技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，涉及一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒。
背景技术
[0002] 乳腺癌目前是全球范围内最常见、致死人数最多的
恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率增长迅速。要降低乳腺癌病人的死亡率除了在病因
预防上降低发病率外，提高早期诊断
水平和药物
治疗的疗效是两个重要方面。然而，
肺癌的早期诊断一直是一个世界性难题，目前影像诊断(B超、钼靶)，化学诊断(癌反应，血清学和免疫学指标)及组织细胞学诊断是肿瘤诊断的三大支柱，前者在亚临床期诊断上有很大局限性，后二者均以肿瘤标志物作为观察指标，可以比影像诊断更早发现肿瘤的存在，具有高效、高灵敏性、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此，在乳腺癌早期诊治研究中，筛选及鉴定高特异性的乳腺癌肿瘤标志物一直是研究的重点和难点。
[0003] 所谓肿瘤标志物，是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质，反映着肿瘤的存在和生长。我们可通过利用化学、免疫、分子生物学等技术对血液或分泌物进行定性或者定量的检测，通过对其分析，帮助我们从正常组织中区别肿瘤或者测定肿瘤细胞核、
细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨别肿瘤细胞的标志。乳腺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最初阶段涉及到许多乳腺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样。
[0004] 由于乳腺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性及多态性，造成单一标志物检测对乳腺癌的诊断价值有限，只能反映了
疾病某些侧面的变化，国内外众多学者倾向于筛选多种有价值的肿瘤标志物进行联合检测，以提高乳腺癌诊断的阳性率。虽然联合检测优于单项检测已成共识，但并非任意一种组合均能提高临床诊断的阳性率，在最佳组合上结论颇不一致，甚至出现相反的结果。因此，寻找一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于乳腺癌临床诊治的生物标志物已成为乳腺癌研究中亟待解决的问题之一。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物，所述标记物包括miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339。
[0007] 在本发明的第二方面，提供了上述miRNA标志物在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。
[0008] 在本发明的第三方面，提供了一种乳腺癌诊断试剂盒，其能够测定组织中的miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339的含量。
[0009] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒含有miR-146a,miR-155,miR-21,miR-222和miR-339的引物和探针。
[0010] 在本发明的一个优选例中，上述引物和探针针对的目标序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0011] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒中含有美国应用生物系统公司的引物探针组合，其产品编号分别为000468、002623、000397、002276和002184。
[0012] 在本发明的一个优选例中，上述试剂盒中还含有内参RNU44。
[0013] 所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0014] 上述人类乳腺癌诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括
荧光定量PCR反应板、PCR反应板
封口膜等。
[0015] 可使用本领域技术人员所熟知的多种技术(例如定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测等)测定相关miRNA在乳腺癌患者和健康人群中的水平；在本发明的具体实施方案中，使用了定量PCR的方法。
[0016] 在本发明的第四方面，提供了上述肺癌诊断试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
[0017] (1)从待测试样品中提取总RNA；
[0018] (2)将步骤(1)提取得到的总RNA使用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；
[0019] (3)将步骤(2)得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以RNU44为内参，检测结果以△Ct表示，其中△Ct＝CtmiRNA-CtRNU44；
[0020] (4)将得到的结果代入公式0.987+0.032a-0.084b-0.061c+0.045d+0.004e中，将计算值与0.709比较，如计算值大于0.709，则判断为乳腺癌；如计算值小于0.709，则判断为非乳腺癌。其中a代表miR-146a的△Ct值，其中b代表miR-155的△Ct值，其中c代表miR-21的△Ct值，其中d代表miR-222的△Ct值，其中e代表miR-339的△Ct值。
[0021] 本发明的有益效果在于：
发明人通过广泛的文献调研，从公开发表的文献中筛选出可能具有潜
力的肿瘤标志物，并通过大量的实验和分析，首次发现了对乳腺癌具有较高诊断价值的生物标记物miR-146a、miR-155、miR-21、miR-222和miR-339五种miRNA；通过miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可以使得乳腺癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为提高临床治疗效果奠定
基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
[0022] 图1为正常对照及乳腺癌组织中miRNA表达的ROC曲线图。
[0023] 图2为计算模型1所得预测概率的ROC曲线图。
具体实施方式
[0024] 一、研究对象
[0025] 病例组为2009年2月至2012年12月在常州市第二人民医院收集的96例乳腺癌病例，均经病理
组织学确诊，手术前未经化放疗。由于正常的医疗过程中无法取得健康女性的乳腺标本，因此对照组采用同期的
