间充质干细胞亲和肽的筛选与用途
阅读：1017发布：2020-08-06
专利汇可以提供间充质干细胞亲和肽的筛选与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及细胞、多肽 生物 技术领域。本发明的目的在于筛选到一种与MSC强结合的小肽用于MSC的分离纯化及作为载体用于靶向 治疗 制剂的制备。本发明所述的MSC亲和肽序列为富含Ser、Thr、Asn、Lys的环七肽序列。本发明利用 噬菌体 展示技术通过与MSC进行亲和筛选，最终在随机环7肽库中筛选到能够和MSC强结合的小肽。利用本发明筛选到的小肽将其连接于固相支持物上可用于MSC的筛选、分离和纯化，与 荧光 标记物联接后可用于制备MSC的示踪剂，可作为MSC与药物间的载体可用于制备靶向治疗的制剂。本发明将在制备 肿瘤 靶向治疗药物、药物筛选、细胞体内示踪及细胞分选中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。，下面是间充质干细胞亲和肽的筛选与用途专利的具体信息内容。
1、一组能与间充质干细胞(MSC)高亲和力结合的小肽，其氨基酸序列从N末端到C末 端为：
Asp Ser Pro Asn Lys Thr Ser
Ser Leu Glu Lys Asn Thr Ser
Ser Thr Asn Pro Lys Val Leu
Ser Asp Pro Leu Arg Gln Leu
Asn Thr Ile Met Arg Ser Asp
Thr Leu Thr Asn Tyr Ser Ser
Ser Pro Phe Asn Thr Lys Ala
Ser Asp Asp Gln Ile Ile Trp。
2、根据权利要求1所述小肽的反向序列，其氨基酸序列从N末端到C末端为：
Ser Thr Lys Asn Pro Ser Asp
Ser Thr Asn Lys Glu Leu Ser
Leu Val Lys Pro Asn Thr Ser
Leu Gln Arg Leu Pro Asp Ser
Asp Ser Arg Met Ile Thr Asn
Ser Ser Tyr Asn Thr Leu Thr
Ala Lys Thr Asn Phe Pro Ser
Trp Ile Ile Gln Asp Asp Ser。
3、根据权利要求1所述小肽，其特征在于所述的小肽的基因是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1～8的DNA序列；
2)与序列表中序列1～8限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋 白质的DNA序列。
4、根据权利要求1所述小肽的融合蛋白。
5、与MSC具有高亲和性的小肽的用途，其特征在于通过与MSC的高亲和性，将此肽连接 于固相支持物上可用于MSC的筛选、分离和纯化。
6、与MSC具有高亲和性的小肽的用途，其特征在于作为MSC与药物间的载体可用于制备 靶向治疗的制剂。
7、与MSC具有高亲和性的小肽的用途，其特征在于与荧光标记物联接后可用于制备MSC 的示踪剂。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及采用噬菌体随机肽库对间充质干细胞表面亲 和肽的筛选及筛选出的亲和肽的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是来源于中胚层的具有高度自我更新 能力和多向分化潜能的成体干细胞。广泛存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组 织中含量最为丰富。近年报道从早产胎儿脐带血、脐带静脉内皮下层、骨膜、肌腱、血 管、脂肪组织等亦分离到MSC。MSC具有高分化潜能，其中骨髓间充质干细胞在不同 的诱导条件下能分化成成熟的间质细胞，如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细 胞、网状细胞、血管内皮细胞等。目前的研究还显示出MSC的终术分化有可能跨越胚层 界限，超越传统意义上的分化为中胚层来源的间质细胞，而向实质细胞转化，如分化为 心肌细胞、神经细胞等，这一研究成果不仅具有重大的理论意义，其多向分化潜能及其 移植时不存在组织配型及免疫排斥等优点使其作为组织工程的种子细胞，在骨及软骨组 织损伤的修复、肌肉组织退行性疾病、冠心病等方面提供了良好的治疗途径。MSC易于 外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景 相当稳定，因此在组织工程创伤修复、细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面的应 用前景相当广阔。间充质干细胞的另一特性是具有迁移趋化能力，能够向肿瘤细胞浸润 的方向迁移，目前国外有许多研究报道以MSC为载体携带治疗基因实现了对肿瘤的靶向 治疗(Nedime Serakinci，Oncogene，2004，23：5095-5098；Nakamural K，Gene Therapy， 2004，11：1155-1164)，这些研究结果为以MSC为细胞载体的靶向治疗提供了实验依 据。
常用的分离MSC的方法有全骨髓法和离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性， 定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞等，达到分离纯化MSC的目的。离心法即根 据细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养，但获取高纯度MSC的时间较长。 为了获得更高纯度的MSC，有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对MSC进行分离纯 化，但是所需仪器设备昂贵。
噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术(phage display)为基础的。1985 年由Smith(Smith GP.，Science，1985，228：1315-1317)首次通过基因工程手段将外 源蛋白质与噬菌体的次要外壳蛋白pIII形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相 对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因 表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基 因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。
