063] 术语“治疗”和“处理”可以包括减轻或消除疾病，疾病或病症；或与疾病，疾病或病症有关的一种或多种症状；或减轻或消除疾病，疾病或病症本身的原因。在某些实施方式中，可以出于预防或在临床病理学过程中进行治疗。所需的治疗效果可包括但不限于，预防疾病的发生或复发、缓减症状、减少疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病进展速度、缓解或缓和疾病状态和减轻或改善预后。
[0064] 如本文中可互换使用的术语“治疗有效量”或“有效量”可以指化合物的量，当给予时，其可足以在一定程度上防止发展或减轻所治疗的疾病，病症或病的症状中的一种或多种。本文所用术语“治疗有效量”还可以指足以引起研究人员，兽医，医生，或临床医师正在寻求的细胞，组织，系统，动物或人的生物或医学反应的化合物的量。
[0065] 术语“药学上可接受的运载体”，“药学上可接受的赋形剂”，“生理学上可接受的运载体”或“生理学上可接受的赋形剂”可以指药学上可接受的材料，组合物或载剂，例如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上，组分可以是“药学上可接受的”。它还适用于与人和动物的组织或器官接触而没有过多的毒性，刺激，过敏反应，免疫原性或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称。参见《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，Lippincott Williams&Wilkins，宾夕法尼亚州费城(Philadelphia，PA)，2005《；药学赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第5版，Rowe等编，药物出版社和美国药学协会(The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association)：2005；和《药物添加剂手册》(Handbook of Pharmaceutical Additives)，第
3版，Ash和Ash编写，Gower出版公司：2007；《药物预配制和配制》(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)，Gibson编，CRC Press LLC：佛罗里达州博卡拉顿，
2004。
3版，Ash和Ash编写，Gower出版公司：2007；《药物预配制和配制》(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)，Gibson编，CRC Press LLC：佛罗里达州博卡拉顿，
2004。
[0066] 如本文所用，术语“药物组合物”可以指本文公开的化合物与其他化学组分(例如稀释剂或运载体)的混合物。药物组合物可以促进化合物向生物体的给药。本领域存在多种给予化合物的技术，包括但不限于口服，注射，气溶胶，肠胃外和局部给予。药物组合物还可以通过使化合物与无机或有机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，水杨酸等反应来获得。
[0067] 如本文所用，“抗癌剂”可以指能够对对象的癌症产生负面影响的药剂或疗法，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移的发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供给、促进对癌细胞或肿瘤的免疫应答、阻止或抑制癌症发展、或延长患癌对象的寿命。抗癌剂的非限制性示例可包括生物制剂(生物疗法)，化疗剂和放射疗法剂。
[0068] 如本文所用，术语“溶瘤”可以指通过试剂(例如溶瘤痘苗病毒)杀死癌症或肿瘤细胞，例如通过直接裂解所述细胞，通过刺激针对所述细胞的免疫应答，细胞凋亡，有毒蛋白质的表达，自噬和蛋白质合成的关闭，诱导抗肿瘤免疫，或其任意组合。由该试剂，例如溶瘤痘苗病毒，感染的癌症或肿瘤细胞的直接裂解可以是病毒在所述细胞内复制的结果。在某些示例中，术语“溶瘤”是指在不裂解所述细胞的情况下杀死癌症或肿瘤细胞。
[0069] 如本文所用，术语“显性负突变”可以指蛋白质的氨基酸序列或编码蛋白质的核苷酸序列中的突变，其导致蛋白质的突变形式，所述突变形式拮抗该蛋白质的野生型。
[0070] 修饰的病毒
[0071] 在某些实施方式中，提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其含有编码STAT3活性(例如STAT-3介导的基因活化)的调节剂的外源核酸序列。STAT3可通过介导其他转录因子的表达或与其他转录因子的物理结合间接调节几种靶基因，以增强或抑制其在基因调控中的功能。STAT3调节的基因的示例包括但不限于p53(NG_017013.2)，Fas(NG_009089.2)，Hsp70(NC_000005.10)，Cyclin-D1(NG_007375.1)，IL-10(NG_012088.1)等。参见，例如，Carpenter和Lo，Cancers，2014，6，897-925，其通过引用并入本文。
[0072] 在某些实施方式中，本文描述的病毒包含一种或多种外源核酸序列，或者称为转基因，其可以产生编码可以调节STAT3活性的试剂的mRNA，并且因此还可以调节受STAT3调节的基因的活化。因此，本文提供的某些实施例提供含有外源核酸序列的溶瘤痘苗病毒，所述外源核酸序列可编码可调节STAT-3介导的基因活化的试剂。如本文所用，短语“调节STAT3介导的基因活化”可以指其中调节STAT3活性，并且因此也调节受STAT3调节的一种或多种基因的活化的过程。
[0073] 在某些实施方式中，可以调节STAT3介导的基因活化的试剂是蛋白质或其片段。在某些实施方式中，蛋白质或其片段可以抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化。抑制，降低和/或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以例如阻断STAT3与STAT3应答基因的启动子区域中的DNA结合序列的结合。在另外的实例中，抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以直接结合STAT3蛋白，例如，在SH2结构域。在某些实施方式中，抑制，减少和/或最小化STAT3活性的蛋白质阻断，阻止，减少和/或最小化STAT3的磷酸化和/或使STAT3去磷酸化。在某些非限制性实施方式中，调节STAT3活性的蛋白质可包括磷酸酪氨酸磷酸酶(PTP)，活化的STAT蛋白抑制剂(PIAS)和细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)。
[0074] 在某些实施方式中，抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是PIAS3蛋白或其片段。例如但不限于，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可表达PIAS3蛋白或其片段。在某些实施方式中，修饰的病毒可表达人PIAS3蛋白，例如，其可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。
[0075] 在某些实施方式中，修饰的病毒可表达小鼠PIAS3蛋白或其片段，例如，其可包含与SEQ ID NO：6的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。
[0076] 在某些实施方式中，病毒可表达大鼠PIAS3蛋白或其片段，例如，其可包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。
[0077] 在某些实施方式中，本公开提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可以表达PIAS3蛋白的PINIT(脯氨酸，异亮氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，苏氨酸)片段。在某些实施方式中，PINIT片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸126-176及其保守取代物。例如但不限于，PINIT片段可包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列及其保守取代物。在某些实施方式中，PINIT片段可包含SEQ ID NO：1的氨基酸132-177及其保守取代物。在某些实施方式中，PINIT片段可包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列及其保守取代物。
[0078] 在某些实施方式中，本公开提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可以表达PIAS3蛋白的PINIT结构域。在某些实施方式中，PINIT结构域可包含SEQ ID NO：1的氨基酸129-316或其保守取代物。例如但不限于，PINIT结构域可包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列及其保守取代物。在某些实施方式中，PINIT结构域可包含SEQ ID NO：1的氨基酸133-316或其保守取代物。在某些实施方式中，PINIT结构域可包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列及其保守取代物。
[0079] 在某些实施方式中，本发明提供了表达人PIAS3蛋白的酸性结构域的病毒，例如痘苗病毒。在某些实施方式中，酸性结构域包含SEQ ID NO：1的氨基酸400-528及其保守取代物。例如但不限于，酸性结构域包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列及其保守取代物。在某些实施方式中，小鼠PIAS3蛋白的酸性结构域包含SEQ ID NO：6的氨基酸400-523及其保守取代物。例如但不限于，酸性结构域包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列及其保守取代物。
[0080] 在某些实施方式中，本公开提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可表达PIAS3蛋白或其片段，例如，其可包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列的全长至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或
100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。在其他实施例中，PIAS3蛋白或其片段可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的全长至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约
99％或100％同源的氨基酸序列。在其他实施例中，PIAS3蛋白或其片段可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约
99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：1-7和24-27的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的氨基酸序列。在其他实施例中，PIAS3蛋白或其片段可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的全长至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约
99％或100％同源的氨基酸序列。在其他实施例中，PIAS3蛋白或其片段可包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约
99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
[0081] 在某些实施方式中，本公开内容提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其可被修饰以包含一种或多种编码可抑制，减少或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段的异源核酸，例如基因，如上所述。在某些实施方式中，本公开内容提供了修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，其具有编码可抑制，降低或最小化STAT3活性的蛋白质的核酸。例如但不限于此，本公开内容提供了修饰的病毒，例如，具有一种或多种可编码PIAS3蛋白或其片段的核酸的溶瘤痘苗病毒(例如，PIAS3蛋白的PINIT结构域或PINIT片段)，如本文所公开。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列，或其片段。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的全长至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％，或者100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，可以编码PIAS3蛋白的核酸可以与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约
97％，约98％，约99％或100％同源。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。
在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：41的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：43的核苷酸序列。在某些实施方式中，该片段可具有来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的约3至约6个核苷酸，约6至约9个核苷酸，约9至约12个核苷酸，约12至约15个核苷酸，约15至约18个核苷酸，约18至约21个核苷酸，约21至约24个核苷酸，约24至约99个核苷酸，约99至约120个核苷酸，约
120至约150个核苷酸，约150至约153个核苷酸，约156个核苷酸至约573个核苷酸，约576个核苷酸至约600个核苷酸或更多的长度。在某些实施方式中，片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的连续核苷酸段。在某些实施方式中，片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的非连续核苷酸。
97％，约98％，约99％或100％同源。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列。在某些实施方式中，可编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：10的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列。
在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：41的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列。在某些非限制性实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：43的核苷酸序列。在某些实施方式中，该片段可具有来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的约3至约6个核苷酸，约6至约9个核苷酸，约9至约12个核苷酸，约12至约15个核苷酸，约15至约18个核苷酸，约18至约21个核苷酸，约21至约24个核苷酸，约24至约99个核苷酸，约99至约120个核苷酸，约
120至约150个核苷酸，约150至约153个核苷酸，约156个核苷酸至约573个核苷酸，约576个核苷酸至约600个核苷酸或更多的长度。在某些实施方式中，片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的连续核苷酸段。在某些实施方式中，片段可包含来自选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核苷酸序列的非连续核苷酸。
[0082] 在某些实施方式中，抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是SOCS3蛋白或其片段。例如但不限于，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可表达SOCS3蛋白或其片段。在某些实施方式中，修饰的病毒可表达人SOCS3蛋白，例如，其可包含与SEQ ID NO：28或30的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的病毒可包含可表达SOCS3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述核酸可包含与SEQ ID NO：29或31的氨基酸序列或其片段至少约85％，约
