检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试剂盒和方法
阅读：272发布：2020-05-15
专利汇可以提供检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试剂盒和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用 磁珠 、高效液相层析柱子、或毛细管 电泳 柱子等支持基质的方法捕获 生物 样品中 肿瘤 蛋白质 组，用 磁性 分离器或高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子分离样品，无需离心样品。然后用质谱法进行分析的蛋白指纹法(PFT)。本发明的方法可用于正常人与传统 肿瘤标记物 表达阴性肿瘤的蛋白指纹、质谱多肽图谱、或免疫组质谱(IMS)检测的 试剂 盒 。本发明可用于监测肿瘤复发或转移、 预后 评估、分子分型及个体化诊疗的试剂盒和方法。本方法准确、方便且快捷。，下面是检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试剂盒和方法专利的具体信息内容。
1.一种用磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子等支持基质的方法捕获生物 样品中肿瘤蛋白质组的试剂盒和方法，其特征是采用蛋白指纹法对传统肿瘤标记物表达阴 性肿瘤中蛋白质组或质谱多肽图谱进行鉴别检测和对肿瘤预后评估。用标准化质控血清 (浆)控制下的定量性质谱分析来检测。该方法通过以下步骤实现：
(1)样品处理及质谱标准化质控血清(浆)制备；
(2)基质与血清(浆)结合试剂盒制备、样品上样；
(3)洗涤；
(4)质谱的定量控制及质谱检测；
其中所述步骤(1)将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用O型血，男女相等，混合制备 质谱的标准化质控血清(浆)；所述步骤(2)将质谱的标准化质控血清(浆)及样品点样 在有支持物的基质中的一个位点上。支持物用磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱 子。基质是用WCX阴离子基质、C8/C18疏水基质或抗体(组)基质与血清(浆)选择性结 合；所述步骤(3)用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。 洗涤溶液在位点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上 步骤。用三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片或位点上。所 述步骤(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制备的饱和标准溶液)用 质谱仪去分析滞留与各位点的生物标志或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用质谱仪去 分析。对血液进行蛋白质对比分析，用计算机分析血液中质荷比数据。本试剂盒依据几个 特征性肿瘤相关蛋白指纹1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、 3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.91、 8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、 15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、 45371.05、51243.46±30Da，双盲测试正常人与传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的敏感性 100％，特异性90％。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控 血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634±1Da强度调至50％质谱 信号强度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da标准峰为质谱定性(分 子量)质控标准。
2.权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用的基质包括阴离子作用、疏水作用、或 抗体(组)作用吸附剂。
3.权利要求2中支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁珠、高效液相层析柱子、 或毛细管电泳柱子等。
4.一种权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，它包括：一容器以及装于容 器中的权利要求1所述的生物样品。将生物样品分装100μl一小管，于-80℃储存或取 生物样品1∶2稀释于一小管U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL)，25℃储存。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征于，所述的生物样品为血清或血浆。
6.权利要求1所述的特征性肿瘤相关蛋白指纹的生物标志群为：truncated fibrinopeptide A、truncated alpha-2-HS-glycoprotein chain B、 alpha-2-HS-glycoprotein chain B、truncated inter-alpha inhibitor heavy chain4、 truncated serum amyloid A2 protein、truncated apolipoprotein C-I、truncated beta-thromboglobulin、truncated apolipoprotein A-II、apolipoprotein A-II、 C3-anaphylatoxin Des-Arg、haptoglobin-1 alpha-1 chain、truncated haptoglobin-2、 serum amyloid A2 protein、beta-2-microglobulin、truncated transthyretin、 transthyretin、hemoglobin beta chain、apolipoprotein M、apolipoprotein A-I、 apolipoprotein E、alpha-1-microglobulin precursor、alpha-1-antichymotrypsin、 alpha-2-HS-glycoprotein precursor、vitamin D-binding protein、apolipoprotein A-IV。
7.一种权利要求6所述的生物标志群在免疫组质谱(IMS)检测的用途，其特征在于， 用于制备检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤其生物标志的抗体及试剂盒。
8.一种权利要求7所述的检测传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的试剂盒，其特征在于， 它包括：一容器以及装于容器中的权利要求8所述的检测传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤 的生物标志抗体(组)。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征于，所述的抗体(组)为单克隆抗体(组) 或多克隆抗体(组)。
10.权利要求1用于监测肿瘤复发或转移、分子分型及个体化诊疗的试剂盒和方法。
技术领域
本发明涉及一种新的传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤生物样品中蛋白质分析方法的试 剂盒。一种通过能与蛋白质结合的基质去捕获生物标志，并用有定量控制的质谱分析来检 测传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物标志。在此提及的此项发明涉及蛋白质检测领域， 为一种新的非侵入性的体外质谱检测方法。本发明可以应用到已经脱离人体的体液中的传 统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物标志组合的检测方法或试剂盒。本发明可用于监测肿瘤 复发或转移、预后评估、分子分型及个体化诊疗的试剂盒和方法。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人民生命健康的疾病。2005年统计显示恶性肿瘤已成为城市 居民死亡的第一原因。近年来，随着我国城乡居民生活水平的提高，部分恶性肿瘤发病率 有上升趋势。据有关部门统计恶性肿瘤死亡率每年递增1.8％，发病率每年递增2.5％。 我国恶性肿瘤排名演变为：肺癌(女性为乳腺癌)，肝癌，胃癌，食管癌，结直肠癌或前 列腺癌。虽然近年来对恶性肿瘤的治疗取得巨大进展，但仍有相当数量的恶性肿瘤患者死 于复发或转移，因此建立一种恶性肿瘤预后评估体系显得尤为重要。它将有助于监测肿瘤 复发或转移，指导临床治疗以及评估疗效，以达到降低病死率，提高肿瘤患者生活质量的 目的。目前临床上对恶性肿瘤患者预后评估主要依赖于临床表现，病理学依据及传统血清 肿瘤标记物(tumor marker)测定，但肿瘤早期复发或转移时常并无明显临床表现，而病 理学证据有时候很难得到且重复性差。传统血清肿瘤标记物因其相对敏感性及特异性和较 好的可重复性在恶性肿瘤预后评估中有重要价值，如原发性肝癌甲胎蛋白(AFP)的检测 及胃癌、结直肠癌中癌胚抗原(CEA)的检测等。但临床工作中也发现有相当比例的恶性 肿瘤患者上述肿瘤标记物表达阴性，如甲胎蛋白(AFP)在肝癌中的检出率(阳性表达率) 仅为40～60％，癌胚抗原(CEA)在结直肠癌中的检出率(阳性表达率)为60～70％， CYFR21-1在肺癌的检出率(阳性表达率)为40～50％，而对于传统肿瘤标记物表达阴性的 恶性肿瘤患者的预后评估则缺乏有效的早期监测手段。
蛋白质组学作为21世纪现代科技前沿在生物医学方面的应用越来越广泛。蛋白质组 学应用于生物医学方面的优点在于可以高通量的方式筛选和鉴定和疾病相关的生物标记 分子，即可通过寻找差异表达蛋白质，发现疾病相关的蛋白质及用于寻找与某些疾病诊断 相关的特异性标志物等。以往蛋白质研究多采用色谱分离纯化、双相电泳、光谱定量或定 性等分析化学的方法，这些方法所需技术条件高，步骤繁琐，耗时，不适于大规模筛查和 临床检测。采用蛋白质组学技术研究肿瘤早期监测、肿瘤转移相关蛋白是当前国内外肿瘤 学研究的热点。样本的选取和所采用的检测技术是研究的关键。
血液，由于易采集性和对机体的生理状况的易记录性，成为研究生物标记物的最好的 来源之一。蛋白指纹图谱(质谱)技术(MALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MS)是近几年发展起 来的实验室诊断新技术，它且具有操作较简便、多样本检测、检测快速、灵敏性和特异性 高等优点，是实验室诊断技术革命性的进展。蛋白指纹图谱技术(protein fingerprinting technology，PFT)在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是肿瘤的早期检测。蛋 白指纹图谱技术是一项发展前景非常好的检测技术，具有广阔的临床应用前景。使用蛋白 指纹图谱技术已经成为研究比较蛋白质组学和发现生物标记物可选用的方法，尤其在多肽 及低分子量蛋白质质谱分析的研究中非常有用。但是，将此技术应用于恶性肿瘤预后评估、 分子分型和个体化诊疗(转归、药物及放射敏感性、分期)，尤其是传统肿瘤标记物表达 阴性的患者预后评估及分子分型则尚未见相似报道。
蛋白质组学作为21世纪现代科技前沿在生物医学方面的应用越来越广泛。蛋白质组 学应用于生物医学方面的优点在于可以高通量的方式筛选和鉴定和疾病相关的生物标记 分子，即可通过寻找差异表达蛋白质，发现疾病相关的蛋白质及用于寻找与某些疾病诊断 相关的特异性标志物等。以往蛋白质研究多采用色谱分离纯化、双相电泳、光谱定量或定 性等分析化学的方法，这些方法所需技术条件高，步骤繁琐，耗时，不适于大规模筛查和 临床检测。采用蛋白质组学技术研究肿瘤早期监测、肿瘤转移相关蛋白是当前国内外肿瘤 学研究的热点。样本的选取和所采用的检测技术是研究的关键。