噬菌体展示随机肽库的筛选是一个亲和纯化(affinity purification)的生物淘选 (biopanning)过程。其具体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，接着 洗涤除去非特异结合噬菌体，将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的 淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出特异结合的重组噬菌体克隆。通过分析 所筛选到的肽的结构和序列，为蛋白质分子之间(如抗原与抗体、受体与配体、酶与底 物)的相互作用机理提供理论依据，同时筛选到有功能的活性肽可以进入临床的应用与 开发。
以往采用噬菌体随机肽库技术研究受体与配体的相互作用大多以纯化的受体分子 筛选肽库，从而获得与受体分子结合的肽段，而当对某一受体分子的结构信息了解不多， 以及在细胞膜表面受体未知的情况下，获得纯化的天然受体分子将十分困难，而且纯化 的受体分子还可能失去其天然构象与功能，此时，采用表达该受体的完整细胞作为筛选 靶标不失为一种简便的选择。目前，用于筛选噬菌体随机肽库技术的细胞包括转染受体 基因的细胞、血小板、外周血中性粒细胞及体外培养的肿瘤细胞等。
本发明的目的在于提供一种利用噬菌体随机肽库体外筛选细胞表面亲合肽的技术， 并获得了能够与间充质干细胞结合的环七肽氨基酸序列，利用本发明筛选到的小肽将其 连接于固相支持物上可用于MSC的筛选、分离和纯化，与荧光标记物联接后可用于制 备MSC的示踪剂，可作为MSC与药物间的载体可用于制备靶向治疗的制剂。本发明 将在制备肿瘤靶向治疗药物、药物筛选、细胞体内示踪及细胞分选中具有极佳的应用前 景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
常用的分离MSC的方法有全骨髓法和离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性， 定期换液除去不贴壁细胞，如造血系细胞等，达到分离纯化MSC的目的。离心法即根 据细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养，但获取高纯度MSC的时间较长。 为了获得更高纯度的MSC，有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对MSC进行分离纯 化，但是所需仪器设备昂贵。
噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术(phage display)为基础的。1985 年由Smith(Smith GP.，Science，1985，228：1315-1317)首次通过基因工程手段将外 源蛋白质与噬菌体的次要外壳蛋白pIII形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相 对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因 表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基 因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。
噬菌体展示随机肽库的筛选是一个亲和纯化(affinity purification)的生物淘选 (biopanning)过程。其具体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，接着 洗涤除去非特异结合噬菌体，将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的 淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出特异结合的重组噬菌体克隆。通过分析 所筛选到的肽的结构和序列，为蛋白质分子之间(如抗原与抗体、受体与配体、酶与底 物)的相互作用机理提供理论依据，同时筛选到有功能的活性肽可以进入临床的应用与 开发。
以往采用噬菌体随机肽库技术研究受体与配体的相互作用大多以纯化的受体分子 筛选肽库，从而获得与受体分子结合的肽段，而当对某一受体分子的结构信息了解不多， 以及在细胞膜表面受体未知的情况下，获得纯化的天然受体分子将十分困难，而且纯化 的受体分子还可能失去其天然构象与功能，此时，采用表达该受体的完整细胞作为筛选 靶标不失为一种简便的选择。目前，用于筛选噬菌体随机肽库技术的细胞包括转染受体 基因的细胞、血小板、外周血中性粒细胞及体外培养的肿瘤细胞等。
本发明的目的在于提供一种利用噬菌体随机肽库体外筛选细胞表面亲合肽的技术， 并获得了能够与间充质干细胞结合的环七肽氨基酸序列，利用本发明筛选到的小肽将其 连接于固相支持物上可用于MSC的筛选、分离和纯化，与荧光标记物联接后可用于制 备MSC的示踪剂，可作为MSC与药物间的载体可用于制备靶向治疗的制剂。本发明 将在制备肿瘤靶向治疗药物、药物筛选、细胞体内示踪及细胞分选中具有极佳的应用前 景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
为实现上述目的，本发明的技术途径是首先分离培养间充质干细胞，当细胞处于对 数生长期并长满瓶底时，用环七肽库进行亲和筛选，通过加强筛选强度，经三轮筛选， ELISA鉴定，获得亲和性较强的克隆，测序并进行序列分析。用流氏方法对合成的肽进 行亲和性鉴定。具体的技术方案如下：
(1)间充质干细胞的分离培养
1)间充质干细胞可来源于鼠的骨髓，人的骨髓、外周血、胚胎、脐血等。
2)人骨髓间充质干细胞的分离：无菌条件下，经双侧髂后上棘穿刺，采集骨髓， 经Percoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.073g/ml)密度梯度离心后收集人骨髓 单个核细胞，贴壁培养72h，去除悬浮细胞后贴壁生长的即为骨髓间充质干细胞。培养 传代的细胞形态如附图1所示。
