杂化纳米孔及其用于检测分析物的用途
阅读：605发布：2021-04-07
专利汇可以提供杂化纳米孔及其用于检测分析物的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种杂化结构及其设备和用途，所述杂化结构包括具有穿过其的至少一个纳米孔的穿孔的固体基材。，下面是杂化纳米孔及其用于检测分析物的用途专利的具体信息内容。
1.一种杂化结构，所述杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，所述区域选自所述纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域，其中所述至少一个环样多肽与所述纳米孔的结合不同于共价结合，其中所述至少一个环样多肽是稳定蛋白1(SP1)。
2.根据权利要求1所述的杂化结构，其中所述至少一个纳米孔具有在所述固体基材的第一表面处的开口和在所述固体基材的相对表面处的另外的开口，且内表面跨越在第一表面处的开口和在所述相对表面处的另外的开口。
3.根据权利要求1或2所述的杂化结构，其中所述纳米孔具有1nm至20nm的直径。
4.根据权利要求3所述的杂化结构，其中所述纳米孔具有3nm至10nm的直径。
5.根据权利要求1或2所述的杂化结构，其中至少一个纳米孔的直径小于或等于所述稳定蛋白1(SP1)的外径。
6.根据权利要求5所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)位于所述纳米孔在所述固体基材的第一表面处的开口。
7.根据权利要求1或2所述的杂化结构，其中至少一个纳米孔的直径大于所述稳定蛋白
1(SP1)的外径。
8.根据权利要求7所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)位于所述纳米孔的内表面。
9.根据权利要求1所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)是同十二聚体寡聚多肽。
10.根据权利要求1所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)是异十二聚体寡聚多肽。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个是具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的野生型稳定蛋白1(SP1)。
12.根据权利要求11所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个由在NCBI中以GenBank：AJ276517.1储存的多核苷酸SEQ ID NO:8编码。
13.根据权利要求9至10中任一项所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)包含从野生型稳定蛋白1(SP1)的突变。
14.根据权利要求9至10中任一项所述的杂化结构，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个具有由以下的任何一个表示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17。
15.根据权利要求1-2、4、6、8-10和12中任一项所述的杂化结构，其中所述固体基材是无机片材。
16.根据权利要求1-2、4、6、8-10和12中任一项所述的杂化结构，其中所述固体基材是或包括硅、铝、钛、铪、石墨烯、玻璃、石英、金刚石或特氟隆。
17.根据权利要求1-2、4、6、8-10和12中任一项所述的杂化结构，其中所述固体基材是或包括氮化硅(SiN)和二氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、氧化钛(TiO2)、氧化铪(HfO2)或石墨烯。
18.根据权利要求17所述的杂化结构，其中所述固体基材是或包括氮化硅。
19.根据权利要求1-2、4、6、8-10、12和18中任一项所述的杂化结构，所述杂化结构用于制造设备。
20.根据权利要求19所述的杂化结构，其中所述设备包括测量单元。
21.根据权利要求1-2、4、6、8-10、12和18中任一项所述的杂化结构，所述杂化结构用于分析样品中的至少一种分析物。
22.根据权利要求21所述的杂化结构，所述杂化结构用于确定以下的至少一种：(i)所述样品中分析物的存在或不存在、(ii)所述样品中所述分析物的身份、和(iii)所述样品中所述分析物的浓度。
23.根据权利要求1-2、4、6、8-10、12和18中任一项所述的杂化结构，所述杂化结构用于测序核酸分子。
24.根据权利要求1-2、4、6、8-10、12和18中任一项所述的杂化结构，所述杂化结构用于诊断受试者中的状况。
25.根据权利要求1-2、4、6、8-10、12和18任一项所述的杂化结构，所述杂化结构用于监测治疗方案在罹患状况的受试者中的效力。
26.一种自组装的杂化结构，所述自组装的杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，其中所述至少一个环样多肽是稳定蛋白1(SP1)，并且所述区域选自所述纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域。
27.一种用于通过使用杂化纳米孔检测分析物的设备，所述设备包括：
(i)杂化结构，所述杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，所述区域选自所述纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域，其中所述至少一个环样多肽与所述纳米孔的结合不同于共价结合，并且其中所述至少一个环样多肽是稳定蛋白1(SP1)；和
(ii)测量单元。
28.根据权利要求27所述的设备，其中所述至少一个纳米孔具有在所述固体基材的第一表面处的开口和在所述固体基材的相对表面处的另外的开口，且内表面跨越在第一表面处的开口和在所述相对表面处的另外的开口。
29.根据权利要求27或28所述的设备，其中所述纳米孔具有1nm至20nm的直径。
30.根据权利要求29所述的设备，其中所述纳米孔具有3nm至10nm的直径。
31.根据权利要求27或28所述的设备，其中至少一个纳米孔的直径小于或等于所述稳定蛋白1(SP1)的外径。
32.根据权利要求31所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)位于所述纳米孔在所述固体基材的第一表面处的开口。
33.根据权利要求27或28所述的设备，其中至少一个纳米孔的直径大于所述稳定蛋白1(SP1)的外径。
34.根据权利要求33所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)位于所述纳米孔的内表面。
35.根据权利要求27、28、30、32和34中任一项所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)是同十二聚体寡聚多肽。
36.根据权利要求27、28、30、32和34中任一项所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)是异十二聚体寡聚多肽。
37.根据权利要求27、28、30、32和34中任一项所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个是具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的野生型稳定蛋白1(SP1)。
38.根据权利要求37所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个由在NCBI中以GenBank：AJ276517.1储存的多核苷酸SEQ ID NO:8编码。
39.根据权利要求27、28、30、32和34中任一项所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)包含从野生型稳定蛋白1(SP1)的突变。
40.根据权利要求27、28、30、32和34中任一项所述的设备，其中所述稳定蛋白1(SP1)的单体的至少一个具有由以下的任何一个表示的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17。
41.根据权利要求27、28、30、32、34和38中任一项所述的设备，其中所述固体基材是无机片材。
42.根据权利要求27、28、30、32、34和38中任一项所述的设备，其中所述固体基材是或包括硅、铝、钛、铪、石墨烯、玻璃、石英、金刚石或特氟隆。
43.根据权利要求27、28、30、32、34和38中任一项所述的设备，其中所述固体基材是或包括氮化硅(SiN)和二氧化硅(SiO2)、氧化铝(Al2O3)、氧化钛(TiO2)、氧化铪(HfO2)或石墨烯。
44.根据权利要求43所述的设备，其中所述固体基材是或包括氮化硅。
45.根据权利要求27、28、30、32、34、38和44中任一项所述的设备，所述设备包括两个分隔的室。
46.根据权利要求45所述的设备，其中所述杂化结构夹在所述两个分隔的室之间。
47.根据权利要求27、28、30、32、34、38、44和46中任一项所述的设备，所述设备包括电极组件。
48.根据权利要求27、28、30、32、34、38、44和46中任一项所述的设备，所述设备包括电压源。
49.一种用于分析样品中至少一种分析物的方法，所述方法包括：
(i)将包含至少一种分析物或疑似包含至少一种分析物的样品应用在杂化结构上，其中所述杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，所述区域选自所述纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域，其中所述至少一个环样多肽与所述纳米孔的结合不同于共价结合并且其中所述至少一个环样多肽是稳定蛋白1(SP1)，
(ii)允许所述样品流动通过所述纳米孔；
(iii)确定以下的至少一种：(a)所述样品中分析物的存在或不存在、(b)所述样品中所述分析物的身份、和(c)所述样品中所述分析物的浓度。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述样品包含稳定蛋白1(SP1)，且所述杂化结构与步骤(i)平行地形成。
51.根据权利要求49或50所述的方法，所述方法包括监测与所述纳米孔相关的至少一种可测量的参数。
52.根据权利要求51所述的方法，其中使用与所述纳米孔相关的所述至少一种可测量的参数以获得至少一个数据值。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述至少一种可测量的参数是以下的至少一种：
(i)电流的变化、和(ii)电流的变化的持续时间以及其任何组合。
54.根据权利要求49、50和52-53中任一项所述的方法，其中所述分析物是蛋白、神经节苷脂、脂质、磷脂、碳水化合物或核酸。
55.根据权利要求49、50和52-53中任一项所述的方法，其中所述分析物是肽。
56.根据权利要求49、50和52-53中任一项所述的方法，其中所述分析物是寡肽。
57.根据权利要求49、50和52-53中任一项所述的方法，其中所述分析物是多肽。
58.根据权利要求49、50和52-53中任一项所述的方法，其中所述分析物是小分子。
59.根据权利要求54所述的方法，其中所述核酸是双链核酸或单链核酸。
60.根据权利要求54所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
61.根据权利要求54所述的方法，其中所述核酸呈线性构象。
62.根据权利要求49、50、52-53和59-61中任一项所述的方法，其中所述样品选自体液、分离的细胞群和细胞制品。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述体液选自由以下组成的组：血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、羊水、泪液、鼻洗液、粘液、唾液、痰、支气管肺泡液、咽喉洗液、阴道液和精液。
64.一种用于测序核酸分子的方法，所述方法包括：
(i)将包含至少一种核酸分子的样品应用在杂化结构上，所述杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，所述区域选自所述纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域，其中所述至少一个环样多肽与所述纳米孔的结合不同于共价结合，并且其中所述至少一个环样多肽选自是稳定蛋白1(SP1)；
(ii)允许所述样品流动通过所述纳米孔；
(iii)确定所述核酸分子的序列；和
(iv)监测步骤，所述监测步骤包括在预定的时间或时间间隔获得至少一种可测量的参数。
65.根据权利要求64所述的方法，所述方法包括允许所述核酸分子的至少一个核苷酸经由所述纳米孔顺序地从所述纳米孔的一个开口通过至所述纳米孔的相对开口，从而在预定的时间或时间间隔获得至少一种可测量的参数。
66.根据权利要求64所述的方法，其中所述监测步骤包括获得与所述纳米孔相关的至少一种可测量的参数。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述至少一种可测量的参数是以下的至少一种：
(i)电流的变化、(ii)电流的变化的持续时间以及其任何组合。
68.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是单链DNA或单链RNA。
69.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是双链DNA或双链RNA。
70.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述核酸分子呈线性构象。
71.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述核酸分子是被修饰的。
72.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，所述方法包括施加电压。
73.根据权利要求64至67中任一项所述的方法，其中所述样品是体液。
74.根据权利要求1至18中任一项所述的杂化结构用于分析样品中至少一种分析物的用途。
75.根据权利要求1至18中任一项所述的杂化结构用于确定以下的至少一种的用途：
(i)样品中分析物的存在或不存在、(ii)所述样品中所述分析物的身份、和(iii)所述样品中所述分析物的浓度。
76.根据权利要求1至18中任一项所述的杂化结构用于测序核酸分子的用途。
77.根据权利要求1至18中任一项所述的杂化结构在制备用于诊断受试者中的状况的制剂中的用途。
78.根据权利要求1至18中任一项所述的杂化结构在制备用于监测治疗方案在罹患状况的受试者中的效力的制剂中的用途。
杂化纳米孔及其用于检测分析物的用途
技术领域
[0001] 本公开内容涉及包括杂化(hybrid)纳米孔结构的结构和设备及其用途。
[0002] 背景
[0003] 最近，基于纳米孔的分析已作为使得能够在分析物诸如离子、核酸分子、多肽等等的通过纳米孔的转位期间检测并分析其的有希望的工具出现。纳米孔通常分为三个主要的组：(i)合成纳米孔(ii)生物纳米孔和(iii)生物和合成纳米孔的组合。
[0004] Hall AR等人[1]已通过将长DNA分子附接至蛋白将α溶血素插入固态纳米孔。此外，建议以可控方式调控(ratchet)DNA通过纳米孔，所述可控方式例如放置在蛋白纳米孔的入口上的phi29分子马达[2-4]以及通过操作固态纳米孔壁上的电荷分布的静电屏蔽[5-6]。
[0005] WO11130312A1[7]描述了纳米孔设备，所述纳米孔设备包括固相支持体，和通过共价键有效附接至通道的内侧壁表面上的区域的环状分子。
[0006] Khoutorsky A等人[8]和WO2012/160565[9]描述，SP1和其衍生物可用于在活细胞的质膜中产生亲水纳米通道。
[0007] Wang等人2013[10]描述了用于确定短单链核酸序列的包含脂质双层中的SP1纳米孔的系统。
[0008] 参考文献
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[0012] [4]E.A.Manrao,I.M.Derrington,A.H.Laszlo,K.W.Langford,M.K.Hopper,N.Gillgren,M.Pavlenok,M.Niederweis和J.H.Gundlach,Nature Biotechnology,2012,30,349-U174.
