用于识别未愈合的皮肤伤口以及用于监测皮肤伤口愈合的方法
阅读：770发布：2021-07-10
专利汇可以提供用于识别未愈合的皮肤伤口以及用于监测皮肤伤口愈合的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于将个体中的 皮肤 伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口的体外方法、用于监测个体中的皮肤 伤口愈合 的体外方法、用于筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法、以及与其相关的 试剂 盒 。，下面是用于识别未愈合的皮肤伤口以及用于监测皮肤伤口愈合的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口的体外方法，所述方法包含：
a)测量
i)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
ii)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，和
b)如果在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，或者
如果在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，
优选地，其中a)中的值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
2.一种用于监测个体中的皮肤伤口愈合的体外方法，所述方法包含：
a)测量
i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
b)任选地，如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口，或者如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口在所述第一时间点是愈合的皮肤伤口，
c)测量
i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
d)任选地，如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口，或者如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
e)
A)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别所述皮肤伤口在所述第二时间点表现出改善的愈合，条件是在所述第一时间点在a)i)中和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，
或者
B)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别所述皮肤伤口在所述第二时间点表现出恶化的愈合，
条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％，
和
f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)，
从而监测所述皮肤伤口的愈合，
优选地
其中所述第一时间点和所述第二时间点相隔6小时至12个月，和/或
所述值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包含：
a)测量
i)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，和
b)如果在a)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，优选其中在a)i)和a)ii)中获得的值比相应对照值低至少10％，更优选其中在a)i)和a)ii)中获得的值比相应对照值低至少15％，甚至更优选至少20％，或
如果在a)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，
优选地，其中在a)i)和a)ii)中获得的值比相应对照值高至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，
优选地，其中
对于在a)i)和a)ii)中获得的值建立组合值和/或a)中的值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中
步骤a)进一步包含以下步骤：
iiia)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量HaCaT细胞的增殖，
并且其中步骤b)包含：
b)如果在i)至iiia)中获得的至少两个、优选三个值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，将所述皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，更优选地，其中在i)和/或ii)和iiia)中获得的值比相应对照值低至少10％，更优选至少15％，或者
如果在i)至iii)中获得的至少两个、优选三个值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，则将所述皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，更优选其中在i)和/或ii)和iiia)中获得的值比相应对照值高至少10％，更优选至少15％，优选地，其中对于在i)和/或ii)和iiia)中获得的值建立组合值。
5.根据权利要求1、3或4所述的方法，其中
步骤a)进一步包含以下步骤iiib)至iiid)中的一个、两个或三个、或以下步骤iiib)至iiie)中的一个、两个、三个或四个：
iiib)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
iiic)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
iiid)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
iiie)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中所述一种或更多细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，并且其中步骤b)包含：
b)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将所述皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
(1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界值，
(5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于临界值，特别地其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
(6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，
(7)在iiie)中获得的值高于临界值，
或者
如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将所述皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
(1)在i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(2)在ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(3)在iiia)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
(5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于临界值，特别地其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
(6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
(7)在iiie)中获得的值低于临界值，
优选地，其中对于在i)、ii)、iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和/或iiie)中获得的值建立组合值。
6.根据权利要求4或5所述的方法，
其中步骤b)包含：
b)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将所述皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
(1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜时建立的相应对照值，(2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜时建立的相应对照值，(3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界值，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
(5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于临界值，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，特别地其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
(6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
(7)在iiie)中获得的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量的值高于临界值，
条件是至少在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
和/或
如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将所述皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
(1)在i)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(2)在ii)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(3)在iiia)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
(4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
(5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于临界值，特别是其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
(6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
(7)在iiie)中获得的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量的值低于临界值，
条件是至少在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。
7.根据权利要求2所述的方法，包含：
a)测量
i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
b)任选地，如果在a)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口，或如果在a)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将所述皮肤伤口识别为在所述第一时间点是愈合的皮肤伤口，c)测量
i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
d)任选地，如果在c)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在c)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口，或
如果在c)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
e)
A)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，
条件是在所述第一时间点在a)i)中以及在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
或者
B)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，
条件是在所述第二时间点在c)i)和c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，并且
f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)。
8.根据权利要求2所述的方法，包含：
a)测量
i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
以及iiia)、iiib)、iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个，或iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和iiie)中的一个、两个、三个、四个或五个：
iiia)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，HaCaT细胞的增殖，
iiib)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
iiic)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物是选自CD200受体、CD206和CD209，
iiid)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
iiie)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出液样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，b)任选地，根据权利要求3、4或5，将所述皮肤伤口识别为在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口或在所述第一时间点是愈合的皮肤伤口，
c)测量
i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，以及iiia)、iiib)、iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个、或iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和iiie)中的一个、两个、三个、四个或五个：
iiia)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，HaCaT细胞的增殖，
iiib)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述巨噬细胞在与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
iiic)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物是选自CD200受体、CD206和CD209，
iiid)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
iiie)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出液样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中一种或多种细胞因子标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，d)任选地，根据权利要求3、4或5，将皮肤伤口识别为在所述第二时间点处是未愈合的皮肤伤口或在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
e)
A)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合：
(1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，(2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
(3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
(4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物与一种或多种M2标志物的量的比率低于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
(5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于在所述第一时间点在a)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与所述一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或的频率分布的比率，
其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
特别地其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，(6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
(7)在所述第二时间点在c)iiie)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiie)中获得的值，
条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值在所述第二时间点高于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
条件是在所述第一时间点在a)i)中和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，
或者
B)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合：
(1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，(2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
(3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
(4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物与一种或多种M2标志物的量的比率高于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
特别地其中所述比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，(5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于在所述第一时间点在a)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与所述一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
(6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％，
(7)在所述第二时间点在c)iiie)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiie)中获得的值，
和
f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
-所述个体是哺乳动物，优选人，和/或
-所述皮肤伤口选自选自糖尿病患者的伤口、被至少一种微生物感染的伤口、缺血性伤口、患有血液供应不足或静脉淤滞的患者的伤口、溃疡如糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡例如动脉性腿部溃疡、混合性溃疡或压疮、神经性伤口、腿部溃疡、手术伤口、烧伤、裂开、肿瘤性溃疡和罕见溃疡，和/或
-未愈合的皮肤伤口被理解为在标准疗法下2个月内不闭合的伤口，和/或
-所述个体表现出进一步的疾病和/或共患病，和/或用药物治疗进一步的疾病和/或共患病，和/或
-所述皮肤伤口未经处理或用以下一种或多种方式来治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物，和/或
-如果(i)所述个体的皮肤伤口通过根据权利要求1或3至6所述的方法被识别为未愈合的皮肤伤口，和/或所述个体的皮肤伤口通过根据权利要求2、7或8的方法被识别为与第一时间点相比在第二时间点表现出恶化的愈合，则识别所述个体用一种或多种疗法进行治疗，所述疗法选自压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物，和/或
-通过物理或化学方法获得伤口渗出物样本，特别是通过向皮肤伤口施加负压，特别是通过使用负压引流装置、使用毛细管力的方法、将伤口渗出物收集在膜敷料或膜中、将伤口渗出物收集在注射器中、施用吸收性材料诸如吸收性珠子、或过滤器、或通过使用拭子诸如棉签，特别是其中膜敷料或膜是纤维素层和/或其中吸收性材料是纤维素层，和/或-愈合的皮肤伤口表征为持续的伤口闭合、肉芽、没有坏死和/或没有感染，和/或-未愈合的皮肤伤口表征为缺乏伤口闭合、伤口面积和/或深度增加、皮肤伤口坏死和/或感染、和/或缺乏肉芽，和/或
-所述方法中使用的所述成纤维细胞和/或单核细胞是人细胞，优选人细胞来自健康人个体、来自与伤口愈合受损相关的共患病诸如糖尿病的患者、和/或来自提供伤口渗出物或伤口生物膜的个体患者，和/或
-所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本在1：2至1：1000之间稀释，优选在1：10至1：
200之间。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中
i)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，包括以下步骤：
(i)培养原代人真皮成纤维细胞，
(ii)将细胞在固体支持物上孵育，从而使所述细胞粘附在所述支持物上，
(iii)使所述细胞与所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在所述细胞粘附发生之前或之后进行所述接触，
(iv)测定所述原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成，
优选地，其中所述方法在2D细胞培养中进行，和/或
ii)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，包括以下步骤：
(i)在支持物上接种原代人真皮成纤维细胞，所述支持物优选预涂有粘附增强剂，诸如明胶，
(ii)在所述支持物上培养所述细胞，优选直至达到融合，
(iii)使所述细胞与(i)基质促进补充物以及(ii)伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
(iv)测定所述成纤维细胞衍生基质的量，
优选地，其中所述方法在3D细胞培养中进行，和/或
iii)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖，包括以下步骤：
(i)培养角质形成细胞，
(ii)将所述细胞在固体支持物上孵育，从而使所述细胞粘附在所述支持物上，(iii)使所述细胞与所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在所述细胞粘附发生之前或之后进行所述接触，
(iv)测定所述角质形成细胞的量，优选细胞数，
优选地，其中所述方法在2D细胞培养中进行，
和/或
iv)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，包括以下步骤：
(i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
(ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
(iii)使所述细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
(iv)测定细胞培养上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，更优选地其中通过使用免疫学测定法，甚至更优选地通过使用ELISA测定法，来测定所述标志物，和/或
v)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，包括以下步骤：
(i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
(ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
(iii)使所述细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
(iv)测定巨噬细胞的细胞表面上的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量和/或频率分布，
其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，优选地其中通过免疫学测定法和/或荧光测定法，特别是通过FACS分析，来确定细胞表面标志物的量和/或频率分布，更优选地，其中步骤iv)包括：
使所述巨噬细胞与结合剂接触，所述结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中所述结合剂任选地被标记，特别地用荧光标记物标记，并测定与所述巨噬细胞结合的结合分子的量，特别地通过测定平均荧光强度，从而测定所述细胞表面标志物的量，
和/或
使所述巨噬细胞与结合剂接触，所述结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中所述结合剂任选地被标记，特别地用荧光标记物标记，并测定细胞群内分别对一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物呈阳性的细胞百分比，特别地其中进行FACS分析，从而测定细胞表面标志物的频率分布，和/或
vi)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，包括以下步骤：
(i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
(ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
(iii)使所述细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
(iv)测定所述巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，
其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，更优选地，其中所述方法包含使特异性结合标志物mRNA的探针与巨噬细胞RNA在有利于杂交的条件下接触，其中所述探针任选地被标记，并检测杂交的探针，和/或
vii)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，包括以下步骤：
(i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
(ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
(iii)使所述细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
(iv)测定细胞培养上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，
优选地，其中通过使用免疫学测定法，更优选地通过使用ELISA测定法，来测定所述细胞因子标志物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以下方法步骤同时进行：
i)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
ii)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
并且可选地
iiia)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖，和/或
iiib)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，和/或
iiic)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，和/或
iiid)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，和/或
iiie)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中一种或多种细胞因子标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中所述一种或更多细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
优选地，其中所述方法步骤在单个支持物上进行，更优选其中所述支持物是芯片、阵列诸如微阵列或纳米阵列、板诸如多孔板、或培养皿。
12.一种试剂盒，其包含用于执行权利要求11所述的方法步骤i)至iiid)或i)至iiie)的试剂，
其中所述试剂盒包含：
a)原代成纤维细胞，
b)角质形成细胞，
c)具有多个限定区域或空腔的支持物，其中所述区域或空腔的子集(i)涂有粘附增强剂和/或(ii)填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，所述粘附增强剂优选为明胶，d)任选地基质促进补充物，和
e)任选地单核细胞，和
f)特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，以及任选地：
特异性识别一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，和/或特异性识别一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的探针，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，并且其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-
23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，并且其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，和
g)任选地，特异性识别选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种一种或多种细胞因子标志物的结合剂，优选抗体。
13.一种适于执行根据权利要求1至11所述的方法的支持物，其中所述支持物包含多个限定的区域或空腔，并且其中：
a)区域或空腔的子集涂有粘附增强剂，
b)区域或空腔体的子集涂有粘附增强剂和/或填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，c)区域或空腔的子集未经处理，
d)任选地：
d1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物的结合剂，优为抗体，和d2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
