用于确定血液样本中的HbA1c的量的方法
阅读：819发布：2020-05-12
专利汇可以提供用于确定血液样本中的HbA1c的量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于在包括少于200μl的 血液样本 中相对于血红蛋白的浓度确定HbA1c的量的方法和套装，所述方法包括以下步骤：将 荧光 团添加至所述样本，并且在荧光随着时间的变化>0的时间间隔内的一个或更多个时间点测量荧光，随后通过添加血红蛋白结合剂并以大约570nm测量透射率变化并将所得到的结果与内部标准进行比较来测量血红蛋白。，下面是用于确定血液样本中的HbA1c的量的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于在包括少于200μl的血液样本中相对于血红蛋白的浓度确定HbA1c的量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包括能够结合HbA1c的配体的荧光团，
b.提供缓冲液体，
c.以大约570nm的波长在时间T0测量所述缓冲液体的透射率(TRT0)，并且可选地，以所述荧光团在被激发时发射荧光的波长(X)测量所述缓冲液体的荧光(FLT0)，d.将所述荧光团添加至所述缓冲液体，由此生成缓冲反应液体，并且可选地，以所述波长X在时间T1测量所述缓冲反应液体的荧光(FLT1)，
e.在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体，由此形成包括荧光络合物的第一检测液体，所述荧光络合物包括所述荧光团和HbA1c，并且在荧光随着时间的变化>0的时间间隔T3-T4内的一个或更多个时间点测量所述第一检测液体在所述波长X下的荧光(FLT3，4)，反映并非所述样本中的所有HbA1c都是所述检测液体中的荧光络合物的一部分，f.在时间T5将血红蛋白结合剂添加至所述第一检测液体，由此生成包括络合物的第二检测液体，所述络合物包括血红蛋白结合剂和血红蛋白，并且在时间T6以大约570nm测量所述第二检测液体的透射率(TRT6)，
g.通过将所述透射信号(TRT6)除以所述透射信号(TRT0)来确定所述样本的吸光度，h.通过将所述荧光信号(FLT3，4)除以在步骤g)中确定的所述吸光度来确定HbA1c的相对量，并且比较所获得的结果与内部标准。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤d)中添加至所述液体的荧光团的量通过在步骤d)中测量所述液体的荧光(FLT1)来确定，并且针对所添加的荧光团的量来校正所述荧光信号(FLT3，4)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述时间间隔T3-T4是在在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体之后的0-30秒的时间间隔，诸如0-20秒。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的方法，其中，所述荧光(FLT3，4)的测量包括：在所述时间间隔T3-T4内的至少两个时间点的测量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述荧光(FLT3，4)的测量包括：在所述时间间隔T3-T4内的至少三个时间点的测量。
6.根据前述权利要求1至5中的任一项所述的方法，其中，所述血红蛋白结合剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
7.根据前述权利要求1至6中的任一项所述的方法，其中，所述配体是硼酸盐或硼酸。
8.根据前述权利要求1至7中的任一项所述的方法，其中，所述荧光团包括四溴荧光素，并且所述荧光X以大约570nm被测量。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述血液样本包括少于5μl。
10.一种用于确定样本中的HbA1c的量的套装，所述套装包括：包括能够结合HbA1c的配体的荧光团、用于实现根据上述权利要求1至12中的一项所述的方法的指令、以及关于具有该方法的步骤h)中使用的已知量的HbA1c和血红蛋白的内部标准使用该方法获得的一个或更多个预定值。