90％，约95％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：28和30的氨基酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：28和30的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
90％，约95％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：28和30的氨基酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或
100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：28和30的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
[0083] 在某些实施方式中，抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是TCPTP蛋白或其片段。例如但不限于，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可表达TCPTP蛋白或其片段。在某些实施方式中，修饰的病毒可表达人TCPTP蛋白，例如，其可包含与SEQ ID NO：32或34的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的病毒可包含可表达TCPTP蛋白或其片段的外源核酸，其中所述核酸可包含与SEQ ID NO：33或35的氨基酸序列或其片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：32和34的氨基酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约
98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：32和34的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约
95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：32和34的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约
95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
[0084] 在某些实施方式中，抑制，降低或最小化STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段可以是STAT3蛋白。例如但不限于，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可表达STAT3蛋白或其片段。在某些实施方式中，修饰的病毒可表达人STAT3蛋白，例如，其可包含与SEQ ID NO：36或38的氨基酸序列或其片段及其保守取代物至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，修饰的病毒可包含可表达STAT3蛋白或其片段的外源核酸，其中所述核酸可包含与SEQ ID NO：37或39的氨基酸序列或其片段至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：36和38的氨基酸序列的全长至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白或其片段可包含与选自SEQ ID NO：36和38的氨基酸序列的全长的部分至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，STAT3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
[0085] 在某些实施方式中，核酸可以与启动子元件可操作地连接，例如病毒内源的启动子元件，或者可选地，引入的外源启动子。在某些实施方式中，启动子是高表达病毒启动子，包括但不限于衍生自vSC8痘苗病毒株的合成痘苗病毒启动子“P11晚期”或源自vSC56痘苗病毒株的“合成早期/晚期启动子”。在某些实施方式中，启动子可以是低表达病毒启动子，包括但不限于衍生自vGK痘苗病毒株的“P7.5早期/晚期”启动子。
[0086] 在某些实施方式中，可编码可调节STAT3活性和STAT3介导的基因活化的蛋白质或其片段的外源核酸可独立地插入病毒基因组的任何位置，例如非必需基因座。可以通过常规分子生物学进行对溶瘤病毒的插入，例如，如Sambrook等所述(2001，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港出版社)。插入腺病毒载体或痘病毒载体可以通过同源重组进行，如Chartier等(1996，J.Virol.70：4805-10)和Paul等(2002，Cancer gene Ther.9：470-7)所述。例如，TK，RR和F2L基因以及基因间区域是适于插入溶瘤痘苗病毒的示例性基因座和适于插入溶瘤病毒的E3和E4区。在某些实施方式中，核酸插入编码胸苷激酶(TK)酶的J2R基因座，导致TK基因座的破坏。
[0087] 本公开的一些非限制性实施方式提供了修饰的痘苗病毒，其可包含可编码PIAS3蛋白或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，或包含一个或多个显性负突变的STAT3蛋白的核酸，其中该核酸可以插入TK基因，导致胸苷激酶失活。或者，可将核酸插入病毒基因组内的任何非必需基因内或病毒基因组内的任何基因内区域内。
[0088] 在某些实施方式中，编码PIAS3蛋白或其片段的外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。例如但不限于，细胞穿透肽可以衍生自HIV-1 tat基因。在某些实施方式中，细胞穿透肽可包括NCBI/UniProtKB登录号NP 057853.1的TAT47-57，其具有氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：11)，例如，衍生自HIV-1基因组的核苷酸残基5515-5547(在NCB1/UniProtKB登录号NC 001802.1中列出)，其具有核苷酸序列TATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA(SEQ ID NO：12)。在某些实施方式中，编码TAT蛋白的核酸可包含可与SEQ ID NO：12的全长至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，编码TAT蛋白的核酸与SEQ ID NO：12的全长的部分至少约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％，约99％或100％同源。在某些实施方式中，SEQ ID NO：11的氨基序列由核苷酸序列TATGGACGAAAAAAACGACGACAACGACGACGA(SEQ ID NO：13)编码。在某些实施方式中，细胞穿透肽可以包括可以衍生自HIV-1 tat基因并且具有核苷酸序列CGACAACGACGAAAGAAGCGAGGT(SEQ ID NO：14)，其编码具有氨基酸序列RQRRKKRG(SEQ ID NO：15)的肽。
[0089] 在某些实施方式中，细胞穿透肽可以是具有氨基酸序列KSKTEYYNAWSEWERNAPPGNGEQREMAVSRLRDCLDRQA(SEQ ID NO：16)的鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)毒力效应物YopM的N-末端结构域(NTD)。在某些实施方式中，YopM NTD细胞穿透肽具有核苷酸序列[0090]
[0091] 在 某 些 实 施 方 式 中 ，细 胞 穿 透 肽 可 以 是 具 有 氨 基 酸 序 列GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(SEQ ID NO：18)的转运肽(transportan)。在某些实施方式中，转运肽细胞穿透肽由核苷酸序列GGCTGGACACTTAACAGCGCAGGATATTTGCTTGGCAAAATCAATTTGAAGGCCTTGGCTGCGCTTGCAAAAAAAATTCTC(SEQ ID NO：19)编码。
[0092] 在某些实施方式中，细胞穿透肽可以是具有氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：20)的穿透肽(penetratin)。在某些实施方式中，穿透肽细胞穿透肽由核苷酸序列CGGCAGATAAAAATCTGGTTCCAGAATCGGCGCATGAAATGGAAGAAA(SEQ ID NO：21)编码。
[0093] 在某些实施方式中，细胞穿透肽可以是具有氨基酸序列RRRRRRRRRHHHHHH(SEQ ID NO：22)的聚精氨酸，参见例如SEQ ID NO：25和27。在某些实施方式中，聚精氨酸细胞穿透肽由核苷酸序列AGGCGGCGAAGACGCCGCAGGAGACGGCACCACCATCACCATCAC(SEQ ID NO：23)编码。
[0094] 在某些实施方式中，细胞穿透肽可以与PIAS3蛋白或其片段偶联，所述PIAS3蛋白或其片段直接置于PIAS3基因构建体的N-或C-末端或其附近。在某些实施方式中，细胞穿透肽可以与SOCS3蛋白或其片段偶联，所述SOCS3蛋白或其片段直接置于SOCS3基因构建体的N-或C-末端或其附近。在某些实施方式中，细胞穿透肽可以与TCPTP蛋白或其片段偶联，所述TCPTP蛋白或其片段直接置于TCPTP基因构建体的N-或C-末端或其附近。在某些实施方式中，细胞穿透肽可以与TCPTP蛋白或其片段偶联，所述TCPTP蛋白或其片段直接置于显性负STAT3核酸构建体的N-或C-末端或其附近。
[0095] 在某些实施方式中，上述修饰可以在本领域已知的任何病毒中产生。例如，可以如上所述修饰本领域已知的痘苗病毒以用于本公开内容。非限制性实例包括西部保留地(WR)毒株，Copenhagen毒株，Wyeth(NYCBOH)毒株，Tian Tian毒株或USSR毒株。在某些实施方式中，上述修饰可以在病毒中产生，例如但不限于其他痘病毒，HSV，腺病毒，呼肠孤病毒，新城疫病毒，麻疹病毒，马拉巴病毒，水泡性口炎病毒，AAV和逆转录病毒。在某些实施方式中，本文公开的修饰的痘苗病毒属于WR毒株。如本文所述修饰的碱基痘苗病毒株本身可以包含相对于其亲本毒株的一个或多个突变，例如但不限于以下一种或多种：TK的缺失；VGF的缺失；SPI-1缺失；和SPI-2缺失。在替代实施方式中，本公开的溶瘤病毒可以是包含缺陷TK和核糖核苷酸还原酶(RR)活性的痘苗病毒，其中RR缺陷是由病毒基因组携带的I4L和/或F4L基因中的失活突变引起的。在另一个非限制性实施方式中，本公开的溶瘤病毒可以是针对dUTP酶缺陷的痘苗病毒，其由病毒基因组的F2L基因中的失活突变单独引起，或由病毒基因组的F2L基因中的失活突变与TK和RR活性中的至少一种或两者的破坏组合引起。在某些实施方式中，痘苗病毒株还可以包括B8R中的突变和/或缺失(IFNγ结合蛋白；例如参见Symons等，
1995，Cell.81(4)：551-60)；B18R(I型IFN结合蛋白；例如参见Colamonici等，1995，J.Biol.Chem.270(27)：15974-8)；B15R(IL-1β结合蛋白；例如参见Alcami等，1992，Cell.71(1)：153-67)；IL-18BP(例如，C12L缺失)；B5R(例如，B5R缺失)；和/或C16(例如，C16L缺失；
参见Fahy等，2008，J.Gen.Virol.89：2377-2387)。同样参见WO2015/027163，其通过引用全文纳入本文。
1995，Cell.81(4)：551-60)；B18R(I型IFN结合蛋白；例如参见Colamonici等，1995，J.Biol.Chem.270(27)：15974-8)；B15R(IL-1β结合蛋白；例如参见Alcami等，1992，Cell.71(1)：153-67)；IL-18BP(例如，C12L缺失)；B5R(例如，B5R缺失)；和/或C16(例如，C16L缺失；
参见Fahy等，2008，J.Gen.Virol.89：2377-2387)。同样参见WO2015/027163，其通过引用全文纳入本文。
[0096] 痘苗病毒通常产生四种病毒粒子形式，包括单包膜细胞内成熟病毒粒子(IMV)，三包膜细胞内包膜病毒粒子(IEV)和双包膜细胞相关包膜病毒粒子(CEV)和胞外包膜病毒粒子(EEV)。EEV形式可与远程病毒传播相关联。在本公开的某些实施方式中，如本文所述的溶瘤病毒群可主要包含EEV形式。在某些实施方式中，所公开的修饰的痘苗病毒在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制。例如但不限于，痘苗病毒在肿瘤细胞中的M2巨噬细胞内复制以产生主要包含胞外包膜病毒(EEV)的病毒群。在某些实施方式中，痘苗病毒通过在M2巨噬细胞内复制而部分地避免免疫抑制。
[0097] PIAS3(活化的STAT3的蛋白质抑制剂；本文表示为PIAS3)
[0098] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以是人PIAS3蛋白，其具有NCBI/UniProtKB登录号NP_006090.2中所述的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0099] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可包含具有SEQ ID NO：1序列的氨基酸序列，如下所示：
[0100]
[0101]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0102] 在某些实施方式中，本发明的PIAS3蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：1的连续片段，长度为至少20，或至少30，或至少40，或至少50，或至少60，或至少70，或至少80，或至少90或至少100或至少200个氨基酸或更长，或与其至少约95％或至少约
98％同源的氨基酸序列。
98％同源的氨基酸序列。
[0103] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可包含SEQ ID NO：1的氨基酸133-316或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如，而不是通过限制的方式，PIAS3蛋白可以包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，如下所述：
[0104]或与其至少约95％或至少
约98％同源的氨基酸序列。
约98％同源的氨基酸序列。
[0105] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可包含SEQ ID NO：1的氨基酸132-177或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如，而不是通过限制的方式，PIAS3蛋白可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，如下所述：LPFYEVYGELIRPTTLASTSSQRFEEAHFTFALTPQQVQQILTSRE(SEQ ID NO：3)或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0106] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可包含SEQ ID NO：1的氨基酸126-176或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如，而不是通过限制的方式，PIAS3蛋白可以包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，如下所述：DVTMKPLPFYEVYGELIRPTTLASTSSQRFEEAHFTFALTPQQVQQILTSR(SEQ ID NO：4)或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0107] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可包含SEQ ID NO：1的氨基酸129-316或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如，而不是通过限制的方式，PIAS3蛋白可以包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，如下所述：
[0108]或与其至少约95％
或至少约98％同源的氨基酸序列。