e)
e1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，和
e2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
f)任选地：
f1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物mRNA的探针，和
f2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M2标志物mRNA的探针，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，和
g)任选地：区域或空腔的子集含有特异性识别选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的结合剂，优选抗体，
其中子集a)至g)不重叠，
优选地
(x)至少一些根据a)的所述区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
(xi)至少一些根据(x)或b)的所述区域或空腔进一步含有单核细胞，和/或
(xii)至少一些根据c)的所述区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
(xiii)至少一些根据c)的所述区域或空腔进一步含有角质形成细胞，
其中根据(xii)和(xiii)的所述区域或空腔不重叠，
更优选地，其中支持物是芯片、阵列诸如微阵列或纳米阵列、板诸如多孔板、或培养皿，和/或支持物是塑料支持物。
14.一种用于筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法，包含以下步骤：
A)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
B)如果在A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少
10％或低至少10％，则执行以下方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个、或以下方法步骤B1)至B6)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个：
B1)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
B2)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量角质形成细胞的增殖，
B3)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物是选自CCL22和CCL18，B4)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，其中所述一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
B5)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中所述一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且所述一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
B6)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中所述巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中所述一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α。
其中，如果在B1)至B5)、或B1)至B6)中获得的至少一个值比在没有候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，将所述化合物识别为适于调节皮肤伤口愈合，优选地，其中根据权利要求10执行根据A)和B1)至B5)、或A)和B1)至B6)的方法步骤。
15.根据权利要求14所述的用于筛选化合物的方法，其中
a)所述至少一种化合物选自小分子、激素、糖、蛋白质、肽、聚合物、生物材料诸如蛋白质、肽、抗体或其衍生物、或其缀合物、核酸诸如病毒剂、或一种或多种细胞，诸如一种或多种遗传修饰的细胞，和/或
b)所述至少一种化合物选自免疫调节剂、更优选免疫抑制剂、抗生素、抗感染剂、生长因子、细胞因子、抗增殖剂和刺激增殖的药剂，和/或
c)所述至少一种化合物是单一化合物，或2、3、4、5或更多种不同的化合物，其中2、3、4、
5或更多种不同的化合物可以存在于单一组合物中、或存在于2种或更多种单独的组合物中，和/或
d)所述值至少重复三次测量和/或在B)中建立统计学显著性，更优选地，其中p≤0.05、p≤0.001或p≤0.001，和/或
如果在B1)至B5)、或B1)至B6)中获得的至少一个值比在没有所述候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，则将所述化合物识别为适于调节皮肤伤口愈合，所述对照值具有统计学显著性，更优选地其中p≤0.05、p≤0.001或p≤0.001。
用于识别未愈合的皮肤伤口以及用于监测皮肤伤口愈合的
方法
[0001] 本发明涉及用于将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口的体外方法、用于监测个体中的皮肤伤口愈合的体外方法、筛选适用于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法、以及与其相关的试剂盒。
[0002] 慢性伤口是世界范围内的主要健康问题，仅在美国就有570万受影响的患者，并且由于人口老龄化和代谢疾病发病率增加而预计会增加。
[0003] 慢性伤口具有多因素病因并且取决于不同的变量：
[0005] 慢性伤口通常被理解为在2个月内未愈合的那些伤口。它们是全世界的主要健康问题。在包括美国和欧盟在内的发达国家，据估计总人口的1％至2％将在其一生中经历慢性伤口[Gottrup F(2004)Am J Surg 187:38S-43S]。仅在美国，约有570万患者受到影响。
由于人口老龄化和代谢疾病发病率增加，预计这一数字将会增加。
由于人口老龄化和代谢疾病发病率增加，预计这一数字将会增加。
[0006] 主要的慢性伤口适应症是静脉溃疡、压疮和糖尿病足溃疡。静脉性溃疡是基于慢性静脉功能不全的小腿病理改变组织的缺陷，通常伴有深静脉血栓形成。压疮是无法移动的患者严重组织低氧血症的结果。糖尿病足溃疡可对多达25％的糖尿病患者终其一生产生影响，并且通常导致下肢截肢。德国皮肤病学会推荐的所有这些伤口的护理标准[Dissemond等人(2014)JDDG 1610-0379/2014/1207:541-554]包括伤口敷料、外科手术和生物(蛆)清创术、感染控制和负压治疗。 (PDGF：血小板衍生生长因子)是唯一
注册的药物治疗，但其治疗效果很小，基于细胞疗法的成功也是如此。无论治疗如何，复发是占所有慢性伤口三分之一的问题。
注册的药物治疗，但其治疗效果很小，基于细胞疗法的成功也是如此。无论治疗如何，复发是占所有慢性伤口三分之一的问题。
[0007] 即使外用皮质类固醇在其他环境中具有抗炎作用，也不能使用它们，因为其副作用之一实际上是伤口愈合延迟[Hengge UR(2006)J Am Acad Dermatol 54:1-15]。非甾体抗炎药(例如布洛芬)仅能有效改善伤口疼痛[Dissemond j等人(2014)]。
[0008] 然而，通常难以评估个体中的皮肤伤口是否发展成为未愈合的慢性伤口和/或未来皮肤伤口的愈合是否改善或恶化。
[0009] 在伤口愈合的背景下已知多种标志物。此外，过去已经描述了某些标志物，一般来说，与一般的愈合伤口(合并或分开地测定平均值)相比，一些标志物在未愈合伤口组中升高或降低(同样合并或分开地测定平均值)。然而，当分析单个伤口样本时，此类标志物在单个个体中的绝对值通常变化很大，并且不能可靠地监测或诊断单个个体中的单个皮肤伤口。例如，与未愈合的伤口相比，发现髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶和弹性蛋白酶活性通常在愈合的皮肤伤口渗出物中较低。然而，在单个伤口渗出物样本中测定的酶水平的可变性非常高，因此不能如此可靠地识别未愈合的皮肤伤口(图8至图10)。此外，与愈合的皮肤伤口相比，IL-1α、IL-1β和TNF-α细胞因子水平通常在未愈合的皮肤中升高(图11)。然而，单独的值还是变化很大。例如，一些愈合伤口渗出物的细胞因子水平与未愈合伤口渗出物的范围相同(图13)，并且来自未愈合伤口的伤口渗出物样本中仅约50％诱导巨噬细胞分泌细胞因子(图15)。
[0010] 用于可靠地识别未愈合的皮肤伤口和/或用于识别皮肤伤口的愈合恶化的方法将为受影响的个体提供及时进一步治疗此类皮肤伤口的机会，从而避免或减弱复发和/或愈合状态的恶化。
[0011] 因此，需要能够准确诊断并监测个体中的未愈合的皮肤伤口的方法、试剂盒和装置，以及能够预测个体中的皮肤伤口的伤口愈合的方法，以便防止复发。
[0012] 在皮肤损伤后，启动复杂的生物过程，导致多种生物途径的激活和同步。伤口愈合的经典阶段包括炎症、新组织形成和组织重塑[在Gurtner GG等人(2008)Nature453:314-321中综述]并涉及多种细胞类型的贡献，如图1所示。
[0013] 当潜在的病理学(例如糖尿病、静脉功能不全或动脉闭塞、或微生物感染)中断了生理性伤口愈合过程，使愈合无法发生，常常导致慢性伤口(溃疡)。在慢性伤口中，伤口愈合过程的炎症阶段持续存在，并且伤口不会发展到组织再生和重塑的阶段。在这种情况下，致病性吞噬细胞释放多种因子，包括细胞因子、蛋白酶和有毒氧自由基进入伤口组织以破坏组织细胞、细胞外基质和生长因子[Clark RAF等人(2007)J Invest Dermatol 127：1018-1029]。伤口本身中含有这些致病因子，例如，在纤维蛋白凝块中或在伤口渗出物(伤口液)中。
[0014] 称为“伤口渗出液(WE)”的伤口液是含有伤口细胞分子指纹的细胞外液，可以称为“液体活组织检查”。可替代地，可以使用伤口生物膜。
[0015] 我们独特的切入点利用了患者材料中含有伤口慢性病的致病因子的事实。使用这种患者材料，我们使用伤口愈合过程中涉及的不同细胞类型建立并开发了体外细胞方法。愈合不良伤口的伤口渗出物在这些方法中具有负面影响。
[0016] 令人惊讶的是，所开发和建立的方法特别适于在皮肤愈合的情况下将个体的皮肤伤口识别为愈合或未愈合的皮肤伤口、和/或用于监测个体中的皮肤伤口的愈合和/或用于评估已知和未知的化合物的功效、和/或用于化合物筛选。
[0017] 在一个实施方案中，本发明涉及用于将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口的体外方法，该方法包含：
[0018] a)测量
[0019] i)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0020] ii)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，和
[0021] b)如果在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，或
[0022] 如果在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，
[0023] 优选地，其中a)中的值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
[0024] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0025] 已知同一个体的不同皮肤伤口可能表现出不同的愈合。例如，一个皮肤伤口可以是愈合的皮肤伤口，而同一个体在相同或不同时间点的另一个皮肤伤口可以是未愈合的皮肤伤口，例如由于感染或影响特定皮肤伤口的潜在疾病。
[0026] 如实施例中所示，本发明涉及体外方法，该方法能够将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口。因此，本发明能够例如评估同一个体的特定不同的皮肤伤口。
[0027] 将个体的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口使得能够监督患者、监测伤口愈合和特定治疗干预以稳定、改进和/或改善皮肤伤口的愈合。例如，使用本发明的方法识别为未愈合的皮肤伤口的皮肤伤口可以用以下一种或多种方式来治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物。
[0028] “伤口”被理解为对活体个体组织的损伤，诸如割伤、撕裂、烧伤或破裂，优选地，“伤口”被理解为活体个体组织的开放性损伤。
[0029] 本发明涉及适用于皮肤伤口的方法和相关主题。因此，“皮肤伤口”被理解为对活体个体的皮肤的损伤，诸如割伤、撕裂、烧伤或破裂。优选地，“皮肤伤口”被理解为活体个体皮肤的开放性损伤。皮肤可以位于个体的任何区域，诸如头部、手臂、腿部、胸部或背部。此外，个体可具有一个、两个、三个、四个或更多个皮肤伤口。此外，皮肤伤口的面积可能不同。在优选的实施方案中，皮肤伤口形成伤口渗出物。在另一个优选的实施方案中，皮肤伤口形成伤口生物膜。皮肤伤口可以例如选自糖尿病患者的伤口、被至少一种微生物感染的伤口、缺血性伤口、患有血液供应不足或静脉淤滞的患者的伤口、溃疡(如糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡(例如动脉性腿部溃疡)、混合性溃疡或压疮)、神经性伤口、腿部溃疡、手术伤口、烧伤、裂开、肿瘤性溃疡和罕见溃疡。为了提高本方法的可靠性，个体的皮肤伤口不受机械地阻止伤口闭合的进一步疾病的影响，诸如钙质沉着，其中伤口中的钙晶体机械地阻止伤口闭合或渗出性皮炎。
[0030] “溃疡”被理解为皮肤上的疼痛，伴随着组织的崩解。溃疡可导致表皮和部分真皮甚至皮下脂肪的完全丧失。
[0031] 如本文所用，“未愈合的皮肤伤口”是指未以预期速率愈合的皮肤伤口，特别是在标准疗法下在2个月内(优选在标准治疗下在3个月或更多个月内)未闭合的皮肤伤口。优选地，未愈合的皮肤伤口表征为缺乏伤口闭合、伤口面积和/或深度增加、皮肤伤口坏死和/或感染、和/或缺乏肉芽。
[0032] 如本文所用，“愈合的皮肤伤口”被理解为以预期速率愈合的皮肤伤口，特别是在标准疗法下在2个月内闭合的皮肤伤口。优选地，愈合的皮肤伤口表征为持续的伤口闭合、肉芽形成、没有坏死和/或没有感染。
[0033] “标准疗法”被理解为医生通常建议的用于皮肤伤口的治疗，特别是选自伤口敷料、外科手术和生物(蛆)清创术、感染控制、负压疗法以及利用生物或细胞治疗的疗法中的一种或多种。
[0034] 在本文所描述的本发明方法的另一个优选实施方案中，皮肤伤口未经治疗或用标准疗法治疗或用以下一种或多种方式治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素治疗、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物。
[0035] 个体是动物，优选个体是脊椎动物，特别是哺乳动物，更优选人。个体可以是健康的个体或可以表现出其他疾病和/或共患病、和/或用药物治疗其他疾病和/或共患病。此外，个体的皮肤伤口可以是未经治疗或用标准疗法治疗或用以下一种或多种方式治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素治疗、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物。
[0036] 在步骤a)中，本发明的方法包括测量
[0037] i)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0038] ii)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质。
[0039] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0040] 可以如实施例中所示，特别是如实施例3.1.1中所示，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖。对于该方法，使用原代成纤维细胞，该原代成纤维细胞可以是原代哺乳动物真皮成纤维细胞，优选原代人真皮成纤维细胞。用于获得培养的原代人真皮成纤维细胞的方法是本领域已知的，并且例如在实施例中描述。例如，可以使用含有FCS的DMEM培养基培养细胞。在另一个优选的实施方案中，将细胞在固体支持物上孵育，从而使细胞粘附到支持物上，例如实施例中所描述的，其中使用多孔板。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，例如用培养基或盐水水溶液稀释。可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触。例如，可以通过在粘附之前(例如在细胞接种时)或在粘附之后将任选地被稀释的液体伤口渗出物样本或伤口生物膜样本加入细胞中来实现接触。例如，可以通过移液和任选的温和混合来实现接触。将细胞培养适当的时间，诸如6小时至300小时，更优选12小时至200小时，甚至更优选24小时至120小时。在实施例中，成功使用了72小时。对于没有伤口渗出物或伤口生物膜样本的阴性对照样本，可以加入相应的没有伤口渗出液或伤口生物膜的液体，诸如培养基或盐水液体，或者不加入液体。随后，测定原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量。例如，可以使用多聚甲醛固定细胞。此外，合适的染料(诸如磺酰罗丹明B)可用于测定原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成。然后可以定量包括形成的细胞外基质的染色细胞，例如通过在合适波长下测定吸光度或荧光，这取决于染料。优选地，该方法在2D细胞培养中进行，该2D细胞培养允许细胞粘附在固体支持物上进行培养。在优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0041] 优选地，该方法步骤包括以下步骤：
[0042] (i)培养原代人真皮成纤维细胞，
[0043] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0044] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，
[0045] (iv)测定原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，
[0046] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0047] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0048] 本发明方法中细胞的培养优选在约20℃至40℃、更优选25℃至38℃、甚至更优选在约37℃下进行。
[0049] 可以如实施例中所示进行，特别是如实施例3.1.2中所示，在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量由原代成纤维细胞形成的成纤维细胞衍生基质。对于该方法，使用原代成纤维细胞，其可以是原代哺乳动物真皮成纤维细胞，优选原代人真皮成纤维细胞。在实施例中，将原代人真皮成纤维细胞接种在支持物上，该支持物优选预涂有粘附增强剂，诸如明胶。例如，可以通过将支持物与含有粘附增强剂(诸如明胶)的溶液或悬浮液一起孵育来实现涂层。在实施例中，成功使用了0.2％的明胶溶液。优选地，培养细胞直至达到融合。随后，使细胞与(i)基质促进补充物以及(ii)伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以被同时或依次接触。例如，基质促进补充物优选选自包含以下的溶液：维生素C或其生理学上可接受的盐(如钠盐)、或2-磷酸-L-抗坏血酸或其生理学上可接受的盐、以及EGF和胰岛素的组合，将该基质促进补充物添加到细胞中，例如通过移液和任选的温和混合。任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本可以同时或依次接触。例如，任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本可以与基质促进补充物混合，并且可以将混合物添加到细胞中。可替代地，任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本可以单独但同时加入，或分开但在基质促进补充物之后或之前加入。在随后非同时接触的情况下，组分(i)和(ii)优选在1小时内接触。随后将细胞孵育，优选孵育12小时至20天，其中任选用补充有任选地被稀释的伤口渗出物或伤口生物膜和基质促进补充剂的新鲜培养基替换培养基至少一次。在该实施例中，孵育4天后培养基更换一次，总培养时间为8天。当形成三维成纤维细胞衍生基质时，固体支持物优选含有至少一个空腔，该空腔允许填充空间并因此允许3D细胞培养。随后，测定成纤维细胞衍生基质的量，例如通过固定细胞和测定总蛋白质含量。例如，可以使用多聚甲醛固定细胞。此外，合适的染料，诸如磺酰罗丹明B，可用于测定原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成。然后可以定量包括细胞外基质形成的染色细胞，例如通过在合适波长下测定吸光度或荧光，这取决于染料。
[0050] 因此，该方法步骤优选包括以下步骤：
[0051] (i)在支持物上接种原代人真皮成纤维细胞，该支持物优选预涂有粘附增强剂，诸如明胶，
[0052] (ii)在支持物上培养细胞，优选直至达到融合，
[0053] (iii)使细胞与(i)基质促进补充物以及(ii)伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0054] (iv)测定成纤维细胞衍生基质的量，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，
[0055] 优选地，其中该方法在3D细胞培养中进行。
[0056] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0057] “成纤维细胞衍生基质”或“FDM”被理解为由活的成纤维细胞在有利于基质形成的环境中(例如在基质促进补充物的存在下)形成的细胞外基质(ECM)。可以如实施例中所述获得FDM。特别地，FDM可通过以下方法获得：(i)将原代人真皮成纤维细胞接种在支持物上，该支持物预涂有粘附增强剂，诸如明胶，(ii)在支持物上培养细胞，优选直至达到融合，以及(iii)使细胞与基质促进补充物接触，该基质促进补充物诸如维生素C或其生理学上可接受的盐、或2-磷酸-L-抗坏血酸或其生理学上可接受的盐、或EGF和胰岛素的组合。
[0058] “基质促进补充物”被理解为促进活的成纤维细胞在体外细胞培养中形成成纤维细胞衍生基质的化合物或组合物。合适的基质促进补充剂是维生素C或其生理学上可接受的盐(如钠盐)、或2-磷酸-L-抗坏血酸或其生理学上可接受的盐、以及EGF和胰岛素的组合、以及包含该化合物的组合物，诸如溶液或悬浮液。可以作为分别包含EGF或胰岛素的单独溶液分别向细胞培养物(例如细胞培养物)提供EGF和胰岛素的组合，或例如作为包含EGF和胰岛素的溶液一起向细胞培养物(例如细胞培养物)提供EGF和胰岛素的组合。
[0059] “粘附增强剂”是增强细胞与固体支持物(诸如塑料支持物)的粘附然而基本上不干扰细胞活力的试剂。在优选的实施方案中，粘附增强剂是明胶或纤连蛋白，更优选明胶。
[0060] “2D细胞培养”被理解为细胞培养，其中细胞在平面或基本上平坦的表面中培养。在优选的实施方案中，2D细胞培养是培养贴壁细胞。
[0061] “3D细胞培养”被理解为细胞培养，其中细胞在非平面或基本上非平面的表面上培养。在优选的实施方案中，3D细胞培养是培养贴壁细胞和/或培养基质内的细胞，诸如ECM，特别是FDM。
[0062] “支持物”或“固体支持物”优选选自芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)、或培养皿。对于细胞培养应用，固体支持物优选适合于培养细胞，例如支持物可以是塑料支持物。
[0063] “伤口渗出物”被理解为位于皮肤伤口内和上方的细胞外液。伤口渗出物也称为“液体活组织检查”。
[0064] “伤口生物膜”被理解为由能够形成集落的微生物感染皮肤伤口引起的物质。通常，伤口生物膜是胶状物质。伤口生物膜包含选自细菌、真菌、酵母、藻类和其他微生物的微生物物种以及细胞碎片。当某些类型的微生物通过分泌粘性物质将其自身附着到皮肤伤口表面时，形成伤口生物膜。例如，可以通过对伤口表面进行外科锐器清创或通过用拭子或伤口敷料材料擦拭伤口表面来获得伤口生物膜样本。
[0065] “伤口渗出物样本”或“WE”被理解为从个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物的样本。获得伤口渗出物样本的方法是本领域已知的。例如，可以通过物理或化学方法获得伤口渗出物样本，特别是通过向皮肤伤口施加负压(诸如通过使用负压引流装置)、使用毛细管力的方法、将伤口渗出物收集在膜敷料或膜中、将伤口渗出物收集在注射器中、施用吸收性材料(诸如吸收性珠子)或过滤器、或通过使用拭子(诸如棉签)，特别是其中膜敷料或膜是纤维素层和/或其中吸收性材料是纤维素层。优选的合适的纤维素层是纳米纤维素层，诸如作为biocellic+和epicite+销售的纳米纤维素层。此类层，包括它们的生产，描述于WO2013/
060321、WO2016/113400和/或WO2017/089005中。伤口渗出物样本的体积可以变化，并且可以在1nl至1l、10nl至1l、或100nl至1l的范围内，诸如1μl至1l、1ml至1l或10ml至1l。例如，在实施例中研究的伤口渗出物样本的体积最高为400ml，通常体积为10-100ml，特别是10-
50ml。伤口渗出物样本可以在获得样本后直接用于本发明的方法，或者可以储存，特别是在用于本发明的方法之前在<4℃、<0℃或<10℃下储存。
060321、WO2016/113400和/或WO2017/089005中。伤口渗出物样本的体积可以变化，并且可以在1nl至1l、10nl至1l、或100nl至1l的范围内，诸如1μl至1l、1ml至1l或10ml至1l。例如，在实施例中研究的伤口渗出物样本的体积最高为400ml，通常体积为10-100ml，特别是10-
50ml。伤口渗出物样本可以在获得样本后直接用于本发明的方法，或者可以储存，特别是在用于本发明的方法之前在<4℃、<0℃或<10℃下储存。
[0066] 可用于获得伤口渗出物的优选纤维素层是纳米纤维素层，特别是作为biocellic+和epicite+销售的那些。此类特别优选的纤维素层描述于WO2013/060321、WO2016/113400和/或WO2017/089005中。因此，明确地参考WO2013/060321、WO2016/113400和/或WO2017/089005中的纳米纤维素层及其制备的公开内容。纳米纤维素通常被理解为指纳米结构纤维素的术语。纳米纤维素或纳米结构纤维素包含纤维素纳米纤维(CNF)(也称为微纤维化纤维素(MFC))、纳米微晶纤维素(NCC或CNC)和细菌纳米纤维素。细菌纳米纤维素被理解为由细菌产生的纳米结构纤维素。
[0067] 特别地，WO2017/089005公开了一种含纳米结构纤维素(BNC)的制品，其中该制品包含至少1重量％且至多15重量％的BNC，包含至少85重量％且至多99重量％的流体，平均厚度为至少0.5mm且至多8mm，其中BNC是微生物来源的。
[0068] 优选地，该制品的平均厚度为至多6mm，优选至多5mm。优选地，该制品的BNC的重均分子量Mw为至多1,500,000g/mol，优选至多1,200,000g/mol、至多1,000,000g/mol、至多900,000g/mol、至多850,000g/mol、至多800,000g/mol、最优选至多780,000g/mol。优选地，该制品的BNC包含的羰基基团的量小于8.5μmol/g，优选小于8.0μmol/g、小于7.5μmol/g、小于7.0μmol/g、小于6.0μmol/g，更优选小于5.75μmol/g。优选地，该制品的多分散指数(Mw/Mn)小于3.5，优选小于3.0，更优选小于2.75和/或大于2.5。优选地，该制品的拉伸强度大于
252MPa，优选大于275MPa，更优选大于300MPa，最优选大于310MPa。此外，WO2017/089005公开了一种用于制备此类纤维素层的方法，并且在此明确地参考WO2017/089005，以获得用于制备此类纤维素层的方法。特别地，公开了一种制造含纤维素制品的方法，其中该方法至少包含以下步骤：a)以半静态连续方法提供生物技术生产的纳米结构纤维素(BNC)，b)提供制品，以及c)任选地，对该制品进行灭菌。
252MPa，优选大于275MPa，更优选大于300MPa，最优选大于310MPa。此外，WO2017/089005公开了一种用于制备此类纤维素层的方法，并且在此明确地参考WO2017/089005，以获得用于制备此类纤维素层的方法。特别地，公开了一种制造含纤维素制品的方法，其中该方法至少包含以下步骤：a)以半静态连续方法提供生物技术生产的纳米结构纤维素(BNC)，b)提供制品，以及c)任选地，对该制品进行灭菌。
[0069] WO 2016/113400公开了一种多相生物材料，其包含细菌合成的纳米纤维素(BNC)，该纳米纤维素包含至少两种不同的细菌纤维素网络，其厚度大于2mm，其中所述BNC是透明的。优选地，所述BNC透明至多约3mm的厚度。优选地，所述BNC透明至多约5mm的厚度。优选地，所述BNC具有至少1％或至少2％的固体含量。优选地，所述BNC具有至少0.1MPa的拉伸强度。优选地，所述BNC具有至少80％的吸水能力(WAC)。优选地，所述BNC在湿态下具有至少100g/(m2*24h)的湿蒸汽透过率。优选地，第一BNC网络的平均横截面孔面积比第二BNC网络的平均横截面孔面积高至少1.2倍。优选地，至少一个BNC网络具有至少400的聚合度。优选地，多相生物材料中具有最高聚合度的BNC网络的聚合度与具有最低聚合度的BNC网络的聚合度相比高出至少2倍。WO 2016/113400公开了一种用于生产由细菌合成的纳米纤维素
(BNC)组成的多相生物材料的方法，该方法包含将培养基接种至少两种不同的产生纤维素的细菌菌株，该细菌菌株已经共同或单独制备，从而合成由多种不同的细菌纤维素网络组成的BNC，其中通过选择至少两种不同的细菌菌株，通过它们的制备和接种以及通过选择合成条件，来预先确定多相生物材料的BNC结构和BNC性质。优选地，具有较快的初始动力学的菌株的纤维素生产的初始动力学(被除数)与具有较慢的初始动力学的菌株的纤维素生产
的初始动力学(除数)的商最多为2。优选地，多相生物材料生长至厚度超过2mm。优选地，培养基包含基于培养基体积至少10g/l的碳源。优选地，一种不同的产纤维素菌株的接种率最多为90：10。
(BNC)组成的多相生物材料的方法，该方法包含将培养基接种至少两种不同的产生纤维素的细菌菌株，该细菌菌株已经共同或单独制备，从而合成由多种不同的细菌纤维素网络组成的BNC，其中通过选择至少两种不同的细菌菌株，通过它们的制备和接种以及通过选择合成条件，来预先确定多相生物材料的BNC结构和BNC性质。优选地，具有较快的初始动力学的菌株的纤维素生产的初始动力学(被除数)与具有较慢的初始动力学的菌株的纤维素生产
的初始动力学(除数)的商最多为2。优选地，多相生物材料生长至厚度超过2mm。优选地，培养基包含基于培养基体积至少10g/l的碳源。优选地，一种不同的产纤维素菌株的接种率最多为90：10。
[0070] WO2013/060321公开了一种用于产生干燥的纤维素和含纤维素的材料的方法，其中纤维素或含纤维素的材料用于干燥和保持可溶胀性，几乎完全重建纤维素结构和一致
性，该纤维素或含纤维素的材料经过水分结合剂的吸附效果，并且在此吸附剂暴露之后干燥，而不考虑材料的任何结构变化。优选地，作为水分结合剂，使用渗透和/或吸湿有效的溶液，特别含有单糖、盐、含糖或糖类物质、聚环氧乙烷、这些水分结合物质组的不同代表的组合和/或这些水分结合物质组的一种或多种代表与一种或多种表面活性剂和/或一种或多
种防腐剂的组合。优选地，为了进一步改变除水分结合剂之外的再溶胀行为，使用含有表面活性剂和/或防腐剂的溶液。优选地，水分结合溶液具有0.01％的渗透活性和/或吸湿性物质的浓度，直至饱和极限，优选5-20％。优选地，与渗透和/或吸湿有效溶液组合使用的表面活性剂和/或防腐剂以0.01％的浓度使用至饱和极限，优选0.01-10％。优选地，将用水分结合剂处理的纤维素或含纤维素材料风干。优选地，将用水分结合剂处理的纤维素或含纤维素材料真空干燥。优选地，将要经过水分结合溶液的吸附效果的纤维素或含纤维素材料浸入水分结合溶液中。优选地，将水分结合溶液喷雾、滴落、刷涂或淋浇在要经过水分结合溶液的吸附效果的纤维素或含纤维素材料上。优选地，除了用于吸附剂暴露的纤维素培养过程之外，已经添加了水分结合剂。进一步公开了一种合适的干燥的纤维素和干燥的含纤维素材料，其特征是纤维素或含纤维素材料的结构包含干燥水分结合剂的渗透吸附和/或吸湿活性物质，用于其可溶胀性，几乎完全重建原始纤维素结构和一致性。