用于确定血液样本中的HbA1c的量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于确定包括少于200μl的血液样本中的HbA1c的量的方法。而且，本发明涉及用于确定样本中的HbA1c的量的套装(kit-of-parts)。
背景技术
[0002] 糖化血红蛋白(HbA1c或血红蛋白A1c、HbA1c、A1C、或Hb1c)是一种天然形式的血红蛋白，其主要被测量以识别人体中长时间段内的平均血浆葡萄糖浓度。HbA1c通过血红蛋白暴露于血浆葡萄糖沿非酶糖基化路径形成。随着血浆葡萄糖的平均量增加，糖化血红蛋白的分数以可预测方式增加。因此，HbA1c的血液水平用作在测量之前的几个月中患者血液中的平均葡萄糖浓度的标记，并且对于葡萄糖水平的自然日常波动(例如，由于锻炼、休息、膳食以及对葡萄糖水平的其它行为影响)相对不敏感。因此，HbA1c已经被建议作为个体患者的一般健康状态的标记。
[0003] 正确评估患者的血液样本中的HbA1c的量对从业医师来说是无处不在的挑战。大量糖化血红蛋白表明对血糖水平的控制不佳，这与心血管疾病、肾病以及视网膜病相关联。尤其是在1型和2型糖尿病患者中，监测HbA1c可能会改善诊断和治疗。
[0004] 用于测量血液样本中的HbA1c的常规方法包括：基于柱(column-based)的硼酸盐亲和力、HPLC亲和力、免疫测定以及硼酸盐荧光猝灭方法，其中，含有荧光团的液体中的荧光变化是由HbA1c到荧光团的选择性结合引起的。在暴露于含HbA1c样本之后的荧光测量的变化被评估并与血红蛋白的相对存在相关。
[0006] 用于确定总血红蛋白的浓度的方法是使用在405nm或415nm的吸光度的常规光度测量，例如在EP 0772779中所公开的。另一种方法是测量在等吸光点(nm)处的总血红蛋白。
[0007] 然而，常规方法在准确性和再现性方面无法提供令人满意的结果，尤其是结合小体积样本使用时。再现性对于使用HbA1c分析物作为糖尿病患者的监测工具尤为重要。其优选具有低于4％的％CV值，诸如少于3.5％(NGSP标准)。
[0008] 因此，本领域一直需要用于确定HbA1c的另选方法，尤其是提供增加的准确度并赋予增加的再现性的方法。本发明的一个目的是提供这样的方法。
[0010] 因此，本领域需要能够分析包括少于200μl血液的血液样本中的HbA1c量的方法和装置。更具体地说，本领域需要能够分析血液样本中的HbA1c量的方法和装置，该血液样本包括少于180μl血液，诸如少于150μl，诸如少于100μl，诸如少于50μl，诸如少于20μl、诸如少于10μl，诸如少于9μl，诸如少于8μl，诸如少于7μl，诸如少于6μl，诸如少于5μl，诸如少于4μl，诸如少于3μl，诸如2μl或更少血液。本发明的一个目的是提供这样的方法。
[0011] 另一挑战是增加每次分析的容易度，优选达到可以在没有从业医师的协助下由患者进行血液中的HbA1c的测量的程度。而且，将成本降低至消费者可负担得起每次测量的水平也是一个挑战。
[0012] 因此，本领域需要允许个体患者准确且容易地测量血液样本中的HbA1c的水平的方法和患者友好套装。而且，本领域需要允许简单且容易处理样本和血液分析的方法和套装。本发明的目的是提供这样的方法和套装。
发明内容
[0013] 如上所述，本领域普遍需要提供血液样本中的HbA1c水平的准确、灵敏且可再现测量的方法和患者友好套装。本发明的目的是提供这样的套装和方法。
[0014] 测量血液样本中的HbA1c水平需要两次测量，即，测量HbA1c的量和测量样本中的血红蛋白的总量。
[0015] 出人意料地，发现通过使用荧光团结合方法测量样本中的HbA1c的量可以获得使用少量样本的具有更高准确度和更高精度的改进方法，其中，荧光测量在样本与荧光团接触之后的特定时间(T3，4)进行，其中，荧光随时间减少，反映并非样本中的所有HbA1c都与荧光团相关联。所述时间(T3，4)也可以被称为结合(binding)阶段。
[0016] 而且，出人意料地发现，通过在将样本与结合血红蛋白的试剂接触之后测量在大约570nm处的吸光度来测量总血红蛋白浓度，可以获得具有更高准确度和更高精度的改进方法，所述测量在已经测量HbA1c的量之后在样本中执行。