或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0109] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸400-528或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如但不限于，PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，如下所示：
[0110]或与其至少约95％或至少约
98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，可以修饰PIAS3蛋白的C末端以包括含有氨基酸序列RRRRRRRRRHHHHHH(SEQ ID NO：22)的聚精氨酸细胞穿透肽。例如，而不是通过限制的方式，偶联至聚精氨酸细胞穿透肽的PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，如下所述：
98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，可以修饰PIAS3蛋白的C末端以包括含有氨基酸序列RRRRRRRRRHHHHHH(SEQ ID NO：22)的聚精氨酸细胞穿透肽。例如，而不是通过限制的方式，偶联至聚精氨酸细胞穿透肽的PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，如下所述：
[0111]或与其
至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0112] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以是小鼠PIAS3蛋白，其具有NCBI/UniProtKB登录号NP_001159421.1中所述的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如但不限于，小鼠PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列，如下所示：
[0113]
[0114]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0115] 在非限制性实施方式中，本发明的PIAS3蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：6的连续部分，长度为至少20，或至少30，或至少40，或至少50，或至少60，或至少70，或至少80，或至少90或至少100或至少200个氨基酸或更长，或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0116] 在某些实施方式中，小鼠PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：6的氨基酸400-523或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如，而不是通过限制的方式，PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列，如下所述：
[0117]或与其至少约95％或至少约98％同源
的氨基酸序列。在某些实施方式中，可以修饰具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的PIAS3蛋白的C末端以包括聚精氨酸。例如但不限于，PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，如下所示：
的氨基酸序列。在某些实施方式中，可以修饰具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的PIAS3蛋白的C末端以包括聚精氨酸。例如但不限于，PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，如下所示：
[0118]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0119] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以是大鼠PIAS3蛋白，其具有NCBI/UniProtKB登录号NP_113972.2中所述的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。例如但不限于，大鼠PIAS3蛋白包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列，如下所示：
[0120]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0121] 在非限制性实施方式中，本发明的PIAS3蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：7的连续部分，长度为至少20，或至少30，或至少40，或至少50，或至少60，或至少70，或至少80，或至少90或至少100或至少200个氨基酸或更长，或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0122] 在某些实施方式中，本发明的PIAS3蛋白可具有包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，P1AS3蛋白可具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的序列至少约95％同源。在某些实施方式中，P1AS3蛋白可具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的序列至少约98％同源。
[0123] 在某些实施方式中，编码人PIAS3蛋白的核酸可包含GenBank登录号CR457090.1中所述的核酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。例如但不限于，核酸包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列，如下所示：
[0124]
[0125]或与其至少约95％或至少约98％
同源的氨基酸序列。
同源的氨基酸序列。
[0126] 在某些实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：9的核酸序列，如下所述：
[0127]或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。
[0128] 在某些实施方式中，编码PIAS3蛋白的核酸可包含SEQ ID NO：10的核酸序列，如下所述：
[0129]或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。
[0130] 在某些实施方式中，编码包含氨基酸SEQ ID NO：1的氨基酸400-528的人PIAS3蛋白的片段的核酸可包含SEQ ID NO：40的核苷酸序列，如下所述：
[0131]或与其至少约
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
[0132] 在某些实施方式中，编码包含氨基酸SEQ ID NO：1的氨基酸400-528的人PIAS3蛋白的片段和聚精氨酸细胞穿透肽的核酸可包含SEQ ID NO：41的核苷酸序列，如下所述：
[0133]或与其至少约
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
[0134] 在某些实施方式中，编码包含氨基酸SEQ ID NO：1的氨基酸400-523的小鼠PIAS3蛋白的片段的核酸可包含SEQ ID NO：42的核苷酸序列，如下所述：
[0135]或与其至少约95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
[0136] 在某些实施方式中，编码包含氨基酸SEQ ID NO：1的氨基酸400-523的小鼠PIAS3蛋白的片段和聚精氨酸细胞穿透肽的核酸可包含SEQ ID NO：43的核苷酸序列，如下所述：
[0137]或与其至少约
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
95％或至少约98％同源的核苷酸序列。
[0138] 在某些实施方式中，用于本发明的核酸编码包含SEQ ID NO：1或其片段的氨基酸序列的PIAS3蛋白。例如但不限于，用于本发明的核酸可编码包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约
98％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。在某些实施方式中，用于本发明的核酸可编码包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其至少约95％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。在某些实施方式中，用于本发明的核酸可编码包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其至少约98％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。例如但不限于，用于本发明的核酸可包含SEQ ID NO：8-10和40-43中所示的核苷酸序列。
98％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。在某些实施方式中，用于本发明的核酸可编码包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其至少约95％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。在某些实施方式中，用于本发明的核酸可编码包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的氨基酸序列或与其至少约98％同源的氨基酸序列的PIAS蛋白。例如但不限于，用于本发明的核酸可包含SEQ ID NO：8-10和40-43中所示的核苷酸序列。
[0139] 在某些实施方式中，PIAS3蛋白或其片段可以与如本文所述的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒的增强的肿瘤比活性相关。
[0140] SOCS3(细胞因子信-号传导抑制蛋白3；本文表示为SOCS3)
[0141] 在某些实施方式中，STAT3活性的调节剂可以是SOCS3蛋白或其片段。
[0142] 在某些实施方式中，SOCS3蛋白可以是人SOCS3蛋白，其具有GenBank登录号CAG46495.1中所述的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人SOCS3蛋白可包含具有SEQ ID NO：28序列的氨基酸序列，如下所示：
[0143]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨
基酸序列。
基酸序列。
[0144] 在某些实施方式中，编码人SOCS3蛋白的核酸可包含GenBank登录号CR541694.1中所述的核酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。在某些实施方式中，编码人SOCS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：29的核酸序列，如下所述：
[0145]或与其至
少约95％或至少约98％同源的核酸序列。
少约95％或至少约98％同源的核酸序列。
[0146] 在某些实施方式中，SOCS3蛋白可包含具有SEQ ID NO：30序列的氨基酸序列，如下所示：
[0147]或与其至少约95％或至少约98％同
源的氨基酸序列。
源的氨基酸序列。
[0148] 在某些实施方式中，编码小鼠SOCS3蛋白的核酸包含SEQ ID NO：31的核苷酸序列，如下所述：
[0149]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0150] 在非限制性实施方式中，本发明的SOCS3蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：28或30的连续部分，长度为至少20，或至少30，或至少40，或至少50，或至少60，或至少70，或至少80，或至少90或至少100直至200个氨基酸，或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白可具有与SEQ ID NO：28或30的序列至少约95％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白可具有与28或30的序列至少约98％同源的氨基酸序列。
[0151] 在某些实施方式中，用于本发明的核酸编码SOCS3蛋白或其片段。例如但不限于，用于本公开内容的核酸可编码包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列的SOCS3蛋白。例如但不限于，用于本公开内容的核酸可包含SEQ ID NO：29和31所示的核苷酸序列，或与其至少约95％或至少约98％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：29和31中所示的核苷酸序列，或与其至少约95％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：29和31中所示的核苷酸序列，或与其至少约98％同源的核苷酸序列。
[0152] TCPTP(T-细胞蛋白酪氨酸磷酸酶；本文表示为TCPTP)
[0153] 在某些实施方式中，STAT3活性的调节剂可以是TCPTP蛋白。
[0154] 在某些实施方式中，TCPTP蛋白可以是人TCPTP同种型2蛋白，其具有NCBI/UniProtKB登录号NP_536347.1中所述的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，人TCPTP同种型2蛋白可包含具有SEQ ID NO：32序列的氨基酸序列，如下所示：
[0155]或与其至少
约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0156] 在某些实施方式中，编码人TCPTP同种型2蛋白的核酸可包含NCBI/UniProtKB登录号NM_080422.2中所述的核酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。在某些实施方式中，编码人TCPTP同种型2蛋白的核酸包含SEQ ID NO：33的核苷酸序列，如下所述：
[0157]
[0158]或与其至少约95％或至少约98％同源的核酸序列。
[0159] 在某些实施方式中，小鼠TCPTP同种型2蛋白可包含具有SEQ ID NO：34序列的氨基酸序列，如下所示：
[0160]或与其至少约95％或至少约
98％同源的氨基酸序列。
98％同源的氨基酸序列。
[0161] 在某些实施方式中，编码小鼠TCPTP同种型2蛋白的核酸包含SEQ ID NO：35的核苷酸序列，如下所述：
[0162]
[0163]或与其至少约95％或至少
约98％同源的核酸序列。
约98％同源的核酸序列。
[0164] 在非限制性实施方式中，本发明的TCPTP蛋白可具有氨基酸序列，所述氨基酸序列为SEQ ID NO：32或34的连续部分，长度为至少20，或至少30，或至少40，或至少50，或至少60，或至少70，或至少80，或至少90或至少100直至200个氨基酸，或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白可具有与SEQ ID NO：32或34的序列至少约95％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白可具有与32或34的序列至少约98％同源的氨基酸序列。
[0165] 在某些实施方式中，用于本发明的核酸编码TCPTP蛋白。例如但不限于，用于本公开内容的核酸可编码包含SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列的TCPTP蛋白，即TCPTP同种型2蛋白。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：33和35中所示的核苷酸序列，或与其至少约95％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：33和35中所示的核苷酸序列，或与其至少约98％同源的核苷酸序列。例如但不限于，用于本发明的核酸可包含SEQ ID NO：33和35中所示的核苷酸序列。
[0166] 含显性负突变的STAT3
[0167] 在某些实施方式中，STAT3活性的调节剂可以是具有一个或多个显性负突变的STAT3蛋白。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可以是显性负突变体人STAT3蛋白。