3)鼠间充质干细胞的分离：无菌条件下分离股骨胫骨，冲出骨髓，吹打成细胞悬液， 离心，弃上清，PBS重悬细胞，将细胞悬液贴壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液 (美国，Sigma公司产品，相对密度1.083g/ml)的离心管中，使悬于上层，离心，收集 云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中，PBS洗涤后，贴壁培养72h，去除悬浮细 胞后贴壁生长的即为骨髓间充质干细胞，经传代培养后得到逐步纯化。
(2)间充质干细胞表面标志与纯度的鉴定
取第3代培养扩增的间充质干细胞，胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2～ 3次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×106个/ml，按5×105 个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体进行组合， 加入各管中，室温下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后， 用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。
(3)噬菌体随机肽库筛选
1)噬菌体随机肽库可以是商品化的十二肽库(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)、七肽库(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit)和环七肽库 ((Ph.D.-C7CTM Phage Display Peptide Library Kit)及其自己构建的不同长度的肽库。
2)抑制二硫键的环七肽库(Ph.D.-C7C)所展示的多肽两侧各加了一个半胱氨酸。 噬菌体组装时经过氧化，形成环化的多肽。一般肽库的库容量受电转条件的限制，最高 可达109库容，足以覆盖7肽的组合概率，但只能覆盖部分12肽的组合概率。另外，7 环肽库由于肽的环化，增强了其空间构象，使之更容易与受体牢固结合。因此选用7环 肽库更容易筛选到与MSC亲和的肽，这是本发明的一个特别优选肽库。
3)筛选方法：首先于平板或培养瓶中培养贴壁的间充质于细胞，至间充质干细胞 对数生长期且密度为90％时，除去培养液，PBS洗涤；加入含噬菌体肽库的无血清培 养液，37℃孵育15min～1h；吸除含噬菌体肽库的无血清培养液，用含有0.1％～0.5％吐 温20(Tween 20)的PBS洗涤细胞3～6次；最后用pH2.2的甘氨酸缓冲液洗下与细胞 表面强结合的噬菌体，并迅速用Tris(pH9.8)缓冲液中和后，留10μl进行滴度测定， 剩余转入新鲜菌液(ER2738)中，37℃孵育15min～30mm，然后37℃剧烈振摇4～5h 扩增噬菌体，PEG法提纯，再进入下一轮筛选。计数每次筛选后及扩增后的噬菌体数目。 为提高噬菌体展示肽与细胞的亲和性，在随后的筛选过程中逐步减少噬菌体与细胞的结 合时间，并增强洗涤强度。
(4)噬菌体滴度测定
每一轮的筛选都需测定投入和产出噬菌体的滴度，并计算收率。将待测噬菌体按梯 度(1∶10～1∶108)稀释，加到含有宿主菌E.coliER2738(OD＝0.2～0.3)的LB中，加入溶化 的上层琼脂中混匀铺于37℃预热的底层平板中。于37℃培养过夜，计算其克隆数及 噬菌体滴度(TU)。TU/L＝＝蓝斑数×稀释倍数×105。
(5)噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定
将最后一轮洗脱的噬菌体铺平板，在IPTG/X-gal琼脂板上随机挑选几十个分隔 良好的蓝色噬菌体斑加入含有宿主菌(如ER2738)的抗性培养基中37℃剧烈振摇4～5h 扩增噬菌体，离心取上清，复离心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至终浓度50％ 后，-20℃保存。单克隆上清测定滴度后进行EL ISA鉴定。
将分离纯化的MSCs细胞接种于96孔培养板中培养，待细胞生长良好至单层贴壁 铺满板底时，用PBS冲洗2次，固定液固定(如0.25％的戊二醛、10％甲醛、丙酮等)； 用PBS冲洗2次，3％双氧水处理细胞内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗后封闭液(如 2～5％脱脂奶、0.1％～0.5％BSA)4℃封闭过夜或37℃封闭1h～3h；每孔加入纯化的噬 菌体(1×108～1×1010pfu)孵育1h～3h，并以野生型M13噬菌体和PBS为对照；用含 有0.05％～0.3％吐温20(Tween20)的PBS洗涤细胞3～6次；每孔加入辣根过氧化酶(HRP) 标记的抗M13噬菌体mAb(1∶2000～1∶5000稀释)50μL，孵育1h～3h；用含有 0.05％～0.3％吐温20(Tween 20)的PBS洗涤细胞3～6次，显色剂(如四氨基联苯胺(TMB)、 邻苯二胺(OPD)等显色后测A450nm.。计算均值±标准差，从上述筛选获得的噬菌体克 隆中挑选阳性克隆。
(6)阳性噬菌体克隆DNA序列测定及分析
参照噬菌体单链DNA抽提试剂盒提取ssDNA，将沉淀溶于30μl超纯水中。取5 μlssDNA进行电泳分析，剩余噬菌体ssDNA进行序列测定，比较序列中氨基酸出现 的比率及规律。
(7)多肽的设计、合成
选择测序结果中出现频率最高及ELISA阳性强的序列作为合成肽的模板。合成肽 采用质谱分析确定准确度和纯度。根据需要可对合成肽进行标记(如FITC、Cy5.5等)。
(8)合成肽与MSC的亲和性检测
可有多种方法检测合成肽与MSC的亲和性
1)与野生型噬菌体M13的竞争结合试验
将阳性噬菌体克隆扩增后分别与野生型M13噬菌体以1∶1的比例混合加入到已长 有间充质干细胞的培养板中进行前述的筛选过程。由于野生型M13不含LacZ基因，故 在IPTG/X-gal琼脂板上不能显示蓝色斑，因此分别计数蓝、白斑数目，并按照下面方 法计算其相对与野生型M13噬菌体的结合能力(Zhang JB，Cancer Lett，2001，171 (2)：153-164.)