[0017] 因此，根据本发明已经解决了上述问题，本发明提供了一种用于在包括少于200μl的血液样本中相对于血红蛋白的浓度确定HbA1c的量的方法，该方法包括以下步骤：
[0018] a.提供包括能够结合HbA1c的配体的荧光团，
[0019] b.提供缓冲液体，
[0020] c.以大约570nm的波长在时间T0测量所述缓冲液体的透射率(TRT0)，并且可选地，以所述荧光团在被激发时发射荧光的波长(X)来测量所述缓冲液体的荧光(FLT0)，[0021] d.将所述荧光团添加至所述缓冲液体，由此生成缓冲反应液体，并且可选地，以所述波长X在时间T1测量所述缓冲反应液体的荧光(FLT1)，
[0022] e.在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体，由此形成包括荧光络合物的第一检测液体，该荧光络合物包括所述荧光团和HbA1c，并且在荧光随着时间的变化>0的时间间隔T3-T4内的一个或更多个时间点测量所述第一检测液体在所述波长X下的荧光(FLT3，4)，反映并非所述样本中的所有HbA1c都是所述检测液体中的荧光络合物的一部分，
[0023] f.在时间T5将血红蛋白结合剂添加至所述第一检测液体，由此生成包括络合物的第二检测液体，该络合物包括血红蛋白结合剂和血红蛋白，并且在时间T6以大约570nm测量所述第二检测液体的透射率(TRT6)，
[0024] g.通过将透射信号(TRT6)除以透射信号(TRT0)来确定所述样本的吸光度，[0025] h.通过将所述荧光信号(FLT3,4)除以在步骤g)中确定的所述吸光度来确定HbA1c的相对量，并且比较所述获得的结果与利用内部标准样本获得的结果。
[0026] 相对HbA1c浓度对比总血红蛋白浓度可以通过将获得的测量结果与利用应用具有已知浓度的HbA1c和血红蛋白的内部标准样本的相同方法获得的结果进行比较来确定。这样的内部标准样本可以从商业源获得。附图说明
[0028] 图1例示了所使用的测量装置中的光学系统，下文中称作“TRACE”。该光学系统由两条光路组成。在光路1中，使用LED 570nm作为光源和光电二极管1作为检测器测量570nm处的透射率。在光路2中，光源是LED 510，并且光电二极管1是用于测量荧光信号的检测器。另外，光路2还具有测量光电二极管2上的510nm信号的传输通道。
[0029] 图2例示了关于TRACE的六个HbA1c标准(BIO-RAD)测量，如示例1中所说明的。从t＝21秒(当将血液样本添加至反应液体时)到t＝198秒，每秒连续测量荧光。如在图2中看到的，该荧光持续下降，大约在80秒-100秒之间稍微接近渐近线。
[0030] 图3例示了利用Tina-quant HbA1c化验作为参照从TRACE原始信号(x轴)到IFCC单位(y轴)的转换。
[0031] 图4例示了利用Tina-quant HbA1c化验作为参照从TRACE原始信号(x轴)到NGSP单位(y轴)的转换。
[0032] 图5例示了根据图4所示的校准曲线从TRACE HbA1c原始信号(x轴)转换成最终NGSP单位(y轴)的40个患者样本。
[0033] 图6以图形方式显示了表4的内容，其中，来自40个患者的TRACE HbA1c NGSP结果被显示(x轴)为来自Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验格式)的最终TRACE NGSP信号(y轴)的函数。
[0034] 图7以图形方式显示表7的内容，其中，在步骤1d，以三种不同浓度的添加荧光团，将来自六个校准器的TRACE HbA1c IFCC结果显示(x轴)为最终TRACE信号(y轴)的函数。
[0035] 定义
[0036] “荧光团”
[0037] 根据本发明，荧光团是指这样的试剂或药剂(means)，即，其在反应和检测液体中的存在导致(在退出之后)发射可检测电磁辐射(光)，诸如光致发光标记化合物。在优选实施方式中，荧光团是响应于接触光或用光照射而发射可检测光的试剂。
[0038] “血液样本”
[0039] 根据本发明，血液样本是指来自患者的全血液样本或者来自或包括来自患者的红血细胞的物质。
[0040] “配体”