[0168] 在某些实施方式中，显性负突变体人STAT3蛋白可在氨基酸705处具有突变，例如Y705F。例如但不限于，显性负突变体STAT3蛋白可包含具有SEQ ID NO：36序列的氨基酸序列，如下所示：
[0169]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0170] 在某些实施方式中，SEQ ID NO：36可以由SEQ ID NO：37的核苷酸序列编码，如下所述：
[0171]
[0172]
[0173]或与其至少约95％或至少约98％同源
的核酸序列。
的核酸序列。
[0174] 在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可在氨基酸434和/或435处具有一个或多个突变，例如E434A和E435A。例如但不限于，显性负突变体人STAT3蛋白包含具有SEQ ID NO：38序列的氨基酸序列，如下所示：
[0175]
[0176]或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列。
[0177] 在某些实施方式中，SEQ ID NO：38可以由SEQ ID NO：39的核苷酸序列编码，如下所述：
[0178]
[0179]或与其至少约95％或至少约98％同源
的核苷酸序列。
的核苷酸序列。
[0180] 在某些实施方式中，用于本发明的核酸可编码显性负突变体STAT3蛋白。例如但不限于，用于本公开内容的核酸可编码包含SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38的氨基酸序列或与其至少约95％或至少约98％同源的氨基酸序列的显性负突变体STAT3蛋白。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可具有与SEQ ID NO：36或38的序列至少约95％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可具有与36或38的序列至少约98％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：37和39中所示的核苷酸序列，或与其至少约95％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，用于本公开的核酸可包含SEQ ID NO：37和39中所示的核苷酸序列，或与其至少约98％同源的核苷酸序列。
[0181] 在某些实施方式中，溶瘤病毒可包含与SEQ ID NO：1-7、11、14、16、18、20、22、24-28、30、32、34、36和38中任一个的氨基酸序列95％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，溶瘤病毒可包含与SEQ ID NO：1-7、11、14、16、18、20、22、24-28、30、32、34、36和38中任一个的氨基酸序列98％同源的氨基酸序列。
[0182] 在某些实施方式中，溶瘤病毒可包含与SEQ ID NO：8-10、12-13、15、17、19、21、23、29、31、33、35、37和39-43中任一个的核苷酸序列95％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，溶瘤病毒可包含与SEQ ID NO：8-10、12-13、15、17、19、21、23、29、31、33、35、37和39-43中任一个的核苷酸序列98％同源的核苷酸序列。
[0183] 在某些实施方式中，可以对上述PIAS3，SOCS3或TCPTP蛋白的氨基酸序列进行改变，其中所得蛋白质保持作为STAT3调节剂的功能。在某些实施方式中，此类变化称为保守取代。如本文所用，术语“保守取代”和“保守修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的本发明公开的STAT3调节蛋白的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代，添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变将修饰引入本公开的STAT3调节蛋白中。氨基酸可根据其物理化学性质如电荷和极性分为几组。
[0184] 保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被同一组内的氨基酸取代的氨基酸取代。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸，精氨酸，组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸，谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸，天冬酰胺，半胱氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)，天冬酰胺，天冬氨酸(酸性极性)，谷氨酸(酸性极性)，谷氨酰胺，组氨酸(碱性极性)，赖氨酸(碱性极性)，丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，色氨酸和缬氨酸。因此，所公开的STAT3调节剂中的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同组的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的STAT3调节蛋白的保留功能。在某些实施方式中，改变特定序列内不超过一个，不超过两个，不超过三个，不超过四个，不超过五个残基。示例性保守氨基酸取代显示在表1中。
[0185] 表1
[0186]
[0187]
[0188] 癌症靶标
[0189] 在本公开的某些实施方式中，考虑了通过递送修饰的病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒)来治疗过度增殖性疾病(例如癌症或肿瘤)的方法。可以通过可包含编码本公开的STAT3介导的基因激活的调节剂的外源核酸的修饰的病毒，例如，修饰的痘苗病毒治疗的癌症可包括但不限于黑素瘤，肝细胞癌，乳腺癌，肺癌，前列腺癌，膀胱癌，卵巢癌，白血病，淋巴瘤，肾癌，胰腺癌，上皮癌，胃癌，结肠癌，十二指肠癌，胰腺癌，间皮瘤，多形性胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，多发性骨髓瘤，前列腺癌，肝细胞癌，胆管肉瘤，胰腺癌，头颈部鳞状细胞癌，结肠直肠癌，肠型胃腺癌，宫颈鳞状细胞癌，骨肉瘤，上皮性卵巢癌，急性淋巴细胞性淋巴瘤，骨髓增生性肿瘤和肉瘤。
[0190] 以通过本发明的方法治疗的癌细胞包括来自膀胱，血液，骨，骨髓，脑，乳房，结肠，食道，胃肠道，胶，头，肾，肝，肺，鼻咽，颈，卵巢，前列腺，皮肤，胃，睾丸，舌头或子宫的细胞。此外，癌症可具体地具有以下组织学类型，但不限于这些：瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并的肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；亲氧腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包封性硬化性癌；肾上腺皮质癌；卵巢内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢问质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；男性细胞瘤，恶性；塞尔托利氏细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨大色素痣中的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维性组织细胞瘤，恶性；黏液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤；缪氏混合瘤；肾胚细胞瘤；肝母细胞癌；癌肉瘤；间质瘤，恶性；布伦内罗氏瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎癌；
畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；
卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；成骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；
成软骨细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙肉瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索癌；神经胶质瘤，恶性；
室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘膜瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金疾病；霍奇金病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞性，扩散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；
巨核细胞白血病；髓样肉瘤；以及毛细胞白血病。在各种实例中，用于本公开的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的STAT3介导的基因激活的调节剂可以是PIAS3蛋白或蛋白质或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，STAT3蛋白或其片段，例如可包含显性负突变的STAT3蛋白，所述调节剂可用于治疗本文公开的癌症靶标。
畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；
卡波济氏肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；成骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；
成软骨细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙肉瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索癌；神经胶质瘤，恶性；
室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆型星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘膜瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金疾病；霍奇金病；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞性，扩散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；
巨核细胞白血病；髓样肉瘤；以及毛细胞白血病。在各种实例中，用于本公开的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的STAT3介导的基因激活的调节剂可以是PIAS3蛋白或蛋白质或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，STAT3蛋白或其片段，例如可包含显性负突变的STAT3蛋白，所述调节剂可用于治疗本文公开的癌症靶标。
[0191] 本公开还涵盖用于抑制或预防任何类型的原发性癌症的局部侵袭性或转移性或局部侵袭性和转移性的方法。例如，原发性癌症可以是黑色素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌肺、肝癌、白血病、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、牙龈肿瘤、舌肿瘤、神经母细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌或膀胱癌。在某些实施方式中，原发性癌症可以是肺癌。例如但不限于，肺癌可以是非小细胞肺癌。此外，本发明可用于预防癌症或治疗癌前或癌前期细胞，包括化生，发育不良和增生。它还可用于抑制不希望但良性的细胞，例如鳞状上皮化生，发育不良，良性前列腺增生细胞，增生性病变等。在某些实施方式中，可通过涉及STAT3调节剂的方法来停止，破坏或延迟癌症或更严重形式的癌症的进展，所述STAT3调节剂可由修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)编码，如本文所述。在各种实例中，用于本公开的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的STAT3介导的基因激活的调节剂可以是PIAS3蛋白或蛋白质或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，STAT3蛋白或其片段，例如可包含显性负突变的STAT3蛋白，所述调节剂可用于抑制或预防任何类型原发性癌症的局部侵袭性或转移性，或局部侵袭性和转移性。
[0192] 治疗和测定功效和药代动力学的方法
[0193] 本公开内容提供了通过给予一种或多种本文公开的修饰的病毒来治疗对象的方法。“对象”或“患者”在本文中可互换使用，指人或非人对象。非人对象的非限制性实例包括非人灵长类动物，狗，猫，小鼠，大鼠，豚鼠，兔，猪，家禽，马，牛，山羊，绵羊，鲸类等。在某些实施方案中，所述对象是人。
[0194] 本公开内容提供了在癌细胞中产生毒性作用的方法，包括向癌细胞给予治疗有效量的如上所述的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，或含有其的药物组合物。本公开还提供抑制第二癌细胞的生长和/或增殖的方法，包括向第一癌细胞给予如上所述的修饰的病毒，使得第一癌细胞被所述病毒感染。因此，在本文公开的方法的某些实施方式中，预期并非每种癌症或肿瘤细胞在给予治疗有效量的如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有其的药物组合物后被感染，并且未感染的细胞可以在没有直接感染的情况下被抑制。
[0195] 在某些实施方式中，为了使用本公开内容的方法和组合物诱导溶瘤作用，杀死细胞，抑制生长，抑制转移，减小肿瘤大小以及以其他方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型，癌细胞或肿瘤可与治疗有效剂量的如本文所述的示例性溶瘤痘苗病毒或含有其的药物组合物接触。在某些实施方式中，本公开的有效量的修饰的病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒)或其药物组合物，可包括足以诱导癌细胞的溶瘤，破坏或裂解的量或抑制或减小癌细胞的生长或大小的量。减少癌细胞的生长可以通过例如细胞死亡或较慢的复制速率或包含细胞的肿瘤的生长速率降低或含有癌细胞的对象的延长的存活来表现。
[0196] 本公开还提供了至少部分地使癌症患者对癌症治疗再敏感的方法，包括向有需要的对象给予治疗有效量的根据本公开的溶瘤痘苗病毒或如本文所述的药物组合物，并与增强痘苗病毒在肿瘤细胞内复制的药物相组合。
[0197] 在某些实施方式中，提供了治疗患有癌症或肿瘤的对象的方法，包括向对象给予有效量的如上所述的修饰的病毒。所述方法中的有效量可包括使癌症的生长速率或传播减小，或使对象的存活延长的量。本发明提供减少肿瘤生长的方法，所述方法可包括给予所述肿瘤有效量的如上所述的修饰的病毒。在某些实施方式中，有效量的修饰的病毒或其药物组合物可包括足以诱导肿瘤生长或大小减缓、抑制或减小的量，并且可包括根除肿瘤的量。例如，通过降低生长速率或延长含有肿瘤的对象的存活，可以表现出减少肿瘤的生长。
[0198] 本公开还提供了确定如本文所述的溶瘤痘苗病毒的感染性或抗肿瘤活性的方法，该方法可以包括(i)从对象收集第一生物样品并测定第一生物样品中STAT3的水平；(ii)单独或与其他疗法组合给予对象治疗有效量的本发明的溶瘤痘苗病毒或药物组合物；(iii)在步骤(ii)给药后约15分钟至约72小时后从对象收集第二生物样品，和(iii)检测第二生物样品中STAT3蛋白的水平，其中如果步骤(iii)中STAT3的水平低于步骤(i)，则确定溶瘤痘苗病毒具有感染性或表现出抗肿瘤活性。在某些实施方式中，上文公开的方法可以进一步包括，在步骤(i)和(iii)中检测由STAT3调节的一种或多种蛋白质的水平，例如Asp53(Uniprot登录号P04637-1)，Fas(Uniprot登录号P25445)，Hsp70(Uniprot登录号P0DMV8)，细胞周期蛋白D1(Uniprot登录号P24385)，IL-10(Uniprot登录号P22301.1)等。参见，例如，Carpenter和Lo，Cancers 2014，6，897-925。
[0199] 在某些实施方式中，通过测定在给予所述对象治疗有效量的本发明的修饰的病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒)或包含其的药物组合物后从对象收集的血浆样品中的细胞因子水平，例如IL-2，IL-7，IL-8，IL-10，IFN-γ，GM-CSF，TNF-α，IL-6，IL-4，IL-5和IL-13来确定抗肿瘤功效。
