用于研究生物分子的溶剂可及性和三维结构的方法、系统和
组合物
相关申请的交叉引用
[0001] 本申请涉及2016年5月19日提交的美国临时
专利申请号62/338,699，要求其优先权，并通过引用将其并入本文。关于联邦资助研究的
声明[0002] 本
发明在由美国国家科学基金会授予的MCB1410164和CBET1066231和由美国
能源部授予的DE-FG02-88ER13938的政府支持下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
[0003] 调查生物系统的现有方法可以获得大量信息。现有方法的实例包括用于确定生物体的基因组、外显子组、转录组、
蛋白质组和代谢组的方法。
[0004] 可以解析基因组以确定生物体的遗传物质，通常以DNA的形式(尽管RNA在生物体的亚组中起到类似的作用)。基因组可包括遗传物质中存储的所有基因。外显子组是由外显子形成的基因组的一部分。
[0005] 转录组是指细胞、细胞组或整个生物体的mRNA的表达
水平。就特定细胞系而言，转录组包含关于环境的一些信息，因为mRNA表达产物可以基于环境条件而变化。
[0006] 蛋白质组是指在细胞、细胞组或整个生物体中表达的蛋白质群体。就特定细胞系而言，蛋白质组还包含关于环境的信息，因为蛋白质表达可以根据环境条件而变化。
[0007] 代谢组是指生物样品中存在的小分子群。就特定细胞系而言，代谢组包含关于环境的额外且不同的信息，因为小分子的产生和消耗可以根据环境条件而变化。
[0008] 除了以上所有之外，还有一个尚未被有效或高效探测的区域，即“构象组(conformatiome)”，其指的是给定生物样品中任何或所有生物分子的构象信息。理想地，构象组提供关于处于其天然和未改变的构象状态的各种生物分子的构象信息。
[0009] 声称探测构象结构信息的当前方法有以下一个或多个问题。首先，一些方法需要结晶样品(例如x射线晶体学)或其他不以其天然状态呈现生物分子的操作。其次，一些方法需要向样品中添加非天然化学物质以提供用于标记样品的物质。一个例子是蛋白质的快速光化学
氧化(FPOP)，其需要加入过氧化氢来氧化生物分子。过氧化氢的添加可能改变所研究的生物分子的构象状态。第三，一些方法需要非常昂贵的设备。例如，上述FPOP需要使用准分子
激光器，这是一种昂贵的仪器。其他方法，例如基于同步
加速器的羟基自由基足迹，可能涉及使用数百万美元的设施，例如
同步加速器。
[0010] 需要用于研究构象组的廉价系统和快速方法，且不需要对所研究的生物分子引入可能改变其结构的外来物质。
发明内容
[0011] 本公开通过提供与生物分子的
等离子体诱导氧化相关的方法、系统、物质组合物和
试剂盒克服了上述缺点。
[0012] 在一个方面，本公开提供了修饰位于样品中的生物分子的方法。样品可以通过
流体接触或被封闭在受限空间内。样品或流体可含有多个标记物自由基(radical)前体。方法可以包括一个或多个以下步骤：a)在流体中产生等离子体和/或在样品内产生等离子体，流体中的等离子体具有在样品1cm内的至少部分等离子体，从而将多个标记物自由基前体中的一个或多个转化为一个或多个标记物自由基；和b)等待足以使一个或多个标记物自由基与生物分子相互作用的时间长度，从而改变生物分子。
[0013] 在另一方面，本发明提供了修饰位于多个样品中的多个生物分子的方法。多个样品可以通过流体接触或者在多个受限空间中被隔离。多个样品或流体可含有多个标记物自由基前体。方法可以包括一个或多个以下步骤：a)在流体中产生一个或多个等离子体，流体中的一个或多个等离子体具有在多个样品的每个的1cm内的至少部分一个或多个等离子体，或在多个样品内产生多个等离子体，从而将多个标记物自由基前体中的一个或多个转化为一个或多个标记物自由基；和b)等待足以使多个标记物自由基中的一个或多个与多个生物分子相互作用的时间长
度，从而修饰多个生物分子。
[0014] 在另一方面，本公开内容提供了确定生物分子的部分是否溶剂可及的方法。生物分子和溶剂可以包含在样品中。样品可以通过流体接触或被封闭在受限空间内。样品或流体可含有标记物自由基前体。方法可以包括一个或多个以下步骤：a)利用将标记物自由基引入样品的
等离子体氧化生物分子；b)在步骤a)之后，评估生物分子的部分是否被a)的氧化步骤氧化，其中氧化的存在表明该部分是溶剂可及的，而没有氧化表明该部分是溶剂不可及的；和
c)生成报告，表明该部分是溶剂可及或溶液不可及的。
[0015] 在另一方面，本公开内容提供了评估含有一种或多种生物分子的生物样品的方法，所述生物分子具有一个或多个溶剂可及部分和一个或多个溶剂不可及部分。方法可以包括一个或多个以下步骤：a)获取生物样品的第一子样品和第二子样品，第一子样品和第二子样品包含基本等同浓度的一种或多种生物分子；b)将切割因子引入生物样品的第二子样品中，切割因子配置成改变一种或多种生物分子以使溶剂不可及部分的至少一部分接触溶剂；
c)利用将标记物自由基引入第一子样品和第二子样品的等离子体氧化第一子样品和
第二子样品中的一种或多种生物分子；
d)在步骤c)之后，评估第一子样品和第二子样品中的一种或多种生物分子之间的氧化水平差异，从而鉴定一个或多个溶剂不可及部分的至少一部分；和
e)生成报告，表明对一个或多个溶剂不可及部分的至少一部分的鉴定。
[0016] 在另一方面，本公开提供了用于修饰生物分子的系统。该系统可包括样品室，接地
电极，
电介质，等离子体电极，等离子体电极
定位系统，电源和控制系统。样品室可以配置为包含含有生物分子的样品。样品室可包括化学和生物惰性内表面。电介质可以将样品室与
接地电极分开。控制系统可以与电源、接地电极和等离子电极
电子通信。控制系统可以被配置为利用来自电源以及等离子体电极和接地电极的电
力从等离子体源点产生等离子体。等离子体可以配置成产生适于氧化生物分子的标记物自由基。
[0017] 在另一方面，本公开提供了用于修饰生物分子的系统。该系统可包括样品室，等离子体射流，等离子体射流定位系统，电源和控制系统。样品室可以配置为包含含有生物分子的样品。样品室可具有化学和生物惰性内表面。等离子体射流可以配置成产生等离子体并将等离子体引导至样品室中。控制系统可以与电源和等离子射流电子通信。控制系统可以配置成利用来自电源以及等离子体射流的