性，该纤维素或含纤维素的材料经过水分结合剂的吸附效果，并且在此吸附剂暴露之后干燥，而不考虑材料的任何结构变化。优选地，作为水分结合剂，使用渗透和/或吸湿有效的溶液，特别含有单糖、盐、含糖或糖类物质、聚环氧乙烷、这些水分结合物质组的不同代表的组合和/或这些水分结合物质组的一种或多种代表与一种或多种表面活性剂和/或一种或多
种防腐剂的组合。优选地，为了进一步改变除水分结合剂之外的再溶胀行为，使用含有表面活性剂和/或防腐剂的溶液。优选地，水分结合溶液具有0.01％的渗透活性和/或吸湿性物质的浓度，直至饱和极限，优选5-20％。优选地，与渗透和/或吸湿有效溶液组合使用的表面活性剂和/或防腐剂以0.01％的浓度使用至饱和极限，优选0.01-10％。优选地，将用水分结合剂处理的纤维素或含纤维素材料风干。优选地，将用水分结合剂处理的纤维素或含纤维素材料真空干燥。优选地，将要经过水分结合溶液的吸附效果的纤维素或含纤维素材料浸入水分结合溶液中。优选地，将水分结合溶液喷雾、滴落、刷涂或淋浇在要经过水分结合溶液的吸附效果的纤维素或含纤维素材料上。优选地，除了用于吸附剂暴露的纤维素培养过程之外，已经添加了水分结合剂。进一步公开了一种合适的干燥的纤维素和干燥的含纤维素材料，其特征是纤维素或含纤维素材料的结构包含干燥水分结合剂的渗透吸附和/或吸湿活性物质，用于其可溶胀性，几乎完全重建原始纤维素结构和一致性。
[0071] 可根据本发明使用的纳米纤维素层可以是纳米纤维素膜或敷料，其任选被覆盖，并且可以具有例如圆盘状的形式。因此，在一个优选实施方案中，纤维素层或纳米纤维素层是纤维素盘或纳米纤维素盘。通常，与伤口渗出物接触的纳米纤维素表面积在约1cm2至约100cm2的范围内。
[0072] “伤口生物膜样本”或“WB”被理解为从个体的皮肤伤口获得的伤口生物膜样本。获得伤口生物膜样本的方法是本领域已知的。例如，可以通过外科锐器清创术或通过用棉签或伤口敷料材料擦拭伤口表面来获得伤口生物膜样本。伤口生物膜样本的体积可以变化，并且可以在1nl至1l、10nl至1l、或100nl至1l、诸如1μl至1l、1ml至1l或10ml至1l的范围内。伤口生物膜的湿重可以变化，并且可以在10μg至10g、100μg至10g、诸如1mg至10g、10mg至
10g、100mg至10g、或1g至10g的范围内。伤口生物膜样本可以在获得样本后直接用于本发明的方法，或者可以储存，特别是在用于本发明的方法之前在<4℃、<0℃或<10℃下储存。
10g、100mg至10g、或1g至10g的范围内。伤口生物膜样本可以在获得样本后直接用于本发明的方法，或者可以储存，特别是在用于本发明的方法之前在<4℃、<0℃或<10℃下储存。
[0073] 令人惊讶地发现，涉及测量原代成纤维细胞增殖和原代成纤维细胞形成成纤维细胞的基质的上述测定可以分别可靠地将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口或未愈合的皮肤伤口。特别地，可以可靠地将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口。因此，这些测定中的一种或两种可用于本发明的方法。特别地，令人惊讶地发现，与没有伤口渗出物的对照相比，愈合伤口的伤口渗出物对原代成纤维细胞的增殖以及由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍
生基质具有剂量依赖性的正面影响。因此，在测定中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物的情况下建立的对照值，表示愈合的伤口。因此，在测定中获得的值低于在不存在伤口渗出物的情况下建立的对照值，表示未愈合的伤口。
生基质具有剂量依赖性的正面影响。因此，在测定中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物的情况下建立的对照值，表示愈合的伤口。因此，在测定中获得的值低于在不存在伤口渗出物的情况下建立的对照值，表示未愈合的伤口。
[0074] 对照值可以并行测定，或者可以独立地建立，优选并行地建立。
[0075] 因此，在本发明方法的步骤b)中，如果在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，皮肤伤口被识别为未愈合的皮肤伤口，优选低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于相应对照值至少20％，
[0076] 或者，如果在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，皮肤伤口被识别为愈合的皮肤伤口，高于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选高于相应对照值至少20％，更优选其中在i)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％，和/或在ii)中获得的值高于相应对照值至少50％，更优选至少100％。
[0077] 此外，优选至少重复三次进行测量和/或建立统计学显著性以提高诊断的准确性。统计方法在本领域中是已知的。例如，可以确定标准偏差。此外，统计学显著性可以是p≤
0.05、p≤0.001或p≤0.001，用于将皮肤伤口识别为愈合的或未愈合的皮肤伤口。
0.05、p≤0.001或p≤0.001，用于将皮肤伤口识别为愈合的或未愈合的皮肤伤口。
[0078] 因此，在优选的实施方案中，步骤a)中的值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
[0079] 此外，发现在两种测定的情况下，分别在伤口渗出物样本存在下测量原代成纤维细胞的增殖以及由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，进一步提高了该方法的准确性。因此，如果在两种测定中获得的值均低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则皮肤伤口可以被可靠地识别为未愈合的皮肤伤口。此外，如果在两种测定中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则可以可靠地将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口。在一个更优选的实施方案中，两种测定中的值各自高于相应对照值至少10％，更优选其中在测定中获得的值各自高于相应对照值至少15％、甚至更优选至少20％、30％、40％或50％，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口。在优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0080] 因此，在另一个优选的实施方案中，两种测定中的值各自低于相应对照值至少10％，更优选其中在测定中获得的值各自低于相应对照值至少15％、甚至更优选至少20％、
30％、40％或50％，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口。因此，可以进一步提高本发明方法的可靠性和准确性。
30％、40％或50％，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口。因此，可以进一步提高本发明方法的可靠性和准确性。
[0081] 因此，在优选的实施方案中，本发明的方法包含
[0082] a)测量
[0083] i)在存在由所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0084] ii)在存在由所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，和
[0085] b)如果在a)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，优选其中在a)i)和a)ii)中获得的值低于相应对照值至少10％，更优选其中在a)i)和a)ii)中获得的值低于相应对照值至少15％，甚至更优选至少20％，或者
[0086] 如果在a)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，
[0087] 优选地，其中在a)i)和a)ii)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选至少20％，更优选其中在a)i)获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％，并且在a)ii)中获得的值高于相应对照值至少50％，更优选至少100％，
[0088] 优选地，其中对于在a)i)和a)ii)中获得的值建立组合值和/或至少重复三次测量在a)中的值和/或建立统计学显著性。
[0089] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0090] 此外，令人惊讶地发现，通过在该方法中包括进一步测定可以进一步提高准确性和可靠性，该方法测量角质形成细胞(诸如原代角质形成细胞或HaCaT细胞)的增殖。此外，在实施例中发现，与原代角质形成细胞相比，优选使用HaCaT细胞，并且与上述基于成纤维细胞的测定相结合，能够进行可靠的预测。令人惊讶地发现，在用测量原代成纤维细胞增殖、测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质、和测量角质形成细胞增殖的测定获得至少两个、优选全部三个值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的情况下，皮肤伤口可被可靠地识别为愈合的皮肤伤口，更优选其中在测量原代成纤维细胞增殖和/或由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质的测定中、以及在测量角质形成细胞增殖的测定中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％、20％、30％、40％或50％。
[0091] 因此，发现在用测量原代成纤维细胞增殖、测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质、和测量角质形成细胞增殖的测定获得至少两个、优选全部三个值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的情况下，皮肤伤口可被可靠地识别为未愈合的皮肤伤口，更优选其中在测量原代成纤维细胞增殖和/或由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质的测定中、以及在测量角质形成细胞增殖的测定中获得的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％、20％、30％、40％或50％。
[0092] 因此，在本发明方法的另一个优选实施方案中，步骤a)还包含以下步骤：
[0093] iiia)在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下测量角质形成细胞的增殖，
[0094] 其中步骤b)包含：
[0095] b)如果在i)至iiia)中获得的至少两个、优选三个值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，更优选地，其中在i)和/或ii)和iiia)中获得的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，
[0096] 或者
[0097] 如果在i)至iii)中获得的至少两个、优选三个值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，更优选其中在i)和/或ii)和iiia)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％，
[0098] 甚至更优选地，其中在i)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％和/或在ii)中获得的值高于相应对照值至少50％，更优选至少100％，并且在iiia)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选至少15％。
[0099] 优选地，其中对于在i)和/或ii)和iiia)中获得的值建立组合值。
[0100] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0101] 在步骤iiia)中，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下测量角质形成细胞的增殖。角质形成细胞增殖测定优选包括在标准条件下培养人原代角质形成细胞或HaCaT细胞，其是标准角质形成细胞系，诸如通过使用含有FCS的
DMEM作为培养基，如实施例中所述。随后将细胞在固体支持物上孵育，从而使细胞粘附在支持物上。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触。例如，可以将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本添加到粘附细胞中，例如通过移液或以其他方式添加液体，或者可以将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本添加到非粘附细胞中，例如通过移液或以其他方式将液体添加到细胞中，然后使角质形成细胞粘附。
随后将细胞孵育，优选孵育6小时至200小时，优选24小时至100小时。在实施例中，将细胞培养72小时。随后，测定角质形成细胞的量，优选细胞数，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量。例如，可以使用多聚甲醛固定细胞。此外，合适的染料(诸如磺酰罗丹明B)可用于测定角质形成细胞的量，优选细胞数。然后可以对染色的细胞进行定量，例如通过测定在合适波长下的吸光度或荧光，这取决于染料。优选地，该方法在2D细胞培养中进行，其允许将细胞粘附在固体支持物上。优选地，样本是伤口渗出物样本。
DMEM作为培养基，如实施例中所述。随后将细胞在固体支持物上孵育，从而使细胞粘附在支持物上。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触。例如，可以将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本添加到粘附细胞中，例如通过移液或以其他方式添加液体，或者可以将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本添加到非粘附细胞中，例如通过移液或以其他方式将液体添加到细胞中，然后使角质形成细胞粘附。
随后将细胞孵育，优选孵育6小时至200小时，优选24小时至100小时。在实施例中，将细胞培养72小时。随后，测定角质形成细胞的量，优选细胞数，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量。例如，可以使用多聚甲醛固定细胞。此外，合适的染料(诸如磺酰罗丹明B)可用于测定角质形成细胞的量，优选细胞数。然后可以对染色的细胞进行定量，例如通过测定在合适波长下的吸光度或荧光，这取决于染料。优选地，该方法在2D细胞培养中进行，其允许将细胞粘附在固体支持物上。优选地，样本是伤口渗出物样本。
[0102] 角质形成细胞可以是原代角质形成细胞或角质形成细胞系，特别是人原代角质形成细胞或人角质形成细胞系。在一个优选的实施方案中，用于本发明的角质形成细胞选自HaCaT细胞和原代角质形成细胞。HaCaT细胞代表已建立且广泛使用的人角质形成细胞系。
[0103] 在更优选的实施方案中，用于本发明的角质形成细胞是HaCaT细胞。
[0104] 因此，在优选的实施方案中，在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下测量角质形成细胞的增殖包括以下步骤：
[0105] (i)培养角质形成细胞，
[0106] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0107] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，所述伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，
[0108] (iv)测定角质形成细胞的数量，优选细胞数，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，
[0109] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0110] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0111] 此外，令人惊讶地发现，通过在该方法中包括一种或多种进一步的测定，可以进一步提高准确性和可靠性，该进一步的测定在伤口渗出物的背景下测定巨噬细胞M1和M2标志物。这些标志物可以是细胞表面蛋白标志物、巨噬细胞上清液中的蛋白质标志物或巨噬细胞中的标志物mRNA。
[0112] 巨噬细胞是驻留在组织的专业吞噬细胞和抗原呈递细胞(APC)，其由循环的外周血单核细胞分化。技术人员将不同表型的活化巨噬细胞分类为M1巨噬细胞和M2巨噬细胞。
M1巨噬细胞是活化的巨噬细胞，其包含具有急性炎症表型的免疫效应细胞。它们对细菌具有高度侵袭性并产生大量淋巴因子。M2巨噬细胞交替激活并抗炎。
M1巨噬细胞是活化的巨噬细胞，其包含具有急性炎症表型的免疫效应细胞。它们对细菌具有高度侵袭性并产生大量淋巴因子。M2巨噬细胞交替激活并抗炎。
[0113] “M2标志物”被理解为对M2巨噬细胞特异的蛋白质标记。优选地，标志物由巨噬细胞分泌。合适的M2标志物是本领域已知的，并且优选选自CCL22和CCL18。可以通过本领域已知的方法测定标志物，例如通过使用免疫学测定法，甚至更优选通过使用ELISA测定法。
[0114] “M1标志物”被理解为对M1巨噬细胞特异的蛋白质标记。优选地，标志物由巨噬细胞分泌。合适的M1标志物是本领域已知的，并且优选选自CXCL10和IL-23p19。可以通过本领域已知的方法测定标志物，例如通过使用免疫学测定法，甚至更优选通过使用ELISA测定法。
[0115] “M1细胞表面标志物”被理解为在巨噬细胞表面表达的蛋白质标志物，其对M1巨噬细胞特异。合适的M1细胞表面标志物是本领域已知的，并且优选选自CD38、CD64和CD197。可以通过免疫学测定法和/或荧光测定法来测定细胞表面标志物的量和/或频率分布，特别是通过FACS分析来测定，由此通常测定频率分布。
[0116] “M2细胞表面标志物”被理解为在巨噬细胞表面表达的蛋白质标志物，其对M2巨噬细胞特异。合适的M2细胞表面标志物是本领域已知的，并且优选选自CD200受体(CD200R)、CD206和CD209。可以通过免疫学测定法和/或荧光测定法来测定细胞表面标志物的量和/或频率分布，特别是通过FACS分析来测定，由此通常测定频率分布。
[0117] “M2标志物mRNA”被理解为由巨噬细胞表达的mRNA，其对M2巨噬细胞是特异性的。合适的M2标志物mRNA是本领域已知的，并且优选选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18。可以通过本领域已知的方法测定标志物mRNA。优选地，可以通过使特异性结合标志物mRNA的探针(其中任选地标记探针)与巨噬细胞RNA在有利于杂交的条件下接触，并检测杂交的探针，来测定该量。例如，mRNA可以在检测之前反转录成cDNA。
[0118] “M1标志物mRNA”被理解为由巨噬细胞表达的mRNA，其对M1巨噬细胞特异。合适的M1标志物mRNA是本领域已知的，并且优选选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19。优选地，可以通过使特异性结合标志物mRNA的探针(其中任选地标记探针)与巨噬细胞RNA在有利于杂交的条件下接触，并检测杂交的探针，来测定该量。例如，mRNA可以在检测之前反转录成cDNA。
[0119] 令人惊讶地发现，与上述一种或多种涉及测量原代成纤维细胞增殖、测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质(FDM)、以及测量角质形成细胞增殖的细胞测定相结合，M1/M2标志物的比率指示愈合的或未愈合的皮肤伤口。特别地，M1/M2标志物、M1/M2细胞表面标志物或M1/M2标志物mRNA的比率升高表示未愈合的皮肤伤口，而M1/M2标志物、M1/M2细胞表面标志物或M1/M2标志物mRNA的比率低表示愈合的皮肤伤口。
[0120] 如实施例3.1.6以及图38至图43和图45所示，令人惊讶地发现，巨噬细胞/成纤维细胞共培养物中巨噬细胞分泌的促炎细胞因子IL1α、IL1β和TNF-α的量被发现对于识别愈合的皮肤伤口或未愈合的皮肤伤口以及对于监测伤口愈合特别具有预测性。特别地，发现与来自愈合伤口的WE相比，在来自未愈合伤口的WE存在下分泌更高量的这些细胞因子。细胞因子IL1α、IL1β和TNF-α是蛋白质，优选人蛋白质，其为技术人员所熟知。IL1α(也称为白细胞介素-1α或IL-1α)、IL1β(也称为白细胞介素-1β或IL-1β)和TNF-α(也称为肿瘤坏死因子α或TNF-α)可通过本领域中已知的方法测定，例如通过使用免疫学测定，甚至更优选通过使用ELISA测定，如实施例中所述。已知IL1α、IL1β和TNF-α是促炎细胞因子。
[0121] 因此，在本发明的另一个优选实施方案中，本发明方法的步骤a)还包含以下步骤iiib)至iiid)中的一个、两个或三个：
[0122] iiib)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0123] iiic)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0124] iiid)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0125] 其中，本发明方法的步骤b)包含：
[0126] b)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
[0127] (1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0128] (2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0129] (3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0130] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界(cut-off)值，
[0131] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于临界值，
[0132] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，
[0133] 或者
[0134] 如果满足(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
[0135] (1)在i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0136] (2)在ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0137] (3)在iiia)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0138] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
[0139] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面的量和/或频率分布的比率低于临界值，
[0140] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
[0141] 优选地，其中对于在i)、ii)、iiia)、iiib)、iiic)和/或iiid)中获得的值建立组合值。
[0142] 因此，在本发明的又一个优选实施方案中，本发明方法的步骤a)还包括以下步骤iiib)至iiid)中的一个、两个或三个，或包含以下步骤iiib)至iiie)的一个、两个、三个或四个：
[0143] iiib)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0144] iiic)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自
CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和
CD209，
CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和
CD209，
[0145] iiid)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-
23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0146] iiie)测量与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中一种或更多细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0147] 并且其中步骤b)包含：
[0148] b)如果满足(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
[0149] (1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0150] (2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0151] (3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0152] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界值，
[0153] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面的量和/或频率分布的比率高于临界值，特别地其中该比率选自CD38/
CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
[0154] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，
[0155] (7)在iiie)中获得的值高于临界值，
[0156] 或者
[0157] 如果满足(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
[0158] (1)在i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0159] (2)在ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0160] (3)在iiia)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0161] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
[0162] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面的量和/或频率分布的比率低于临界值，特别地其中该比率选自CD38/
CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
[0163] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
[0164] (7)在iiie)中获得的值低于临界值，
[0165] 优选地，其中对于在i)、ii)、iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和/或iiie)中获得的值建立组合值。
[0166] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0167] 在本发明的又一个优选实施方案中，本发明方法的步骤a)还包括上述步骤iiib)、iiic)和iiie)中的一个、两个或三个。在这样的优选实施方案中，步骤b)包含：如果满足上述未愈合皮肤伤口标准的(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口。此外，在这样的优选实施方案中，步骤b)包含：如果满足上述愈合皮肤伤口标准的(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口。
[0168] 如实施例3.1.6和图34、图35和图44所示，令人惊讶地发现，以下M1细胞表面标志物/M2细胞表面标志物比率被发现对于识别愈合的皮肤伤口或未愈合的皮肤伤口特别具有预测性，分别为：CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率。
[0169] 因此，在一个优选的实施方案中，如果在iiic)中获得的选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率的量和/或频率分布的比率高于临界值，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口。
[0170] 因此，在另一个优选的实施方案中，如果在iiic)中获得的选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197的/CD206比率的量和/或频率分布的比率低于临界值，则将皮肤伤口识别为愈合皮肤伤口。
[0171] 可以通过测定种群内对给定标志物呈阳性的细胞的年龄百分比来测定频率分布，这是FACS分析中最常用的读数。可替代地，可以通过测定细胞表面表达的量来测定该量，作为当使用用于标志物的标记的结合剂时每个细胞的细胞表面上的标记分子的数目的替代，例如通过平均荧光强度测量。
[0172] 在一个优选的实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，包括以下步骤：
[0173] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0174] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0175] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0176] (iv)测定细胞培养上清液中一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，
[0177] 优选地，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，和/或所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，更优选其中通过使用免疫学测定法来测定所述标志物，甚至更优选通过使用ELISA测定法测定，
[0178] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0179] 例如，原代人单核细胞可以在2D细胞培养中与人真皮成纤维细胞共培养，或与成纤维细胞衍生基质共培养。上文以及实施例中描述了产生成纤维细胞衍生基质的方法。随后，孵育细胞直至达到巨噬细胞分化。例如，CD163可用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，例如通过将样本移液到细胞中，并任选地温和混合。此外，将细胞孵育优选1小时至100小时，例如4小时至100小时。随后，测定细胞培养上清液中一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量。通常为此目的收获上清液，并使用合适的测定法(诸如免疫测定法)测定标志物。例如，可以使用ELISA。在优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0180] 在另一个优选的实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，包括以下步骤：
[0181] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0182] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0183] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0184] (iv)测定巨噬细胞的细胞表面上的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量和/或频率分布。