相对结合力＝投入的M13×产出的肽库噬菌体/产出的M13×投入的肽库噬菌体
2)流氏检测
将培养的间充质干细胞用胰酶消化，PBS洗涤后与荧光标记(如FITC、Cy5.5等) 的合成肽在37℃孵育20min～30min，阴性对照采用不加合成肽的MSC。PBS洗涤三次 之后，流氏检测荧光标记的比率与强度。
(1)间充质干细胞的分离培养
1)间充质干细胞可来源于鼠的骨髓，人的骨髓、外周血、胚胎、脐血等。
2)人骨髓间充质干细胞的分离：无菌条件下，经双侧髂后上棘穿刺，采集骨髓， 经Percoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.073g/ml)密度梯度离心后收集人骨髓 单个核细胞，贴壁培养72h，去除悬浮细胞后贴壁生长的即为骨髓间充质干细胞。培养 传代的细胞形态如附图1所示。
3)鼠间充质干细胞的分离：无菌条件下分离股骨胫骨，冲出骨髓，吹打成细胞悬液， 离心，弃上清，PBS重悬细胞，将细胞悬液贴壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液 (美国，Sigma公司产品，相对密度1.083g/ml)的离心管中，使悬于上层，离心，收集 云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中，PBS洗涤后，贴壁培养72h，去除悬浮细 胞后贴壁生长的即为骨髓间充质干细胞，经传代培养后得到逐步纯化。
(2)间充质干细胞表面标志与纯度的鉴定
取第3代培养扩增的间充质干细胞，胰酶消化收集细胞，离心。以PBS洗涤细胞2～ 3次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓度为1×106个/ml，按5×105 个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC标记的多个抗体进行组合， 加入各管中，室温下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后， 用流式细胞仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。
(3)噬菌体随机肽库筛选
1)噬菌体随机肽库可以是商品化的十二肽库(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit)、七肽库(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit)和环七肽库 ((Ph.D.-C7CTM Phage Display Peptide Library Kit)及其自己构建的不同长度的肽库。
2)抑制二硫键的环七肽库(Ph.D.-C7C)所展示的多肽两侧各加了一个半胱氨酸。 噬菌体组装时经过氧化，形成环化的多肽。一般肽库的库容量受电转条件的限制，最高 可达109库容，足以覆盖7肽的组合概率，但只能覆盖部分12肽的组合概率。另外，7 环肽库由于肽的环化，增强了其空间构象，使之更容易与受体牢固结合。因此选用7环 肽库更容易筛选到与MSC亲和的肽，这是本发明的一个特别优选肽库。
3)筛选方法：首先于平板或培养瓶中培养贴壁的间充质于细胞，至间充质干细胞 对数生长期且密度为90％时，除去培养液，PBS洗涤；加入含噬菌体肽库的无血清培 养液，37℃孵育15min～1h；吸除含噬菌体肽库的无血清培养液，用含有0.1％～0.5％吐 温20(Tween 20)的PBS洗涤细胞3～6次；最后用pH2.2的甘氨酸缓冲液洗下与细胞 表面强结合的噬菌体，并迅速用Tris(pH9.8)缓冲液中和后，留10μl进行滴度测定， 剩余转入新鲜菌液(ER2738)中，37℃孵育15min～30mm，然后37℃剧烈振摇4～5h 扩增噬菌体，PEG法提纯，再进入下一轮筛选。计数每次筛选后及扩增后的噬菌体数目。 为提高噬菌体展示肽与细胞的亲和性，在随后的筛选过程中逐步减少噬菌体与细胞的结 合时间，并增强洗涤强度。
(4)噬菌体滴度测定
每一轮的筛选都需测定投入和产出噬菌体的滴度，并计算收率。将待测噬菌体按梯 度(1∶10～1∶108)稀释，加到含有宿主菌E.coliER2738(OD＝0.2～0.3)的LB中，加入溶化 的上层琼脂中混匀铺于37℃预热的底层平板中。于37℃培养过夜，计算其克隆数及 噬菌体滴度(TU)。TU/L＝＝蓝斑数×稀释倍数×105。
(5)噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定
将最后一轮洗脱的噬菌体铺平板，在IPTG/X-gal琼脂板上随机挑选几十个分隔 良好的蓝色噬菌体斑加入含有宿主菌(如ER2738)的抗性培养基中37℃剧烈振摇4～5h 扩增噬菌体，离心取上清，复离心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至终浓度50％ 后，-20℃保存。单克隆上清测定滴度后进行EL ISA鉴定。
将分离纯化的MSCs细胞接种于96孔培养板中培养，待细胞生长良好至单层贴壁 铺满板底时，用PBS冲洗2次，固定液固定(如0.25％的戊二醛、10％甲醛、丙酮等)； 用PBS冲洗2次，3％双氧水处理细胞内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗后封闭液(如 2～5％脱脂奶、0.1％～0.5％BSA)4℃封闭过夜或37℃封闭1h～3h；每孔加入纯化的噬 菌体(1×108～1×1010pfu)孵育1h～3h，并以野生型M13噬菌体和PBS为对照；用含 有0.05％～0.3％吐温20(Tween20)的PBS洗涤细胞3～6次；每孔加入辣根过氧化酶(HRP) 标记的抗M13噬菌体mAb(1∶2000～1∶5000稀释)50μL，孵育1h～3h；用含有 0.05％～0.3％吐温20(Tween 20)的PBS洗涤细胞3～6次，显色剂(如四氨基联苯胺(TMB)、 邻苯二胺(OPD)等显色后测A450nm.。计算均值±标准差，从上述筛选获得的噬菌体克 隆中挑选阳性克隆。
(6)阳性噬菌体克隆DNA序列测定及分析
参照噬菌体单链DNA抽提试剂盒提取ssDNA，将沉淀溶于30μl超纯水中。取5 μlssDNA进行电泳分析，剩余噬菌体ssDNA进行序列测定，比较序列中氨基酸出现 的比率及规律。
(7)多肽的设计、合成
选择测序结果中出现频率最高及ELISA阳性强的序列作为合成肽的模板。合成肽 采用质谱分析确定准确度和纯度。根据需要可对合成肽进行标记(如FITC、Cy5.5等)。
(8)合成肽与MSC的亲和性检测
可有多种方法检测合成肽与MSC的亲和性
1)与野生型噬菌体M13的竞争结合试验
将阳性噬菌体克隆扩增后分别与野生型M13噬菌体以1∶1的比例混合加入到已长 有间充质干细胞的培养板中进行前述的筛选过程。由于野生型M13不含LacZ基因，故 在IPTG/X-gal琼脂板上不能显示蓝色斑，因此分别计数蓝、白斑数目，并按照下面方 法计算其相对与野生型M13噬菌体的结合能力(Zhang JB，Cancer Lett，2001，171 (2)：153-164.)