电能产生等离子体并将等离子体引导至样品室中。等离子体可以配置成产生适于氧化生物分子的标记物自由基。
[0018] 在另一方面，本公开提供了物质组合物。物质组合物可包括液体样品中的生物分子和至少一种标记物自由基前体和该液体样品中的等离子体。等离子体可以配置成将至少一种标记物自由基前体转化为标记物自由基。
[0019] 在另一方面，本公开提供了物质组合物。物质组合物可包括合成的生物分子，其配置成对等离子体诱导的氧化具有可预测的响应。
[0020] 在另一个其他方面，本公开提供了试剂盒。该试剂盒可包括对等离子体诱导的氧化具有已知响应的参考样品和关于已知响应的信息。
附图说明
[0021] 图1是根据本公开的一个方面的系统。
[0022] 图2是根据本公开的一个方面的系统。
[0023] 图3是根据本公开的一个方面的等离子体的图像。
[0024] 图4是放电中
电压和
电流的曲线图，如
实施例1所述。
[0025] 图5是显示生物分子的相对修饰的图，如实施例1中所述。
[0026] 图6是显示生物分子的修饰百分比的图，如实施例2所述。
[0027] 图7是
电泳凝胶的图像，示出了DNA的分解，如实施例3所述。
[0028] 图8是电泳凝胶的图像，示出了DNA的分解，如实施例3所述。
[0029] 图9是显示细胞内生物分子的修饰百分比的图，如实施例4所述。
[0030] 图10是显示细胞内特定生物分子的特定部分的修饰百分比的图，如实施例4所述。
[0031] 图11是未消化和消化的
牛血清
白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0032] 图12是未消化和消化的牛血清白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0033] 图13是未消化和消化的牛血清白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0034] 图14是未消化和消化的牛血清白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0035] 图15是未消化和消化的牛血清白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0036] 图16是未消化和消化的牛血清白蛋白的一对氧化图，如实施例6所述。
[0037] 图17是表皮生长因子受体蛋白的
晶体结构，显示当与表皮生长因子结合时氧化减少的残基。
[0038] 图18是表皮生长因子受体蛋白同二聚体的晶体结构，显示当与表皮生长因子结合时氧化减少的残基。
具体实施方式
[0039] 在进一步详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方式。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的。本发明的范围仅受
权利要求的限制。如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数实施方式形式，除非文中另有明确说明。
[0040] 公开了与修饰生物分子有关的具体结构，装置和方法。对本领域技术人员显而易见的是，除了已描述的那些外，在不背离所述发明理念的前提下可以进行更多的改良。在解释本公开时，所有术语应以与上下文一致的最广义的方式解释。术语“包含”的变体应该被解释为以非排他的方式引用元件，组件或步骤，因此引用的元件，组件或步骤可以与不明确引用的其他元件，组件或步骤组合。被称为“包含”某些元件的实施方式也被认为是“基本上由(这些元件)组成”和“由(这些元件)组成”。当列举特定值的两个或更多个范围时，本公开考虑了未明确列举的那些范围的上限和下限的所有组合。例如，叙述1至10或2至9的值也考虑1至9或2至10之间的值。
[0041] 可以在各种功能组件和处理步骤方面描述各个方面。应当理解，这些组件和步骤可以由被配置为执行
指定功能的任何数量的
硬件组件来实现。方法
[0042] 本公开提供了多种方法。应该理解，各种方法适合与其他方法一起使用。类似地，应当理解，各种方法适合与本文其他地方描述的系统和组合物一起使用。当关于给定方法描述本公开的特征时，除了上下文另外明确指出之外，该特征还明确地预期为对本文所述的其他方法、系统和组合物有用。
[0043] 本公开的方法通常源于发现用于修饰生物分子的新方法。这种新方法涉及产生等离子体，该等离子体本身产生可以氧化生物分子上的各种取代基的标记物自由基(例如，羟基自由基)。使用羟基自由基氧化生物分子通常是已知的，本公开内容代表了该方法的改进。
[0044] 在一个方面，本公开提供了修饰生物分子的方法。生物分子可以位于样品中。样品可以通过流体接触或被封闭在受限空间内。所述方法可包括：a)在样品的一定距离内的流体中产生等离子体或在样品内产生等离子体；和b)等待一定时间长度。等离子体可以在距离多至1cm，包括但不限于，多至5mm，多至
3mm，多至1mm，多至100μm，多至10μm，或多至1μm处具有距离样品最近的点。在某些方面，等离子体可以接触样品。在通过电极产生等离子体的某些方面中，等离子体可以通过距离样品多至3cm，包括但不限于多至1cm，或多至3mm的电极产生。本领域普通技术人员将理解，这些距离可以通过例如使用更大或更小的电压或改变等离子体脉冲的
频率来按比例放大或缩小。
[0045] 因此，步骤a)的产生可以将多个标记物自由基前体中的一个或多个转化为一个或多个标记物自由基。标记物自由基的实例包括但不限于羟基自由基(·OH)，氢自由基(H·)，亚
硝酸根或二氧化氮自由基(·NO2)，硝酸根自由基(·NO3)，过氧化物自由基(·OOH)，本领域普通技术人员已知的通过等离子体与自由基前体相互作用而产生的其他自由基，其组合等。标记物自由基前体的实例包括但不限于羟基自由基前体，例如水或过氧化氢，氢自由基前体，例如氢气，亚硝酸根自由基前体或二氧化氮自由基前体，例如亚硝酸盐或二氧化氮，硝酸根自由基前体，例如硝酸盐，过氧化物自由基前体，例如过氧化氢，本领域普通技术人员已知的通过与等离子体相互作用而转