[0185] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0186] 例如，原代人单核细胞可以在2D细胞培养中与人真皮成纤维细胞共培养，或与成纤维细胞衍生基质共培养。上文以及实施例中描述了产生成纤维细胞衍生基质的方法。随后，孵育细胞直至达到巨噬细胞分化。例如，CD163可用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，例如通过将样本移液到细胞中，并任选地温和混合。此外，将细胞孵育优选1小时至100小时，例如4小时至100小时。随后，测定巨噬细胞的细胞表面上的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量和/或频率分布。例如，可以收获细胞并进行FACS分析，对单核细胞/巨噬细胞种群进行门控。平均荧光强度的几何平均值可用于量化表面标志物表达。
[0187] 优选地，一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，和/或一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，更优选其中通过免疫学测定法和/或荧光测定法，特别是通过FACS分析，测定细胞表面标志物的量和/或频率分布。
[0188] 在一个优选的实施方案中，步骤(iv)包含将巨噬细胞与结合剂(优选抗体)接触，该结合剂特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标记物进行标记，并测定与巨噬细胞结合的结合分子的量，特别是通过测定平均荧光强度，从而测定细胞表面标志物的量。例如，可以使用特异性识别表面标志物并含有荧光标记物的抗体。
[0189] 在另一个优选的实施方案中，步骤(iv)包含将巨噬细胞与结合剂(优选抗体)接触，该结合剂特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标志物标记，并测定细胞群体内分别对一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物呈阳性的细胞的百分比，特别地其中进行FACS分析，从而测定细胞表面标志物的频率分布。例如，可以使用特异性结合表面标志物并含有荧光标记物的抗体。
[0190] 可以使用多种已知方法中的任何一种来确定蛋白质作为标志物蛋白质的结合剂，该方法用于识别并获得与蛋白质或多肽特异性相互作用的蛋白质，例如，诸如美国专利第5,283,173号和美国专利第5,468,614号中所描述的酵母双杂交筛选系统或等同物。特异性识别标志物的结合剂优选对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性识别标志物的结合剂优选对其靶标志物分子具有108μl/mol或甚至更优选109μl/mol的亲和力。如技术人员将理解的，术语“特异性”用于表示样本中存在的其他生物分子不显著结合特异性识别标志物的结合剂。优选地，与除靶标志物分子之外的生物分子的结合水平分别导致结合亲和力仅为10％或更低，更优选对靶标志物分子的亲和力仅为5％或更低。优选的特异性结合剂将满足上述亲和力和特异性的最低标准。
[0191] 特异性识别标记的结合剂优选是与标志物反应的抗体。术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体、此类抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体结合结构域的遗传构建体。
[0192] 术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、其片段(诸如F(ab')2和Fab片段)、以及任何天然存在的或重组产生的结合伴侣，它们是特异性结合标志物蛋白质的分子。可以使用保留上述特异性结合剂标准的任何抗体片段。通过现有技术方法产生抗体，例如，如Tijssen(Tijssen,P.，酶免疫测定法的实践与理论(Practice and theory of enzyme
immunoassays)，爱思唯尔(Elsevier)科学出版社，阿姆斯特丹(1990)，书本全文，尤其是第
43-78页)中所描述的。此外，技术人员非常了解基于免疫吸附剂的方法，该方法可用于特异性分离抗体。通过这些方法，可以增强多克隆抗体的质量并因此提高它们在免疫测定中的性能(Tijssen,P.，同上，第108-115页)。
immunoassays)，爱思唯尔(Elsevier)科学出版社，阿姆斯特丹(1990)，书本全文，尤其是第
43-78页)中所描述的。此外，技术人员非常了解基于免疫吸附剂的方法，该方法可用于特异性分离抗体。通过这些方法，可以增强多克隆抗体的质量并因此提高它们在免疫测定中的性能(Tijssen,P.，同上，第108-115页)。
[0193] 对于本发明中公开的实现，可以使用例如在山羊中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种(例如大鼠、兔或豚鼠)的多克隆抗体、以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以以所需的恒定特性以任何量生产，因此它们是开发临床常规试验的理想工具。
[0194] 为了测量，将从个体获得的样本与结合剂一起孵育，该结合剂在适于形成结合剂标志物复合物的条件下特异性识别所述标志物。不需要指定此类条件，因为本领域技术人员不需要任何创造性努力就能够容易地识别此类适合的孵育条件。测量结合剂标志物-复合物的量并将其用于本发明的方法和用途中。如本领域技术人员将理解的，有多种方法来测量特异性结合剂标志物-复合物的量，所有这些都详细描述于相关教科书中(参见，例如，Tijssen P.，同上，或Diamandis,EP和Christopoulos,TK(编著)，免疫测定法(Immunoassay)，学术(Academic)出版社，波士顿(1996))。
[0195] 特别地，针对标志物的单克隆抗体以定量(测定标志物的量或浓度)免疫测定法使用。
[0196] 例如，可以以夹心型测定形式检测标志物。在这种测定中，第一种特异性结合剂用于在一侧捕获讨论中的标志物，第二种特异性结合剂(例如第二种抗体)在另一侧用于标记为直接或间接可检测的。第二种特异性结合剂可含有可检测的报告分子部分或标记物，诸如酶、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团或生物素等。任何报告分子或标记物可与本文公开的方法一起使用，只要其信号与洗涤后残留在支持物上的结合剂的量直接相关或成比率即可。然后使用适合于特定可检测报告分子部分或标记物的方法来测定保持结合到固体支持物的第二种结合剂的量。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影方法通常是适合的。可以使用多种偶联技术制备抗体-酶缀合物(综述参见例如Scouten,W.H.，酶学中的方法
(Methods in Enzymology)135:30-65,1987)。光谱方法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。可以使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白来检测生物素，该生物素与不同的报告基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联。通常可以通过添加底物(通常持续特定的时间段)，然后进行光谱、分光光度或反应产物的其他分析来检测酶报告基团。使用众所周知的技术，标准品和标准添加物可用于测定样本中的抗原水平。
(Methods in Enzymology)135:30-65,1987)。光谱方法可用于检测染料(包括例如酶反应的比色产物)、发光基团和荧光基团。可以使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白来检测生物素，该生物素与不同的报告基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联。通常可以通过添加底物(通常持续特定的时间段)，然后进行光谱、分光光度或反应产物的其他分析来检测酶报告基团。使用众所周知的技术，标准品和标准添加物可用于测定样本中的抗原水平。
[0197] 用于测量本发明的标志物蛋白质的免疫测定法包括例如ELISA、酶免疫测定法(EIA)和电化学发光免疫测定法(ECLIA)，用于定量测定本文所述的标志物蛋白质。
[0198] 在另一个优选的实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，包括以下步骤：
[0199] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0200] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0201] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0202] (iv)测定巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平。
[0203] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0204] 优选地，一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，和/或一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，更优选地，该方法包含将特异性结合标志物mRNA的探针(其中该探针任选地被标记)在有利于杂交的条件下与巨噬细胞RNA接触，并检测杂交的探针。
[0205] 例如，原代人单核细胞可以在2D细胞培养中与人真皮成纤维细胞共培养，或与成纤维细胞衍生基质共培养。上文以及实施例中描述了产生成纤维细胞衍生基质的方法。随后，孵育细胞直至达到巨噬细胞分化。例如，CD163可用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，例如通过将样本移液到细胞中，并任选地温和混合。此外，将细胞孵育优选1小时至100小时，例如4小时至100小时。随后，测定巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平。例如，可以收获细胞并且可以使用合适的探针测定mRNA表达水平。例如，可以测定管家基因诸如肌动蛋白或GAPDH的表达水平，并且可以将M1或M2标志物RNA的表达水平测定为相对于持家基因的表达水平。
[0206] 在另一个优选的实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，包括以下步骤：
[0207] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0208] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0209] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0210] (iv)测定细胞培养上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，
[0211] 优选地，其中通过使用免疫学测定法，更优选通过使用ELISA测定法，来测定细胞因子标志物。
[0212] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0213] 例如，原代人单核细胞可以在2D细胞培养中与人真皮成纤维细胞共培养，或与成纤维细胞衍生基质共培养。上文以及实施例中描述了产生成纤维细胞衍生基质的方法。随后，孵育细胞直至达到巨噬细胞分化。例如，CD163可用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物。此外，使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，例如通过将样本移液到细胞中，并任选地温和混合。此外，将细胞孵育优选1小时至100小时，例如4小时到100小时。随后，测定细胞培养上清液中IL-1α、IL-1β和TNF-α中的一种或多种的量。通常为此目的收获上清液，并使用合适的测定法，诸如免疫学测定法，来测定细胞因子标志物。例如，可以使用ELISA。在优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0214] 如实施例3.1.6以及图38至图43和图45所示，在不同的时间点，与愈合的伤口相比，在存在来自未愈合伤口的伤口渗出物的情况下，上清液中IL-1α、IL-1β和TNF-α的量更高，并且与在愈合情况下来自相同伤口的伤口渗出物相比，在存在来自未愈合情况下伤口的伤口渗出物的情况下，上清液中IL-1α、IL-1β和TNF-α的量更高。因此，IL-1α、IL-1β和TNF-α的量分别指示愈合的或未愈合的伤口，并且用于监测皮肤伤口的伤口愈合。在这种情况下，适当地测定临界值。
[0215] 可根据所需的敏感度和特异度选择测定法的合适临界值。敏感度和特异度是二元分类测试性能的统计测量，在统计学中也称为分类函数：
[0216] 敏感度(也称为真阳性率)测量正确识别的阳性的比率(例如，愈合的皮肤伤口分别被识别为愈合的皮肤伤口的的百分比)。
[0217] 特异度(也称为真阴性率)测量正确识别的阴性的比率(例如，愈合的皮肤伤口被识别为未愈合的皮肤伤口的百分比)。
[0218] 对于任何测试，通常在测量之间进行权衡。例如，在机场安全设定中，人们正在测试潜在的安全威胁，扫描仪可能会被设定为触发低风险项目，如皮带扣和钥匙(低特异度)，以减少错过对飞机和船上的人构成威胁的物品的风险(高敏感度)。这种折衷可以用图形表示为接收器操作特性曲线。完美的预测器将被描述为100％敏感(例如，所有未愈合的皮肤伤口都被识别为未愈合的皮肤伤口)和100％特异(例如，所有愈合的皮肤伤口未被识别为未愈合的皮肤伤口)；然而，理论上任何预测器都将具有称为贝叶斯(Bayes)误差率的最小误差界限。可以设定临界值以增加敏感度或特异度。
[0219] 如果在本发明的方法中使用两个或更多个值，诸如在进行测量原代成纤维细胞增殖和测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质的测定时所测定的值，可以使用在测定中获得的两个或更多个值来计算组合值。将组合值与相应对照的组合值进行比较，该相应对照的组合值是使用相同的数学过程获得的。在优选的实施方案中，通过值的加权计算来获得组合值。这意味着其中一种测定的权重高于另一种测定。优选地，通过分析皮肤伤口的参考种群来获得加权因子。
[0220] 此外，令人惊讶地发现，在进行本文所述的两种或更多种细胞和生物化学测定的情况下，可以实现提高的准确性和可靠性，其中在测量原代成纤维细胞增殖和/或测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质(FDM)的测定中获得的值对于将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口或未愈合的皮肤伤口是强制性的。例如，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口优选地要求至少在测量原代成纤维细胞增殖和/或测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质(FDM)的测定中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。此外，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口优选地要求至少在测量原代成纤维细胞增殖和/或测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质(FDM)的测定中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。优选地，样本是伤口渗出物样本。
[0221] 因此，在本发明更优选的实施方案中，步骤b)包含：
[0222] 如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
[0223] (1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0224] (2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0225] (3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0226] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界值，
[0227] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于临界值，
[0228] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，
[0229] 条件是至少在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0230] 和/或
[0231] 如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
[0232] (1)在i)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0233] (2)在ii)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0234] (3)在iiia)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0235] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
[0236] (5)在iiic)中获得的值一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面的量和/或频率分布的比率低于临界值，
[0237] (6)在iiid)中获得的值一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
[0238] 条件是至少在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。
[0239] 因此，在本发明的另一个更优选的实施方案中，步骤b)包含：
[0240] b)如果满足(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个或(1)至(7)的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口：
[0241] (1)在i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0242] (2)在ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0243] (3)在iiia)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0244] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率高于临界值，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0245] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于临界值，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，特别地其中该比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
[0246] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于临界值，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、
CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0247] (7)在iiie)中获得的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量的值高于临界值，
[0248] 条件是至少在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0249] 和/或
[0250] 如果满足(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或(1)至(7)的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口：
[0251] (1)在i)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0252] (2)在ii)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0253] (3)在iiia)中获得的值高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0254] (4)在iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于临界值，
[0255] (5)在iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于临界值，特别地其中该比率选自
CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，
[0256] (6)在iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于临界值，
[0257] (7)在iiie)中获得的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量的值低于临界值，
[0258] 条件是至少在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。
[0259] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0260] 在本发明的另一个更优选的实施方案中，步骤b)包含：如果满足上述未愈合皮肤伤口的标准(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，条件是至少在i)和/或ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。在本发明的另一个更优选的实施方案中，步骤b)包含：如果满足上述愈合皮肤伤口的标准(1)至(5)和(7)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，条件是至少在i)和/或ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出液或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值。
[0261] 在一个更优选的实施方案中，如果满足用于愈合皮肤伤口的上述(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或上述(1)至(7)的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个、或上述(1)至(5)和(7)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为愈合的皮肤伤口，条件是至少在i)和/或ii)中获得的值高于相应对照值至少10％，更优选其中在i)和/或ii)中获得的值高于相应对照值至少15％，甚至更优选至少20％、30％、40％或50％，甚至更优选其中在i)中获得的值高于相应对照值至少15％，甚至更优选至少20％、30％、40％或50％，并且在ii)中获得的值高于相应对照值至少50％，更优选至少
100％，甚至更优选110％、120％、130％或140％。
100％，甚至更优选110％、120％、130％或140％。
[0262] 在另一个更优选的实施方案中，如果满足用于未愈合皮肤伤口的上述(1)至(6)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个、或上述(1)至(7)的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个、或上述(1)至(5)和(7)的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，条件是至少在i)和/或ii)中获得的值低于相应对照值至少10％，更优选其中在i)和/或ii)中获得的值低于相应对照值至少15％，甚至更优选至少
20％、30％、40％或50％。
20％、30％、40％或50％。
[0263] 此外，令人惊讶的是，可以使用一种或多种上述细胞和生物化学测定法建立用于监测个体中的皮肤伤口愈合的体外方法。特别地，令人惊讶地发现，在两个不同时间点在存在从皮肤伤口处获得的伤口渗出物样本的情况下测量原代成纤维细胞的增殖，和/或在两个不同时间点在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，能够监测伤口的愈合：与较早的第一时间点相比，在较晚的第二时间点测定的值的增加表明皮肤伤口的愈合已经改善，而与较早时间点相比，在较晚时间点测定的值的减少表明皮肤伤口愈合已经恶化。如上所述进行细胞测定用于识别方
法。另外，通过应用上述识别方法，任选地可以分别在每个时间点确定皮肤伤口是愈合的皮肤伤口还是未愈合的皮肤伤口。
法。另外，通过应用上述识别方法，任选地可以分别在每个时间点确定皮肤伤口是愈合的皮肤伤口还是未愈合的皮肤伤口。
[0264] 此外，在一个优选实施例中，可以在一个或多个其他时间点重复方法步骤，从而进一步监测患者随时间的愈合。
[0265] 如图所示，对于3个个体患者(图27为患者“B”，图30为患者“C”，图33为患者“A”)，本发明的方法能够可靠地监测和预测患者皮肤伤口的伤口愈合。例如，在视觉检查推断伤口愈合改善的时间点，本发明的方法正确地预测了患者皮肤伤口愈合的随后恶化。
[0266] 因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于监测个体中的皮肤伤口愈合的体外方法，该方法包含：
[0267] a)测量
[0268] i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0269] ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0270] b)任选地，如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口，或如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第一时间点是愈合的皮肤伤口，
[0271] c)测量
[0272] i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0273] ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0274] d)任选地，如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口，或如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
[0275] e)
[0276] A)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，
[0277] 或者
[0278] B)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，
[0279] 和
[0280] f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)，
[0281] 从而监测皮肤伤口的愈合，
[0282] 优选地
[0283] 其中第一时间点和第二时间点相隔6小时至12个月，和/或
[0284] 该值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
[0285] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0286] 第二时间点被理解为晚于第一时间点。通常，第一时间点和第二时间点相隔至少6小时，特别是6小时至12个月。例如，第一时间点和第二时间点相隔12小时至3个、6个或12个月，或1天、1周或1个月至12个月。
[0287] 如果在第二较晚时间点，在用于测量在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下原代成纤维细胞的增殖、以及用于测量在存在伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质中的一种或两种测定中获得的值等于或低于在第一较早时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建
立的对照值，当与较早时间点相比，在较晚时间点测定到一种或两种基于成纤维细胞的测定的值增加时，监测令人惊讶地可靠地测定皮肤伤口在第二时间点表现出与第一时间点相比愈合改善。因此，如通过本发明的识别方法所测定的，在伤口于第一较早时间点为未愈合伤口的情况下，对愈合改善的监测是特别可靠的。
立的对照值，当与较早时间点相比，在较晚时间点测定到一种或两种基于成纤维细胞的测定的值增加时，监测令人惊讶地可靠地测定皮肤伤口在第二时间点表现出与第一时间点相比愈合改善。因此，如通过本发明的识别方法所测定的，在伤口于第一较早时间点为未愈合伤口的情况下，对愈合改善的监测是特别可靠的。
[0288] 因此，优选的是，本发明的用于监测个体中的皮肤伤口愈合的方法包括通过在相应的时间点执行本发明的方法，分别将皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口。
[0289] 此外，如果在第二较晚时间点，在用于测量在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下原代成纤维细胞的增殖、以及用于测量在存在伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质中的一种或两种测定中获得的值等于或低于在第一较早时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情
况下建立的对照值的100％，当与较早时间点相比，在较晚时间点测定到一种或两种基于成纤维细胞的测定的值减少时，监测令人惊讶地可靠地测定皮肤伤口在第二时间点表现出与第一时间点相比愈合恶化。因此，如通过本发明的识别方法所测定的，在伤口于第二较晚时间点为未愈合伤口的情况下，对愈合恶化的监测是特别可靠的。
况下建立的对照值的100％，当与较早时间点相比，在较晚时间点测定到一种或两种基于成纤维细胞的测定的值减少时，监测令人惊讶地可靠地测定皮肤伤口在第二时间点表现出与第一时间点相比愈合恶化。因此，如通过本发明的识别方法所测定的，在伤口于第二较晚时间点为未愈合伤口的情况下，对愈合恶化的监测是特别可靠的。
[0290] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0291] 应当理解，用于识别的方法的优选实施方案也适用于本发明的用于监测的方法。
[0292] 因此，在另一个实施方案中，本发明涉及用于监测个体中的皮肤伤口愈合的体外方法，该方法包含：
[0293] a)测量
[0294] i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0295] ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0296] b)任选地，如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口，或如果在a)i)和/或a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在第一时间点是愈合的皮肤伤口，
[0297] c)测量
[0298] i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和/或
[0299] ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0300] d)任选地，如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口识别在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口，或如果在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
[0301] e)
[0302] A)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，