血液，由于易采集性和对机体的生理状况的易记录性，成为研究生物标记物的最好的 来源之一。蛋白指纹图谱(质谱)技术(MALDI-TOF-MS、SELDI-TOF-MS)是近几年发展起 来的实验室诊断新技术，它且具有操作较简便、多样本检测、检测快速、灵敏性和特异性 高等优点，是实验室诊断技术革命性的进展。蛋白指纹图谱技术(protein fingerprinting technology，PFT)在医学领域的应用，主要用于多种疾病，特别是肿瘤的早期检测。蛋 白指纹图谱技术是一项发展前景非常好的检测技术，具有广阔的临床应用前景。使用蛋白 指纹图谱技术已经成为研究比较蛋白质组学和发现生物标记物可选用的方法，尤其在多肽 及低分子量蛋白质质谱分析的研究中非常有用。但是，将此技术应用于恶性肿瘤预后评估、 分子分型和个体化诊疗(转归、药物及放射敏感性、分期)，尤其是传统肿瘤标记物表达 阴性的患者预后评估及分子分型则尚未见相似报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种在传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物样品中检测的方法。 该方法为传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新的 传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物标志提供了基础及将此技术应用于恶性肿瘤预后评 估、分子分型和个体化诊疗(转归、药物及放射敏感性、分期)的方法。
本发明采用质谱技术对临床上常见且发病率较高的恶性肿瘤如肝癌，结直肠癌，乳腺 癌，胃癌患者等进行预后评估。选取传统肿瘤标记物表达阴性患者(肝癌-AFP阴性，胃 癌-CEA阴性，结直肠癌-CEA阴性，乳腺癌-CA153阴性)进行动态血清蛋白质指纹测定 及随访，并评估相关蛋白质指纹变化与手术前后以及肿瘤复发和转移的关系，并与传统肿 瘤标记物表达阳性患者血清蛋白质进行对比分析，筛选用于传统肿瘤标记物表达阴性的患 者预后评估的血清蛋白指纹图谱并评估其应用价值，以建立一种新型快速、早期、简便、 准确的恶性肿瘤预后评估体系。为早期发现肿瘤复发或转移，监测肿瘤治疗效果，减少肿 瘤病死率，相关试剂的开发及药物的研制提供理论依据、新的研究手段与途径。
生物标志(biomarker)的研究分为三个阶段：发现生物标志、鉴定生物标志、验证 生物标志。选取经病理确诊且接受择期手术的恶性肿瘤患者，其中正常对照组300名，甲 胎蛋白表达阴性原发性肝癌患者30名，阳性患者30名，CEA表达阴性胃癌及结直肠癌患 者各30名，阳性患者各30名，CA153表达阴性乳腺癌患者30名，阳性患者30名；CYFR21-1 表达阴性肺癌患者30名，阳性患者30名；食管癌患者30名。并于术前排除影响血清蛋 白质含量的相关性疾病史。对照组与患病组年龄、性别匹配，患者未经放化疗，病历资料 齐全，病理诊断明确。
收集患者的一般体检资料、病史、主要临床症状及各种检查结果填表并进行随访(为 期两年)，记录患者发现术后复发或转移情况。收集其不同发病时间段的血清标本(术前， 术后两周，三个月，半年，一年，两年)取患者术前血或健康志愿者外周血。采集后立即 于4℃冰箱静置2小时，4℃4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃12000r/min 再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100μl/管，共 5管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。
建立用质谱技术比较分析传统肿瘤标记物阴性的恶性肿瘤患者血清蛋白指纹图谱的 方法，并对实验方法和条件进行完善，如质控血清设定、参数的设定、缓冲体系的选择、 基质的选择及处理、基质的检测与数据处理方法等。对所建立的蛋白指纹图谱分析方法进 行系统评价，分析方法的特异性、灵敏度、准确度及重复性。
用质谱技术对不同时间点的传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者和阳性患者血 清蛋白质进行对比分析，筛选可用于传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者预后评估的 血清蛋白指纹图谱。
筛选与确定可用于的传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者预后评估的新的特异 性生物标志，并分析其生化特性(分子量、pI)及临床应用价值，并初步建立预后评估体 系及疗效监测体系。
本发明涉及一种通过生物标志结合的基质表面，并用定量性质谱分析来同时检测多种 生物标志状态。
本发明中的生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1％。
基质是任何能与生物标志选择性或特异性结合的物质。举例说明，WCX阴离子作用、 C8/C18疏水作用、抗体(组)基质吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产 生的吸附剂具有诊断反面的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质)。底基洗去未吸附 的物质。任何适宜的洗液均可使用。
生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合基质吸附表面捕获，非吸附物能从基质 上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生源，如激 光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的 离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控： 每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da 强度调至50％质谱信号强度的最大值。生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。 这样，生物标志的数量与质量都可以被检测出来。
飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子 化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干 扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包 括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而 减轻高频噪音。
通过对生物标志的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。 该计算机程序分析这些数据以显示检测出的生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被 检测的每个生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志的信号强度和矫 正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度， 可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的 干扰，这可以设置调零。
计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形 式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分 子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生 物标志物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。
分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选 择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于 一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序 中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本 聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的 峰指定一个质量(质荷比)簇。
发明中使用的生物标志是基质所捕获。这些生物标记是进一步通过质谱(mass spectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。
对生物标志的检测需要将一个样本放在磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子 上等基质的一个吸附点上，接着进行清洗。电喷雾电离质谱(electrospray ionizsation mass spectrometry，ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从 毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大， 最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式 进入气相。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)的基本原 理是向吸附点上加入SINAPINIC酸分子等并让其干燥，将分析物分散在SINAPINIC酸分子 中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于SINAPINIC酸分子经辐射所吸收的能量，导致 能量蓄积并迅速产热，从而使SINAPINIC酸分子晶体升华，致使连同分析物一起进入气相。 而后，用质谱测定法进行分析，而一个显示了蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在 蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。
特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。 通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专 有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就 要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检 测和界定方法有了很大的突破。如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿瘤的标志。
本发明利用WCX阴离子基质、利用C8/C18疏水基质磁珠、高效液相层析柱子、或毛 细管电泳柱子上的抗体(组)、磁珠上的抗体(组)为例对正常人与传统肿瘤标记物表达 阴性肿瘤的血清(浆)进行蛋白质对比分析。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试 前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0 Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。
检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试剂盒和方法的具体操作步骤：
以下是用本发明提供的一个操作方案及检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试 剂盒实例。
1.样品处理及标准化质控血清(浆)制备
将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。
质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准：供血者10人，5男5女，血 型为O型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、空 腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能检查、肾功能检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。 女性不能怀孕，男性为不吸烟者。
2.基质与肿瘤、标准化质控血清(浆)制备、样品上样
抽取O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜血液：(a)4℃下待血液凝固后马上离 心，4℃离心5min分离血清。(b)4℃下马上离心，4℃离心5min分离血浆。标准化质 控或肿瘤血清(浆)样品分装100μl一小管，于-80℃储存；或取混合血清(浆)1∶2稀 释于U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0)一小管，25℃储存。即成 为肿瘤、标准化质控血清(浆)试剂盒。将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物 的基质[WCX阴离子基质、C8/C18疏水基质或抗体(组)基质]中的一个位点上。支持物用 磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子等。基质是用于标记、结合血清(浆)的。 标记至高效液相层析柱子或毛细管电泳柱子上的基质可用液相色谱质谱联用仪(LC-MS) 的标准方法去分析。将质谱的标准化质控O血清(浆)用于质谱仪试剂盒的定量方法。
3.洗涤