化成自由基的其他前体，其组合等。时间长度可以是足以使一个或多个标记物自由基与生物分子相互作用的时间长度。这种相互作用可以修饰生物分子。
[0046] 不希望受任何特定理论的束缚，在流体中产生等离子体可涉及将流体中的标记物自由基前体转化为标记物自由基，然后标记物自由基经扩散或以其它方式输送到样品中。不希望受任何特定理论的束缚，在样品内产生等离子体可涉及将样品中的标记物自由基前体转化为标记物自由基，其在样品内扩散然后与生物分子相互作用。在某些方面，在流体中或样品内产生等离子体可包括在流体和样品内都产生等离子体。
[0047] 在某些方面，产生等离子体的步骤可包括从等离子体射流产生等离子体。等离子体射流背后的原理在下面更详细地描述，但简言之，等离子体射流涉及在受限空间中产生等离子体并随后使用气流向目标投射产生的等离子体(在本文情况中是向样品投射)。
[0048] 产生等离子体的步骤可包括产生单个等离子体脉冲或一系列等离子体脉冲。
[0049] 在某些方面，等离子体可以通过1V和1MV之间的电压产生，包括但不限于500V和100kV之间，1kV和50kV之间或5kV和15kV之间的电压。与上面公开的距离一样，这些电压可以根据具体的操作参数按比例放大或缩小。
[0050] 在利用一系列等离子体脉冲的方面中，可以利用本段中的操作参数。等离子体脉冲的脉冲宽度可为1ps至1ms的范围内，包括但不限于500ps至100μs或1ns至10μs的范围内的脉冲。等离子体脉冲序列的频率可以在1Hz和100GHz之间的范围内，包括但不限于10Hz和100MHz之间或1kHz和10kHz之间的范围中的频率。等离子体脉冲的序列可以在1ns至几小时到几天的总时间长度范围内产生，包括但不限于100ns至20分钟，1μs至1小时，1ms至30分钟，1s至10分钟，或30s至5分钟的总时间长度范围。上述等离子体脉冲序列的脉冲宽度，频率和总时间长度参数可以根据下述而变化：所产生的标记物自由基的寿命，目标生物分子的浓度，目标生物分子的大小，标记物自由基前体的浓度，目标生物分子在不同浓度的标记物自由基存在下的
稳定性，和/或所需生物分子的修饰程度和/或破坏程度。
[0051] 在某些方面，等离子体产生的步骤可以配置成使样品产生一定浓度标记物自由基。标记物自由基的浓度在等离子体之后立即处于最高点，并随着标记物自由基与生物分子相互作用、与样品内的其他组分相互作用、和/或由于重组过程而随时间的自然衰减而随时间衰减。在某些方面，产生等离子体的步骤可以配置成提供样品中标记物自由基的峰值浓度，其可以在50nM和800μM之间，包括但不限于500nM和800nM之间、5μM和8μM之间、或50μm和80μm之间的样品中标记物自由基的峰值浓度。在某些方面，产生等离子体的步骤可以配置成提供样品中标记物自由基的50nM至800μM平均浓度，包括但不限于500nM和800nM之间、5μM和8μM之间、或50μm和80μm之间的样品中标记物自由基的峰值浓度。在某些方面，平均浓度可以是基于等离子体的“开启”时间提供的值的分数或百分比，包括但不限于提供的值的
75％，50％，40％，30％，20％或10％。可以针对产生等离子体或等离子体脉冲序列期间的时间长度加上约5秒、10秒、30秒或1分钟的时间长度而测量平均浓度。
[0052] 在某些方面，产生等离子体的步骤可以将样品的
温度升高，升高的量小于一个或多个生物分子将开始变性的量。如果多个生物分子具有不同变性温度，那么产生等离子体的步骤可以使样品的温度升高，升高的量小于具有最低变性温度的生物分子将开始变性的量。出于本公开的该方面的目的，变性可以指四级、三级或二级结构的变性。
[0053] 在某些方面，产生等离子体的步骤可以将样品的温度升高小于50℃，包括但不限于小于5℃，或小于0.5℃。在某些方面，产生等离子体的步骤可以将样品的温度升高至低于73.5℃的温度，包括但不限于低于28.5℃的温度，或低于23.5℃的温度。
[0054] 在某些方面，产生等离子体的步骤中转移至样品的每单位体积
能量小于60MJ/μL，包括但不限于转移至样品的每单位体积能量小于180MJ/μL、或小于360MJ/μL。
[0055] 在某些方面，该方法可以在体积为1μL和400L的样品上进行，包括但不限于10μL至100mL的体积，或50μL至200μL的体积。
[0056] 在样品与流体接触的方面，流体可以是含有标记物自由基前体的气态原料气，所述标记物自由基前体的浓度范围为0.01wt％至99.99wt％，包括但不限于10％至99.9％，或90％至99％的浓度范围。气态原料气可以是空气，氧气，氮气，氩气，氦气，氙气，氪气，四氟化
碳，氢气，它们的组合等。
[0057] 在标记物自由基前体位于样品中的方面中，样品可含有浓度范围为0.01wt％至99.99wt％的标记物自由基前体，包括但不限于10％至99.9％，或90％至99％的浓度范围。
[0058] 可以扩展修饰生物分子的方法以修饰多个生物分子。这可以通过至少两种方式完成。首先，单个样品可含有多种生物分子。其次，多个样品(每个样品含有至少一种生物分子)可以进行本文所述的方法。对于涉及多个样品的第二种方法，本文关于单个样品描述的方法的方面(例如体积)可以适用于多个样品中的每一个。
[0059] 样品可以是在其中包含一种或多种生物分子的生物样品，或者样品可以是经制备以包括生物分子的样品，例如溶解在缓冲溶液中的蛋白质样品。
[0060] 在某些方面，生物分子可以选自核酸分子，蛋白质，脂质，生物
代谢物及其组合。
[0061] 在某些方面，样品可选自：血液，
血浆，尿液，唾液，淋巴液，泪液，汗液，脑脊髓液，
羊水，房水，玻璃体液，胆汁，
母乳，
耳垢，乳糜，食糜(chime)，内淋巴，外淋巴，渗出物，
粪便，女性射液，胃酸，胃液，粘液，心包液，腹膜液，胸膜液，脓液，稀黏液，皮脂，
浆液(serious fluid)，精液，包皮垢，痰液，滑液，
阴道分泌物，呕吐物，活细菌培养物，活组织或真核细胞培养物，及其组合。在某些方面，样品可选自真核细胞内液，真核细胞外液，原核细胞内液，原核细胞外液，匀浆组织或细胞，匀浆组织或细胞培养物，匀浆
