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用于移动设备分析核酸和蛋白质的系统和方法

阅读:577发布:2021-06-26

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1.一种用于快速分析生物样品的系统,所述系统包括:
接收至少一个集成芯片的移动设备;
所述移动设备处理所述集成芯片以分析其上所加载的生物样品;
所述移动设备和所述集成芯片共同被配置成执行以下各项中的至少一种:对所述集成芯片上的分子或流体系统进行操纵和控制;
并且其中所述移动设备和集成芯片共同被配置成将制约对所述生物样品进行的所述分析的多个步骤中的至少一个的至少一种参数精确控制到加上或减去10%、加上或减去
1%、加上或减去0.1%、加上或减去0.01%、加上或减去0.001%或者加上或减去0.0001%以内。
2.如权利要求1所述的系统,
其中所述移动设备包括便携式控制组件,所述便携式控制组件接收所述至少一个紧凑的集成芯片,所述集成芯片包括:
提取模
任选的核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述提取模块处于流体连通;以及生物样品检测模块,所述生物样品检测模块与所述核酸扩增模块或提取模块处于流体连通,
所述便携式控制组件通过利用以下各项来处理所述集成芯片以分析其上所加载的生物样品:
提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述提取控制模块可操作地连接;以及生物样品检测控制模块,所述生物样品检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述提取模块可操作地连接。
3.如权利要求1或2所述的系统,其中所述便携式控制组件还包括用于将生物样品和任选的一种或多种试剂加载到所述集成芯片上的装置。
4.如权利要求1至3中任一项所述的系统,其中所述核酸提取控制模块还包括用于实现被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的细胞裂解的化学裂解装置。
5.如权利要求1至4中任一项所述的系统,其中所述提取控制模块还包括超声处理装置,所述超声处理装置用于在被加载到所述集成芯片上的所述生物样品内产生声波,所述超声波足以破坏所述生物样品中细胞的细胞膜。
6.如权利要求1至5中任一项所述的系统,其中所述提取控制模块还包括流体压产生装置,所述流体压力产生装置用于产生足够的流体压力以在被设置在所述集成芯片上的微细加工的凸起上对被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的细胞进行机械剪切。
7.如权利要求1至6中任一项所述的系统,其中所述提取控制模块还包括电穿孔装置,所述电穿孔装置用于向被加载到所述集成芯片上的生物样品施加可变电压,所述电压足以破坏所述生物样品中的细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的系统,其中所述提取控制模块还包括粒子捕获装置,所述二氧化硅粒子捕获装置用于捕获被引入到被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的二氧化硅粒子。
9.如权利要求1至8中任一项所述的系统,其中所述核酸提取控制模块还包括磁性粒子捕获装置,所述磁性粒子捕获装置用于捕获被引入到被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的磁性粒子。
10.如权利要求1至9中任一项所述的系统,其中所述磁性粒子捕获装置包括磁体。
11.如权利要求1至10中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块还包括用于基于孔的核酸扩增的装置。
12.如权利要求1至11中任一项所述的系统,其中所述用于基于孔的核酸扩增的装置包括热电加热装置,所述热电加热装置用于加热/冷却所述集成芯片的所述核酸扩增模块。
13.如权利要求1至12中任一项所述的系统,其中所述用于加热/冷却所述集成芯片的所述核酸扩增模块的热电加热装置包括温度传感器、用于控制所述热电加热装置的功率控制装置、以及用于存储和执行用于核酸扩增的指令的处理单元。
14.如权利要求1至13中任一项所述的系统,其中所述用于基于孔的核酸扩增的装置包括用于红外线加热所述集成芯片的所述核酸扩增模块的装置。
15.如权利要求1至14中任一项所述的系统,其中所述用于基于孔的核酸扩增的装置包括用于微波加热所述集成芯片的所述核酸扩增模块的装置。
16.如权利要求1至15中任一项所述的系统,其中所述用于基于孔的核酸扩增的装置包括用于向所述集成芯片的所述核酸扩增模块内的核酸链施加受控的张力的装置。
17.如权利要求1至16中任一项所述的系统,其中所述受控的张力是机械张力、流体动力学张力或电磁张力。
18.如权利要求1至17中任一项所述的系统,其中所述用于向所述核酸链施加受控的张力的装置被配置成等温操作。
19.如权利要求1至18中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块还包括基于流体的核酸扩增装置,所述核酸扩增装置包括产生流体流动的装置,所述产生流体流动的装置用于产生穿过所述集成芯片的所述核酸扩增模块的缓冲液流动,所述产生流体流动的装置与温度控制装置可操作地连接,所述温度控制装置用于控制所述集成芯片的所述核酸扩增模块的温度。
20.如权利要求1至19中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块包括用于实现核酸扩增的实时聚合链反应(PCR)控制装置。
21.如权利要求1至20中任一项所述的系统,其中所述生物样品检测控制模块包括用于检测核酸的荧光检测装置。
22.如权利要求1至21中任一项所述的系统,其中所述荧光检测装置包括发光二极管和/或激光二极管数据采集设备、以及用于存储和处理所述所采集的数据的处理单元。
23.如权利要求22中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块还包括用于实现核酸分离的毛细管电泳(CE)控制装置,所述CE控制装置与所述荧光检测装置可操作地连接。
24.如权利要求1至23中任一项所述的系统,其中所述CE控制装置还包括高电压控制单元,所述高电压控制单元用于对所述集成芯片的所述核酸检测模块施加电压,所述电压足以实现核酸的分离。
25.如权利要求1至24中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块还包括杂交微阵列。
26.如权利要求1至25中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块包括用于检测核酸的电化学装置。
27.如权利要求1至26中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块包括用于检测核酸的阻抗测量装置。
28.如权利要求1至27中任一项所述的系统,所述系统还包括用于使生物样品和/或核酸移动穿过所述集成芯片的流体压力产生装置。
29.如权利要求1至28中任一项所述的系统,所述系统还包括数据处理装置,所述数据处理装置用于存储、分类、定量以及传输通过分析所述生物样品所采集的数据。
30.如权利要求1至29中任一项所述的系统,其中所述数据处理装置包括用于无线数据传输的装置。
31.如权利要求1至30中任一项所述的系统,其中所述数据处理装置还包括用于计算病毒载量的病毒载量计算装置。
32.如权利要求1至31中任一项所述的系统,所述系统还包括用于输出数据的数据显示装置。
33.如权利要求1至32中任一项所述的系统,其中所述系统是移动设备。
34.如权利要求1至33中任一项所述的系统,其中所述集成芯片是一次性的。
35.一种用于快速分析生物样品的系统,所述系统包括:
接收至少一个紧凑的集成芯片的便携式控制组件,
所述集成芯片包括:
用于将生物样品和任选的一种或多种试剂加载到所述集成芯片上的注射口;
提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述提取模块处于流体连通;以及
检测模块,所述检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
所述便携式组件包括:
提取控制模块,所述提取控制模块包括磁性粒子捕获装置,所述磁性粒子捕获装置用于捕获被引入到被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的磁性粒子;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述提取控制模块可操作地连接,所述核酸扩增装置包括热电加热装置,所述热电加热装置用于加热/冷却所述集成芯片的所述核酸扩增模块;以及
检测控制模块,所述检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接,所述检测控制模块包括:
用于检测核酸或蛋白质的荧光检测装置;以及
毛细管电泳(CE)控制装置,所述装置与所述荧光检测装置可操作地连接,所述CE控制装置还包括高电压控制单元,所述高电压控制单元用于对所述集成芯片的所述核酸检测模块施加电压,所述电压足以实现核酸或蛋白质的分离;以及
流体压力产生装置,所述流体压力产生装置用于使所述生物样品和/或核酸移动穿过所述集成芯片。
36.如权利要求35所述的系统,所述磁性粒子捕获装置包括用于捕获磁性珠粒的永磁体和/或电磁体。
37.如权利要求35或36所述的系统,其中所述荧光检测装置包括发光二极管和/或激光二极管、数据采集设备、以及用于存储和处理所述所采集的数据的处理单元。
38.如权利要求35至37中任一项所述的系统,所述系统还包括数据处理装置,所述数据处理装置用于存储、分类、定量以及传输数据。
39.如权利要求35至38中任一项所述的系统,其中所述数据处理装置包括用于无线数据传输的装置。
40.如权利要求35至39中任一项所述的系统,所述系统还包括用于输出数据的数据显示装置。
41.如权利要求35至40中任一项所述的系统,其中所述系统是手持式的。
42.如权利要求35至41中任一项所述的系统,其中所述集成芯片是一次性的。
43.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(1)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(2)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(3)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
以及
(4)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测。
44.如权利要求43所述的方法,所述方法还包括计算病毒载量。
45.如权利要求43或44所述的方法,其中所述生物样品是血液、唾液、精液、尿液、、脑脊髓液、滑液、玻璃体液、胃液、鼻咽抽出液或淋巴中的任何一种或多种。
46.如权利要求43至45中任一项所述的方法,其中所述样品是组织样品、水样品、空气样品、食物样品或作物样品。
47.如权利要求43至46中任一项所述的方法,其中所述生物样品分析检测水传播的病原体、空气传播的病原体、食物传播的病原体或作物传播的病原体中的任何一种或多种。
48.一种用于快速相继提取、扩增以及分离生物样品中的核酸的集成芯片,所述集成芯片包括:
外壳,所述外壳具有集成在其中的微流体通道,所述微流体通道相继与核酸提取模块、核酸扩增模块以及核酸分离模块处于流体连通;
用于注射生物样品和试剂的至少一个样品入口端口,所述入口端口与所述核酸提取模块处于流体连通;
其中所述核酸提取模块包括用于从所述生物样品中提取核酸的至少一个提取室,所述提取室通过至少一个样品输送通道与所述样品入口端口连接;
其中所述核酸扩增模块包括用于扩增核酸的至少一个扩增室,所述核酸扩增室通过至少一个核酸输送通道与所述提取室连接;以及
其中所述核酸分离模块包括用于分离和检测所述核酸的至少一个检测通道,所述检测通道通过至少一个扩增产物输送通道与核酸扩增室连接。
49.如权利要求48所述的集成芯片,其中所述至少一个提取室包括磁性珠粒。
50.如权利要求48或49所述的集成芯片,其中所述至少一个提取室包括用于细胞裂解和核酸提取的试剂。
51.如权利要求48至50中任一项所述的集成芯片,其中所述核酸扩增模块还包括至少一个试剂添加口,所述试剂添加口与至少一个核酸输送通道处于流体连通。
52.如权利要求48至51中任一项所述的集成芯片,其中所述核酸分离模块还包括至少一个样品孔,所述样品孔与至少一个扩增产物输送通道处于流体连通。
53.如权利要求48至52中任一项所述的集成芯片,其中所述核酸分离模块还包括:
与至少一个检测通道处于流体连通的至少一个样品废物孔;
与至少一个检测通道处于流体连通的缓冲液废物孔;以及
与至少一个检测通道处于流体连通的缓冲液孔。
54.如权利要求48至53中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片包括:
至少两个样品入口端口;
至少两个核酸提取室,每一个所述核酸提取室通过对应的样品输送通道与所述至少两个样品入口端口中的一个连接;
至少两个核酸扩增室,每一个所述核酸扩增室通过对应的核酸输送通道与所述至少两个提取室中的一个连接;以及
至少两个检测通道,每一个所述检测通道通过对应的扩增产物输送通道与对应的核酸扩增室连接。
55.如权利要求48至54中任一项所述的集成芯片,其中所述至少两个检测通道相交。
56.如权利要求48至55中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括至少两个试剂添加口,每一个所述试剂添加口与对应的核酸输送通道处于流体连通。
57.如权利要求48至56中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括至少两个样品孔,每一个所述样品孔与对应的扩增产物输送通道处于流体连通。
58.如权利要求48至57中任一项所述的集成芯片,其中所述至少两个样品孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
59.如权利要求48至58中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括至少一个样品废物孔,所述至少一个样品废物孔中的每一个通过至少两个样品废物通道与至少两个检测通道连接。
60.如权利要求48至59中任一项所述的集成芯片,其中所述至少一个样品废物孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
61.如权利要求48至60中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括:
至少一个缓冲液废物孔,每一个所述缓冲液废物孔与至少两个检测通道处于流体连通;以及
缓冲液孔,所述缓冲液孔与至少两个检测通道处于流体连通。
62.如权利要求48至61中任一项所述的集成芯片,其中所述至少一个缓冲液废物孔和所述缓冲液孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
63.如权利要求48至62中任一项所述的集成芯片,其中所述缓冲液孔被设置在至少两个检测通道的相交点处,并且其中所述缓冲液孔与所述相交的检测通道处于流体连通。
64.如权利要求48至63中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片包括:
至少八个样品入口端口;
至少八个核酸提取室;
至少八个核酸扩增室;
至少八个检测通道;
至少八个试剂添加口;
至少八个样品孔;
至少四个样品废物孔;
至少四个缓冲液废物孔;以及
至少一个缓冲液孔。
65.如权利要求48至64中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括微细加工的凸起,所述凸起被设置在所述至少一个核酸提取室和/或所述至少一个样品输送通道中。
66.如权利要求48至65中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括用于对所述至少一个检测通道施加电压的至少两个电极
67.如权利要求48至66中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括至少一个核酸流量控制,所述核酸流量控制阀用于控制穿过所述至少一个核酸输送通道的流体流动。
68.如权利要求48至67中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括至少一个扩增产物控制阀,所述扩增产物控制阀用于控制穿过所述至少一个扩增产物输送通道的流体流动。
69.如权利要求48至68中任一项所述的集成芯片,所述集成芯片还包括:
至少两个核酸流量控制阀,所述核酸流量控制阀用于控制穿过对应的核酸输送通道的流体流动;以及
至少两个扩增产物控制阀,所述扩增产物控制阀用于控制穿过对应的扩增产物输送通道的流体流动。
70.如权利要求48至69中任一项所述的集成芯片,其中所述至少两个核酸流量控制阀和所述至少两个扩增产物控制阀是被动式旋塞,所述被动式旋塞被配置成插入到对应的试剂添加口和/或对应的样品孔中。
71.如权利要求48至70中任一项所述的集成芯片,其中所述至少两个核酸流量控制阀和所述至少两个扩增产物控制阀是可电磁控制的阀
72.如权利要求48至71中任一项所述的集成芯片,其中所述可电磁控制的阀门是磁流体阀门。
73.如权利要求48至72中任一项所述的集成芯片,其中所述至少两个样品入口端口、所述至少两个试剂添加口、所述至少两个样品孔、所述至少四个样品废物孔、所述至少四个缓冲液废物孔、以及所述至少一个缓冲液孔被配置成接收被动式旋塞。
74.如权利要求48至73中任一项所述的集成芯片,其中所述至少一个提取室具有至少
5μL的体积。
75.一种用于快速分析生物样品的系统,所述系统包括:
接收至少一个集成芯片的硬件系统,
所述集成芯片包括:
用于将生物样品和任选的一种或多种试剂加载到所述集成芯片上的注射口;
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸分离模块,所述核酸分离模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
所述硬件系统包括:
核酸提取控制模块,所述核酸提取控制模块包括磁性粒子捕获装置,所述磁性粒子捕获装置用于捕获被引入到被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的磁性粒子;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接,所述核酸扩增装置包括热电加热装置,所述热电加热装置用于加热/冷却所述集成芯片的所述核酸扩增模块;以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接,所述核酸检测控制模块包括:
用于检测核酸的荧光检测装置;以及
毛细管电泳(CE)控制装置,所述装置与所述荧光检测装置可操作地连接,所述CE控制装置还包括高电压控制单元,所述高电压控制单元用于对所述集成芯片的所述核酸分离模块施加电压,所述电压足以实现核酸的分离;以及
流体压力产生装置,所述流体压力产生装置用于使所述生物样品和/或核酸移动穿过所述集成芯片。
76.如权利要求75所述的系统,所述磁性粒子捕获装置包括用于捕获磁性珠粒的永磁体和/或电磁体。
77.如权利要求75或76所述的系统,其中所述荧光检测装置包括发光二极管和/或激光二极管、数据采集设备、以及用于存储和处理所述所采集的数据的处理单元。
78.如权利要求75至77中任一项所述的系统,所述系统还包括数据处理装置,所述数据处理装置用于存储、分类、定量以及传输数据。
79.如权利要求75至78中任一项所述的系统,所述系统还包括用于输出数据的数据显示装置。
80.如权利要求75至79中任一项所述的系统,其中所述用于加热/冷却所述集成芯片的所述核酸扩增模块的热电加热装置包括温度传感器、用于控制所述热电加热装置的功率控制装置、以及用于存储和执行用于核酸扩增的指令的处理单元。
81.如权利要求75至80中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块包括用于实现核酸扩增的实时聚合链反应(PCR)控制装置。
82.如权利要求75至81中任一项所述的系统,其中所述荧光检测装置包括发光二极管和/或激光二极管、数据采集设备、以及用于存储和处理所述所采集的数据的处理单元。
83.如权利要求75至82中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块还包括用于实现核酸分离的毛细管电泳(CE)控制装置,所述CE控制装置与所述荧光检测装置可操作地连接。
84.如权利要求75至83中任一项所述的系统,其中所述CE控制装置还包括高电压控制单元,所述高电压控制单元用于对所述集成芯片的所述核酸分离模块施加电压,所述电压足以实现核酸的分离。
85.如权利要求75至84中任一项所述的系统,其中所述高电压控制单元对所述集成芯片的所述核酸分离模块施加10V至10kV。
86.如权利要求75至85中任一项所述的系统,其中所述核酸检测控制模块还包括杂交微阵列。
87.如权利要求75至86中任一项所述的系统,其中所述流体压力产生装置包括供给正压负压模块。
88.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括以下步骤:
提供集成芯片,所述集成芯片包括:
用于注射生物样品和试剂的至少一个样品入口端口;
核酸提取模块,所述核酸提取模块包括用于从所述生物样品中提取核酸的至少一个提取室,所述提取室通过至少一个样品输送通道与所述样品入口端口连接;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块包括用于扩增核酸的至少一个扩增室,所述核酸扩增室通过至少一个核酸输送通道与所述提取室连接;以及
核酸分离模块,所述核酸分离模块包括用于分离和检测所述核酸的至少一个检测通道,所述检测通道通过至少一个扩增产物输送通道与核酸扩增室连接;
经由所述至少一个样品注射口将至少一种生物样品和任选的试剂注射到至少一个提取室中;
在所述至少一个提取室中,通过将所述至少一种生物样品添加到连接有分子探针的磁性珠粒中来从所述至少一种生物样品中提取核酸;
将所述核酸从所述至少一个提取室输送到所述至少一个核酸扩增室中;
在所述至少一个核酸扩增室中,通过热聚合酶链反应(PCR)使所述核酸扩增;
将所述核酸从所述核酸扩增室输送到所述至少一个检测通道中;以及
在所述至少一个检测通道中根据尺寸使所述核酸分离并且检测所述核酸。
89.如权利要求88所述的方法,其中所述在所述至少一个提取室中从所述至少一种生物样品中提取核酸的步骤包括从几个细胞至几千个细胞中提取核酸。
90.如权利要求88或89所述的方法,其中所述从所述至少一种生物样品中提取核酸的步骤包括在所述至少一个提取室内使所述细胞裂解,保留所述所提取的核酸,以及纯化所述所提取的核酸。
91.如权利要求88至90中任一项所述的方法,所述方法还包括从所述至少一个提取室中去除细胞碎片。
92.如权利要求88至91中任一项所述的方法,其中所述PCR是实时定量PCR。
93.如权利要求88至92中任一项所述的方法,其中所述在所述至少一个检测通道中检测所述核酸的步骤包括:
对所述至少一个检测通道施加电压;以及
通过光源照射所述至少一个检测通道;以及
检测来自所述至少一个检测通道的荧光信号
94.如权利要求88至93中任一项所述的方法,其中所述集成芯片包括:
至少两个样品入口端口;
至少两个核酸提取室,每一个所述核酸提取室通过所述样品输送通道与所述至少两个样品入口端口中的一个连接;
至少两个核酸扩增室,每一个所述核酸扩增室通过一个核酸输送通道与所述至少两个提取室中的一个连接;以及
至少两个检测通道,每一个所述检测通道通过一个扩增产物输送通道与所述至少两个核酸扩增室中的一个连接,
其中所述至少两个检测通道相交。
95.如权利要求88至94中任一项所述的方法,所述方法还包括经由所述至少两个样品注射口将至少两种生物样品和任选的试剂注射到至少两个提取室中,其中所述检测步骤同时或相继进行以分析所述至少两种生物样品中的每一种。
96.如权利要求88至95中任一项所述的方法,其中所述集成芯片还包括:
至少一个核酸流量控制阀,所述核酸流量控制阀用于控制穿过所述至少一个核酸输送通道的流体流动;以及
至少一个扩增产物控制阀,所述扩增产物控制阀用于控制穿过所述至少一个扩增产物输送通道的流体流动。
97.如权利要求88至96中任一项所述的方法,其中所述集成芯片还包括:
至少一个缓冲液废物孔,每一个所述缓冲液废物孔与至少两个检测通道处于流体连通;以及
缓冲液孔,所述缓冲液孔与至少两个检测通道处于流体连通,
其中所述至少一个缓冲液废物孔和所述缓冲液孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
98.如权利要求88至97中任一项所述的方法,其中所述缓冲液孔被设置在至少两个检测通道的相交点处,并且其中所述缓冲液孔与所述相交的检测通道处于流体连通。
99.如权利要求88至98中任一项所述的方法,所述方法还包括以下步骤:将所述至少两个检测通道加载以用于分离所述核酸的筛分基质。
100.如权利要求88至99中任一项所述的方法,其中在所述至少一个检测通道中检测所述核酸包括检测不大于0.5μL的所述由PCR扩增的核酸。
101.如权利要求88至100中任一项所述的方法,其中在少于2小时、少于1小时、少于
30分钟、少于1分钟或少于1秒内进行所述根据尺寸分离所述核酸并且检测所述核酸的步骤。
102.如权利要求88至101中任一项所述的方法,其中在以下至少一项内进行所述从所述至少一种生物样品中提取核酸的步骤:3分钟至4分钟;以及5分钟至30分钟。
103.在微流体设备中,一种阀门组件,所述阀门组件包括:
用于输送流体的微流体通道,所述微流体通道在顶部表面与底部表面之间形成并且具有纵轴;
所述顶部表面中用于接收被动式旋塞的阀门口;以及
被配置成用于插入到所述阀门口中的被动式旋塞,
其中所述底部表面中与所述阀门口相对的部分沿纵轴具有均一的深度。
104.在微流体设备中,一种阀门组件,所述阀门组件包括:
用于输送流体的输送通道;
与所述输送通道相交的铁磁流体通道;
第一铁磁流体贮存器和第二铁磁流体贮存器,所述第一铁磁流体贮存器和所述第二铁磁流体贮存器由所述铁磁流体通道连接;
一个或两个铁磁流体贮存器中的铁磁流体;以及
用于使所述铁磁流体通道填充以所述铁磁流体的永磁体或电磁体。
105.在微流体设备中,一种阀门组件,所述阀门组件包括:
贮存器;
用于输送流体的流入输送通道,所述流入输送通道具有与所述贮存器连接的输出端;
用于输送流体的第一流出通道和第二流出通道,所述第一流出通道和所述第二流出通道中的每一个具有与所述贮存器连接的输入端;
被设置在所述贮存器中的铁磁流体;以及
用于控制所述铁磁流体在所述贮存器中的位置的磁体,
其中所述贮存器内的所述铁磁流体被定位以关闭:
所述流入通道的任何一个输出端;
或所述第一流出通道的输入端,而不关闭所述第二流出通道的输入端;
或所述第二通道的输入端,而不关闭所述第一流出通道的输入端;
或既不关闭所述流入通道的输出端,也不关闭所述第一流出通道和所述第二流出通道的输入端。
106.在微流体设备中,一种阀门组件,所述阀门组件包括:
用于输送流体的微流体通道,所述微流体通道在顶部表面与底部表面之间形成;
所述顶部表面中用于接收充气式弹性膜的阀门口;
被配置成用于插入到所述阀门口中的充气式弹性膜;以及
与所述充气式弹性膜联接用于将所述充气式弹性膜充气的进气管,所述充气式弹性膜在未充气时允许穿过所述微流体通道的流体输送,并且在充气时阻止穿过所述微流体通道的流体输送。
107.如权利要求106所述的阀门组件,其中所述充气式弹性膜和进气管被嵌入所述芯片中。
108.如权利要求106或107所述的阀门组件,其中所述充气式弹性膜被设置在所述顶部表面与所述底部表面之间。
109.在微流体设备中,一种阀门组件,所述阀门组件包括:
用于接收流体的加载孔;
与所述加载孔连接的第一输送通道;
经由所述第一输送通道与所述加载孔处于流体连通的封闭腔室;
与所述封闭腔室连接的第二输送通道;
经由所述第二输送通道与所述封闭腔室处于流体连通的开放孔;
所述第一输送通道中的第一充气式弹性膜,所述第一充气式弹性膜在未充气时允许所述加载孔与所述封闭腔室之间的流体连通,并且在充气时阻止所述加载孔与所述封闭腔室之间的流体连通;
在所述封闭腔室中在充气时排出流体的第二充气式弹性膜;以及
所述第二输送通道中的第三充气式弹性膜,所述第三充气式弹性膜在未充气时允许所述封闭腔室与所述开放孔之间的流体连通,并且在充气时阻止所述加载孔与所述封闭腔室之间的流体连通。
110.如权利要求109所述的阀门组件,所述阀门组件还包括分别与所述第一充气式弹性膜、所述第二充气式弹性膜、以及所述第三充气式弹性膜连接的第一气动输入管、第二气动输入管、以及第三气动输入管。
111.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及
(f)基于所述至少一种生物标志物,确定以下各项中的至少一种:
(i)至少一种药物实现对与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的剂量;
(ii)多种药物实现对所述与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的组合;以及
(iii)确定所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人是否是对用于所述与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的药物疗法的反应者。
112.如权利要求111所述的方法,其中所述至少一种生物标志物是病原体或疾病的特定株系所特有的。
113.如权利要求111或112所述的方法,所述方法包括确定以下各项中的至少一种:
(i)至少一种药物实现对与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的剂量;以及
(ii)多种药物实现对所述与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的组合;
所述方法包括基于所述特定株系来独特地确定所述至少一种药物的剂量以及所述多种药物的组合中的至少一种。
114.如权利要求111至113中任一项所述的方法,所述方法还包括基于所述特定株系递送所述被独特确定的剂量或组合。
115.如权利要求111至114中任一项所述的方法,其中所述特定株系包括人类免疫缺陷病毒(HIV)的株系。
116.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,确定在所述至少一种生物样品中与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物的量;以及(f)基于所述至少一种生物样品中所述至少一种生物标志物的量,确定对所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人的与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗进展程度。
117.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及
(f)基于所述至少一种生物标志物,确定以下各项中的至少一种:(i)用于所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个人护理产品的选择;(ii)用于所述个人的所述个人护理产品的递送量;(iii)所述个人的美容皮肤类型;以及(iv)在所述至少一种生物样品中所述个人的至少一种美容生物标志物的量。
118.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,确定在所述至少一种生物样品中与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种美容生物标志物的量;以及(f)基于所述至少一种生物样品中所述至少一种生物标志物的量,确定对所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人的美容护理的进展程度。
119.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及
(f)基于所述至少一种生物标志物,确定所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人的健康程度或类型。
120.如权利要求119所述的方法,其中确定所述个人的健康程度或类型包括确定以下各项中的至少一种:(i)所述个人的营养健康程度;或(ii)所述个人的营养需要;以及(iii)所述个人的阿育吠陀体型。
121.如权利要求119或120所述的方法,其中确定所述个人的健康程度或类型包括对所述个人的与糖尿病相关的至少一种生物标志物进行定量。
122.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及
(f)基于所述至少一种生物标志物,确定所述作为所述至少一种生物样品的来源的个人是否是与所述至少一种生物标志物有关的子集遗传群体的成员。
123.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,递送以下各项中的至少一种:(i)至少一种药物实现对疾病病况的治疗性处理的剂量;以及(ii)多种药物实现对所述疾病病况的治疗性处理的组合。
124.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中来自所述生物样品的所述所检测到的核酸包括以下各项中的至少一种:指示食品安全病原体的核酸;指示农业疾病的核酸;指示兽医学疾病的核酸;来自考古学样品的核酸;来自法证学样品的核酸;来自水样品的核酸;指示环境条件的核酸;来自海关样品的核酸;与保安相关的核酸;与生物防御相关的核酸;与生物燃料相关的核酸;与体育运动参与者相关的核酸;以及与个人的保健相关的核酸。
125.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括使用与所述便携式控制组件联接的通信模块,进行以下各项中的至少一种:发送和接收与所述生物样品有关的调制数据信号。
126.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过包括有线网络的网络进行所述发送和接收中的至少一种。
127.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过包括无线网络的网络进行所述发送和接收中的至少一种。
128.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述网络被配置成根据蓝牙标准进行操作。
129.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过调制解调器进行所述发送和接收中的至少一种。
130.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过网络进行所述发送和接收中的至少一种。
131.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括进行所述发送和接收中的至少一种以在距所述便携式控制组件一段距离处提供临床健康护理。
132.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括进行所述发送和接收中的至少一种以使用所述便携式控制组件提供医疗护理和公共卫生服务中的至少一种。
133.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过包括移动设备网络的网络进行所述发送和接收中的至少一种。
134.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括经由文本消息系统进行所述发送和接收中的至少一种。
135.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括通过局域网、广域网以及互联网中的至少一种进行所述发送和接收中的至少一种。
136.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述发送和接收中的至少一种包括与存储至少一种基因组谱的远程基因组数据库连接。
137.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述发送和接收中的至少一种包括参与中央数据中心与所述通信模块之间的调制数据信号的双向交换。
138.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括使用所述通信模块,(i)从所述中央数据中心接收病原体或疾病映射信息,以及(ii)向所述中央数据中心发送至少一种测定结果。
139.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述发送和接收中的至少一种包括向中央数据中心发送地理位置信息。
140.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述发送和接收中的至少一种包括从中央数据中心接收有关对来自多个通信模块的所检测到的疾病暴发模式的检测的通知。
141.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法还包括使用与所述便携式控制组件联接的通信模块,进行以下各项中的至少一种:存储、发送以及接收单一参考样品的信号谱。
142.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括基于来自所述生物样品的所述所检测到的核酸,确定病毒载量、每单位体积预测的细胞计数、以及药物剂量的滴定中的至少一种。
143.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述系统被配置成容许将分子的位置或取向控制到小于100nm、小于10nm、或小于1nm的尺寸内。
144.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述系统包括至少一个反应室,所述反应室包括以下最大尺寸:小于10mm、小于1mm、小于100微米、小于10微米、小于1微米、小于100nm、小于10nm或小于1nm。
145.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述系统被配置成将制约用于分析所述生物样品的反应的参数控制到加上或减去10%、加上或减去1%、加上或减去
0.1%、加上或减去0.01%、加上或减去0.001%或加上或减去0.0001%以内。
146.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述提取模块是核酸提取模块。
147.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述提取模块是蛋白质提取模块。
148.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块包括等温核酸扩增模块。
149.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述等温核酸扩增模块包括以下各项中的至少一种:环介导等温扩增模块、解旋酶依赖性扩增模块、链置换扩增模块、桥式扩增模块、或滚环扩增模块。
150.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述等温核酸扩增模块包括通过以下方法扩增核酸的模块,所述方法包括:
(a)使单链核酸的一条或多条模板链与和所述一条或多条模板链的一部分互补的一种或多种寡核苷酸引物接触
(b)使所述一种或多种引物中的至少一种引物与所述一条或多条模板链中所述与所述引物互补的部分退火
(c)使所述一条或多条模板链与核酸聚合酶和至少四种不同的三磷酸核苷接触;
(d)通过所述核酸聚合酶使所述至少一种退火的引物延伸,从而形成与所述一条或多条模板链结合的一种或多种延伸产物;
(e)使所述一种或多种延伸产物与所述一条或多条模板链分离;以及
(f)重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)以及(e)以扩增所述核酸,
其中在步骤(a)-(e)的后续循环中使用步骤(e)中的所述一种或多种延伸产物中的至少一种作为模板链,
其中,对于最后一个循环,步骤(e)是任选的,以及
其中步骤(b)或(d)中的至少一个包括向所述一条或多条模板链施加倾向于使所述核酸拉伸的张力。
151.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述系统是手持式的。
152.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(1)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
蛋白质提取模块;以及
蛋白质检测模块,所述蛋白质检测模块与所述蛋白质提取模块处于流体连通,(2)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(3)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
蛋白质提取控制模块;以及
蛋白质检测控制模块,所述蛋白质检测控制模块与所述蛋白质提取模块可操作地连接;
以及
(4)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的蛋白质进行提取和检测。
153.一种用于快速分析生物样品的方法,所述方法包括:
(a)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
(b)将所述至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;
(c)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
(d)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;
(e)基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及
(f)基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个性化基因组谱的至少一部分。
154.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与所述个人的保健相关的核酸。
155.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与所述个人的运动营养学相关的核酸。
156.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与所述个人的饮食相关的核酸。
157.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与所述个人的营养学相关的核酸。
158.如权利要求157所述的方法,其中所述与所述个人的营养学相关的核酸包括与所述个人的营养易感性相关的核酸。
159.如权利要求158所述的方法,其中所述易感性包括以下各项中的至少一种:所述个人的营养过敏、营养敏感性以及营养不耐受。
160.如权利要求159所述的方法,其中所述与所述个人的营养学相关的核酸包括与以下各项中的至少一种相关的核酸:麸质敏感性、麸质不耐受以及乳糖不耐受。
161.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与以下各项中的至少一种相关的核酸:营养品对所述个人的作用;所述个人的营养谱;
医学美容品对所述个人的作用;药物对所述个人的作用;以及食品或饮料对所述个人的作用。
162.如权利要求153至161中任一项所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测至少一种炎症标志物。
163.如权利要求162所述的方法,其中所述至少一种炎症标志物包括创伤性损伤的至少一种炎症标志物。
164.如权利要求162所述的方法,其中所述至少一种炎症标志物包括与饮食耐受性相关的至少一种炎症标志物。
165.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测至少一种类型的表型表达的至少一种RNA标志物。
166.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测与营养缺乏症相关的核酸。
167.如权利要求166所述的方法,其中所述营养缺乏症包括微量营养素缺乏症。
168.如权利要求167所述的方法,其中所述微量营养素包括维生素。
169.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括确定所述个人的微生物群落中缺乏的或发生改变的至少一种益生菌益生元
170.如权利要求153所述的方法,其中确定所述个性化基因组谱的至少一部分包括检测指示糖尿病类型或亚型的核酸。
171.一种用于快速分析生物样品的系统,所述系统包括:
(i)至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
至少一种生物样品被加载到所述至少一个集成芯片上;
(ii)便携式控制组件,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
所述便携式控制组件实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸的提取、扩增以及检测;
(iii)遗传分析单元,所述遗传分析单元被配置成基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;
(iv)所述遗传分析单元还被配置成基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个性化基因组谱的至少一部分。
172.如权利要求171所述的系统,所述系统还包括分配控制单元,所述分配控制单元被配置成至少部分地基于所述个性化基因组谱的至少一部分确定所分配的产品的至少一部分。
173.如权利要求172所述的系统,所述系统还包括分配启动器,所述分配启动器与所述分配控制单元联接,并且被配置成在所述分配控制单元的控制下分配所述产品的至少一部分。
174.如权利要求173所述的系统,其中所述分配启动器包括以下各项中的一种的至少一部分:售货机;自动柜员机;以及信息亭。
175.如权利要求173或174所述的系统,其中所述分配启动器包括被配置成打印所述产品的至少一部分的三维打印机
176.如权利要求173或174所述的系统,其中所述分配启动器被配置成分配预先包装的产品。
177.如权利要求172至176中任一项所述的系统,其中所述产品包括以下各项中的至少一种:食品、饮料、医学美容品、营养品、药物、草药、替代药物以及美容品。
178.如权利要求172至177中任一项所述的系统,其中所述分配控制单元被配置成至少部分地基于以下各项中的至少一种来确定所分配的所述产品的至少一部分:营养易感性、营养缺乏症、以及微生物群落中缺乏的或发生改变的至少一种益生菌或益生元。
179.如权利要求172至178中任一项所述的系统,其中所述用于快速分析生物样品的系统被配置成加强从所述分配启动器获得所述产品的消费者的体验。
180.一种用于快速分析生物样品的系统,所述系统包括:
(i)至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:
核酸提取模块;
核酸扩增模块,所述核酸扩增模块与所述核酸提取模块处于流体连通;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块与所述核酸扩增模块处于流体连通,
至少一种生物样品被加载到所述至少一个集成芯片上;
(ii)便携式控制组件,所述便携式控制组件包括:
核酸提取控制模块;
核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及
核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;
所述便携式控制组件实现对来自被加载到所述集成芯片上的所述生物样品的核酸的提取、扩增以及检测;
(iii)遗传分析单元,所述遗传分析单元被配置成基于所述对来自所述生物样品的所述核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;
心脏搏动控制单元,所述心脏搏动控制单元与所述遗传分析单元联接并且被配置成基于所述至少一种生物标志物控制心脏搏动单元。
181.如权利要求180所述的系统,其中所述至少一种生物标志物包括牵涉到动脉粥样硬化过程的生物标志物,并且其中所述心脏搏动控制单元被配置成逆转心脏动脉粥样硬化病况。
182.如权利要求180或181所述的系统,其中所述心脏搏动单元包括增强型体外反搏(EECP)治疗机器。
183.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括以下各项中的至少一种:经由核酸标志物诊断、分类或监测慢性疾病。
184.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述慢性疾病包括糖尿病。
185.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,其中所述核酸标志物包括炎症标志物。
186.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括对有机体进行基因分型,从而确定以下各项中的至少一种:对遗传疾病的易感性、疾病的株系、以及疾病病况的抗生素抗性。
187.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括进行以下各项中的至少一种:护理点检测HIV株、HIV病毒载量确定以及HIV基因分型。
188.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括确定病毒性肝炎的类型。
189.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括鉴定癌症基因。
190.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括进行药物监测。
191.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括使用移动设备进行以下各项中的至少一种:监测和预防HIV的母婴传播。
192.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括确定患者中存在的病原体以及所述病原体对至少一种抗生素或其它治疗的敏感性和抗性谱中的至少一种。
193.如前述方法权利要求中任一项所述的方法,所述方法包括以下各项中的至少一种:进行药物监测、使用设备作为疾病的预后指示器、以及使用设备作为治疗诊断设备。
194.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述系统被配置成容许将所述分子的位置或取向控制到小于100nm、小于10nm、或小于1nm的尺寸内。
195.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,所述流体系统包括至少一个反应室,所述反应室包括以下最大尺寸:小于10mm、小于1mm、小于100微米、小于10微米、小于1微米、小于100nm、小于10nm或小于1nm。
196.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中一个或多个模块共用共同的反应室。
197.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,所述系统被配置成用于作为可注射设备、可植入设备、可穿戴式设备或可摄取设备向所述患者递送。
198.如前述系统权利要求中任一项所述的系统,其中所述核酸扩增模块被配置成仅进行扩增、复制或测序的一个循环。
199.如权利要求198所述的系统,其中所述唯一一个循环是等温循环。
200.如权利要求198所述的系统,其中所述唯一一个循环是热循环。

说明书全文

用于移动设备分析核酸和蛋白质的系统和方法

[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2014年3月11日提交的美国临时申请号61/951,084的权益;并且要求2013年9月9日提交的美国临时申请号61/875,661的权益;并且要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/790,354的权益。上述申请的全部教导以引用的方式并入本文。

背景技术

[0003] 对生物机体的遗传物质进行检测和分析可以被用于病原体鉴定、基因分型、生物标志物鉴定、个性化医疗、个性化营养、个性化皮肤护理、个性化医学美容、个性化营养品、伴随诊断、药物监测、药物遗传学以及营养基因组学。可以通过将样品中存在的核酸与已知的参考样品中的核酸进行比较来确定生物样品中物质的身份。然而,在进行这种比较之前,必须从样品中提取核酸,将所述核酸扩增,然后检测。通常,在实验室或医院中,经过数小时、数天或数周的过程进行所述提取步骤、扩增步骤以及检测步骤。举例来说,扩增通常涉及聚合酶链反应(PCR),如美国专利号4,683,202和4,683,195中所述。为了使用常规的PCR扩增核酸,必须将核酸在酶、核苷酸、引物以及缓冲液存在下反复地加热和冷却。
[0004] 用于提取、扩增以及检测核酸的传统方法和设备通常没有稳健到足以在专的实验室基础结构外部的移动配置或现场配置中进行。提取和扩增单独即使不耗费数天,也要耗费数小时,这取决于有机体的类型、核酸链的长度、以及循环数。此外,可商购获得的设备和方法需要熟练劳动、流以及电力。此外,必须严格控制温度、pH值以及缓冲液成分。污染物可能会抑制或干扰复制中所使用的核酸聚合酶,从而降低扩增过程的效率和保真性。类似的限制适用于提取和检测核酸的常规技术。因此,对用于检测、定量以及鉴定核酸的自动化的、集成的、紧凑的、稳健的、快速的、准确的并且易于使用的设备和方法存在需求。发明内容