相对结合力＝投入的M13×产出的肽库噬菌体/产出的M13×投入的肽库噬菌体
2)流氏检测
将培养的间充质干细胞用胰酶消化，PBS洗涤后与荧光标记(如FITC、Cy5.5等) 的合成肽在37℃孵育20min～30min，阴性对照采用不加合成肽的MSC。PBS洗涤三次 之后，流氏检测荧光标记的比率与强度。
附图说明
图1人骨髓间充质干细胞的形态(×100)
图2大鼠间充质干细胞的形态(×100)
图3大鼠骨髓间充质干细胞流氏鉴定
(1)FITC-CD90阳性表达
(2)FITC-CD45阳性表达
(3)PE-CD31阳性表达
(4)FITC-CD44阳性表达
图4阳性克隆噬菌体克隆的DNA电泳分析
图5FITC标记合成肽与大鼠MSC结合的荧光观察
图6FITC标记合成肽与大鼠MSC结合的流氏分析
(1)大鼠脑胶质瘤9L细胞阴性对照
(2)大鼠脑胶质瘤9L细胞与FITC标记合成肽的结合
(3)大鼠骨髓间充质干细胞阴性对照
(4)大鼠骨髓间充质干细胞与FITC标记合成肽的结合
表1阳性噬菌体的富集
表2阳性噬菌体克隆的EL ISA法鉴定
表38个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列
具体实施方案
结合附图说明本发明的具体实施方法如下：
实施例1、以大鼠为例说明MSC的分离培养
本实施例的实验步骤如下：
选用6周龄健康wistar大鼠(约150克，雌雄不限)，无菌条件下分离股骨、胫骨， 冲出骨髓，吹打成细胞悬液，1200rpm，离心5min。弃上清，PBS重悬细胞，将细胞 悬液贴壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液(比重1.083)的离心管中，使悬于上层， 1800rpm，离心25min。收集云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中，PBS洗涤一 次(1200rpm离心5min)，弃上清，用含10％新生小牛血清L-DMEM重悬。以1×105/ml 接种细胞于培养瓶中，于饱和温度、37℃、pH7.2条件下培养于5％CO2恒温培养箱。 3d时首次换液，以后每周换液两次，待细胞接近90％融合时，胰蛋白酶消化，1×104/ml 传代，标记为第一代，倒置显微镜逐日观察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作，反复 传代扩增，每次传代用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，严格控制酶的量和消化时间，将 MSC与可能混杂的淋巴细胞、单细胞分开，从而得到纯化的MSC(见图2)。
实施例2、大鼠骨髓MSC表面标志与纯度的鉴定
取第4代培养扩增的大鼠骨髓间充质干细胞，0.25％胰酶消化收集细胞，1200rpm 离心5min。以PBS洗涤细胞2次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓 度为1×106个/ml，按5×105个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC 标记的多个抗体CD90、CD45、CD44和CD31(Peprotech公司产品)各5μl加入各管 中，室温下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞 仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。结果显示，培养扩增的大鼠骨髓间充质 干细胞CD90、CD45、CD44和CD31表达阳性(见图3)。
实施例3、MSC亲和肽的筛选
本实施例的实验步骤如下：
将分离纯化的第2代或第3代的MSC接种在加有L-DMEM培养基(含10％胎牛血 清)的6孔培养板中培养2d，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底时，吸取培养液，用 L-DMEM培养基冲洗2次，加入1ml含10μL Ph.D.-C7C噬菌体肽库的原液(滴度为 6.5×1012pfu/mL)L-DMEM培养基于37℃孵育1h。用含有0.1％Tween20的PBS液洗涤 4次，每次1min。去除与MSC非特异结合的噬菌体，然后每孔加入1mL pH2.2的甘氨 酸缓冲液于冰上放置8min，并不时摇动以使洗脱出结合到细胞表面的噬菌体。吸出洗 脱下来的噬菌体，迅速用Tris(pH9.8)缓冲液中和。留10μl进行滴度测定，剩余转入 20ml含有4ml新鲜菌液(ER2738，OD＝0.2～0.4)的LB(四环素抗性)培养液中，37℃孵 育15min，然后37℃剧烈振摇4～5h扩增噬菌体，PEG法提纯，再进入下一轮筛选。计 数每次筛选后及扩增后的噬菌体数目。每轮阳性噬菌体的富集情况见表1。为提高特异 性，第2，3，4轮逐步减少噬菌体与细胞的结合时间(45min，30min，15min)，增强 洗脱弱亲和力的噬菌体(0.1％PBST，0.2％PBST，0.3％PBST)经4轮洗脱-扩增-洗脱 的筛选过程后，将第4轮洗脱的噬菌体铺平板，在IPTG/X-gal琼脂板上随机挑选30 个分隔良好的蓝色噬菌体斑进行大量扩增提纯，用于EILSA阳性克隆鉴定。
表1
Round Input(pfu) Output(pfu) Recovery(％) 1 2 3 4 1.0×1011 1.0×1011 1.0×1011 1.0×1011 6.6×106 8.7×106 1.1×109 1.3×108 6.6×10-5 8.7×10-5 1.1×10-2 1.3×10-3
实施例4、噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定
挑取在LB(Tet抗性)生长的ER2738单克隆于LB(Tet抗性)培养基中扩增至 OD＝0.4～0.5，用LB(Tet抗性)培养液1∶10稀释，每个试管中加入2ml。分别从4轮 筛选后测定滴度的平板上随机挑取50个蓝斑进行扩增，37℃，250rpm，振摇5h；培 养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，取80％上清，4℃保存或加 入甘油至终浓度50％后，-20℃保存。单克隆上清测定滴度后进行EL ISA鉴定。