[0200] 本文进一步提供了在给予治疗有效量的根据本发明的修饰的病毒，例如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有痘苗病毒的药物组合物后监测药代动力学的方法。用于监测药代动力学的示例性方法可包括以下步骤：(i)单独或与其他疗法组合向对象给予治疗有效量的溶瘤痘苗病毒或包含其的药物组合物；(ii)在选自步骤(ii)中给药后约15分钟，约30分钟，约45分钟，约60分钟，约75分钟，约90分钟，约120分钟，约180分钟和约240分钟的一个或多个时间点从对象收集生物样品，和(iii)检测在上述时间点收集的生物样品中病毒基因组的量。在某些实施方式中，在15分钟时间点收集的样品中病毒基因组拷贝/mL可以是最高的，并且在240分钟时间点收集的样品可以不包含可检测量的病毒基因组。因此，在某些实施方式中，可以在给予后约15分钟观察到病毒峰，并且在约240分钟(或4小时)后可以从对象的系统中清除大部分病毒。在某些实施方式中，在给予后约15分钟后可以观察到第一病毒峰，并且可以在随后的时间点，例如，在约30分钟，约45分钟，约60分钟，或约90分钟时收集的生物样品中观察到第二病毒峰。在某些实施方式中，生物样品可以是血液，并且病毒基因组/mL的量可以通过定量PCR或其他适当的技术来确定。在某些实施方式中，在给予后约15分钟后可观察到第一病毒峰，并且在给予本公开的修饰病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒)后约3小时至约72小时后可观察到第二病毒峰。
[0201] 修饰的病毒的递送
[0202] 在某些实施方式中，给予对象的本公开的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的量可以是约103至1012个感染性病毒颗粒或噬斑形成单位(PFU)，或约105至1010PFU，或约105至108PFU，或约108至1010PFU之间。还参见Thorne和Kim，2009，Nat Rev Cancer 9：64-71。在某些实施方式中，给予对象的本公开的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的量可以是约103至
1012个病毒颗粒或PFU，或约105至1010PFU，或约105至108PFU，或约108至1010PFU之间。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可以以约103PFU/剂量至约104PFU/剂量，约104PFU/剂量至约105PFU/剂量，约105PFU/剂量至约106PFU/剂量，约107PFU/剂量至
8 9 10 10 11
约10 PFU/剂量，约10 PFU/剂量至约10 PFU/剂量，约10 PFU/剂量至约10 PFU/剂量，约
1011PFU/剂量至约1012PFU/剂量，约1012PFU/剂量至约1013PFU/剂量，约1013PFU/剂量至约
1014PFU/剂量，或约1014PFU/剂量至约1015PFU/剂量的剂量给予。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可以以可包含约103个病毒颗粒/剂量至约104个病毒颗
4 5 5 6
粒/剂量，约10 个病毒颗粒/剂量至约10个病毒颗粒/剂量，约10个病毒颗粒/剂量至约10个病毒颗粒/剂量，约107个病毒颗粒/剂量至约108个病毒颗粒/剂量，约109个病毒颗粒/剂量至约1010个病毒颗粒/剂量，约1010个病毒颗粒/剂量至约1011个病毒颗粒/剂量，约1011个病毒颗粒/剂量至约1012个病毒颗粒/剂量，约1012个病毒颗粒/剂量至约1013个病毒颗粒/剂量，约1013个病毒颗粒/剂量至约1014个病毒颗粒/剂量，或约1014个病毒颗粒/剂量至约1015个病毒颗粒/剂量的剂量给予。
1012个病毒颗粒或PFU，或约105至1010PFU，或约105至108PFU，或约108至1010PFU之间。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可以以约103PFU/剂量至约104PFU/剂量，约104PFU/剂量至约105PFU/剂量，约105PFU/剂量至约106PFU/剂量，约107PFU/剂量至
8 9 10 10 11
约10 PFU/剂量，约10 PFU/剂量至约10 PFU/剂量，约10 PFU/剂量至约10 PFU/剂量，约
1011PFU/剂量至约1012PFU/剂量，约1012PFU/剂量至约1013PFU/剂量，约1013PFU/剂量至约
1014PFU/剂量，或约1014PFU/剂量至约1015PFU/剂量的剂量给予。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可以以可包含约103个病毒颗粒/剂量至约104个病毒颗
4 5 5 6
粒/剂量，约10 个病毒颗粒/剂量至约10个病毒颗粒/剂量，约10个病毒颗粒/剂量至约10个病毒颗粒/剂量，约107个病毒颗粒/剂量至约108个病毒颗粒/剂量，约109个病毒颗粒/剂量至约1010个病毒颗粒/剂量，约1010个病毒颗粒/剂量至约1011个病毒颗粒/剂量，约1011个病毒颗粒/剂量至约1012个病毒颗粒/剂量，约1012个病毒颗粒/剂量至约1013个病毒颗粒/剂量，约1013个病毒颗粒/剂量至约1014个病毒颗粒/剂量，或约1014个病毒颗粒/剂量至约1015个病毒颗粒/剂量的剂量给予。
[0203] 在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒可以以可包含约103PFU/kg至约104PFU/kg，约104PFU/kg至约105PFU/kg，约105PFU/kg至约106PFU/kg，约107PFU/kg至约108PFU/kg，约109PFU/kg至约1010PFU/kg，约1010PFU/kg至约1011PFU/kg，约1011PFU/kg至约1012PFU/kg，约1012PFU/kg至约1013PFU/kg，约1013PFU/kg至约1014PFU/kg，或约1014PFU/kg至约1015PFU/3
kg的剂量给予。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒可以以可包含约10个病毒颗粒/kg至约104个病毒颗粒/kg，约104个病毒颗粒/kg至约105个病毒颗粒/kg，约105个病毒颗粒/kg至约106个病毒颗粒/kg，约107个病毒颗粒/kg至约108个病毒颗粒/kg，约109个病毒颗粒/kg至约1010个病毒颗粒/kg，约1010个病毒颗粒/kg至约1011个病毒颗粒/kg，约1011个病毒颗
12 12 13 13
粒/kg至约10 个病毒颗粒/kg，约10 个病毒颗粒/kg至约10 个病毒颗粒/kg，约10 个病毒颗粒/kg至约1014个病毒颗粒/kg，或约1014个病毒颗粒/kg至约1015个病毒颗粒/kg的剂量给予。
kg的剂量给予。在某些实施方式中，本发明的修饰的病毒可以以可包含约10个病毒颗粒/kg至约104个病毒颗粒/kg，约104个病毒颗粒/kg至约105个病毒颗粒/kg，约105个病毒颗粒/kg至约106个病毒颗粒/kg，约107个病毒颗粒/kg至约108个病毒颗粒/kg，约109个病毒颗粒/kg至约1010个病毒颗粒/kg，约1010个病毒颗粒/kg至约1011个病毒颗粒/kg，约1011个病毒颗
12 12 13 13
粒/kg至约10 个病毒颗粒/kg，约10 个病毒颗粒/kg至约10 个病毒颗粒/kg，约10 个病毒颗粒/kg至约1014个病毒颗粒/kg，或约1014个病毒颗粒/kg至约1015个病毒颗粒/kg的剂量给予。
[0204] 在某些实施方式中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒的液体剂型可包含约103PFU/mL4 4 5 5 6 7
至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约
108PFU/mL，约109PFU/mL至约1010PFU/mL，约1010PFU/mL至约1011PFU/mL，约1011PFU/mL至约
1012PFU/mL，约1012PFU/mL至约1013PFU/mL，约1013PFU/mL至约1014PFU/mL，或约1014PFU/mL至约1015PFU/mL的病毒剂量。在某些实施方式中，当通过注射给予修饰的病毒时，剂量可包含每次注射约103个病毒颗粒，每次注射104个病毒颗粒，每次注射105个病毒颗粒，每次注射
106个病毒颗粒，每次注射107个病毒颗粒，每次注射108个病毒颗粒，每次注射109个病毒颗粒，每次注射1010个病毒颗粒，每次注射1011个病毒颗粒，每次注射1012个病毒颗粒，每次注射2×1012个病毒颗粒，每次注射1013个病毒颗粒，每次注射1014个病毒颗粒，或每次注射1015个病毒颗粒。在某些实施方式中，当通过注射给予修饰的病毒时，剂量可包含每次注射约
103个感染性病毒颗粒，每次注射104个感染性病毒颗粒，每次注射105个感染性病毒颗粒，每次注射106个感染性病毒颗粒，每次注射107个感染性病毒颗粒，每次注射108个感染性病毒颗粒，每次注射109个感染性病毒颗粒，每次注射1010个感染性病毒颗粒，每次注射1011个感染性病毒颗粒，每次注射1012个感染性病毒颗粒，每次注射2×1012个感染性病毒颗粒，每次注射1013个感染性病毒颗粒，每次注射1014个感染性病毒颗粒，或每次注射1015个感染性病毒颗粒。在另外的实施方式中，本发明的修饰的病毒可以以约103组织培养抑制剂剂量50％(TCID50)/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，
104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，
4 8 8 8 9
10 TCID50/kg，3x10 TCID50/kg，4x10 TCID50/kg，5x10 TCID50/kg，3x10 TCID50/kg，
4x109TCID50/kg，5x109TCID50/kg，3x1010TCID50/kg，4x1010TCID50/kg或4x1010TCID50/kg的剂量给予。注意，此处10x可选地表示为1eX。在某些实施方式中，修饰的病毒可以一个或多个剂量给予。在某些实施方式中，所述病毒的给予量足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞，至少约30％的肿瘤细胞，至少约40％的肿瘤细胞，至少约50％的肿瘤细胞，至少约60％的肿瘤细胞，至少约70％的肿瘤细胞，至少约80％的肿瘤细胞，或至少约90％的肿瘤细胞中的溶瘤作用。在某些实施方式中，单剂量的病毒可以指在1、2、5、10、15、20或24小时期间给予对象或肿瘤的量。在某些实施方式中，剂量可以随时间推移或通过单独注射分散。在某些实施方式中，可以向对象给予多剂量(例如，2、3、4、5、或更多剂量)的痘苗病毒，例如，其中第二次治疗可以在第一次治疗的1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5、6、7周内发生。在某些实施方式中，可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或数周的时间内向对象给予多剂量的修饰的病毒。在某些实施方式中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2周，约2周至约3周，约3周至约4周，约4周至约5周，约6周至约7周，约7周至约8周，约8周至约9周，约9周至约
10周，约10周至约11周，约11周至约12周，约12周至约24周，约24周至约48周，约48周或约52周或更长的时间内给予。在某些情况下，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物的给予频率可以是每天一次，每天两次，每周一次，每三周一次，每四周一次(或每月一次)，每8周一次(或每2个月一次)，每12周一次(或每3个月一次)，或每24周一次(每6个月一次)。在本文公开的方法的某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量给予持续第一时间段，中间剂量给予持续第二时间段，并且高剂量给予持续第三时间段。在某些实施方式中，初始剂量低于中间剂量并且中间剂量低于高剂量。在某些实施方式中，第一，第二和第三时间段独立地为约1周至约2周，约2周至约3周，约3周至约4周，约4周至约5周，约6周至约7周，约7周至约8周，约8周至约9周，约9周至约10周，约10周至约11周，约11周至约12周，约12周至约24周，约24周至约48周，约48周或约52周或更长。
至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约10PFU/mL，约10PFU/mL至约
108PFU/mL，约109PFU/mL至约1010PFU/mL，约1010PFU/mL至约1011PFU/mL，约1011PFU/mL至约
1012PFU/mL，约1012PFU/mL至约1013PFU/mL，约1013PFU/mL至约1014PFU/mL，或约1014PFU/mL至约1015PFU/mL的病毒剂量。在某些实施方式中，当通过注射给予修饰的病毒时，剂量可包含每次注射约103个病毒颗粒，每次注射104个病毒颗粒，每次注射105个病毒颗粒，每次注射
106个病毒颗粒，每次注射107个病毒颗粒，每次注射108个病毒颗粒，每次注射109个病毒颗粒，每次注射1010个病毒颗粒，每次注射1011个病毒颗粒，每次注射1012个病毒颗粒，每次注射2×1012个病毒颗粒，每次注射1013个病毒颗粒，每次注射1014个病毒颗粒，或每次注射1015个病毒颗粒。在某些实施方式中，当通过注射给予修饰的病毒时，剂量可包含每次注射约
103个感染性病毒颗粒，每次注射104个感染性病毒颗粒，每次注射105个感染性病毒颗粒，每次注射106个感染性病毒颗粒，每次注射107个感染性病毒颗粒，每次注射108个感染性病毒颗粒，每次注射109个感染性病毒颗粒，每次注射1010个感染性病毒颗粒，每次注射1011个感染性病毒颗粒，每次注射1012个感染性病毒颗粒，每次注射2×1012个感染性病毒颗粒，每次注射1013个感染性病毒颗粒，每次注射1014个感染性病毒颗粒，或每次注射1015个感染性病毒颗粒。在另外的实施方式中，本发明的修饰的病毒可以以约103组织培养抑制剂剂量50％(TCID50)/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，
104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，104TCID50/kg，
4 8 8 8 9
10 TCID50/kg，3x10 TCID50/kg，4x10 TCID50/kg，5x10 TCID50/kg，3x10 TCID50/kg，
4x109TCID50/kg，5x109TCID50/kg，3x1010TCID50/kg，4x1010TCID50/kg或4x1010TCID50/kg的剂量给予。注意，此处10x可选地表示为1eX。在某些实施方式中，修饰的病毒可以一个或多个剂量给予。在某些实施方式中，所述病毒的给予量足以诱导肿瘤中至少约20％的细胞，至少约30％的肿瘤细胞，至少约40％的肿瘤细胞，至少约50％的肿瘤细胞，至少约60％的肿瘤细胞，至少约70％的肿瘤细胞，至少约80％的肿瘤细胞，或至少约90％的肿瘤细胞中的溶瘤作用。在某些实施方式中，单剂量的病毒可以指在1、2、5、10、15、20或24小时期间给予对象或肿瘤的量。在某些实施方式中，剂量可以随时间推移或通过单独注射分散。在某些实施方式中，可以向对象给予多剂量(例如，2、3、4、5、或更多剂量)的痘苗病毒，例如，其中第二次治疗可以在第一次治疗的1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5、6、7周内发生。在某些实施方式中，可以在1、2、3、4、5、6、7或更多天或数周的时间内向对象给予多剂量的修饰的病毒。在某些实施方式中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以在约1周至约2周，约2周至约3周，约3周至约4周，约4周至约5周，约6周至约7周，约7周至约8周，约8周至约9周，约9周至约
10周，约10周至约11周，约11周至约12周，约12周至约24周，约24周至约48周，约48周或约52周或更长的时间内给予。在某些情况下，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或药物组合物的给予频率可以是每天一次，每天两次，每周一次，每三周一次，每四周一次(或每月一次)，每8周一次(或每2个月一次)，每12周一次(或每3个月一次)，或每24周一次(每6个月一次)。在本文公开的方法的某些实施方式中，溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以独立地以初始剂量给予持续第一时间段，中间剂量给予持续第二时间段，并且高剂量给予持续第三时间段。在某些实施方式中，初始剂量低于中间剂量并且中间剂量低于高剂量。在某些实施方式中，第一，第二和第三时间段独立地为约1周至约2周，约2周至约3周，约3周至约4周，约4周至约5周，约6周至约7周，约7周至约8周，约8周至约9周，约9周至约10周，约10周至约11周，约11周至约12周，约12周至约24周，约24周至约48周，约48周或约52周或更长。