[0041] 根据本发明，配体是指这样的药剂或试剂，即，其存在(例如，在荧光团上或与荧光团缔合(association))引起HbA1c和荧光团的结合或缔合。在优选实施方式中，配体是附着(以共价方式)至荧光团并且能够结合到HbA1c的试剂。硼酸盐选择性地结合至HbA1c并且可以附着至几个荧光团。因此，硼酸盐或硼酸是根据本发明的合适配体。因而，根据本发明，“包括配体的荧光团”是指包括荧光团基团和配体基团的分子络合物。US 5877025描述了作为含有与糖化蛋白质(诸如HbA1c)选择性反应的硼酸基团的光致发光或化学发光标记化合物的示例性荧光团/配体络合物。
[0042] “结合阶段”
[0043] 根据本发明，结合阶段意指其中发生HbA1c与荧光团的结合或缔合但结合尚未完成的阶段。
[0044] “精度”和“准确度”
[0045] 根据本发明，精度是指用于生成彼此没有显著变化的关于HbA1c浓度的测试结果(例如，来自针对同一样本的多次运行)的方法的能力。根据本发明，准确度意味着生成关于HbA1c浓度的测试结果的方法的能力，其平均值相对于HbA1c的真实浓度没有显著变化。方法可能具有低准确度和高精度，意味着测试始终给出相对于真实结果改变的类似结果。
[0046] 该真实结果根据NGSP标准定义。方法也可能具有高准确度和低精度，意味着测试始终给出不相似结果，但具有与真实结果相似的平均结果。高度优选的是获得并使用具有高准确度和高精度的方法。
具体实施方式
[0047] 出人意料地，发现通过用荧光团结合法测量样本中的HbA1c的量可以获得具有更高准确度和更高精度的改进方法，其中，荧光测量在样本与荧光团接触之后在时间(T3,4)进行，其中，荧光随时间减少，反映并非样本中的所有HbA1c都与荧光团相关联。所述时间(T3,4)也可以被称为结合阶段，其中，所述荧光团通过所述配体结合至HbA1c。
[0048] 而且，出人意料地发现，通过在将样本与能够结合总血红蛋白的试剂接触之后测量在大约570nm处的吸光度的降低来测量总血红蛋白浓度，可以获得具有更高准确度和更高精度的改进方法，所述测量在已经测量HbA1c的量之后在样本中执行。
[0049] 由此，在导致本发明的调查期间，出人意料地观察到，可以通过在提供HbA1c至荧光团的结合阶段的反应条件下测量HbA1c对从荧光团发射的荧光的影响，以改进的精度和准确度并且以改进的容易度从血液样本中获得HbA1c的测量结果，其中，在使用总血红蛋白与合适血红蛋白结合剂结合的方法测量总血红蛋白含量之后，在570nm处提供可检测的透射率降低。
[0050] 因此，本发明涉及一种用于在包括少于200μl的血液样本中相对于血红蛋白的浓度确定HbA1c的量的方法，该方法包括以下步骤：
[0051] a.提供包括能够结合HbA1c的配体(ligand)的荧光团，
[0052] b.提供缓冲液体，
[0053] c.以大约570nm的波长在时间T0测量所述缓冲液体的透射率(TRT0)，并且可选地，以所述荧光团在被激发时发射荧光的波长(X)来测量所述缓冲液体的荧光(FLT0)，[0054] d.将所述荧光团添加至所述缓冲液体，由此生成缓冲反应液体，并且可选地以所述波长X在时间T1测量所述缓冲反应液体的荧光(FLT1)，
[0055] e.在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体，由此形成包括荧光络合物的第一检测液体，该荧光络合物包括所述荧光团和HbA1c，并且在荧光随着时间的变化>0的时间间隔T3-T4内的一个或更多个时间点，测量所述第一检测液体在所述波长X下的荧光(FLT3，4)，反映并非所述样本中的所有HbA1c都是所述检测液体中的荧光络合物的一部分，[0056] f.在时间T5将血红蛋白结合剂添加至所述第一检测液体，由此生成包括络合物的第二检测液体，该络合物包括血红蛋白结合剂和血红蛋白，并且在时间T6以大约570nm测量所述第二检测液体的透射率(TRT6)，
[0057] g.通过将透射信号(TRT6)除以透射信号(TRT0)来确定所述样本的吸光度，[0058] h.通过将所述荧光信号(FLT3，4)除以在步骤g)中确定的所述吸光度来确定HbA1c的相对量，并且比较所获得的结果与内部标准。
[0059] 来自步骤h)中使用的内部标准的结果应当是使用与在生成样本结果时所使用的方法完全相同的方法所获得的结果。内部样本结果不需要在每次执行该方法时运行，但优选被提前获得并提供和存储以用于与后续样本比较的目的。然而，出乎意料地观察到，关于与步骤h)中的内部标准的比较，添加至样本的荧光团的量对该方法的性能具有显著影响。