用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位 点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。以下步 骤：用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有 3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制 备的饱和标准溶液)。
吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。
3.质谱的定量控制及测试
用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行 管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)标准 方法去分析滞留于各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。
定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中 用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值。定量性控制及质谱激光 能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用 于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909± 1Da、6634±1Da标准峰为质谱定性(分子量)质控标准。
本发明将蛋白质分成了几大类，即WCX阴离子、C8/C18疏水作用等蛋白。这样，可 用质谱仪直接进行分析及定量。
利用C8及C18疏水基质的实验结果与WCX阴离子基质的实验结果，通过用 Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值。分析几百种血清蛋白指纹峰，发 现下述蛋白指纹或质谱多肽图谱可以用于区分正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤。峰 值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异(图1)：
正常与肿瘤蛋白指纹或质谱多肽图谱的显著性差异
1008.9 2019.4 11091.0 1087.1 33273.1 9499.1 1266.3
1101.2 3398.2 11682.7 1573.2 1285.4 1296.5 14691.2
1212.8 2740.2 11731.1 3981.1 2548.9 2289.6 8938.3
1302.2 2859.4 12946.0 5345.2 3322.8 5269.5 8687.1
1392.2 3224.5 13761.4 15336 5912.7 6706.3 3935.3
1414.4 3272.6 15867.0 1042.9 2267.7 12862.4 4469.2
1436.8 3515.4 21253.2 2043.5 5976.3 1536.8 11490.3
1465.5 3806.0 28078.6 2092.7 13756.4 4356.2 11700.7
1481.9 4020.3 34236.6 6566.3 1338.4 9714.4 5080.3
1503.7 4417.8 23511.5 7573.1 10269.3 6016.8 5318.2
1594.4 5089.5 5543.2 9298.3 1079.21 6844.9 13130.8
1616.2 5501.9 7595.1 1070.5 3249.1 36951.7 38999.4
1683.3 6432.3 3254.5 1104.2 4160.3 6441.4 39324.6
1705.4 6532.3 5531.9 1114.4 3225.2 14151.5 45265.8
1750.1 7722.0 5549.2 3893.3 5643.2 14042.8 45371.0
1772.2 8707.9 5932.2 1061.5 6660.6 7944.5 51243.4
1793.5 8826.9 6094.2 1840.5 3165.6 21955.2 6562.3
1817.4 8938.5 6133.2 4656.2 5820.2 5957.2 7752.0
1885.3 9192.2 7776.2 5892.1 3964.1 8159.5 8968.5
1906.2 9269.0 15122.2 6119.2 4764.9 21808.2 3692.1
用筛选出几个特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、 3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.91、 8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、 15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、 45371.05、51243.46±30Da，双盲测试300例正常与180例传统肿瘤标记物表达阴性的 肿瘤，试剂盒的敏感性100％，特异性90％。
将生物标志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestion fragments)，又称多肽指纹， 的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与胰蛋白酶消化生成的消化片断的分子 量相吻合。最后，用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)对胰蛋白酶消化片断进行排序。蛋白质生物标记可用蛋白质梯状排 序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作 用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质 梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments) 在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。鉴别出传统肿瘤标记物表达阴性肿 瘤的生物标志群：
分子量 pI 鉴别出生物标志群
1,465.50 3.92 Truncated Fibrinopeptide A
2,740.27 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
2,859.42 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,224.55 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,272.64 6.67 Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4
3,515.49 10.86 Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,806.09 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,020.35 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,417.83 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,089.50 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,501.98 6.98 Truncated Serum Amyloid A2 protein
6,432.36 8.2 Truncated Apolipoprotein C-I
7,722.01 7.86 Truncated Beta-Thromboglobulin
8,707.91 5.05 Truncated Apolipoprotein A-II
8,826.91 5.05 Apolipoprotein A-II
8,938.50 9.5 C3-anaphylatoxin Des-Arg
9,192.21 5.23 Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain
9,269.05 6.04 Truncated Haptoglobin-2
11,091.08 6.8 Truncated Serum Amyloid A2 protein
11,682.70 5.89 Serum Amyloid A protein
11,731.17 6.07 Beta-2-Microglobulin
12,946.08 5.33 Truncated Transthyretin
13,761.41 5.35 Transthyretin
15,867.06 6.81 Hemoglobin Beta Chain
21,253.29 5.66 Apolipoprotein M
28,078.62 5.27 Apolipoprotein A-I
34,236.68 5.52 Apolipoprotein E
23,511.56 4.93 Alpha-1-Acid Glycoprotein
38,999.48 5.95 Alpha-1-Microglobulin Precursor
45,265.82 5.32 Alpha-1-Antichymotrypsin
39,324.68 5.43 Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor
51,243.46 5.22 Vitamin D-Binding Protein
45,371.05 5.28 Apolipoprotein A-IV
将纯化或合成的生物标志群免疫小鼠，制备传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物标 志群抗体。
用抗生物标志群抗体与质谱仪联合应用验证被分析物。质谱与抗体分离技术联合应用 即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测(Immunomic mass spectrometry analysis，IMSA)为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或 修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的 或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。抗 体组基质可放在高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子中。目前ELISA等技术主要依靠间 接的化学或放射测定法，因而无法直接鉴定抗原的变异，而用免疫组质谱技术能测定抗原 变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病的特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。 即用质谱同时可检测多种疾病特异性抗原的分子量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅 毒)，及进行窗口期检查，而ELISA技术及免疫荧光技术无法做到。由于每种特异性抗体 所捕获生物抗原的分子量是不同的，故免疫组与质谱联合应用时，质谱仪就非常容易地将 这四种抗原同时分开了。用三种以上抗体组标在磁珠上、高效液相层析柱子中、或毛细管 电泳柱子中与质谱联合，可同时检测出多种(三种以上)的生物标志及一种或一种以上变 异的或修饰的生物标志。这样产生了一种新型可用质谱仪直接进行分析多种(三种以上) 生物标志及一种或一种以上变异或修饰生物标志的方法。三色免疫荧光法可以同时分析 三种生物标志，但无法达到三种以上的生物标志的分析或像免疫组质谱检测来精确地、高 效地确定一种变异的或修饰的被分析物(抗原或生物标志)。这些生物标志组合可以用于 同时鉴别正常人及不同种类疾病的检测方法。本发明可以用于疾病的检测的金标准。举例 讲，如果用抗HIV gP120基质去捕获血清HIV gP120，质谱图显示一个120kDa蛋白，我 们可以检测HIV；如果出现一个100kDa蛋白，则可能是HIV gP120降解产物；如果出现 一个140kDa蛋白，则可能是非特异性蛋白。这时就可以用免疫组质谱检测来做氨基酸序 列鉴定：即最精确鉴别(金标准)。
将肿瘤患者按照转移情况分组，然后进行组间两两比较，各组间有显著性差异的蛋白 质峰数量种类不尽相同，其中3692Da等蛋白指纹在脏器转移组中显著增高，可监测肿 瘤复发或转移(图2)。
对肿瘤患者在根治性根除后14天再次进行检测，蛋白指纹3398Da等在根治性切除 后，血清中的浓度显著下降，基本接近于正常人，可用于监测肿瘤预后评估、分子分型及 个体化诊疗(图3)。