[0013] [5]B.Q.Luan,H.B.Peng,S.Polonsky,S.Rossnagel,G.Stolovitzky和G.Martyna,Phys.Rev.Lett.,2010,104.
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[0016] [8]A.Khoutorsky,A.Heyman,O.Shoseyov,ME.Spira.,Nano Lett.2011,11:2901-2904.
[0017] [9]WO2012/160565
[0018] [10]H.Y.Wang,Y.Li,L.X.Qin,A.Heyman,O.Shoseyov,I.Willner,Y T.Long,H.Tian,Chem Commun 2013,49(17):1741-1743..
[0019] [11]WO2002/070647
[0020] [12]WO2004/022697
[0021] [13]WO2007007325
[0022] [14]WO2011/027342
[0023] 发明概述
[0024] 本发明基于一种独特平台的开发，所述独特平台使得能够诊断和测量样品中的化学或生物实体(分析物)的存在、身份和量的一种或更多种。本发明的独特平台是基于在设备的表面区域上制造的合成纳米孔，所述设备被调整用于测量与通过纳米孔的分析物相关的参数。
[0025] 根据本发明，纳米孔装饰有、或掺入了或包含或涂覆了环样多肽诸如SP1多肽以及其任何片段、肽、类似物、同源物和衍生物。环样多肽的中心孔(穴)与纳米孔轴以这样的方式重合和重叠，所述方式形成连接环样多肽的开口面和纳米孔的一个开口的连续通道。包括多肽和纳米孔两者的连续通道在此称为杂化纳米孔。
[0026] 已确定了本发明的杂化纳米孔显示不同于无多肽的裸纳米孔的特性。例如，如在下文中将进一步显示的，已表明与通过裸合成纳米孔的转位速率比较，分析物通过杂化纳米孔的转位速率(时间)较慢。环样结构，例如，SP1在杂化纳米孔中的存在不仅影响转位速率(时间)，而且还影响分析物在转位期间的构象。还发现杂化纳米孔选择性转位单一构象的分析物。
[0027] 因此，参数诸如通过纳米孔的转位速率和分析物构象的控制和微调允许使得能够在材料通过(转位通过)纳米孔期间的优质瞬时分辨的灵敏平台。
[0028] 因此，根据第一方面，本发明提供了一种杂化结构，所述杂化结构包括(a)固体基材，所述固体基材具有穿过其的至少一个纳米孔，和(b)至少一个环样多肽，所述至少一个环样多肽位于所述至少一个纳米孔的区域，所述区域选自纳米孔的开口和所述纳米孔的内部区域。
[0029] 至少一个环样多肽与纳米孔的结合不同于共价结合。在一些实施方案中，至少一个纳米孔在其开口表面处包含至少一个环样多肽。在其他实施方案中，至少一个环样多肽位于纳米孔的内部区域内。
[0030] 根据本公开内容，固体基材是一个或更多个纳米孔位于其中的固体连续材料。基材的厚度限定了纳米孔结构的长度或深度。固体基材以具有第一面或表面和相对面或第二面或表面为特征。在第一和第二面之间的距离限定了基材的厚度和纳米孔结构的长度或深度。
[0031] 换言之，当提及基材的第一面和第二面时，应提及是基材的面(顶端和/或底部)的基材的平面表面。在一些实施方案中，第一表面或面和第二面或面可被认为是平行的表面或基本上平行的表面。
[0032] 纳米孔从一个面到另一个面穿过基材后，基材可称为膜。
[0033] 当提及固体膜时，应注意，它不包括细胞膜或双脂层膜。在一些实施方案中，固体基材是合成的。在一些其他实施方案中，固体基材是无机片材。在一些实施方案中，固体基材包括选自硅、铝、钛、铪、石墨烯、玻璃、石英、金刚石和特氟隆(teflon)的材料。
[0034] 在一些实施方案中，固体基材包括或是掺杂的材料，诸如掺杂的硅或掺杂的金刚石或以上列出的任何材料的掺杂的形式。
[0035] 在一些其他实施方案中，固体基材包括或是未掺杂的材料，如以上列出的。
[0037] 在一些实施方案中，固体基材由氮化硅组成或包括氮化硅。
[0038] 如本文所用术语“纳米孔”表示在如定义的固体基材内存在的孔(穴、开口)。在本公开内容的上下文中，纳米孔可视为各自具有通道(隧道)的三维表示的穿孔，有两个开口在固体基材的相对侧处，其中两个开口通过由高度(长度、深度)限定的内部连接。应注意，在本公开内容的上下文中，纳米孔存在于固体基材内，使得纳米孔开口的一个存在于基材的第一面，且第二开口存在于基材的第二相对面。
[0039] 纳米孔的内部从在第一表面处的一个开口(第一开口)跨越至在相对表面处的开口(第二开口)并连接两个开口。内部可以是开放的内部，允许任何介质，例如，液体介质或任何材料的流通。
[0040] 纳米孔的第一开口和第二开口各自以可以相似或不同的直径为特征。当提及纳米孔的相对面时，注意，两个开口可认为是基本上平行的开口或几乎平行的开口。在一些实施方案中，两个开口同轴定位。
[0041] 在一些实施方案中，纳米孔的每个具有多达约50nm的平均直径；在其他实施方案中，在约1nm至约50nm之间；在另外的实施方案中，在约1nm至约20nm之间；在一些另外的实施方案中，在约2nm至约10nm之间；在一些另外的实施方案中，在约3nm至约8nm之间，且在一些其他实施方案中在约3nm至约5nm之间。
[0042] 在一些实施方案中，跨第一开口和第二开口的纳米孔的内部，具有从约5nm至约50nm的长度；在一些其他实施方案中，从约10nm至约40nm；在一些另外的实施方案中，从约
20nm至约35nm。
20nm至约35nm。
[0043] 纳米孔可钻在固体基材内，或可选地可通过本领域已知的任何可用的方法来制造。纳米孔在固体基材内的制造，可通过以下非限制性实例中的任何一个或更多个来实现：反馈控制的低能量(0.5-5.0keV)惰性气体离子束雕刻，高能(200-300keV)电子束照射。纳米孔的属性诸如例如直径和长度，可通过本领域已知的方法诸如透射电子显微术(TEM)和/或原子力显微术(AFM)来确定。
[0044] 固体基材可包括多个纳米孔。多个纳米孔可以以纳米孔的阵列来排列，其中在阵列中纳米孔以组或模式排列，其中纳米孔的各组或模式在选自纳米孔密度、纳米孔大小、纳米孔深度和纳米孔结构的至少一种参数中是相同的或不同的。例如，对于某些应用，一组纳米孔通常可具有相同的孔径，同时形成另一组纳米孔以具有不同孔径。在其他情况下，可形成纳米孔的每个组以包括具有不同孔径的多个纳米孔。
[0045] 根据一些实施方案，本文描述的杂化结构可被认为是自组装的结构。术语自组装或其任何语言的变化形式表示其中杂化纳米孔结构的组件通过可以施加或可以不施加于该系统以引导组装的力组装为结构(模式)的过程。在一些实施方案中，该过程可被认为是被驱动，而不需要引入外力。在一些其他实施方案中，该过程可使用施加电压。因此，根据本发明的一些实施方案，杂化结构可被认为是自组装的杂化结构。
[0046] 根据本发明采用的环样多肽不限于特定蛋白，并可认为是适合于具有环样形状的任何蛋白/多肽，即，以圆环形状(环样)排列的寡聚多肽(蛋白)，具有中腔(作为内穴)使得其中心符合纳米孔的中心。还选择环样多肽(蛋白)以形成与纳米孔开口或纳米孔内壁的稳定相互作用，并因此被选择与纳米孔区域(开口或内壁)非共价地，直接地或经由具有使得能够结合的官能团的连接物缔合。
[0047] 环样多肽可以具有限定环样结构多肽的外缘的外径和限定内腔(作为内穴)的直径的内径为特征。包含内径的平面本文称为X-Y平面，并因此限定多肽的平面取向。环样多肽还可以具有本文中称为Z轴的高度为特征。根据本公开内容，当沿着X-Y平面观察时，环样多肽以具有对称结构为特征。在一些实施方案中，环样多肽不以具有蘑菇样形状而是甜甜圈样形状为特征。
[0048] 在一些实施方案中，至少一个环样多肽具有约1nm至约10nm之间的内径。在一些其他实施方案中，至少一个环样多肽具有约1nm至约7nm之间的内径。在一些另外的实施方案中，至少一个环样多肽具有约3nm至约4nm之间的内径。
[0049] 在一些实施方案中，至少一个环样多肽具有约8nm至约18nm之间的外径。在一些其他实施方案中，至少一个环样多肽具有约10nm至约15nm之间的外径。在一些另外的实施方案中，至少一个环样多肽具有约11nm至约13nm之间的外径。
[0050] 如本文描述的杂化结构以具有符合或匹配纳米孔直径的至少一个环样多肽的内径为特征，并因此，当沿着Z轴观察时，多肽的内径的中心和纳米孔的直径的中心基本上处于相同位置。
[0051] 至少一个环样多肽在纳米孔的内部的位置由环样多肽的外径和纳米孔的直径之间的平衡所决定。环样多肽可具有大于、等于或小于纳米孔的直径的外径(即，整个多肽的直径本文中称为外缘)。在一些实施方案中，至少一个纳米孔的直径小于或等于至少一个环样多肽的外径。在一些实施方案中，多肽的外径/缘比纳米孔的大，并因此，多肽不能进入纳米孔的内部，而采用在其直径中心同轴定向的构象。
[0052] 在一些实施方案中，至少一个环样多肽位于纳米孔的开口上。结合本公开内容，与多肽缔合的表面(面)是膜的第一表面。这可视为至少一个环样多肽位于纳米孔的第一开口的顶部。
[0053] 在一些实施方案中，至少一个纳米孔的直径大于至少一个环样多肽的外径。在一些实施方案中，至少一个环样多肽可位于纳米孔的内表面内。
[0054] 可选择环样多肽以包含彼此相同(同)或不同(异)的数个单体亚基，一起形成环样结构，例如复合物多肽。多肽可以是包括例如，以同心排列排列的单体亚基的天然同寡聚体或异寡聚体。
[0055] 可根据本发明使用的环样多肽可以是热休克蛋白(HSP)。当细胞暴露于升高的温度和其他应激时，HSP的表达增加。环样多肽可以是例如HSP60、HSP70、HSP90或嗜热菌蛋白酶。
[0056] 在一些实施方案中，环样多肽是稳定蛋白1(SP1)多肽[11-13]。
[0057] SP1的制备、结构修饰(突变)和特性已在以下国际专利申请号中公开：WO2002/070647[11]、WO2004/022697[12]、WO2007/007325[13]和WO2011/027342[14]，和相应美国专利申请，各自通过引用并入本文。