[0303] 条件是在所述第一时间点在a)i)中和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，
[0304] 或者
[0305] B)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在
[0306] a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，
[0307] 条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％，
[0308] 和
[0309] f)任选地在一个或多个稍后的时间点重复步骤a)至e)，
[0310] 从而监测皮肤伤口的愈合，
[0311] 优选地
[0312] 其中第一时间点和第二时间点相隔6小时至12个月，和/或
[0313] 该值至少重复三次测量和/或建立统计学显著性。
[0314] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0315] 如果在第一时间点的样本是伤口渗出物样本，则在第二时间点的样本优选也是伤口渗出物样本。这同样适用于步骤f)的方法步骤的任何重复。
[0316] 如果在第一时间点的样本是伤口生物膜样本，则在第二时间点的样本优选也是伤口生物膜样本。这同样适用于步骤f)的方法步骤的任何重复。
[0317] 在一个优选的实施方案中，本发明的方法包含：
[0318] a)测量
[0319] i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0320] ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0321] b)任选地，如果在a)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口，或
[0322] 如果在a)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在a)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第一时间点是愈合的皮肤伤口，
[0323] c)测量
[0324] i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0325] ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0326] d)任选地，如果在c)i)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在c)ii)中获得的值低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别所述皮肤伤口在所述第二时间点为未愈合的皮肤伤口，或
[0327] 如果在c)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
[0328] 如果在c)i)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，并且在c)ii)中获得的值等于或高于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，则识别皮肤伤口在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
[0329] e)
[0330] A)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，
[0331] 条件是在所述第一时间点在a)i)中以及在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，
[0332] 或者
[0333] B)如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，
[0334] 条件是在所述第二时间点在c)i)和c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，和
[0335] f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)。
[0336] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0337] 例如，步骤a)至e)可以在两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个较晚的时间点重复。
[0338] 在一个优选的实施方案中，如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少至少10％、更优选15％、甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％、更优选15％、甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合。
[0339] 条件是在所述第一时间点在a)i)以及在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或
50％。
50％。
[0340] 在另一个优选的实施方案中，如果在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合。
[0341] 条件是在所述第二时间点在c)i)和c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，优选其中在所述第二时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第二时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0342] 此外，令人惊讶地发现，如上所述，如果用于测量在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下原代成纤维细胞的增殖以及用于测量在存在伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质的测定
相关的两种测定都得以进行，并任选地进行与巨噬细胞M1和M2标志物和/或细胞因子标志物IL1α、IL1β和/或TNFα相关的进一步测定，可以实现更加准确和可靠的监测。
相关的两种测定都得以进行，并任选地进行与巨噬细胞M1和M2标志物和/或细胞因子标志物IL1α、IL1β和/或TNFα相关的进一步测定，可以实现更加准确和可靠的监测。
[0343] 因此，在另一个优选实施例中，本发明的方法包含：
[0344] a)测量
[0345] i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0346] ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0347] 以及iiia)、iiib)、iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个：
[0348] iiia)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，角质形成细胞的增殖，
[0349] iiib)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0350] iiic)在第一时间点，与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的
量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0351] iiid)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0352] b)根据本发明的方法，任选地将皮肤伤口识别为在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口或将皮肤伤口识别为在第一时间点是愈合的皮肤伤口，
[0353] c)测量
[0354] i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0355] ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，以及iiia)、iiib)、iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个：
[0356] iiia)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，角质形成细胞的增殖，
[0357] iiib)在第二时间点，在与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0358] iiic)在第二时间点与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量
和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0359] iiid)在第二时间点与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0360] d)根据本发明的方法，任选地将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口或将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，e)
[0361] A)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合：
[0362] (1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，
[0363] (2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
[0364] (3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
[0365] (4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物与一种或多种M2标志物的量的比率低于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
[0366] (5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于在所述第一时间点a)ii)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细
胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
[0367] (6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，
[0368] 条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
[0369] 条件是在所述第一时间点在a)i)和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，
[0370] 或者
[0371] B)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合：
[0372] (1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，
[0373] (2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
[0374] (3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
[0375] (4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物与一种或多种M2标志物的量的比率高于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
[0376] (5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于在所述第一时间点在a)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种
M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
[0377] (6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，
[0378] 条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
[0379] 条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％，
[0380] 和
[0381] f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)。
[0382] 因此，在另一个优选实施方案中，本发明的方法包含：
[0383] a)测量
[0384] i)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0385] ii)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0386] 以及iiia)、iiib)、iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个，或iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和iiie)中的一个、两个、三个、四个或五个：
[0387] iiia)在第一时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，HaCaT细胞的增殖，
[0388] iiib)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0389] iiic)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志
物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、
CD206和CD209，
物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、
CD206和CD209，
[0390] iiid)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0391] iiie)在第一时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出液样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0392] b)根据本发明的方法，任选地将皮肤伤口识别为在所述第一时间点是未愈合的皮肤伤口或将皮肤伤口识别为在第一时间点是愈合的皮肤伤口，
[0393] c)测量
[0394] i)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，原代成纤维细胞的增殖，和
[0395] ii)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，以及iiia)、iiib)iiic)和iiid)中的一个、两个、三个或四个，或iiia)、iiib)、iiic)、iiid)和iiie)中的一个、两个、三个、四个或五个：
[0396] iiia)在第二时间点，在存在从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，HaCaT细胞的增殖，
[0397] iiib)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞在与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0398] iiic)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志
物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、
CD206和CD209，
物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、
CD206和CD209，
[0399] iiid)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0400] iiie)在第二时间点，与从所述皮肤伤口获得的伤口渗出液样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0401] d)根据本发明的方法，任选地将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是未愈合的皮肤伤口或将皮肤伤口识别为在所述第二时间点是愈合的皮肤伤口，
[0402] e)
[0403] A)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合：
[0404] (1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，
[0405] (2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
[0406] (3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
[0407] (4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率低于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
[0408] 其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18。
[0409] (5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率低于在所述第一时间点a)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2
细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
[0410] 其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
[0411] 特别地其中该比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，[0412] (6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率低于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0413] (7)在所述第二时间点在c)iiie)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiie)中获得的值，
[0414] 条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值在所述第二时间点高于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
[0415] 条件是在所述第一时间点在a)i)和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值，
[0416] 或者
[0417] B)如果满足(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合：
[0418] (1)在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值，
[0419] (2)在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值，
[0420] (3)在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值，
[0421] (4)在所述第二时间点在c)iiib)中获得的一种或多种M1标志物与一种或多种M2标志物的量的比率高于在所述第一时间点在a)iiib)中获得的一种或多种M1标志物的量与一种或多种M2标志物的量的比率，
[0422] 其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0423] 特别地其中该比率选自CD38/CD209比率、CD197/CD209比率和CD197/CD206比率，[0424] (5)在所述第二时间点在c)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率高于在所述第一时间点在a)iiic)中获得的一种或多种M1细胞表面标志物的量和/或频率分布与一种或多种
M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
M2细胞表面标志物的量和/或频率分布的比率，
[0425] 其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
[0426] (6)在所述第二时间点在c)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率高于在所述第一时间点在a)iiid)中获得的一种或多种M1标志物mRNA的表达水平与一种或多种M2标志物mRNA的表达水平的比率，
[0427] 其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0428] (7)在所述第二时间点在c)iiie)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiie)中获得的值，
[0429] 条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，和
[0430] 条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％，
[0431] 和
[0432] f)任选地在一个或多个较晚的时间点重复步骤a)至e)。
[0433] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0434] 在本发明方法的一个优选实施方案中，步骤a)和c)包含测量iiia)、iiib)、iiic)和iiie)中的一个、两个或三个或四个。在此类优选实施方案中，在步骤e)A)中，如果满足用于改善的伤口愈合的(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值在所述第二时间点高于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，并且条件是在所述第一时间点在a)i)中获得的值和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值。此外，在此类优选实施方案中，在步骤e)B)中，如果满足用于恶化的皮肤伤口愈合的(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，条件是至少在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)和/或a)ii)中获得的值，并且条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的对照值的100％。
[0435] 在一个优选的实施方案中，如果满足用于改善的愈合的(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，或(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口识别在第二时间点表现出改善的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，
[0436] 条件是在所述第一时间点在a)i)和/或在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或
50％。
50％。
[0437] 优选地，样本是伤口渗出物样本。
[0438] 在一个更优选的实施方案中，如果满足用于改善的愈合的(1)至(6)中的在至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，或(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，
[0439] 条件是在所述第一时间点在a)i)和在所述第一时间点在a)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0440] 在另一个优选的实施方案中，如果满足用于恶化的伤口愈合的(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，或(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，优选地其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，
[0441] 条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，优选其中在所述第二时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第二时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0442] 在另一个更优选的实施方案中，如果满足用于恶化的伤口愈合的(1)至(6)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个、六个或七个，或(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个、四个、五个或六个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，优选地其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，
[0443] 条件是在所述第二时间点在c)i)和c)ii)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，优选其中所述第二时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第二时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％，
[0444] 此外，优选执行至少三种测定，该三种测定为在所述第一时间点和第二时间点测量原代成纤维细胞的增殖、测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，以及测量角质形成细胞的增殖。因此，在本发明方法的另一个优选实施方案中，在所述第一时间点执行方法步骤a)i)、a)ii)和a)iii)，并且在所述第二时间点执行c)i)、c)ii)和c)iii)。
[0445] 在一个更优选的实施方案中，如果满足用于改善的愈合的(1)至(3)中的至少两个、优选三个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出改善的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第二时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、
30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，[0446] 条件是在所述第一时间点在a)i)和/或在所述第一时间点在a)ii)和/或在所述第
一时间点在a)iiia)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少
15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，[0446] 条件是在所述第一时间点在a)i)和/或在所述第一时间点在a)ii)和/或在所述第
一时间点在a)iiia)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少
15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0447] 在一个更优选的实施方案中，如果满足用于改善的愈合的(1)至(3)中的至少两个、优选三个，则识别皮肤伤口在第二时间点在愈合情况下表现出改善的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值高于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值高于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选
20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、
40％或50％，
20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值高于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、
40％或50％，
[0448] 条件是在所述第一时间点在a)i)和在所述第一时间点在a)ii)和/或在所述第一时间点在a)iiia)获得的值等于或低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值，优选其中在所述第一时间点的值比低于相应对照值至少
10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第一时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0449] 在另一个优选的实施方案中，如果愈合，如果满足用于恶化的伤口愈合的(1)至(6)中的至少两个、优选三个，或(1)至(7)中的至少两个、优选三个，或(1)至(5)和(7)中的至少两个、优选三个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i)中获得的值至少10％，更优选
15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)ii中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、
25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或
50％，
15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)ii中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、
25％、30％、40％或50％，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或
50％，
[0450] 条件是在所述第二时间点在c)i)和/或c)ii)和/或c)iiia)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，优选其中在所述第二时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选至少15％，甚至更优选低于在所述第二时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少20％、30％、40％或50％。
[0451] 在另一个更优选的实施方案中，如果愈合，如果满足用于恶化的伤口愈合的(1)至(3)中的至少两个、优选三个，则识别皮肤伤口在第二时间点表现出恶化的愈合，优选其中在所述第二时间点在c)i)中获得的值低于在所述第一时间点在a)i中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％，并且在所述第二时间点在c)ii)中获得的值低于在所述第一时间点在a)ii)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、30％、40％或50％更低，和/或在所述第二时间点在c)iiia)中获得的值低于在所述第一时间点在a)iiia)中获得的值至少10％，更优选15％，甚至更优选20％、25％、