本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外肿瘤质谱检测方法的定量控制，如离体体液 的传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的试剂盒用于临床质谱的肿瘤检测方法。可以检测多个肿 瘤生物标志群及质谱多肽图谱。
本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：
(1)准确
质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有0.1Da。因为蛋白质是由氨基酸组 成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原 的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。
(2)方便
本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、疏水作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进 行分析。磁珠支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁性微粒或磁珠。用磁性分离器分离 磁珠及样品，无需离心样品。这样，可用质谱仪直接进行分析。
(3)快捷
用本发明提供的免疫组质谱检测进行疾病诊断时，无需对蛋白质进行测序。抗体组基 质可放在高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子中。本发明采用了计算机“条码格式”， 信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析 对比强弱，从而有助于临床复杂的诊断，如可用此“免疫组质谱蛋白指纹”或条码格式进 行医学分析。
说明书附图
图1正常人与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤蛋白指纹及质谱多肽谱的一个表示图
图2蛋白指纹3692Da在肿瘤脏器转移组中显著增高
图3蛋白指纹3398Da在肿瘤根治性切除后下降
本发明采用质谱技术对临床上常见且发病率较高的恶性肿瘤如肝癌，结直肠癌，乳腺 癌，胃癌患者等进行预后评估。选取传统肿瘤标记物表达阴性患者(肝癌-AFP阴性，胃 癌-CEA阴性，结直肠癌-CEA阴性，乳腺癌-CA153阴性)进行动态血清蛋白质指纹测定 及随访，并评估相关蛋白质指纹变化与手术前后以及肿瘤复发和转移的关系，并与传统肿 瘤标记物表达阳性患者血清蛋白质进行对比分析，筛选用于传统肿瘤标记物表达阴性的患 者预后评估的血清蛋白指纹图谱并评估其应用价值，以建立一种新型快速、早期、简便、 准确的恶性肿瘤预后评估体系。为早期发现肿瘤复发或转移，监测肿瘤治疗效果，减少肿 瘤病死率，相关试剂的开发及药物的研制提供理论依据、新的研究手段与途径。
生物标志(biomarker)的研究分为三个阶段：发现生物标志、鉴定生物标志、验证 生物标志。选取经病理确诊且接受择期手术的恶性肿瘤患者，其中正常对照组300名，甲 胎蛋白表达阴性原发性肝癌患者30名，阳性患者30名，CEA表达阴性胃癌及结直肠癌患 者各30名，阳性患者各30名，CA153表达阴性乳腺癌患者30名，阳性患者30名；CYFR21-1 表达阴性肺癌患者30名，阳性患者30名；食管癌患者30名。并于术前排除影响血清蛋 白质含量的相关性疾病史。对照组与患病组年龄、性别匹配，患者未经放化疗，病历资料 齐全，病理诊断明确。
收集患者的一般体检资料、病史、主要临床症状及各种检查结果填表并进行随访(为 期两年)，记录患者发现术后复发或转移情况。收集其不同发病时间段的血清标本(术前， 术后两周，三个月，半年，一年，两年)取患者术前血或健康志愿者外周血。采集后立即 于4℃冰箱静置2小时，4℃4000r/min离心10分钟分离血清，将血清于4℃12000r/min 再次离心5分钟，去除所有残留细胞碎片和不溶物，在冰上将血清分装为100μl/管，共 5管，保存于-80℃冰箱。避免反复冻融。
建立用质谱技术比较分析传统肿瘤标记物阴性的恶性肿瘤患者血清蛋白指纹图谱的 方法，并对实验方法和条件进行完善，如质控血清设定、参数的设定、缓冲体系的选择、 基质的选择及处理、基质的检测与数据处理方法等。对所建立的蛋白指纹图谱分析方法进 行系统评价，分析方法的特异性、灵敏度、准确度及重复性。
用质谱技术对不同时间点的传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者和阳性患者血 清蛋白质进行对比分析，筛选可用于传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者预后评估的 血清蛋白指纹图谱。
筛选与确定可用于的传统肿瘤标记物表达阴性的恶性肿瘤患者预后评估的新的特异 性生物标志，并分析其生化特性(分子量、pI)及临床应用价值，并初步建立预后评估体 系及疗效监测体系。
本发明涉及一种通过生物标志结合的基质表面，并用定量性质谱分析来同时检测多种 生物标志状态。
本发明中的生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.1％。
基质是任何能与生物标志选择性或特异性结合的物质。举例说明，WCX阴离子作用、 C8/C18疏水作用、抗体(组)基质吸附剂，分离生物化学中的这些方法和由这些方法产 生的吸附剂具有诊断反面的用途(即阴离子吸附剂捕获阳离子蛋白质)。底基洗去未吸附 的物质。任何适宜的洗液均可使用。
生物标志首先能够被具有能与生物标志物结合基质吸附表面捕获，非吸附物能从基质 上洗脱，吸附到底基的生物标志物在质谱仪中被检测。生物标志通过离子发生源，如激 光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的 离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控： 每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da 强度调至50％质谱信号强度的最大值。生物标志的检测明显地将与信号强度的检测有关。 这样，生物标志的数量与质量都可以被检测出来。
飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子 化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干 扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包 括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而 减轻高频噪音。
通过对生物标志的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。 该计算机程序分析这些数据以显示检测出的生物标志的数量，并显示信号的强度和确定被 检测的每个生物标志的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志的信号强度和矫 正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度， 可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的 干扰，这可以设置调零。
计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形 式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分 子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生 物标志物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。
分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选 择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于 一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序 中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本 聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的 峰指定一个质量(质荷比)簇。
发明中使用的生物标志是基质所捕获。这些生物标记是进一步通过质谱(mass spectrometry)测定其不同分子量来知道它们特定的身份。
对生物标志的检测需要将一个样本放在磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子 上等基质的一个吸附点上，接着进行清洗。电喷雾电离质谱(electrospray ionizsation mass spectrometry，ESI-MS)是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从 毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大， 最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式 进入气相。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)的基本原 理是向吸附点上加入SINAPINIC酸分子等并让其干燥，将分析物分散在SINAPINIC酸分子 中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于SINAPINIC酸分子经辐射所吸收的能量，导致 能量蓄积并迅速产热，从而使SINAPINIC酸分子晶体升华，致使连同分析物一起进入气相。 而后，用质谱测定法进行分析，而一个显示了蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在 蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。
特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。 通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专 有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就 要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检 测和界定方法有了很大的突破。如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿瘤的标志。
本发明利用WCX阴离子基质、利用C8/C18疏水基质磁珠、高效液相层析柱子、或毛 细管电泳柱子上的抗体(组)、磁珠上的抗体(组)为例对正常人与传统肿瘤标记物表达 阴性肿瘤的血清(浆)进行蛋白质对比分析。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试 前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0 Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。
检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试剂盒和方法的具体操作步骤：
以下是用本发明提供的一个操作方案及检测传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤质谱试 剂盒实例。
1.样品处理及标准化质控血清(浆)制备
将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中，视需要离心澄清样品。
质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准：供血者10人，5男5女，血 型为O型；年龄为18-30岁；民族汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、空 腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能检查、肾功能检查；无遗传病家族史；无重大传染病史。 女性不能怀孕，男性为不吸烟者。
2.基质与肿瘤、标准化质控血清(浆)制备、样品上样
抽取O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜血液：(a)4℃下待血液凝固后马上离 心，4℃离心5min分离血清。(b)4℃下马上离心，4℃离心5min分离血浆。标准化质 控或肿瘤血清(浆)样品分装100μl一小管，于-80℃储存；或取混合血清(浆)1∶2稀 释于U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0)一小管，25℃储存。即成 为肿瘤、标准化质控血清(浆)试剂盒。将质谱的标准化质控血清及样品点样在有支持物 的基质[WCX阴离子基质、C8/C18疏水基质或抗体(组)基质]中的一个位点上。支持物用 磁珠、高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子等。基质是用于标记、结合血清(浆)的。 标记至高效液相层析柱子或毛细管电泳柱子上的基质可用液相色谱质谱联用仪(LC-MS) 的标准方法去分析。将质谱的标准化质控O血清(浆)用于质谱仪试剂盒的定量方法。