[0005] 本发明涉及一种用于快速分析、定量以及鉴定核酸或蛋白质的系统和方法。
[0006] 本发明提供了一种用于提取,任选地扩增、和检测(以及任选地定量)核酸或蛋白质的便携式或移动的或护理点(POC)系统,所述系统使用紧凑的集成芯片与便携式系统或移动设备的组合来分析所检测到的信号,并且经由无线网络比较和分发结果。可交换的模可以用于提取、扩增以及检测中的一种或多种。
[0007] 本发明具有许多优势。本发明与用于检测和分析核酸或在一些实施方案中检测和分析蛋白质的现有方法相比是更快的、更便宜的、更可现场部署的并且更精确的。不同于甚至耗费数小时到数周来对大样品进行表征或分析的常规方法,本发明通常在不到一小时、或不到半小时,例如数分钟内产生测量结果。本发明是灵敏到足以检测从含有少数细胞的样品中所提取的核酸(参见例证)。不同于需要实验室或诊所中的台式设备、训练有素的技术人员、电力、水、以及常常需要冷冻样品和试剂的标准诊断设备和方法,本发明可以在利用任选地一次性的紧凑集成芯片的便携式或移动设备中被实施。结果可以经由一种或多种通信网络,如无线网络和/或互联网被分发。本发明的系统不需要熟练劳动力或受过训练的技术人员,并且可以在医院或集中式实验室基础结构的外部工作。本发明的系统对于各种环境变量来说是稳健的并且可以在宽的pH值范围、温度范围、传统的架空的基础结构下以及任选地,在没有冷冻的情况下起作用。
[0008] 本发明可以被用于检测和辨别来自单一的生物有机体或其它来源或者多个有机体或来源的核酸分子或蛋白质。本发明不仅可以检测和分析未知的核酸,而且所述方法还灵敏到足以区分属内的物种、或辨别点突变和/或生物标志物序列和/或疾病易感性等位基因。在利用一次性集成芯片的本发明的实施方案中,在与现有的诊断测定的成本相比时,还存在显著的削减成本的效果。
[0009] 此外,在利用美国专利号7,494,791(它的整个公开内容在此以引用的方式并-7入本文)中所公开的非热核酸扩增方法的本发明的实施方案中,可以实现少于约1×10-10
处误差/基对或更好(例如少于10 处误差/碱基对)的误差率。甚至在“困难序列”(在所述序列上聚合酶有滑移、产生误差或停止工作的倾向;困难序列的实例包括重复序列、多聚腺苷酸序列、富含GC的序列、三核苷酸重复序列等)的情况下,可以实现少-3 -6
于1×10 处误差/碱基对或更好(例如少于10 处误差/碱基对)的误差率。所公开的非热核酸扩增方法可以用于利用可以经受得住超过100个核酸复制循环的试剂来扩增具有最多20,000个碱基对的长度的序列。可以使用其它等温的扩增方法,例如环介导等温扩增(LAMP)技术,如T.Notomi等,Nucleic Acids Research,28,e63(2000)中所述的那些;解旋酶依赖性扩增(HDA)技术,如Vincent M,Xu Y,Kong H.(2004),“解旋酶依赖性等温DNA扩增(Helicase-dependent isothermal DNA amplification)”,EMBO Rep
5(8):795-800中所述的那些;链置换扩增(SDA)技术,如G.T.Walker等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,392-396(1992)中所述的那些;所有这些参考文献的全部教导在此以引用的方式并入本文。可以使用桥式扩增、滚环扩增以及任何其它扩增方法(热或等温)。
[0010] 在根据本发明的一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的系统。所述系统包括接收至少一个集成芯片的移动设备。所述移动设备处理所述集成芯片以分析其上所加载的生物样品。所述移动设备和所述集成芯片共同被配置成执行以下各项中的至少一种:对所述集成芯片上的分子或流体系统进行操纵和控制。所述移动设备和集成芯片共同被配置成将制约对生物样品进行的分析的多个步骤中的至少一个的至少一种参数精确控制到加上或减去10%、加上或减去1%、加上或减去0.1%、加上或减去0.01%、加上或减去0.001%或者加上或减去0.0001%以内。
[0011] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的系统。所述系统包括接收至少一个紧凑的集成芯片的便携式控制组件。所述集成芯片包括提取模块;任选的与所述提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块或提取模块处于流体连通的生物样品检测模块。所述便携式控制组件处理所述集成芯片以通过利用以下各项来分析其上所加载的生物样品:提取控制模块;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述提取控制模块可操作地连接;以及生物样品检测控制模块,所述生物样品检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述提取模块可操作地连接。
[0012] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的系统。所述系统包括接收至少一个紧凑的集成芯片的便携式控制组件。所述集成芯片包括用于将生物样品和任选的一种或多种试剂加载到所述集成芯片上的注射口;提取模块;与所述提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块处于流体连通的检测模块。所述便携式组件包括提取控制模块,所述提取控制模块在一些实施方案中包括例如用于捕获被引入到被加载到所述集成芯片上的所述生物样品中的磁性粒子的磁性粒子捕获装置;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述提取控制模块可操作地连接,所述核酸扩增装置在一些实施方案中包括例如用于加热/冷却所述集成芯片的核酸扩增模块的基于热电、薄膜、红外线或光学的或机械加热装置;以及检测控制模块,所述检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接。所述检测控制模块在一些实施方案中包括用于检测核酸或蛋白质的荧光检测装置;并且在一些实施方案中包括例如与所述荧光检测装置可操作地连接的毛细管电泳(CE)控制装置,所述CE控制装置还包括用于在所述集成芯片的核酸检测模块上施加电压的高电压控制单元,所述电压足以实现核酸或蛋白质的分离;以及用于使所述生物样品和/或核酸移动穿过所述集成芯片的流体压力产生装置。
[0013] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的方法。所述方法包括(1)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:核酸提取模块;与所述核酸提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块处于流体连通的核酸检测模块;(2)将至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;(3)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括:核酸提取控制模块;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;以及核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;以及(4)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测。
[0014] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的方法。所述方法包括(1)提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:蛋白质提取模块;以及与所述蛋白质提取模块处于流体连通的蛋白质检测模块;(2)将至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;(3)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接,所述便携式控制组件包括蛋白质提取控制模块;以及蛋白质检测控制模块,所述蛋白质检测控制模块与所述蛋白质提取模块可操作地连接;以及(4)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的蛋白质进行提取和检测。
[0015] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速相继提取、扩增以及分离生物样品中的核酸的集成芯片。所述集成芯片包括外壳,所述外壳具有集成在其中的微流体通道,所述微流体通道相继与核酸提取模块、核酸扩增模块以及核酸分离模块处于流体连通;用于注射生物样品和试剂的至少一个样品入口端口,所述入口端口与所述核酸提取模块处于流体连通;其中所述核酸提取模块包括用于从所述生物样品中提取核酸的至少一个提取室,所述提取室通过至少一个样品输送通道与所述样品入口端口连接;其中所述核酸扩增模块包括用于扩增核酸的至少一个扩增室,所述核酸扩增室通过至少一个核酸输送通道与所述提取室连接;并且其中所述核酸分离模块包括用于分离和检测所述核酸的至少一个检测通道,所述检测通道通过至少一个扩增产物输送通道与所述核酸扩增室连接。
[0016] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的方法。所述方法包括提供至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:核酸提取模块;与所述核酸提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块处于流体连通的核酸检测模块。所述方法还包括将至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;以及使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接。所述便携式控制组件包括核酸提取控制模块;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;
以及核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接。所述方法还包括启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测;以及基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物。
[0017] 在另外的相关实施方案中,所述方法可以包括基于至少一种生物标志物,确定以下各项中的至少一种:(i)至少一种药物实现对与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的剂量;(ii)多种药物实现对与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗性处理的组合;以及(iii)确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人是否是对用于与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的药物疗法的反应者。
[0018] 在其它相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,确定所述至少一种生物样品中与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物的量;以及基于所述至少一种生物样品中所述至少一种生物标志物的量,确定对作为所述至少一种生物样品的来源的个人的与所述至少一种生物标志物相关的疾病病况的治疗进展程度。
[0019] 在另外的相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及基于所述至少一种生物标志物,确定以下各项中的至少一种:(i)用于作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个人护理产品的选择;(ii)用于所述个人的个人护理产品的递送量;(iii)例如所述个人的美容皮肤类型;以及(iv)在所述至少一种生物样品中所述个人的至少一种美容生物标志物的量。
[0020] 在其它相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,确定所述至少一种生物样品中与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种美容生物标志物的量;以及基于所述至少一种生物样品中所述至少一种生物标志物的量,确定对作为所述至少一种生物样品的来源的个人的美容护理的进展程度。
[0021] 在另外的相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的健康程度或类型。
[0022] 在其它相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人是否是与所述至少一种生物标志物有关的子集遗传群体的成员。
[0023] 在另外的相关实施方案中,所述方法可以包括基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个性化基因组谱的至少一部分。
[0024] 在另外的相关实施方案中,确定所述个性化的基因组谱的至少一部分可以包括检测与所述个人的保健、所述个人的运动营养、所述个人的个性化饮食以及所述个人的营养或个性化营养相关的核酸。
[0025] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的系统。所述系统包括至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:核酸提取模块;与所述核酸提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块处于流体连通的核酸检测模块,至少一种生物样品被加载到所述至少一个集成芯片上。所述系统还包括便携式控制组件,所述便携式控制组件包括:核酸提取控制模块;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;以及核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;所述便携式控制组件实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测。所述系统还包括遗传分析单元,所述遗传分析单元被配置成基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物。所述遗传分析单元还被配置成基于所述至少一种生物标志物,确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个性化基因组谱的至少一部分。
[0026] 在根据本发明的另一个实施方案中,提供了一种用于快速分析生物样品的系统。所述系统包括至少一个集成芯片,所述集成芯片包括:核酸提取模块;与所述核酸提取模块处于流体连通的核酸扩增模块;以及与所述核酸扩增模块处于流体连通的核酸检测模块,至少一种生物样品被加载到所述至少一个集成芯片上。所述系统还包括便携式控制组件,所述便携式控制组件包括:核酸提取控制模块;核酸扩增控制模块,所述核酸扩增控制模块与所述核酸提取控制模块可操作地连接;以及核酸检测控制模块,所述核酸检测控制模块与所述核酸扩增模块和所述核酸提取模块可操作地连接;所述便携式控制组件实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测。所述系统还包括遗传分析单元,所述遗传分析单元被配置成基于对来自所述生物样品的核酸的检测,测定与作为所述至少一种生物样品的来源的个人相关的至少一种生物标志物;以及心脏搏动控制单元,所述心脏搏动控制单元与所述遗传分析单元联接并且被配置成基于所述至少一种生物标志物控制增强型体外反搏(EECP)或其它心脏搏动单元。
[0027] 实施方案可以诸如通过电泳来进行蛋白质分离。
[0028] 提供了另外的相关系统和方法。附图说明
[0029] 根据以下对本发明的示例性实施方案的更具体的说明,上文将是显而易见的,如附图中所图示,其中贯穿不同的视图,同样的附图标记指代相同的零件。这些附图不一定是按比例绘制的,而是将重点放在图示本发明的实施方案。
[0030] 图1图示了用于检测和分析核酸的具有紧凑的集成芯片的便携式测定系统或移动系统的一个实施方案。
[0031] 图1A图示了与基因组数据库通信的便携式测定系统的模块化设计的一个实施方案。
[0032] 图2是本发明的系统和设备的模块化设计的一个实施方案的图示。
[0033] 图2A图示了提取控制模块的模块化设计的一个实施方案。
[0034] 图2B图示了扩增控制模块的模块化设计的一个实施方案。
[0035] 图3是用于检测和分析核酸的方法的流程图的说明性实施例
[0036] 图4是可以与本发明的设备和方法一起使用的紧凑的集成芯片的一个实施方案的图示。
[0037] 图5图示了用于控制集成芯片上的流体流动的示例性被动式旋塞。
[0038] 图6A和6B图示了用于控制穿过本发明所利用的集成芯片的流体流动的示例性可电磁控制的门和方法。
[0039] 图7A和7B图示了用于控制去往和来自芯片上孔的流体流动的示例性方法。
[0040] 图8A-8C图示了将样品注射到由本发明的一个实施方案用于毛细管电泳的通道中的通道和方法的示例性布置。
[0041] 图9A图示了荧光检测控制模块的模块化设计的一个实施方案。
[0042] 图9B图示了用于检测在集成芯片的核酸检测模块中所产生的荧光信号的示例性系统和方法。
[0043] 图10是图示了本申请在各种应用中的效用的流程图。
[0044] 图11图示了根据本发明的实施方案与紧凑的集成芯片一起使用的硬件模块。
[0045] 图12图示了与图11的硬件模块一起使用的珀尔帖加热设备(Peltier heating device)。
[0046] 图13图示了与紧凑的集成芯片一起使用的检测系统。
[0047] 图14图示了根据本发明的实施方案的与紧凑的集成芯片一起使用的硬件系统。
[0048] 图15A和15B图示了紧凑的集成芯片的基于充气式封装弹性膜的微流体阀门的不同视图。
[0049] 图16A-16F图示了紧凑的集成芯片的基于充气式封装弹性膜的微流体阀门组件的不同视图。
[0050] 图17A、17B、17C以及17D示出了芯片上DNA纯化和扩增的结果。
[0051] 图18是通过基于琼脂糖凝胶的电泳验证所得的扩增产物的尺寸的描绘。
[0052] 图19A、19B、19C以及19D示出了芯片上DNA纯化和扩增的结果。
[0053] 图20是通过基于琼脂糖凝胶的电泳验证所得的扩增产物的尺寸的描绘。
[0054] 图21示出了可穿戴式设备。(A)是皮肤贴片或真皮贴片;(B)是箍套,所述箍套包括根据本发明的设备和用于将所述设备保持在腕部、手臂、腿、手指上的带子;并且(C)是可以粘合方式在一侧与身体的体外部分附接并且在同一侧或相对侧与根据本发明的设备附接的贴片。
[0055] 图22示出了本发明的被配置成可植入的设备、可注射的设备或可摄取的设备的设备。
[0056] 图23是在根据本发明的一个实施方案的实验中用于HIV定量的稀释系列的目标标准曲线的图表。
[0057] 图24是示出了传统的PCR机器扩增目标HIV-1的典型动态范围的曲线的图表。
[0058] 图25A是图示了在根据本发明的一个实施方案的系统中对常见的细菌性病原体大肠杆菌进行测试的曲线的图表。
[0059] 图25B是在图25A的实验中定量循环与DNA拷贝数之间的线性拟合的图表。
[0060] 图26是根据本发明的一个实施方案的设备的示意图。
[0061] 图27是可以根据本发明的一个实施方案被测定、测量和/或监测的所选心血管炎症生物标志物的表。
[0062] 图28是可以根据本发明的一个实施方案被测定、测量和/或监测的所选糖尿病炎症生物标志物的表。
[0063] 图29是可以根据本发明的一个实施方案被测定、测量和/或监测的所选的针对肥胖、糖尿病以及心血管疾病进展的生物标志物的表。

具体实施方式

[0064] 本发明的示例性实施方案的说明如下。
[0065] 如本文所用的术语“流体”指的是气体或液体这两者。
[0066] 如本文所用的术语“微流体”指的是以0.1μL-100μL,并且优选地1μL至10μL的流体体积操作或与所述流体体积有关的设备和/或方法。
[0067] 如本文所用的术语“流体系统”意指使流体流动,例如使流体在至少一个通道、至少一个腔室、至少一个孔和/或至少一个端口中流动的系统,它们中的每一个均可以是微流体的。
[0068] 如本文所用的“核酸”指的是由单体核苷酸链(聚合物或低聚物)构成的大分子。最常见的核酸是脱核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。还应当了解的是,本发明可以用于检测和鉴定含有人工核酸的样品,所述人工核酸诸如肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)以及苏糖核酸(TNA)等等。在本发明的各个实施方案中,核酸可以源自于多种来源,如细菌、病毒、人类和动物以及诸如植物真菌的来源等等。所述来源可以是病原体。或者,所述来源可以是合成有机体。核酸可以是基因组的、染色体外的或合成的。在本文使用术语“DNA”的情况下,本领域的普通技术人员将了解的是,本文所述的方法和设备可以应用于其它核酸,例如RNA或上述那些。此外,术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”在本文用以包括任何长度的核苷酸的聚合形式,包括但不限于核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在这些术语之间不存在预期的长度方面的区别。此外,这些术语仅指的是分子的一级结构。因此,在某些实施方案中,这些术语可以包括三链、双链和单链DNA、PNA以及三链、双链和单链RNA。它们还包括多核苷酸的修饰(如通过甲基化和/或通过封端)以及未经过修饰的形式。更具体地说,术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)、任何其它类型的多核苷酸(它是嘌呤碱基或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷)、以及含有非核苷酸骨架的其它聚合物,例如聚酰胺(例如肽核酸(PNA))和聚吗啉代(可以Neugene商购自美国俄勒冈州科瓦利斯的抗病毒药物公司(Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.,U.S.A.))聚合物、以及其它合成序列特异性核酸聚合物,前体条件是所述聚合物在允许碱基配对和碱基堆积的(如DNA和RNA中所存在的)构型中含有核苷碱基。
[0069] 如本文所用的“蛋白质”是由一条或多条基酸链组成的生物分子。蛋白质彼此主要在它们的氨基酸序列方面有所不同,所述氨基酸序列是由编码基因的核苷酸序列决定的。肽是由相邻的氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键键合在一起的两个或更多个氨基酸的单一线型聚合物链;呈链形式的多个肽可以被称为多肽。蛋白质可以由一种或多种多肽构成。在合成之后不久或甚至在合成期间,蛋白质中的残基常常通过翻译后修饰而被化学修饰,所述翻译后修饰改变了蛋白质的物理特性和化学特性、折叠、稳定性、活性以及最终的功能。有时,蛋白质连接有非肽基团,这些基团可以被称作辅基或辅因子。
[0070] 如本文所用的“生物样品”包括含有可以被提取、分析以及检测的核酸和/或蛋白质的任何材料的样品。优选地,所述材料呈液体或气体的形式,或可以溶解或悬浮在液体或气体中,或可以被液化或转变成气体形式,或以其它方式制备用于通过本发明的设备和方法进行分析。例如可以将如粪便土壤样品的固体样品放置在水中,然后加载到芯片上。可以使用气溶胶生物样品。“生物样品”可以是以下各项或可以是以下各项的一部分:组织样品、生物流体样品、环境样品或另一类型的样品。优选地,所述生物样品源自于生物流体,诸如但不限于血液、唾液、精液、尿液、羊水、脑脊髓液、滑液、玻璃体液、胃液、鼻咽抽出液和/或淋巴。所述生物样品还可以是被核酸和/或蛋白质来源污染的材料或流体。所述生物样品可以是组织样品、水样品、空气样品、食物样品或作物样品。优选地,生物样品分析检测水传播的病原体、空气传播的病原体、食物传播的病原体或作物传播的病原体中的任何一种或多种。
[0071] 如本文所用的术语“生物分析”指的是实施生物化学测定,其中使用诸如细胞、核酸、蛋白质或其它生物分子等样品作为起始材料以提取信息来实现诊断、物种鉴定、辨别点突变和/或疾病易感性等位基因、定性分析、定量分析(例如以确定病毒载量)的目的以及本文所教导的其它目的。这种技术的应用的实例是通过从细胞提取遗传信息进行的病原体检测。如本文所用的“生物分析”的“步骤”指的是提取、任选的扩增以及检测的步骤。
[0072] 如本文所用的“生物标志物”指的是可以用作一定的生物状态或状况的指标的测量特征。举例来说,可以对生物标志物进行测量和评价以研究正常的生物过程、发病过程、或对治疗性处理的药理反应。
[0073] 如本文所用的“治疗性处理”是试图矫治健康问题。
[0074] 如本文所用的“遗传分析单元”指的是处理器,如硬件计算机处理器或其它专用数字信号处理器,所述处理器例如基于计算机程序接收电子信号、存储电子信号、输出电子信号、以及处理电子信号,其中所述电子信号与遗传分析有关。举例来说,所述遗传分析单元可以被编程以基于与所检测的核酸相关的输入信号测定生物标志物,以及基于所述生物标志物确定和输出个性化的基因组谱。
[0075] 如本文所用的“分配控制单元”指的是处理器,如硬件计算机处理器或其它专用数字信号处理器,所述处理器例如基于计算机程序接收电子信号、存储电子信号、输出电子信号、以及处理电子信号,其中所述电子信号与分配产品的至少一部分有关。举例来说,所述分配控制单元可以被配置成至少部分地基于个性化的基因组谱确定所分配的产品的至少一部分。
[0076] 如本文所用的“分配启动器”指的是被配置成分配产品的至少一部分的设备或系统。举例来说,所述分配启动器可以包括以下各项中的一种的至少一部分:售货机;自动柜员机;以及信息亭;并且可以包括被配置成打印所述产品的至少一部分的三维打印机或分配预先包装的产品。
[0077] 本发明的实施方案的部分,如遗传分析单元可以使用一种或多种计算机系统来实施,并且可以例如是在计算机处理器上运行的程序代码的一部分。举例来说,所述实施方案可以使用硬件、软件或其组合来实施。当在软件中实施时,所述软件代码可以被存储在任何形式的非暂态计算机可读介质上并且在任何合适的处理器或处理器的集合上加载并执行,无论是提供于单个计算机中还是在多个计算机之间分布。
[0078] 一般说明
[0079] 如本领域技术人员所将了解的是,本发明可以包括硬件部分、软件部分和/或软件部分和硬件部分的组合。在一个实施方案中,本发明是一种便携式处理装置,所述便携式处理装置与紧凑的集成芯片交接以在一个实施方案中根据计算机可读介质上所体现的计算机可使用的指令来提取、扩增、以及检测生物样品中的核酸,或在另一个实施方案中诸如通过电泳分离蛋白质。所述系统可以使用可交换的模块,如下文结合图2所进一步论述。