噬菌体ELISA：将分离纯化的第2代或第3代的MSC接种在加有L-DMEM培养 基(含10％胎牛血清)的96孔培养板中培养，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底时， 吸取培养液，用PBS冲洗2次，0.25％的戊二醛4℃固定30min，用PBS冲洗2次，加 入双氧水(10μLH2O2/10ml PBS)常温作用30min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2 次，加入2％脱脂奶，4℃封闭过夜。每孔加入纯化的噬菌体1×109，室温孵育2h。0.1％PBST 洗4次，每孔加入1∶2000稀释的HRP标记抗M13噬菌体mAb(New England Biolabs) 50μL，室温孵育2h。0.1％PBST洗4次，TMB显色后测A450nm。每个克隆均设6个 平行孔，以包被PBS为阴性对照，同时以M13为对照，计算均值±标准差。从上述筛 选获得的噬菌体克隆中挑选阳性克隆比对照值＞2者，共获得8个阳性克隆(表2)。
表2
阳性克隆(A450) 对照M13(A450) 阴性对照PBS(A450) 1 2 3 4 5 6 7 8 0.233 0.230 0.280 0.258 0.240 0.248 0.358 0.263 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.104 0.104 0 104 0.104 0.104 0.104 0.104 0.104
实施例5、单链DNA提取与鉴定
对阳性噬菌体克隆进行扩增，即取50μL单克隆上清加入到5ml含有ER2738的抗 性培养基中37℃，250rpm，培养5h；培养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重 复离心一次，取80％上清。取1ml噬菌体上清，加入400μLPEG，4℃ 10min沉淀噬菌 体；4℃，12000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀；加入200μL Loddie Buffr(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，4M NaCl，常温闭光保存)重旋噬菌体；加入500μL乙 醇，混匀室温放置10min后室温12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉 淀，室温干燥5min，加入30μL DNA Free Warter溶解，取5μL用于电泳分析，其余用 于序列测定。从电泳图(图4)可见提取8个阳性克隆的ssDNADNA条带为3.4kb，证 实提取的是噬菌体的ssDNA。
实施例6、阳性克隆DNA测序及多肽氨基酸序列分析
对8个阳性克隆的ssDNA由上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序 分析，其编码氨基酸序列见表3。对8个阳性克隆的氨基酸进行对比分析，发现Asn、 Lys、Thr、Ser在筛选的阳性克隆中出现的几率较大，因此选用 Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu进行化学合成。为了便于检测，对此肽加入FITC作为荧光 标记，由北京中科亚光生物科技有限公司合成的序列为 FITC-Ahx-Cys-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys。
表3
编号 氨基酸序列 1 2 3 4 5 6 7 8 Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ser Ser Ser Leu Thr Asp Thr Leu Pro Asp Pro Glu Asn Pro Ile Thr Phe Asp Asn Lys Pro Leu Met Asn Asn Gln Lys Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser Ser Lys Ile Ser Ser Leu Leu Asp Ser Ala Trp
实施例7、合成肽对MSC亲和性的检测
1×104的MSC接种于96孔板，长至90％密度后，去除培养液，用100μL含有100μM FITC标记肽的无血清培养液中，37℃孵育30min，荧光显微镜检测可见100％细胞呈现 绿色荧光，见图5。
用流氏细胞仪检测合成肽对MSC的亲和性，步骤如下：分离纯化的的Wistar大鼠 MSC，2×105消化后用PBS冲洗一遍，加入200μL浓度为100μM的合成肽，37℃恒温 培养箱中孵育30min，用PBS冲洗2遍，1％多聚甲醛固定后进行流氏检测，设立阴性 对照除自身对照外，还以随机不相干的胶质瘤细胞9L为阴性对照。流氏检测结果显示 几乎100％MSC标记上绿色荧光，荧光强度为自身阴性对照的29.7倍，为阴性对照的 3.8倍，说明合成肽对MSC有结合特异性。见图6。
序列表
<210>1
<211>21
<212>DNA
<400>1
ctatcaggct tattctgatc a 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<400>2
agcgacctct tcttatgctc a 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<400>3
agctgcttag gcttccaaga c 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<400>4
tcactaggcg acgccgtcga c 21
<210>5
<211>21
<212>DNA
<400>5
ttatgctaat catcctcact a 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<400>6