3.洗涤
用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位 点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。以下步 骤：用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有 3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片，加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制 备的饱和标准溶液)。
吸能分子可用Sinapinic acid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid等。
3.质谱的定量控制及测试
用激光解吸/离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行 管分析阵列，或用电喷雾电离已洗脱的生物标志后用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)标准 方法去分析滞留于各位点的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。
定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清中 用于定量的标准峰6634.0Da等强度调至50％信号强度的最大值。定量性控制及质谱激光 能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)，将标准化质控血清(浆)中用 于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最大值。用2746±1Da、5909± 1Da、6634±1Da标准峰为质谱定性(分子量)质控标准。
本发明将蛋白质分成了几大类，即WCX阴离子、C8/C18疏水作用等蛋白。这样，可 用质谱仪直接进行分析及定量。
利用C8及C18疏水基质的实验结果与WCX阴离子基质的实验结果，通过用 Mann-Whitney U检验比较配对样本的蛋白峰，计算p值。分析几百种血清蛋白指纹峰，发 现下述蛋白指纹或质谱多肽图谱可以用于区分正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤。峰 值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异(图1)：
正常与肿瘤蛋白指纹或质谱多肽图谱的显著性差异
1008.9 2019.4 11091.0 1087.1 33273.1 9499.1 1266.3
1101.2 3398.2 11682.7 1573.2 1285.4 1296.5 14691.2
1212.8 2740.2 11731.1 3981.1 2548.9 2289.6 8938.3
1302.2 2859.4 12946.0 5345.2 3322.8 5269.5 8687.1
1392.2 3224.5 13761.4 15336 5912.7 6706.3 3935.3
1414.4 3272.6 15867.0 1042.9 2267.7 12862.4 4469.2
1436.8 3515.4 21253.2 2043.5 5976.3 1536.8 11490.3
1465.5 3806.0 28078.6 2092.7 13756.4 4356.2 11700.7
1481.9 4020.3 34236.6 6566.3 1338.4 9714.4 5080.3
1503.7 4417.8 23511.5 7573.1 10269.3 6016.8 5318.2
1594.4 5089.5 5543.2 9298.3 1079.21 6844.9 13130.8
1616.2 5501.9 7595.1 1070.5 3249.1 36951.7 38999.4
1683.3 6432.3 3254.5 1104.2 4160.3 6441.4 39324.6
1705.4 6532.3 5531.9 1114.4 3225.2 14151.5 45265.8
1750.1 7722.0 5549.2 3893.3 5643.2 14042.8 45371.0
1772.2 8707.9 5932.2 1061.5 6660.6 7944.5 51243.4
1793.5 8826.9 6094.2 1840.5 3165.6 21955.2 6562.3
1817.4 8938.5 6133.2 4656.2 5820.2 5957.2 7752.0
1885.3 9192.2 7776.2 5892.1 3964.1 8159.5 8968.5
1906.2 9269.0 15122.2 6119.2 4764.9 21808.2 3692.1
用筛选出几个特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、3515.49、 3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、8826.91、 8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、 15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、 45371.05、51243.46±30Da，双盲测试300例正常与180例传统肿瘤标记物表达阴性的 肿瘤，试剂盒的敏感性100％，特异性90％。
将生物标志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestion fragments)，又称多肽指纹， 的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与胰蛋白酶消化生成的消化片断的分子 量相吻合。最后，用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)对胰蛋白酶消化片断进行排序。蛋白质生物标记可用蛋白质梯状排 序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作 用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质 梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments) 在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。鉴别出传统肿瘤标记物表达阴性肿 瘤的生物标志群：
分子量 pI 鉴别出生物标志群
1,465.50 3.92 Truncated Fibrinopeptide A
2,740.27 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
2,859.42 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,224.55 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,272.64 6.67 Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4
3,515.49 10.86 Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,806.09 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,020.35 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,417.83 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,089.50 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,501.98 6.98 Truncated Serum Amyloid A2 protein
6,432.36 8.2 Truncated Apolipoprotein C-I
7,722.01 7.86 Truncated Beta-Thromboglobulin
8,707.91 5.05 Truncated Apolipoprotein A-II
8,826.91 5.05 Apolipoprotein A-II
8,938.50 9.5 C3-anaphylatoxin Des-Arg
9,192.21 5.23 Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain
9,269.05 6.04 Truncated Haptoglobin-2
11,091.08 6.8 Truncated Serum Amyloid A2 protein
11,682.70 5.89 Serum Amyloid A protein
11,731.17 6.07 Beta-2-Microglobulin
12,946.08 5.33 Truncated Transthyretin
13,761.41 5.35 Transthyretin
15,867.06 6.81 Hemoglobin Beta Chain
21,253.29 5.66 Apolipoprotein M
28,078.62 5.27 Apolipoprotein A-I
34,236.68 5.52 Apolipoprotein E
23,511.56 4.93 Alpha-1-Acid Glycoprotein
38,999.48 5.95 Alpha-1-Microglobulin Precursor
45,265.82 5.32 Alpha-1-Antichymotrypsin
39,324.68 5.43 Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor
51,243.46 5.22 Vitamin D-Binding Protein
45,371.05 5.28 Apolipoprotein A-IV
将纯化或合成的生物标志群免疫小鼠，制备传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的生物标 志群抗体。
用抗生物标志群抗体与质谱仪联合应用验证被分析物。质谱与抗体分离技术联合应用 即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测(Immunomic mass spectrometry analysis，IMSA)为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或 修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的 或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。抗 体组基质可放在高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子中。目前ELISA等技术主要依靠间 接的化学或放射测定法，因而无法直接鉴定抗原的变异，而用免疫组质谱技术能测定抗原 变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病的特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。 即用质谱同时可检测多种疾病特异性抗原的分子量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅 毒)，及进行窗口期检查，而ELISA技术及免疫荧光技术无法做到。由于每种特异性抗体 所捕获生物抗原的分子量是不同的，故免疫组与质谱联合应用时，质谱仪就非常容易地将 这四种抗原同时分开了。用三种以上抗体组标在磁珠上、高效液相层析柱子中、或毛细管 电泳柱子中与质谱联合，可同时检测出多种(三种以上)的生物标志及一种或一种以上变 异的或修饰的生物标志。这样产生了一种新型可用质谱仪直接进行分析多种(三种以上) 生物标志及一种或一种以上变异或修饰生物标志的方法。三色免疫荧光法可以同时分析 三种生物标志，但无法达到三种以上的生物标志的分析或像免疫组质谱检测来精确地、高 效地确定一种变异的或修饰的被分析物(抗原或生物标志)。这些生物标志组合可以用于 同时鉴别正常人及不同种类疾病的检测方法。本发明可以用于疾病的检测的金标准。举例 讲，如果用抗HIV gP120基质去捕获血清HIV gP120，质谱图显示一个120kDa蛋白，我 们可以检测HIV；如果出现一个100kDa蛋白，则可能是HIV gP120降解产物；如果出现 一个140kDa蛋白，则可能是非特异性蛋白。这时就可以用免疫组质谱检测来做氨基酸序 列鉴定：即最精确鉴别(金标准)。