[0080] 如本文所用的术语“紧凑”指的是使流体通道、腔室、孔以及端口所使用的空间减至最少,如下文所论述,诸如通过例如微流体设备布局来实现的微流体设备布局设计。在一个实施方案中,相交流体通道和共用孔的使用举例说明了紧凑设计。如本文所用的术语“集成”指的是其中用于各种目的的流体通道、腔室、孔以及端口被组装在同一个微流体设备上/中的微流体设备布局设计。举例来说,图4中所示的芯片的实施方案包括用于核酸提取的核酸提取室、用于核酸扩增的核酸扩增室、以及用于分离和检测核酸的检测通道。尽管在前一句中所论述的腔室和通道是以复数形式说明的,但应当了解的是,它们可以是“至少一个”这样的腔室或通道。此外,应当了解的是,如本文所用,一个或多个“模块”可以共用共同的腔室,例如提取模块、扩增模块以及检测模块中的一个或多个可以共用一个或多个共同的腔室。如本文所用的术语“便携式”指的是系统或设备或移动设备可以容易地由个人用手携带或运送。如本文所用的术语“移动设备”指的是小型便携式设备,它通常具有带有触摸输入的显示屏和/或微型键盘并且重量少于约10kg,包括例如智能电话、平板电脑、膝上型计算机或其它便携式医疗设备。
[0081] 所述系统可以在计算机可读介质或中存储与所检测的核酸有关的指示并且将那些指示与基因组或转录组数据库中所存储的记录相比较,所述数据库可以被存储在计算机可读介质中或远程位置中。在替代性实施方案中,与参考标准有关的信息被存储在所述系统内所设置的计算机可读存储器中。在又另一个实施方案中,核酸标准被包括在集成芯片中,所述集成芯片可以与本发明的系统一起使用。
[0082] 所述处理器装置可以包括例如小型计算机、微型计算机、UNIX机器、个人计算机,如具有英特尔处理器或类似设备的个人计算机、微处理器或其它适当的计算机或甚至智能电话。它还通常包括常规的计算机部件(未示),如母板、中央处理单元(CPU)、随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器、以及外围设备,如键盘和显示器。RAM存储操作系统,如Windows CE或其它操作系统;以及用于处理与所检测的核酸或蛋白质有关的信号的适当的软件。
[0083] 本文所述的本发明的实施方案的部分可以使用一种或多种计算机系统来实施。举例来说,所述实施方案可以使用硬件、软件或其组合来实施。当在软件中实施时,所述软件代码可以被存储在任何形式的非暂态计算机可读介质上并且在任何合适的处理器或处理器的集合上加载并执行,无论是提供于单个计算机中还是在多个计算机之间分布。
[0084] 此外,应当了解的是,计算机可以任何多种形式体现,如膝上型计算机、平板计算机、或被嵌入一般不被视为计算机,但具有合适的处理能力的设备中的计算机,所述设备包括个人数字助理(PDA)、智能电话或任何其它合适的便携式或移动电子设备。
[0085] 此外,计算机可以具有一个或多个输入设备和输出设备。这些设备尤其可以用于呈现用户界面。可以用于提供用户界面的输出设备的实例包括用于视觉呈现输出的打印机或显示屏以及扬声器或用于听觉呈现输出的其它发声设备。可以用于用户界面的输入设备的实例包括键盘和指取设备,如鼠标触摸板以及数字化输入板。作为另一个实例,计算机可以经由语音识别或以其它可听形式接收输入信息。
[0086] 这些计算机可以通过一种或多种网络以任何合适的形式,包括作为局域网或广域网,如企业网络或互联网互连。这些网络可以基于任何合适的技术并且可以根据任何合适的协议来操作并且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。
[0087] 此外,本文所概述的各种方法或处理可以被编码成软件,所述软件可在利用多种操作系统或操作平台中的任一种的一种或多种处理器上执行。此外,这样的软件可以使用多种合适的编程语言和/或编程工具或脚本工具中的任一种来编写,并且还可以被编译成在框架虚拟机上执行的可执行机器语言代码或中间代码。
[0088] 在这方面,本发明的至少一部分可以被体现为一种计算机可读介质(或多种计算机可读介质)(例如计算机存储器、一种或多种软盘、压缩光盘、光盘、磁带、闪存存储器、现场可编程门阵列或其它半导体设备中的电路配置、或其它有形的计算机存储介质),所述计算机可读介质被编码有一种或多种程序,所述程序当在一种或多种计算机或其它处理器上被执行时执行实施上述本发明的各个实施方案的方法。所述一种或多种计算机可读介质可以是可移动的,以使得其上所存储的一种或多种程序可以被加载到一种或多种不同的计算机或其它处理器上以实施如上文所述的本发明的各个方面。
[0089] 在这方面,应当了解的是,上述实施方案的一个实施方式包括编码有计算机程序(例如多个指令)的至少一种计算机可读介质,所述计算机程序当在处理器上被执行时执行这些实施方案的一些或所有上述功能。如本文所用的术语“计算机可读介质”仅涵盖了非暂态计算机可读介质,所述非暂态计算机可读介质可以被认为是机器或制品(即制造产品)。计算机可读介质可以是例如上面可以编码或存储了计算机可读信息的有形介质、上面可以编码或存储了计算机可读信息的存储介质、和/或上面可以编码或存储了计算机可读信息的非暂态介质。计算机可读介质的其它非详尽的实例包括计算机存储器(例如ROM、RAM、闪存存储器、或其它类型的计算机存储器)、磁盘或磁带、光盘、和/或可以被认为是机器或制品的其它类型的计算机可读介质。
[0090] 术语“程序”或“软件”在本文中在一般意义上用以指可以被用于对计算机或其它处理器进行编程以实施如上文所述的本发明的各个方面的任何类型的计算机代码或计算机可执行的指令集。此外,应当了解的是,根据这个实施方案的一个方面,当被执行时执行本发明的方法的一种或多种计算机程序不需要驻留在单个计算机或处理器上,而是可以模块化方式在多个不同的计算机或处理器之间分布以实施本发明的各个方面。
[0091] 计算机可执行的指令可以呈由一种或多种计算机或其它设备执行的许多形式,如程序模块。一般来说,程序模块包括执行特定任务或实施特定抽象数据类型的例程、程序、对象、部件、数据结构等。通常,程序模块的功能可以在各个实施方案中根据需要被组合或分布。
[0092] 在一个实施方案中,便携式测定系统10大致是移动无线设备的尺寸,如图1中所示。用户使用显示装置12(例如液晶显示器)和输入装置14(例如键盘)与便携式测定系统10进行交接。为了使用便携式测定系统10,用户将样品22放置在集成芯片20上(在下文更详细地描述),然后将所述集成芯片20插入到所述系统本身中的狭槽16中。
[0093] 在用户加载集成芯片20之后,所述便携式测定系统10使用下文所述的方法或根据所使用的其它模块(如电泳)提取、扩增、以及检测样品22中的核酸。微处理器(未示)处理所检测到的信号,所述信号可以经由显示装置12向用户呈现并且经由通信装置18向其它用户发送。通信装置18可以用于发送和接收与生物样品22有关的调制数据信号。
[0094] 术语“调制数据信号”指的是传播的信号,所述信号的特征中的一种或多种已被设置或发生变化以编码所述信号中的信息。示例性调制数据信号包括载波或其它传输机制。通信介质包括任何信息传递介质。举例来说而不限于,通信介质包括:有线介质,如有线网络或直接有线连接;以及无线介质,如声波、红外线、无线电、微波、扩展频谱、以及其它无线介质技术。
[0095] 本发明可以包括用于存储多个基因组谱或转录组谱或目标生物标志物序列的基因组或转录组数据库。在一个实施方案中,本发明可以包括单一参考样品的信号谱。本发明的设备还可以与远程定位的基因组或转录组数据库,如由美国国家卫生研究院的疾病控制中心(National Institutes of Health,Center for Disease Control)等所维护的那些连接。这样的连接将有助于跟踪和协调在广泛分布的分析点对疾病暴发的响应。示例性分析点包括医院、过境、机场、难民营、农场、检疫区、灾害现场、无家可归者收容所、疗养院、肉类包装厂以及食品加工中心。本领域技术人员将了解本发明所适用的另外的其它分析点。
[0096] 本发明不需要直接与基因组或转录组数据库连接,尽管如果有必要的话,它也可以连接。在其它实施方案中,所述设备可以经由各种公共或专用网络,如局域网(LAN)、广域网(WAN)或互联网与基因组或转录组数据库连接。在一个实施方案中,基因组数据库是可通过公共网络(如互联网)访问的。数据在安全装置中,如经由安全套接字层(SSL)或安全复制来通信。
[0097] 在图1A中所示的实施方案中,便携式测定系统10与基因组数据库5经由互联网连接1和服务器3通信。便携式测定系统10中的处理装置15使用通信装置18向和从基因组数据库5发送和接收存储器17中所保留的数据,所述通信装置18可以是天线、以太网连接、或用于通信的其它合适的装置。所述处理装置15控制使用提取模块40、扩增模块50以及检测模块60对DNA数据进行的收集和处理。所述处理装置15将所收集的数据存储在存储器17中并且将它经由显示装置12向用户呈现;它经由输入装置12从用户接收命令和查询。
[0098] 在本发明的一些型式中,所述设备是移动的或POC并且任选地是手持式的。
[0099] 提取模块-扩增模块-检测模块
[0100] 便携式测定系统10(图1)使用模块的组合以对来自样品22的核酸进行提取、扩增以及检测(图1)。包括对所检测到的信号进行的任何数据处理70在内的整个过程通常耗时不到20分钟,如图3中所示,并且可以耗时不到180分钟、不到120分钟、不到90分钟、不到60分钟、不到30分钟、不到20分钟、不到10分钟、不到5分钟或不到1分钟。
[0101] 这些模块中的每一个可以包括各种实施方式和组合中的一种,如图2中所示。
[0102] 生物样品22(图1)被加载到集成芯片20上(图1和图4)。生物样品的加载可以手动地经由样品入口端口100(图4)或经由便携式系统10内的自动化加载装置来实现。举例来说,入口端口100可以使用手动或自动操作的加载设备,如移液器来加载。或者,在预期用于现场使用的实施方案中,入口端口100可以直接使用拭子或刺破的手指,通过将刺破的手指压到入口端口100上来加载。毛细管作用使得血液从刺破口流到入口端口100中。
[0103] 在集成芯片20的核酸提取模块25(图4)中在核酸提取控制模块40(图2和3)的控制下提取核酸。举例来说,并且参考图2,核酸提取控制模块40可以包括用于实施下列方法的合适的装置或用于从生物样品中提取核酸的任何其它合适的装置中的任一种:化学提取(WO 2005/05073691);超声处理(WO 1999/9933559);机械剪切,包括在集成芯片上设置的微细加工的凸起(美国专利号5,635,358和WO 2006/06029387);破坏细胞膜的热装置(参见例如WO 2005/05011967);电穿孔,包括用于对被加载到集成芯片上的生物样品施加可变电压的装置,所述电压足以破坏生物样品中的细胞(美国专利申请公开号US2004/6783647);二氧化珠粒,所述珠粒任选地连接有,任选地共价连接有核酸探针(WO
2005/05073691和WO 2003/03104774)、或连接有,任选地共价连接有核酸探针的磁性珠粒(美国专利申请公开号US 2002/6344326)。上列的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。优选地,在其中使用磁性珠粒的实施方案中,在核酸提取模块40中包括磁性粒子捕获装置,如磁体。
[0104] 在一个实施方案中,磁性珠粒可以连接有,任选地共价连接有核酸探针。在这个实施方案中,可以使用小电磁体或磁体来控制提取模块中的磁性珠粒。可以使用的磁性珠粒是可从诸如以下的供应商获得的可商购获得的磁性珠粒核酸纯化试剂盒中的任一种:Agencourt生物科技公司(Agencourt Bioscience)、Cosmo Bio有限公司(Cosmo Bio Co.,Ltd.)、Invitek有限公司(Invitek GmbH)、Polysciences公司(Polysciences,Inc.)、罗氏应用科学公司(Roche Applied Science)、B-桥国际公司(B-Bridge International)、Dynal生物科技公司(Dynal Biotech)、Novagen公司(Novagen)或普洛麦格公司(Promega)。磁性珠粒用于DNA或RNA纯化的用途描述于例如Caldarelli-Stefano等,“磁性珠粒用于组织DNA提取和IS6110结核分枝杆菌PCR的用途(Use of magnetic beads for tissue DNA extraction and IS6110Mycobacterium tuberculosis PCR)”,Mol Pathol.1999年6月;52(3):158-160中。
[0105] 如图2A中所示,所述提取控制模块40可以包括控制单元250、电源252、以及电磁体254。在从提取控制模块40发出指令之后,控制单元250将来自电源252的功率施加到电磁体254,从而向提取模块25施加磁场(未示)。这使得提取模块25中的磁性珠粒(未示)沿着提取模块25中的提取室(未示)的内壁簇集。控制单元250通过关闭电源252,从而使得电磁体254停止施加磁场来释放磁性珠粒。
[0106] 可以在集成芯片20的核酸扩增模块27(图4)内在核酸扩增控制模块50(图2和3)的控制下使所提取的核酸扩增。扩增可以使用任何合适的扩增技术来实现,所述技术包括美国专利号4,683,202和4,683,195中所公开的常规PCR技术,这两件专利均以引用的方式整体并入本文。所述核酸还可以使用等温技术来扩增,如美国专利号7,494,791中所教导的技术,所述专利以引用的方式整体并入本文。
[0107] 在一些实施方案中,核酸扩增包括逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。
[0108] 参考图2,所述核酸扩增控制模块50可以包括用于实施核酸扩增(即核酸模板拷贝数增加)的合适装置中的任一种。扩增可以是线性扩增或指数扩增。在一个实施方案中,模块50包括用于基于孔的核酸扩增的装置。如图2B中所示,这样的装置可以包括用于加热/冷却集成芯片20的核酸扩增模块27的装置201。用于加热/冷却集成芯片的核酸扩增模块的加热装置201的实例包括珀尔帖设备(WO 1998/9850147,以引用的方式整体并入本文)和基于薄膜的设备。在其它实施方案中,用于加热集成芯片的核酸扩增模块(参见图4,元件25)的装置可以包括红外线加热装置(WO1996/9641864,以引用的方式整体并入本文)或微波辐射加热装置。
[0109] 如图2B中所示,加热装置201可以包括加热/冷却元件203、温度传感器205、处理单元207、功率控制单元209、以及电源211。在从扩增控制模块50发出指令之后,处理单元207通过指示功率控制单元209将功率从电源211供应给加热/冷却元件203来启动加热/冷却。处理单元207借助于温度传感器205监测加热/控制元件203的温度并且根据需要调整它向功率控制单元209的指令以维持扩增模块27所需的温度。
[0110] 在另一个实施方案中,模块50(参见图2和3)包括用于基于流体的核酸扩增的装置(参见例如U.S.7,041,481,以引用的方式整体并入本文)。这样的装置可以包括用于产生穿过集成芯片的核酸扩增模块的缓冲液流动的产生流体流动的装置,所述产生流体流动的装置与用于控制集成芯片的核酸扩增模块的温度的温度控制装置可操作地连接。
[0111] 在其它实施方案中,模块50(参见图2和3)包括用于实时聚合酶链反应(PCR)控制装置以实现核酸扩增的装置(参见例如U.S.7,315,376,以引用的方式整体并入本文)。
[0112] 在其它实施方案中,模块50(参见图2和3)包括用于向集成芯片的核酸扩增模块(参见图4,元件25)内的核酸链施加受控的张力的装置。这样的装置的详细说明提供于美国专利号7,494,791中,该专利以引用的方式整体并入本文。
[0113] 如本文所用的术语“张力”在被用于核酸扩增、处理和/或检测的背景下时,指的是双链核酸的热循环或热变性的替代方案或核酸扩增或变性或退火或引物延伸的非热驱动过程。向核酸施加“张力”是向核酸链施加物理力,而不是仅仅由热能产生的结果。张力可以是“精确受控的”(如本文别处所定义)和/或可调控制的和/或可变的。
[0114] 精确受控的张力可以是机械张力、流体动力学张力、电磁张力或其组合。此外,在一些实施方案中,用于向核酸链施加受控的张力的装置被配置成等温操作。如本文在核酸扩增、处理以及检测的背景下所用的术语“等温”指的是其中不需要热循环的核酸扩增方法,并且优选地,可以在基本上相同的温度下进行所有步骤的扩增方法。
[0115] 利用用于向集成芯片的核酸扩增模块(参见图4,元件25)内的核酸链施加受控的张力的装置的实施方案相对于用于核酸扩增的常规方法(热循环方法)的装置具有重要的优势。这些优势包括一般来说优越的准确性,以及特别是当扩增“困难”序列(例如富含GC的序列)时,所扩增的序列的长度、反应收率、以及反应速度(扩增反应的总时间)。其它重要的优势包括更高的扩增效率以及例如通过使用张力而诱导校对核酸外切酶活性来提高扩增的保真性的能力(参见美国专利号7,494,791、美国专利号8,632,973以及美国专利申请序列号14/106,399的教导,所有这些参考文献的全部教导均以引用的方式并入本文)。
[0116] 利用用于向核酸链施加受控的张力的装置的实施方案包括用于向集成芯片的核酸扩增模块(参见图4,元件25)内所保留的核酸分子施加可变的和受控量的张力的机构。这样的机构可以包括第一表面和第二表面,在所述第二表面上具有用于锚定核酸分子的装置,其中所述第一表面和所述第二表面被配置用于相对于彼此移动。或者,这样的机构可以包括至少一个表面,在所述表面上具有用于锚定核酸分子的装置,所述设备还包括用于在所述核酸分子上提供受控的和可变的流体流动的机构。在又另一个实施方案中,这样的机构可以包括至少一个表面,在所述表面上具有用于锚定核酸分子的装置,所述表面还包括用于在用于锚定所述核酸分子的装置之间分布的流体流动的通路。在其它实施方案中,这样的机构可以包括用于在所述核酸分子上提供受控的和可变的流体流动的机构,所述机构被配置成形成层流流动中的速度梯度。或者,这样的机构可以包括流体流动通道,所述流体流动通道被配置成提供层流流动中的速度梯度、流体流动内的滞流点、反向传播的流体流动或这些的组合。在其它实施方案中,这样的机构可以包括光学、电学或磁性操纵器(例如光镊、可单独控制的磁性珠粒等)的阵列,所述操纵器被配置成操纵与核酸分子结合的粒子。用于将核酸保留在集成芯片的核酸扩增模块(参见图4,元件25)内的装置可以包括可激活的引物,所述引物包含用于固定在核酸扩增期间所获得的延伸产物的配合基团。或者,核酸聚合酶可以被固定或以其它方式被保留在集成芯片20的表面上。
[0117] 在集成芯片20的核酸检测模块29(图4)中在核酸检测控制模块60(图2和3)的控制下检测扩增的核酸。
[0118] 在各个实施方案中,模块60可以包括用于检测核酸的荧光或电光检测装置950,如图9A中所示。所述荧光检测装置950可以包括发射器952,如发光二极管和/或激光二极管数据采集设备954,如光检测器、光电倍增管(PMT)或电荷耦合设备(CCD)、光电二极管、以及用于存储和处理所采集的数据的处理单元956。在一个实施方案中,发射器952用发射的辐射960激发样品以产生由数据采集设备954所感测的荧光信号962。在图9A中所示的实施方案中,发射的辐射960以透射几何形状照射检测模块29,尽管应当了解的是,也可以使用反射和其它几何形状。数据采集设备954将荧光信号962转换成调制数据信号958,处理单元956检测和记录所述调制数据信号958。
[0119] 可以使用如美国专利号6,261,431中所公开的毛细管电泳来分离和检测扩增的核酸,该美国专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中,模块60可以包括用于实现核酸分离的毛细管电泳(CE)控制装置,所述CE控制装置与荧光检测装置可操作地连接。所述CE控制装置还可以包括用于对集成芯片20的核酸检测模块60施加电压的高电压控制单元,所述电压足以实现核酸的分离。
[0120] 参考图4,在一个实施方案中,在检测通道112中进行CE,所述检测通道112可以被填充以适当的缓冲液,并且任选地被预先填充以诸如琼脂糖、羟丙基纤维素或聚丙烯酰胺等筛分基质。在某些实施方案中,最终用户可以在使用点将检测通道112(图4)填充以筛分基质。
[0121] 在替代性实施方案中,所述核酸检测控制模块60还包括杂交微阵列,如可从加利福尼亚州圣克拉拉的Affimetrix公司(Affimetrix,Santa Clara,CA)获得的微阵列。
[0122] 在一个实施方案中,所述核酸检测控制模块60包括用于检测核酸的电化学装置。用于检测核酸的电化学装置的实例提供于美国专利申请公开US 2008/0081329中,该专利申请以引用的方式整体并入本文。简单地说,这样的装置实施用于确定在测试样品中存在或不存在目标基质的方法。所述装置包括具有导电表面的电极、以及与所述导电表面结合并且能够与目标基质结合的探针。与导电表面结合的探针与测试样品接触以形成与表面结合的目标复合体。所述与表面结合的目标复合体还包含第一氧化还原复合体。与表面结合的探针或与表面结合的目标复合体(如果存在的话)与流体介质接触,所述流体介质包含第二氧化还原复合体,其中所述第一氧化还原复合体或所述第二氧化还原复合体中的一种是能够进行氧化还原反应的氧化还原过渡金属复合体并且所述第一氧化还原复合体或所述第二氧化还原复合体中的另一种是能够催化氧化还原过渡金属复合体的氧化还原反应的氧化还原催化剂复合体。所述氧化还原过渡金属复合体在不存在所述氧化还原催化剂复合体的情况下不会进行任何显著量的氧化还原反应。检测由所述氧化还原催化剂复合体所催化的氧化还原过渡金属复合体的氧化还原反应。
[0123] 在另一个实施方案中,核酸检测控制模块60包括用于检测核酸的阻抗测量装置。用于检测核酸的阻抗测量装置的实例描述于例如美国专利7,169,556中,该专利以引用的方式整体并入本文。简单地说,所述方法包括使具有第一部分和第二部分的核酸与连接有寡核苷酸的基质接触,所述寡核苷酸位于一对电极之间,所述寡核苷酸具有与所述核酸的序列的第一部分互补的序列,所述接触在有效允许所述基质上的寡核苷酸与所述核酸杂交的条件下进行。在核酸和寡核苷酸已经进行杂交之后,使与所述基质结合的核酸与第一种类型的导电粒子(例如金属珠粒)接触,所述导电粒子由可以导电的材料制成,所述导电粒子连接有一种或多种类型的寡核苷酸,这些类型的寡核苷酸中的至少一种具有与所述核酸的序列的第二部分互补的序列,所述接触在有效允许所述导电粒子上的寡核苷酸与所述核酸杂交以形成复合有导电粒子的测试基质的条件下进行。在已经进行第二杂交之后,使测试基质与盐水溶液接触,所述盐水溶液具有有效地将非特异性结合的导电粒子充分去杂交和去除的盐浓度。杂交/去杂交引起了电极之间的阻抗出现由特异性结合的导电粒子的存在所引起的可检测的变化。
[0124] 根据本发明的一个实施方案,用于提取、扩增以及检测的许多不同的可能的技术中的任一种可以组合使用;或实际上,提取、扩增以及检测中的一种或多种可以完全从提取、扩增以及检测的组合中被省去。举例来说,在图2的模块化系统中,可以使用提取模块40下所示的可能类型的模块中的任一种或另一种类型的提取模块进行提取;并且这样的一个或多个提取模块40可以与扩增模块50下所示的可能类型的模块中的任一种或另一种类型的扩增模块组合使用;并且此外,这样的一个或多个提取模块40和一个或多个扩增模块50可以与检测模块60下所示的可能类型的模块中的任一种或另一种类型的检测模块组合使用。根据有待检测的目标,可以使用这些模块的不同组合。首先,可以使用诸如血液、唾液等生物样品作为有待分析的生物样品;或可以使用固体样品(例如粪便样品)或气溶胶样品。在提取模块40中,将目标核酸或蛋白质与生物样品的其余部分分离。然后可以在扩增模块50中进行扩增。在另一种情况下,如果目标是蛋白质,则可以将它直接通到检测模块60,如毛细管电泳模块或图2中所示的任何其它检测模块、或另一种类型的检测模块中,所述另一种类型的检测模块包括例如熔融曲线分析模块、化学发光模块、量子点模块、使用诸如金纳米粒子的纳米粒子的模块、或基于使用辐射的检测模块。在另一种情况下,如果有待分析的初始生物样品是核酸,则可能不需要使用提取模块40,并且可以将样品直接送到检测模块60中。对于扩增模块50,除了图2中所示的类型的模块之外,有待使用的其它可能的模块是环介导等温扩增(LAMP)模块、解旋酶依赖性扩增(HDA)模块、SDA(链置换扩增)模块或桥式扩增模块。可以使用LAMP技术,如T.Notomi等,Nucleic Acids Research,28,e63(2000)中所阐述的那些;可以使用HDA技术,如Vincent M,Xu Y,Kong H.(2004),“解旋酶依赖性等温DNA扩增(Helicase-dependent isothermal DNA amplification)”,EMBO Rep 5(8):795-800中所阐述的那些;可以使用SDA技术,如G.T.Walker等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89,392-396(1992)中所阐述的那些;所有这些参考文献的全部内容在此以引用的方式并入本文。所述系统中的模块可以是可在热扩增模块与等温扩增模块之间交换的;并且可以使用本文所教导的任何扩增技术,如解旋酶依赖性扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、以及美国专利号7,494,791、美国专利号8,632,973以及美国专利申请序列号14/106,399(全部均属于Nanobiosym公司)中所教导的任何技术,这些参考文献的全部教导在此以引用的方式并入本文。在一个具体的实施方案中,所述便携式测定系统10包括提取控制模块40,所述提取控制模块40被配置成使用磁性珠粒来提取核酸;扩增控制模块50,所述扩增控制模块50使用利用珀尔帖设备的热循环方法;以及检测控制模块60,所述检测控制模块60使用毛细管电泳和荧光信号检测来分离和检测核酸。
[0125] 根据本发明的一个实施方案,不同的集成芯片能够由单一移动设备分析,其中所述不同的可能的集成芯片中的每一个实现由所述单一移动设备所识别和执行的不同的功能。举例来说,一个芯片可以用于分析核酸,并且另一个芯片可以在同一移动设备中用于分析蛋白质。
[0126] 材料和数据通过本发明的系统,如图2中所描绘的模块化系统的典型流程的示意图示于图3中。提取模块40、扩增模块50、以及检测模块60通常各自运行约4分钟,相比之下,在使用常规技术的情况下,耗时数小时至数周。在根据本发明的实施方案中,可以在从开始分析样品起少于2小时、少于1小时、少于30分钟、少于1分钟或少于1秒内进行检测。在一个实施方案中,容纳提取模块40、扩增模块50以及检测模块60的集成芯片20通常重约35g,而用于处理所检测到的信号的专用集成电路(ASIC)重约25g,从而使得总盒重量达到约60g。所述模块位于集成芯片上并且由便携式测定系统10中的相应的控制模块(未示)控制。
[0127] 同样,在一些实施方案中,可以使用珀尔帖设备或薄膜加热器或其它温度控制装置来加热和冷却核酸扩增室108(图4),而热电偶监测所述腔室108的温度。毛细管电泳过程可以由控制对用于毛细管电泳的通道所施加的电场的强度和持久性的检测控制模块来控制。
[0128] 在一些实施方案中,系统10(图1)可以包括用于使生物样品和/或核酸移动穿过集成芯片的流体压力产生装置。流体压力可以由蠕动活塞泵、气动泵或任何其它合适的装置来产生。或者,可以借助于与适当的入口端口联接的手动泵送的注射器来向芯片中的微流体通道施加压力,所述入口端口例如样品入口端口100、试剂添加口108、样品孔120、缓冲液孔116、或缓冲液废物孔114(图4)。