[0205] 在某些实施方式中，根据本文描述的任何治疗方法，对象可以在给予修饰的病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒)或包含其的药物组合物之前，同时和之后给予减少的碳水化合物饮食，例如生酮饮食。在某些实施方式中，对象进行饮食，其可包括每天消耗少于500克的碳水化合物，每天少于450克的碳水化合物，每天少于450克的碳水化合物，每天少于400克的碳水化合物，每天少于350克碳水化合物，每天少于300克碳水化合物，每天少于250克碳水化合物，每天少于200克碳水化合物，每天少于150克碳水化合物，每天少于100克碳水化合物，每天少于90克碳水化合物，每天少于80克碳水化合物，每天少于70克碳水化合物，每天少于60克碳水化合物，每天少于50克碳水化合物，每天少于40克碳水化合物，每天少于30克碳水化合物，每天少于20克碳水化合物，或每天少于10克碳水化合物。
[0206] 用于将本公开的修饰的病毒(例如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含其的药物组合物)递送至癌症或肿瘤细胞的示例性方法可以通过肿瘤内注射。然而，也可以使用其他给药方法，例如静脉内，通过输注，肠胃外，静脉内，皮内，肌肉内，透皮，直肠，尿道内，阴道内，鼻内，鞘内或腹膜内。给药途径可随肿瘤的位置和性质而变化。在某些实施方式中，给药途径可以是牙内，透皮，肠胃外，静脉内，肌肉内，鼻内，皮下，区域(例如，在肿瘤附近，特别是与肿瘤的脉管系统或相邻脉管系统)，经皮，鞘内，气管内，腹膜内，动脉内，膀胱内，肿瘤内，吸入，灌注，灌洗或口服。在某些实施方式中，可以将修饰的病毒从植入患者体内的来源给予患者。在某些实施方式中，修饰的病毒的给予可以通过在选定的一段时间内连续输注来进行。在某些实施方式中，如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有其的药物组合物可以通过输注在约15分钟，约30分钟，约45分钟，约50分钟，约50分钟，约55分钟，约60分钟，约75分钟，约90分钟，约100分钟，或约120分钟或更长的时间段内以治疗有效剂量给予。本发明的溶瘤痘苗病毒或药物组合物可以以液体剂量给药，其中给药的总体积为约1ml至约5ml，约5ml至
10ml，约15ml至约20ml，约25ml至约30ml，约30ml至约50ml，约50ml至约100ml，约100ml至
150ml，约150ml至约200ml，约200ml至约250ml，约250ml至约300ml，约300ml至约350ml，约
350ml至约400ml，约400ml至约450ml，约450ml至500ml，约500ml至750ml或约750ml至
1000ml。
10ml，约15ml至约20ml，约25ml至约30ml，约30ml至约50ml，约50ml至约100ml，约100ml至
150ml，约150ml至约200ml，约200ml至约250ml，约250ml至约300ml，约300ml至约350ml，约
350ml至约400ml，约400ml至约450ml，约450ml至500ml，约500ml至750ml或约750ml至
1000ml。
[0207] 药物组合物
[0208] 本公开还提供了包含本文公开的修饰的病毒的药物组合物。在某些实施方式中，含有本文所述的修饰的病毒(例如溶瘤痘苗病毒)的药物组合物可制备成溶液，甘油中的分散体，液体聚乙二醇及其在油中的任意组合，固体剂型，如可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任意组合。相对于特定的给药途径配制药物组合物。例如但不限于，可以胃肠外，静脉内，皮内，肌肉内，透皮或腹膜内给予的药物组合物描述于美国专利号5,543,158、5,641,515和5,399,363中，其内容通过引用全文纳人本文。
[0209] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含赋形剂。赋形剂可以是《药学赋形剂手册》，美国药学协会(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例可包括缓冲剂，防腐剂，稳定剂，粘合剂，压实剂，润滑剂，螯合剂，分散增强剂，崩解剂，调味剂，甜味剂，着色剂。
[0210] 在某些实施方式中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例可包括柠檬酸钠，碳酸镁，碳酸氢镁，碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，碳酸氢钠，碳酸氢钾，氢氧化镁，乳酸镁，葡萄糖酸镁，氢氧化铝，柠檬酸钠，酒石酸钠，乙酸钠，碳酸钠，多磷酸钠，多磷酸钾，焦磷酸钠，焦磷酸钾，磷酸氢二钠制药，磷酸氢二钾，磷酸三钠，磷酸三钾，偏磷酸钾，氧化镁，氢氧化镁，碳酸镁，硅酸镁，醋酸钙，甘油磷酸钙，氯化钙，氢氧化钙等钙盐或其组合可用于药物配制。
[0211] 在某些实施方式中，赋形剂可包含防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例可包括抗氧化剂，例如α-生育酚和抗坏血酸盐，和抗微生物剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇和苯酚。抗氧化剂可进一步包括但不限于EDTA，柠檬酸，抗坏血酸，丁基化羟基甲苯(BHT)，丁基化羟基苯甲醚(BHA)，亚硫酸钠，对氨基苯甲酸，谷胱甘肽，没食子酸丙酯，半胱氨酸，甲硫氨酸，乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在某些实施方式中，防腐剂可包括有效霉素A，TL-3，邻钒酸钠，氟化钠，N-α-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮，N-α-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮，抑肽酶，苯基甲基磺酰氟，二异丙基氟磷酸盐，激酶抑制剂，磷酸酶抑制剂，半胱天冬酶抑制剂，颗粒酶抑制剂，细胞粘附抑制剂，细胞分裂抑制剂，细胞周期抑制剂，脂质信号传导抑制剂，蛋白酶抑制剂，还原剂，烷化剂，抗微生物剂，氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
[0212] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例可包括淀粉，预糊化淀粉，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，乙基纤维素，聚丙烯酰胺，聚乙烯基唑烷酮，聚乙烯醇，C12-C18脂肪酸醇，聚乙二醇，多元醇，糖类，低聚糖，及其组合。可以在药物制剂中使用的粘合剂可以选自淀粉，例如马铃薯淀粉，玉米淀粉，小麦淀粉；糖，如蔗糖，葡萄糖，葡萄糖，乳糖，麦芽糖糊精；天然和合成树胶；明胶；纤维素衍生物如微晶纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇类如山梨糖醇，木糖醇，甘露醇和水或其组合。
[0213] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例可包括硬脂酸镁，硬脂酸钙，硬脂酸锌，氢化植物油，Sterotex，聚氧乙烯单硬脂酸酯，滑石，聚乙二醇，苯甲酸钠，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。可用于药物制剂的润滑剂可选自金属硬脂酸盐(例如硬脂酸镁，硬脂酸钙，硬脂酸铝)，脂肪酸酯(例如硬脂酰富马酸钠)，脂肪酸(例如硬脂酸)，脂肪醇类，山嵛酸甘油酯，矿物油，石蜡，氢化植物油，亮氨酸，聚乙二醇(PEG)，金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸镁)，氯化钠，苯甲酸钠，乙酸钠和滑石粉或其组合。
[0214] 在某些实施方式中，药物制剂可包含分散增强剂作为赋形剂。合适的分散剂的非限制性实例可包括淀粉，海藻酸，聚乙烯吡咯烷酮，瓜尔胶，高岭土，膨润土，纯化木纤维素，羟基乙酸淀粉钠，异戊酸硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
[0215] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含崩解剂作为赋形剂。在某些实施方式中，崩解剂可以是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例可包括淀粉，例如玉米淀粉，马铃薯淀粉，其预糊化和改性的淀粉，甜味剂，粘土，例如膨润土，微晶纤维素，藻酸盐，羟基乙酸淀粉钠，树胶，如琼脂，瓜尔胶，刺槐豆胶，刺梧桐树胶，果胶和黄蓍胶。在某些实施方式中，崩解剂可以是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例可包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
[0216] 在某些实施方式中，赋形剂可包含调味剂。掺入外层的调味剂可选自合成香料油和调味芳香剂；天然油；植物，叶子，花和果实的提取物；及其组合。在某些实施方式中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉叶油；香草；柑橘油，如柠檬油，橙油，葡萄和葡萄柚油；和水果精华，包括苹果，桃，梨，草莓，覆盆子，樱桃，李子，菠萝和杏。
[0217] 在某些实施方式中，赋形剂可包含甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例可包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖和它们的混合物(当不用作运载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽类甜味剂，如阿斯巴甜；双氢查耳酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(Stevia rebaudiana，甜叶菊苷)；蔗糖的氯化衍生物，如三氯蔗糖(三氯蔗糖)；糖醇，如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。
[0218] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和美容剂色素(FD&C)、药品和美容剂色素(D&C)、和外用药物和美容剂色素(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
[0219] 在某些实施方式中，如本文所述的药物组合物可包含螯合剂。在某些情况下，螯合剂可以是杀真菌剂。示例可包括但不限于：乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠，三钠，四钠，二钾，三钾，二锂和二铵盐；EDTA的钡，钙，钴，铜，镝，铕，铁，铟，镧，镁，锰，镍，钐，锶或锌螯合物；反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸一水合物；N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1，3-二氨基-2-羟基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；1，3-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；乙二胺-N，N′-二乙酸；乙二胺-N，N′-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N，N′-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N，N′，N′-三乙酸；乙二胺-N，N，N′，N′-四(亚甲基膦酸)；O，O′-双(2-氨基乙基)乙二醇-N，N，N′，N′-四乙酸；N，N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N，N-二乙酸；1，6-六亚甲基二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1，2-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；次氮基三乙酸；硝基三丙酸；硝基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7，19，30-三氧杂-1，4，10，13，16，22，27，33-八氮杂双环[11，11，11]五氯壬烷六溴化物；
或三乙烯四胺-N，N，N′，N″，N″′，N″′-六乙酸。
或三乙烯四胺-N，N，N′，N″，N″′，N″′-六乙酸。
[0220] 还考虑了包含一种或多种本文公开的修饰的病毒和一种或多种其他抗微生物或抗真菌剂的组合产品，例如，多烯如两性霉素B，两性霉素B脂质复合物(ABCD)，脂质体两性霉素B(L-AMB)，和脂质体制霉菌素，唑类和三唑类，例如伏立康唑，氟康唑，酮康唑，伊曲康唑，聚唑唑等；葡聚糖合成酶抑制剂如卡泊芬净，米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；特比萘芬等烯丙胺类；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。此外，预期肽可以与局部抗真菌剂组合，例如环吡酮胺，卤代蛋白，托萘酯，十一烯酸酯，局部制霉菌素，阿莫罗芬，布替萘芬，萘替芳，特比萘芬和其他局部药剂。在某些实施方式中，药物组合物可包含另外的药剂。在一些情况下，另外的药剂可以以治疗有效量存在于药物组合物中。
[0221] 在通常的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物可包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物可不包含防腐剂。适于注射用途的药品形式可包括无菌水性溶液或者分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物可包含运载体，其是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、和/或植物油或其任意组合的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等带来对微生物作用的阻碍。在很多情况中，优选包括等张剂，例如糖类或氯化钠。可通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶用于组合物中来延长可注射组合物的吸收。
[0222] 例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，可以适当地缓冲液体剂型，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些液体剂型特别适用于静脉内，肌肉内，皮下，肿瘤内和腹膜内给药。就此而言，可用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本公开内容已知的。例如，可将一个剂量溶于1mL至20mL等渗NaCl溶液中，并加入100mL至1000mL流体(例如碳酸氢钠缓冲盐水)中或在所提出的输注部位注射。
[0223] 在某些实施方式中，无菌可注射溶液可通过掺入根据本发明的修饰的病毒例如本文所述的溶瘤痘苗病毒或含有其的药物组合物制备，其以所需量与各种其它根据需要的上面列出的成分在适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，将不同的无菌活性成分纳入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载体中制备分散液。本文所述的组合物可以中性或盐形式配置。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的游离氨基基团形成)，其用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。用游离羧基形成的盐还可源自无机碱例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配置后，药物组合物可以能够与剂量配方相容的方式和有效的量给予。
[0224] 在某些实施方式中，本公开的药物组合物可包含有效量的本文公开的修饰的病毒，与药学上可接受的运载体组合。本文所用的“药学上可接受的”涵盖任何运载体，其不干扰活性成分的生物学活性的有效性和/或对给予的患者无毒。合适的药物运载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳液，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的运载体的其他非限制性实例可包括凝胶，生物可吸收的基质材料，含有修饰的病毒的植入元件或任何其它合适的载剂，递送或分配装置或材料。这些运载体可以通过常规方法配制，并且可以以有效量给予对象。
[0225] 生产方法