tgagactgat taataagcag c 21
<210>7
<211>21
<212>DNA
<400>7
agcggaaaat tatgcttccg c 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<400>8
agcctactag tctcctccaa c 21
图2大鼠间充质干细胞的形态(×100)
图3大鼠骨髓间充质干细胞流氏鉴定
(1)FITC-CD90阳性表达
(2)FITC-CD45阳性表达
(3)PE-CD31阳性表达
(4)FITC-CD44阳性表达
图4阳性克隆噬菌体克隆的DNA电泳分析
图5FITC标记合成肽与大鼠MSC结合的荧光观察
图6FITC标记合成肽与大鼠MSC结合的流氏分析
(1)大鼠脑胶质瘤9L细胞阴性对照
(2)大鼠脑胶质瘤9L细胞与FITC标记合成肽的结合
(3)大鼠骨髓间充质干细胞阴性对照
(4)大鼠骨髓间充质干细胞与FITC标记合成肽的结合
表1阳性噬菌体的富集
表2阳性噬菌体克隆的EL ISA法鉴定
表38个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列
具体实施方案
结合附图说明本发明的具体实施方法如下：
实施例1、以大鼠为例说明MSC的分离培养
本实施例的实验步骤如下：
选用6周龄健康wistar大鼠(约150克，雌雄不限)，无菌条件下分离股骨、胫骨， 冲出骨髓，吹打成细胞悬液，1200rpm，离心5min。弃上清，PBS重悬细胞，将细胞 悬液贴壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液(比重1.083)的离心管中，使悬于上层， 1800rpm，离心25min。收集云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中，PBS洗涤一 次(1200rpm离心5min)，弃上清，用含10％新生小牛血清L-DMEM重悬。以1×105/ml 接种细胞于培养瓶中，于饱和温度、37℃、pH7.2条件下培养于5％CO2恒温培养箱。 3d时首次换液，以后每周换液两次，待细胞接近90％融合时，胰蛋白酶消化，1×104/ml 传代，标记为第一代，倒置显微镜逐日观察，待细胞铺满瓶底时，重复上述操作，反复 传代扩增，每次传代用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，严格控制酶的量和消化时间，将 MSC与可能混杂的淋巴细胞、单细胞分开，从而得到纯化的MSC(见图2)。
实施例2、大鼠骨髓MSC表面标志与纯度的鉴定
取第4代培养扩增的大鼠骨髓间充质干细胞，0.25％胰酶消化收集细胞，1200rpm 离心5min。以PBS洗涤细胞2次后，用1ml PBS重悬细胞，计数。用PBS调整细胞浓 度为1×106个/ml，按5×105个细胞/管将细胞平均分至多个EP管中，分别将PE或FITC 标记的多个抗体CD90、CD45、CD44和CD31(Peprotech公司产品)各5μl加入各管 中，室温下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重悬细胞后，用流式细胞 仪对培养扩增细胞的表面标志进行检测和鉴定。结果显示，培养扩增的大鼠骨髓间充质 干细胞CD90、CD45、CD44和CD31表达阳性(见图3)。
实施例3、MSC亲和肽的筛选
本实施例的实验步骤如下：
将分离纯化的第2代或第3代的MSC接种在加有L-DMEM培养基(含10％胎牛血 清)的6孔培养板中培养2d，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底时，吸取培养液，用 L-DMEM培养基冲洗2次，加入1ml含10μL Ph.D.-C7C噬菌体肽库的原液(滴度为 6.5×1012pfu/mL)L-DMEM培养基于37℃孵育1h。用含有0.1％Tween20的PBS液洗涤 4次，每次1min。去除与MSC非特异结合的噬菌体，然后每孔加入1mL pH2.2的甘氨 酸缓冲液于冰上放置8min，并不时摇动以使洗脱出结合到细胞表面的噬菌体。吸出洗 脱下来的噬菌体，迅速用Tris(pH9.8)缓冲液中和。留10μl进行滴度测定，剩余转入 20ml含有4ml新鲜菌液(ER2738，OD＝0.2～0.4)的LB(四环素抗性)培养液中，37℃孵 育15min，然后37℃剧烈振摇4～5h扩增噬菌体，PEG法提纯，再进入下一轮筛选。计 数每次筛选后及扩增后的噬菌体数目。每轮阳性噬菌体的富集情况见表1。为提高特异 性，第2，3，4轮逐步减少噬菌体与细胞的结合时间(45min，30min，15min)，增强 洗脱弱亲和力的噬菌体(0.1％PBST，0.2％PBST，0.3％PBST)经4轮洗脱-扩增-洗脱 的筛选过程后，将第4轮洗脱的噬菌体铺平板，在IPTG/X-gal琼脂板上随机挑选30 个分隔良好的蓝色噬菌体斑进行大量扩增提纯，用于EILSA阳性克隆鉴定。
表1
Round Input(pfu) Output(pfu) Recovery(％) 1 2 3 4 1.0×1011 1.0×1011 1.0×1011 1.0×1011 6.6×106 8.7×106 1.1×109 1.3×108 6.6×10-5 8.7×10-5 1.1×10-2 1.3×10-3
实施例4、噬菌斑的扩增及噬菌体阳性克隆的鉴定
挑取在LB(Tet抗性)生长的ER2738单克隆于LB(Tet抗性)培养基中扩增至 OD＝0.4～0.5，用LB(Tet抗性)培养液1∶10稀释，每个试管中加入2ml。分别从4轮 筛选后测定滴度的平板上随机挑取50个蓝斑进行扩增，37℃，250rpm，振摇5h；培 养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重复离心一次，取80％上清，4℃保存或加 入甘油至终浓度50％后，-20℃保存。单克隆上清测定滴度后进行EL ISA鉴定。