30％、40％或50％，
30％、40％或50％，
[0452] 条件是在所述第二时间点在c)i)和c)ii)和/或c)iiia)中获得的值等于或低于在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值的100％，优选其中在所述第二时间点的值低于相应对照值至少10％，更优选低于在所述第二时间点在没有伤口渗出物或伤口生物膜的情况下建立的相应对照值至少15％，甚至更优选至少20％、30％、40％或
50％。
50％。
[0453] 在本文所述的本发明任何方法的一个优选实施方案中，个体是哺乳动物，更优选是人。
[0454] 在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，皮肤伤口选自糖尿病患者的伤口、被至少一种微生物感染的伤口、缺血性伤口、患有血液供应不足或静脉淤滞的患者的伤口、溃疡(如糖尿病性溃疡、静脉性溃疡、动脉性溃疡(例如动脉性腿部溃疡)、混合性溃疡或压疮)、神经性伤口、腿部溃疡、手术伤口、烧伤、裂开、肿瘤性溃疡和罕见溃疡。
[0455] 如实施例中所述，此类伤口具有发展成慢性皮肤伤口和/或未愈合的皮肤伤口和/或表现出恶化的伤口愈合的高风险。此类皮肤伤口尤其可以受益于本发明的方法。在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，未愈合的皮肤伤口被理解为在标准疗法下在2个月内不闭合的伤口。
[0456] 在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，个体表现出进一步的疾病和/或共患病，和/或用药物治疗进一步的疾病和/或共患病。如实施例中所述，此类个体可能具有发展慢性皮肤伤口和/或未愈合的皮肤伤口和/或表现出恶化的伤口愈合的风险。此类皮肤伤口尤其可以受益于本发明的方法。
[0457] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，皮肤伤口未经处理或用以下一种或多种方式来治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物。
[0458] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，如果(i)通过本发明的用于将个体的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口的方法，将个体的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口，和/或通过本发明的用于监测皮肤伤口愈合的方法，将个体的皮肤伤口识别为与第一时间点相比在第二时间点表现出恶化的愈合，识别个体用选自以下的一种或多种疗法来治疗：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物。
[0459] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及治疗个体的未愈合皮肤伤口的方法，包含向个体施用选自以下的一种或多种疗法：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物，其中通过执行本发明的方法，识别个体具有至少一个未愈合的皮肤伤口。
[0460] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及治疗表现出愈合恶化的个体中的皮肤伤口的方法，包含向个体施用选自以下的一种或多种疗法：压迫、伤口敷料、外科清创术、生物清创术、感染控制、抗生素疗法、负压疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药、植物提取物，其中通过执行本发明的方法，识别个体具有至少一个表现出伤口愈合恶化的皮肤伤口。
[0461] 对于涉及施用至少一种活性剂的疗法，诸如抗生素疗法、蛋白质、特别是生长因子、抗体、肽、糖、细胞或细胞成分、人造皮肤、人类血液衍生产品、基因疗法或基因工程伤口床修饰、药物、草药和植物提取物，向个体施用治疗有效量。优选地，此类至少一种活性剂包含在药物组合物中，该药物组合物可进一步包含至少一种药学上可接受的支持物或赋形剂。治疗有效量取决于药剂的性质，并且是本领域技术人员已知的。此外，可以一次或重复施用至少一种活性剂。
[0462] 在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，通过物理或化学方法获得伤口渗出物样本，特别是通过向皮肤伤口施加负压(特别是通过使用负压引流装置)、使用毛细管力的方法、将伤口渗出物收集在膜敷料或膜中、将伤口渗出物收集在注射器中、施用吸收性材料(诸如吸收性珠子)或过滤器、或通过使用拭子(诸如棉签)，特别是其中膜敷料或膜是纤维素层和/或其中吸收性材料是纤维素层。在实施例中，对皮肤伤口施加负压以获得伤口渗出物样本。
[0463] 在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，愈合的皮肤伤口表征为持续的伤口闭合、肉芽、没有坏死和/或没有感染。
[0464] 在本文所述的本发明任何方法的另一个优选实施方案中，未愈合的皮肤伤口表征为缺乏伤口闭合、伤口面积和/或深度增加、皮肤伤口坏死和/或感染、和/或没有肉芽。
[0465] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，该方法中使用的成纤维细胞和/或单核细胞是人类细胞，优选从健康人类个体、从患有与受损伤口愈合相关的共患病(诸如糖尿病)的患者、和/或从提供伤口渗出物的个体患者获得的人类细胞和/或原代细胞。
[0466] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，将伤口渗出物样本在1：2至1：1000之间稀释，优选在1：10至1：200、或1：20至1：100之间。例如，成功使用1：25或1：50的稀释液，诸如培养基中的稀释液。伤口渗出物样本优选在水性液体(诸如水性溶液或悬浮液)中稀释。在优选的实施方案中，将伤口渗出物样本稀释在细胞培养基(诸如含有FCS的DMEM)中。此外，可以使用盐水溶液，诸如水性缓冲盐水溶液。优选地，伤口渗出物样本在水性液体中稀释，其基本上不干扰本发明方法的测定中使用的细胞的活力。
[0467] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，将伤口生物膜样本在1：2至1：1000之间稀释，优选在1：10至1：200、或1：20至1：100之间。伤口生物膜样本优选在水性液体(诸如水性溶液或悬浮液)中稀释。在优选的实施方案中，将伤口生物膜样本稀释在细胞培养基(诸如含有FCS的DMEM)中。此外，可以使用盐水溶液，诸如水性缓冲盐水溶液。优选地，伤口生物膜样本在水性液体中稀释，其基本上不干扰本发明方法的测定中使用的细胞的活力。
[0468] 在本发明方法的一个优选实施方案中，在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，包括以下步骤：
[0469] (i)培养原代人真皮成纤维细胞，
[0470] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0471] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，
[0472] (iv)诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，测定原代成纤维细胞的量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成，
[0473] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0474] 在本发明方法的一个优选实施方案中，在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，包括以下步骤：
[0475] (i)在支持物上接种原代人真皮成纤维细胞，所述支持物优选预涂有粘附增强剂，诸如明胶，
[0476] (ii)在支持物上培养细胞，优选直至达到融合，
[0477] (iii)使细胞与(i)基质促进补充物和(ii)伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0478] (iv)诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，测定成纤维细胞衍生基质的量，
[0479] 优选地，其中该方法在3D细胞培养中进行。
[0480] 在本发明方法的一个优选实施方案中，在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖，包括以下步骤：
[0481] (i)培养角质形成细胞，
[0482] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0483] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，
[0484] (iv)诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，测定角质形成细胞的量，优选细胞数，
[0485] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0486] 在本发明方法的一个优选实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，包括以下步骤：
[0487] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0488] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0489] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0490] (iv)测定细胞培养上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，[0491] 优选地，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，和/或一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，更优选其中通过使用免疫学测定法，甚至更优选通过使用ELISA测定法，来测定标志物。
[0492] 在本发明方法的一个优选实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，包括以下步骤：
[0493] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0494] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0495] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0496] (iv)测定巨噬细胞的细胞表面上的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量和/或频率分布，
[0497] 优选地，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，和/或一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，更优选其中通过免疫学测定法和/或荧光测定法，特别是通过FACS分析，来测定细胞表面标志物的量和/或频率分布，[0498] 甚至更优选地，其中步骤iv)包括：
[0499] 使巨噬细胞与结合剂接触，该结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标记物标记，并且测定与巨噬细胞结合的结合分子的量，特别是通过测定平均荧光强度，从而测定细胞表面标志物的量，
[0500] 和/或
[0501] 使巨噬细胞与结合剂接触，该结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标记物标记，并且测定细胞群内分别对一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物呈阳性的细胞百分比，特别地其中进行FACS分析，从而测定细胞表面标志物的频率分布。
[0502] 在本发明方法的一个优选实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，包括以下步骤：
[0503] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0504] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0505] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0506] (iv)测定巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，
[0507] 优选地，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，和/或一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18。更优选地，其中该方法包含使特异性结合标志物mRNA的探针(其中任选地标记探针)与巨噬细胞RNA在有利于杂交的条件下接触，并检测杂交的探针。
[0508] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0509] 在一个优选的实施方案中，测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，包括以下步骤：
[0510] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0511] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0512] (iii)使细胞与伤口渗出物样本或伤口生物膜样本接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，
[0513] (iv)测定细胞培养上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量。
[0514] 在一个优选的实施方案中，通过使用免疫学测定法，更优选通过使用ELISA测定法，来测定细胞因子标志物。
[0515] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0516] 此外，优选在本发明的方法中进行的两种或更多种测定同时进行，甚至更优选其中方法步骤在单个支持物上进行。在此类实施例中，提供了一种芯片上卷绕(wound-on-a-chip)测试方法。从而满足了临床医生的需求。
[0517] 在本文所述的本发明方法的优选实施方案中，同时执行以下方法步骤：
[0518] i)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
[0519] ii)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0520] 以及任选地
[0521] iiia)在存在伤口渗出物样本或从皮肤伤口获得的伤口生物膜样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖，和/或
[0522] iiib)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，和/或
[0523] iiic)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，和/或
[0524] iiid)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0525] 优选其中该方法步骤在单个支持物上进行，更优选其中该支持物是芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)、或培养皿。
[0526] 在本文所述的本发明方法的另一个优选实施方案中，同时执行以下方法步骤：
[0527] i)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
[0528] ii)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0529] 以及可选地
[0530] iiia)在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖，和/或
[0531] iiib)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，和/或
[0532] iiic)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，和/或
[0533] iiid)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-
23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0534] 和/或
[0535] iiie)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本一起孵育的巨噬细胞上清液中一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中一种或更多细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0536] 优选地，其中方法步骤在单个支持物上进行，更优选其中支持物是芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)、或培养皿。
[0537] “同时”应理解为意指与测定有关的方法步骤在时间上至少部分重叠。
[0538] 优选地，本发明的任何方法的方法步骤在单个支持物上进行，更优选其中支持物是芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)、或培养皿。固体支持物优选含有至少一个、优选多个限定的区域或空腔，更优选至少一个、甚至更优选多个空腔，该空腔的空间能够被填充并因此允许3D细胞培养。例如，可以使用包含多个限定空腔的多孔板或微阵列或纳米阵列。在实施例中，成功使用了多孔板。优选地，固体支持物基本上不干扰细胞的活力和/或它适合于培养细胞，例如支持物可以是塑料支持物。对于3D细胞培养，固体支持物优选含有至少一个空腔，诸如孔，更优选多个限定的空腔。例如，可以使用多孔板。此类多孔板包含多个限定的空腔。
[0539] 在另一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含用于进行上述方法步骤i)至iiid)的试剂，
[0540] 优选地其中该试剂盒包含：
[0541] a)原代成纤维细胞，
[0542] b)角质形成细胞，
[0543] c)具有多个限定的区域或空腔的支持物，其中区域或空腔的子集(i)涂有粘附增强剂(优选明胶)，和/或(ii)填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，
[0544] d)任选地基质促进补充物，和
[0545] e)单核细胞，和
[0546] f)任选地，特异性识别一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，和/或特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，和/或特异性识别一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的探针。
[0547] 上文针对本发明的方法描述了优选的M1和M2标志物、细胞表面标志物和/或标志物mRNA。
[0548] 在另一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含用于进行上述方法步骤i)至iiid)或i)至iiie)的试剂，其中该试剂盒包含：
[0549] a)原代成纤维细胞，
[0550] b)角质形成细胞，
[0551] c)具有多个限定的区域或空腔的支持物，其中区域或空腔的子集(i)涂有粘附增强剂(优选明胶)，和/或(ii)填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，
[0552] d)任选地基质促进补充物，和
[0553] e)任选地单核细胞，和
[0554] f)特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，以及任选地：
[0555] 特异性识别一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，和/或特异性识别一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的探针，
[0556] 其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，并且其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，并且其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，以及
[0557] g)任选地特异性识别选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种一种或多种细胞因子标志物的结合剂，优选抗体。
[0558] 在一个优选的实施方案中，角质形成细胞选自HaCaT细胞和原代角质形成细胞，特别是人原代角质形成细胞。
[0559] 在更优选的实施方案中，用于本发明的角质形成细胞是HaCaT细胞。
[0560] 可通过以下方法获得成纤维细胞衍生基质(FDM)：(i)在支持物上接种原代人真皮成纤维细胞，该支持物预先涂有粘附增强剂，诸如明胶，(ii)在支持物上培养细胞，优选直至达到融合并且(iii)使细胞与基质促进补充物接触，该基质促进补充物诸如维生素C或其生理学上可接受的盐、或2-磷酸-L-抗坏血酸或其生理学上可接受的盐、以及EGF和胰岛素的组合。FDM可原位形成或可在形成后转移至支持物。
[0561] 此外，优选支持物(诸如芯片)能够实施本发明的方法。例如，可以提供一种芯片上卷绕，其能够诊断、监测和预测皮肤伤口愈合的方面，诸如识别未愈合的皮肤伤口并预测皮肤伤口的恶化愈合。
[0562] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及适用于实施本发明方法的支持物，其中该支持物包含多个限定的区域或空腔，并且其中：
[0563] a)区域或空腔的子集涂有粘附增强剂，
[0564] b)区域或空腔的子集体涂有粘附增强剂和/或填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，[0565] c)区域或空腔的子集未经处理，
[0566] d)任选地：
[0567] d1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物的结合剂，优选抗体，和
[0568] d2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，
[0569] e)任选地：
[0570] e1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，和
[0571] e2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，
[0572] 和
[0573] f)任选地：
[0574] f1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物mRNA的探针，和
[0576] 优选地
[0577] (x)根据a)的至少一些区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
[0578] (xi)根据(x)或b)的至少一些区域或空腔进一步含有单核细胞，和/或
[0579] (xii)根据c)的至少一些区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
[0580] (xiii)根据c)的至少一些区域或空腔室进一步含有角质形成细胞，
[0581] 其中根据(xii)和(xiii)的区域或空腔不重叠，
[0582] 更优选地，其中支持物是芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)，和/或支持物是塑料支持物。
[0583] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及适用于实施本发明方法的支持物，其中该支持物包含多个限定的区域或空腔，并且其中：
[0584] a)区域或空腔的子集涂有增粘剂，
[0585] b)区域或空腔的子集涂有粘附增强剂和/或填充有成纤维细胞衍生基质(FDM)，
[0586] c)区域或空腔的子集未经处理，
[0587] d)任选地：
[0588] d1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物的结合剂，优选抗体，和
[0589] d2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种一种或多种M2标志物的结合剂，优选抗体，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0590] e)
[0591] e1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，和
[0592] e2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M2细胞表面标志物的结合剂，优选抗体，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，并且其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
[0593] f)任选地：
[0594] f1)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M1标志物mRNA的探针，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，和
[0595] f2)区域或空腔的子集含有特异性识别一种或多种M2标志物mRNA的探针，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，和一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0596] 和
[0597] g)任选地，区域或空腔的子集含有特异性识别选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的结合剂，优选抗体，
[0598] 其中子集a)到f)不重叠，
[0599] 优选
[0600] (x)根据a)的至少一些区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
[0601] (xi)根据(x)或b)的至少一些区域或空腔进一步含有单核细胞，和/或
[0602] (xii)根据c)的至少一些区域或空腔进一步含有原代成纤维细胞，和/或
[0603] (xiii)根据c)至少一些区域或空腔进一步含有角质形成细胞，
[0604] 其中根据(xii)和(xiii)的区域或空腔不重叠，
[0605] 更优选地，其中支持物是芯片、阵列(诸如微阵列或纳米阵列)、板(诸如多孔板)，和/或支持物是塑料支持物。
[0606] 固体支持物优选含有多个限定的空腔。空腔允许空间被填充，因此允许3D细胞培养。例如，可以使用包含多个限定空腔的多孔板或微阵列或纳米阵列。在实施例中，成功使用了多孔板。优选地，固体支持物基本上不干扰细胞的活力和/或它适合于培养细胞，例如支持物可以是塑料支持物。对于3D细胞培养，固体支持物可含有多个限定的孔。例如，可以使用多孔板。在一个优选的实施方案中，支持物包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个限定的区域或空腔，诸如2、3、4、5、6、7、8、9或10至105个、2、3、4、5、6、7、8、9或10至104个、2、3、4、5、6、7、8、9或10至103个，或2、3、4、5、6、7、8、9或10至102个限定的区域或空腔。
[0607] 传统的药物发现是一个漫长的过程。尽管基因组学和蛋白质组学技术的最新进展带来了许多新的潜在药物靶标的识别，但基于临床前假设的研究仍然具有较高的流失率。事实上，10种药物中有8种在临床试验中失败[DiMasi J(2010),Clin Pharmacol Ther 87:
272-277]，以及美国食品药品管理局(FDA)等监管机构在临床开发阶段I批准药物的可能性低至10％[Hay M等人(2014)Nat Biotechnol 32:40-51]。失败的原因大多是缺乏疗效
(56％)，安全问题(28％)排在第二位。[Arrowsmith J和Miller P(2013)Nat Rev Drug
Discov 12:569]。
272-277]，以及美国食品药品管理局(FDA)等监管机构在临床开发阶段I批准药物的可能性低至10％[Hay M等人(2014)Nat Biotechnol 32:40-51]。失败的原因大多是缺乏疗效
(56％)，安全问题(28％)排在第二位。[Arrowsmith J和Miller P(2013)Nat Rev Drug
Discov 12:569]。
[0608] 缺乏疗效表明，途径假设驱动的药物发现限制了临床的可转化性，从而导致了显著的失败率。对于其中潜在的病理机制知之甚少的疾病尤其如此，因为慢性伤口就是这种情况[Eming SA等人(2014),Sci Transl Med 6:1-16)]。
[0609] 我们的目标是通过使用患者材料作为系统生物学驱动的、专注于药物发现的起点来提高可转化性和临床成功率。在我们的方法中，我们使用患病的患者组织或体液，其中含有新开发的体外离体测试系统中的关键病理机制驱动因素，并寻找会干扰病理生理学的化合物。
[0610] 来自健康供体的人类材料目前主要用于药物安全性和毒性测试，该测试使用包括皮肤在内的各种器官[Coleman RA(2011)国际学术资源网(Int Scholarly Res Network)文章号806789；Clotworthy M和Archibald K(2013)Expert Opin Drug Metab Toxicol 9:
1155-1169；Atac B(2013)Lab Chip 13:3555-3561]。使用人体组织的转化药物发现尚处于起步阶段[Clotworthy M(2012)Expert Opin Drug Discov 7:543-547]，仅在肿瘤学中，患病组织被大量使用[Nieva JJ(2012)Future Oncol 8:989-998]。利用在化合物筛选开始时含有相关致病因子的人体材料，我们相信我们可以提高可转化性、临床成功率，并大大缩短临床前开发时间。
1155-1169；Atac B(2013)Lab Chip 13:3555-3561]。使用人体组织的转化药物发现尚处于起步阶段[Clotworthy M(2012)Expert Opin Drug Discov 7:543-547]，仅在肿瘤学中，患病组织被大量使用[Nieva JJ(2012)Future Oncol 8:989-998]。利用在化合物筛选开始时含有相关致病因子的人体材料，我们相信我们可以提高可转化性、临床成功率，并大大缩短临床前开发时间。
[0611] 来自慢性伤口的伤口渗出物在体外是促炎性的并且在体内测定中延迟伤口愈合。因此，我们得出结论，导致延迟愈合的关键因子包含在这些渗出物以及伤口生物膜中。
[0612] 巨噬细胞、角质形成细胞和成纤维细胞被认为是持续伤口炎症和导致伤口慢性的关键细胞。使用来自慢性伤口的WE作为刺激物，我们在这些适合化合物筛选的细胞类型中建立了新的测试系统。它们构成了我们研究的基础，旨在识别WE诱导的细胞活化抑制剂，用于治疗未愈合的慢性溃疡(图2)。
[0613] 令人惊讶的是，我们可以建立一种可靠、稳健和有效的方法来筛选适合调节皮肤伤口愈合的化合物。方法步骤概述于实施例4.3中，并且该方法利用上述测定步骤用于本发明的其他方法。特别地，在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)至少一种候选化合物的情况下测量原代成纤维细胞的增殖作为主要测定。如果发现候选化合物在测定中具有活性，则进行本文所述的至少一种进一步的测定。