植物组织，及其组合。在样品是细胞外液的某些方面，细胞外液可以选自：血管内液，间质液，淋巴液，跨细胞液，植物非原质体液或维管液，来自原核或真核体外生长的过量营养介质，及其组合。在样品是活细菌、组织或真核细胞培养物的某些方面，培养物可以是任何种类的原核生物，任何
哺乳动物组织或细胞培养物，任何可培养的真核生物物种，或其组合。在某些方面，样品可以是生物体的任何活生物体或亚组分，例如可以合适地定位在本文描述的系统中和/或适合用于本文所述的方法的一种或多种细胞。
[0062] 在某些方面，样品可包含一种或多种生物分子和缓冲溶液。在某些方面，缓冲溶液可包括或是
磷酸盐缓冲盐水溶液，三(羟甲基)
氨基甲烷(Tris)，Tris
盐酸，碳酸氢铵，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，2,2-双(羟甲基)-2,2′,2″-硝基三
乙醇(bis-tris)，N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)，哌嗪-N，N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)，3-(N-吗啉基)-
2-羟基丙磺酸钠盐(MOPSO)，1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(双-Tris丙烷)，N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)，
3-(双(2-羟乙基)氨基)-2-羟基丙烷-1-磺酸(DIPSO)，3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟基丙-1-磺酸(TAPSO)，Trizma，哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物(POPSO)，3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPS)，N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(TRICINE)，甘氨酰甘氨酸(GLY-GLY)，2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(BICINE)，N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(4-丁磺酸)(HEPBS)，3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]丙-1-磺酸(TAPS)，2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇(AMPD)，N-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)，N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)，N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)，1-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)，N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)，4-(环己基氨基)-
1-丁磺酸(CABS)，Lysogeny肉汤(LB)或其他营养生长培养基，任何定义为“生物缓冲液”的缓冲液，生物学或生理学相关的盐，其组合等。在某些方面，缓冲溶液可具有1至14的pH值，包括但不限于pH为3至9，或pH为4至8。
[0063] 本领域普通技术人员可以利用上述方法的操作参数将所需量的氧化引入生物分子中。此外，本领域普通技术人员可以利用操作参数来诱导这种氧化，同时对生物分子的损害最小。另一方面，本领域普通技术人员可以利用操作参数在对生物分子造成所需量的损伤的条件下诱导这种氧化。应当理解，可以从不引起损伤的方法中认识各种信息，并且可以从引起受控损伤和/或完全损伤的方法中认识各种不同类型的信息。
[0064] 可以使用对某些理想操作参数具有可预测的已知响应的对照样品来监测损伤量和氧化水平的控制。例如，在下面实施例1中描述的细胞色素C实验可以用作确定某个实验的操作参数是否合适的基准。在某些方面，本文描述的方法可包括使用对等离子体诱导的氧化具有已知响应的对照样品确认操作参数组的步骤。
[0065] 上述方法可用于确定关于生物分子的结构信息。生物分子可包括二级，三级和四级结构，其阻碍溶剂与生物分子的各个部分的相互作用。
[0066] 在另一方面，本公开内容提供了确定生物分子的部分是否被溶剂可及的方法。该方法可包括以下步骤：利用将标记物自由基引入样品的等离子体氧化生物分子；在氧化之后，评估生物分子的部分是否被a)的氧化步骤氧化，其中氧化的存在表明该部分是溶剂可及的而没有氧化表明该部分是溶剂不可及的；和生成报告，表明该部分是溶剂可及或溶液不可及的。
[0067] 在另一方面，本公开提供了评估含有一种或多种生物分子的生物样品的方法，所述生物分子具有一个或多个溶剂可及部分和一个或多个溶剂不可及部分。该方法可包括以下步骤：获取生物样品的第一子样品和第二子样品，第一子样品和第二子样品包含基本等同浓度的一种或多种生物分子；将切割因子引入生物样品的第二子样品中，切割因子配置成改变一种或多种生物分子以使溶剂不可及部分的至少一部分接触溶剂；利用将标记物自由基引入第一子样品和第二子样品的等离子体氧化第一子样品和第二子样品中的一种或多种生物分子；在氧化之后，评估第一子样品和第二子样品中的一种或多种生物分子之间的氧化水平差异，从而鉴定一个或多个溶剂不可及部分的至少一部分；和生成报告。
[0068] 这些方法的氧化可以通过本文他处描述的方法实现。
[0069] 引入切割因子的步骤可用于促进一种或多种生物分子中结构的可预测变化。使用这种可预测的结构变化作为比较基线，将不受切割因子影响的生物分子的氧化水平与经历切割因子的生物分子的氧化水平进行比较可以提供关于溶剂可及性的信息。