[0060] 将明确限定量的荧光团添加至小体积样本是一项困难的任务，并且实际上，无法提供保证荧光团的量在化验之间精确且均匀的套装或即用型化验。
[0061] 然而，出人意料地发现，在根据本发明的方法中在结合阶段(FLT3，4)中进行的荧光测量可以通过预定因子来校正，所述因子取决于样本中存在的荧光团的实际量。因此，通过结合用于校正针对所使用的荧光团的量的实际获得的荧光信号的倍增因子，每个单独样本运行都可以以更高准确度和精度来与内部标准进行比较，而不管添加的荧光团的变化如何。
[0062] 因此，在优选方面，本发明涉及一种方法，其中，在步骤d)中添加至所述液体的荧光团的量通过在步骤d)中测量所述液体的荧光(FLT1)来确定，并且针对所添加荧光团的量来校正所述荧光信号(FLT3，4)。要在每种情况下应用的校正因子根据本发明的各个实施方式而变化(诸如温度、缓冲液体、所用荧光团等的特定化验条件)，但可以容易地针对每种特定化验来确定。这种校正因子可以针对每种特定化验被预先确定，以使它们准备好应用于具有未知量的添加(实际)量荧光团的后续化验中。
[0063] 而且，根据本发明，观察到当在形成荧光团-HbA1c络合物后不久确定荧光减少(FLT3，4)时，该方法的精度和准确度更高。
[0064] 因此，在本发明的优选实施方式中，在多于1％但少于85％的HbA1c被结合在包括荧光团的络合物中的时间，在结合阶段中执行检测液体在时间T3-T4的荧光减少(FLT3，4)的测量。
[0065] 甚至更优选的是，在多于1％但少于75％的HbA1c被结合在包括荧光团的络合物中的时间，在结合阶段中执行检测液体在时间T3-T4的荧光减少(FLT3，4)的测量。
[0066] 甚至更优选的是，在多于1％但少于60％的HbA1c被结合在包括荧光团的络合物中的时间，在结合阶段中执行检测液体在时间T3-T4的荧光减少(FLT3，4)的测量。
[0067] 甚至更优选的是，在多于1％但少于50％的HbA1c被结合在包括荧光团的络合物中的时间，在结合阶段中执行检测液体在时间T3-T4的荧光减少(FLT3，4)的测量。
[0068] 在优选实施方式中，在多于1％但少于10％的HbA1c被结合在包括荧光团的络合物中的时间，在结合阶段中执行检测液体在时间T3-T4的荧光减少(FLT3，4)的至少一个测量，即，紧接在添加荧光团之后执行至少一次测量。
[0069] 因此，本发明涉及一种方法，其中，所述时间间隔T3-T4是在在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体之后的0-30秒的时间间隔，诸如0-20秒。甚至更优选地，所述时间间隔T3-T4是在在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体之后的0-15秒的时间间隔。甚至更优选地，所述时间间隔T3-T4是在在时间T2将所述样本添加至所述缓冲反应液体之后的0-15秒的时间间隔。
[0070] 所述荧光的测量(FLT3，4)包括在时间间隔T3-T4内的至少两个时间点处的测量，使得可以确定给定时段内的减少。更优选的是，所述荧光的测量(FLT3，4)包括在时间间隔T3-T4内的至少三个时间点处的测量，从而改进所测量的减少的准确度。甚至更优选地，所述荧光的测量(FLT3，4)包括在时间间隔T3-T4内的至少四个时间点处的测量，从而改进所测量的减少的准确度。
[0071] 然后，可以通过测量总血红蛋白浓度并计算相对浓度来确定相对HbA1c浓度对比总血红蛋白浓度。
[0072] 在大约570nm处的透射率的测量
[0073] 发现通过使用样本与结合血红蛋白的试剂接触的方法测量样本中的血红蛋白的量并且测量样本在大约570nm处的透射率变化，可以获得改进的准确度和精度。与根据本发明的荧光的测量相反，发现进行样本的透射率(在添加血红蛋白结合剂之后)测量的时间对于该方法的执行不太重要。
[0074] 实际上，通过使用发射(并过滤)大约570nm的光的光源(并且优选地还有滤波器)照射液体并检测在大致相同波长处透射的光量来执行透射率测量。