[0129] 用于控制阀门(如图7和8A以及8B中所更详细示出以及下文所论述的阀门)的装置可以被并入系统10(图1)中。这些阀门控制不同的模块之间以及沿着各种输送通道的流体流动。可以使用许多阀门技术,包括被动式旋塞阀、机械致动阀、电磁致动阀、磁流体阀、气动阀、或任何其它合适的阀门。
[0130] 在一些实施方案中,系统10(图1)包括用于存储、分类、定量以及传输通过分析生物样品所采集的数据的数据处理装置。所述数据处理装置可以包括用于无线数据传输的装置。
[0131] 在某些实施方案中,可以分析信号强度与时间的关系以给出有关生物样品22(图1)中所存在的核酸物质的类型和量的指示。举例来说,相对于由参考样品产生的信号标绘所检测到的信号允许用户确定参考样品中所存在的病原体是否存在于所测试的样品中,这是因为相同的病原体将在同一时刻产生信号峰(假定相同的分析条件)。所述数据处理装置还包括用于计算病毒载量的病毒载量计算装置(例如,通过对表明随时间而变的荧光信号的曲线下的面积进行积分)。
[0132] 在其它实施方案中,所述系统10还包括用于输出数据的数据显示装置。
[0133] 所述便携式测定系统10经由电接口、热接口以及机械接口与集成芯片20交接。夹具和/或扣件以足够的稳定性将芯片固定到位以确保振动不会使得电极、检测器(如光检测器)或加热器变得不对准。被定位在扩增控制模块40下方、上方或上面的加热器(以及任选的冷却元件,如喷墨冷却器)(未示)加热和/或冷却芯片的某些区段,如下文所述。类似地,被定位在检测控制模块60附近的电极可以用于控制穿过芯片的流体的分离和流动,如下文所述。由于芯片20是透明的,因此可以使用电磁束,如用于加热的红外线束或电磁束或用于探查荧光标签的光束来探测芯片20中的孔、腔室以及通道。
[0134] 集成芯片
[0135] 虽然以下说明涉及集成芯片20(图1和图4)的具体实施方案,但应当了解的是,其它芯片设计可以与本发明的便携式组件系统10(图1)一起使用。
[0136] 在一个实施方案中,本发明是一种紧凑的集成芯片,所述集成芯片用于与用于快速分析生物样品的系统一起使用。
[0137] 所述集成芯片20可以由以下各项形成:玻璃;具有良好的光学特性的任何塑料,包括但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚(氨基甲酸酯-酰亚胺)、聚(四氟乙烯)、聚酸酯、环状烯共聚物(COC)、聚酰胺、环状烯烃聚合物(COP)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、PMMA、或任何其它合适的材料或材料组合。
[0138] 所述集成芯片包括用于注射生物样品和试剂的至少一个样品入口端口;核酸提取模块,所述核酸提取模块包括用于从生物样品中提取核酸的至少一个提取室,所述提取室通过至少一个样品输送通道与样品入口端口连接;核酸扩增模块,所述核酸扩增模块包括用于扩增核酸的至少一个扩增室,所述核酸扩增室通过至少一个核酸输送通道与提取室连接;以及核酸检测模块,所述核酸检测模块包括用于分离和检测核酸的至少一个检测通道,所述检测通道通过至少一个扩增产物输送通道与核酸扩增室连接。优选地,所述至少一个样品入口端口、所述至少一个提取室、所述至少一个扩增室、以及所述至少一个检测通道被布置成使空间的利用减到最低程度。如上文结合图2所述,可以使用可交换的模块。
[0139] 优选地,所述核酸扩增模块还包括与至少一个核酸输送通道处于流体连通的至少一个试剂添加口。在某些实施方案中,所述核酸检测模块还包括与至少一个扩增产物输送通道处于流体连通的至少一个样品孔。在一些实施方案中,所述核酸检测模块还包括与至少一个检测通道处于流体连通的至少一个样品废物孔;与至少一个检测通道处于流体连通的缓冲液废物孔;以及与至少一个检测通道处于流体连通的缓冲液孔。优选地,本发明的集成芯片包括至少两个样品入口端口;至少两个核酸提取室,每一个所述核酸提取室通过对应的样品输送通道与所述至少两个样品入口端口中的一个连接;至少两个核酸扩增室,每一个所述核酸扩增室通过对应的核酸输送通道与所述至少两个提取室中的一个连接;以及至少两个检测通道,每一个所述检测通道通过对应的扩增产物输送通道与对应的核酸扩增室连接。
[0140] 在实施方案中,至少两个检测通道相交。在图4中所示的一个实施方案中,检测通道112以直相交。应当了解的是,可以选择任何相交角,这取决于集成芯片20的一般形状、检测通道的数目、以及集成芯片的所需布局。优选的是,所述布局是紧凑的。参考图4,检测通道112的相交提供了紧凑设计的优势,这是因为样品废物孔118和缓冲液孔116可以由数个(或所有)检测通道112共用。此外,在其中用户将检测通道112加载以分子筛的实施方案中,使检测通道112在缓冲液孔116处相交提供了同时加载所有检测通道的优势。
[0141] 所述集成芯片还可以包括至少两个试剂添加口,每一个所述试剂添加口与对应的核酸输送通道处于流体连通;至少两个样品孔,每一个所述样品孔与对应的扩增产物输送通道处于流体连通。优选地,至少两个样品孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
[0142] 在某些实施方案中,所述集成芯片还包括至少一个样品废物孔,所述至少一个样品废物孔中的每一个通过至少两个样品废物通道与至少两个检测通道连接。优选地,至少一个样品废物孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
[0143] 在其它实施方案中,所述集成芯片还包括至少一个缓冲液废物孔,每一个所述缓冲液废物孔与至少两个检测通道处于流体连通;以及缓冲液孔,所述缓冲液孔与至少两个检测通道处于流体连通。优选地,至少一个缓冲液废物孔和缓冲液孔被配置成用于添加和/或处理另外的试剂。
[0144] 在一个实施方案中,缓冲液孔被设置在至少两个检测通道的相交点处,并且其中所述缓冲液孔与所述相交的检测通道处于流体连通。
[0145] 优选地,其中每一个样品废物通道与至少一个扩增产物输送通道下游的检测通道连接,从而有效地增加至少一个扩增产物输送通道和至少一个扩增产物输送通道相交的横截面(参见图8A-8C和以下说明)。如本文所用的术语“下游”被定义为核酸在分离期间行进穿过检测通道的方向。
[0146] 在一些实施方案中,所述集成芯片还包括被设置在至少一个核酸提取室和/或至少一个样品输送通道中的微细加工的凸起(柱子)。如先前所述,被设置在集成芯片上的微细加工的凸起可以用于对生物样品中的细胞进行机械剪切,如例如美国专利号5,635,358和WO 2006/06029387中所述,这些参考文献以引用的方式整体并入本文。
[0147] 所述集成芯片还可以具有用于对至少一个检测通道施加电压的至少两个电极。在其它实施方案中,所述集成芯片可以包括另外的电触点,所述电触点用于对可以被设置在集成芯片内的电致动机构提供功率和/或控制信号
[0148] 在一个方面,本发明是一种新型阀门组件,如图5以及图6A和6B中所示以及如下文所更详细描述。因此,在一个实施方案中,本发明是微流体设备中的阀门组件。
[0149] 在一个实施方案中,所述阀门组件包括用于输送流体的微流体通道,所述微流体通道在顶部表面与底部表面之间形成并且具有纵轴;顶部表面中用于接收被动式旋塞的阀门口;以及被配置用于插入到所述阀门口中的被动式旋塞。优选地,底部表面中与阀门口相对的部分沿纵轴具有均一的深度。这种布置通过消除或降低用于对准零件的严格性来简化集成芯片的制造工艺。
[0150] 在另一个实施方案中,所述阀门组件包括用于输送流体的输送通道;与所述输送通道相交的铁磁流体通道;第一铁磁流体贮存器和第二铁磁流体贮存器,所述第一铁磁流体贮存器和所述第二铁磁流体贮存器由铁磁流体通道连接;一个或两个铁磁流体贮存器中的铁磁流体;以及用于将铁磁流体通道填充以铁磁流体的永磁体或电磁体。铁磁流体通常是包含悬浮在液体中的磁性粒子并且还具有与所述液体混合以防止粒子聚集在一起的洗涤剂/表面活性剂的胶态混合物。(还参见Berger等,(1999年7月).“水性铁磁流体的制备和特性(Preparation and properties of an aqueous ferrofluid)”.Journal of Chemical Education 76(7):第943-948页,以引用的方式整体并入本文。)可以使用任何可商购获得的铁磁流体,例如像可从新罕布什尔州贝德福德的磁性流体技术株式会社(Ferrotec Corporation,Bedford,NH)获得的铁磁流体。
[0151] 在又另一个实施方案中,并且现在参考图7A和7B,本发明是微流体设备中的阀门组件,所述阀门组件包括:贮存器;用于输送流体的流入输送通道,所述流入输送通道具有与所述贮存器连接的输出端;用于输送流体的第一流出通道和第二流出通道,每一个均具有与所述贮存器连接的输入端;被设置在所述贮存器中的铁磁流体;以及用于控制贮存器中的铁磁流体的位置的磁体。在操作图7A和7B的阀门组件期间,所述贮存器内的铁磁流体被定位以关闭流入通道的输出端;或第一流出通道的输入端,而不关闭第二流出通道的输入端;或第二通道的输入端,而不关闭第一流出通道的输入端;或既不关闭流入通道的输出端,也不关闭第一流出通道和第二流出通道的输入端。
[0152] 在图4中所示的实施方案中,集成芯片20包括八个样品区130,这些样品区中的每一个均包括核酸提取模块25、核酸扩增模块27、以及核酸检测模块29。所述芯片可以由玻璃、丙烯酸类树脂或任何其它合适的材料制成。通常,所述芯片大致是厚信用卡的尺寸。在一个实施方案中,所述芯片具有1"至4"的长度、1"至4"的宽度;优选地,集成芯片20是约2"宽×4"长。
[0153] 每一个样品区130包括一个样品入口端口100、一个提取室104、一个扩增室108以及一个检测通道112。应当了解的是,对于每一种生物样品,存在从对应的样品入口端口到对应的提取室,进一步到对应的扩增室,然后到对应的检测通道的独立的并且可辨别的通路。因此,避免了样品的交叉污染并且确保样品完整。然而,存在由数个样品区共用的共同孔(例如样品废物孔118和缓冲液孔112)。这种共用减少了集成芯片布局所需的空间并且还减少了材料的浪费。
[0154] 应当了解的是,所述芯片可以被配置成具有任何数目的样品区(例如1个、12个、24个、256个、386个或512个),前提条件是样品区130的尺寸对于提取、扩增以及检测核酸是足够的。样品区130可以用于针对相同的目标生物标志物序列或病原体对多种不同的样品进行分析、针对多种不同的病原体或生物标志物对一种样品进行分析、或分析样品和病原体或生物标志物的任何合适的排列或组合,前提条件是可获得合适的参考。
[0155] 生物样品22(参见图1)、用于提取、扩增以及检测的试剂在不同的孔和反应室之间经由微流体输送通道102行进,如图4中所示。在一个具体的实施方案中,输送通道102具有10-1000μm×10-1000μm,并且优选地200μm×100μm的横截面,并且具有足够的尺寸以适应提取方法的一个实施方案中所使用的磁性珠粒的流动。在一个实施方案中,端口和孔,如样品入口端口100、试剂入口/出口端口108、缓冲液废物孔114、缓冲液孔116、样品废物孔118、以及样品孔120具有0.5mm-10.0mm的直径,并且优选地0.9mm-5.0mm的直径,其中深度由集成芯片20的厚度决定。核酸扩增室108一般具有0.1mm-30.0mm的直径,并且优选地10.0mm的直径,以及10μm至19.0mm的深度,并且优选地0.5mm的深度。核酸提取室104可以具有1mm-25mm的长度和1mm-30mm的宽度,更优选地15mm的长度和10mm的宽度。使用毛细管电泳的集成芯片20的核酸检测模块29通常具有检测通道112,所述检测通道112具有10-200μm×10-200μm,更优选地50μm×10μm的横截面。
[0156] 穿过通道、端口、孔以及腔室的流体流动由阀门和推进装置的组合控制,所述推进装置可以是与样品入口端口100联接的手动泵送的注射器。还可以使用其它推进装置,如蠕动泵活塞泵。除非关闭的阀门阻挡流体流动,否则推进装置推进流体穿过通道和腔室。阀门可以使用许多技术中的任一种,包括诸如手动致动旋塞、机械致动旋塞、电磁致动旋塞、铁磁流体阀门、气动阀、或任何其它合适的技术之类的技术。
[0157] 举例来说,图5示出了阀门组件152,所述阀门组件152包括被动式旋塞阀150、阀口151、以及由顶部表面160和底部表面161形成的输送通道102。可以将被动式旋塞阀150插入阀口151中以控制流体经由输送通道102向核酸扩增室108中的流动。阀门150可以被手动插入或它可以被机械致动。在一个实施方案中,入口样品孔100、试剂入口/出口端口106、样品废物孔118、样品孔120、缓冲液废物孔114、以及缓冲液孔116可以用作用于接收被动式旋塞阀150的阀口151。
[0158] 图6A和6B示出了使用铁磁流体阀门600控制流体流动的替代方法。铁磁流体通常是包含悬浮在液体中的磁性粒子并且还具有与所述液体混合以防止粒子聚集在一起的洗涤剂/表面活性剂的胶态混合物。(还参见Berger等,(1999年7月).“水性铁磁流体的制备和特性(Preparation and properties of an aqueous ferrofluid)”,Journal of Chemical Education 76(7):第943-948页,以引用的方式整体并入本文。)可以使用任何可商购获得的铁磁流体,例如像可从新罕布什尔州贝德福德的磁性流体技术株式会社获得的铁磁流体。在线铁磁流体阀门600包括被设置横跨输送通道102的铁磁流体通道601。铁磁流体通道601的一端终止于填充有铁磁流体602的铁磁流体贮存器604中,并且另一端终止于倾卸式贮存器606中。在“打开”状态下,铁磁流体602保持在铁磁流体贮存器
604中,从而允许流体沿流体流动方向608流过输送通道102,如图6A中所示。将磁体610放置在倾卸式贮存器606附近将铁磁流体602吸引穿过铁磁流体通道601,从而阻挡输送通道102,如图6B中所示。
[0159] 图7A和7B示出了如何可以使用铁磁流体阀门600来控制流体流入和流出多端口腔室和孔的流动。在图7A和7B中所示的一个实施方案中,流体经由入口704进入孔702中。少量铁磁流体602停留在孔702内部。在其中出口706a和706b这两者都是打开的位置上,铁磁流体602停留在孔702内部稳定的位置处,如图7A中所示。图7A和7B中所示的孔702具有一个入口端口702和两个出口端口706a、706b;在其它实施方案中,孔702可以具有多个入口和输出端口704、706。
[0160] 流体经由入口704进入孔702中。流体可以经由出口端口706a或出口端口706b离开孔702,这取决于铁磁流体602的位置。如图7B中所示,可以使用磁体610使铁磁流体602定位以阻挡出口706a,留下另一个出口706b打开以使流体流出。类似地,出口706b可以被阻挡,而出口706a打开。还应当了解的是,入口704也可以被阻挡。还应当了解的是,流体流动的方向可以被逆转。在一个实施方案中,不同的流体可以经由出口706a和706b进入孔702中,而入口704可以用作流体流出端口。
[0161] 再参考图4中所示的实施方案,在本发明的一个实施方案中,用户将包被有链霉亲和素的磁性珠粒(例如Applied Biosystems 链霉亲和素珠粒,6微米-8微米)加载到样品区130中。所述磁性珠粒可以在来自注射器泵或任何其它合适的流体压力产生装置的压力下沿着微流体输送通道102向核酸提取室104移动。或者,所述磁性珠粒可以已经被加载在提取室104中。随后,用户经由样品入口端口100将生物样品22加载到样品区130中。在生物样品22被加载之后,它经由同一个输送通道102从样品入口端口100向提取室104行进。所述磁性珠粒(未示)本身经由链霉亲和素包衣与生物样品22中的核酸连接。在连接过程完成之后,向提取室施加磁场使得磁性珠粒(和所连接的核酸)沿磁场方向移动,从而从所述生物样品22中提取核酸。
[0162] 用户通过使用经由样品入口端口注射的洗涤液(未示)冲洗提取室104来完成提取处理。洗涤液流过提取室104到达试剂入口/出口端口106,从所述端口106,用户提取洗涤产物。用户可以重复洗涤循环直到所提取的核酸是无污染到足以被扩增和检测为止。
[0163] 在所提取的核酸不含污染物之后,迫使它(例如通过施加来自注射器或泵的压力)向下游进入核酸扩增室108中,用户然后将所述核酸扩增室108经由试剂入口/出口端口106加载以试剂。用户然后在开始通过常规的扩增技术进行扩增之前通过关闭适当的阀门来隔离扩增室。可以使用热电加热器(未示)来加热和冷却扩增室108中的试剂。在一个实施方案中,试剂包括引物、DNA聚合酶(如Taq聚合酶)、三磷酸脱氧核苷酸、缓冲溶液、以及二价阳离子。
[0164] 在核酸被充分扩增之后,打开隔离扩增室108的阀门并且将扩增的核酸冲洗到样品孔120中,所述样品孔120经由输送通道102与检测通道112连接,如图8A中所示。
[0165] 在一个实施方案中,使用毛细管电泳来检测和鉴定生物样品22中存在的核酸。毛细管电泳包括在短(约50μm长)通道(如检测通道112)中使电流流过与所测试的样品混合的电解质,如缓冲水溶液。电流使样品沿检测通道112向下迁移;然而,化合物随着它们迁移而分离,这是因为它们的迁移速度取决于它们的分子量、电流和通道尺寸以及其它变量。
[0166] 在一个实施方案中,用户经由缓冲液孔116(还示于图4中)将电解质溶液和任选的筛分基质添加到检测通道112中。在其中缓冲液孔116与多个检测通道116连接的实施方案(如图4中所示)中,实现对所有检测通道的同时加载。在缓冲液孔116已满之后,向位于样品孔120和样品废物孔118上或附近的电极施加的电场130引起扩增的核酸23从样品孔120经由检测通道112迁移到样品废物118,如图8B中所示。通常,电场130为约400V。所提取的核酸积聚在位于检测通道112中连接样品孔120和样品废物孔118的输送通道102与检测通道112的交点之间的积聚区113中。来自样品孔120的废物继续到达样品废物孔118中。
[0167] 图8C示出了施加从缓冲液孔116穿过检测通道112到缓冲液废物孔114的电场131如何使得扩增的核酸23样品根据分子量分离成物质140。通常,强电场131为约6kV。
由于来自不同的目标生物标志物序列或不同的病原体的扩增子具有不同的分子量,因此不同的生物标志物或病原体以不同的速度沿检测通道112向下行进。未知的物质可以通过将它的速度与已知的参考(未示)在相同的强电场131下在同一检测通道114或相同的检测
112中的速度相比较来鉴定。
[0168] 图9B图示了示例性毛细管电泳检测控制模块60的操作。如上文所述,电场131牵引物质140沿检测通道112向下朝向缓冲液废物孔114。随着物质140沿检测通道112向下行进,它们逐个穿过测量区1005,其中它们由激光束1004或LED或其它光源探查以产生信号,所述信号可以被解读以给出有关目标生物标志物序列或病原体类型的指示以及定量相应的加载物。
[0169] 在一个实施方案中,荧光信号1010是通过用适当频率的激光束1004或LED或其它光源照射分离的加载物140来产生的。激光1002产生激光束1004,所述激光束1004可以使用镜面1006而指向测量区。或者,激光束1004可以使用透镜而聚焦到样品上。所述光束还可以由发光二极管或其它光源而不是激光产生,并且它可以或可以不经由光纤电缆来耦合。应当了解的是,可以使用多种光学布置来探查物质140。
[0170] 激光束1004激发分离的加载物140以产生荧光束1010,使用二向色分光镜1007使所述荧光束1010与激光束1004分离。在一个实施方案中,检测器1012响应于荧光束1010的强度产生光电流(未示)。可以将所述光电流送到处理器1014,所述处理器1014可以用于分析所检测的荧光束1010。举例来说,所述分析可能包括在输出信号图表1020上将所检测到的信号与来自已知的参考样品的参考信号迹线1021相比较,其中所述迹线中匹配的峰表明相同的生物标志物序列或病原体的存在。对峰下面积进行积分给出了有关每一种样品中存在的生物标志物或病原体的相对量(即病毒载量)的指示。在实施方案中,软件使用标准相关技术使输出信号图表1020与参考信号迹线1021相关联以产生适用于由用户解读的输出。
[0171] 用于核酸或蛋白质检测的芯片实验室
[0172] 本发明的实施方案包括一种集成芯片,所述集成芯片能够在单一设备中进行上述生物测定,这种集成芯片还被称为集成微流体芯片或芯片实验室。所述集成芯片被设计成依次进行以下三种处理:(1)从生物细胞中进行提取;(2)通过PCR进行序列特异性核酸扩增;以及(3)通过毛细管电泳对扩增的DNA进行尺寸分离联同对分离的DNA进行荧光检测。
[0173] 将了解的是,与本部分中所论述的相似的集成微流体芯片或芯片实验室在对所述技术作出适当改动以供蛋白质检测使用的情况下可以用于蛋白质检测。举例来说,在检测蛋白质中,一个实施方案可以仅使用提取模块和检测模块而不使用扩增。此外,在一些实施方案中,可以仅使用检测模块。在其它实施方案中,可以仅使用提取和核酸测序和检测模块而不使用扩增模块。这些模块中的任一个可以被单独使用或彼此组合使用。
[0174] 在一个实施方案中,本文所阐述的本发明是一种用于快速提取、扩增以及分离生物样品中的核酸的集成芯片。本发明还包括接收至少一个集成芯片的硬件系统。所述集成芯片是微流体设备,所述设备包括相继与以下功能模块处于流体连通的微流体通道:核酸提取模块、核酸扩增模块以及核酸分离模块。
[0175] 在一个实施方案中,将所关注的生物样品加载到所述集成芯片上并且在所述提取模块内从所述生物样品中提取核酸。举例来说,所述生物样品包括细胞,并且从细胞中提取细胞DNA。所述提取处理优选地利用使用磁性珠粒进行的核酸沉淀。然后通过流体压力将所提取的核酸输送到核酸扩增模块中,其中使用聚合酶链反应扩增所述核酸。在一些实施方案中,所述扩增利用热循环。在其它实施方案中,所述扩增利用等温扩增技术,包括但不限于美国专利号7,494,791、美国专利号8,632,973以及美国专利申请序列号14/106,399(全部都属于Nanobiosym公司)的教导,这些参考文献的全部教导在此以引用的方式并入本文。然后通过流体压力将扩增的核酸产物输送到核酸分离模块中,其中通过利用毛细管电泳来分离和检测所述核酸。优选地,使用荧光核酸引物并且使用荧光检测来检测核酸产物。上文所述的三种相继的处理在同一个集成芯片内进行。
[0176] 提取、扩增、分离/检测的相继处理是由硬件系统控制的,所述硬件系统包括核酸控制模块、核酸扩增控制模块、以及核酸检测控制模块。优选地,这些模块分别控制:(1)应用磁体来使与磁性珠粒连接的核酸沉淀;(2)在所提取的核酸扩增期间的热循环;以及(3)对核酸进行荧光辅助的检测。
[0177] 参考图10,在各个实施方案中,本发明使得健康护理和其它行业能够进步。下文所详细描述的本发明的集成芯片和硬件系统可以用于在生物防御、环境测试、对食物传播的病原体进行的测试、医疗服务、器官移植、生命科学研究、工业应用、农业、法医测试、兽医学、以及公共卫生应用(包括公共突发事件)中的生物医学测试中对生物样品进行分析。
[0178] 紧凑的集成芯片设计
[0179] 回到图4,该图是根据本发明的实施方案的集成微流体芯片20的图示,所述集成微流体芯片20具有八个样品区130,每一个所述样品区均具有提取模块25、扩增模块27、以及分离模块29。在集成芯片20中,上述处理是在封闭室、开放孔、以及互连通道(它们的组合构成了微流体芯片)中实现的。在这种集成芯片20中,适应对多种样品进行分析的多重化设计是通过以下构造来实现的,在所述构造中,每一种样品在单独的样品区130中具有从输入到最终检测的独立流体途径而没有任何交叉污染的可能。每一个样品区130包括一个样品入口端口100、一个提取室104、一个扩增室108、以及一个检测通道112。存在由数个样品区130共用的共同孔(例如样品废物孔118和缓冲液孔116)。这种共用共同的孔减少了集成芯片布局所需的空间并且还减少了材料和试剂的浪费,如毛细管电泳运行缓冲液。
[0180] 在图4中所示的具体实施方案中,四个样品输入孔100(加载口)位于芯片的每一个末端上,因此容纳八种样品。这些孔100然后独立地由通道102与被指定用于核酸提取的一组封闭的提取室104连接。这些提取室104中的每一个进而与另一组开放孔(试剂入口/出口端口106)连接以根据需要使得流体能够流动穿过提取室104以实施提取测定。在优选的实施方案中,穿过通道、端口、孔以及腔室的流体流动由下文所述的阀门和推进装置的组合控制。合适的推进装置包括与样品输入孔100联接的手动泵送的注射器、蠕动泵、或活塞泵。
[0181] 试剂入口/出口端口106进而与被设计用于扩增的另一组封闭的扩增室108连接。扩增室108还在一侧与样品孔120连接并且在另一侧与试剂入口/出口端口106(与对应的提取室104共用)连接,从而再次使得流体能够流动穿过扩增室108。
[0182] 最终,流体途径中的每一个独立地终止于一组单独的分离/检测通道(CE通道)112,其中在对CE通道112的末端进行荧光检测之前实现电泳分离。电泳模块再一次被独特设计成使先前经受芯片上提取和扩增处理的所有八种样品的注射和分离多重化。
[0183] 扩增室108的电泳侧上的孔120是开放的并且被用作CE样品孔120。因此,每一种样品(或扩增产物)具有从它的对应的扩增室108引出的独立的CE样品孔120。然而,CE测定所需的缓冲液孔116在样品之间(全部或两个相邻的样品途径之间)被共用,如图4中所示。这种多重化设计还降低了高电压线路的复杂性:通过依靠共同的缓冲液孔116,需要较少的电极来操作系统,这是因为一个电极可以由若干个通道所共用。举例来说,可以将单个高电压(优选地,大于6kV)电极用于所有八种经受CE的样品。芯片20的CE操作确保了被共用的缓冲液孔116不会造成样品交叉污染的危险。包括加载和卸载孔114、116、
118和120以及施加电场在内的CE操作在下文参考图4和8A-8C被更详细地论述。
[0184] 通常,芯片20大致是厚信用卡的尺寸。在一个实施方案中,芯片20具有2.5cm至25cm的长度、2.5cm至15cm的宽度、以及0.1mm至10mm的厚度;优选地,集成芯片20是约
5cm宽×10cm长×2mm厚。本领域技术人员将了解的是,具体芯片的尺寸和设计将是设计偏好的问题。
[0185] 在一个优选的实施方案中,芯片20特征尺寸对于检测(CE)通道112来说是10-200μm×10-200μm(例如50μm×20μm),并且对于所有其它通道来说是10-1000μm×10-1000μm(例如200μm×100μm)。将了解的是,对于磁性珠粒将流过的通道来说,通道尺寸被选择以确保磁性珠粒不受阻碍地流动。检测(CE)通道112可以具有
10mm-120mm的长度(例如80mm长度)。更大的检测CE通道112尺寸需要更高的电压来进行CE分析。其它通道,如输送通道102以及连接提取室104和试剂入口/出口端口106、试剂入口/出口端口106和扩增室108、扩增室108和样品孔120、样品孔120和检测通道
112的通道的尺寸不是关键的。
[0186] 在优选的实施方案中,圆形的孔和腔室(如缓冲液孔116)具有5mm-15mm(例如10mm)的直径和0.05mm-1mm(例如0.5mm)的深度。六边形的腔室(如提取室104)可以具有5mm-25mm(例如15mm)的长度(锥形边缘)和5mm-15mm(例如10mm)的宽度。这种六边形设计促使流体容易在提取室104中流动,特别是因为所述处理涉及高体积流体流动。其它实施方案可以容纳具有0.1mm-30mm的直径和0.01mm-19mm的深度的圆形腔室以及具有
1mm-25mm长度(锥形边缘)和1mm-30mm宽度的六边形腔室。