[0058] 本文所用的“SP1”(稳定蛋白1)表示具有环状，还称为“甜甜圈样”形状的同十二聚体寡聚蛋白。SP1多肽天然地定位于植物细胞的细胞质中，并且未在动物例如哺乳动物(人或非人)细胞中发现。SP1具有分布在其表面上的-12个电荷单位的净电荷。
[0059] 当提及SP1时，它可被认为是由可以相同的12个单体组成并因此具有149kDa的分子量。它是非常稳定的(TM～109℃)并认为是沸腾稳定多肽，在水溶液中约95℃下处理至少10分钟后，具有结构寡聚体稳定性，如通过大小分级测定确定的。另外，SP1以变性剂稳定多肽为特征，在包含1:2,000摩尔比(单体:SDS)的水溶液中处理后，具有寡聚蛋白的结构寡聚稳定性，如通过大小分级测定确定的。显示SP1多肽是参与其他蛋白的折叠和解折叠的功能上相关的蛋白。
[0060] 在本公开内容的上下文中，当提及SP1时，应认为包括SP1及其任何片段、肽、变体、类似物、同源物和衍生物。此外，在本公开内容的上下文中，当提及SP1及其任何片段、肽、变体、类似物、同源物和衍生物时，应该认为还包括异十二聚体，即具有不同序列的单体的多肽。
[0061] 应注意，本文中提供的不同的SEQ ID NO限定SP1的一个单体的氨基酸序列或编码SP1的一个单体的核苷酸序列。
[0062] 在一些实施方案中，SP1是野生型多肽(其单体在例如[14]中作为SEQ ID NO:4公开；本文中称为SEQ ID NO:1)或例如，在文献[11-14]的任何一个中公开的其任何片段、肽、变体、类似物、同源物和衍生物，每个通过引用并入本文。在一些实施方案中，SP1多肽是野生型多肽(其单体在例如[14]中作为SEQ ID NO:4公开；本文中称为SEQ ID NO:1)或其任何衍生物(例如，在文献[11-14]的任何一个中公开的，每个通过引用并入本文)。
[0063] 应该理解，在某些实施方案中，SP1蛋白是指如由SEQ ID NO：1表示的SP1多肽。如贯穿本文所指出的，这是指SP1的一个单体的序列。具体地，SP1蛋白包含如标示为GenBank登录号AJ276517.1的108个氨基酸残基的一个单体的氨基酸序列。
[0064] 在某些实施方案中，SP1多肽包含如由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列MATRTPKLVKHTLLTRFKDEITREQIDNYINDYTNLLDLIPSMKSFNWGTDLGAELNRGYTHAFESTFESKSGLQEYLDSAALAAFAEGFLPTLSQRLVIDYFLY。
[0065] 在一些实施方案中，SP1多肽是由在NCBI中以GenBank:AJ276517.1储存的多核苷酸(SEQ ID NO:8)编码的多肽。
[0066] 在一些实施方案中，SP1多肽是野生型SP1多肽(SEQ ID NO:1)。
[0067] 如本领域技术人员可理解，多肽的遗传修饰是常见的实践，并包括编码各自多肽的多核苷酸中的突变，使得核苷酸序列中的选择性突变将导致期望的氨基酸突变。本文所指的SP1多肽的任何突变是基于野生型多肽的突变。多肽中的突变可包括至少一个氨基酸的取代(突变)、至少一个氨基酸的缺失或至少一个氨基酸的添加。因此，根据本发明使用的多肽可选自野生型SP1多肽、半胱氨酸突变的/取代的/添加的SP1多肽，组氨酸突变的/取代的/添加的SP1多肽和甲硫氨酸突变的/取代的/添加的SP1多肽。
[0068] 本发明的某些实施方案包含SP1多肽及其任何片段、肽、类似物、同源物和衍生物。应当理解，这样的肽(多肽)或氨基酸序列优选地是分离的和纯化的分子，如本文所定义。术语“纯化的”或“分离的”是指从它们的天然环境中移出、分离或分开的分子，诸如氨基酸序列或肽。因此“分离的肽”是纯化的氨基酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含、优选至少75％不含、且更优选至少90％不含与它们天然缔合的其他组分。如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”还指从样品中除去污染物。
[0069] 如本文所用的术语“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸残基。多肽序列通常从包含游离氨基基团的N-末端至包含游离羧基基团的C-末端报告。
[0070] 更具体地，“氨基酸分子”、“氨基酸序列”或“肽序列”是以其中通过肽键连接的氨基酸残基位于肽和蛋白中的链的顺序。序列通常从包含游离氨基基团的N-末端至包含酰胺的C-末端报告。如果它表示蛋白的一级结构，氨基酸序列通常称为肽、蛋白序列，然而人们必须分清术语“氨基酸序列”或“肽序列”和“蛋白”之间的差别，由于蛋白定义为折叠成特定三维构象的氨基酸序列并且其通常已经历了翻译后修饰，诸如磷酸化、乙酰化、糖基化、甘露糖基化、酰胺化、羧化、巯基键形成，切割等。
[0071] 如本文所用，氨基酸是指天然存在的和合成的氨基酸，以及其以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基基团、氨基基团、和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。氨基酸在本文中可通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的它们的通常已知的三字母符号，或通过单字母符号提及。
[0072] 应注意，除了本文包括的SP1衍生的片段或肽的任一种以外，本发明还包括SP1多肽的任一种的任何衍生物、类似物、变体或同系物。术语“衍生物”用于定义具有对氨基酸序列(多肽)的任何插入、缺失、取代和修饰的氨基酸序列(多肽)。在一些实施方案中，这些不改变原始多肽的活性。术语“衍生物”还指其同系物、变体和类似物，以及根据本发明制备的多肽的共价修饰形式。
[0073] 在一些实施方案中，SP1多肽包含另外的组氨酸残基(SEQ ID NO:2)并由具有序列SEQ ID NO:9的多核苷酸编码。更具体地，SP1多肽包含如SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列MHHHHHHATRTPKLVKHTLLTRFKDEITREQIDNYINDYTNLLDLIPSMKSFNWGTDLGMESAELNRGYTHAFESTFESKSGLQEYLDSAALAAFAEGFLPTLSQRLVIDYFLY。如此，本文描述的6His-SP1衍生物对应于SEQ ID NO:2。
[0074] 在另外的实施方案中，SP1多肽是野生型SP1的同源变体。同源变体可包含例如野生型SP1的N-末端区中的氨基酸的缺失。
[0075] 在一些实施方案中，SP1多肽是具有N-末端区域中的氨基酸的缺失的多肽。具有SEQ ID NO:3的该变体SP1多肽由具有序列SEQ ID NO:10的多核苷酸编码。
[0076] 在一些实施方案中，SP1多肽包含氨基酸至半胱氨酸的突变。这样的多肽的非限制性实例包括：SEQ ID NO:4(由具有序列SEQ ID NO:11的多核苷酸编码)；SEQ ID NO:5(由具有序列SEQ ID NO:12的多核苷酸编码)；SEQ ID NO:6(由具有序列SEQ ID NO:13的多核苷酸编码)；和SEQ ID NO:7(由具有序列SEQ ID NO:14的多核苷酸编码)。
[0077] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:11表示的多核苷酸编码的多肽。
[0078] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:12表示的多核苷酸编码的多肽。
[0079] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:13表示的多核苷酸编码的多肽。
[0080] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:14表示的多核苷酸编码的多肽。
[0081] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:15表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:16表示的多核苷酸编码的多肽。
[0082] 在一些实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:15表示的氨基酸序列MRKLPDAATRTPKLVKHTLLTRFKDEITREQIDNYINDYTNLLDLIPSMKSFNWGTDLGMESAELNRGYTHAFESTFESKSGLQEYLDSAALAAFAEGFLPTLSQRLVIDYFLY。
[0083] 在一些其他实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列。在一些另外实施方案中，SP1多肽是由SEQ ID NO:18表示的多核苷酸编码的多肽。
[0084] 在一些实施方案中，SP1多肽包含如SEQ ID NO:17表示的氨基酸序列MRKLPDAATRTPKLVKHTLLTRFKDEITREQIDNYINDYTNLLDLIPSCKSFNWGTDLGMESAELNRGYTHAFESTFESKSGLQEYLDSAALAAFAEGFLPTLSQRLVIDYFLY。
[0085] 在本公开内容的上下文中，对任何一个SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的任何提及，视为提及十二聚体SP1多肽的一个单体。另外，当提及由SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18表示的序列时，应视为提及编码十二聚体SP1多肽的一个单体的多核苷酸。