[0070] 在一些方面，切割因子可使一种或多种生物分子的所有溶剂不可及部分暴露于溶剂。例如，蛋白质可以被消化成单独的氨基酸，这些氨基酸都为溶剂可及的，在这种情况下，消化的蛋白质的所有部分将溶剂可及，从而氧化，并且未消化的蛋白质将仅其通常溶剂可及的部分为溶剂可及。
[0071] 切割因子可以是胰蛋白酶(牛)，胰凝
乳蛋白酶(牛)，内蛋白酶Asp-N(草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi))，内蛋白酶Arg-C(小鼠颌下腺)，内蛋白酶Glu-C(V8蛋白酶)(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))，内蛋白酶Lys-C(产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes))，胃蛋白酶(猪)，嗜热菌蛋白酶(热蛋白
水解杆菌(Bacillus thermo-proteolyticus))，弹性蛋白酶(猪)，木瓜蛋白酶(番木瓜(Carica papaya))，蛋白酶K(白色念球菌(Tritirachium album))，枯草杆菌蛋白酶(枯草杆菌(Bacillus subtilis))，梭菌蛋白酶(内蛋白酶-Arg-C)(溶组织梭菌(Clostridium histolyticum))，外肽酶，羧肽酶A(牛)，羧肽酶B(猪)，羧肽酶P(微紫青霉菌(Penicillium janthinellum))，羧肽酶Y(
酵母)，组织蛋白酶C，酰氨基酸释放酶(猪)，焦谷氨酸氨肽酶(牛)，本领域普通技术人员已知的其他切割因子，其组合等。
[0072] 评估步骤可涉及质谱分析，凝胶电泳，测序，例如DNA测序等。本文所述的氧化可以改变生物分子的一部分的分子量。例如，某些氨基酸易被标记物自由基氧化。特定氨基酸的分子量的增加表明它在氧化时是溶剂可及的。作为另一个例子，体内的DNA段可以避开周围环境(例如，通过使蛋白质与其结合)，并且该段不会暴露于如本文所述产生的自由基，因此不会经历自由基切割。因此，保持完整并且如此鉴定的DNA段可以与体内蛋白质结合相关。
[0073] 本文描述的方法可用于各种应用，包括但不限于生物药物的
质量控制。在某些情况下生物药物只有在保留其必要的二级、三级和/或四级结构以使它们能够在预期的生物环境中起作用时才可能是有效的。因此，在生产期间，整个运输期间和使用之前，重要的是确认生物药物没有失去其预期的二级，三级和/或四级结构。本文描述的方法提供了监测该结构并评估生物制药的依从性的手段。
[0074] 本文所述的方法还可用于评估受试者的
疾病状态，其中疾病状态通过一种或多种生物分子的构象变化来表现。例如，如果疾病状态通过蛋白质二聚体的分离来表现，则本公开的方法可用于鉴定二聚体的亚基之间的接触表面(其通常是溶剂不可及的)已经变为溶剂可及。如果方法确定接触表面为溶剂可及，则该信息可用于形成疾病状态的诊断。
[0075] 本文描述的方法可用于研究感兴趣样品的温度依赖性。例如，可以利用本文所述方法的温度依赖性部署来研究动力学、蛋白质折叠和其他感兴趣的温度依赖性机制。
[0076] 本文描述的方法可用于确定感兴趣的样品内的组分或亚组分的修饰率。例如，本文描述的方法可以比较感兴趣蛋白质上两个不同残基的氧化率，并且可以基于该速率之间的差异进行各种后续推断，例如确定溶剂可及性水平。系统
[0077] 本公开还提供了系统。该系统可适用于本文所述的方法和组合物。当关于给定系统描述本公开的特征时，除了上下文另外明确指出之外，该特征还明确地预期与本文所述的其他系统、方法和组合物组合。另外，除非上下文另有明确规定，下面关于图1中所示的本公开的方面所描述的特征适用于图2所示的本发明的方面，反之亦然。例如，在不脱离本公开的范围的情况下，图2中所示的冷却装置44，样品室
支架46或保护壳体48和
门50可以在图1的环境中部署。
[0078] 在一个方面，参考图1，本公开提供了用于修饰生物分子的系统10。用于修饰生物分子的系统10可包括样品室12，接地电极14，等离子体电极16，电源18和控制系统20。系统10还可以包括位于电源18和等离子体电极16之间的
放大器22。该系统可包括位于样品室12和接地电极14之间的电介质24。
[0079] 样品室12可配置成接收样品26。样品26可以是本文其他地方描述的那些。样品室12可具有化学和/或生物惰性的内表面。如本文所用，生物惰性是指不影响一种或多种生物分子的构象状态的材料。
[0080] 样品室12可以采用各种形状，例如圆柱体，椭圆柱体，矩形体，圆锥台，椎体(三
角形，矩形，五边形等)的平截头体，棱柱(三角形，五边形，六角形等)，用于保持液体样品的任何合适的形状，其任何细分(例如，半圆柱形)等。
[0081] 样品室12可以具有高度28和宽度30，其被配置为提供最佳的等离子体产生，以及产生的标记物自由基的随后相互作用。高度28可以是0.75英寸，宽度30可以是0.5英寸，但是可以预期其他尺寸的样品室12，并且适当的尺寸可以由本领域普通技术人员确定。
[0082] 在一些方面，样品室12可具有敞开的顶部。在一些方面，样品室可具有封闭的顶部。在样品室12具有封闭顶部的方面中，样品26可以完全填充样品室12，使得没有流体(例如气体，空气等)接触样品26，或者样品26可以填充样品室12的部分，用流体占据样品室12的剩余部分。
[0083] 在某些方面，样品室12可以是微流体装置和/或通道的一部分。
[0084] 接地电极14可以由本领域普通技术人员已知的导电材料构成。用于接地电极14的合适导电材料的实例包括但不限于
铜，
银，金，
铝，
铁，
石墨，
钙，铍，镁，铑，钼，铱，钨，锌，钴，镉，镍，钌，锂，锇，铂，钯，硒，钽，铌，铅，
钒，
锡，
钛，其导电氧化物，其导电
合金，导电
聚合物，及其组合。
[0085] 等离子体电极16可以由本领域普通技术人员已知的导电材料构成。用于等离子体电极16的合适导电材料的实例包括但不限于上面列出的适用于接地电极14的材料。