[0075] 根据本发明的方法需要至少两次透射率测量；用作样本的基线测量的第一测量(T1)和在添加结合总血红蛋白的试剂之后的后续测量(T2)，在与基线测量相比较之后，测量因将结合血红蛋白的试剂添加至样本造成的透射率变化。随后，可以使用该透射率变化来确定样本的吸光度，其是样本中的血红蛋白浓度的直接测量。
[0076] 优选在大约570nm处的荧光的测量
[0077] 发现通过使用样本与HbA1c结合荧光团接触的方法测量样本中的HbA1c的量并且测量样本大约在荧光团的发射波长处的荧光变化，可以获得改进的准确度和精度。
[0078] 实际上，通过使用发射(并过滤)大约处于相应荧光团的激发波长的光的光源(并且优选地还有滤波器)照射液体，并检测样本大约在荧光团的发射波长处的荧光来执行荧光的测量。
[0079] 当利用含四溴荧光素(eosin)的荧光团时，即使四溴荧光素在大约543nm处发光，也发现可以(在不影响该化验的精度和准确度的情况下)测量在与透射波长相同的波长处的荧光，由此提供更加简单的化验。因此，在本发明的高度优选实施方式中，荧光团包括四溴荧光素，并且荧光测量(X)在570nm处执行。
[0080] 荧光团
[0081] 根据本发明，术语“荧光团”包括磷光化合物和荧光化合物。优选的是，荧光团具有450nm-800nm的主激发波长(即，离蛋白质的主激发波长稍远)。还优选的是，主荧光波长为
450nm-600nm。特别优选的是，荧光团含有荧光化合物的残基(诸如荧光素或荧光素衍生物)，例如羧基荧光素或氯代荧光素(chlorofluoreacein)。在这种情况下，激发波长优选为大约480nm，并且优选在约520nm处检测荧光。为化学发光或磷光而不是荧光的其它络合物有机分子也可以用作本发明的方法中的发光标记物，只要它们的化学发光或磷光可以通过共价键合至HbA1c被选择性地猝灭。
450nm-600nm。特别优选的是，荧光团含有荧光化合物的残基(诸如荧光素或荧光素衍生物)，例如羧基荧光素或氯代荧光素(chlorofluoreacein)。在这种情况下，激发波长优选为大约480nm，并且优选在约520nm处检测荧光。为化学发光或磷光而不是荧光的其它络合物有机分子也可以用作本发明的方法中的发光标记物，只要它们的化学发光或磷光可以通过共价键合至HbA1c被选择性地猝灭。
[0082] 合适荧光团包括(括号中示出的数字是主激发波长和荧光波长)：萘并荧光素(600nm/672nm)、四溴荧光素(522nm/543nm)、四碘荧光素(528nm/553nm)、香豆素和伞形酮(360nm/460nm)衍生物、罗丹明衍生物(例如，罗丹明B(550nm/585nm)、四甲基罗丹明(540nm/570nm))、德克萨斯红衍生物(589nm/615nm)、荧光黄衍生物(420nm/535nm)、以及各种BODIPY(4.sub.l 4-difluoro-4-bora-3a.sub.1 4a diaza-s-indacine)衍生物、NBD-卤化物(4-halogeno-7-nitrobenzo-2-oxa-l.sub.l 3-diazole)衍生物、镧系元素螯合物衍生物、过渡金属螯合物衍生物(例如，Ru三菲咯啉或Ru三联吡啶衍生物)和藻胆蛋白衍生物。
[0083] 激发光源和发射测量二极管(或相应滤波器)应当优选地发射/测量处于大约相关波长的光，但不需要精确地与这些最佳波长对准。根据本发明的优选实施方式，荧光团包括四溴荧光素(522nm/543nm)，并且发射荧光X在大约570nm被测量，从而提供更简单的化验。
[0084] 能够结合HbA1c的配体
[0085] 根据本发明，该配体是能够将HbA1c和荧光团选择性地接合或结合在一起的任何试剂。
[0086] 在本发明的优选实施方式中，配体是硼酸盐或硼酸。
[0087] 血红蛋白结合剂
[0088] 根据本发明，血红蛋白结合剂是能够结合所有类型的血红蛋白的任何试剂。
[0089] 在本发明的优选实施方式中，血红蛋白结合剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。
[0090] 套装
[0091] 在另一实施方式中，本发明提供了一种用于确定样本中的HbA1c的量的套装，该套装包括：包括能够结合HbA1c的配体的荧光团、用于实现根据本发明的方法的指令、以及关于具有用于在该方法的步骤h)中使用的已知量的HbA1c和血红蛋白的内部标准使用该方法获得的一个或更多个预定值。