[0086] 可遗传操作SP1以包括12个单体，其中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个单体是相同或不同的。在一些实施方案中，单体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或至少12个独立地选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:17。
[0087] 根据本发明应用的多肽可合成地或通过重组DNA技术来产生。用于产生多肽肽类的方法是本领域中熟知的。
[0088] 在一些实施方案中，SP1衍生物包括但不限于其整体序列与本文定义的多肽(根据本发明的SP1蛋白或由其衍生的任何片段或肽)在一个或更多个氨基酸中不同的多肽，具有缺失、取代、倒位或添加的多肽。
[0089] 在一些实施方案中，衍生物是通过氨基酸残基的插入与本发明中具体定义的多肽不同的多肽。应理解，术语“插入”或“缺失分别意指1个至50个氨基酸残基之间、20个至1个氨基酸残基之间、且具体地在1个至10个氨基酸残基之间的氨基酸残基向多肽的任何添加或从其缺失。插入或缺失可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸中的任何一个，并可发生在修饰的肽的任何位置上，以及其N'或C'末端的任何一个中。
[0090] 本发明的肽可全部带正电、带负电荷或是中性的。另外，它们可呈二聚体、多聚体的形式或呈受限的构象，其可通过内部桥、短程环化、延伸或其他化学修饰形式来实现。
[0091] 本发明的多肽可通过它们的任何残基与另一个肽或试剂偶合(缀合)。例如，本发明的多肽可通过它们的N-末端与月桂酰-半胱氨酸(LC)残基偶合和/或通过它们的C-末端与半胱氨酸(C)残基偶合。
[0092] 此外，肽可在其N-末端和/或C-末端处用各种相同或不同的氨基酸残基来延伸。作为这样的延伸的实例，肽可在其N-末端和/或C-末端处用可以是天然存在或合成的氨基酸残基的相同或不同的氨基酸残基来延伸。这样的延伸的另外的实例，可由在其N-末端和/或C-末端两处用半胱氨酸残基延伸的肽提供。自然地，由于起因于二硫键的形成的Cys-Cys环化，这样的延伸可导致受限的构象。另一个实例可以是N-末端赖氨酰-棕榈酰尾部的掺入，赖氨酸用作连接物且棕榈酸作为疏水性锚点。另外，肽可通过可以是天然存在或合成的氨基酸残基的芳族氨基酸残基来延伸，例如，特定的芳族氨基酸残基可以是色氨酸。肽可在其N-末端和/或C-末端用各种相同或不同的不是天然存在或合成的氨基酸的有机部分来延伸。作为这样的延伸的实例，肽可在其N-末端和/或C-末端用N-乙酰基基团来延伸。
[0093] 对于本文定义的每个单一的肽，本发明包括相应的逆-反向(retro-inverse)序列，其中肽链的方向已反转并且其中所有氨基酸属于D-系列。
[0094] 本发明还包括根据本发明通过它们的氨基酸序列明确定义的多肽(SP1蛋白或其任何片段或肽类)的任何同系物。术语“同系物”用于定义保持了与由本发明定义的氨基酸序列的最低同源性的氨基酸序列(多肽)，例如，优选地与如以上在结构方面定义的多肽的任何一个、例如特定的序列的氨基酸序列具有至少约65％，更优选地至少约75％，甚至更优选地至少约85％，最优选地至少约95％的整体序列同源性的氨基酸序列，更具体地，如由以下的任何一个表示的多肽的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17。
[0095] 更具体地，关于天然多肽和其功能性衍生物的“同源性”在本文定义为，在比对序列且如果必要引入缺口以达到最大同源性百分比后，候选序列中与相应天然多肽的残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分。N-末端延伸和C-末端延伸以及插入或缺失都不应解释为减少同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域已知的。
[0096] 在一些实施方案中，本发明还包括在本发明中通过它们的氨基酸序列被明确定义的多肽的变体或类似物的多肽。关于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对肽、多肽或蛋白序列的单独的取代、缺失或添加从而改变、添加或缺失编码的序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸，是“保守地修饰的变体”，其中改变导致用化学上相似的氨基酸取代氨基酸。
[0097] 提供功能上相似的氨基酸的保守取代表格是本领域熟知的。这样的保守修饰的变体是本发明的多态变体(polymorphic variant)、种间同系物、和等位基因和类似肽的附加的，并不排除本发明的多态变体、种间同系物、和等位基因和类似肽。
[0098] 例如，可进行其中脂肪族氨基酸(G、A、I、L或V)被该组的另一个成员取代的取代、或诸如一个极性残基取代另一个的取代，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺。以下八组的每个包含是彼此的保守取代的其他示例性氨基酸：
[0099] 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
[0100] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
[0101] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
[0102] 4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
[0103] 5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
[0104] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
[0105] 7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
[0106] 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。
[0107] 更具体地，氨基酸“取代”可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸代替一个氨基酸的结果，即，保守的氨基酸代替。氨基酸取代可基于参与的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质中的相似性来做出。例如，非极性“疏水性”氨基酸选自由以下组成的组：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、丙氨酸(A)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)；“极性”氨基酸选自由以下组成的组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；“带正电荷的”氨基酸选自由以下组成的组：精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)；且其中“酸性”氨基酸选自由以下组成的组：天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)。
[0108] 根据本发明的多肽的任何一个，例如由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17表示的多肽的任何一个的指定的序列的衍生物可在它们的大小方面变化并可包括全长多肽或其任何片段。在某些实施方案中，多肽可以包含一个或更多个氨基酸残基替代物。如本文定义的“氨基酸残基替代物”是用于制备肽的重要功能结构域的模拟物的氨基酸残基或肽。
[0109] 氨基酸替代物的实例包括但不限于：氨基酸的化学修饰形式和衍生物、天然存在的氨基酸的立体异构体和修饰形式、非蛋白氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶促修饰的氨基酸等。实例还包括肽的二聚体或多聚体。氨基酸替代物还可包括在氨基酸的侧链部分所做的任何修改。因此，这包括天然存在的氨基酸中存在的侧链部分、修饰的天然存在的氨基酸中的侧链部分，所述修饰的天然存在的氨基酸诸如糖基化氨基酸。它还包括天然存在的蛋白氨基酸的立体异构体和修饰形式、非蛋白氨基酸、翻译后修饰的氨基酸、酶促合成的氨基酸、衍生的氨基酸、设计为模拟氨基酸的构建体或结构等中的侧链部分。
[0110] 应理解，本发明还包括任何肽、其任何替代物、其任何盐、碱、酯或酰胺、其任何对映体、立体异构体或非对映异构体，或其任何组合或混合物。药学上可接受的盐包括本发明的化合物中存在的酸性基团或碱性基团的盐。药学上可接受的酸加成盐包括，但不限于，盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐，异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐。本发明的某些化合物可与各种氨基酸形成药学上可接受的盐。合适的碱性盐包括，但不限于，铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌和二乙醇胺盐。
[0111] 应注意，本发明还包括模拟本发明的多肽，即SP1及其任何片段或肽的任何模拟肽化合物。当提及模拟肽时，意思是模拟特定天然肽的构象和期望的特征但避免不期望的特征例如柔性和键断裂的化合物。从化学角度来看，模拟肽可具有不含任何肽键的结构；然而，由于其化学性质而不是由于化学结构，该化合物是模拟肽。模拟肽(肽和非肽基类似物)可具有改进的性能(例如，减少的蛋白水解、增加的保留或增加的生物利用度)。应注意，模拟肽可具有或可不具有相似的二维化学结构，但共享共同的三维结构特征和几何形状。每个模拟肽还可具有一个或更多个独特的另外的结合元件。
[0112] 如本文定义的杂化纳米孔结构可通过包括以下的过程来制备：在允许在所述至少一个纳米孔的轮缘开口处或所述至少一个纳米孔的内部区域中放置所述至少一个环样多肽的条件下，使具有穿过其的至少一个纳米孔的固体基材与至少一个环样多肽接触。