[0086] 在一些方面，等离子体电极16可以紧邻样品或可以接触样品。在等离子体电极16紧邻样品或与样品接触的情况下，等离子体电极16可由不污染样品的材料制成。本领域普通技术人员将理解，等离子体电极16污染样品的程度取决于样品的性质。等离子体电极16对本文其他地方描述的样品可以是非污染性的。
[0087] 等离子体电极16可以具有等离子体源点32，等离子体源点32是等离子体34出现的点。等离子体电极16可具有多个等离子体源点32。
[0088] 在某些方面，等离子体电极16可以具有介电涂层(未示出)，其可以防止等离子体电极16和样品26之间的直接接触。介电涂层可以至少
覆盖等离子体源点32。本领域普通技术人员将理解这种涂层可能对系统10的等离子体生产性能的影响，并且可以调整系统10的各个方面以适应这种涂层，同时保持系统10的整体性能。
[0089] 在某些方面，等离子体电极16可以具有针的形状或适于产生等离子体34的任何形状。等离子体源点32可以采用适合于产生根据本公开的等离子体34的形状。在某些方面，等离子体源点32可以采用针尖、凸圆形表面、平坦表面、多个针尖、圆盘、球体形状或本领域普通技术人员已知的适合于产生等离子体34的其他形状。
[0090] 在某些方面，等离子体34可以由不包括电极的
等离子体发生器产生。作为一个示例，
微波源可以被配置为产生具有本文他处描述的特性的等离子体34。
[0091] 在某些方面，等离子体电极16可以机械地耦合到等离子体电极移动装置36。等离子体电极移动装置36的示例包括但不限于1维，2维或3维移动台(手动和
电动机驱动)，
机械臂，电极阵列等。
[0092] 还考虑了这样的系统，其中样品室12，接地电极14和可选的电介质24可通过样品室移动装置(未示出)相对于等离子体电极16移动。样品室移动装置的实例包括上面关于等离子体电极移动装置36描述的那些。
[0093] 控制系统20可包括各种函数发生器，可编程
控制器，脉冲发生器，电压表，安培计，光
传感器，
温度计，气体
压力传感器，气体流量控制器，
荧光计，单色器，液体流量计，液体流量控制器，
定时器或本领域普通技术人员将认识到有用于控制系统10的各种组件的其他组件。在某些情况下，控制系统20是计算机。控制系统20可以配置成提供等离子体放电时间的精确控制。控制系统20可以提供毫秒级的等离子体放电
分辨率，例如大于100ms、大于10ms或大于1ms的分辨率。
[0094] 系统10可包括
用户界面38。用户界面38可以与控制系统20和/或电极移动装置36通信。用户界面可以采用计算机、个人设备的形式，例如
平板电脑或智能电话，机械输入的布置形式，例如按钮、旋钮、
开关等，或者接收用户输入并向控制系统20和/或电极移动装置36提供
信号以
操作系统10的其他手段的形式。
[0095] 在某些方面，系统10可具有多于一个的样品室12。在这些方面，系统10还可以具有多于一个等离子体电极16，其量等于样品室16的数量。例如，系统10可具有类似于96孔板的样品室12的阵列和单独或独立的等离子体电极16的阵列，其配置成使得每个样品室12具有位于其内的等离子体源点32以用于产生等离子体34。
[0096] 在一方面，系统10可用于评估生物样品。用于评估生物样品的系统10可任选地包括能够确定生物分子的部分是否已被标记物自由基修饰的分析装置40。分析装置40可以任选地与控制系统20和/或用户输入38电子通信。控制系统20可以任选地协调分析装置40的控制以及系统10的其他方面。用户界面38可以任选地与分析装置40协同使用，以控制分析装置和/或直接接收用户输入用以控制分析装置40。
[0097] 在某些方面，分析装置40可以是质谱仪。质谱仪可以是专用质谱仪，其配置成检测特别相关的物质。例如，专用质谱仪可以配置成检测氧化肽和非氧化肽的质量，为此可以获得对修饰的氨基酸进行定位的序列信息，同时忽略其他质量。
[0098] 在某些方面，样品室12可以直接连接到分析装置40，因此可以自动处理样品而无需用户将样品转移至分析装置。在某些方面，自动转移可以通过例如
机器人移液系统进行。
[0099] 在某些方面，系统10可包括用于将样品26自动引入样品室12中的样品料斗。样品料斗的实例包括但不限于位于样品室上方的自动移液管。本领域普通技术人员将理解，可与其他技术(例如气相色谱法)一起使用的自动化技术可与系统10一起使用。
[0100] 通过使用自动装载和/或自动转移到分析装置，结合下面描述的参考样品和试剂盒，系统10可以自动优化操作参数。例如，系统10可以在
存储器中存储参考质谱。然后系统可以自动将参考样品引入样品室，用操作参数组自动氧化参考样品，将氧化的参考样品自动转移至质谱，自动获取参考样品的质谱，比较获得的质谱与存储的参考质谱。系统可以重复该过程并使用优化程序改变操作参数，直到获得的质谱与存储的参考质谱基本匹配。
[0101] 如本文所用，“接地电极”是指单独的接地电极或多个接地电极，它们基本上彼此等效地接地。例如，在本公开的上下文中，全部电连接到同一地面的多个铜电极可以被认为是一个接地电极。为清楚起见，述及接地电极包括任何数量的单独接地电极。
[0102] 参考图2，示出系统10，其具有与图1中所示的特征兼容并可交换的修饰。为提高效率，图2中所示的并如上参考图1进行描述的特征，这里将不再重复，但是将其部署在上述相同和/或类似的环境中。若这些特征需要调整以在图2的环境中使用，本领域普通技术人员将理解如何适应这种调整。在一个方面，参考图2，本公开提供了包括等离子体射流42的系统10。系统10可包括等离子体射流移动装置37，其配置成物理操纵等离子体射流42，以便精确地输送从等离子体射流42射出的等离子体34。系统10可包括冷却装置44，其配置成热冷却样品室12内的样品26。该系统可包括配置成接收样品室12的样品室支架46。系统10可包括保护壳体48。保护壳体48可包括门50。系统10可包括气体
歧管52。系统10可包括温度传感器54。