如果在测定中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％
或低至少10％、或高于临界值，则发现候选化合物在原代成纤维细胞测定的增殖中具有活性。
如果在测定中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％
或低至少10％、或高于临界值，则发现候选化合物在原代成纤维细胞测定的增殖中具有活性。
[0614] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法，包含以下步骤：
[0615] A)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)至少一种候选化合物的情况下测量原代成纤维细胞的增殖，和
[0616] B)如果在A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，则执行以下方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个：
[0617] B1)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下测量原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生
基质，
基质，
[0618] B2)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下测量角质形成细胞的增殖，
[0619] B3)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标
志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0620] B4)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面
标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0621] B5)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA
和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0622] 其中如果在B1)至B5)中获得的至少一个值比在没有候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合，优选地，其中根据A)和B1)至B5)的方法步骤如上文对本发明方法所述进行。
[0623] 因此，在又一个实施方案中，本发明涉及筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法，包含以下步骤：
[0624] A)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)至少一种候选化合物的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
[0625] B)如果在A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，执行以下方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个以及以下方法步骤B1)至B6)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个：
[0626] B1)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，
[0627] B2)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量角质形成细胞的增殖，
[0628] B3)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标
志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，
[0629] B4)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面
标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，其中一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体、CD206和CD209，
[0630] B5)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA
和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，并且一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，
[0631] B6)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞
因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0632] 其中，如果在B1)至B5)、或B1)至B6)中获得的至少一个值比在没有候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，所述化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合，
[0633] 优选地，其中根据A)和B1)至B5)、或A)和B1)至B6)的方法步骤如上文对本发明方法所述进行。
[0634] 在优选的实施方案中，步骤B)涉及：如果在A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，执行上述方法步骤B1)至B4)和B6)中的一个、两个、三个、四个或五个。在此类优选实施方案中，如果在B1)至B4)和B6)中获得的至少一个值比在没有候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，则该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合，
[0635] 优选地，其中如上文对本发明方法所述执行根据A)和B1)至B4)和B6)的方法步骤。
[0636] 在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0637] 该方法可以重复一次或多次。
[0638] 在一个优选实施方案中，步骤B)包括：如果在A)中获得的值高于或低于临界值，执行所述方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个、或所述方法步骤B1)至B6中的一个、两个、三个、四个、五个或六个、或上述方法步骤B1)至B4)和B6)中的一个、两个、三个、四个或五个。例如，临界值可以是在没有候选化合物的情况下建立的对照值+X*标准偏差，其中X为0.5或更多，诸如1、1.5、2、2.5、3、4或更多，诸如至多5、6、7、8、9或10。在实施例中，X是3。可替代地，临界值可以是在没有候选化合物的情况下建立的对照值-X*标准偏差，其中X为0.5或更多，诸如1、1.5、2、2.5、3、4或更多，诸如至多5、6、7、8、9或10。
[0639] 在进一步优选的实施方案中，如果在B1)至B5)、或B1)至B6)、或B1)至B4)和B6)中获得的至少一个值比相应的临界值高至少10％或低至少10％，则该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合。
[0640] 在一个优选的实施方案中，将伤口渗出物样本稀释，特别是如上所述。在另一个优选的实施方案中，将伤口生物膜样本稀释，特别是如上所述。
[0641] 因此，本发明进一步方法的优选实施方案，特别是关于本发明测定的优选实施方案，也适用于上述筛选方法。
[0642] 在一个优选实施方案中，如果在上述A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少15％、20％、25％、30％、40％或50％，执行方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个、或所述方法步骤B1)至B6中的一个、两个、三个、四个、五个或六个、或上述方法步骤B1)至B4)和B6)中的一个、两个、三个、四个或五个。
[0643] 在一个更优选的实施方案中，如果在B1)和B2)中获得的至少一个值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％，则该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合。
[0644] 在更优选的实施方案中，调节伤口愈合是改善伤口愈合。
[0645] 在另一个优选的实施方案中，如果在上述A)中获得的值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值低至少15％、20％、25％、30％、40％或50％，执行方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个、或所述方法步骤B1)至B6)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个、或上述方法步骤B1)至B4)和B6)中的一个、两个、三个、四个或五个。
[0646] 在一个更优选的实施方案中，如果在B1)和B2)中获得的至少一个值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值低至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％，则该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合。
[0647] 在另一个实施方案中，调节伤口愈合是使伤口愈合恶化。被识别为适于使皮肤伤口愈合恶化的化合物适用于治疗和/或预防肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩或纤维化。
[0648] (i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物可以同时或依次添加用于孵育。在同时添加的情况下，(i)和(ii)可以作为单独的组合物添加，或作为单一的组合物添加。例如，可以将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本加入到测定中，例如通过将液体移液到支持物的孔中，并分开添加候选化合物，例如在任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本之前、同时或之后，通过将含有这种化合物的液体移液到支持物的孔中。可替代地，可将任选地被稀释的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本与至少一种候选化合物或包含至少一种候选化合物
的组合物混合，随后添加到测定中。
的组合物混合，随后添加到测定中。
[0649] 方法步骤包括接触从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本。例如，可以使用从一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本，或者从两个或更多个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的混合物，诸如2、3、4、5、
6、7、8、9、10或更多个个体。伤口渗出物样本或伤口生物膜样本可以是来自愈合伤口或未愈合伤口(诸如溃疡)的样本、或其混合物。在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
6、7、8、9、10或更多个个体。伤口渗出物样本或伤口生物膜样本可以是来自愈合伤口或未愈合伤口(诸如溃疡)的样本、或其混合物。在本发明的一个优选实施方案中，样本是伤口渗出物样本。在另一个优选的实施方案中，样本是伤口生物膜样本。在更优选的实施方案中，样本是伤口渗出物样本。
[0650] 在一个优选的实施方案中，在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)至少一种候选化合物的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，包括以下步骤：
[0651] (i)培养原代人真皮成纤维细胞，
[0652] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0653] (iii)使细胞与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中该接触可在细胞粘附发生之前或之后进行，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0654] (iv)诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，测定原代成纤维细胞的数量，优选细胞数，包括细胞外基质的形成，
[0655] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0656] 在一个优选的实施方案中，在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一个候选化合物的情况下，测量由原代成纤维细胞形成成纤维细胞衍生基质，包括以下步骤：
[0657] (i)在支持物上接种原代人真皮成纤维细胞，所述支持物优选预涂有粘附增强剂，诸如明胶，
[0658] (ii)在支持物上培养细胞，优选直至达到融合，
[0659] (iii)使细胞与(i)基质促进补充物、(ii)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(iii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，并且其中(i)、(ii)和(iii)可以同时或依次接触，
[0660] (iv)测定成纤维细胞衍生基质的量，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，
[0661] 优选地，其中所述方法在3D细胞培养中进行。
[0662] 在另一个优选的实施方案中，在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量角质形成细胞的增殖，包括以下步骤：
[0663] (i)培养角质形成细胞，
[0664] (ii)在固体支持物上孵育细胞，从而使细胞粘附在支持物上，
[0665] (iii)使细胞与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中可以在细胞粘附发生之前或之后进行接触，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0666] (iv)测定角质形成细胞的量，优选细胞数，诸如通过固定细胞和测定总蛋白质含量，
[0667] 优选地，其中该方法在2D细胞培养中进行。
[0668] 在另一个优选的实施方案中，测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上
清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
[0669] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0670] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0671] (iii)使细胞与i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0672] (iv)测定细胞培养上清液中一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，
[0673] 优选地，其中所述一种或多种M1标志物选自CXCL10和IL-23p19，和/或所述一种或多种M2标志物选自CCL22和CCL18，更优选其中通过使用免疫学测定法，甚至更优选通过使用ELISA测定法来测定标志物。
[0674] 在另一个优选的实施方案中，测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上
的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
[0675] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0676] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0677] (iii)使细胞与i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0678] (iv)测定巨噬细胞的细胞表面上的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量和/或频率分布，
[0679] 优选地，其中一种或多种M1细胞表面标志物选自CD38、CD64和CD197，和/或一种或多种M2细胞表面标志物选自CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，更优选其中通过免疫学测定法和/或荧光测定法，特别是通过FACS分析，来测定细胞表面标志物的量和/或频率分布，甚至更优选地，其中步骤iv)包括：
[0680] 使巨噬细胞与结合剂接触，该结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标记物标记，并测定与巨噬细胞结合的结合分子的量，特别是通过测定平均荧光强度，从而测定细胞表面标志物的量，
[0681] 和/或
[0682] 使巨噬细胞与结合剂接触，该结合剂优选抗体，其特异性识别一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物，其中结合剂任选地被标记，特别是用荧光标记物标记，并测定细胞群内分别对一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物呈阳性的细胞百分比，特别是其中进行FACS分析，从而测定细胞表面标志物的频率分布。
[0683] 在另一个优选的实施方案中，测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞中
的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
[0684] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0685] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0686] (iii)使细胞与i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0687] (iv)测定巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，
[0688] 优选地，其中一种或多种M1标志物mRNA选自CD38、CD64、CD197、CXCL10和IL-23p19，和/或一种或多种M2标志物mRNA选自CD200受体(CD200R)、CD206、CD209、CCL22和CCL18，更优选地，其中该方法包含使特异性结合标志物mRNA的探针(其中该探针任选地被标记)在有利于杂交的条件下与巨噬细胞RNA接触，并检测杂交的探针。
[0689] 在另一个优选的实施方案中，测量一种或多种细胞因子标志物的量，该细胞因子标志物选自与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的IL1α、IL1β和TNFα，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，包括以下步骤：
[0690] (i)将原代人单核细胞与(a)2D细胞培养中的人真皮成纤维细胞或(b)成纤维细胞衍生基质共培养，
[0691] (ii)孵育细胞直至达到巨噬细胞分化，任选地其中CD163用作巨噬细胞分化的细胞表面标志物，
[0692] (iii)使细胞与i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本或伤口生物膜样本以及(ii)至少一种候选化合物接触，该伤口渗出物样本或伤口生物膜样本任选地被稀释，其中(i)和(ii)可以同时或依次接触，
[0693] (iv)测定细胞培养上清液中一种或多种细胞因子IL1α、IL1β和TNFα的量，
[0694] 优选地，其中通过使用免疫学测定法，更优选通过使用ELISA测定法，来测定细胞因子标志物。
[0695] 在筛选方法中可以使用多种化合物。例如，可以使用小分子、激素、糖、蛋白质、肽、聚合物、生物材料(诸如蛋白质、肽、抗体或其衍生物、或其缀合物)、核酸(诸如病毒剂)、任选包含治疗活性剂的伤口敷料、或一种或多种细胞(诸如一种或多种遗传修饰的细胞)。此外，可以并行测试多种化合物。在待并行测试的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种候选化合物的情况下，此类化合物可以单独添加或作为包含两种或更多种候选化合物的至少一种组合物添加。从而，可以测试大量候选化合物。例如，可以添加2种或更多种组合物，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种组合物，每种组合物包含至少一种、诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种候选化合物。化合物或包含化合物的组合物可以作为液体提供，诸如溶液，特别是水性溶液或介质或悬浮液，诸如水性溶液或介质中的悬浮液。不含候选化合物的液体，特别是溶液或悬浮液，优选基本上不干扰测定中使用的细胞的存活力。
[0696] 因此，在本发明方法的一个优选实施方案中，所述至少一种化合物选自小分子、激素、糖、蛋白质、肽、聚合物、生物材料(诸如蛋白质、肽、抗体或其衍生物、或其缀合物)、核酸(诸如病毒剂)、或一种或多种细胞(诸如一种或多种遗传修饰的细胞)。在本发明方法的另一个优选实施方案中，该至少一种化合物选自免疫调节剂，更优选免疫抑制剂、抗生素、抗感染剂、生长因子、细胞因子、抗增殖剂和刺激增殖的药剂。例如，可以测试已知的批准的活性剂，诸如在伤口愈合领域中批准的活性剂或用于其他适应症(诸如炎症和/或增殖性疾病)的活性剂。此外，可以测试新化合物和/或化合物库。例如，可以测试组合文库或其他小分子化合物文库或抗体文库。
[0697] 在本发明方法的另一个优选实施方案中，该至少一种化合物是单一化合物，或2、3、4、5或更多种不同的化合物，其中该2、3、4、5或更多种不同的化合物可以是存在于单一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。
[0698] 在本发明方法的另一个优选实施方案中，值至少重复三次测量和/或在B)中建立统计学显著性，更优选地，其中p≤0.05、p≤0.001或p≤0.001，和/或如果在B1)至B5)、或B1)至B6)、或B1)至B4)和B6)中获得的至少一个值至少比在不存在候选化合物的情况下建立的对照值高10％(诸如高至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％)，或低至少10％(诸如低至少10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％)，该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合，该对照值具有统计学显著性，更优选地，其中p≤0.05、p≤0.001或p≤0.001。
[0699] 可以在用于伤口愈合情况下的功效和安全性的体外、离体和/或体内模型中测试被识别为适于调节(特别是改善皮肤伤口愈合)的化合物。
[0700] 可以在用于肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩和纤维化情况下的功效和安全性的体外、离体和/或体内模型中测试被识别为适于调节(特别是使皮肤伤口愈合恶化)的化合物。
[0701] 瘢痕疙瘩是一种皮肤瘢痕，根据其成熟程度，主要由III型或I型胶原组成。这是在愈合的皮肤损伤部位肉芽组织过度生长的结果，该肉芽组织然后由I型胶原蛋白缓慢地代替。瘢痕疙瘩是良性的。
[0703] 图1：皮肤伤口的细胞募集：正常的愈合过程。
[0704] 图2：体外测定的示意图。收集来自慢性溃疡的伤口渗出物，稀释到细胞培养基中并用于刺激微量滴定板中的细胞。通过体外分化单核细胞产生巨噬细胞，该单核细胞分离自人血液。在用慢性WE刺激后，它们产生促炎细胞因子。原代人成纤维细胞在单层培养物中生长或在成纤维细胞衍生基质(“人造皮肤”)中生长——在存在或不存在WE的情况下。慢性WE可以抑制细胞和/或基质的生长。在不存在或存在WE的情况下，巨噬细胞在成纤维细胞或成纤维细胞衍生基质存在下生长。慢性WE导致向M1巨噬细胞表型的转变。在不存在或存在WE的情况下，角质形成细胞在单层培养物中生长。慢性WE可抑制细胞生长。WE筛选了化合物，这些化合物抵消了WE的促炎和生长抑制作用，或者产生向M2巨噬细胞谱的转变。
[0705] 图3：不同WE对成纤维细胞衍生基质(FDM)形成的影响。在不存在(对照)或存在不同WE的情况下，FDM在96孔板中生长。测量总细胞蛋白质以反映生长和细胞外基质产生。
[0706] 图4：在四种WE存在下原代人成纤维细胞的生长特征。将WE在培养基中以1：25、1：50或1：100稀释，并将增殖与未处理的对照(＝100％)进行比较。值是8个样本的平均值±SD。
[0707] 图5：一个示例性384孔板中的原代筛选的增殖结果。线代表单个化合物。WE#27(48,8％水平线“WE#27增殖”)抑制增殖的临界线以下的线是抗增殖化合物。上水平线以上的值被认为是阳性命中。
[0708] 图6：筛选分泌物的生化和细胞(巨噬细胞)表征。A)髓过氧化物酶(MPO)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和金属蛋白酶(MMP)的酶活性；B)WE中的炎性细胞因子IL-1α、IL-1β和TNF-α的水平，以及C)已用WE刺激24小时的巨噬细胞上清液中的诱导的IL-1α、IL-1β和TNF-α的水平。
[0709] 图7：患者伤口渗出物材料。
[0710] 图8：渗出物的生化特征。髓过氧化物酶(MPO)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶和金属蛋白酶(MMP)的酶活性。
[0711] 图9：酶活性：来自未愈合伤口的WE。大约一半的未愈合伤口显示出嗜中性粒细胞汇集(MPO、弹性蛋白酶)的迹象，可能是由于感染。金属蛋白酶活性通常较低，但有一些例外。MPO(前线列)：最高值：2.2×106mU/ml。弹性蛋白酶(中线列)：最高值：5×104nM。MMP(后线列)：最高值：1.8×106nM。
[0712] 图10：酶活性：来自愈合伤口的WE。MPO前线列。弹性蛋白酶中线列。MMP后线列。所有酶水平通常低于未愈合的伤口。
[0713] 图11：来自愈合与未愈合伤口的WE中的细胞因子。
[0714] 图12：来自未愈合伤口的WE中的细胞因子。超过一半的未愈合WE含有相当水平的IL-1β。IL-1α在相同的WE中与IL-1β一样是可测量的，但水平要低得多。TNF-α存在于一半以上的未愈合WE中。
[0715] 图13：来自愈合伤口的WE中的细胞因子。在一些愈合WE中，细胞因子水平与未愈合WE中的相同。
[0716] 图14：巨噬细胞上清液中的细胞因子。
[0717] 图15：巨噬细胞上清液中的细胞因子。巨噬细胞IL-1α前线列。巨噬细胞IL-1β中线列。TNF-α后线列。来自未愈合伤口的WE中仅约50％诱导巨噬细胞分泌细胞因子。来自未愈合伤口的WE诱导的主要细胞因子是TNF-α。
[0718] 图16：巨噬细胞上清液中的细胞因子。巨噬细胞IL-1线柱前线列。巨噬细胞IL-1β中线列。TNF-α后线列。来自愈合伤口的WE诱导更少的细胞因子。WE和巨噬细胞上清液中的细胞因子水平之间没有相关性。
[0719] 图17：来自未愈合伤口的WE存在下的增殖和成纤维细胞衍生基质形成。HaCaT增殖前线列。成纤维细胞增殖中线列。成纤维细胞衍生基质形成后线列。大约一半的未愈合WE抑制原代人成纤维细胞和HaCaT角质形成细胞的72小时增殖，以及成纤维细胞衍生基质形成。所有WE均在1：25稀释度下进行测试。
[0720] 图18：在来自愈合伤口的WE存在下的增殖和成纤维细胞衍生基质形成。HaCaT扩散前线列。成纤维细胞增殖中线列。成纤维细胞衍生基质形成后线列。对于大多数愈合WE，FDM形成测定中的结果与HDF和HaCaT增殖测定平行。所有WE均在1：25稀释度下进行测试。
[0721] 图19：成纤维细胞和原代内皮细胞(EC)增殖：来自未愈合伤口的WE。原代EC增殖前线列，n＝18。成纤维细胞增殖后线列，n＝18。在1：25稀释度下测试WE。14/18WE对原代内皮细胞增殖的活性与它们对成纤维细胞的活性相关。
[0722] 图20：成纤维细胞和原代内皮细胞(EC)增殖：来自愈合伤口的WE。原代EC增殖前线列，n＝15。成纤维细胞增殖后线列，n＝15。在1：25稀释度下测试WE。对成纤维细胞显示出一些生长抑制作用的3WE对原代内皮细胞增殖具有强烈抑制作用。
[0723] 图21：2D成纤维细胞测定与伤口愈合的相关性：注册药物PDGF的作用。PDGF的作用反映在2D成纤维细胞增殖测定中。PDGF仅部分逆转侵袭性的未愈合的伤口渗出物(WE#49)的生长抑制作用。WE#13(愈合的)对HDF增殖具有增强作用，类似于PDGF。
[0724] 图22：成纤维细胞(HDF)增殖试验：金属蛋白酶抑制作用(GM6001)。泛MMP抑制剂GM6001对没有MMP活性的培养基或WE没有影响。GM6001部分逆转WE#49的作用，其具有最高的MMP活性(1.8×106nM)。
[0725] 图23：增殖/FDM形成：抑制性和刺激性的WE。上部：成纤维细胞增殖：剂量依赖性抑制(未愈合的WE)。浓度较低时增殖较高。一些WE的增殖接近阳性对照(PDGF)。底部：FDM形成：剂量依赖性抑制(未愈合的WE)。剂量依赖性FDM形成增强(一些愈合的WE)。增强符合TGF-β效应。
[0726] 图24：3D成纤维细胞测定与伤口愈合的相关性。第1个样本(第1天)：未愈合的溃疡。第二个样本(第14天)：开始出现肉芽。第3个样本(第17天)：愈合改善。第4个样本(第21天)：愈合。第一个样本高度抑制FDM形成。对于第三个样本(“改善”)，FDM形成持续增长。增强的FDM形成反映了伤口愈合的情况。
[0727] 图25：患者B：腿部溃疡，右小腿，绿脓杆菌(P.aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)阳性。对样本#2的评估(2015年6月1日)：无愈合倾向。对样本#3(2015年6月8日)的评估：改善，但从这个时间点开始再次恶化。生化参数：MPO和弹性蛋白酶数据与嗜中性粒细胞汇集减少一致(由于感染)。MMP活性相对较低(总体最高值的3％)
[0728] 图26：患者B：细胞因子作为标志物。渗出物中的细胞因子水平与炎症减少一致，然而：增加巨噬细胞中IL-1的诱导。
[0729] 图27：患者B：成纤维细胞和角质形成细胞增殖、FDM形成。两种渗出物对所有成纤维细胞和角质形成细胞都具有剧毒性，即使WE 3的伤口被描述为愈合。然而，一周后伤口恶化。该实验显示了本发明方法的预测价值。
[0730] 图28患者C：腿部溃疡，右小腿，愈合倾向。样本#5(2015年8月28日)。对样本#6的评估(2015年9月2日)：愈合趋势。对样本#10的评估(2015年9月18日)：愈合趋势。生化参数。所有酶活性水平低(总体最高值的5％)。
[0731] 图29：患者C：细胞因子。伤口渗出物中的水平对比巨噬细胞上清液中的水平。渗出物中细胞因子水平低(总体最高值的3％)。巨噬细胞中IL-1诱导非常低，没有TNF-α。
[0732] 图30：患者C：成纤维细胞和角质形成细胞增殖、FDM形成。没有渗出物显示出对成纤维细胞或KC的毒性作用。例外：WE#6在1：25稀释度下位于原代KC上。一种渗出物(WE#6)在1：25稀释度下使FDM形成增加2.5倍。体外数据与个体患者的临床表型一致，显示该方法的预测价值。
[0733] 图31：患者A：腿部溃疡，小腿，两侧。生化参数：MPO和弹性蛋白酶数据与嗜中性粒细胞汇集减少一致(2015年3月18日：未愈合–2015年6月23日：愈合)。愈合伤口样本中的MMP活性中等。
[0734] 图32：患者A：伤口渗出物中的细胞因子对比巨噬细胞上清液中的细胞因子。渗出物中的IL-1水平与炎症减少一致，但TNF-α方向相反。巨噬细胞中IL-1诱导低，但伤口愈合中TNF-α水平中等。
[0735] 图33：患者A：成纤维细胞和角质形成细胞增殖、FDM形成。第一渗出液(2015年3月18日–未愈合)对所有成纤维细胞都具有剧毒性。随后的渗出物(2015年6月23日-愈合)仅显示对原代KC的抑制。体外数据与临床表型一致，显示了本发明方法的预测价值。