[0113] 在一些实施方案中，杂化结构通过自组装而形成。在一些实施方案中，杂化结构的形成通过施加电压来驱动。
[0114] 如本文以下的实施例2中以及具体地在图2A中所示，SP1向固体基材中的添加导致了将SP1捕获在纳米孔轮缘上，如由明显的三个峰所示的。此外，如图2B至2D中所示，发现了SP1的布置在基本上与纳米孔平面方向平行的方向。发现了SP1在纳米孔中的捕获(涂覆)是可逆的并取决于所施加的极性。
[0115] 如实施例2中具体地在图2G和2H中另外所示的，SP1在纳米孔中的捕获可受到SP1特性的影响。例如，发现了SP1的不同衍生物具有不同的捕获行为。具体地，在SP1突变体SiSP1中，需要较低电压以在纳米孔中捕获多肽。
[0116] 杂化结构可以是设备(例如电子设备)的一部分。电子设备可以包括测量单元。
[0117] 因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种设备，所述设备包括(i)如本文定义的杂化结构和(ii)测量单元。
[0118] 根据一些实施方案，将杂化结构放置在设备内，使得它可分离两个室。两个室可单独地保持在适当的位置。在一些实施方案中，并如本文以下所述，两个室可仅通过电解质溶液电力地连接。如本文所述的室可通过本领域已知的适合于这样的目的的任何常规材料来制备。非限制性实例包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、塑料、特氟隆和任何已知的绝缘固体材料。在一些实施方案中，室包含电解质溶液。
[0120] 如上指出，至少一个环样多肽并不限于任何多肽且可以是例如SP1，如本文所定义。在一些实施方案中，配置设备使得两个分隔的室的一个的底部面向(与之连接，触及)第一表面(具有SP1)并包含第一表面中的纳米孔的开口。在一些实施方案中，这称为顺式室(或顺式容器)。
[0121] 在一些实施方案中，面向第一表面的室具有在约1nm至10nm之间的开口；在一些其他实施方案中，在约2nm至约5nm之间；在一些另外的实施方案中，在约3nm至约4nm之间。开口在杂化结构的顶部，使得它覆盖纳米孔直径。室中的开口可呈任何形状，例如漏斗形孔。室中的开口可与杂化纳米孔通过本领域任何已知的方法，例如通过光学显微镜对准。
[0122] 在一些其他实施方案中，两个分隔的室的一个的顶部面向(与之连接，触及)第二相对面并包含纳米孔在第二表面中的开口。在一些实施方案中，这称为反式室(或反式容器)。
[0123] 在一些实施方案中，且特别当室填充有电解质溶液时，可允许溶液经由纳米孔的内部从第一开口流动至第二开口通过纳米孔。因此，两个单独的室以液体或气体连通。
[0124] 在一些实施方案中，设备包括使得能够改变样品溶液的微流体系统。在一些实施方案中，设备包括冷却-加热系统，以控制设备的温度。设备中使用的这些系统和任何另外的系统可手动或由计算机控制。在一些又其他实施方案中，且为了减少可能的噪声，设备可放置在法拉第笼内且甚至在隔振台的顶部。
[0125] 根据本公开内容的设备包括测量单元。测量单元适于测量通过纳米孔的离子电流。在一些实施方案中，离子电流由相同单元产生并测量。在一些其他实施方案中，需要不同单元生成并测量电流。在一些实施方案中，单元可以是电压源、膜片钳系统。在一些实施方案中，产生和/或测量单元可以进一步配备有放大器和/或低通滤波器和/或数字化仪。
[0126] 在一些实施方案中，测量单元包括计算机可读系统。
[0127] 当样品放置在接近纳米孔或可选地在顺式室中且条件是允许样品通过纳米孔时，包括该结构的杂化结构和设备可用于分析样品。本文确定了本文描述的杂化纳米孔监测分析物转位的灵敏度和特异性。
[0128] 通常且如本文所示，当施加电压至杂化纳米孔且邻近纳米孔或在顺式室中无分析物存在时，可测量表示开放孔电流的稳定离子电流。
[0129] 当接近纳米孔或向接近纳米孔的顺式室中加入分析物时，分析物可通过纳米孔到纳米孔(膜)的另一侧，有时可以是反式室。此外，分析物可接近纳米孔的一个开口存在。当分析物接近(即不在内部)或在纳米孔内(在内部)存在时(本文以下还称为监测步骤)，纳米孔中的离子流的部分被改变，引起离子电流中的可检测变化。变化可以是电流的增加或电流的阻塞。这个信号(瞬时)可取决于不同的参数，例如纳米孔、电解质溶液、和通过分子的性质。因此，杂化纳米孔提供了用于样品分析的基本工具。
[0130] 因此，本公开内容根据它的另外的方面提供了用于分析样品中的至少一种分析物的方法，包括：(a)将包含至少一种分析物或疑似包含至少一种分析物的样品应用在杂化结构上，其中杂化结构如本文定义。根据本公开内容多肽是SP1多肽。下一步骤(b)包括允许样品流动通过纳米孔。在随后的步骤(c)中，进行确定以下的至少一种：(i)样品中分析物的存在或不存在、(ii)样品中分析物的身份、和(iii)样品中分析物的浓度。
[0131] 根据本文描述的方法，包含至少一种分析物或疑似包含至少一种分析物的样品可与SP1混合，并然后施加到固体纳米孔。
[0132] 方法可还包括监测与纳米孔相关的至少一种可测量的参数，所述可测量的参数可尤其指示分析物通过孔并因此允许确定步骤(c)。
[0133] 在一些实施方案中，至少一种可测量的参数是化学或物理参数。在一些另外的实施方案中且如本文以下详述，至少一种可测量的参数是光学参数。在一些实施方案中，可测量的参数是电信号。
[0134] 当分析物接近或在杂化纳米孔中时，可获得数种可测量的参数。在一些实施方案中，可检测到电流(或电流值)的变化。
[0135] 如本文所使用，“电流值的变化”可通过将观察到的电流与在较早时间点下例如在样品不存在时测量的电流比较，并确定两次测量之间的值的比率来确定(测量)。电流的变化可以是电流的阻塞或增加。在一些实施方案中，可观察到电流中的阻塞(下降)并例如，随后与在先的测量结果比较。
[0136] 在一些实施方案中，电流的变化可表示为，开放纳米孔电流、开放通道电流的分数或百分比，I/Io，其中I是阻塞电流且Io是开放通道电流(例如，在未检测到分析物的情况下)。在一些实施方案中，如以上指出的电流阻塞可指示分析物存在于接近杂化纳米孔的区域或在纳米孔结构内，例如在通过杂化纳米孔通道期间。
[0137] 在一些实施方案中，电流的变化可定义为具有可测量的持续时间的事件。电流的变化的持续时间或可测量的或观察到的或检测到的事件的持续时间，是指在其间电流中的变化发生的时间段。在一些实施方案中，变化(事件)的测量的时间可反映如本文定义的样品或分析物通过杂化结构的转位时间(通过)。
[0138] 在一些实施方案中，在其间电流的变化发生的时间段，可确定为当观察到第一电流变化(增加或阻塞)的时间点与当捕获或进一步改变了变化的稍后时间点之间的时间差。在一些实施方案中，测量时间段直到观察到电流中阻塞或增加的进一步变化。这通常可经设置超过基线噪声水平的阈值确定。
[0139] 在一些实施方案中，变化的持续时间可拟合为高斯函数。在一些实施方案中，变化的持续时间可拟合为指数与时间常数。
[0140] 在一些其他实施方案中，事件由瞬时峰值(指示可测量的电流中一种或更多种变化)表示。在一些其他实施方案中，可确定电流的变化事件的频率。
[0141] 在一些实施方案中，如本文所述的事件积分可通过计算离子电流经事件的持续时间的积分来确定。
[0142] 在一些实施方案中，至少一种可测量参数是以下的至少一种：(i)电流的变化、和(ii)电流的变化的持续时间以及其任何组合。
[0143] 当提及电流时，应注意，包括与固体膜的表面平行的方向上的电流；或垂直于表面的隧道效应电流。
[0145] 在一些实施方案中，至少一种测量的参数可用于获得与至少一种参数相关的至少一个数据值。
[0146] 在一些实施方案中，该方法包括将至少一种可测量的参数和/或至少一个数据值与预定的标准对应参数和/或对应数据值比较。这可通过参考已知的测量或实验来完成，其中在应用待测试的样品之前没有进行测量。
[0147] 在一些其他实施方案中，该方法包括将至少一种可测量的参数和/或至少一个数据值与在应用样品前在样品的不存在下的对照研究中获得的相应参数和/或相应数据值比较。
[0148] 如本文所用的术语“比较”指样品中获得的至少一种可测量参数和/或至少一个数据值的任何检查，如贯穿本文详细说明的，以发现至少两个不同样品之间的相似性或差异。应注意，根据本发明的比较包括使用基于计算机的方法的可能性。
[0149] 本文公开的本方法还包括在应用待测试的样品至杂化结构之前进行的步骤。在一些实施方案中，该方法还包括用电解质溶液填充两个分隔的室，顺式室和反式室。在一些实施方案中，溶液是标准的溶液，例如包含1M KCl TE(10mM tris和1mM EDTA在pH 7.4)的缓冲溶液。在一些其他实施方案中，在用电解质溶液填充室之后，进行纳米孔的初始测试，例如，诸如，纳米孔导电率测试。在一些另外的实施方案中，这些初始测量可用于确定与纳米孔相关的至少一种可测量的参数，以可能地确定在样品的不存在下获得的数据值。在一些另外的实施方案中，施加电压至电极，且纳米孔的电流在样品的不存在下确定，以获得开放通道电流(本文中还称为开放纳米孔电流)。
[0150] 结合本公开内容，将样品应用在杂化纳米孔上。样品的应用可以是通过本领域已知的任何方法，例如，浇注、注射等等，使得样品能够接近和物理接触纳米孔的一个开口。
[0151] 在一些实施方案中，将样品应用在杂化纳米孔上，如此将样品应用至包含SP1多肽的纳米孔的开口。在一些具体的实施方案中，将样品应用在杂化纳米孔在膜的第一表面内的第一开口上。
[0152] 在一些实施方案中，将包含SP1的样品应用在纳米孔(没有SP1或具有部分SP1的涂层)上。在一些具体的实施方案中，将样品应用在纳米孔在膜的第一表面内的第一开口上。
[0153] 然后允许样品通过纳米孔。在本公开内容的上下文中，样品通过纳米孔使得能够测量与纳米孔相关的至少一种可测量的参数。在一些实施方案中，至少一种可测量的参数可以是至少一种物理或化学性质。在一些实施方案中，至少一种可测量的参数可以是至少一种光学性质。