[0103] 如本文所用，术语“等离子体射流”是指在第一空间内产生等离子体并通过气体的移动和等离子体射流的成形将产生的等离子体推向靶标的装置。等离子体产生领域的普通技术人员将认识到等离子体射流可以采用各种形式而不脱离本公开的范围。在一个示例中，等离子体射流42可以是玻璃管，具有如上所述的标记物自由基前体的流体通过该玻璃管流动。玻璃管可以被电极包围，在一些情况下是盘绕电极，其配置成在玻璃管内产生等离子体34。然后可以调节流体的流速以将等离子体34推出玻璃管并推向样品26。玻璃管可具有便于可重复地引导等离子体34的形状。等离子体射流42可以具有本领域普通技术人员已知的进气控制，并且可以由控制系统42控制。等离子体射流42还可以具有部署鞘气的能力，以控制等离子体34的方向性，尺寸和形状。商业上可获得的等离子体射流的非限制性实例是 可从总部位于乔治亚州罗斯威尔的Plasma Surgical公司商购获得。
[0104] 使用等离子体射流42的优点可包括但不限于
位置灵活性，增加对等离子体34的控制，以及本领域技术人员将理解的其他优点。作为一个示例，使用等离子体射流42可以便于使用更大的样品室12。在该示例中，等离子体射流42可以被部署为在样品26的大面积表面上“扫描”(例如，光栅扫描运动)以将等离子体34引入到样品26的不同区域。
[0105] 在一些情况下，等离子体射流42可具有与其功能相关的
湍流。该湍流可有利地用于辅助样品26的混合。
[0106] 冷却装置44可以是本领域普通技术人员已知的
对流冷却装置。合适的冷却装置44的示例包括但不限于液体流通冷却装置，珀耳帖冷却器等。冷却装置44可以由控制系统20控制。尽管未示出，但应该理解的是，冷却装置44也可以是加热装置或冷却和加热装置。
[0107] 样品室支架46可以配置成接收样品室12，因此可以具有与样品室12的尺寸和形状相关的尺寸和形状。在一些情况下，样品室保持器46可具有凹腔，该凹腔构造成接收样品室12。在一些情况下，样品室支架46可具有平坦表面，其上置有样品室12。在样品室12具有圆柱形状的某些情况下，样品室支架46可具有圆柱形腔，其配置成接收样品室。样品室支架46可以由导热的材料制成，例如陶瓷。样品室支架46可以是电绝缘的。
[0108] 保护壳体48可以是气密密封的。保护壳体48的门50可以具有自动
锁闭机构(未示出)。自动锁闭机构可以与控制系统20电子通信并由控制系统20控制。自动锁闭机构可以通过在系统10使用时锁闭门50并在系统10不活动时解锁门50来起作用。保护壳体48可以具有用于接收气体的入口51，以便控制保护壳体内的环境。气体歧管52可以连接到入口并且可以控制保护壳体48内的空气组成。气体歧管52可以是手动控制的，或者可以任选地由控制系统20自动控制。保护壳体48可以是透明的。保护壳体48可以由有机玻璃制成。
[0109] 温度传感器54可定位在样品室12附近，样品室12内，样品26附近和/或样品26内。可以使用多个温度传感器54。温度传感器54可以是温度计，
热电偶或本领域普通技术人员已知的可用于测量气体和/或液体温度的任何其他装置。温度传感器54可以可选地与控制系统20通信。由温度传感器54测量的温度可以用作反馈以控制系统10并且具体地用于控制等离子体34和/或冷却装置44。
[0110] 电源18可以包括并利用回扫
变压器，从而以较低的成本提供高电压性能。
[0111] 控制系统20可以接收关于已经引入样本的等离子体脉冲的数量的反馈，并且可以基于该反馈进一步控制系统10。
[0112] 在一些情况下，样品26可在样品26顶上具有一层油(未示出)，以使
蒸发和/或湍流最小化。物质组合物
[0113] 本公开内容提供了物质组合物。
[0114] 在一个方面，物质组合物可包含液体样品中的生物分子和样品内的等离子体。液体样品可包括至少一种标记物自由基前体。等离子体可以配置成将标记物自由基前体转化为标记物自由基。
[0115] 在一个方面，物质组合物可包含液体样品中的生物分子，其与流体和该液体样品和/或该流体内的等离子体接触。液体样品和/或流体可包括至少一种标记物自由基前体。等离子体可以配置成将标记物自由基前体转化为标记物自由基。
[0116] 在前述物质组合物的某些方面，组合物可包括多个标记物自由基前体，并且一部分前体已转化为标记物自由基，因此组合物包括等离子体，标记物自由基前体和标记物自由基。
[0117] 在一个方面，物质组合物可包括合成的生物分子，其配置成对等离子体诱导的氧化具有可预测的响应。合成的生物分子可具有预定质量和/或预定序列。合成的生物分子可以配置为被选择性地氧化预定次数，例如1次，2次，3次等，多至n次。合成的生物分子可以配置成在特定残基(例如特定氨基酸)或多个特定残基上选择性氧化。合成的生物分子可以配置成通过特定的自由基标记物选择性氧化。
[0118] 合成的生物分子可以被配置成在特定残基上被选择性氧化，所述残基在某些条件下是溶剂可及的而在其他条件下是溶液不可及的。例如，特定残基可以在第一温度，pH，
盐度或其他参数下是溶剂可及的，并且在第二温度，pH，盐度或其他参数下是溶液不可及的。
[0119] 在某些方面，物质组合物可包含合成的生物分子的混合物，其被配置成具有预定性质，例如以上关于合成生物分子所述的那些，和/或对等离子体诱导的氧化的可预测响应。
[0120] 在某些方面，物质组合物可以用作本文所述系统和方法的基准性能标准。试剂盒
[0121] 本公开提供了试剂盒。
[0122] 在一个方面，试剂盒可包括参考样品和信息，其允许参考样品用于根据上述一种或多种方法鉴定生物分子的性质。参考样品可具有对等离子体诱导的氧化的已知响应。该信息可包括已知响应。例如，信息可以是用于参考样品的最佳等离子体诱导氧化的已知质谱，其可以存储在存储器中。
[0123] 实验员会理解蛋白质样品可能是珍贵的。因此，本公开的试剂盒可以允许用户将系统调节为适当的设置，从而仅冒着破坏较不珍贵的参考样品的
风险。例如，具有对上述方法的已知响应的参考样本和描述该已知响应的信息可用于优化系统的操作参数，然后优化的操作参数可与感兴趣的样品本身一起使用。
[0124] 在一个方面，该试剂盒可用于确定系统是否被适当地配置。
[0125] 参考样品可以包括本文他处描述的样品的特征，只要在某种程度上已知对等离子体诱导的氧化的响应即可。
[0126] 信息可以是参考质谱的形式或参考质谱的目录。
[0127] 实施例1.标记细胞色素C