[0187] 进入孔和入口端口,如入口孔100的优选的实施方案具有0.9mm-5mm的直径,其中深度由用于制成芯片20的塑料的厚度决定。替代性实施方案可以容纳具有0.5mm-10mm直径的进入孔。再次,孔的深度由所使用的塑料的厚度决定,并且通常是0.5mm-2mm。
[0188] 紧凑的集成芯片的加工
[0189] 被加工用于在此所述的目的和应用的微流体芯片的实施方案是由塑料、聚合物、或可生物降解的聚合物制成的;因此,这些芯片对于生产来说是有成本效益的并且可以用作一次性设备。一次性方面因此确保了诸如遗留污染(一种与重复使用生物学处理工具相关的典型问题)的问题被最小化到消除的程度。这些芯片也可以用玻璃、硅以及其它材料制成。
[0190] 与制造这些芯片相关的加工工艺涉及硅(Si)或玻璃或(Al)或其它这样的材料中结构的微细加工以形成具有所需的微流体结构的母板。这形成了微细加工的Si/玻璃设备上的负向微流体结构。所述工艺然后涉及在这种微细加工的Si/玻璃设备上模塑基于橡胶的模具以形成阳模。将橡胶模具在塑料板上进行热压印形成了与初始的Si/玻璃微细加工的设备相同的微流体结构。在这一工艺中,将塑料板加热并且压到橡胶阳模上,从而使得所述板变得有延展性。这种延展性使得该板的塑料适形于橡胶模具上的图案,从而在塑料板中形成与初始的Si/玻璃微细加工的设备的负向结构相同的负向结构。最终对上面压印有负向结构的塑料板进行钻孔并且将所述塑料板与另一个未加工的塑料板粘合以形成封闭的流体结构。
[0191] 对于压印和粘合,可以利用塑料材料,如聚乙烯、聚丙烯、聚(氨基甲酸酯-酰亚胺)、聚(四氟乙烯)、聚碳酸酯、聚酰亚胺、环状烯烃共聚物(COC)和环状烯烃聚合物(COP)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、或其它这样的材料,这取决于特定应用要求的定制。
[0192] 上述进行热压印以制造塑料微流体芯片的工艺使得能够生产适于一次性使用的低成本设备。此外,由于塑料制造一般是可按非线性成本比率缩放的,因此还有可能通过批量加工这些微流体设备而大幅降低生产成本。所制造的塑料微流体芯片可以用于进行如下文所述的生物测定。
[0193] 模块化设计
[0194] 参考图4,芯片20包括参与生物分析或诊断测定的三个模块,即DNA提取模块25、PCR扩增模块27、以及电泳分离模块29。一般来说,提取、扩增以及分离的整个过程在同一个芯片内进行,样品通过流体流动从一个模块被输送到下一个模块。
[0195] 这种集成的方法包括细胞的裂解、磁性珠粒与核酸结合、与核酸结合的珠粒的重悬/洗脱、所提取的核酸的扩增以及对扩增的核酸的检测。在提取过程期间,在提取室104中将样品孵育并且洗涤以产生所提取的DNA。在扩增模块27中进行的扩增中,将所提取的DNA连同扩增主混合物一起加载到扩增室108中。DNA和扩增主混合物在扩增室108中被密封,根据适当的热方案对所述扩增室108进行加热和冷却。在所述方案完成之后,将扩增的样品转移到样品孔120中以进行后续的分离和检测。将筛分基质/凝胶、缓冲液、以及任选的分子尺寸标准加载到适当的CE孔和缓冲液孔(孔114、116、118以及120)中,并且施加第一电场,从而使样品进入检测(CE)通道112中。向检测通道112施加第二电场使得样品分离成扩散穿过检测区的物质,其中可以刺激和检测与所述物质连接的荧光标签。提取、扩增、以及检测在下文被更详细地描述。
[0196] 核酸或蛋白质提取模块
[0197] 将了解的是,与以下在本部分中所论述的相似的提取模块在对下文所述的核酸技术作出适当改动以供蛋白质提取使用的情况下可以用于蛋白质提取。
[0198] 被并入这种集成芯片中的核酸提取方法利用磁性珠粒,其中来自被化学裂解的细胞的核酸由所述磁性珠粒捕获。磁性珠粒可以包被有将与所分离的目标结合的任何合适的配体。包衣的实例包括链霉亲和素(用于生物素化的目标)、针对所需目标的抗体、蛋白A、蛋白G、寡脱氧胸苷酸(用于mRNA)。
[0199] 这些珠粒可以被保留在腔室内以直接由连接有DNA的珠粒或通过在扩增之前从珠粒洗脱DNA来进行任选的后续扩增。为了实施提取测定,最初,将裂解缓冲液和包被有链霉亲和素的磁性珠粒(可从例如Dynal (可从英杰公司(Invitrogen)获得)获得或由最终用户根据本领域公知的方案来制备)的组合与细胞样品混合并且按照下文所述的方案进行提取处理。提取方案中所使用的缓冲液和珠粒的组分和规格还详述于以下方案中。
[0200] 用于供紧凑的集成芯片(包括图4中所示的芯片20)使用的提取程序的示例性方案包括:细胞的裂解、磁性珠粒与核酸结合、与核酸结合的珠粒的重悬/洗脱、以及检测核酸。可以使用移液管或注射器经由样品输入孔100(参见图4)将芯片上提取室加载以约0.01μL-10μL的细胞样品。
[0201] 随后,经由孔100将磁性珠粒/裂解溶液加载到提取室中,所述提取室容纳早先分配的细胞样品。将珠粒溶液分配到所述提取室中使得细胞与珠粒溶液在流动期间混合。
[0202] 如本文所用的术语“裂解缓冲液”指的是用于实现裂解细胞的目的以用于分析细胞的化合物的实验中的任何缓冲液。通常,裂解缓冲液包括引起细胞膜破裂的洗涤剂。这些洗涤剂的实例包括Triton X-100、NP40或Tween-20。裂解缓冲液的其它组分可以包括蛋白酶抑制剂、DNA酶;镁盐、溶菌酶、二硫化物还原剂(如β-巯基乙醇)、离子螯合剂(如EDTA)以及防腐剂(如叠氮化钠)。本领域的普通技术人员将了解的是,所使用的具体的缓冲液是基于起始材料和所分析的目标来确定的。
[0203] 在提取室104被充满之后,停止磁性珠粒加载。将已充满的提取室在室温下孵育几分钟以容许例如DNA的目标与磁性珠粒上所包被的配体结合。
[0204] 在一些实施方案中,在完成孵育之后,将磁体放置(或如果使用电磁体的话,接合)在芯片20的提取室104(图4)下方。磁体迫使磁性珠粒沉淀并且容许在洗涤细胞碎片时磁性珠粒保留在提取室104中。通常,所使用的磁体对提取室施加约12,000高斯-13,000高斯的场。将了解的是,磁体的强度取决于珠粒的尺寸、样品的尺寸以及其它因素并且可以相应地调整。
[0205] 在一些实施方案中,在磁体仍被接合的情况下,从提取室洗涤粗提取物。将洗涤溶液加载到与早先加载相同的芯片上孔中。洗涤溶液的实例包括Tris/EDTA(TE)缓冲液、磷酸盐缓冲液(NaH2PO4、NaCl,pH 8)、或本领域公知的其它标准洗涤缓冲液。
[0206] 在一些实施方案中,可以将洗涤步骤重复足够的次数以确保所纯化的目标(例如DNA)不含裂解溶液和细胞碎片。本领域技术人员将能够容易地确定实现这一目标所需的洗涤循环数。现在可以通过使用本领域公知的标准洗脱缓冲液将所捕集的目标分子(例如DNA)在提取室104中洗脱出。
[0207] 流过提取室104的溶液将由移液管、注射器、泵或任何其它合适的装置经由提取室的另一端上的试剂入口/出口端口106被去除。这种废溶液经由试剂入口/出口端口106定期被去除。
[0208] 可以几种不同的方式进行DNA/RNA扩增。一种方法包括将已知不会抑制扩增的磁性珠粒连同与所述珠粒连接的DNA/RNA一起直接添加到扩增主混合物中。在其它实施方案中,可以直接在不进行扩增的情况下,例如通过直接读取核酸序列来进行DNA/RNA检测。
[0209] 如本文所用的术语“主混合物”指的是在反应缓冲液(例如(NH4)2SO4、TrisHCl、Tween-20(pH 8.8)的水溶液)中含有聚合酶(例如Taq DNA聚合酶、逆转录酶)、氯化镁以及脱氧核糖核苷酸(dNTP)的混合物的溶液。本领域技术人员将了解的是,具体的主混合物是基于所扩增的目标、测试条件以及优选的聚合酶来选择的。
[0210] 第二种方法包括将DNA或RNA从珠粒洗脱,继而将DNA重悬在本领域已知的不会抑制扩增的任何标准缓冲液中。
[0211] 如果在扩增中直接使用连接有核酸的珠粒,则将主混合物加载到扩增室108中。然后使提取室104下方的磁体脱离,从而允许磁性珠粒自由漂浮在提取室中。为了防止磁性珠粒(和与所述珠粒连接的DNA)流出提取室104,将提取室104的任何一侧上的端口106和孔120密封。举例来说,可以将试剂入口/出口端口106和孔120用旋塞阀密封或可以使用弹性阀门或铁磁流体阀门将连接入口/出口端口106和孔120与提取室104的通道102密封。因此,所述珠粒可以在提取室104内自由移动,但是被阻止离开提取室104。提取完成并且所述芯片准备进行扩增。
[0212] 在其它情况下,如果没有使用连接有DNA的珠粒,那么使用重悬缓冲液冲洗提取室。将重悬缓冲液加载到提取室104中直到它完全再填充提取室104,从而将洗涤缓冲液从提取室104中置换和卸载为止。然后,使提取室104下方的磁体脱离并且使用适当的阀门将孔100和试剂入口/出口端口106密封。
[0213] 随后,在珀尔帖设备或通常被用作控制或调节温度的装置(如用于扩增的温度控制方法)的其它适当的热源上将芯片加热到50℃-90℃(例如70℃)。这使得DNA从磁性珠粒洗脱。
[0214] 在加热后,阻挡流体从提取室104经由输送通道102输送到扩增室108的阀门打开。最终,所提取的DNA/RNA/蛋白质从提取室104被冲洗到扩增室108中。
[0215] DNA/RNA/蛋白质提取处理完成,并且无论是否与磁性珠粒连接,所提取的DNA准备好进行芯片上扩增,如下文所详述。根据扩增或检测所需的DNA/RNA溶液的体积(即DNA的浓度),可以将洗脱的DNA/RNA的一部分从提取室中卸载并且添加扩增主混合物。
[0216] 扩增模块
[0217] 根据本发明的实施方案,如本文别处所述,扩增模块可以是等温扩增模块或可以是热扩增模块。同样,根据本发明的其它实施方案,如本文别处所述,扩增模块可以被替换为仅进行扩增或DNA/RNA复制或DNA/RNA测序的一个循环并且这个过程可以是等温的或可以是热的。在另一个实施方案中,不进行扩增。
[0218] 在一个实施方案中,将来自提取模块的所提取的DNA/RNA和扩增主混合物在扩增模块108中混合。扩增主混合物含有(除了随后所详述的其它标准试剂之外)一组序列特异性正向引物和反向引物以扩增所提取的DNA/RNA中所关注的基因序列(通常是所述物质的独特特征)。
[0219] 在一些实施方案中,在将所需量的扩增主混合物加载到扩增室108中之后,在所需的DNA变性温度(70℃-100℃)和引物退火温度(40℃-70℃)下进行热循环。
[0220] 在一些实施方案中,通过将集成芯片与精确温度控制和例如编程的温度循环方案的装置放置在一起来实现扩增。(参见例如例证部分中所述的用于扩增大肠杆菌DH10B细胞特征性的700bp DNA片段的方案。)本领域技术人员可以容易地基于样品的起始浓度和最终扩增产物的所需浓度来确定循环数。
[0221] 在其它实施方案中,通过将集成芯片与对DNA或RNA分子的精确控制和例如编程的张力循环方案的装置放置在一起来实现扩增。
[0222] 在一个实施方案中,使用下文详细描述的硬件模块来进行扩增。
[0223] 在某些实施方案中,本领域的普通技术人员将给上述温度加上10℃并且给每次孵育时间加上额外的分钟数。
[0224] 热循环或张力循环的完成使得如引物中所设计的DNA/RNA序列扩增,准备好使用随后所述的方法进行分析。
[0225] 毛细管电泳(CE)模块
[0226] 在某些实施方案中,在完成特定DNA序列的扩增/复制之后,在图4中所示的芯片20的分离模块29中对复制/扩增的DNA分子进行尺寸分离,然后进行荧光检测。如下实现基于电泳的检测。
[0227] 再参考图4,检测(CE)通道112被加载有聚丙烯酰胺(例如GenceScan聚合物(ABI公司)或适用于毛细管电泳的自制聚丙烯酰胺溶液)筛分基质(在本文还被称作“凝胶”)。这是通过将筛分基质同时从集成芯片20上的中心缓冲液孔116分配到所有八个多重化分离模块29中而实现的。随后,在除一个以外的所有CE孔中加载CE运行缓冲液(本领域的普通技术人员已知的适用于毛细管电泳的任何标准缓冲液)(即将缓冲液加载到CE缓冲液孔116、CE缓冲液废物孔114、以及CE样品废物孔118中,而不加载到CE样品孔120中)。首先通过驱使样品从扩增室108进入CE样品孔120中的压力将CE样品孔120加载以扩增产物。然后,将运行缓冲液添加到CE样品孔120中的扩增产物中。
[0228] 本领域技术人员还将了解的是,可以使用不同的凝胶介质进行电泳分离。举例来说,可以使用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶(例如0.1%至20%不同的浓度)进行DNA分离和RNA分离。可以使用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶进行蛋白质分离。在蛋白质分析中,可以使用低的丙烯酰胺浓度来分离高分子量的蛋白质(例如5%用于40kDa-200kDa),而可以使用高丙烯酰胺浓度来分离具有低分子量的蛋白质(例如15%用于10kDa-40kDa)。类似地,可以使用低琼脂糖浓度来分离高分子量的核酸(例如
0.5%用于1kbp-30kbp)并且使用高琼脂糖浓度来分离低分子量的核酸(例如1.5%用于
0.1kbp-2kbp)。
[0229] 适用于毛细管电泳的缓冲液的实例包括Tris/酸盐/EDTA(TBE)缓冲液(例如用于在琼脂糖基质上分离核酸)、Tris/甘氨酸/SDS(例如用于在聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质)。本领域技术人员将了解的是,运行缓冲液的选择将取决于所分析的目标。
[0230] 或者,如果还使用尺寸标准来验证扩增产物的尺寸,那么可以将尺寸标准(例如Gene Scan TAMRA orr ABI)添加到扩增产物和顶上所加载的运行缓冲液中。可以将运行缓冲液和扩增的DNA混合以在孔120内形成均匀的悬浮液。在这种情况下,为了能够对DNA进行荧光检测,被类似于尺寸标准的荧光团(例如VIC(ABI公司))标记的引物将使得扩增的DNA通过扩增过程被标记,如可以预期的那样。
[0231] 可以使用适用于核酸分离的任何分子量标准。实例包括可从快而精公司(QiaGen)获得的 分子量标准(molecular weight marker)和可从新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)获得的分子量标准梯。
[0232] 荧光标记的核酸引物是可商购获得的(例如从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))或可以由本领域普通技术人员根据已知的方案合成。(参见例如Prudnikov等,Nucleic Acids Res.1996年11月15日;24(22):4535-4542,或可在URL http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/n_label.html在线获得的方案。这两个出版物的全部教导以引用的方式并入本文。)荧光标记的实例包括荧光素、6-羧基荧光素、
5'-四氯-荧光素、德克萨斯红(Texas Red)(磺酰罗丹明101酰氯)、量子点、以及荧光标记的纳米粒子。
[0233] 图8A-8C图示了如在检测(CE)通道112中所进行的CE处理。在将试剂加载到孔114、116、118以及120中之后,铂电极网(未示)下降到芯片20(图4)上,从而将电极的尖端浸泡到所有的孔114、116、118以及120中。如图8B中所示,在样品孔120与样品废物孔118之间施加电场130,如短持续时间、相对低的注入电压(例如约400V)。这使得扩增产物(扩增的核酸23)沿着输送通道102和检测(CE)通道112的连接样品孔120与样品废物孔116的部分移动。随后,如图8C中所示,在缓冲液孔116与缓冲液废物孔114之间施加强电场131,如约6kV的高电压。这使得在输送通道102和检测(CE)通道112中所捕集的扩增的核酸23沿着连接这些孔的途径移动。
[0234] 强电场131的施加使得DNA分子基于分子尺寸而分离。在沿检测通道112从CE通道112中DNA的初始定位再向下处(例如距其中在缓冲液孔116与缓冲液废物孔114之间的途径中捕集DNA 23的点75mm),可以通过用具有与和物质140所连接的荧光团的激发波长相匹配的波长的激光源或LED或其它光源适当地照射所分离的物质140来刺激荧光。本领域技术人员可以容易地基于所选择的荧光团来确定所要使用的适当波长。
[0235] 如下文参考图11所述,硬件模块400的检测控制模块406感测激发了的对扩增的DNA或尺寸标准所标记的荧光团的荧光。
[0236] 芯片20的分离模块29(图4)可以有利地作为独立的模块用于许多其它应用,包括DNA、RNA以及蛋白质分析。为了针对指定的应用定制芯片,可能需要操纵流动参数的组合来获得所需水平的分析数据(即分离中的高分辨率)。
[0237] 在本文所述的任何实施方案中,检测通道112的长度可以从几厘米被调整到数米以适应多种独立的分子的分离。这提高了分辨所分离的分子的能力。
[0238] 类似地,所施加的电场(例如电场130和强电场131)可以从数毫伏变成数千伏特以获得所需水平的片段(DNA/RNA/蛋白质)分离。这也提高了分辨所分离的分子的能力。本领域技术人员将能够基于检测通道112(图4)的长度、所需的分辨率以及所关注的分子来确定所要施加的电场。
[0239] 本领域技术人员还将了解的是,可以使用不同的凝胶介质进行电泳分离。举例来说,可以使用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶(例如0.1%至20%不同的浓度)进行DNA分离和RNA分离。可以使用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶进行蛋白质分离。在蛋白质分析中,可以使用低的丙烯酰胺浓度来分离高分子量的蛋白质(例如5%用于40kDa-200kDa),而可以使用高丙烯酰胺浓度来分离具有低分子量的蛋白质(例如15%用于10kDa-40kDa)。类似地,可以使用低琼脂糖浓度来分离高分子量的核酸(例如
0.5%用于1kbp-30kbp)并且使用高琼脂糖浓度来分离低分子量的核酸(例如1.5%用于
0.1kbp-2kbp)。
[0240] 此外,可以使用非光学检测策略,如电化学检测策略,从而减轻了对有待通过分离而被检测的分子进行荧光标记的需要。
[0241] 试剂盒和预加载的集成芯片
[0242] 在一个示例性实施方案中,不同的集成芯片可以被制备用于分析不同的病原体、疾病以及生物样品。
[0243] 本文所述的集成芯片的最终用户可以将芯片和硬件系统(下文所述)部署在对应的位置处以分析多种生物样品,如上文参考图10所述。为了进一步使得这种能力成为可能,本发明的集成芯片可以被包括在试剂盒中,所述试剂盒包括另外的组分,如试剂,包括上文所述的各种缓冲液、分子标记、分子量标准、磁性珠粒、寡核苷酸、荧光染料、CE筛分基质等。或者,这些组分中有许多可以被预加载到集成芯片上。
[0244] 参考图4,集成芯片20可以被加工而具有至少一个提取室104,所述提取室104包括可以被例如链霉亲和素包被的磁性珠粒。在一些实施方案中,至少一个提取室104可以包括用于细胞裂解和核酸提取的试剂(例如上文所述的裂解缓冲液)。在一些实施方案中,至少一个提取室104可以包括被设置在当中和/或至少一个输送通道102中的微细加工的凸起,所述凸起可以用来将生物样品中的细胞机械剪切和裂解。至少一个扩增室108可以被预加载以磁性珠粒、寡核苷酸(任选地被荧光标记)、扩增主混合物等。至少一个检测通道112可以被预加载以CE筛分基质和/或运行缓冲液和/或分子量标准。在另一个实施方案中,至少一个检测通道112包括用于鉴定所扩增的核酸目标的杂交微阵列。
[0245] 在其它实施方案中,本发明的集成芯片可以包括用于对至少一个检测通道112施加电压的至少两个电极。在其它实施方案中,所述集成芯片可以包括用于控制穿过至少微流体通道的流体流动的至少一个流量控制阀。所述阀门可以是被动式旋塞或可以是下文详细描述的任何阀门系统。
[0246] 精确控制
[0247] 根据本发明的一个实施方案利用在纳米级对分子进行纳米操纵和精确控制。通过以极高的精确度对分子或流体系统进行精确控制,根据本发明的一个实施方案可以显著地提高通过在纳米工程的芯片或精确工程的芯片上在高度受控和可调的条件下所进行的化学反应和生物化学反应所产生的总体质量。因此,通过利用纳米技术,根据本发明的一个实施方案不仅可以对集成方法的至少一个步骤加以改进,而且还可以显著地提高总体信噪比,从而提高检测流体样品中痕量的生物目标,如病原性核酸、生物标志物序列或蛋白质的能力。根据本发明的一个实施方案的纳米工程的芯片以及根据本发明的一个实施方案的平台设备中的精确控制元件收紧了由芯片上的反应所产生的产物中的总体高斯扩散(Gaussian spread),从而使得多种关键的性能指标能够有数量级的改进,包括快速性、准确性、可部署性、适应性、以及稳健性。
[0248] 根据本发明的一个实施方案容许对核酸和蛋白质进行精确控制或纳米级控制。纳米级反应器或精确反应器容许与常规的更大规模的系统相比对生物样品进行分析所需的时间、成本、速度以及基础结构有意想不到的改进。举例来说,可以诸如通过在反应室中所施加的电磁场来向核酸施加张力,所述电磁场可以使得核酸,如2nm宽的DNA分子沿给定的方向拉伸。这加速了例如通过打开DNA进行反应的倾向。因此,实现了对分子的小规模控制。在这样的小规模上进行的控制容许实现更大的信噪比、提高的收率并且缩短了用于在反应室中平衡的时间。各种力可以用于纳米级上的控制,例如机械力、电磁力和/或流体动力,以及使用美国专利号7,494,791中所教导的类型的张力,该专利的整个公开内容以引用的方式并入本文。
[0249] 如本文所用的术语“精确控制”参数指的是能够控制参数,以使得在不变的条件下对所述参数进行的重复测量在精确度范围内显示出相同的结果,并且还指的是能够将所述参数以这样的精确度调节到所述参数的新的值。举例来说,根据本发明的一个实施方案,制约用于分析生物样品的反应的至少一个步骤的参数可以被精确控制到加上或减去10%、加上或减去1%、加上或减去0.1%、加上或减去0.01%、加上或减去0.001%或加上或减去0.0001%的程度以内,并且可以这样的精确度被调节到所述参数的新的值。这样的精确控制可以多种方式进行,包括例如通过使用受控的流体流动或通过施加张力,包括用于蛋白质和核酸这两者。
[0250] 如本文所用的向核酸或蛋白质施加张力包括向核酸或蛋白质直接施加和间接施加倾向于使核酸或蛋白质拉伸或伸长的力。作为实例,可以通过直接施加机械张力、通过流体流动中的流体动力学应力、或电磁场向核酸或蛋白质施加张力,无论是作用于核酸或蛋白质分子本身和/或与所述核酸或蛋白质结合的表面、基质、或粒子等上。
[0251] 根据本发明的一个实施方案,可以在至少一个循环中施加倾向于使核酸拉伸的张力。此外,可以在核酸扩增方法中的以下步骤(a)-(e)的每一个循环期间施加倾向于使核酸拉伸的张力并且任选地使所述张力变化:
[0252] 使单链核酸的一条或多条模板链与和所述一条或多条模板链的一部分互补的一种或多种寡核苷酸引物接触;
[0253] 使所述一种或多种引物中的至少一种引物与所述一条或多条模板链中与所述引物互补的部分退火;
[0254] 使所述一条或多条模板链与核酸聚合酶和至少四种不同的三磷酸核苷接触;
[0255] 通过所述核酸聚合酶使至少一种退火的引物延伸,从而形成与所述一条或多条模板链结合的一种或多种延伸产物;
[0256] 使所述一种或多种延伸产物与所述一条或多条模板链分离;以及
[0257] 重复步骤(a)、(b)、(c)、(d)以及(e)以扩增核酸,
[0258] 其中在步骤(a)-(e)的后续循环中使用步骤(e)中的一种或多种延伸产物中的至少一种作为模板链,
[0259] 其中,对于最后一个循环,步骤(e)是任选的。
[0260] 此外,步骤(b)或(d)的至少一个循环包括向所述一条或多条模板链施加倾向于使核酸拉伸的张力。在一些型式中,可以等温进行所述处理。
[0261] 根据本发明的一个实施方案,可以使用例如以下各项来实现精确控制:流体动力聚焦,如Wong等,“通过流体动力聚焦使DNA分子变形(Deformation of DNA molecules by hydrodynamic focusing)”,J.Fluid Mech.,2003,第497卷,第55-65页,剑桥大学出版社(Cambridge University Press)中所教导的;和/或使用机械力,如使用由Liphardt等,“通过机械力使单个RNA分子可逆性地展开(Reversible Unfolding of Single RNA Molecules by Mechanical Force)”,Science,2001,第292卷,第733-737页,American Society for the Advancement of Science所教导的技术;这两篇参考文献的全部教导在此以引用的方式并入本文。可以使用其它技术。
[0262] 鉴于例如DNA具有2nm的直径并且蛋白质可以具有10nm的直径,精确控制的水平可以处在纳米级上。根据本发明的一个实施方案,可以在小于100nm、小于10nm、或小于1nm范围内实现对分子的平移位置或旋转取向的控制。此外,反应室本身可以是小规模的,如具有小于10mm、小于1mm、小于100微米、小于10微米、小于1微米、小于100nm、小于10nm或小于1nm的最大尺寸。此外,调节或制约反应的温度、压力、扩散速率、张力、化学品浓度、盐浓度、酶浓度或其它参数可以在严格控制的范围内变化,例如加上或减去10%、加上或减去1%、加上或减去0.1%、加上或减去0.01%、加上或减去0.001%或加上或减去0.0001%。
[0263] 如本文所用,在系统“被配置成”对参数进行精确控制的情况下,可以例如使用在根据本发明的一个实施方案的移动设备中的计算机处理器的控制下执行的一种或多种软件或硬件模块来对参数进行这样的精确控制。所述计算机处理器可以包括一种或多种控制模块,所述控制模块接收对应于所要控制的一种或多种参数的值的数字编码信号,并且被专门编程以对所要控制的那些参数进行闭环控制。举例来说,所述控制模块可以接收参数的值,并且可以基于所述参数的值,调整对(例如使用张力的施加)所分析的分子所施加的一种或多种力或其它条件。由于通过所述控制模块实施调整,因此所述参数然后将发生变化,并且因此可以形成闭环反馈环路,在所述闭环反馈环路下,所述控制模块对所要控制的一种或多种参数进行闭环控制。除了从一种或多种其它计算机模块接收数字编码信号之外,所述控制模块还可以从一种或多种传感器接收一种或多种传感器输入,所述传感器感测所要控制的参数的值;例如,温度传感器或压力传感器可以向所述控制模块提供温度传感器输入或压力传感器输入。
[0264] 硬件系统
[0265] 如上文所述,具有生物测定的紧凑的集成芯片意图是一次性的。本发明还包括一种硬件系统,所述硬件系统包括机械设备、电气设备和电子设备、以及用于控制这些设备的计算机可读的指令。本领域技术人员将了解的是,这样的硬件系统可以被配置成适应利用上述生物处理模块(例如核酸提取、热扩增或等温扩增、基于激光的荧光检测、以及CE分离)的芯片的各种设计。
[0266] 图11是本发明中所包括的硬件系统400的方框图。硬件系统400的构造细节在下文参考图14被进一步详细描述。
[0267] 参考图11,通常将芯片20(它可以是一次性的)插入硬件模块400中,所述硬件模块400由微处理器/计算机接口408控制。如图11中所示,硬件模块400具有提取控制模块402、扩增控制模块404、以及检测控制模块406。中央控制的硬件模块400可以被操作以适应芯片20上的相继处理,或模块402、404以及406可以被单独地控制以执行两个模块中的任何一个或组合的操作。硬件模块400中的每一个的单独的特征描述于下文中。
[0268] 微处理器/计算机接口408装置可以包括例如适当的计算机(如本文所教导的任一种)和常规的计算机部件(如本文所教导的任一种);并且可以包括存储操作的RAM(如本文所教导的任一种)和用于处理与所检测的核酸有关的信号的适当的软件。