[0154] 不受限于理论，提出，如果分析物存在于样品中，它将引起测量的参数(可测量的参数)的至少一种中的变化。此外，且不受限于理论，如果分析物不存在于样品中，不引起至少一种参数中的变化。更具体地，不检测到电流中的变化。
[0155] 通常，当使用时，术语至少一种参数的“变化”或“差异”涉及至少一种参数的增大或减小，如本文所述。更具体地，当与对照测量中的相应电流(有时是开放的纳米孔电流)比较，电流减少了至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、
29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
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400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。
29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
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400％、500％、600％、700％、800％、900％或约1000％。
[0156] 在一些实施方案中，方法通过与对照测量比较提供了定性(是＝存在，否＝不存在)的结果，如本文所述。应理解，在测定的上下文中，术语“不存在”还包括分析物以低于方法的检测极限的量的存在。
[0157] 根据本发明的“样品”可以是任何样品，包括但不限于，从生物系统(包括细胞培养物、微生物培养物)获得的生物样品、从受试者(包括人和动物)获得的生物样品、从环境获得的样品例如土壤样品、水样品、农业样品(包括植物和农作物的样品)、食物样品。术语“样品”还可包括体液，诸如全血样品、血细胞、骨髓、淋巴液、血清、血浆、尿液、痰、唾液、粪便、精液、脊髓液或CSF；皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物；泪液；乳汁；任何人的器官或组织；任何活检，例如淋巴结或脾活检；从任何组织或组织提取物所取得的任何样品；通过灌洗任选地乳腺导管系统获得的任何样品；多种渗出液；体外或离体细胞培养物和细胞培养物成分的样品。
[0158] 在一些实施方案中，样品是液体样品。在一些实施方案中，液体样品是在其天然状态中的液体。在一些另外的实施方案中，液体样品被预处理呈液体状态。预处理可以是通过将在其天然状态中不是液体的样品转换为液体状态的任何方法。在一些实施方案中，预处理是通过提取。在一些其他实施方案中，样品包括至少一种液体级分。
[0159] 取决于具体方法和待获得的结果，在本发明的上下文中的样品可在体外设置中分析之前进行制备，且不一定获自受试者。
[0160] 如本文所用的术语“分析物”是指可在样品中发现并需要检测或定量的分子或离子。在一些实施方案中，样品可包含能够在通过纳米孔(或杂化纳米孔)之前或期间结合至分析物的结合剂。在本文所用的术语“结合剂”是指能够特异性结合至分析物的任何分子，例如适体、抗体、受体配体或分子印迹聚合物。
[0161] 在一些实施方案中，分析物可以是蛋白、多肽、肽、神经节苷脂、脂质、磷脂、碳水化合物、小分子或核酸。
[0163] 在一些实施方案中，分析物是癌症(或肿瘤)标志物或病毒标志物(或其任何片段)。通常，肿瘤标志物可发现于体液诸如血液或尿液，或身体组织中。肿瘤标志物可表达或过表达于癌症，并且通常指示特定疾病进程。
[0164] 在一些实施方案中，分析物是核酸。
[0165] 在一些实施方案中，分析物可被修饰。在一些实施方案中，分析物可缀合(化学地)至可以是能够产生可检测信号的任何化合物的部分。该部分可以是例如发色团、荧光团或发光团。在一些其他实施方案中，至少一种可测量的参数可以是光学信号。如所理解的，碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)底物检测可通过可使用各种分光光度计和荧光计检测的发色信号、荧光信号或发光信号来实现。
[0166] 根据本发明和如以下本文所公开的，分析物可以是核酸分子，且在本公开内容的一些实施方案中是修饰的核酸分子。
[0167] 如本文实施例3中所示，ds-DNA转位通过纳米孔。有趣地，与裸纳米孔(无SP1)比较，通过杂化纳米孔的ds-DNA采用线性构象。另外有趣地发现，与裸纳米孔比较，通过纳米孔的转位减慢，如由较长停留时间指示的。
[0168] 不受限于理论，表明在SP1的内孔中存在的正电荷可与当转位通过它时的带负电荷的DNA静电地相互作用并因此减慢DNA转位。在先研究表明，发现通过这种杂化结构的DNA转位与当α-溶血素埋设在较不稳定脂质双层中时相同。即，未观察到杂化纳米孔的优势。因此，此处显示的结果是优于现有技术中发现的数据。
[0169] 本文出人意料地显示的对很少核苷酸/毫秒的转位瞬时分辨率的改进是有高度优势的，并为使用具有SP1的杂化纳米孔用于核酸测序的新平台做准备。此外，本文公开的杂化纳米孔对线性构象的选择性对于测序转位的核苷酸几乎是必需的。
[0170] 因此，根据另一个方面，本公开内容提供了用于测序核酸分子的方法，包括：(a)将包含至少一种核酸分子的样品应用于杂化结构上，并确定核酸分子的序列。
[0171] 如本文所用，“核酸”可与术语“多核苷酸”互换使用并通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA或其任何组合。“核酸”包括但不限于，单链核酸和双链核酸。
[0172] 如本文所用，术语“核酸”还包括可包含一个或更多个修饰的碱基的DNA或RNA，如本文所述。因此，具有为了稳定性或为了其他原因修饰的骨架的DNA或RNA是“核酸”。术语“核酸”，如其在本文中所用的，包括此类化学、酶促或代谢修饰的形式的核酸，以及病毒和细胞包括例如简单的和复杂的细胞的典型的DNA和RNA的化学形式。“核酸”或“核酸序列”还可包括单链或双链RNA或DNA的区域或任何组合。
[0173] 在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些其他实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是双链(ds)核酸。在一些其他实施方案中，核酸是单链(ss)核酸。
[0174] 当提及至少一个核酸分子的测序时，应注意，该分子可以是ds-DNA、ss-DNA、ds-RNA或ss-RNA。核酸可以是合成的分子或可选地从任何生物样品、食物样品等获得的核酸分子，如本文所述。在一些实施方案中，被分析的核酸呈线性构象。在一些另外的实施方案中，核酸是非结构化核酸。
[0175] 如本文所指出的，核酸可以是修饰的核酸。在一些实施方案中，核酸分子包含2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷，和吡咯并嘧啶。根据一些其他实施方案，核酸分子可附接至荧光部分。根据一些另外的实施方案，核酸是被生物素化的。如所理解的，如本文所述，核酸的修饰可以是通过共价键合。术语“缀合”、“缔合”、“连接”、“相互作用”可互换使用以表示两个化学实体之间的键合。键合可以是例如共价结合、氢键结合、静电结合、疏水相互作用等。
[0176] 在一些实施方案中，核酸分子的构象可通过电流的阻塞进行评价。如本文所示，以线性构象的核酸的转位具有不同于各种构象的转位的独特模式。
[0177] 在一些其他实施方案中，碱基(本文还称为核苷酸)数或DNA分子的大小可从事件的积分面积来估计。在一些另外的实施方案中，线性核酸分子可用作标志物。
[0178] 在本公开内容的上下文中，核酸构象和核酸大小的评价可例如通过记录来自已知核酸(梯状物)分子的事件，洗涤已知分子并添加测试的分子来确定。
[0179] 如所理解的，修饰的核酸的检测可以例如通过光学手段诸如荧光。
[0180] 在一些实施方案中，如果核酸是ss-DNA或ss-RNA，互补链可在通过纳米孔之前或期间形成。在这样的实施方案中，该方法还包括提供合适的酶诸如聚合酶或外切核酸酶。
[0181] 核酸分子的测序包括确定核苷酸(本文还表示为碱基)在核酸分子内的精确顺序，即，确定四种碱基的顺序：DNA链中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，或RNA链中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。
[0182] 在本公开内容的上下文中，测序方法包括，使核酸分子以连续核苷酸-接-核苷酸转位从一个开口至相对开口通过纳米孔。每个核苷酸的信息在监测步骤中单独监测。在一些实施方案中，监测步骤包括：确定与核苷酸相关的至少一种可测量参数以可能地获得数据值。至少一种可测量的参数和/或至少一个数据值可指示核苷酸。至少一种可测量的参数和/或数据值还与相应的预定标准参数和/或相应的数据值或从对照核苷酸获得的相应的预定标准参数和/或相应的数据值比较。
[0183] 在一些实施方案中，将在各监测步骤中获得的至少一种可测量参数和/或数据值与对照样品中核苷酸的预定标准参数或数据值比较。计算了在各监测步骤中获得的至少一种参数或数据值与对照样品中对不同核苷酸的任何一个获得的至少一种参数或数据值的相似性以确定在核酸分子内的核苷酸。相似性的程度指示核酸分子中的特定核苷酸的存在。
[0184] 如此，根据一些实施方案的方法通过提供分析物的身份且在一些实施方案中核酸分子内特定核苷酸的身份的分析，提供了定性测试。
[0185] 在另一个方面，本发明提供了用于诊断受试者中状况的方法，所述方法包括使用如以上所述的根据本发明的分析方法。在一些实施方案中，分析物是与状况相关的分析物且其中分析物的存在或不存在指示状况在受试者中的存在。
[0186] 在另一个方面，本发明提供了用于监测治疗方案在罹患状况的受试者中的效力的方法，所述方法包括使用如以上所述的根据本发明的分析方法。在一些实施方案中，分析物与状况相关，且其中分析物的量指示状况的水平并从而指示治疗方案在受试者中的效力。