[0128] 如图1所示的系统用于在蛋白质溶液中产生自由基。等离子体按照如下制备：低压交流电源产生在音频范围内的可变频率信号。将该信号馈入Trek放大器(可从纽约洛克波特市的Trek公司商购)以产生高达30kHz的相同频率的高压信号。然后将Trek放大器的输出送入镍针，该镍针置于玻璃管中的蛋白质溶液上方。玻璃管的高度为0.75英寸，直径为0.5英寸。将管密封至玻璃薄片(0.0625英寸厚)，其用作电介质屏障。将铜电极放置在玻璃电介质的相对侧，并连接到信号发生器的另一侧(接地)。只要针和铜电极之间的电压超过取决于信号发生器的电压幅度和频率的特定值，就以微秒脉冲形成等离子体。等离子体在蛋白质溶液上方的空气中产生并延伸到液体本身中。
[0129] 得到的电介质屏障放电的照片如图3所示。跨放电的电压和电流的曲线示于图4，电压标记为U并且电流标记为I。该图显示了发生击穿并产生等离子体的时间。电压飙升，电流在正负值之间摆动，脉冲宽度为3-4μs。
[0130] 在蛋白质溶液中使用纯化的蛋白质细胞色素C来说明该方法的蛋白质标记能力。细胞色素C是一种模型蛋白，历史上已经通过其他方法进行了基准测试，包括背景技术部分中描述的基于同步加速器的方法。为了证明该方法的有效性，在以下条件下测试浓度为50μM的轻度缓冲盐溶液中的细胞色素C：无等离子体暴露；等离子体暴露30秒；和等离子体暴露
2分钟。实验进行两次，独立进行，并使用两种不同的互补质谱技术进行分析。结果已经浓缩成图5，其说明增加的等离子体暴露时间增加了对细胞色素C的特定区域的修饰。这些实验验证了上述方法是剂量依赖性的和可再现的。
[0131] 实施例2.标记牛血清白蛋白
[0132] 如图1所示的系统用于在蛋白质溶液中产生自由基，使用与实施例1中所述相同的操作参数。
[0133] 在以下条件下测试浓度为10μM的轻度缓冲盐溶液中的纯化牛血清白蛋白(BSA)：无等离子体暴露；等离子体暴露30秒；和等离子体暴露1分钟。通过该方法以剂量依赖性方式修饰BSA内的四种不同肽。
[0134] 参考图6，显示了在三种不同条件下四种不同肽的修饰百分比。结合实施例1，本实施例说明了系统和方法在标记不同浓度的蛋白质，标记不同大小的蛋白质和标记具有不同生理化学性质的蛋白质方面的有效性。
[0135] 实施例3.尺寸依赖和暴露剂量依赖性形式的DNA分解
[0136] 将水中的纯化的λ
噬菌体基因组DNA样品用作样品，使用类似于图1所示的实验装置和实施例1中描述的实验参数。λ噬菌体基因组含有48,500个
碱基对并且是线性的。将样品暴露于无等离子体、等离子体5秒、10秒、15秒、30秒、45秒和60秒。图7显示了在等离子体暴露后用DNA样品运行的电泳凝胶。没有暴露，5秒暴露和10秒暴露的样品基本上未经修饰。暴露15秒，30秒，45秒和60秒的样品在凝胶中产生拖尾。拖尾代表许多不同的DNA分解产物，其由羟基自由基非特异性地切割DNA产生，因此导致具有各种不同大小的
片段。随着暴露时间增加而发生的拖尾迁移表明随着暴露时间的增加，分解产物的尺寸减小。
[0137] 将7500碱基对质粒(环状DNA)暴露于相同条件下进行不暴露，5秒暴露，10秒暴露，15秒暴露和30秒暴露。图8显示了在等离子体暴露后用DNA样品运行的电泳凝胶。在这种情况下，与λ噬菌体基因组DNA相比，开始分解该DNA需要较少的总暴露时间，尽管总体上观察到类似的结果。
[0138] 实施例4.完整/活细胞中的蛋白质标记。
[0139] 将活的大肠杆菌暴露于实施例1中描述的等离子体条件。将样品暴露于无等离子体，1分钟等离子体暴露，3分钟等离子体暴露和5分钟等离子体暴露。未观察到大肠杆菌存活率由等离子体暴露显著降低。检查了其中序列信息来源于质谱后分析的所有肽，且鉴定出的肽百分比的剂量依赖性增加表明其中含有至少一个氧化事件。结果总结于图9。
[0140] 从蛋白质组背景中分离甘油激酶用于分析，甘油激酶是一种来自大肠杆菌的单一蛋白质。图10显示了蛋白质内修饰百分比与位置的图。该图说明了修饰选择性地发生在蛋白质的特定区域，特别是暴露于溶剂的区域。
[0141] 实施例5.对氧化的构象敏感性。
[0142] 在两个样品上重复实施例1的实验参数：1)含有完整细胞色素C的溶液；2)含有先通过蛋白水解成肽而变性的细胞色素C的溶液。将两种溶液暴露于等离子体持续相同的时间长度。当与完整细胞色素C相比时，变性细胞色素C的标记更广泛。该结果提供了构象信息可以源自本文公开的系统和方法的证据。
[0143] 实施例6.天然的与消化的牛血清白蛋白的比较。
[0144] 将水中未消化和消化的牛血清白蛋白样品用作样品，使用类似于图1所示的实验装置和实施例1所述的实验参数。图11至16显示了未消化的(顶部)和消化的(底部)牛血清白蛋白的氧化水平的比较图。图11和12缩放到100％，图13和14缩放到10％，图15和16缩放到1.0％。虽然缩放到100％的图看起来有些相似，但是缩放到10％和1.0％的图显示了未消化的实验和消化的实验之间的主要差异。具体而言，这些数据表明，当蛋白质未被消化时，各种残基的氧化受到溶剂相互作用减少的限制。另一方面，消化使得大多数残基为溶剂可及，并且在消化的实验中得到的氧化水平表明更多残基是可及的。该实施例证实，本文所述的方法可用于研究溶剂可及性，并且消化的蛋白质可用作与未消化的蛋白质比较的基准。
[0145] 实施例7.通过配体研究蛋白质结合和未结合的溶剂可及性。
[0146] 类似于图1中所示的实验装置和实施例1中所述的实验参数用于本实施例。图17显示了表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的蛋白质晶体结构。当与结合EGF的EGFR的氧化相比时，黑色残基代表未结合表皮生长因子(EGF)的EGFR中氧化更高的残基。图18显示了EGFR蛋白活化的同型二聚体的蛋白质晶体结构。在两种情况下，都未示出EGF。应当理解，与测得的氧化减少(即，当与EGF结合时氧化减少)相关的许多残基位于EGFR同型二聚体的界面处，这意味着在结合EGF并形成活化的同型二聚体中的相互作用区域(除了一些远离这些相互作用区域的残基外)由于结合和二聚化的结构修饰而具有降低的氧化。
[0147] 尽管已经关于某些实施方式相当详细地描述了本发明,但是本领域技术人员能够理解，可以通过不同于所述实施方式的方式实施本发明，本文所述的实施方式是为了举例说明，而没有限制的作用。因此，所附权利要求书的范围不应限于本文包含的实施方式所述的内容。