[0736] 图34：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中巨噬细胞表面标志物的表达：CD38/CD209、CD197/CD209和CD197/CD206的比率。WE来自未愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，对于CD38/CD209、
CD197/CD209和CD197/CD206分别具有0.5、0.6和0.6的比率。
CD197/CD209和CD197/CD206分别具有0.5、0.6和0.6的比率。
[0737] 图35：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中巨噬细胞表面标志物的表达：CD38/CD209、CD197/CD209和CD197/CD206的比率。WE来自愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，对于CD38/CD209、CD197/CD209和CD197/CD206分别具有0.5、0.6和0.6的比率。
[0738] 图36：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中巨噬细胞M2趋化因子分泌：CCL18。WE来自未愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，分泌70pg/ml。
[0739] 图37：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中巨噬细胞M2趋化因子分泌：CCL18。WE来自愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，分泌70pg/ml。
[0740] 图38：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：IL-1α。WE来自未愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何IL-1α。通常，用未愈合WE刺激的共培养物中的IL-1α水平高于愈合WE。
[0741] 图39：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：IL-1α。WE来自愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何IL-1α。通常，用愈合WE刺激的共培养物中的IL-1α水平低于未愈合的WE。
[0742] 图40：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：IL-1β。WE来自未愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何IL-1β。通常，用未愈合WE刺激的共培养物中的IL-1β水平高于愈合WE。
[0743] 图41：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：IL-1β。WE来自愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何IL-1β。通常，用愈合WE刺激的共培养物中的IL-1β水平低于未愈合的WE。
[0744] 图42：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：TNF-α。WE来自未愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何TNF-α。通常，用未愈合WE刺激的共培养物中的TNF-α水平高于愈合WE。
[0745] 图43：成纤维细胞/巨噬细胞共培养物中的促炎细胞因子分泌：TNF-α。WE来自愈合的伤口。N＝18。在1：25稀释度下测试WE。未刺激的细胞，即在不存在WE的情况下共培养的巨噬细胞，不分泌任何TNF-α。通常，用愈合WE刺激的共培养物中的TNF-α水平低于未愈合的WE。
[0746] 图44：在成纤维细胞/巨噬细胞共培养测定中评估巨噬细胞M1/M2细胞表面标志物比率对伤口愈合的相关性。第1个样本(第1天)：未愈合的溃疡。第二个样本(第14天)：开始出现肉芽。第3个样本(第17天)：愈合改善。第4个样本(第21天)：愈合。第一个样本的CD197/CD209和CD197/CD206的比率高于愈合期的样本。
[0747] 图45：成纤维细胞/巨噬细胞共培养测定中细胞因子分泌与伤口愈合的相关性。第1个样本(第1天)：未愈合的溃疡。第二个样本(第14天)：开始出现肉芽。第3个样本(第17天)：愈合改善。第4个样本(第21天)：愈合。第一个样本的IL-1α、IL-1β和TNF-α水平高于其他所有样本。细胞因子分泌减少反映了伤口愈合的情况。
实施例
实施例
[0748] 1.缩写
[0749] 缩写 描述
[0750] DMSO 二甲基亚砜
[0751] EC 内皮细胞
[0752] FCS 胎牛血清
[0753] FDM 成纤维细胞衍生基质
[0754] HaCaT 人角质形成细胞系
[0755] HBSS Hank平衡盐溶液
[0756] HDF 人真皮成纤维细胞
[0757] M-CSF 巨噬细胞集落刺激因子
[0758] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0759] PDGF-BB 血小板衍生生长因子
[0760] RPMI 罗斯威尔(Roswell)公园纪念研究所培养基
[0761] SRB 磺酰罗丹明B
[0762] WE 伤口渗出物
[0763] 2.使用来自患有慢性伤口的患者的伤口渗出物以在实验系统中模拟伤口慢性的测定系统
[0764] 伤口渗出液(伤口液)是含有伤口细胞分子指纹的细胞外液，可以称为“液体活组织检查”。由于去除伤口渗出物(WE)可以改善伤口愈合，我们推断WE中含有的因子严重阻碍伤口愈合，例如，通过激活先天免疫细胞。
[0765] 如下所述，我们可以显示来自慢性伤口的伤口渗出物在体外是促炎性的并且在体内测定中延迟伤口愈合。因此，我们得出结论，这些渗出物中含有导致延迟愈合的关键因子。
[0766] 3.体外测定
[0767] 巨噬细胞、角质形成细胞和成纤维细胞被认为是持续伤口炎症和导致伤口慢性的关键细胞。使用来自慢性伤口的WE作为刺激物，我们在这些细胞类型中建立了新的测试系统，其适用于化合物筛选、监测皮肤伤口的愈合和/或用于将个体的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口。这些分析为我们的研究奠定了基础，旨在识别WE诱导的细胞活化抑制剂，用于治疗未愈合的慢性溃疡(图2)以及监测皮肤伤口愈合的方法和/或将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口。
[0768] 慢性伤口表现出促炎性M1巨噬细胞表型，其产生大量促炎细胞因子，而愈合伤口表现出M2表型[Sindrilaru A等人(2013)Adv Wound Care 2:357-368]。我们研究了来自慢性溃疡的伤口渗出物(WE)对体外分化的巨噬细胞的影响。基于它们介导这些巨噬细胞释放低水平或高水平细胞因子的能力，它们可以分成两个子集。此外，我们能够证明，该子集的WE中含有显著更高水平的IL-1α、IL-1β和TNF-α，导致巨噬细胞释放高水平的细胞因子。
[0769] 3.1.细胞测定
[0770] 3.1.1.原代人真皮成纤维细胞(HDF)增殖测定：在存在从个体中的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖
[0771] 原代人皮肤成纤维细胞(HDF)购自伯尔尼(Bern)的CELLnTEC。它们通常在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基
(DMEM)中生长。培养基、抗生素和谷氨酰胺购自Lonza。在第10代使用细胞。用胰蛋白酶消化细胞，以5000个细胞/孔以200μl接种到96孔板的内孔中。外孔装有无菌水。使细胞粘附过夜，然后在37℃下在以下条件下孵育72小时：分级化合物浓度或20ng/ml PDGF-BB(Tonbo生物科学#TO-21-8501-U010)，培养基中不存在或存在不同稀释度的无菌过滤的WE。对于阴性对照样本，加入200μl培养基代替特异性刺激。可替代地，将细胞以2500个细胞/孔接种到
384孔板中，连同测试化合物或生长因子和WE或培养基，总体积为50μl。
(DMEM)中生长。培养基、抗生素和谷氨酰胺购自Lonza。在第10代使用细胞。用胰蛋白酶消化细胞，以5000个细胞/孔以200μl接种到96孔板的内孔中。外孔装有无菌水。使细胞粘附过夜，然后在37℃下在以下条件下孵育72小时：分级化合物浓度或20ng/ml PDGF-BB(Tonbo生物科学#TO-21-8501-U010)，培养基中不存在或存在不同稀释度的无菌过滤的WE。对于阴性对照样本，加入200μl培养基代替特异性刺激。可替代地，将细胞以2500个细胞/孔接种到
384孔板中，连同测试化合物或生长因子和WE或培养基，总体积为50μl。
[0772] 在72小时孵育期结束时，将细胞用4％多聚甲醛(Morphisto)在室温下固定15分钟并用PBS洗涤3次。在细胞过夜粘附(第1天)后固定对照板以测定起始细胞数。
[0773] 通过用磺酰罗丹明B(SRB，西格玛(Sigma))染色固定的细胞，测定总细胞蛋白质作为细胞数量的量度。将溶于1％乙酸中的0.4％SRB溶液加入孔中30分钟。然后用1％乙酸洗涤孔直至洗涤溶液保持无色。干燥后，用10mM Tris·HCl(pH8.5)洗脱染料，并分别在550或492nm处测量吸光度以获得更低和更高的细胞密度。从WE处理的细胞的吸光度值中减去代表第1天起始细胞数(对于96孔板)的样本的平均吸光度。
[0774] 对于每个样本和浓度，所有实验重复三次进行，并且平均值±标准偏差(SD)用于评估实验。结果表示为未刺激细胞的对照值的百分比。
[0775] 图4中示出了由四种选择的WE的不同稀释液诱导的原代人成纤维细胞(HDF)的生长抑制。
[0776] 对于384孔板中的化合物筛选，通过声学转移点样50nl DMSO中的化合物溶液，得到最终DMSO浓度为0.1％，其不影响细胞生长(结果未显示)。对于用WE筛选，化合物结果计算为未处理且未刺激对照的增殖百分比(＝100％)，阳性命中的临界值定义为％平均增殖WE+3*标准偏差，如图5所示。
[0777] 3.1.2.成纤维细胞衍生基质(FDM)的形成：在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下，测量原代成纤维细胞形成成纤维细胞基质
[0778] 将HDF细胞在第3天以5000个细胞/孔接种到96孔组织培养板(对于384孔板1250细胞/孔)中，其已经在37℃下用100μl的0.2％明胶溶液(Sigma)预涂覆1小时。当细胞达到融合时(＝第0天)，加入基质促进补充物(维生素C：2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，100μg/ml；
Sigma)与含有PDGF-BB、TGF-β1，或化合物的分级浓度-/+WE的测试样本一起加入，如HDF增殖试验所述。4天后，培养基被新鲜的维生素C——和刺激物——以及含有化合物的培养基替代，维持在第0天开始的条件。包括TGF-β1和PDGF-BB作为阳性对照以分别促进FDM形成和细胞生长。在8天的总培养时间后，通过SRB染色在固定培养物中测量FDM产生，并如上所述进行评估。
Sigma)与含有PDGF-BB、TGF-β1，或化合物的分级浓度-/+WE的测试样本一起加入，如HDF增殖试验所述。4天后，培养基被新鲜的维生素C——和刺激物——以及含有化合物的培养基替代，维持在第0天开始的条件。包括TGF-β1和PDGF-BB作为阳性对照以分别促进FDM形成和细胞生长。在8天的总培养时间后，通过SRB染色在固定培养物中测量FDM产生，并如上所述进行评估。
[0779] 3.1.3.角质形成细胞增殖测定：在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下，测量角质形成细胞的增殖
[0780] 将HaCaT角质形成细胞系常规培养在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素的DMEM中。如对HDF细胞所述进行增殖测定。原代人角质形成细胞在含有0.06mM钙的KBM培养基(Lonza CC-3104)中生长，并在涂有鼠尾胶原(40μg/ml；Gibco)或明胶(0.2％；Sigma)的塑料上补充生长因子(Lonza CC-4131)。没有使用抗生素。如对HDF细胞所述进行增殖测定。
[0781] 3.1.4.原代人真皮微血管内皮细胞增殖试验：在存在从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本的情况下，测量内皮细胞的增殖
[0782] 在EGM-2-MV BulletKit培养基(Lonza CC-3156和CC-4147)中培养原代人内皮细胞HMVEC-d-(Lonza，CC-2543)。如对HDF细胞所述进行增殖测定。
[0783] 3.1.5.原代人巨噬细胞刺激测定
[0784] 原代人巨噬细胞由单核细胞分化，单核细胞已从外周血单核细胞(PBMC)中分离。使用LymphoPrep(Technoclone)从维也纳红十字会获得的白膜层中分离PBMC。用PBS以1：2稀释30ml白膜层浓缩物，用50ml falcon管中的15ml淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)轻轻分至底层，并在21℃下以1800rpm离心25分钟。将中间相小心地转移到新的falcon管中，并用冰冷的PBS填充至50ml。在另一个离心步骤(10分钟，1200rpm，4℃)后，用PBS洗涤细胞沉淀3次，重悬于含有20％FCS和10％DMSO的RPMI培养基中并在液氮中冷冻。根据制造商的说明，在autoMACS-Sorter(Miltenyi)上使用CD14 Beads-Kit(Miltenyi)用阳性选择从冷冻等分试样产生单核细胞。
[0785] 为了培养和分化成巨噬细胞，将单核细胞以4×106个单核细胞/孔接种在6孔板(Nunc)中，并与20ng/ml M-CSF(安迪系统(R&D Systems))一起在补充有10％FCS、2mM谷氨酰胺、和100U/ml青霉素/100μg/ml链霉素的RPMI中孵育，每孔总体积为5ml。2天后，取出2ml上清液，用2.5ml/孔含有20ng/ml M-CSF的新鲜培养基替换。在第三天，显微镜检查显示分化成粘附的、经常伸长的细胞。
[0786] 用橡皮刮刀收获巨噬细胞，以1200rpm离心5分钟，重悬于无血清培养基中，以2×105个细胞/孔接种于100μl。在37℃下1小时后，以100μl的体积加入2倍浓缩的刺激物，得到指定的最终浓度。100ng/ml LPS(Sigma)和50ng/ml IFN-γ(PeproTech)的组合用作诱导细胞因子分泌的阳性对照。在不存在或存在1：100稀释的无菌过滤的WE的情况下，制备分级浓度的测试化合物。对于阴性对照样本，加入100μl培养基替代特异性刺激。
[0787] 24小时后，将200μl上清液转移到U孔板中并在-20℃冷冻用于将来的细胞因子分析(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α)。从上清液水平中减去输入WE的细胞因子浓度，以计算WE诱导的细胞因子刺激。
[0788] 3.1.6.人类单核细胞-真皮成纤维细胞共培养物作为反映人类皮肤中巨噬细胞行为的体外模型：
[0789] 测量(a)与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且(b)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，(c)测量与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本一起孵育的巨噬细胞中的一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，以及(d)与从皮肤伤口获得的伤口渗出物样本一起孵育的巨噬细胞上清液中的选自IL-1α、IL-1β和TNF-α的一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养。
[0790] 通过磁珠分离从健康供体的PBMC分离的CD14+单核细胞单独孵育，或在原代人真皮成纤维细胞(CellNTec)或成纤维细胞衍生基质(FDM)的存在下孵育。通过使用生长补充剂维生素C或胰岛素和EGF(维生素C：2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐，100μg/ml；人类EGF，5ng/ml；人胰岛素，5μg/ml)孵育3周，从原代人皮肤成纤维细胞产生FDM。可替代地，也可以使用成纤维细胞单层培养物。在存在或不存在M-CSF(25ng/ml)的情况下，4天至一周之后，以允许巨噬细胞分化，用IFN-g(50ng/ml)、LPS(100ng/ml)和IL-4(25ng/ml)或其组合刺激培养物过夜，作为M1和M2巨噬细胞诱导的对照。为了评估来自未愈合和愈合伤口的WE的影响，将WE添加到培养基中以在1：25至1：100的稀释度下进行过夜刺激。
[0791] 收获上清液并冷冻用于通过ELISA测定细胞因子，收获细胞并进行FACS分析，对单核细胞群进行门控。平均荧光强度(MFI)的几何平均值用于量化表面标志物表达。
[0792] 特定mRNA水平测定为与管家基因相比的比率；获得的值是“相对于管家基因的表达”。
[0793] 评估有两种可能性：a)群体中给定标记阳性细胞的年龄百分比(％)，这是FACS分析中最常用的读数，或b)细胞表面表达的数量(作为每个单独细胞的细胞表面上的标记分子数量的替代)，通过平均荧光强度测量。
[0794] 使用了以下读数：
[0795] FACS：M1巨噬细胞的CD38、CD64和CD197，M2巨噬细胞的CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，CD163作为巨噬细胞分化的标志物。计算M1/M2细胞表面标志物表达的比率。
[0796] ELISA：用于M1巨噬细胞的CXCL10和IL-23p19，以及作为M2巨噬细胞标志物的CCL22和CCL18，作为指示M1表型的促炎标志物的IL-1α、IL-1β和TNF-α。
[0797] mRNA：M1巨噬细胞的CD38、CD64CD38、CD64和CD197，M2巨噬细胞的CD200受体(CD200R)、CD206和CD209，CD163作为巨噬细胞分化的标志物。
[0798] 3.2.生化测定
[0799] 3.2.1.蛋白质测定
[0800] 将伤口渗出物在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，并进行商业蛋白质测定，Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(赛默科学(Thermo Scientific)#23225)，使用牛血清白蛋白作为标准，范围为20-2000μg/ml。该测定在96孔ELISA微量培养板(葛莱娜(Greiner)#655101)中进行，并在TECAN Infinite M200 Pro微量滴定板读数器上在562nm处测量，使用Magellan 7.2软件进行评估。
[0801] 3.2.2.髓过氧化物酶(MPO)活性测定
[0802] 通过在96孔ELISA微量培养板中氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)测定用PBS预先稀释的WE样本中的MPO活性。将10μl稀释的WE样本加入到40μl测定缓冲液(78mM NaH 2 PO4·H2O、1.67mM Na2HPO4、0.5％HTAB pH 5.40)中，然后与40μl 1X TMB ELISA底物溶液(eBioscience#00-4201-56)一起孵育直至蓝色(至多30分钟)。来自测定缓冲液中的人白细胞(Sigma M6908-5UN)的MPO以0.12至120mU/ml的浓度用作标准。通过加入45μl 2N H2SO4终止反应，并在TECAN Infinite M200 Pro微量滴定板读数器上在450nm处测量样本，使用Magellan 7.2软件进行评估。
[0803] 3.2.3.嗜中性粒细胞弹性蛋白酶测定
[0804] 通过测量荧光底物MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC的荧光，测定在PBS中预先稀释1：2的WE中的弹性蛋白酶活性。将5μl WE预稀释液加入到384孔黑色聚苯乙烯板(Corning#
3573)中的20μl测定缓冲液(50mM Tris pH7.4、600mM NaCl、0.05％CHAPS)中。在测定缓冲液中加入终浓度为1.4μM的25μl弹性蛋白酶底物V(Merck-Millipore/Calbiochem Cat#
324740)后，使反应进行1小时。使用最高浓度为10nM的来自人白细胞(Sigma E8140-1UN)的弹性蛋白酶的系列稀释液作为标准品。在TECAN Infinite M200 Pro(激发380nm，发射
460nm)上测量反应，使用Magellan 7.2软件进行评估。
3573)中的20μl测定缓冲液(50mM Tris pH7.4、600mM NaCl、0.05％CHAPS)中。在测定缓冲液中加入终浓度为1.4μM的25μl弹性蛋白酶底物V(Merck-Millipore/Calbiochem Cat#
324740)后，使反应进行1小时。使用最高浓度为10nM的来自人白细胞(Sigma E8140-1UN)的弹性蛋白酶的系列稀释液作为标准品。在TECAN Infinite M200 Pro(激发380nm，发射
460nm)上测量反应，使用Magellan 7.2软件进行评估。
[0805] 3.2.4.基质金属蛋白酶(MMP)测定
[0806] 通过测量荧光底物MCA-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2的荧光，在WE中测定所有基质金属蛋白酶的活性。将WE稀释于测定缓冲液(100mM Tris pH＝7.4、100mM NaCl、10mM CaCl2、10μM ZnCl2、0.075％(v/v)Brij35)中，并将15μl WE稀释液转移至384孔黑色聚苯乙烯板(Corning#3573)的孔中。测定缓冲液中的活性人MMP9全长蛋白(Abcam#
ab168863)以0.31至20nM的浓度用作标准。在测定缓冲液中加入终浓度为5μM的15μl MMP底物(Biosyntan#50347.1)后，使反应在37℃下进行2小时。在TECAN Infinite M200 Pro(激发323nm，发射382nm)上测量荧光，使用Magellan 7.2软件进行评估。
ab168863)以0.31至20nM的浓度用作标准。在测定缓冲液中加入终浓度为5μM的15μl MMP底物(Biosyntan#50347.1)后，使反应在37℃下进行2小时。在TECAN Infinite M200 Pro(激发323nm，发射382nm)上测量荧光，使用Magellan 7.2软件进行评估。
[0807] 3.3.细胞因子测定
[0808] 3.3.1.IL-1α的测定
[0809] 根据制造商的说明书，使用来自R&D Systems(#DY200)的hIL1-α DuoSetELISA试剂盒，在F96 Maxisorp Nunc Immuno板(Nunc，#439454)中测定WE中和巨噬细胞上清液中的IL-1α。用TMB溶液(eBioscience)检测酶反应，并通过加入50μl/孔2N H2SO4终止酶反应。在Tecan Infinite M200 Pro上在450nm处读取吸光度。
[0810] 3.3.2.IL-1β的测定
[0811] 根据制造商的说明，使用来自eBioscience的IL1-β ELISAReadySet-Go试剂盒(#88-7261-88)，在F96 Maxisorp Nunc Immuno板(Nunc，#439454)中测定WE中和巨噬细胞上清液中的IL-1β。如对IL-1α所述进行酶反应和测量。
[0812] 3.3.3.TNF-α的测定
[0813] 根据制造商的说明，使用来自eBioscience的TNF-α ELISAReadySet-Go试剂盒(#88-7346-88)，在F96 Maxisorp Nunc Immuno板(Nunc，#439454)中测定WE中和巨噬细胞上清液中的TNF-α。如对IL-1α所述进行酶反应和测量。
[0814] 3.3.4.CCL18的测定
[0815] 根据制造商的说明书，使用来自R&D Systems的hCCL18/PARC DuoSet ELISA试剂盒(#DY394)，在F96 Maxisorp Nunc Immuno板(Nunc，#439454)中测定WE中和巨噬细胞上清液中的CCL18。如对IL-1α所述进行酶反应和测量。
[0816] 3.4流式细胞术分析巨噬细胞表面标志物
[0817] 收获细胞并重悬于FACS缓冲液(含有2％FCS的PBS)中。通过与人Trustain FCR封闭溶液(Biolegend，#422302)在冰上孵育10分钟来防止非特异性抗体结合。来自
eBioscience(现为ThermoFisher Scientific)的以下荧光染色偶联抗体用于通过在冰上
染色30分钟来检测特异性表面标志物：CD38-PerCPeFluor710(#46-0388-42)、CD197-APC(#
17-1979-42)、CD206-AF488(#53-2069-42)、CD209-PerCP Cy5.5(#45-2099-42)。当从共培养物中分析时，使用CD45eFluor(#506 69-0459-42)的共染色来区分巨噬细胞与原代人成纤维细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞后，用PBS中的1％多聚甲醛固定，并在黑暗中于4℃保存，直至在Beckman Coulter的Gallios流式细胞仪上获得数据，并用Kaluza分析软件1.3分析。
eBioscience(现为ThermoFisher Scientific)的以下荧光染色偶联抗体用于通过在冰上
染色30分钟来检测特异性表面标志物：CD38-PerCPeFluor710(#46-0388-42)、CD197-APC(#
17-1979-42)、CD206-AF488(#53-2069-42)、CD209-PerCP Cy5.5(#45-2099-42)。当从共培养物中分析时，使用CD45eFluor(#506 69-0459-42)的共染色来区分巨噬细胞与原代人成纤维细胞。用FACS缓冲液洗涤细胞后，用PBS中的1％多聚甲醛固定，并在黑暗中于4℃保存，直至在Beckman Coulter的Gallios流式细胞仪上获得数据，并用Kaluza分析软件1.3分析。
[0818] 4.1.选择本发明的筛选方法中的用于化合物筛选的伤口渗出物
[0819] 选择了具有不同特征和非常多样病因的四种不同伤口渗出物(以便识别其中一些或全部常见的命中)。表1中总结了患者特征。
[0820] 表1：提供筛选分泌物的患者的特征
[0821]
[0822] 图6中示出了这些WE中的不同酶活性、炎性细胞因子水平和原代人巨噬细胞中的细胞因子诱导。
[0823] 4.2将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合皮肤伤口的方法以及监测个体中的皮肤伤口愈合的方法
[0824] 使用上述细胞试验和生物化学测定，令人惊讶地，有可能建立一种可靠的方法，将个体中的皮肤伤口识别为未愈合的皮肤伤口或愈合的皮肤伤口，以及监测个体中的皮肤伤口的愈合的方法。
[0825] 测定评估显示：
[0826] -原代人成纤维细胞的生长被45％的来自未愈合溃疡的渗出物抑制，但仅被8％的来自愈合伤口的渗出物抑制(所有3个都是手术伤口)，
[0827] -在成纤维细胞增殖测定中证明有活性的大多数渗出物也抑制HaCaT角质形成细胞的增殖和成纤维细胞衍生基质(FDM)的形成。
[0828] -对于在微血管内皮细胞增殖中测试的33种渗出物，大多数活性与对成纤维细胞的作用相似，
[0829] -部分来自愈合的和未愈合的溃疡的渗出物显示出有趣的FDM增强活性。
[0830] 特别地，本发明的方法令人惊讶地允许预测在确定的个体中确定的皮肤伤口在未来是否表现出改善的或恶化的伤口愈合。
[0831] 4.3筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的本发明的方法
[0832] 令人惊讶地发现，可以通过以下步骤成功地建立筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法：
[0833] 主要测定：成纤维细胞增殖
[0834] 如果发现候选化合物在测定中具有活性，则进行如上详细描述的以下5或6种二级测定1)至5)、或1)至6)中的一种或多种：
[0835] 1)FDM(3D成纤维细胞)测定，其测量增殖和细胞外基质形成。
[0836] 2)HaCaT增殖
[0837] 3)成纤维细胞/巨噬细胞共培养物：M1-相比于M2-巨噬细胞表面标志物的表达
[0838] 4)成纤维细胞/巨噬细胞共培养：M1-相比于M2-巨噬细胞标志物分泌
[0839] 5)成纤维细胞/巨噬细胞共培养物：M1-相比于M2-巨噬细胞标志物mRNA的表达
[0840] 6)成纤维细胞/巨噬细胞共培养物：IL-1α、IL-1β和TNF-α的细胞因子标志物分泌[0841] 在存在来自至少一个个体的伤口渗出物的情况下进行测定。如果化合物在五种或六种二级测定中的至少一种中具有进一步活性，则识别化合物适于调节皮肤伤口愈合。
[0842] 对于384孔板中的化合物筛选，通过声学转移点样50nl DMSO中的化合物溶液，得到最终DMSO浓度为0.1％，其不影响细胞生长(结果未显示)。对于用WE筛选，化合物结果计算为未处理且未刺激对照的增殖百分比％(＝100％)，阳性命中的临界值定义为平均增殖WE百分比％+3*标准偏差，如图5所示。
[0843] 因此，筛选适于调节皮肤伤口愈合的化合物的方法包含以下步骤：
[0844] A)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本和(ii)至少一种候选化合物的情况下，测量原代成纤维细胞的增殖，和
[0845] B)如果在A)中获得的值比没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，则执行以下方法步骤B1)至B5)中的一个、两个、三个、四个或五个、或以下方法步骤B1)至B6)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个、或以下方法步骤B1至B4)和B6)中的一个、两个、三个、四个或五个：
[0846] B1)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量原代成纤维细胞的成纤维细胞衍生基质形成，
[0847] B2)在存在(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本和(ii)所述至少一种候选化合物的情况下，测量HaCaT细胞的增殖，
[0848] B3)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种M1标志物和一种或多种
M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
M2标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0849] B4)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上的一种或多种M1细胞表面标志物和一种或多
种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
种M2细胞表面标志物的量和/或频率分布，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0850] B5)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞中一种或多种M1标志物mRNA和一种或多种M2标
志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
志物mRNA的表达水平，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，
[0851] B6)测量与(i)从至少一个个体的皮肤伤口获得的伤口渗出物样本以及(ii)所述至少一种候选化合物一起孵育的巨噬细胞上清液中的一种或多种细胞因子标志物的量，其中巨噬细胞与成纤维细胞共培养，并且其中一种或多种细胞因子标志物选自IL-1α、IL-1β和TNF-α，
[0852] 其中，如果在B1)至B5)、或B1至B6)、或B1至B4)和B6)中获得的至少一个值比在没有至少一种候选化合物的情况下建立的对照值高至少10％或低至少10％，则该化合物被识别为适于调节皮肤伤口愈合，
[0853] 优选地，其中如实施例和/或本申请的其余部分所述执行根据A)和B1)至B5)、或A)和B1)至B6)、或B1至B4)和B6)的方法步骤。
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