[0187] 在一些实施方案中，从受试者获得样品并随后对其进行根据本发明的方法。
[0188] 如本文所用，“疾病”、“紊乱”、“状况”等，因为它们涉及受试者的健康，可互换使用并具有归因于每个和所有这样的术语的含义。在一些实施方案中，状况是病理状况。
[0189] 根据本发明的“病理状况”可选自但不限于：癌症、炎症、血液凝固紊乱、和自身免疫。因此，本发明的方法可用于检测已知的癌症标志物，炎症标志物，诸如是败血症的已知标志物的降钙素原，肽诸如青霉素结合蛋白2(PBP2)、驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)、毒素和变应原。
[0190] 在一些其他实施方案中，病理状况是病毒、细菌或真菌感染。病毒感染的非限制性实例包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、HERPES病毒、脊髓灰质炎病毒、和流感病毒。
[0191] 细菌感染的非限制性实例包括李斯特菌属(Listeria)、白喉、大肠杆菌(E.coli)、B组链球菌(Group B streptococcus)(GBS)、A组链球菌(Group A streptococcus)、结核(TB)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio Cholerae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、布鲁菌病、脑膜炎双球菌(meningococcus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和念珠菌属(Candida)。
[0192] 在一些实施方案中，病理状况是癌症。癌症与术语恶性肿瘤、肿瘤可互换使用，并且在本文中是指，其中一组细胞显示不受控制的生长和侵袭，可破坏邻近组织，且有时导致转移(扩散至身体中的其他位置)的一类疾病。癌症可以是实体癌或非实体瘤并可分类为癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞肿瘤、或胚细胞瘤。
[0193] 在一些另外的实施方案中，病理状况是自身免疫性疾病。如本领域理解的，自身免疫性疾病起因于身体对身体中正常地存在的物质和组织过于活跃的免疫反应。自身免疫性疾病的非限制性实例是多发性硬化、关节炎、自身免疫性肝炎、克罗恩病、1型糖尿病、炎症性肠病、银屑病、类风湿关节炎、韦格纳肉芽肿病。
[0194] 使用本发明的检测方法，可确定指示病理状态的靶分子的水平。因此，这些靶分子的水平的测量可用于诊断病理状况，监测疾病进展和监测治疗方案的效力，即监测受试者对治疗的响应。
[0195] 在一些另外的实施方案中，状况是非病理状况。
[0196] 本发明的其他方面提供了如本文公开的杂化结构在制造根据本发明的设备中的用途。
[0197] 在一些其他方面中，提供了用于研究目的的杂化结构和/或包括其的设备。非限制性实例包括实验室使用，科学实验等。
[0198] 在一些另外的方面，提供了用于分析样品中至少一种分析物的杂化结构和/或包括其的设备。在一些实施方案中，杂化结构用于确定以下的至少一种：(i)样品中分析物的存在或不存在、(ii)样品中分析物的身份、(iii)样品中分析物的浓度。
[0199] 根据本公开内容，杂化结构用于测序核酸分子。
[0200] 如本文所用的术语“约”表示可比提及的值偏离高达1％、更具体地5％、更具体地10％、更具体地15％、且在某些情况下高达20％，更高或更低的值，偏差范围包括构成连续的范围的整数值，并且，如果可适用，非整数值。
[0202] 为了更好地理解本文公开的主题并举例说明如何可以在实践中进行，现将参考附图，通过仅非限制性实例的方式描述实施方案，其中：
[0203] 图1A-1D示出了SP1通过固体纳米孔的转位。
[0204] 图1A是SP1通过两个容器之间以电势差分隔的SiN膜(以TEM图像显示，比例尺为5nm)中15nm固态纳米孔的转位的示意图。
[0205] 图1B示出了在各种电压下通过固态纳米孔的SP1(浓度为10mg/mL)转位的四个连续的电流对时间的踪迹，转位事件表示为瞬时峰值，插图是在稀释蛋白浓度后的对照实验，显示较低转位事件率。
[0206] 图1C是示出事件率与以对数行为施加的电压的相关性的图。虚线示出了在各种电压下的实验数据(来自至少3次重复带有误差线的散点)的线性拟合(以对数标尺)。
[0207] 图1D示出了SP1转位踪迹，显示SP1的负电荷性质，其中仅在正极性处观察到转位事件。
[0208] 图2A-2I示出了固体纳米孔上的SP1捕获。
[0209] 图2A是示出在3nm(小于蛋白/多肽尺寸)的固体纳米孔的顶部捕获SP1的图，TEM图像中的比例尺为5nm，在以上孔上成功捕获SP1的典型踪迹示出了电流直方图中的三个明显的峰，其分别表示在400mV下没有蛋白的开放孔(1)、孔上负载蛋白(2)、和最终捕获(3)。
[0210] 图2B-2D是在400mV下在具有各种直径(分别地3nm、5nm和8nm)的纳米孔中SP1捕获的踪迹，基线电流随纳米孔直径增加而上升。用于TEM图像的比例尺是5nm。
[0211] 图2E是示出了捕获事件(将电流下降长于1s定义为一个SP1捕获事件)的电流减少(在电流下降和基线电流之间)与对纳米孔测量的具有3nm、5nm和8nm直径的孔径的相关性的图。插图：示出了考虑几何形状的纳米孔的电导模型。理论阻塞值是基于SP1位于孔的顶部的情况(点)。
[0212] 图2F示出了纳米孔上捕获的SP1蛋白及通过手动改变极性释放的SP1蛋白的踪迹。当极性被切换回来时，可捕获另一种蛋白。
[0213] 图2G示出了在200mV和400mV下SP1(L81C)蛋白在纳米孔(3nm孔)上的捕获效率的两条踪迹。需要400mV电势差以捕获SP1(L81C)蛋白。
[0214] 图2H示出了在200mV、300mV和400mV下显示硅结合的SP1(SiSP1)突变体在纳米孔(5nm孔)上的增加的捕获效率的三条踪迹。对于该突变体，200mV的电势差足以将硅结合的SP1蛋白捕获在纳米孔上。
[0215] 图2I示出了显示SiSP1有时在改变至负偏压后仍可被捕获的踪迹。
[0216] 图3A-3G示出了在SP1杂化纳米孔中的DNA转位。
[0217] 图3A是示出了捕获SP1随后为DNA转位的图，其揭示了由于DNA转位通过杂化孔的四个阶段。一个典型的踪迹示出了在400mV下记录的通过L81CSP1纳米孔的DNA转位。电流直方图示出了表示DNA转位的第四峰。
[0218] 图3B是示出了通过SP1杂化纳米孔的48kbp dsDNA转位率作为在400mV下DNA浓度的函数的图。
[0219] 图3C和3D示出了将10nm金纳米颗粒(GNP)插入杂化纳米孔，所述金纳米颗粒(GNP)通过巯基与杂交于另一个100个碱基长的ssDNA的26个碱基长的ssDNA连接。图3C：1秒后发生SP1的捕获，引起电流的第一次减少。添加GNP-DNA缀合物后，158秒后发生了GNP-DNA向SP1的插入，引起电流的第二次减少到小于基线电流的10％。图3D：GNP-DNA缀合物停留在SP1孔持续～1s。然后，释放GNP或使杂交的100个碱基长的ssDNA脱杂交，且GNP释放，导致开放SP1电流的恢复。
[0220] 图3E和3F示出了在裸SiN(图3E)和SP1纳米孔(图3F)中DNA转位的代表性踪迹。使用具有排除短脉冲(<0.1ms)的自适应阈值的方法进行事件检测。
[0221] 图3G示出了通过L81SP1杂化纳米孔(点)和通过裸SiN纳米孔(三角形)转位的48kbp DNA的停留时间和电导的散点图和直方图。电导直方图示出了通过L81SP1纳米孔的DNA转位的窄峰，指示在L81SP1内的单一DNA构象，关于通过裸SiN纳米孔的DNA转位的多个峰，指示可变DNA构象。
[0222] 图4A-4B是示出了通过SP1杂化纳米孔的DNA转位是较慢的图。
[0223] 图4A SP1杂化纳米孔对裸固态孔的48kbp dsDNA转位停留时间。测量了SP1(L81C)杂化纳米孔的400mV踪迹，并测量了SiSP1杂化纳米孔的100mV、200mV、和300mV踪迹。
[0224] 图4B描绘了最有可能的停留时间作为电压的函数。两个图示出了通过SP1蛋白的明显减慢的转位。
具体实施方式
[0225] 非限制性实施例
[0226] 方法
[0227] 纳米孔制造
[0228] 使用200keV TEM(Tecnai、F20G2)的聚焦电子束在硅片(Protochips)支撑的30nm厚、低应力SiN窗口(50×50μm2)制造纳米孔。使用收缩过程通过散焦电子束来制备具有小尺寸，诸如3-4nm的纳米孔。在钻孔后，将它们立即存储于乙醇：ddH2O(1:1，v:v)中以避免任何污染。
[0229] 蛋白合成
[0230] 蛋白的表达、纯化和再折叠如由Heyman等人详细描述的来进行。简言之，将大肠杆菌菌株BL21(DE3)用于蛋白表达，使用IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂。累积在包涵体(IB)中的蛋白，通过离心、洗涤、变性来分离并最后再折叠，以允许自组装成其十二聚体形式。使用离子交换色谱法进行进一步纯化。在这项工作中使用两种类型SP1突变体：L81CSP1(不具有与Si的特异性结合)和SiSP1(与Si特异性结合)。
[0231] L81CSP1的单体在本文中表示为SEQ ID NO:5且SiSP1的单体序列在本文中表示为SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17。
[0232] 转位实验
[0233] 纳米孔膜在等离子体清洁仪(Plasma Cleaner)中处理30s以促进湿润，随后被安装进定制的电泳流通池(Nanopore Solution,Inc.)。对在每侧的具有1mL体积的两个储存器(反式和顺式)填充1M KCl、10mM Tris pH 7.4、10％甘油，和1mM EDTA的过滤的和脱气的缓冲液。