将肿瘤患者按照转移情况分组，然后进行组间两两比较，各组间有显著性差异的蛋白 质峰数量种类不尽相同，其中3692Da等蛋白指纹在脏器转移组中显著增高，可监测肿 瘤复发或转移(图2)。
对肿瘤患者在根治性根除后14天再次进行检测，蛋白指纹3398Da等在根治性切除 后，血清中的浓度显著下降，基本接近于正常人，可用于监测肿瘤预后评估、分子分型及 个体化诊疗(图3)。
本发明可用于体外细胞和非侵入性的体外肿瘤质谱检测方法的定量控制，如离体体液 的传统肿瘤标记物表达阴性肿瘤的试剂盒用于临床质谱的肿瘤检测方法。可以检测多个肿 瘤生物标志群及质谱多肽图谱。
本发明中的试剂盒及方法与其他非侵入性的体外检测方法比较，具有以下的特点：
(1)准确
质谱直接分析有很强的精确性，一般误差率只有0.1Da。因为蛋白质是由氨基酸组 成的，而氨基酸的平均质量是已知的，如果知道了抗原或生物标志的总分子量，那么抗原 的变异(指氨基酸变化)就很容易被推测出来。
(2)方便
本方法将蛋白质分成了几大类，即阴离子、疏水作用蛋白。这样，可用质谱仪直接进 行分析。磁珠支持基质的方法所用吸附剂的支持物是磁性微粒或磁珠。用磁性分离器分离 磁珠及样品，无需离心样品。这样，可用质谱仪直接进行分析。
(3)快捷
用本发明提供的免疫组质谱检测进行疾病诊断时，无需对蛋白质进行测序。抗体组基 质可放在高效液相层析柱子、或毛细管电泳柱子中。本发明采用了计算机“条码格式”， 信号强度沿着线性轴以暗度强度值显示。此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动分析 对比强弱，从而有助于临床复杂的诊断，如可用此“免疫组质谱蛋白指纹”或条码格式进 行医学分析。
说明书附图
图1正常人与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤蛋白指纹及质谱多肽谱的一个表示图
图2蛋白指纹3692Da在肿瘤脏器转移组中显著增高
图3蛋白指纹3398Da在肿瘤根治性切除后下降
具体实施方式
本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本 发明范围。
实施例1正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤生物标志发现及质谱的试剂盒制备
(1)实验方法
一、材料
标本来源：质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准，供血者男女各半， 血型为O型；年龄为18-30岁；民族，汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、 空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能检查、肾功能检查；无遗传病家族史；无重大传染病 史。女性无怀孕，男性无吸烟史者。抽取10位O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜 血液，4℃下待血液凝固后马上离心，10,000rpm，4℃离心5min；样品的处理和储存。 取混合血清(浆)10μl，用20μl U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0) 稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min。将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结 合缓冲液，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。
简要操作步骤：将200μl结合缓冲液(50mM NaAC，pH 4.0～4.5)加至已装好WCX 阴离子磁珠小管中，置振荡器(MS1 Minishaker)400-600rpm，震荡5min，用磁性分离 器分离磁珠及样品。重复上述操作两次。用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个WCX阴离子 磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片， 加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的饱和标准溶液)。然后用质谱分 析阅读。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)， 将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最 大值。
数据收集：在每次实验数据收集前，用All-in-one蛋白校正仪器，使蛋白质分子量 误差＜0.1％。
数据分析：用统计学方法，分析所得数据的形式是用计算机读取的条码格式或峰，蛋 白指纹显示为沿着线性轴的暗度强度值信号，此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动 分析对比强弱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的 总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％信号强度的最大 值，并且用6634.0Da的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5)。 分析了所有700～60000Da之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的 平均数，标准差(SD)和变异系数(CV％)。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与WCX 阴离子基质磁珠的实验结果，通过分析几百种血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹可以用 于区分正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤。峰值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异 (图1、表1)：
表1正常与肿瘤蛋白指纹的显著性差异(疏水基质与WCX阴离子基质总和)
1008.9 2019.4 11091.0 1087.1 33273.1 9499.1 1266.3
1101.2 3398.2 11682.7 1573.2 1285.4 1296.5 14691.2
1212.8 2740.2 11731.1 3981.1 2548.9 2289.6 8938.3
1302.2 2859.4 12946.0 5345.2 3322.8 5269.5 8687.1
1392.2 3224.5 13761.4 15336 5912.7 6706.3 3935.3
1414.4 3272.6 15867.0 1042.9 2267.7 12862.4 4469.2
1436.8 3515.4 21253.2 2043.5 5976.3 1536.8 11490.3
1465.5 3806.0 28078.6 2092.7 13756.4 4356.2 11700.7
1481.9 4020.3 34236.6 6566.3 1338.4 9714.4 5080.3
1503.7 4417.8 23511.5 7573.1 10269.3 6016.8 5318.2
1594.4 5089.5 5543.2 9298.3 1079.21 6844.9 13130.8
1616.2 5501.9 7595.1 1070.5 3249.1 36951.7 38999.4
1683.3 6432.3 3254.5 1104.2 4160.3 6441.4 39324.6
1705.4 6532.3 5531.9 1114.4 3225.2 14151.5 45265.8
1750.1 7722.0 5549.2 3893.3 5643.2 14042.8 45371.0
1772.2 8707.9 5932.2 1061.5 6660.6 7944.5 51243.4
1793.5 8826.9 6094.2 1840.5 3165.6 21955.2 6562.3
1817.4 8938.5 6133.2 4656.2 5820.2 5957.2 7752.0
1885.3 9192.2 7776.2 5892.1 3964.1 8159.5 8968.5
1906.2 9269.0 15122.2 6119.2 4764.9 21808.2 3692.1
实施例2试剂盒的双盲测试
用从实施例1中筛选出几个特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、 3515.49、3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、 8826.91、8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、 15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、 45371.05、51243.46±30Da，双盲测试300例正常与180例传统肿瘤标记物表达阴性的 肿瘤(表2)。
表2
双盲测试 肿瘤(180) 正常(300) 肿瘤 180 30 正常 0 270
敏感性100％ 特异性90％
结论
用本方法的试剂盒可鉴别正常人与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤，敏感性100％， 特异性90％。
实施例3肿瘤生物标志群的排序鉴定
将生物标志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestion fragments)，又称多肽指纹， 的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与胰蛋白酶消化生成的消化片断的分子 量相吻合。最后，用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)对胰蛋白酶消化片断进行排序。蛋白质生物标记可用蛋白质梯状排 序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作 用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质 梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments) 在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。鉴别出生物标志群：
实验结果
表3
分子量 pI 鉴别出生物标志群
1,465.50 3.92 Truncated Fibrinopeptide A
2,740.27 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
2,859.42 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,224.55 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,272.64 6.67 Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4
3,515.49 10.86 Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,806.09 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,020.35 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,417.83 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,089.50 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,501.98 6.98 Truncated Serum Amyloid A2 protein
6,432.36 8.2 Truncated Apolipoprotein C-I
7,722.01 7.86 Truncated Beta-Thromboglobulin
8,707.91 5.05 Truncated Apolipoprotein A-II
8,826.91 5.05 Apolipoprotein A-II
8,938.50 9.5 C3-anaphylatoxin Des-Arg
9,192.21 5.23 Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain
9,269.05 6.04 Truncated Haptoglobin-2
11,091.08 6.8 Truncated Serum Amyloid A2 protein