[0269] 提取控制模块
[0270] 再次参考图11,根据需要在提取室(图4中所示的腔室104)下方或上方使提取模块402中12,000高斯-13,000高斯的磁体或电磁体通电。可以在少到一秒至数十分钟内控制磁场的施加以根据方案的需要使磁性珠粒能够聚集和保留。如提取方案中所述,如果需要的话,可以使用热来使DNA从珠粒洗脱。因此,除了施加磁场之外,可以通过硬件系统400,使用由随后所述的扩增模块704所使用的相同的加热模块来实现在扩增期间在任何合适的时间长度内在约50℃-90℃下的热的施加。
[0271] 扩增控制模块
[0272] 在图11中,在扩增模块404中使温度在约40℃-95℃之间循环以进行热循环。这是使用珀尔帖设备或可以用于扩增的任何其它合适的加热/冷却设备来实现的。在所需的时间间隔和重复的循环内最多三个热循环温度使得能够进行DNA变性(70℃-100℃)、引物退火(约40℃-80℃)以及延伸温度(50℃-90℃)的处理,从而形成指数DNA扩增。芯片20上所指定的扩增室被定位在能够进行温度循环的珀尔帖设备上方。
[0273] 图12示出了由扩增控制模块404(图11)所利用的珀尔帖设备550的一个示例性实施方案的方框图。计算机接口408控制微处理器556,所述微处理器556对热控制单元562实施数字比例/积分/微分(P/I/D)反馈控制。数字-模拟(D/A)转换器558将来自微处理器556的数字值转换成施加于电源560的模拟电压或电流,所述电源560与热循环单元562联接。对模拟电压或电流进行调整使得电源560输出发生变化,这进而使得热循环单元562的温度发生变化。由于芯片(未示)与热循环单元562联接,因此热循环单元562的温度的变化相应地加热或冷却芯片。温度传感器554监测芯片和/或热循环单元562的温度并且向模拟-数字(A/D)转换器552提供模拟信号参数,如模拟电压。A/D转换器552将模拟信号参数转换成适于由微处理器556使用的数字值。
[0274] 检测控制模块
[0275] 图13示出了根据本发明系统的实施方案的检测控制模块406的方框图。对于检测扩增的DNA或在一些实施方案中检测分离的蛋白质,利用激光诱导的荧光和高电压电泳的组合。检测控制模块406使用可编程的高电压电源620来经由电极622沿着芯片20上所指定的通道赋予所需的电压信号(400V至10kV)。如果容纳电子设备和芯片的外壳(未示)没有被封闭并且接地,那么包括安全特征以关闭高电压电源620。
[0276] 具有所需的波长和合适的滤光器布置(未示)的激光源602经由透镜606照射芯片20的所选部分。所述照射激发与DNA或蛋白质连接的荧光团,从而使得荧光团以不同于激光波长的波长发射辐射(未示)。滤光器阻挡激光并且透射所发射的辐射,用透镜607收集所述辐射。透镜607使滤过的辐射聚焦到检测器608上,所述检测器608如光电倍增管、雪崩光电二极管、电荷耦合设备、或其它合适的检测器。所述检测器发射信号,如光电流,所述信号由信号放大器电路610放大(和滤过,如果有必要的话)。计算机408记录和处理放大的信号;计算机408还可以用于使用软件接口来控制高电压电源620和激光602,如下文所述。本领域技术人员将了解的是,可以使用光学部件的替代性布置来探查与DNA连接的荧光标记。
[0277] 硬件系统400的详细构造
[0278] 图14图示了根据本发明的实施方案的硬件系统400的方框图。固定器752在凹槽758中容纳紧凑的集成芯片(未示),如图4的芯片20。所述芯片可以使用可调式夹具或任何其它合适的固定装置固定在固定器752中。加热器562(图12的珀尔帖组件562)和磁体756位于固定器752下方,以使它们紧挨着被固定在固定器752中的芯片的适当部分。在优选的实施方案中,加热器562和磁体756可以移动以适应不同尺寸或配置的芯片。
[0279] 覆盖件754可以使用铰链或其它合适的机构定位于被固定在固定器752的凹槽758中的芯片上方。将覆盖件754定位在芯片上方使得电极776被插入芯片的适当孔(例如图4中的芯片20的CE孔114、116、118以及120)中。与由计算机408控制的高电压电源620联接的电极776可以向芯片的相应区段,如图4和8A-8C中所示的CE通道112施加不同强度的电场(例如400V-6000V)。
[0280] 硬件系统400还包括与图13中所示的检测系统相似的检测系统。激光602产生激光束760(实线),所述激光束760从分光镜766和两个镜面781和783反射出以照射芯片中容纳荧光标记的核酸的部分,如图4和8A-8C中所示的检测通道112。当由激光束760照射时,荧光标签发射荧光辐射。这一荧光辐射的一部分形成荧光束762(虚线),所述荧光束762沿着激光束760的途径,但是在相反的方向上传播。荧光束762的一部分传播穿过分光镜766并且穿过滤光器764,所述滤光器764滤掉除荧光波长以外的波长的光。滤过的荧光束762照射检测器608(例如光电倍增管、雪崩光电二极管、电荷耦合设备、线性阵列、或其它合适的检测器),所述检测器608向放大器778发送相应的信号,如光电流。放大器778增强来自检测器608的信号并且将它发送到计算机408,所述计算机408可以记录、处理并且显示与荧光测量相关的结果。
[0281] 软件接口
[0282] 本发明的一些实施方案包括软件模块,所述软件模块被配置成独立地使用图形用户界面(GUI)控制三个生物学硬件模块(即图11中所示和上文所述的硬件系统400的提取控制模块402、扩增控制模块404、以及检测控制模块406)中的每一个。
[0283] GUI允许用户经由用户输入或预编程的磁场启动来控制提取模块。在一些实施方案中,可以在指定的时间间隔内间断地施加磁场,如由上文所述的方案所指定。GUI还允许用户指定持续指定的时间段的温度施加。
[0284] GUI允许用户设定用户指定的温度(通常3个不同的温度,如之前所指定)以及每一个温度的停留时间间隔。用户还可以指定所需的热循环数,从而重复上述输入温度和时间参数。GUI使得用户能够设定硬件设置的芯片/样品温度的微处理器/计算机数据采集;所得的数据可以实时温度与时间的关系图表的形式显示。
[0285] 此外,GUI使得用户能够:(1)选择任一对电极并且使所述电极通电以配置用于施加高电压信号;(2)根据用户的需要,按顺序指定上述对于给定时间间隔的选择;(3)获得对被通电的电极对中的任一个上所施加的电压的反馈监测并且以图表方式表示这一随时间而变的数据;(4)获得对来自被通电的电极对中的任一个的电流的反馈监测并且以图表方式表示这一随时间而变的数据;(5)以图表方式表示随时间而变的所采集的荧光信号;以及(6)根据尺寸标准信号鉴定/辨别荧光信号(峰值/强度)。这些特征可以用于确认扩增以鉴定DNA中序列的存在(或不存在)。
[0286] 本发明的硬件系统和计算机可读指令还可以有助于将通过使用本文所述的集成芯片分析生物样品所获得的数据与存储多种基因组谱的基因组数据库比较。
[0287] 微流体阀门调节
[0288] 微流体阀门和泵通常被用于芯片,如图5的芯片20(在一个实施方案中,它可以是图4的芯片20)中以获得受控的流动以及使流体和蒸气保留在所述芯片内。
[0289] 举例来说并且参考图4,在本发明的一些实施方案中,橡胶塞可以用作阀门。在提取核酸期间将这些橡胶塞插入例如芯片20的样品输入孔100和试剂入口/出口端口106中以密封提取室104。类似地,在扩增期间,可以通过将橡胶塞插入到试剂入口/出口端口106和样品孔120中来密封扩增室108。
[0290] 在其它实施方案中,可以使用各种阀门系统。这些系统在本文别处例如参考图5、6A-6B以及7A-7B来描述。
[0291] 集成微流体芯片的另外的其它实施方案包括被称作“弹性阀门”的阀门技术,该技术的实例示于图15A和15B中。如图15A和15B中所示,弹性阀门1100使用类似于医疗手术中所使用的导管的充气式弹性封装膜1110,以密封芯片内的流体途径。流体途径包括上部芯片基板1104与下部芯片基板1106之间形成的通道1102。膜1110的充气或致动可以使用与膜1110连接的进气管1112来实现,如图15A和15B中所示(即,膜1110被气动致动和控制)。当将已被放气的膜1110放置在开放端口1108中时,如图15A中所示,穿过通道1102的流体流动1114是可行的。然而,当弹性阀门由空气1116充气时,如图15B中所示,它膨胀并且密封开放端口1108并且因此限制流体流动1114在通道1102中穿过开放端口1108。在集成芯片中,可以利用一系列这样的阀门1100来根据需要实现流量控制。
[0292] 在另一种操作配置中,可以将上述弹性阀门嵌入芯片中,而不是以外部接口插入或操作,以实现更高水平的自动化。这样的配置的实例将包括如下的加工工艺,其中将弹性膜沿着需要流量控制的任何通道夹在芯片的两层之间。被用于致动弹性膜阀门的进气管也被嵌入芯片中并且被放到芯片的外围以用于外部空气压力管线连接。被嵌入的和外部的阀门和泵送系统这两者可以有效用于在数纳升至数毫升范围内的阀门/泵体积。
[0293] 图16A-16F示出了弹性阀门组件1200,所述弹性阀门组件1200包括一系列弹性阀门,如图15A和15B中所示的弹性阀门1100,这些弹性阀门被配置成使得能够进行与寄生泵(parasitic pump)的泵送操作类似的泵送操作。阀门组件1200包括与封闭腔室1208经由通道1206a连接的加载有流体的开放孔1202a。封闭腔室1208经由第二通道1206b与第二开放孔1202b连接。根据上文所述的原理,弹性膜1204a和1204b分别控制通道1206a和1206b中流体的流动。被设置在封闭腔室1208中的第三弹性膜1204c控制流体是否进入和离开封闭腔室1208。分别与弹性膜1204a-1204c联接的气动入口管1212a-1212c允许膜
1204a-1204c被充气和放气。
[0294] 如图16A-16F中所示,可以通过将三个膜1204a-1204c依次充气和放气将流体从开放孔1202a吸取到封闭腔室1208中。首先,将流体加载到开放孔1202a中,如图16A中所示。然后按顺序将弹性膜1204a-1204c充气,如图16B-16D中所示。在将所有三个膜1204a-1204c充气之后,将通道1206a中的膜1204a放气,从而形成将流体从开放孔1202a吸取到通道1206a中的吸力。使封闭腔室1208中的膜1204c放气形成另外的吸力,从而将流体从通道1206a吸取到封闭腔室1208中。还可以通过对膜1204a-c进行类似的相继操作将流体从封闭腔室1208卸载到开放孔1202a和1202b中的任一个中。
[0295] 使用系统和集成芯片的方法
[0296] 在根据本发明的一个实施方案中,提供了一种用于提取、任选地扩增、以及检测核酸的便携式系统,所述便携式系统使用紧凑的集成芯片与便携式系统的组合来分析所检测的信号,并且经由无线网络比较和分发结果。便携式基于芯片的诊断设备可以用于快速和准确检测生物样品中的DNA/RNA标志。所述便携式设备可以被用作用于个性化的和动员的纳米医疗或伴随诊断的平台以及提高功效、降低毒性、以及有助于加速对新型药物的临床试验和监管部门批准的工具。
[0297] 在一个实施方案中,系统可以用于进行个性化医疗的方法中。在广义上,个性化医疗使用遗传学来向正确的患者提供以正确剂量的正确的药物以得到正确的结果。在根据本发明的一个实施方案中,便携式测定系统用于提取、扩增以及检测样品中的核酸,并且特别是用于基于所述核酸检测个性化的生物标志物。所述系统然后可以基于所检测到的个性化生物标志物确定适当的剂量和/或药物组合以递送定制的医疗。可以提供目标药物和伴随诊断。此外,所述系统可以用于确定个人是否是对药物疗法的反应者。所述系统还可以用于帮助对患者进行分层以提高药物安全性和功效,并且可以帮助优化给药治疗方案。此外,所述系统可以用于例如通过监测在不同的时间所获取的来自个人的生物样品中存在的核酸的水平来对所述个人进行监测。这样的监测可以用于例如跟踪患者的治疗进展或用于监测所述个人的疾病。举例来说,可以经由DNA/RNA标志物,例如炎症标志物来诊断、分类或监测糖尿病和其它慢性疾病。举例来说,确定个性化的基因组谱可以包括检测指示糖尿病的类型或亚型的核酸。
[0298] 在另一个实施方案中,根据本发明的一个实施方案的便携式系统可以用于通过丰富研究群体而帮助使得监管临床试验更小型和成本更低。使用子集遗传群体使试验个性化可以显著地提高治疗作用,并且缩短审批过程。所得的药物和伴随诊断组合对于目标遗传群体具有优越的价值。
[0299] 在另一个实施方案中,根据本发明的便携式系统可以用于提供个性化的护理,例如在美容、医学美容以及皮肤护理应用领域。举例来说,便携式测定系统可以用于提取、扩增、以及检测样品中的核酸;并且特别是用于基于所述核酸检测个性化的生物标志物。所述系统然后可以基于所述个性化的生物标志物确定所递送的个人护理产品的类型、量或组合。举例来说,所述系统可以用于基于个性化的美容生物标志物来选择和递送美容品。在一个实施例中,基于个性化的生物标志物确定皮肤类型,所述个性化生物标志物然后可以用于确定向个人递送的美容产品的类型、量或组合。移动设备可以用于实时测量和定量关键生物标志物的存在(可以例如基于DNA或RNA)。可以针对皮肤产品测量序列生物标志物(例如美容生物标志物,如年龄相关的基因座、某些衰老基因或基因表达模式、肤质)。根据本发明的一个实施方案的便携式系统可以用于使个体的基因型与这些序列生物标志物具有相关性。集成芯片可以被定制以顺应用于美容生物测定学的目标基因的文库。可以通过经由根据本发明的一个实施方案的便携式系统实时定量个体的美容生物标志物来测量所述个体的美容生物测定学。然后可以观测在使用相应的美容产品的情况下这些生物标志物随时间推移如何变化。实施方案还可以用于保健应用、营养基因组学、以及阿育吠陀式(ayurvedic)基因组学,例如经由对应于瓦塔(vata)、卡法(kapha)以及皮塔(pitta)体型的基因进行阿育吠陀式诊断。
[0300] 在另一个实施方案中,可以使用根据本发明的便携式系统,其中集成芯片的检测能力与特定的独特确定的医药产品相关。举例来说,便携式测定系统可以用于提取、扩增、以及检测样品中的核酸;并且特别是用于基于所述核酸检测个性化的生物标志物,其中所述个性化的生物标志物可以指示疾病或病原体的特定株系的存在。所述系统然后可以基于所述特定株系生物标志物来独特地确定所递送的定制剂量和/或药物组合。在一个实施例中,可以针对特定的人类免疫缺陷病毒(HIV)株来确定所递送的药物剂量和/或组合。根据本发明的便携式系统可以用于护理点检测HIV株、HIV病毒载量确定、以及HIV基因分型或用作监测和预防HIV的母婴传播的药物监测设备或工具。
[0301] 更一般地说,根据本发明的一个实施方案可以用于对任何有机体进行基因分型,从而确定以下各项中的至少一种:对遗传疾病的易感性、疾病的株系、以及疾病病况的抗生素抗性。举例来说,可以确定病毒性肝炎的类型;或可以鉴定癌症基因。
[0302] 在各个实施方案中,根据本发明的便携式系统可以用于多种不同的可能的行业中。举例来说,便携式测定系统可以用于提取、扩增、以及检测样品中的核酸。所检测到的核酸然后可以被用于任何多种不同的可能的行业中(除了本文别处所论述的行业之外)。举例来说,所检测到的核酸可以与以下各项有关:食品安全、农业疾病、兽医学应用、考古学、法证学、营养学、营养品、营养基因组学、水测试/卫生、食品和饮料、环境监测、海关、保安、防务、生物燃料、运动和保健;并且可以用于治疗诊断(theragnosis)。
[0303] 根据本发明的一个实施方案的系统可以用于确定作为生物样品的来源的个人的个性化的基因组谱。所述个性化的基因组谱然后可以用于基于所述个性化的基因组谱针对所述个人使营养品、医学美容品、药物、食品或饮料或营养学个性化。个性化的基因组谱可以例如用于所述个人的个性化的保健、个性化的运动营养学、个性化的饮食或个性化的营养学。在体育运动领域中,例如,可以测定炎症标志物以检测、测量以及治疗运动员的损伤,如运动员在身体接触的运动项目中的创伤性脑损伤。在另一个实施方案中,在体育运动方面,可以测定标志物以评估血液兴奋剂。在另一个实施方案中,可以针对各种类别的表型表达来测量RNA标志物。
[0304] 根据本发明的一个实施方案的系统可以用于个性化的营养学,其中芯片读取器(如核酸提取控制模块、核酸扩增控制模块以及核酸检测控制模块)和软件被定制以有助于基于个人的DNA/RNA谱来使食品和饮料以及营养学个性化。在广义上,个性化的营养学包括使用遗传学来向正确的消费者实时提供以正确的营养学以得到正确的结果。在根据本发明的一个实施方案中,可以向个人基于他们的DNA/RNA谱提供伴随个性化营养性添加剂。可以提供针对性的营养学和伴随诊断,并且可以产生针对健康和保健生物标志物的伴随诊断。可以提供用于健康和保健的全面和综合的方法。可以向消费者提供反馈以不仅通过普遍接受的表型标志物,还通过DNA/RNA生物标志物来测量他们的进展,所述DNA/RNA生物标志物提供了对进展的稳健的和可信的测量。通过基于个人的DNA/RNA标志物确定他们的基因谱,或他们的易感性,可以使所述个人的饮食个性化。个性化的基因组谱可以用于确定个人的营养易感性,如遗传性食物过敏、不耐受或敏感性,例如麸质敏感性、麸质不耐受或乳糖不耐受,以及用于基于所述图谱来使饮食个性化。可以测量炎症标志物作为监测一定的饮食是否被耐受的方式。此外,可以检测、测量,然后通过将微量营养素添加到食品或饮料中来解决营养缺乏症。举例来说,可以基于通过根据本发明的一个实施方案测量的生物标志物来测量维生素缺乏症、矿物质缺乏症以及其它缺乏症(如维生素B12缺乏症、叶酸缺乏症、铁缺乏症)。然后可以通过在食品或饮料中提供适当的微量营养素补充来解决所述缺乏症。此外,可以确定在个人的微生物群落中缺乏的或发生改变的益生菌益生元。举例来说,可以获得来自个人的唾液、肠道或尿液的生物样品并且分析以确定所述个人的微生物群落中有哪些益生菌或益生元缺乏或发生改变,如在所述个人的口腔微生物群落或肠道微生物群落中。然后可以在所述个人的食品或饮料中补充缺乏的益生菌或益生元以帮助所述个人恢复正常的微生物群落。
[0305] 在根据本发明的一个实施方案中,可以基于确定炎症的生物标志物来执行个性化的营养学。炎症牵涉到多种病况,包括癌症、心血管病况、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、部疾病、关节炎、自身免疫性疾病、神经疾病以及糖尿病。在根据本发明的一个实施方案中,通过基于个人的DNA/RNA标志物确定他们的基因谱或他们的易感性,可以使所述个人的饮食个性化。举例来说,可以根据本发明的一个实施方案被测定、测量和/或监测的所选心血管炎症生物标志物列于图27中。可以使用的所选糖尿病炎症生物标志物列于图28中。在个性化医疗以及个性化营养学中,可以使用图29中所示的生物标志物例如来确定肥胖、糖尿病以及心血管疾病的进展。将了解的是,可以使用除图27-29的那些生物标志物以外的其它生物标志物,并且这些生物标志物可以用于个性化营养学、个性化医疗以及本文所述的其它技术。
[0306] 在根据本发明的另一个实施方案中,可以通过基于个人的营养基因组谱分配食品或饮料来加强消费者对食品或饮料的体验。本文所教导的系统可以被嵌入分配启动器的外形(form factor)中,所述分配启动器诸如售货机、自动柜员机、或信息亭的至少一部分,可以基于来自本文所教导的系统的控制输入而被控制。举例来说,个人可以向遗传分析单元提供生物样品,所述遗传分析单元被配置成测定与所述个人相关的生物标志物。基于所述生物标志物,可以确定作为所述至少一种生物样品的来源的个人的个性化的基因组谱。分配控制单元然后被配置成基于所述个性化的基因组谱确定所分配的产品、或产品的一部分。分配启动器与分配控制单元联接,并且被配置成在所述分配控制单元的控制之下分配所述产品的至少一部分。使用这种系统,例如,消费者可以将生物样品(如唾液样品)插入到售货机中,所述售货机将基于消费者的营养基因组谱确定哪种食品或饮料最适合于所述消费者。所述分配启动器可以包括三维打印机,所述三维打印机被配置成打印所述产品的至少一部分,或所述分配启动器可以被配置成分配预先包装的产品。所述产品可以例如是食品、饮料、医学美容品、营养品、药物、草药、替代药物以及美容品。分配控制单元可以被配置成基于营养易感性、营养缺乏症、以及微生物群落中缺乏的或发生改变的至少一种益生菌或益生元(这些方面中的任一个可以通过基于本文所教导的实施方案检测核酸来确定)来确定所分配的产品或产品的一部分。三维打印机可以例如用于在售货机或信息亭,基于消费者的基因谱打印所述消费者的食品或饮料。另外的信息可以由消费者使用用户界面,如键盘、触摸板、语音识别界面、增强现实界面或其它用户界面来输入。消费者可以例如被提供以一些有关基于所述消费者的图谱将是有益的替代性成分的信息,然后能够使用用户界面选择所述成分中的一种或多种以定制食品或饮料。诸如售货机之类的系统可以集成了使用点伴随诊断和营养增强型食品或饮料的使用点生产(例如利用对所述食品或饮料的三维打印)。食品、饮料、医学美容品、营养品以及美容品可以用这种方式被三维打印。在美容品方面,例如,顾客在美容品柜台的信息亭处可以使用本文所教导的系统而被提供以定制的图谱,然后能够打印所述顾客自身的美容品,如皮肤护理溶液。可以提供类似的系统以用于营养品、草药、替代药物、草药茶、食品以及饮料。举例来说,可以在果汁中提供香料或其它成分,如姜黄、肉桂、绿茶或其它抗炎成分,以降低消费者的炎症水平。在上述实施方案中,可以由控制系统基于顾客的基因谱提供定制的剂量。
[0307] 在根据本发明的另一个实施方案中,本文所教导的系统联同增强型体外反搏(EECP)治疗机器一起使用。通过本文所教导的核酸分析系统实时监测心脏标志物、炎症标志物以及与心脏功能改善相关的其它标志物的水平,并且所述水平用于向EECP机器提供电子控制输入,例如以增加或减少血流量或滴定剂量。举例来说,炎症因子、VEGF、内皮自动生长因子、其它基因表达模式、心脏标志物、与心脏状态有关的DNA/RNA标志物等可以由本文所教导的系统来监测。通过将本文所教导的核酸分析系统与EECP治疗机器联接,可以提供有助于使用组合作用逆转动脉粥样硬化的工具,所述组合作用是通过在流动以及对炎症因子进行测量的情况下刺激内皮修复而产生的。可以同时在核酸分析系统的多个通道上监测牵涉到动脉粥样硬化过程的生物标志物,并且基于所述生物标志物的水平向EECP机器提供电子控制输入。
[0308] 在各个实施方案中,由根据本发明的便携式系统所提供的结果可以包括病毒载量(例如以拷贝数/毫升计)、每单位体积预测的细胞计数(例如以细胞数/立方毫米计的预测的CD4计数)以及药物剂量的滴定。
[0309] 在根据本发明的另外的实施方案中,根据本发明的便携式系统可以与其它系统以多种不同的可能的方式通信。所述便携式系统可以发送和接收与生物样品有关的调制数据信号,并且可以经由有线介质(例如有线网络或直接有线连接)或无线介质(例如声波、红外线、无线电、微波、扩展频谱)来通信。所述便携式系统可以例如经由全球资讯网(World Wide Web)和/或移动式网络和/或经由文本消息(如SMS消息)来通信。所述便携式系统可以与存储基因组谱的远程基因组数据库连接。所述便携式系统可以存储、或发送或接收单一参考样品的信号谱。
[0310] 在根据本发明的另外的实施方案中,所述便携式系统或移动设备可以被实施为利用任选地一次性的紧凑集成芯片的任何多种不同的可能的可广泛使用的手持式或平板设备的一部分或与所述手持式或平板设备交接,所述手持式或平板设备诸如智能电话、个人数字助理(PDA)、蜂窝电话、或其它手持式或平板设备。此外,类似的图形用户界面和外部设计可以被用于这些可广泛使用的手持式或平板设备上。在一个实施例中,根据本发明的一个实施方案可以被实施在以下各项中、或与以下各项交接、或使用与以下各项类似的图形用户界面或外部接口:iPhone、iPad或iPod(全部均由美国加利福尼亚州库珀蒂诺的苹果公司(Apple Inc.,Cupertino,California,U.S.A.)出售)或Galaxy(由南韩水原市的三星电子有限公司(Samsung Electronics Co.,Ltd.,Suwon,South Korea)出售)。
[0311] 在根据本发明的一个实施方案中,便携式系统、或处于分散地点处的多个这样的便携式系统可以用于跟踪在分散的分析点的疾病暴发。便携式系统可以经由一种或多种网络(例如局域网、广域网和/或互联网)连接;并且可以参与中央数据中心与系统最终用户之间的信息双向交换。数据中心可以向最终用户/本发明系统提供已知的病原体/疾病映射信息以进行生物样品分析,并且随后本发明系统/最终用户可以向数据中心发送测定结果。数据中心可以接收来自最终用户/本发明系统的地理位置信息和其它病例识别信息。数据中心可以监测来自多个所部署的单元/本发明系统的输入测定结果并且利用模式检测程序,例如以跟踪疾病的暴发。在检测到临界模式之后,数据中心可以编程方式向根据本发明的远程便携式系统生成通知。
[0312] 系统和集成芯片的另外的用途和应用
[0313] 在各个实施方案中,本发明的系统可以用于鉴定病原体、诊断带有遗传标志物的病症、或对个体进行基因分型。本发明的方法一般包括(1)提供至少一个集成芯片;(2)将至少一种生物样品加载到所述至少一个集成芯片上;(3)使便携式控制组件与至少一个集成芯片可操作地连接;以及(4)启动所述便携式控制组件以实现对来自被加载到所述集成芯片上的生物样品的核酸进行提取、扩增以及检测。
[0314] 本发明可以用于诊断和检测具有基于核酸的遗传物质和/或遗传组分的多种多样的病原体和病症。除了检测诸如HIV、HBV、HCV以及性传播疾病等目标之外,本发明的系统和方法还可以用于检测和诊断在肿瘤学、心血管、鉴定测试以及产前筛查领域中出现的分子诊断目标。
[0315] 优选地,生物样品源自于生物流体,诸如但不限于血液、唾液、精液、尿液、羊水、脑脊髓液、滑液、玻璃体液、胃液、鼻咽抽出液和/或淋巴。
[0316] 生物样品可以是组织样品、水样品、空气样品、食物样品或作物样品。优选地,所述生物样品分析检测水传播的病原体、空气传播的病原体、食物传播的病原体或作物传播的病原体中的任何一种或多种。
[0317] 可由本发明的系统和方法检测的病原体可以来自多种宿主。所述宿主,无论是生物宿主还是非生物宿主,均应当能够通过允许感染因子在所述宿主中或所述宿主上复制而支持所述感染因子复制。这样的宿主的实例包括液体或固体体外培养基、动物、植物或单细胞有机体的细胞或组织、整个有机体,包括哺乳动物,如人类。
[0318] 本发明的系统和方法可以用于以下领域中的一种或多种中。在一个实施方案中,本发明的系统和方法可以用于防御生物武器的领域中。举例来说,本发明可以用于发病点和实时病原体检测。在另一个实施方案中,本发明的系统和方法可以用于生命科学的领域中。举例来说,本发明可以用作便携式分析仪器以及与便携式分析仪器一起使用。在另一个实施方案中,本发明的系统和方法可以用于临床诊断学的领域中。举例来说,本发明可以用于在医院、家庭或现场由医生、护士或未经培训的用户来诊断和/或鉴定病原体。本发明还可以用于对有机体进行基因分型,从而确定对遗传性疾病的易感性(如果有的话)或抗生素抗性(如果有的话)。本发明还可以用于确定患者中存在的病原体以及那些病原体对各种抗生素的敏感性和抗性谱。本发明还可以用作药物监测设备、疾病的预后指示器、以及治疗诊断设备。在另一个实施方案中,本发明的系统和方法可以用于工业和农业监测的领域中。举例来说,本发明可以用于监测和/或检测由食物、作物、牲畜等传播的病原体。在另一个实施方案中,本发明的系统和方法可以用于法证学的领域中。举例来说,本发明可以用于对个体进行遗传鉴定。
[0319] 在一个实施方案中,可以通过利用本发明的系统和方法来诊断遗传性病症和具有遗传组分的病症。举例来说,已经鉴定出许多致癌基因,包括p53,所述p53牵涉到乳腺癌、结肠直肠癌以及其它癌症的产生;c-erbB2,所述c-erbB2与乳腺癌的产生和转移相关;以及BRCA1,所述BRCA1涉及全部遗传性乳腺癌的50%并且还与前列腺癌和其它癌症的险增加相关。可以使用本文所述的系统和方法来实现对这些遗传标志物的筛选。