[0234] 将一对Ag/AgCl沉淀物电极浸入两个储存器中，并连接至Axopatch200B放大器(Molecular Devices,Inc.)以记录流动通过纳米孔的离子电流。将整个设置放入双法拉第笼，以降低外部静电干扰。在100kHz采样率下使用Digidata 1440A(Molecular Devices,Inc.)收集信号，并在10kHz下使用Axopatch的内置的低通Bessel过滤器来过滤。Clampfit 10.2(Molecular Devices,Inc.)用于用自适应阈值方法的事件检测，通过自适应阈值方法排除了短脉冲(<0.01ms)。所有的DNA样品购自Fermentas,Inc.并直接使用。将DNA和SP1用移液管注射进连接至接地电极的顺式侧，并通过用移液管反复抽吸和注射充分混合。
[0235] 结果
[0236] 实施例1-SP1通过纳米孔的转位
[0237] 本实施例描述了SP1通过纳米孔的转位性质的表征。SP1具有分布在其表面上的-6个电荷单位的净电荷/单体。
[0238] 图1A示出了SiN膜中比SP1蛋白直径稍大的孔，其分隔配备了具有电势差的一对电极的两个离子缓冲液容器。
[0239] 当蛋白在电泳力下通过单个纳米孔时，蛋白转位通过测量瞬时电流阻塞(微秒至毫秒的时间尺度)来检测。图1B示出了在四个不同电压(20mV、50mV、80mV和100mV)下的四个连续1min踪迹。在电压上升后观察到事件的增加的频率，对应于增加的转位事件率，如当增加离子电流和作用于带电蛋白的力时预计的。
[0240] 在20mV、50mV、80mV和100mV下，观察的速率分别为51、290±33、465±32、587±125min-1。根据在先的研究，聚合物通过限制的孔的捕获率应遵循随增加的电压的指数增长，表示为Van’t Hoff-Arrhenius关系，Rcapture∝eV。
[0241] 从50mV至150mV获得的本实验数据符合这种关系(图1C)。在20mV的转位率不遵循以上方程式，并被向下移动。因此，建议在20mV下，转位可通过扩散控制。如可在图1B(插图)中看出的，SP1浓度的稀释导致降低的事件率。
[0242] 另外，当极性更改为负偏压时，未观察到SP1转位事件，但在它改回至正偏压后返回(图1D)。这表明，在这些缓冲液条件(1M KCl、pH 7.4)下SP1带负电荷，并在正偏压应用后转移至纳米孔且转位通过它。该观察结果符合SP1蛋白的等电点(pI)是4.7的事实。
[0243] 转位的电压和浓度相关性确认SP1转位通过纳米孔以及因此还通过双向电泳将SP1引至纳米孔的能力。
[0244] 实施例2-SP1在纳米孔中的捕获
[0245] 为了在纳米孔上捕获SP1，使用3nm至8nm直径的纳米孔(主要地3nm至5nm)(16个孔)(图2A)。图2A中的踪迹示出了典型的捕获过程，其包括通过踪迹右侧提供的电流直方图中的三个不同的峰所示的三个连续步骤。
[0246] 这些峰解释如下：起初，存在反映SP1击在纳米孔上的许多事件，表现为基线上的峰(峰1)。这些之后为可能在一些倾斜蛋白取向中的中间阻塞(峰2)，且最终为在与膜表面平行的取向中的成功捕获(峰3)。
[0247] 稍后示出的通过SP1的DNA转位不可能以非平面SP1取向，因为“甜甜圈形”SP1的3nm宽度将完全阻塞3nm纳米孔开口并使不能进行dsDNA转位。
[0248] 简单的等效电路假定，除了SiN孔电阻以外，SP1孔引入恒定串联电阻至离子电流。基于该模式，捕获后的相对电流降低应显示对孔径的强相关性。实验数据与计算的电流下降良好符合，所述计算的电流下降假定了SP1事实上位于纳米孔的顶部(图2B-2D)。
[0249] 图2B-2D表示杂化纳米孔中的相对电流减少(即在纳米孔中捕获SP1之后)取决于纳米孔直径。对于具有3nm、5nm和8nm直径的纳米孔观察到相对电流减少分别为45±7％(5个孔，30个捕获事件)，30±5％(2个孔，25个捕获事件)，和10±2％(2个孔，15个捕获事件)，如图2E中所示。
[0250] 根据纳米孔的电导模型，纳米孔的电导可描述为 其中h是SiN膜的厚度(30nm)，d是孔的平均直径，σ是1M KCl溶液的体电导率(11.2S m-1)，以及D是孔开口的直径。实验数据与计算的电流下降(对于具有3nm、5nm和8nm直径的纳米孔分别为56％、27％和25％)相符合。
[0251] 这表明，SP1位于纳米孔的顶部，其中D和h将受SP1的影响。因此，实验数据与计算的电流下降良好符合，表明SP1位于纳米孔的顶部上(图2B-2E)。
[0252] 如图2F中所示，捕获SP1后(踪迹的左边部分)，改变极性以有意释放SP1(标有箭头)，且基线返回至裸孔电流水平(即孔中没有任何捕获的蛋白)。
[0253] 此后，另一个捕获事件发生(踪迹的右侧部分)。应注意，由于SP1的天然带负电荷的表面，可原样捕获SP1，即没有任何另外的遗传修饰。这不同于α溶血素，其为了此目的需要进行化学修饰。
[0254] 为了显示捕获行为和对表面的结合亲和力的可变性，比较两种SP1突变体，第一种是L81CSP1(不具有与Si的特异性结合)且第二种是SiSP1，其在每个N-末端具有促进与Si表面结合的Si结合肽。
[0255] 结果示于图2G和2H。如在图2G中可以看出的，对于L81CSP1，将SP1捕获在纳米孔上的阈值电压是400mV。在200mV的较低电势下，未检测到捕获事件。
[0256] 当使用SiSP1时，捕获阈值降低到200mV(图2H)。随着电压升高，SiSP1捕获频率进一步增加。
[0257] 如图2I中所示，改变极性未能从纳米孔释放紧密结合的SiSP1。
[0258] 两种蛋白突变体的比较显示了遗传工程突变对蛋白捕获行为的影响，并进一步确认SP1捕获在纳米孔的顶部。这对不具有特异性结合的SP1没有观察到，在这种情况下，在电压极性改变后，释放SP1。
[0259] 实施例3–DNA通过SP1修饰的纳米孔的转位
[0260] 在表征SP1捕获后，展示了通过SP1修饰的纳米孔的DNA转位(图3A-3G)。
[0261] 图3A中所示的方案中的前三个阶段与以上描述的SP1捕获类似。在顺式室中混合SP1蛋白和dsDNA分子后，沿着捕获的SP1水平观察到了另一组阻塞事件。
[0262] 这些另外的事件归因于通过杂化SP1-SiN纳米孔的DNA转位。此外，它们的事件频率随DNA浓度的增加而增加(图3B)。
[0263] 为了进一步证实DNA转位通过纳米孔，将10nm金纳米颗粒(所述金纳米颗粒与杂交于100bp单链DNA的26bp单链DNA缀合)添加至溶液，并转位进入杂化纳米孔中，导致SP1孔由纳米颗粒的深得多(降至基线的10-30％)的阻塞(图3C)。
[0264] 这种阻塞可持续几秒钟，除非该缀合的DNA通过电力从金纳米颗粒脱杂交或分离(图3D)。
[0265] 这进一步强调了SP1以水平方式位于SiN纳米孔的顶部的暗示。这些实验证实了dsDNA确实穿过SP1修饰的纳米孔，以及图3A中直方图中的第4个峰对应于dsDNA转位。
[0266] 图3E和3F示出了，48kbpλ-DNA通过裸纳米孔(图3E)和通过SP1修饰的杂化纳米孔(图3F)的转位之间的比较。在SP1修饰的杂化纳米孔踪迹中均匀阻塞水平的事件显示了，转位通过杂化纳米孔的dsDNA具有单一构象，可能是线性的，与转位通过裸固态纳米孔的DNA截然不同，其具有多种构象。
[0267] 图3G提供了使用转位通过L81SP1杂化纳米孔(点)和通过裸SiN纳米孔(三角形)的48kbpλ-DNA的电导和停留时间的散点图和直方图的概括比较。
[0268] 电导直方图示出了通过杂化纳米孔的DNA转位的单一窄峰，暗示单一线性DNA构象，关于通过裸纳米孔的DNA转位的多个峰，暗示可变DNA构象。
[0269] 与转位通过裸纳米孔的dsDNA比较，通过杂化纳米孔的dsDNA转位阻塞具有较低振幅的离子电流(图3E、3F和3G)。
[0270] 当DNA以其线性形式转位通过裸纳米孔时，其引起离子电导中～2ns的减少。
[0271] 对于杂化纳米孔，阻塞电导减少至～0.5ns(图3E、3F和3G)可与被SP1的内孔中的固有正电荷的电荷屏蔽相关。
[0272] 不受限于理论，这样的电荷屏蔽可导致减少的离子流，引起较低阻塞电导。
[0273] 另外，通过杂化纳米孔的DNA转位停留时间比通过裸纳米孔的转位的停留时间长了超过一个数量级，如通过监测通过杂化纳米孔的DNA转位的动力学观察到的(图3G和图4)。
[0274] 不受限于理论，表明通过杂化纳米孔的停留时间的减慢可起因于存在于SP1的内孔的固有正电荷或可能的较高摩擦力。这两种参数可通过使用遗传或化学修饰的SP1进行控制。
[0275] 由于通过孔的DNA的电泳拖动是动力学驱动力，预计获得停留时间与电压的指数相关性。
[0276] 图4A示出了对于SiSP1在100mV、200mV和300mV以及对于L81CSP1在400mV的各种驱动电压下测量的DNA转位的停留时间分布。
[0277] 该分布的峰是用于转位的最可能的停留时间并绘于图4B中。
[0278] 对于裸纳米孔和杂化纳米孔两者，观察到了停留时间与电压的指数相关性，其符合电泳-力驱动转位。
[0279] 这些结果表明，dsDNA转位通过捕获的SP1。与裸纳米孔相比，对于所有电压，DNA转位减慢至少10倍(图4)。这表明，dsDNA的绝对转位速度通过蛋白和转位通过孔的DNA之间的相互作用来控制。
[0280] 与裸固态纳米孔相比，显示杂化纳米孔具有至少三个核心优势。
[0281] 首先，其使得能够减慢转位超过一个数量级。进一步的减慢可由SP1蛋白的遗传或化学修饰来实现，因此解决了DNA测序道路上的核心挑战之一。没有考虑DNA在SP1上非常快速击中尝试作为转位事件的分析，提供了进一步相对减慢，高达几乎两个数量级。然而，必须进一步控制并验证这种分析的有效性。
[0282] 第二，其允许仅以线性构象的转位，与裸固态纳米孔不同，在裸固态纳米孔中观察到许多构象，使得转位模式形状失真并影响转位停留时间以及自然地还有测序转位的核苷酸的能力。
[0283] 除了其极度的稳定性之外，SP1蛋白的第三个优势是其易于遗传工程化和功能修饰。
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