噬菌体ELISA：将分离纯化的第2代或第3代的MSC接种在加有L-DMEM培养 基(含10％胎牛血清)的96孔培养板中培养，待细胞生长良好至单层贴壁铺满板底时， 吸取培养液，用PBS冲洗2次，0.25％的戊二醛4℃固定30min，用PBS冲洗2次，加 入双氧水(10μLH2O2/10ml PBS)常温作用30min去除内源性过氧化物酶。PBS冲洗2 次，加入2％脱脂奶，4℃封闭过夜。每孔加入纯化的噬菌体1×109，室温孵育2h。0.1％PBST 洗4次，每孔加入1∶2000稀释的HRP标记抗M13噬菌体mAb(New England Biolabs) 50μL，室温孵育2h。0.1％PBST洗4次，TMB显色后测A450nm。每个克隆均设6个 平行孔，以包被PBS为阴性对照，同时以M13为对照，计算均值±标准差。从上述筛 选获得的噬菌体克隆中挑选阳性克隆比对照值＞2者，共获得8个阳性克隆(表2)。
表2
阳性克隆(A450) 对照M13(A450) 阴性对照PBS(A450) 1 2 3 4 5 6 7 8 0.233 0.230 0.280 0.258 0.240 0.248 0.358 0.263 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.118 0.104 0.104 0 104 0.104 0.104 0.104 0.104 0.104
实施例5、单链DNA提取与鉴定
对阳性噬菌体克隆进行扩增，即取50μL单克隆上清加入到5ml含有ER2738的抗 性培养基中37℃，250rpm，培养5h；培养液4℃，10000rpm，离心5min，取上清重 复离心一次，取80％上清。取1ml噬菌体上清，加入400μLPEG，4℃ 10min沉淀噬菌 体；4℃，12000rpm离心10min，获得噬菌体沉淀；加入200μL Loddie Buffr(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，4M NaCl，常温闭光保存)重旋噬菌体；加入500μL乙 醇，混匀室温放置10min后室温12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤沉 淀，室温干燥5min，加入30μL DNA Free Warter溶解，取5μL用于电泳分析，其余用 于序列测定。从电泳图(图4)可见提取8个阳性克隆的ssDNADNA条带为3.4kb，证 实提取的是噬菌体的ssDNA。
实施例6、阳性克隆DNA测序及多肽氨基酸序列分析
对8个阳性克隆的ssDNA由上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA测序 分析，其编码氨基酸序列见表3。对8个阳性克隆的氨基酸进行对比分析，发现Asn、 Lys、Thr、Ser在筛选的阳性克隆中出现的几率较大，因此选用 Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu进行化学合成。为了便于检测，对此肽加入FITC作为荧光 标记，由北京中科亚光生物科技有限公司合成的序列为 FITC-Ahx-Cys-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys。
表3
编号 氨基酸序列 1 2 3 4 5 6 7 8 Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ser Ser Ser Leu Thr Asp Thr Leu Pro Asp Pro Glu Asn Pro Ile Thr Phe Asp Asn Lys Pro Leu Met Asn Asn Gln Lys Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser Ser Lys Ile Ser Ser Leu Leu Asp Ser Ala Trp
实施例7、合成肽对MSC亲和性的检测
1×104的MSC接种于96孔板，长至90％密度后，去除培养液，用100μL含有100μM FITC标记肽的无血清培养液中，37℃孵育30min，荧光显微镜检测可见100％细胞呈现 绿色荧光，见图5。
用流氏细胞仪检测合成肽对MSC的亲和性，步骤如下：分离纯化的的Wistar大鼠 MSC，2×105消化后用PBS冲洗一遍，加入200μL浓度为100μM的合成肽，37℃恒温 培养箱中孵育30min，用PBS冲洗2遍，1％多聚甲醛固定后进行流氏检测，设立阴性 对照除自身对照外，还以随机不相干的胶质瘤细胞9L为阴性对照。流氏检测结果显示 几乎100％MSC标记上绿色荧光，荧光强度为自身阴性对照的29.7倍，为阴性对照的 3.8倍，说明合成肽对MSC有结合特异性。见图6。
序列表
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<212>DNA
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agctgcttag gcttccaaga c 21
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<212>DNA
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tcactaggcg acgccgtcga c 21
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<212>DNA
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ttatgctaat catcctcact a 21
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<212>DNA
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tgagactgat taataagcag c 21
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<212>DNA
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