[0226] 本公开的修饰的病毒可通过本领域技术人员已知的方法生产。在某些实施方式中，修饰的病毒可以在合适的宿主细胞中繁殖，从宿主细胞中分离并储存在促进病毒稳定性和完整性的条件下，使得随时间的感染性丧失最小化。宿主细胞的非限制性实例包括HeLa细胞，HEK293细胞和Vero细胞。在某些示例性方法中，使用细胞堆叠，滚瓶或灌注生物反应器在宿主细胞中繁殖修饰的病毒。在某些实施方式中，用于纯化修饰的病毒的下游方法可包括过滤(例如深度过滤，切向流过滤或其组合)，超速离心或色谱捕获。修饰的病毒可以例如通过冷冻或干燥，例如通过冷冻干燥来储存。在某些实施方式中，在给予之前，可以将储存的修饰的病毒(如果干燥用于储存)在药学上可接受的运载体中重建并稀释用于给予。
[0227] 联合疗法
[0228] 在某些实施方式中，本公开内容的方法包括在一种或多种其他疗法之后，之前，或与之组合给予本文公开的修饰的病毒或含有其的药物组合物。其他疗法的实例可包括但不限于化学疗法，放射疗法，用另外的病毒进行的溶瘤病毒疗法，用免疫调节蛋白治疗，STAT3抑制剂，抗癌剂或其任意组合。关于给予修饰的病毒，例如溶瘤痘苗病毒，可以同时或相继给予其他疗法。在某些实施方式中，本公开内容的方法可包括在一种或多种抗癌剂或癌症疗法之后，之前，或与之组合给予本文公开的修饰的病毒。抗癌剂可包括但不限于化学治疗剂，放射治疗剂，细胞因子，免疫检查点抑制剂，抗血管生成剂，凋亡诱导剂，抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方式中，癌症疗法可包括化学疗法，生物疗法，放射疗法，免疫疗法，激素疗法，抗血管疗法，冷冻疗法，毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方式中，本公开内容的方法可包括在一种或多种STAT3抑制剂之后，之前，或与之组合给予本文公开的修饰的病毒。STAT3抑制剂的非限制性实例包括抑制和/或降低STAT3的表达和/或活性的化合物，分子，化学品，多肽和蛋白质。在某些实施方式中，STAT3抑制剂可包括设计用于阻断STAT3二聚化或DNA结合的肽适体；哺乳动物蛋白SOCS3和GRIM-19；小分子，例如但不限于S31-201，S31-2001，STA-21，1S3-295，木本茄素(withacnistin)，肉盘菌内酯，氯硝柳胺，Stattic和葫芦素(例如葫芦素I)；或其组合。在Yue等，Expert Opin.Investig.Drugs 18(1)：45-56(2009)，Siveen等，Biochimica et Biophysica Acta 1845：136-154(2014)，Bu等，Gene 512(2)：198-205(2013)和Furtek等，ACS Chem.Biol.11(2)：308-318(2016)中公开了STAT3抑制剂的其他非限制性实例，其内容通过引用整体并入本文。在某些实施方式中，STAT3抑制剂可以是可以部分或完全阻断STAT3信号传导和/或活性的抗体或抗体片段。STAT3抑制剂的其他非限制性实例可包括核酶，反义寡核苷酸，通过模拟STAT3应答元件阻断STAT3 DNA结合位点的诱饵寡核苷酸，特异性抑制和/或降低STAT3表达或活性的shRNA分子和siRNA分子。STAT3抑制剂的一个非限制性实例可包含与STAT3核酸序列的至少一部分同源的反义、shRNA或siRNA核酸序列，其中该部分相对于STAT3序列的同源性可至少为约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约
98％，其中同源性百分比可通过例如BLAST或FASTA软件确定。在某些实施方式中，互补部分可以构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少
30个核苷酸，并且反义核酸、shRNA或siRNA分子的长度可以多至15或多至20或多至25或多至30或多至35或多至40或多至45或多至50或多至75或多至100个核苷酸。反义、shRNA或siRNA分子可包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于硫代磷酸酯残基。RNA分子可以从载体表达或者化学或合成产生。用于选择合适的dsRNA或dsRNA编码载体的方法在本领域中是众所周知的，其序列是已知的(例如，参见Tuschl，T.等，(1999)；Elbashir，S.M.等，(2001)；Hannon，G J.(2002)；McManus，M T.等，(2002)；Brummelkamp，T R.等，(2002)；
美国专利号6,573,099和6,506,559；以及PCT专利申请号WO 2001/036646，WO 1999/032619和WO 2001/068836)。
98％，其中同源性百分比可通过例如BLAST或FASTA软件确定。在某些实施方式中，互补部分可以构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少
30个核苷酸，并且反义核酸、shRNA或siRNA分子的长度可以多至15或多至20或多至25或多至30或多至35或多至40或多至45或多至50或多至75或多至100个核苷酸。反义、shRNA或siRNA分子可包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于硫代磷酸酯残基。RNA分子可以从载体表达或者化学或合成产生。用于选择合适的dsRNA或dsRNA编码载体的方法在本领域中是众所周知的，其序列是已知的(例如，参见Tuschl，T.等，(1999)；Elbashir，S.M.等，(2001)；Hannon，G J.(2002)；McManus，M T.等，(2002)；Brummelkamp，T R.等，(2002)；
美国专利号6,573,099和6,506,559；以及PCT专利申请号WO 2001/036646，WO 1999/032619和WO 2001/068836)。
[0229] 在某些实施方式中，采用修饰的病毒的治疗可单独使用或与一种或多种免疫调节剂联用。免疫调节剂可包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物，分子或物质。在某些实施方式中，免疫调节剂能够抑制对修饰的病毒的先天免疫或适应性免疫。免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区，抗CD11b抗体或其可变区，COX2抑制剂，例如塞来昔布，细胞因子，例如IL-12，GM-CSF，IL-2，IFN3和1FNγ，和趋化因子，如MIP-1，MCP-1和IL-8。在某些实施方式中，免疫调节剂包括免疫检查点抑制剂，例如但不限于抗-CTLA4，抗-PD-1，抗-PDL1和TLR激动剂(例如，聚1：C)。
[0230] 在某些实例中，在其他疗法是放射的情况下，示例性剂量可以是5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad(500Gy)，或所述范围内的其他适当剂量。或者，辐射剂量可为约30至60Gy，约40至约50Gy，约40至48Gy，或约44Gy，或所述范围内的其它适当剂量，其中剂量例如通过如上所述的剂量测定研究确定。如本文所用，“Gy”可以指等于100Rad的辐射的特定吸收剂量单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。
[0231] 在某些实施例中，在其他疗法是化疗的情况下，示例性化疗剂可包括但不限于烷化剂(例如，氮芥子衍生物，乙烯亚胺，烷基磺酸盐，肼和三嗪，亚硝基脲和金属盐)，植物生物碱(例如，长春花生物碱，紫杉烷，鬼臼毒素和喜树碱类似物)，抗肿瘤抗生素(如蒽环霉素，色霉素等)，抗代谢物(如叶酸拮抗剂，嘧啶拮抗剂，嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂和其他抗肿瘤药物(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂，肾上腺皮质类固醇抑制剂，酶，抗微管剂和类维生素A)。示例性化疗剂可包括但不限于阿那曲唑 比卡鲁胺 硫酸博来霉素 白消安 白消安注射液 卡培他滨 N4-戊氧羰基-
5-脱氧-5-氟胞苷，卡铂 卡莫司汀 苯丁酸氮芥
顺铂 克拉屈滨 环磷酰胺( 或
)，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷 阿糖胞苷脂质体注射液
达卡巴嗪 放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)，盐酸柔红
霉素 柠檬酸柔红霉素脂质体注射液 地塞米松，多西
紫杉醇 盐酸多柔比星 依托泊苷
磷酸氟达拉滨 5-氟尿嘧啶 氟他胺
替扎他滨，吉西他滨(二氟脱氧胞苷)，羟基脲 伊达比星 异环
磷酰胺 伊立替康 L-天冬酰胺酶 甲酰四氢
叶酸钙，美法仑 6-巯基嘌呤 甲氨蝶呤 米托蒽
醌 吉妥单抗，紫杉醇 菲尼克斯(钇90/MX-DTPA)，喷司他丁，
聚苯丙生20，含有卡莫司汀 他莫昔芬柠檬酸盐 替尼泊甙
6-硫鸟嘌呤，噻替哌，替拉扎明 注射用托泊替康盐酸盐
长春碱 长春新碱 和长春瑞滨
依鲁替尼，艾代拉利司和布妥昔单抗。
5-脱氧-5-氟胞苷，卡铂 卡莫司汀 苯丁酸氮芥
顺铂 克拉屈滨 环磷酰胺( 或
)，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷 阿糖胞苷脂质体注射液
达卡巴嗪 放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)，盐酸柔红
霉素 柠檬酸柔红霉素脂质体注射液 地塞米松，多西
紫杉醇 盐酸多柔比星 依托泊苷
磷酸氟达拉滨 5-氟尿嘧啶 氟他胺
替扎他滨，吉西他滨(二氟脱氧胞苷)，羟基脲 伊达比星 异环
磷酰胺 伊立替康 L-天冬酰胺酶 甲酰四氢
叶酸钙，美法仑 6-巯基嘌呤 甲氨蝶呤 米托蒽
醌 吉妥单抗，紫杉醇 菲尼克斯(钇90/MX-DTPA)，喷司他丁，
聚苯丙生20，含有卡莫司汀 他莫昔芬柠檬酸盐 替尼泊甙
6-硫鸟嘌呤，噻替哌，替拉扎明 注射用托泊替康盐酸盐
长春碱 长春新碱 和长春瑞滨
依鲁替尼，艾代拉利司和布妥昔单抗。
[0232] 示例性的烷基化剂可包括但不限于氮芥，乙烯亚胺衍生物，烷基磺酸盐，亚硝基脲和三 氮烯) ：乌拉 莫 司汀 (A min ou rac ilUra cil
nitrogen )、盐
酸氮芥(chlormethine) 环磷酰胺(
RevimmuneTM)、异环磷酰胺 美法仑
苯丁酸氮芥 哌泊溴烷(pipobroman)
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine) 三乙烯硫代磷酰
胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺 噻替哌 白消
安 卡莫司汀 洛莫司汀 链脲佐菌素
和达卡巴嗪 其他示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
替莫唑胺(Temodar和 )；更生霉素(也称为放线菌素D、
)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新、和苯丙氨酸氮芥、 )；六甲蜜胺
(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、 )；卡莫司汀 苯达莫司汀
白消安(Busulfex和甅 )；卡铂 洛莫司汀(也称为CCNU、
)；顺铂(也称为CDDP、Platinol和 -AQ)；苯丁酸氮芥 环磷
酰胺(Cytoxan和 )；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC- )；六
甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、 )；异环磷酰胺 皮莫司汀
(Prednumustine)；丙卡巴肼 二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、啶芥和盐酸氮芥、
)；链佐星 噻替哌(也称为thiophosphoamide、TESPA和TSPA、
)；环磷酰胺(Endoxan、Cytoxan、Neosar、Procytox、 )；和苯达莫
司汀HCl
nitrogen )、盐
酸氮芥(chlormethine) 环磷酰胺(
RevimmuneTM)、异环磷酰胺 美法仑
苯丁酸氮芥 哌泊溴烷(pipobroman)
三乙撑蜜胺(triethylenemelamine) 三乙烯硫代磷酰
胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺 噻替哌 白消
安 卡莫司汀 洛莫司汀 链脲佐菌素
和达卡巴嗪 其他示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
替莫唑胺(Temodar和 )；更生霉素(也称为放线菌素D、
)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新、和苯丙氨酸氮芥、 )；六甲蜜胺
(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、 )；卡莫司汀 苯达莫司汀
白消安(Busulfex和甅 )；卡铂 洛莫司汀(也称为CCNU、
)；顺铂(也称为CDDP、Platinol和 -AQ)；苯丁酸氮芥 环磷
酰胺(Cytoxan和 )；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC- )；六
甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、 )；异环磷酰胺 皮莫司汀
(Prednumustine)；丙卡巴肼 二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、啶芥和盐酸氮芥、
)；链佐星 噻替哌(也称为thiophosphoamide、TESPA和TSPA、
)；环磷酰胺(Endoxan、Cytoxan、Neosar、Procytox、 )；和苯达莫
司汀HCl
[0233] 示例性蒽环霉素包括但不限于，例如，多柔比星( 和 )；博来霉素 柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸铷霉素、 )；柔红
霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体、 )；米托蒽醌(DHAD、 )；
表柔比星(表阿霉素) ；伊达比星 丝裂霉素C
格尔德霉素；除莠霉素；灰霉素；和去乙酰灰霉素。
霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体、 )；米托蒽醌(DHAD、 )；
表柔比星(表阿霉素) ；伊达比星 丝裂霉素C
格尔德霉素；除莠霉素；灰霉素；和去乙酰灰霉素。
[0234] 示例性长春花生物碱可包括但不限于长春瑞滨酒石酸盐 长春新碱 和长春地辛 )；长春碱(也称为长春碱硫酸盐，长春花碱和VLB，
和 )；和长春瑞滨
和 )；和长春瑞滨
[0235] 示例性蛋白酶体抑制剂包括但不限于，硼替佐米(Velcade.RTM.)；卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁烷)-戊酰胺)；马丽佐米(NPI-0052)；爱卡佐米柠檬酸盐(MLN-9708)；德兰佐米(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(-2R)-2-甲基-2-环氧乙烷]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
[0236] 如本文所用，“与......组合”是指修饰的病毒，例如本文所述的溶瘤痘苗病毒或包含其的药物组合物，与其他疗法，例如包含一种或多种试剂的其他疗法作为治疗方案或计划的一部分给予对象。在某些实施方式中，组合使用不需要在给药前将修饰的病毒和一种或多种试剂物理结合，或者在相同的时间范围内给药。例如但不限于，修饰的病毒和一种或多种试剂可以同时给予被治疗的对象，或者可以同时给予或以任何顺序或在不同的时间点顺序给予。
[0237] 在各种实施方式中，可以以液体剂型，固体剂型，栓剂，可吸入剂型，鼻内剂型，脂质体制剂，包含纳米颗粒的剂型，包含微粒的剂型，聚合物剂型或其任意组合的形式给予其他疗法。在某些实施方式中，其他疗法在约1周至约2周，约2周至约3周，约3周至约4周，约4周至约5周，约6周至约7周，约7周至约8周，约8周至约9周，约9周至约10周，约10周至约11周，约11周至约12周，约12周至约24周，约24周至约48周，约48周或约52周或更长的时间段内给予。在某些情况下，其他疗法的给予频率可以是每天一次，每天两次，每周一次，每三周一次，每四周一次(或每月一次)，每8周一次(或每2个月一次)，每12周一次(或每3个月一次)，或每24周一次(每6个月一次)。
[0238] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括给予对象有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其包含编码调节STAT3活性的蛋白质的一种或多种外源核酸。例如但不限于，治疗患有癌症的对象的方法包括给予对象有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其包含编码抑制，降低和/或最小化STAT3活性的蛋白质的一种或多种外源核酸。在某些实施方式中，在公开方法中使用的痘苗病毒包括外源核酸，其编码PIAS3蛋白或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段和/或显性负突变体STAT3蛋白。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括：给予所述对象有效量的一种或多种试剂。例如但不限于，试剂可以是抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，如上所述。