11,682.70 5.89 Serum Amyloid A protein
11,731.17 6.07 Beta-2-Microglobulin
12,946.08 5.33 Truncated Transthyretin
13,761.41 5.35 Transthyretin
15,867.06 6.81 Hemoglobin Beta Chain
21,253.29 5.66 Apolipoprotein M
28,078.62 5.27 Apolipoprotein A-I
34,236.68 5.52 Apolipoprotein E
23,511.56 4.93 Alpha-1-Acid Glycoprotein
38,999.48 5.95 Alpha-1-Microglobulin Precursor
45,265.82 5.32 Alpha-1-Antichymotrypsin
39,324.68 5.43 Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor
51,243.46 5.22 Vitamin D-Binding Protein
45,371.05 5.28 Apolipoprotein A-IV
实施例4生物标志群抗体的制备
将纯化或合成的生物标志群免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细 胞。用溶血噬菌斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞。将单个细胞 扩增至1×107个以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA 为模板，合成cDNA链。以此cDNA为模板，加入鼠抗体重链可变区(VH)通用引物， 轻链可变区(VL)通用引物，进行聚合酶链反应，获得扩增的VH基因片段和VL基因 片段。将扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离。用glass milk回收扩增的 VH基因片段和VL基因片段。与等摩尔尝试的Limker Primer Mix混合，进行聚合酶 链反应，连接VH和VL。扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScFV)。此ScFV 可用于制备检测所需DNA片。将此扩增产物两端加限制性酶切位点，纯化定量后，连 接到PUC19载体上。将连接产物转化感染大肠杆菌TOP10。经蓝白斑筛选及酶切鉴定， 筛选出重组质粒。在96孔板形成单克隆抗体。用ELISA法筛选出效价最高的单克隆 抗体株，大量制备，并从培养上清中提取所需抗体。此抗体可用于制备检测所需试 剂盒。
实施例5抗生物标志群的抗体验证生物标志群
用Carbodiimide方法(Carbodiimide Method)将带有羧酸基团标记的基质与抗生 物标志群的排序鉴定抗体的氨基基团结合(Gunn DL，et al.Preparation of sensitive and stable erythrocytes by the carbodiimide method for the detection of primary and secondary IgM and IgG antibody.J Immunol Methods.1972；1(4)：381-389.)。
将样品点样在一个抗生物标志群抗体基质的位点上。
用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位 点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用1％三 氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上， 自然干燥金属片，加0.5μL Sinapinic acid吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的 制备的标准溶液)。
用质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析各位点 的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。
(2)实验结果
用抗生物标志群抗体基质与质谱仪联合应用验证被分析物与实施例3一致：
表4
抗生物标志群抗体 被分析物分子量
Truncated Fibrinopeptide A 1,465.50
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 2,740.27
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 2,859.42
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 3,224.55
Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4 3,272.64
Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 3,515.49
Truncated Serum Amyloid A2 protein 3,806.09
Truncated Serum Amyloid A2 protein 4,020.35
Truncated Serum Amyloid A2 protein 4,417.83
Truncated Serum Amyloid A2 protein 5,089.50
Truncated Serum Amyloid A2 protein 5,501.98
Truncated Apolipoprotein C-I 6,432.36
Truncated Beta-Thromboglobulin 7,722.01
Apolipoprotein A-II 8,707.91
Apolipoprotein A-II 8,826.91
C3-anaphylatoxin Des-Arg 8,938.50
Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain 9,192.21
Truncated Haptoglobin-2 9,269.05
Truncated Serum Amyloid A2 protein 11,091.08
Serum Amyloid A protein 11,682.70
Beta-2-Microglobulin 11,731.17
Truncated transthyretin 12,946.08
Transthyretin 13,761.41
Hemoglobin Beta Chain 15,867.06
Apolipoprotein M 21,253.29
Apolipoprotein A-I 28,078.62
Apolipoprotein E 34,236.68
Alpha-1-Acid Glycoprotein 23,511.56
Alpha-1-Microglobulin Precursor 38,999.48
Alpha-1-Antichymotrypsin 45,265.82
Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor 39,324.68
Vitamin D-Binding Protein 51,243.46
Apolipoprotein A-IV 45,371.05
实施例5中抗生物标志群的抗体验证疾病生物标志群，即抗体及质谱联合，可省去 生物标志群的排序鉴定。
实施例6监测肿瘤复发或转移相关蛋白指纹筛选
将结直肠癌患者按照转移情况分组，然后进行组间两两比较，各组间有显著性差异的 蛋白质峰数量种类不尽相同，其中3692Da蛋白指纹在脏器转移组中显著增高(图2)。
实施例7监测肿瘤预后评估、分子分型及个体化诊疗
对结直肠癌病人在根治性根除后14天再次进行检测，发现蛋白指纹3398Da在根治性切 除后，血清中的浓度显著下降，基本接近于正常人，3398Da信号强度术前14.5术后4.6 (图3)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为 参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改并应用于对心血管疾病或感染性疾病等其他疾病的检测，这些等价 形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤生物标志发现及质谱的试剂盒制备
(1)实验方法
一、材料
标本来源：质谱的标准化质控血清(浆)制备定义符合如下标准，供血者男女各半， 血型为O型；年龄为18-30岁；民族，汉。生化指标正常，包括：总胆固醇、甘油三酯、 空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能检查、肾功能检查；无遗传病家族史；无重大传染病 史。女性无怀孕，男性无吸烟史者。抽取10位O型血的健康受试者(男女各半)的新鲜 血液，4℃下待血液凝固后马上离心，10,000rpm，4℃离心5min；样品的处理和储存。 取混合血清(浆)10μl，用20μl U9缓冲液(9M Urea，2％CHAPS，50mM Tris-HCL，pH 7.0) 稀释，而后，将以上标本冰浴振荡30min。将30μl上述变性后标本加入360μl相应的结 合缓冲液，待用。所有样本均进行双份检测以减少实验误差。
简要操作步骤：将200μl结合缓冲液(50mM NaAC，pH 4.0～4.5)加至已装好WCX 阴离子磁珠小管中，置振荡器(MS1 Minishaker)400-600rpm，震荡5min，用磁性分离 器分离磁珠及样品。重复上述操作两次。用0.05％～1％三氟乙酸彻底洗涤整个WCX阴离子 磁珠阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上，自然干燥金属片， 加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸制备的饱和标准溶液)。然后用质谱分 析阅读。定量性控制及质谱激光能量调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清(浆)， 将标准化质控血清(浆)中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％质谱信号强度的最 大值。
数据收集：在每次实验数据收集前，用All-in-one蛋白校正仪器，使蛋白质分子量 误差＜0.1％。
数据分析：用统计学方法，分析所得数据的形式是用计算机读取的条码格式或峰，蛋 白指纹显示为沿着线性轴的暗度强度值信号，此强度可以用扫描仪记录并用分析软件自动 分析对比强弱。所有的图谱都进行了标准化，统一到它们自己全部的离子总数(峰面积的 总和)。将标准化质控血清中用于定量的标准峰6634.0Da强度调至50％信号强度的最大 值，并且用6634.0Da的峰进行了校正，而后又进行了“减少基线”，定义蛋白峰(s/n＞5)。 分析了所有700～60000Da之间的蛋白峰，并且仔细检查了每个相应的峰，计算出峰的 平均数，标准差(SD)和变异系数(CV％)。利用C8及C18疏水基质磁珠的实验结果与WCX 阴离子基质磁珠的实验结果，通过分析几百种血清蛋白指纹峰，发现下述蛋白指纹可以用 于区分正常与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤。峰值CV＞30％或者p＜0.01为有显著性差异 (图1、表1)：
表1正常与肿瘤蛋白指纹的显著性差异(疏水基质与WCX阴离子基质总和)
1008.9 2019.4 11091.0 1087.1 33273.1 9499.1 1266.3
1101.2 3398.2 11682.7 1573.2 1285.4 1296.5 14691.2
1212.8 2740.2 11731.1 3981.1 2548.9 2289.6 8938.3
1302.2 2859.4 12946.0 5345.2 3322.8 5269.5 8687.1
1392.2 3224.5 13761.4 15336 5912.7 6706.3 3935.3
1414.4 3272.6 15867.0 1042.9 2267.7 12862.4 4469.2
1436.8 3515.4 21253.2 2043.5 5976.3 1536.8 11490.3
1465.5 3806.0 28078.6 2092.7 13756.4 4356.2 11700.7
1481.9 4020.3 34236.6 6566.3 1338.4 9714.4 5080.3
1503.7 4417.8 23511.5 7573.1 10269.3 6016.8 5318.2
1594.4 5089.5 5543.2 9298.3 1079.21 6844.9 13130.8
1616.2 5501.9 7595.1 1070.5 3249.1 36951.7 38999.4
1683.3 6432.3 3254.5 1104.2 4160.3 6441.4 39324.6
1705.4 6532.3 5531.9 1114.4 3225.2 14151.5 45265.8
1750.1 7722.0 5549.2 3893.3 5643.2 14042.8 45371.0