[0320] 可以使用本发明的系统和方法诊断的感染因子包括但不限于细菌、病毒、真菌、放线菌、以及寄生物。实例包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia)、志贺菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、亚利桑那菌属(Arizona)(沙门氏菌亚属III)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterogacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providentia)、摩根氏菌属(Morganella);弧菌属(Vibrio)和弯曲杆菌属(Campylobacter);布鲁氏菌属(Brucella),如波状热;耶尔森氏菌属(Yersinia);巴氏杆菌属(Pasteurella);弗朗西斯氏菌属(Francisella);放线杆菌属(Actinocacillosis);嗜血杆菌属(Haemophilus)、博德特氏菌属(Bordetella)(例如百日咳博德特氏菌(Burdetella pertussis));假单胞菌属(Pseudomonas)和军团菌属(Legionella);拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Fusobacterium)、链杆菌属(Streptobacillus)以及肉芽肿荚膜杆菌属(Calymmatobacterium);芽孢杆菌属(Bacillus)(产芽孢需氧菌);梭菌属(Clostridium)(产芽孢厌氧菌);李斯特菌属(Lissteria)和丹毒丝菌属(Erysipelothrix);棒状杆菌属(Corynebacterium);分枝杆菌属(Mycobacterium);螺旋体(Spirochete);立克次氏体(Rickettsia);衣原体(Chlamydia);支原体(Mycoplasma);痘病毒(Poxvirus);
疱疹病毒(Herpesvirus);乳多空病毒(Papovavirus);腺病毒(Adenovirus);正粘病毒(Orthomyxovirus)、副粘病毒(Paramyxovirus);弹状病毒(Rhabdovirus);巨细胞病毒(Cytomegalovirus);逆转录病毒;小RNA病毒(Picornavirus);冠状病毒(Cornavirus);轮状病毒(Rotavirus);肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒);
披膜病毒(Togavirus);布尼亚病毒(Bunyavirus);嵌沙样病毒(Arenavirus);隐球酵母属(Cryptococcus);念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis));孢子丝菌属(Sporothrux);组织胞浆菌属(Ilestoplasma);
球孢子菌属(Coccidioides);芽生菌属(Blastomyces);曲霉属(Aspergilli);接合菌(Zygomycetes);暗色孢科(Dematiaceae);镰刀菌属(Fusarium);原生动物(Protozoa);
线虫(Nemathelminthes);以及扁蠕虫(Platyhelminthes)。
[0321] 在其它实施方案中,可以使用本发明的系统和方法来检测逆转录病毒,如HIV-1、HIV-2、HIV-1M族、N族、O族或P族中的任一种、HIV-1M族亚型A-K中的任一种、或任何其它已知类型或亚型的HIV、HTLV-1和HTLV-2以及疱疹病毒,如HSV-1、HSV-2、VZV、EBV、CMV以及HHV-6。
[0322] 在其它实施方案中,可以使用本发明的系统和方法检测的病症和疾病包括:包柔氏螺旋体属(Borellia)、人类T细胞淋巴瘤/白血病病毒-I、人类T细胞淋巴瘤/白血病病毒-II、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、HSV、VZV、HPV(普通、6、11、16、18、31、33)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、军团菌属菌种(Legionella spp.);
人类细小病毒B19、B族链球菌。
[0323] 在其它实施方案中,可以使用本发明的系统和方法检测的病症和疾病包括遗传性病症和存在遗传易感性的病症。实例包括但不限于囊肿性纤维化、戈谢病(Gaucher disease)、中链酰基脱氢酶缺乏症、强直性肌营养不良、钠通道病、氯通道病、杜氏/贝克型肌营养不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy)。
[0324] 在某些实施方案中,可以诊断以下病原体:人类免疫缺陷病毒、TB细菌、丙型肝炎病毒、SARS病毒、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、巨细胞病毒、阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、A族链球菌、B族链球菌、人类乳头状瘤病毒、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)以及大肠杆菌。
[0325] 在一个实施方案中,所检测的感染因子是甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)。金黄色葡萄球菌代表了引起医院获得性感染和社区获得性感染的最显著的病原体之一。β-内酰胺类抗生素是用于严重的金黄色葡萄球菌感染的优选药物。由于在1961年将甲氧西林引入到临床使用中,因此甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株的出现已经稳步增加,并且医院感染已经成为世界范围内一个严重的问题。因此,对甲氧西林抗性的检测对于患者的治疗和管理来说具有重要的意义。在临床实验室中,通过生长特征以及后续对过氧化氢酶和凝固酶活性或特定的表面成分的检测来鉴定金黄色葡萄球菌。已经使用DNA酶和热稳定性核酸内切酶测试作为没有定论的或阴性的凝固酶测试的确证测试。如果根据NCCLS标准使用琼脂稀释或琼脂筛选方法,那么常规的金黄色葡萄球菌敏感性测试可靠地检测对甲氧西林或苯唑西林(oxacillin)的抗性。甲氧西林抗性与由mecA基因编码的青霉素结合蛋白的产生有关,或偶尔与β-内酰胺酶的过量产生有关。
[0326] 检测MRSA的常规方法利用基于肉汤和基于琼脂的抗微生物剂敏感性测试并且提供给定的微生物对一系列药剂的反应的表型谱。这些方法是缓慢的并且充满了问题,如假阳性和假阴性是常见的。这些失败是由于葡萄球菌中抗性基因的表达,这些抗性基因可以非常异质的方式表达,从而使得难以对抗性进行表型表征。可以使用目标在于检测抗性基因mec A的分子方法。可以通过使用可以用于实施本发明的高密度探针阵列来促进对扩增TM产物中的突变的筛选,所述阵列如 Genechips 。
[0327] 可以类似地在许多有机体中通过检测特异性抗微生物药物抗性基因(抗性基因分型)来检测药物抗性。实例列于下表1中:
[0328] 表1:用于检测抗微生物剂抗性的分子方法
[0329]
[0330] 在其它实施方案中,可以通过利用本发明的系统和方法检测的病毒性和微生物性疾病是表2中所列的那些:
[0331] 表2:可以通过基于核酸的测试加以测试的临床上重要的病毒性和细菌性病原体[0332]
[0333] 在另外的实施方案中,可以通过利用本发明的系统和方法来测试表3中所列的感染性疾病:
[0334] 表3:可以通过基于核酸的测试加以测试的感染性疾病
[0335] 沙眼衣原体检测
[0336] 淋病奈瑟氏菌检测
[0337] 沙眼衣原体/淋病奈瑟氏菌筛选/检测
[0338] 结核分枝杆菌检测
[0339] HPV筛选
[0340] CMV
[0341] A族链球菌检测
[0342] HIV定量
[0343] 加德纳菌属、阴道毛滴虫、以及念珠菌属
[0344] 细菌和真菌的培养确认
[0345] 多部门、跨行业使用
[0346] 鉴于本发明的上述特征和优势,使得健康护理(和其它行业),特别是跨多个部门能够有许多进步。健康护理行业中的部门包括:
[0347] 政府部门(例如疾病控制中心(Centers for Disease Control)、军事行动、农业部(Department of Agriculture)等),
[0348] 商业部门(例如医院/医疗机构、分析/诊断实验室、医药实体等),以及[0349] 私营部门(例如医师、农场主/牧场主、个体)。
[0350] 在一个示例性实施方案中,实验室或医药公司用作上文所述的多种所制备的集成芯片的分发点。不同的芯片被制备用于分析不同的病原体和疾病。芯片的最终用户来自于各种部门并且将所述便携式测定系统(上文所述)部署在对应的地点和环境处,包括家庭患者使用、现场(例如作物和兽医检查点)、偏远/郊外地区以及医院/医疗中心、进口港等。由于本发明的集成芯片与便携式测定系统之间的即插即用配置(即快速的读取器周转、芯片测定多样性以及芯片可处理性),因此本发明的给定的便携式测定系统/设备可以在现场读取多种不同的芯片(以检测不同的病原体/疾病)或可以专用于读取一种类型的芯片(以检测某种病原体/疾病)。
[0351] 在使用所述便携式测定系统期间,在中央数据中心(其中驻留或维护工作数据文库和生物信息学数据)与系统最终用户之间存在信息的双向交换。在这种双向交换中,数据中心向最终用户/本发明系统提供已知的病原体/疾病映射信息以进行生物样品分析,并且随后,本发明系统/最终用户向数据中心发送测定结果。除了测定结果之外,数据中心还可以接收来自最终用户/本发明系统的地理位置信息和其它病例识别信息。数据中心监测来自多个所部署的单元/本发明系统的输入测定结果并且利用模式检测程序(本领域常见的)。举例来说,基于从多个最终用户接收的数据,可以检测在集中的地理区域中给定疾病的病例数目的模式,或可以检测给定疾病移动(传播)的模式。涵盖了对某些病况或病原体/疾病的出现(例如在水供应、粮食作物、血库等中)的其它模式检测和监测。
[0352] 进而,数据中心可以被配置成在检测到临界模式之后以编程方式生成通知。数据中心可以通知医务人员(救护车、急救室、医师)、军事单位、政府机构等。这种通知可能是在订阅的基础上的,其中接收方支付订阅以分享数据中心的警报和通知。可以存在不同的订阅级别,其中各方/用户在一个级别上支付以具有数据文库的访问权限并且在另一个级别上支付以有权访问所收集的测定结果数据。另一个订阅级别可以使用订阅者提供的联系信息(在何处以及以何种介质/形式发送警报)向订阅者提供自动的警报和通知。
[0353] 如本文所用,通知和警报可以呈电子邮件、电话呼叫、报警或其它听觉和/或视觉指示的形式。
[0354] 此外,数据中心可以被配置成在接收和处理来自最终用户的测定结果之后进一步对最终用户作出响应。使用给定的测定结果,数据中心交叉参考其它已知的相关信息,如基因型、有效的疗法/治疗等。数据中心将这一附加信息发送给最终用户以供现场使用。
[0355] 因此,本发明提供了医疗护理和治疗、疾病控制、生物防御(发病点和实时病原体检测以及实时跟踪感染和传染)、以及其它多部门、跨行业使用的增强的方法。
[0356] 示例性设备配置
[0357] 本文所述的本发明可以被配置在或被用于包括但不限于以下各项的产品或设备中:手持式设备、平板计算机、笔记本、智能电话、可植入设备(可植入物)、可摄取设备(可摄取物)、可穿戴式设备(可穿戴物)以及可注射设备(可注射物)。
[0358] “可穿戴式设备”是预期用于身体的体外部分,如手臂、腿、皮肤、颊面贴片、躯干上的设备。可穿戴式设备被配置成保持在身体上,诸如但不限于夹持件、箍套、粘合贴片、皮肤贴片、颊面贴片、眼镜、头带、脚腕带、配件(在脚底处)等。可植入设备可以常规地进行本文所述的设备的操作并且任选地与计算机,诸如通过无线通信来交接设备操作的输出。根据本发明的一个实施方案的可穿戴式设备可以包括一个或多个独立的部件,所述部件可能被或可能不被附接或机械交接在一起和/或可以位于身体的一个或多个不同的体外部分处,并且可以相互无线和/或使用有线通信来通信。根据本发明的一个实施方案的可穿戴式设备还可以仅包括本文所述的设备的一部分,并且可以与本文的这种设备的其它部分进行无线和/或有线通信,其中这些其它部分处在人体内部和/或外部。示例性可穿戴式设备示于图21中,所述设备被配置成(A)皮肤贴片或真皮贴片;(B)箍套,所述箍套包括根据本发明的设备和用于将所述设备保持在腕部、手臂、腿、手指上的带子;以及(C)可以粘合方式在一侧与身体的体外部分附接并且在同一侧或相对侧与根据本发明的设备附接的贴片。在一些实施方案中,所述设备的所有部件均被包括在可穿戴式设备上。在其它实施方案中,这些部件中的一些被包括在可穿戴式设备上并且向位于别处的接收器发送信号。根据本发明的一个实施方案的可穿戴式设备还可以仅包括本文所述的设备的一部分,并且可以与本文的这种设备的其它部分进行无线和/或有线通信,其中这些其它部分处在人体内部和/或外部。
[0359] “可植入设备”是如下的设备,所述设备被放入人体内通过手术或天然形成的腔体中,在所述设备意图在那里保留数天、数月或更长的一段时间的情况下。可植入设备可以常规地进行本文所述的设备的操作并且任选地与计算机,诸如通过无线通信来交接设备操作的输出。根据本发明的一个实施方案的可植入设备可以包括一个或多个独立的部件,所述部件可能被或可能不被附接或机械交接在一起和/或可以位于人体的一个或多个不同的部分处,并且可以相互无线和/或使用有线通信来通信。根据本发明的一个实施方案的可植入设备还可以仅包括本文所述的设备的一部分,并且可以与本文的这种设备的其它部分进行无线和/或有线通信,其中这些其它部分处在人体内部和/或外部。
[0360] “可摄取设备”是可以向患者口服递送以进行个人监测的设备。举例来说,所述设备可以是用于使用本文所述的设备记录时间标记的患者记录的事件的可摄取事件标记器。可摄取部件经由通信与外部记录仪无线连接,所述外部记录仪记录摄取的日期和时间以及所述可摄取设备的独特序列号。
[0361] “可注射设备”是可以被注射到人体内的部位并且能够保持在体内预期部位的设备。可注射设备可以常规地进行本文所述的设备的操作并且任选地与计算机,诸如通过无线通信来交接设备操作的输出。
[0362] 用于可植入物、可注射物或可摄取物的示例性设备示于图22中。本发明的设备被并入载体基材中。
[0363] 例证
[0364] DNA纯化程序
[0365] 参考如图4中所示的集成芯片和如图9B中所示的荧光检测模块来描述以下实施例。
[0366] 用户经由样品入口端口100将生物样品、磁性珠粒以及裂解缓冲液注射到核酸提取室104中,然后将集成芯片20加载到便携式测定系统(10,图1)中。所述系统将生物样品孵育7分钟,在此期间,进行裂解并且样品中的DNA与磁性珠粒结合。所述系统然后接合磁体,所述磁体使得磁性珠粒(和所连接的DNA)簇集在磁场区域中。使用用户经由样品入口端口100注射到提取室104中的洗涤缓冲液将珠粒洗涤两分钟至三分钟。在洗涤期间使磁体脱离。用户将这一循环重复一次,之后经由样品入口端口100注射无DNA/RNA的水。随后,用户使磁体脱离,将流体在核酸提取室中在70℃加热8-10分钟,从而释放DNA。使磁体接合以固定珠粒,使用被动式旋塞密封试剂添加口106,并且使用注射器迫使所提取的DNA进入核酸扩增室108中。
[0367] 用户密封扩增室108,优选地使用被动式旋塞阀插入试剂添加口106和样品孔120中。在密封所述腔室之后,将所提取的DNA与PCR主混合物混合,之后珀尔帖冷却器使温度在50℃与97℃之间循环最多35次以扩增所提取的DNA。在扩增完成之后,用户将扩增室解除密封,然后使用与集成芯片经由试剂添加口106联接的手动泵送的注射器将扩增的核酸推到检测模块中。
[0368] 用户经由缓冲液孔116将聚合物凝胶/筛分基质和CE运行缓冲液加载到八个检测通道112中。随后,将分子量标准加载到样品孔120中。随后,用户在位于样品孔120和样品废物孔118上或附近的电极间施加400V以将扩增的核酸吸取到检测通道112中。在足量的扩增的核酸进入检测通道之后,用户关闭400V场,然后从缓冲液废物孔向缓冲液孔施加6kV场。这使得分子量标准沿着检测通道112分离,从而提供参考时间。在任选地冲洗检测通道112之后,用户使用由施加于核酸扩增室108的注射器压力而被迫进入样品孔120中的所加载的扩增的核酸重复所述过程。这使得扩增的核酸分离成物质并且沿检测通道112向下迁移。
[0369] 随着它们迁移,分子量标准或扩增的核酸物质穿过测量区1005,其中在被配置成检测荧光信号的检测控制模块60的控制下对它们进行探查,如图9B中所示。随着物质140迁移穿过测量区1005,它们被适当波长的激光束1004照射,从而使得物质140发射不同波长的荧光束1010。荧光束1010和激光束1004从测量区1005向外传播到二向色分光镜1007,所述二向色分光镜1007反射激光束1004并且透射荧光束1010。光束阻挡器1008吸收激光束1004,并且检测器1012感测荧光束1010。检测器1012按与荧光束1010强度的比例发射光电流(未示)。处理器1014检测、记录并且处理随时间而变的所检测到的光电流。
[0370] 将所检测到的经过处理的信号与来自在相同条件下分析的已知参考的信号相匹配以鉴定样品中的病原体。所述系统用输出信号图表1020表示这一鉴定过程。对已知的参考进行分析产生参考信号迹线1021,该迹线1021具有对应于已知量的已知病原体的峰。将来自未知样品的信号峰1022的时间纵坐标与参考信号迹线1021进行比较向用户给出了有关病原体类型的指示;所述系统通过计算信号峰1022下面积来确定病毒载量。
[0371] 细胞培养
[0372] 为了证实集成芯片的性能,使用大肠杆菌细胞进行实验性测试。在振荡器上以200rpm在5mL管中在LB培养基(英杰公司)中在约37℃将大肠杆菌细胞(DH-10B,英杰公司)培养过夜。然后将储备培养物直接用于实验或稀释(在无RNA酶水中)以获得所需的细胞稀释液/浓度。通过在分光光度计(Ultraspec 10,英国阿默舍姆生物科技公司(Amersham Biosciences,UK))中对培养物进行测量来获得培养细胞浓度。大肠杆菌类型TM TM
的细节如下:大肠杆菌,DH10B细胞(ElectroMAX DH10B ,目录号:12033-015,美国的英杰公司);基因型:F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG tonA;整个基因组DNA的近似尺寸是
6
约4.6×10bp。
[0373] 使用这些细胞,在芯片上进行实验。两组实验呈现于下文中。在第一组中,直接使用储备培养物(0.2μL-2μL)进行芯片实验。在第二组实验中,将1μL储备培养物连续稀释至最多无限稀释。在这些实验中的每一个中,在生物测定的过程中对细胞和DNA浓度这两者进行测量,从而能够提供定量数据以进行分析。如之前所述对细胞进行定量,同时在(GE健康科学公司(GE Health Sciences))分光光度计上对DNA浓度进行测量。然而,由于所利用的这两种分光光度计的检测限度,对低浓度样品的定量是具有挑战性的,直到完成涉及扩增的生物测定为止,所述扩增使得DNA能够扩增,所述DNA扩增是可容易定量的。使用上述方案在集成芯片上进行以下实验。
[0374] 使用储备细胞培养物鉴定病原体
[0375] 图17A至17D和图18示出了来自第一组实验的结果,其中将不同量的储备培养物连同磁性珠粒溶液(即裂解溶液和包被有链霉亲和素的 磁性珠粒悬浮液)一起加载到芯片的提取室中。向芯片中输入的细胞计数(cfu)来源于所测量的储备物浓度。在如之前的方案中所述,进行细胞裂解以及由珠粒捕获DNA之后,将DNA重悬于2μL的水(无RNA酶)中。然后测量所提取的DNA的浓度,然后添加主混合物(之前所定义的测定)。
[0376] 然后在芯片上在扩增室中进行扩增。
[0377] 最终,在完成扩增之后,再次测量DNA浓度并且推导分子计数和扩增倍数。图17A、17B、17C以及17D示出了芯片上DNA纯化和扩增的结果。这些曲线图示出了:图17A示出了随初始DNA量而变的扩增倍数,图17B示出了随初始DNA量而变的最终DNA量,图17C示出了随初始DNA浓度而变的最终DNA浓度,并且图17D示出了随输入细胞计数而变的所提取的DNA的量。
[0378] 常规的基于凝胶的电泳使得能够验证所得的扩增产物的尺寸是约700bp,如图18中所示以及由初始引物设计所期望。图18中所呈现的结果如下:
[0379] 泳道2:DNA标准梯;
[0380] 泳道4:DH10B细胞扩增的阳性对照(约700bp);
[0381] 泳道5:DH10B细胞扩增的阴性对照;
[0382] 泳道6:DNA标准梯;
[0383] 泳道8:DH10B细胞扩增的阳性对照(约700bp);
[0384] 泳道9:DH10B细胞扩增的阴性对照;泳道10:50bp标准梯。
[0385] 使用细胞培养物的稀释液鉴定病原体
[0386] 图19A至19D和图20示出了来自第二组实验的结果,其中用9μL的水将1μL的储备培养物溶液连续稀释以实现直到少于一个细胞的衍生细胞稀释液。由于基于芯片的方法仅可以容纳非常低的体积(通常是几微升),因此然后将培养物稀释液短暂离心以确保利用稀释液中所有的细胞。然后将这些经过短暂离心的细胞沉淀物添加到10μL的磁性珠粒溶液中并且进行类似于第一组实验的提取处理。
[0387] 如之前所进行,将所提取的DNA重悬于2μL的水中,继而添加约8μL的扩增主混合物。然后在芯片上进行扩增。
[0388] 在扩增之前和之后测量DNA浓度。然后使用数据推导所使用的每一种培养物稀释液样品的DNA浓度和扩增倍数。图19A、19B、19C以及19D示出了芯片上DNA纯化和扩增的结果。这些曲线图示出了:图19A示出了随输入细胞数而变的所测量的DNA分子数,图19B示出了随在扩增之前初始DNA分子数而变的在扩增后最终的DNA分子数,图19C示出了随所测量的初始DNA分子数而变的扩增倍数,并且图19D示出了随理论的初始DNA分子数而变的扩增倍数。
[0389] 使用常规的基于实验室的凝胶电泳以验证所得扩增产物的尺寸是约700bp,如图20中所示。图20中所呈现的结果如下:
[0390] 泳道1:DNA标准梯;
[0391] 泳道3:DH10B细胞扩增的阳性对照(约700bp);
[0392] 泳道5:DH10B细胞扩增的阴性对照;
[0393] 泳道7:DNA标准梯;
[0394] 泳道9:DH10B细胞扩增的阳性对照(约700bp)。
[0395] 结果
[0396] 如从上述扩增实验中的任何一个明显的是,随着初始样品的浓度增加,存在效率的下降(即由扩增倍数所表明)。在其中理论上的限制因素可忽略的理想测定中,应当预期指数扩增。然而,鉴于以下因素的限制,诸如(1)在重复循环之后酶效率损失、(2)缺乏足够的dNTP和引物组、(3)抑制扩增的DNA或引起扩增DNA的不良修复的吸附系数(由芯片上表面积与体积的比率不利地增强),可能难以实现理论扩增水平。仍然,如在第二组实验中所注意到,实现了使用未被污染的输入样品中少到约十二个起始细胞进行的可检测的扩增。
[0397] HIV-1扩增、定量的证实
[0398] 不同于目前被销售用于病毒载量研究的PCR机器,根据本发明的一个实施方案的系统不需要任何离线样品制备并且处理步骤在定制的纳米芯片内是配套的。将生物流体直接施加到所述设备内所含的纳米芯片上。
[0399] 根据本发明的一个实施方案的系统可在非常宽的动态范围内对cDNA、DNA或RNA进行定量。举例来说,在测定灭活的HIV-1cDNA中,样品的HIV-1滴度越高,则检测信号越早上升到高于基线水平。样品的HIV-1滴度越低,则产生可检测量的HIV-1物质所需的扩增循环数越大。检测器信号的出现被报告为临界阈值(Ct)。Ct被定义为检测器信号超过预定的阈值并且开始指数增长期时的分数循环数。更高的Ct值指示更低的初始HIV-1目标物质滴度。
[0400] 图23示出了在根据本发明的一个实施方案的实验中,跨越106个HIV-1至102个HIV-1cDNA分子的稀释系列的目标标准曲线。随着HIV-1物质的浓度增加,标准曲线显示移向更早的循环。因此,最左侧的标准曲线对应于最高的病毒滴度水平,而最右侧的标准曲线对应于最低的病毒滴度水平(图23)。水平蓝线反映了这组实验的Ct值。使用根据本发明的一个实施方案进行的初步研究已经证实了不到50个拷贝至200万个拷贝的起始HIV-1cDNA或RNA分子的HIV检测的动态范围以及使用其它病原体的概念验证,并且研究正在进行中以重复先前使用另一种病原体(大肠杆菌)所实现的单一分子检测水平。在图23的左上角是根据本发明的一个实施方案的原型设备的图片,所述设备小于常规的膝上型计算机。所述设备的放大图在图26中,示出了显示屏2601和隔室2602,其中插入包含用于分析的生物样品的芯片。这种设备的操作系统是用户直观的并且提供无缝功能、以及数据共享和存储的创新性集成能力。图23的数据是在不到一小时内生成的。
[0401] 已经证实的是,根据本发明的一个实施方案的设备以被防护的(armored)HIV-1RNA病毒参考样品为起始物产生用于定量的标准曲线,所述参考样品含有我们的HIV-1RNA病毒序列目标的被精确定量的拷贝数。被防护的RNA对照在广泛的诊断测试中已经变成行业标准,所述诊断测试包括大部分的商业HIV病毒载量测试。
[0402] 与FDA批准的Stratagene PCR机器的面对面直接比较
[0403] 我们已经通过将原型相对于黄金标准定量PCR机器,即Stratagene MX4000进行基准化来进一步证实关于根据本发明的一个实施方案的系统的可行性数据。
[0404] 在图24中,将灭活的HIV-1连续稀释到106个至102个HIV-1cDNA分子范围内的起始量。使用由SYBR荧光产生的标准扩增曲线的阈值循环(Ct)定量病毒载量。再现了这些基于已知的HIV-1病毒浓度的标准曲线。图24显示了传统的PCR机器扩增目标HIV-1的动态范围。水平蓝线反映了这组实验的Ct值。图23(上述)图示了在根据本发明的一个实施方案的系统中具有已知的HIV-1浓度的相同样品。这些数据提供了以下概念验证,即基于Ct、曲线拟合以及动态范围,来自根据本发明的一个实施方案的定量病毒载量数据在原则上等同于Stratagene系统。黄金标准由FDA批准的病毒载量Stratagene机器的尺寸是根据本发明的一个实施方案的系统的约十倍。
[0405] 通过精确定量检测细菌负荷
[0406] 在根据本发明的一个实施方案的系统中测试了常见的细菌性病原体大肠杆菌,显示出1000个拷贝至10,000,000个拷贝的大肠杆菌DNA/微升的检测动态范围(图25A,左侧)。皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)R2=0.9886表明定量循环与DNA拷贝数之间的统计显著性线性拟合,这证实了所述技术的保真性(图25B,右侧)。
[0407] 本文所引用的所有专利、公开的申请以及参考文献的教导以引用的方式整体并入本文。
[0408] 虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出并且描述了本发明,但将由本领域技术人员了解的是,可以在其中作出形式和细节上的各种变化,而不脱离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围。
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