[0092] 在优选实施方式中，在根据本发明的套装中，所述配体是硼酸盐或硼酸。
[0093] 在优选实施方式中，在根据本发明的套装中，所述荧光团包括四溴荧光素。
[0094] 在优选实施方式中，套装还包括一组预定校正因子，该组预定校正因子被用于校正在该方法的步骤d)中添加至样本的荧光团的实际量。
[0095] 示例
[0096] 示例1、HbA1c化验和校准过程
[0097] 样本
[0098] 六个校准器样本(全部表示人血中的HbA1c浓度的不同水平)购自Lyphochek血红蛋白Alc线性组(BIO-RAD)。根据制造商的说明，将来自该BIO-RAD套件的六个样本溶解。
[0099] 关于TRACE测量的六个线性样本和原始信号值在下表1中被报告。
[0100] 表1
[0101]
[0102] 表1显示了六个校准器(BIO-RAD)的TRACE测量。在第2列中，显示了TRACE荧光信号。在第3列中，显示了总血红蛋白信号，而在第4列中，显示最终TRACE HbA1c原始信号。第1列示出了六种不同水平的HbA1c，每个水平都表示特定HbA1c浓度。第2列示出了在添加血液样本之后测量荧光减少的20秒之后，在510nm荧光通道中报告的HbA1c的原始信号。第3列示出了在测量荧光信号之后并且在将SLS溶液混合到TRACE比色杯之后，在570nm吸光度通道中报告的血红蛋白吸光度信号。在20秒内测量该570nm信号。第4列示出了最终HbA1c结果，其中，将来自第2列的荧光信号除以来自第3列的吸光度信号。第4列的信号表示TRACE报告的最终HbA1c原始信号。
[0103] 化验过程
[0104] 在t＝0至t＝10秒之间，在光电二极管1处测量的510nm荧光通道(光路1)和利用光电二极管2的570nm吸光度通道(光路2)两者中，将来自HbA1c缓冲液体(氯化铵、脱氧胆酸钠、叠氮化钠PH 8,6)的信号记录在TRACE比色杯中，如图1所示。
[0105] 在时间t＝11，将四溴荧光素-硼酸盐(含有HbA1c配体的荧光标记化合物)引入反应比色杯中。通过510nm LED(经过波长504nm-521nm)激发比色杯中的反应液体，并且针对光路1(光电二极管1)和光路2(光电二极管2)两者，在t＝11秒与t＝20秒之间记录荧光信号。
[0106] 在t＝21秒，将得自全血的样本(水平1-6)(每个样本中2.0μl)添加到比色杯中并与含有HbA1c缓冲液体和四溴荧光素-硼酸盐组分的反应液体混合。
[0107] 从t＝21秒(当将血液样本添加至反应液体时)到t＝198秒，每秒连续测量荧光。如在图2中看到的，该荧光持续减少，大约在80秒-100秒之间稍微接近渐近线。
[0108] 观察到，在该化验中，在时间点t＝22秒到时间点t＝42秒(即，在添加样本之后20秒)进行测量，记录在荧光通道中的荧光信号(光路1、光电二极管1)示出已经形成大约50％的HbA1c荧光团络合物。发现在该时间点(20秒钟)之前的样本测量提供比该时间点之后的测量更好的与内部标准的相关性。
[0109] 在时间点t＝45，将十二烷基硫酸钠引入主比色杯(3mg/mL HbA1c缓冲液体)中，并且在时间t＝55和t＝65之间，在吸光度通道(光路2、光电二极管2)中测量月桂基硫酸钠-总血红蛋白络合物。表示血红蛋白浓度的最终值在570nm吸光度通道(光路2、光电二极管2)中以10秒(t＝55秒至t＝65秒)测量的中间值来计算。通过利用在t＝0秒与t＝10秒之间生成的缓冲液体信号，将原始570nm信号转化成吸光度信号，来计算总血红蛋白浓度(Abs＝2-log(T％))，％T＝(570nm信号t＝55至t＝65/570nm信号t＝0至t＝10))*100。
[0110] 最终HbA1c信号被记录为HbA1c＝HbA1c(荧光信号t＝22秒至t＝42秒/吸光度信号t＝55秒至t＝65秒)。
[0111] 应注意到，在t＝11至t＝20之间测量的荧光信号(即，引入的荧光团分子的量)可能影响最终HbA1c信号，这意味着在将TRACE中获得的结果与内部标准进行比较时，可以针对该观察引入相关因子以进行相关。然而，这些相关因子很容易确定，并且在比较结果时可能很容易使用。
[0112] 从TRACE原始信号到最终IFCC或NGSP标准HbA1c结果