[0239] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括向对象给予有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其表达编码包含氨基酸序列的PIAS3蛋白的一种或多种核酸，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1及其保守取代物的氨基酸序列)至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。例如但不限于，本发明的修饰的病毒可包含核酸序列，所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO：8-10和40-43的核酸序列至少约85％，至少约
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括：给予所述对象有效量的一种或多种试剂。例如但不限于，试剂可以是抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，如上所述。
90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，PIAS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括：给予所述对象有效量的一种或多种试剂。例如但不限于，试剂可以是抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，如上所述。
[0240] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括向对象给予有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其表达编码包含氨基酸序列的SOCS3蛋白的一种或多种核酸，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：28及其保守取代物的氨基酸序列)至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。例如但不限于，本发明的修饰的病毒可包含核酸序列，所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO：29和31的核酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，SOCS3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括：给予所述对象有效量的一种或多种试剂。例如但不限于，试剂可以是抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，如上所述。
[0241] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括向对象给予有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其表达编码包含氨基酸序列的TCPTP蛋白的一种或多种核酸，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：32及其保守取代物的氨基酸序列)至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。例如但不限于，本发明的修饰的病毒可包含核酸序列，所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO：33和35的核酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，TCPTP蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。在某些实施方式中，本发明的方法还可包括：给予所述对象有效量的一种或多种试剂。例如但不限于，试剂可以是抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，如上所述。
[0242] 在某些实施方式中，治疗患有癌症的对象的方法包括向对象给予有效量的修饰的病毒，例如痘苗病毒，其表达编码包含氨基酸序列的显性负突变体STAT3蛋白的一种或多种核酸，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列，(例如SEQ ID NO：36及其保守取代物的氨基酸序列)至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源。例如但不限于，本发明的修饰的病毒可包含核酸序列，所述核酸序列包含与选自SEQ ID NO：37和39的核酸序列至少约
85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的核苷酸序列。在某些实施方式中，显性负突变体STAT3蛋白可以如本文所公开的，进一步与细胞穿透肽偶联，并且外源核酸可以进一步编码细胞穿透肽。
[0243] 试剂盒
[0244] 本公开还提供了包含一种或多种本文所述的溶瘤病毒的试剂盒。在实施方式中，本公开提供了用于给予如本文所述的修饰的病毒的试剂盒。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括如上所述的修饰的病毒或包含修饰的病毒的药物组合物。在某些实施方式中，本公开的试剂盒还可以包括一种或多种组分，如使用说明书、装置和其它试剂及组分，如用于实践上述方法的管、容器或注射器。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可以进一步包括一种或多种试剂，例如抗癌剂，STAT3抑制剂和/或免疫调节剂，其可以与修饰的病毒组合给予。
[0245] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包含一个或多个含有本文公开的修饰的病毒的容器。例如但不限于，本公开的试剂盒可包含一个或多个容器，其含有表达PIAS3蛋白或其片段，SOCS3蛋白或其片段，TCPTP蛋白或其片段，显性负突变体STAT3蛋白或其片段或其任意组合中的一种或多种的修饰的痘苗病毒。在某些实施方式中，调节STAT3活性的蛋白质可以与细胞穿透肽偶联。
[0246] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括有效量的修饰的痘苗病毒，其包含编码PIAS3蛋白的一种或多种核酸，所述PIAS3蛋白可包含可与选自SEQ ID NO：1-7和24-27及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括修饰的痘苗病毒，其包含编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：1的氨基酸133-316，129-316，126-176，132-177或400-528)的PIAS3蛋白的一种或多种核酸。
[0247] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括有效量的修饰的痘苗病毒，其包含编码SOCS3蛋白的一种或多种核酸，所述SOCS3蛋白可包含可与选自SEQ ID NO：28和30及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括修饰的痘苗病毒，其包含编码具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列或其片段的SOCS3蛋白的一种或多种核酸。
[0248] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括有效量的修饰的痘苗病毒，其包含编码TCPTP蛋白，例如TCPTP同种型2蛋白的一种或多种核酸，所述TCPTP蛋白可包含可与选自SEQ ID NO：32和34及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括修饰的痘苗病毒，其包含可编码具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列或其片段的TCPTP蛋白的一种或多种核酸。
[0249] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括有效量的修饰的痘苗病毒，其包含编码显性负突变体STAT3蛋白的一种或多种核酸，所述显性负突变体STAT3蛋白可包含可与选自SEQ ID NO：36和38及其保守取代物的氨基酸序列至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％同源的氨基酸序列。在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括修饰的痘苗病毒，其包含可编码具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列或其片段的显性负突变体STAT3蛋白的一种或多种核酸。
[0250] 在某些实施方式中，本发明的试剂盒可包含使用说明书，用于将修饰的病毒给予对象的装置，或用于将其它试剂或化合物给予对象的装置。例如但不限于，说明书通常包括说明，其描述了病毒，和任选地包括在该试剂盒中的其它组分，和给予方法，包括用于确定对象的适当状态、适当剂量和适当给予方法的方法，用于给予修饰的病毒。说明书还可包括用于在治疗期间监测对象的指南。
[0251] 在某些实施方式中，本公开的试剂盒可包括用于将修饰的病毒给予于对象的装置。用于给予药物和药物组合物的本领域已知的多种器具中的任一种都可包含在本发明提供的试剂盒中。例如但不限于，所述装置包括，皮下注射用针头、静脉内针头、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如，点眼药器。在某些实施方式中，待全身(例如通过静脉内注射)递送的修饰的病毒可与皮下注射用针头和注射器一同包含在试剂盒中。
[0252] 实施例
[0253] 以下实施例进一步说明了所述实施方式，但不限制本发明的范围。
[0254] 实施例1：PIAS3阻断STAT3功能
[0255] 如图1所示，人PIAS3是628个氨基酸的蛋白质，其包括PINIT结构域，包括氨基酸133-316。PINIT结构域包括PINIT片段，包括氨基酸132-177。
[0256] 如下制备表达PIAS3蛋白或其片段的示例性溶瘤病毒：通过对源自口腔细胞拭子的mRNA的逆转录PCR获得人PIAS3 DNA。将全长PIAS3，区段133-316或区段132-177克隆到含有荧光素酶报告基因和具有痘苗病毒TK基因区段的侧翼区域的载体。载体在PIAS3构建体的类型，病毒启动子以及包含或排除与PIAS3序列连接的HIV TAT衍生的细胞穿透肽或其他细胞穿透肽序列上具有变化。不同的PIAS3构建体如下：全长PIAS3基因，PIAS3133-316+TAT与P11启动子(DCP)，PIAS3133-316+TAT与P7.5启动子(DC7)，PIAS3133-316与P11启动子(DNP)，PIAS3133-316与P7.5启动子(DN7)，PIAS3132-177+TAT与P11启动子(FCP)，PIAS3132-177+TAT与P7.5启动子(FC7)，PIAS3132-177与P11启动子(FNP)和PIAS3132-177与P7.5启动子(FN7)。然后将载体转染到绿猴肾上皮细胞系CV-1中，其同时用野生型痘苗病毒的Western Reserve株感染。这些细胞的转染和感染导致载体中TK位点之间的非同源重组，其用PIAS3构建体和荧光素酶报告基因之一替换痘苗基因组中的TK基因。通过六轮荧光素酶阳性病毒噬斑纯化并通过DNA测序验证选择表达PIAS3的痘苗病毒。
[0257] 通过测定STAT3调节的蛋白质的表达水平，在人上皮样癌细胞系PANC1和小鼠肾皮质腺癌细胞系RENCA中分析痘苗病毒表达PIAS3，PINIT结构域或PINIT片段以阻断STAT3活性的能力。Western Reserve痘苗毒株获自BEI资源公司(弗吉尼亚州玛纳萨斯)，并且使用或构建的所有重组痘苗病毒均基于该毒株。在用表达人PIAS3的氨基酸133-316的STAT3抑制构建体或痘苗病毒处理后，分析STAT3调节的蛋白质BCL-xL和细胞周期蛋白-D1的表达水平。如图2所示，与TK-痘苗病毒对照(其不表达PIAS3构建体)相比，STAT3抑制构建体和表达人PIAS3的氨基酸133-316的痘苗病毒降低了BCL-xL和细胞周期蛋白D1的表达。
[0258] 实施例2：PIAS3的表达增强了癌细胞的细胞死亡
[0259] 为了测试PIAS3的表达对人肿瘤细胞系的影响，用表达PIAS3或PIAS3结构域的痘苗病毒感染肾细胞癌细胞系RCC4，胰腺癌上皮细胞系PL45，胰腺上皮癌细胞系PANC1，和肾皮质腺癌细胞系RENCA，并且随时间监测这些细胞的活力。为了测量细胞活力，在感染后每天对细胞进行MTS测定(CELLTITER AQueous非放射性细胞增殖试验，普洛麦格公司(Promega))，持续1周。
[0260] 如图3所示，与对照和STAT3抑制剂，葫芦素I相比，PIAS3的表达增强了痘苗病毒介导的对人肿瘤细胞系的杀伤。此外，如图4所示，与对照相比，在正常细胞系例如人包皮成纤维细胞(HFF)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中没有观察到由表达PIAS3的痘苗病毒引起的额外杀伤作用。具体地，表达PIAS3或其片段的痘苗病毒，例如PIAS133-316，PIAS132-177或PIAS132-177TAT，表现出比葫芦素I更低的毒性。
[0261] 另外，如图5所示，与正常细胞系HFF相比，用表达PIAS133-316的痘苗病毒感染导致骨肉瘤肿瘤细胞系143b中的斑块大小增大。较大的斑块大小可以解释为病毒复制的增强和/或病毒传播的增强。
[0262] 这些结果表明PIAS3的PINIT结构域或PINIT片段的表达足以促进癌细胞死亡。
[0263] 实施例3：通过PIAS3表达增加病毒复制
[0264] 为了确定病毒复制是否受PIAS3表达的影响，用表达PIAS3和荧光素酶基因结构域的痘苗病毒感染与实施例2相同的人肿瘤细胞系组。通过病毒噬斑测定法测量病毒复制，并以每毫升噬菌斑形成单位(PFU/mL)给出。如图6所示，与TK-病毒相比，PIAS133-316，PIAS132-177或PIAS132-177TAT的表达使肿瘤细胞中的病毒复制增加。
[0265] 通过体内荧光素酶表达的生物发光成像测量肿瘤中的病毒基因表达。如图7所示，在RENCA肿瘤模型(皮下植入BALB/c小鼠)中，肿瘤内注射1x108PFU的修饰的痘苗病毒的单次静脉内剂量。当PIAS3结构域表达时，肿瘤中的病毒荧光素酶表达增加，证实通过PIAS3结构域的表达使得肿瘤细胞中的病毒复制增加(图7)。具体地，通过PIAS3结构域的表达，病毒基因表达增加约5至10倍。
[0266] 实施例4：PIAS3的表达减小肿瘤体积
[0267] 为了确定PIAS3表达是否影响肿瘤体积，通过在BALB/c小鼠中植入RENCA细胞产生的肿瘤用表达PIAS3或其片段(例如PIAS133-316，PIAS132-177或PIAS132-177TAT)的痘苗病毒处理。每只小鼠肿瘤内给予1×108PFU的单次静脉内剂量。对于高剂量给药，肿瘤内给予5×109PFU的单次静脉内剂量。如图8所示，与具有TK缺失的对照或痘苗病毒相比，PIAS133-316，PIAS132-177或PIAS132-177TAT的表达使肿瘤体积减小。
[0268] 实施例5：PIAS3的酸性结构域的表达和TCPTP或SOCS3的表达降低STAT3活性[0269] 为了确定PIAS3的酸性结构域是否影响STAT3的下游靶标，细胞周期蛋白D1的表达，以5MOI用表达hPIAS3126-176或mPIAS3400-523的痘苗病毒或TK-痘苗病毒感染汇合的小鼠细胞系4T1或B16的12孔板。18小时后，用2xLaemmli缓冲液裂解细胞，煮沸5分钟，并在SDS-PAGE上跑胶用于Western印迹。为了检测STAT3调节的基因的变化，用抗细胞周期蛋白D1或抗BCL-xL抗体对膜染色，并与β-微管蛋白的对照染色进行比较。结果显示为STAT3调节的基因与β-微管蛋白表达的条带强度的比率。如图9所示，PIAS3的酸性结构域导致细胞周期蛋白D1表达降低。
[0270] 为了确定STAT3活性的其他调节剂是否可以影响细胞周期蛋白D1的表达，用表达mTCPTP或mSOCS3的痘苗病毒以5MO感染4T1或B16。如图9所示，表达mTCPTP的痘苗病毒和表达mSOCS3的痘苗病毒导致细胞周期蛋白D1表达降低。
[0271] 本文引用了各种NCBI登录号，出版物，专利和专利申请，其内容通过引用全文并入本文。
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