1772.2 8707.9 5932.2 1061.5 6660.6 7944.5 51243.4
1793.5 8826.9 6094.2 1840.5 3165.6 21955.2 6562.3
1817.4 8938.5 6133.2 4656.2 5820.2 5957.2 7752.0
1885.3 9192.2 7776.2 5892.1 3964.1 8159.5 8968.5
1906.2 9269.0 15122.2 6119.2 4764.9 21808.2 3692.1
实施例2试剂盒的双盲测试
用从实施例1中筛选出几个特征蛋白峰1465.50、2740.27、2859.42、3224.55、3272.64、 3515.49、3806.09、4020.35、4417.83、5089.50、5501.98、6432.36、7722.01、8707.91、 8826.91、8938.50、9192.21、9269.05、11091.08、11682.70、11731.17、12946.08、13761.41、 15867.08、21253.29、23511.56、28078.62、34236.68、38999.48、39324.68、45265.82、 45371.05、51243.46±30Da，双盲测试300例正常与180例传统肿瘤标记物表达阴性的 肿瘤(表2)。
表2
双盲测试 肿瘤(180) 正常(300) 肿瘤 180 30 正常 0 270
敏感性100％ 特异性90％
结论
用本方法的试剂盒可鉴别正常人与传统肿瘤标记物表达阴性的肿瘤，敏感性100％， 特异性90％。
实施例3肿瘤生物标志群的排序鉴定
将生物标志群用胰蛋白酶消化，其消化片段(digestion fragments)，又称多肽指纹， 的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与胰蛋白酶消化生成的消化片断的分子 量相吻合。最后，用多级质谱(MS/MS)、源后裂解(PSD)及蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)对胰蛋白酶消化片断进行排序。蛋白质生物标记可用蛋白质梯状排 序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作 用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质 梯度(protein ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments) 在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。鉴别出生物标志群：
实验结果
表3
分子量 pI 鉴别出生物标志群
1,465.50 3.92 Truncated Fibrinopeptide A
2,740.27 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
2,859.42 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,224.55 10.86 Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,272.64 6.67 Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4
3,515.49 10.86 Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B
3,806.09 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,020.35 6.93 Truncated Serum Amyloid A2 protein
4,417.83 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,089.50 8.51 Truncated Serum Amyloid A2 protein
5,501.98 6.98 Truncated Serum Amyloid A2 protein
6,432.36 8.2 Truncated Apolipoprotein C-I
7,722.01 7.86 Truncated Beta-Thromboglobulin
8,707.91 5.05 Truncated Apolipoprotein A-II
8,826.91 5.05 Apolipoprotein A-II
8,938.50 9.5 C3-anaphylatoxin Des-Arg
9,192.21 5.23 Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain
9,269.05 6.04 Truncated Haptoglobin-2
11,091.08 6.8 Truncated Serum Amyloid A2 protein
11,682.70 5.89 Serum Amyloid A protein
11,731.17 6.07 Beta-2-Microglobulin
12,946.08 5.33 Truncated Transthyretin
13,761.41 5.35 Transthyretin
15,867.06 6.81 Hemoglobin Beta Chain
21,253.29 5.66 Apolipoprotein M
28,078.62 5.27 Apolipoprotein A-I
34,236.68 5.52 Apolipoprotein E
23,511.56 4.93 Alpha-1-Acid Glycoprotein
38,999.48 5.95 Alpha-1-Microglobulin Precursor
45,265.82 5.32 Alpha-1-Antichymotrypsin
39,324.68 5.43 Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor
51,243.46 5.22 Vitamin D-Binding Protein
45,371.05 5.28 Apolipoprotein A-IV
实施例4生物标志群抗体的制备
将纯化或合成的生物标志群免疫小鼠，待免疫反应出现后，从外周血中分离B细 胞。用溶血噬菌斑分析法选择并分离出能分泌所需抗体的单个淋巴细胞。将单个细胞 扩增至1×107个以上，用Quick mRNA Purification Kit提取mRNA。以提取的mRNA 为模板，合成cDNA链。以此cDNA为模板，加入鼠抗体重链可变区(VH)通用引物， 轻链可变区(VL)通用引物，进行聚合酶链反应，获得扩增的VH基因片段和VL基因 片段。将扩增产物在15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定和分离。用glass milk回收扩增的 VH基因片段和VL基因片段。与等摩尔尝试的Limker Primer Mix混合，进行聚合酶 链反应，连接VH和VL。扩增产物分离纯化后，获得特异性单链抗体(ScFV)。此ScFV 可用于制备检测所需DNA片。将此扩增产物两端加限制性酶切位点，纯化定量后，连 接到PUC19载体上。将连接产物转化感染大肠杆菌TOP10。经蓝白斑筛选及酶切鉴定， 筛选出重组质粒。在96孔板形成单克隆抗体。用ELISA法筛选出效价最高的单克隆 抗体株，大量制备，并从培养上清中提取所需抗体。此抗体可用于制备检测所需试 剂盒。
实施例5抗生物标志群的抗体验证生物标志群
用Carbodiimide方法(Carbodiimide Method)将带有羧酸基团标记的基质与抗生 物标志群的排序鉴定抗体的氨基基团结合(Gunn DL，et al.Preparation of sensitive and stable erythrocytes by the carbodiimide method for the detection of primary and secondary IgM and IgG antibody.J Immunol Methods.1972；1(4)：381-389.)。
将样品点样在一个抗生物标志群抗体基质的位点上。
用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位 点上至少停留10秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用1％三 氟乙酸彻底洗涤整个阵列点，将生物标志洗脱至质谱专用金属片(有3×3mm圆孔)上， 自然干燥金属片，加0.5μL Sinapinic acid吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的 制备的标准溶液)。
用质谱仪，用氮激光仪(337nm)和80cm或120cm飞行管分析阵列去分析各位点 的生物标志或蛋白质。用计算机分析数据进行数据重叠展示。
(2)实验结果
用抗生物标志群抗体基质与质谱仪联合应用验证被分析物与实施例3一致：
表4
抗生物标志群抗体 被分析物分子量
Truncated Fibrinopeptide A 1,465.50
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 2,740.27
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 2,859.42
Truncated Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 3,224.55
Truncated Inter-Alpha Inhibitor Heavy Chain 4 3,272.64
Alpha-2-HS-Glycoprotein Chain B 3,515.49
Truncated Serum Amyloid A2 protein 3,806.09
Truncated Serum Amyloid A2 protein 4,020.35
Truncated Serum Amyloid A2 protein 4,417.83
Truncated Serum Amyloid A2 protein 5,089.50
Truncated Serum Amyloid A2 protein 5,501.98
Truncated Apolipoprotein C-I 6,432.36
Truncated Beta-Thromboglobulin 7,722.01
Apolipoprotein A-II 8,707.91
Apolipoprotein A-II 8,826.91
C3-anaphylatoxin Des-Arg 8,938.50
Haptoglobin-1 Alpha-1 Chain 9,192.21
Truncated Haptoglobin-2 9,269.05
Truncated Serum Amyloid A2 protein 11,091.08
Serum Amyloid A protein 11,682.70
Beta-2-Microglobulin 11,731.17
Truncated transthyretin 12,946.08
Transthyretin 13,761.41
Hemoglobin Beta Chain 15,867.06
Apolipoprotein M 21,253.29
Apolipoprotein A-I 28,078.62
Apolipoprotein E 34,236.68
Alpha-1-Acid Glycoprotein 23,511.56
Alpha-1-Microglobulin Precursor 38,999.48
Alpha-1-Antichymotrypsin 45,265.82
Alpha-2-HS-Glycoprotein Precursor 39,324.68
Vitamin D-Binding Protein 51,243.46
Apolipoprotein A-IV 45,371.05
实施例5中抗生物标志群的抗体验证疾病生物标志群，即抗体及质谱联合，可省去 生物标志群的排序鉴定。
实施例6监测肿瘤复发或转移相关蛋白指纹筛选
将结直肠癌患者按照转移情况分组，然后进行组间两两比较，各组间有显著性差异的 蛋白质峰数量种类不尽相同，其中3692Da蛋白指纹在脏器转移组中显著增高(图2)。
实施例7监测肿瘤预后评估、分子分型及个体化诊疗
对结直肠癌病人在根治性根除后14天再次进行检测，发现蛋白指纹3398Da在根治性切 除后，血清中的浓度显著下降，基本接近于正常人，3398Da信号强度术前14.5术后4.6 (图3)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用参考，就如同每一篇文献被单独引用作为 参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改并应用于对心血管疾病或感染性疾病等其他疾病的检测，这些等价 形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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