纤维囊性乳腺病患者的手术标本11例，取其中的正常组织做为对照，按性别和年龄(±5岁)与病例进行频数匹配。用于研究的样本为同期收取，
采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的
整理。
[0026] 二、研究方法
[0027] (1)使用10％中性甲
醛充分固定手术标本，脱水、
石蜡包埋、切片、HE
染色后，由病理医师对切片进行组织学诊断，确定肿瘤组织、正常组织区域，并进行标记。
[0028] (2)按照石蜡组织总RNA快速提取试剂盒(美国QIAGEN公司)
说明书从石蜡组织中提取总RNA。
[0029] (3)按照miRNA逆转录试剂盒(TaqMan microRNA反转录试剂盒，货号NO.1302146R，美国ABI公司)说明书进行逆转录反应。反应总体积为15ul(总RNA5ul，TaqMan MicroRNA Assay 3ul,核酸酶自由水4.16ul，RNase
抑制剂0.19ul，缓冲液1.5ul，Multiscribe逆转录酶1.00ul和dNTP0.15ul)，在不同
温度下(16℃，42℃，85℃，4℃)进行不同时长(30mins，30mins，5mins，10mins)反应。
[0030] (4)实时荧光定量PCR按照TaqMan试剂盒(TaqMan通用混合试剂盒II，货号NO.121207，美国ABI公司)说明书进行。PCR扩增体系总体积为10ul，反应共40个循环。PCR反应Ct值通过7900实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)测定，每个反应重复三次，以RNU44为内参。检测结果以△Ct表示，其中△Ct＝CtmiRNA-CtRNU44，△Ct值越大，表达量越低。
[0031] 三、研究结果
[0032] 病例组miR-146a,miR-155,miR-21,miR-222和miR-339的水平显著高于正常对照组，具体数据如表1所示：
[0033] 表1：正常乳腺(NC)及乳腺癌(BC)组织中microRNA表达水平(△Ct，均值±标准差)[0034]
[0035] 表2：miRNA引物探针信息及目标序列
[0036]
[0037]
[0038] ROC曲线分析显示，miR-146a,miR-155,miR-21,miR-222和miR-339五种miRNA作为生物标记物对乳腺癌具有较高诊断价值(AUC为0.971，敏感度和特异度分别为94.8％和90.9％)，结果见附图1。
[0039] 以上述五种miRNA为自变量，五种miRNA联合预测概率为应变量进行线性拟合，计算得到预测概率值，将该计算模型(计算模型1)所得的数值再次进行ROC曲线分析，结果显示，该计算模型所得数值依然具有极高的诊断价值，AUC为0.952，界限值为0.709，敏感度和特异度分别为89.6％和90.9％。结果见表3、表4和图2。
[0040] 表3：以五种microRNA△Ct为变量的线性拟合模型(以下简称“模型1”)汇总[0041]
[0042] 表4：模型1系数表
[0043]
[0044] 计算模型1：0.987+0.032a-0.084b-0.061c+0.045d+0.004e
[0045] 分析方法说明：使用SPSS 19.0
软件包进行数据分析，对于两组之间的比较，首先进行方差齐性检测，对于方差齐性的两组数据，采用Student’s t-test进行比较分析；对于方差不齐的两组数据，采用Welch校正分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。将具有统计学差异的数据进行二元logistic回归，得出预测概率值，并将预测概率值用于后续ROC曲线分析。ROC曲线分析用于评价miRNA在乳腺癌诊断中的价值，曲线下面积(AUC)越接近1，则说明该指标作为乳腺癌诊断的价值越高。
[0046] 用于乳腺癌诊断的试剂盒包括美国应用生物系统公司的引物探针组合，其产品编号分别为000468、002623、000397、002276和002184；还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等，这些都是本领域技术人员熟知的；另外还可以含有标准品和/或对照品。
[0047] 上述人类乳腺癌诊断试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是定量PCR扩增试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的；所述的试剂例如(但不限于)：阴性对照品、阳性对照品；还可以包括荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。
[0048] 本发明提及的所有文献都在本
申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
[0050] <110>常州杰傲医学检验所有限公司
[0051] <120>一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
[0052] <160>5
[0053] <210>1
[0054] <211>22
[0055] <212>RNA
[0056] <213>人工序列
[0057] <400>1
[0058] UGAGAACUGA AUUCCAUGGG UU
[0059] <110>常州杰傲医学检验所有限公司
[0060] <120>一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
[0061] <160>5
[0062] <210>2
[0063] <211>23
[0064] <212>RNA
[0065] <213>人工序列
[0066] <400>2
[0067] UUAAUGCUAA UCGUGAUAGG GGU
[0068] <110>常州杰傲医学检验所有限公司
[0069] <120>一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
[0070] <160>5
[0071] <210>3
[0072] <211>22
[0073] <212>RNA
[0074] <213>人工序列
[0075] <400>3
[0076] UAGCUUAUCA GACUGAUGUU GA
[0077] <110>常州杰傲医学检验所有限公司
[0078] <120>一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
[0079] <160>5
[0080] <210>4
[0081] <211>20
[0082] <212>RNA
[0083] <213>人工序列
[0084] <400>4
[0085] AGCUACAUCUGGCUACUGGGU
[0086] <110>常州杰傲医学检验所有限公司
[0087] <120>一种用于乳腺癌诊断的miRNA标志物、其应用及诊断试剂盒
[0088] <160>5
[0089] <210>5
[0090] <211>23
[0091] <212>RNA
[0092] <213>人工序列
[0093] <400>5
[0094] UGAGCGCCUC GACGACAGAG CCG