[0113] 将HbA1c值报告为mmol/mol值被称为IFCC(国际临床化学联合会)单位，而将HbA1c值报告为％值被称为NGSP(国家糖化血红蛋白标准化计划)单位。
[0114] 如表2中所示，最终TRACE原始信号针对本领域中的已知标准仪器被校准。在表2中，显示了根据IFCC的已知值和关于Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验)测量的六个校准器的NGSP值。
[0115] 表2
[0116]
[0117] 表2显示了与针对IFCC和NGSP标准两者的参照方法(罗氏Tina-quant化验)相比的六个校准器(BIO-RAD)的TRACE测量结果。在图3和图4中，显示了针对Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验)校准化验的最终HbA1c值，而图3显示了IFFC校准，并且图4显示了NGSP校准。
[0118] 示例2、HbA1c准确度过程
[0119] 根据示例1，关于TRACE测量从Herlev医院获得的40个患者的样本。针对每个样本，从Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验)获得以NGSP格式报告的已知值。
[0121] 表3
[0122]
[0123] 图5以图形方式显示了表3的内容，其中，来自40个患者的TRACE HbA1c原始信号被显示(x轴)为最终TRACE NGSP信号(y轴)的函数。
[0124] 在表4中，将关于TRACE运行的40名患者的样本与关于Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验格式)运行的相同40名患者的样本相比较。
[0125] 表4
[0126]
[0127] 图6以图形方式显示了表4的内容，然而，来自40个患者的TRACE HbA1c NGSP结果被显示(x轴)为来自Roche cobas c系统(Tina-quant HbA1c化验格式)的最终TRACE NGSP信号(y轴)的函数。
[0128] 可以从图6观察到，两种化验格式(TRACE HbA1c化验格式对比Tina-quant HbA1c化验格式)之间存在良好的相关性。
[0129] 在表5中，TRACE与Tina-quant HbA1c化验格式之间的偏差以实际值(第4列)并且以％值(第5列)两者被计算。
[0130] 表5
[0131]
[0132]
[0133] 根据NGSP认证过程，来自40个样本中的37个样本应当被定位成离已知标准化验+/-6％。如表5所示，TRACE符合针对NGSP认证的该标准(偏差＝+/-6％以内)。
[0134] 示例3、HbA1c精度过程
[0135] 在五天内关于TRACE测量Liquichek糖尿病控制水平1、2以及3(BIO-RAD标准)。每个控制每天被测量四次。根据示例1和2执行总共3×4×5＝60次测量。
[0136] 针对Tina-quant HbA1c化验格式执行校准，并且以NGSP单位报告值。
[0137] 表6显示了平均值以及批内和批间％CV显示。
[0138] 表6
[0139]
[0140] 根据NGSP计划，针对HbA1c化验的精度的推荐应低于3.5％。如表6所示，根据本发明的方法使该标准符合NGSP推荐以用于精度标准。
[0141] 示例4、样本中的荧光团的浓度的HbA1c最终信号依赖性
[0142] 样本
[0143] 六个校准器样本(全部表示人血中的HbA1c浓度的不同水平)购自Lyphochek血红蛋白Alc线性组(BIO-RAD)。根据制造商的说明将来自该BIO-RAD套件的六个样本溶解。
[0144] 以在根据本发明的方法的步骤1d中添加的三种不同浓度的荧光团(FLT1)，关于TRACE测量六个线性样本，并且在表7中报告最终信号值。
[0145] 表7
[0146]
[0147] 表7显示了以在步骤1d中添加的三种不同浓度的荧光团(FLT1)关于TRACE测量的六个线性样本。
[0148] 从表7和图7可以观察到，添加的荧光团的初始浓度影响最终HbA1c信号。特别是，观察到，主要差异存在于以荧光团浓度3ug开始的六个校准器与以荧光团浓度4ug开始的六个校准器之间。
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