一种新型肿瘤放疗参考标记物
阅读：43发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种新型肿瘤放疗参考标记物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种新型 肿瘤 放疗参考标记物，是NBCA和碘化油的 混合液 ，其中NBCA和碘化油的混合液的体积比为：1：1～1：3，总体积为0.1～0.15ml，优选体积为1：3，总体积为0.15ml，该混合液可以达到对组织的影响最小，且能达到放疗过程持续显影及放疗结束后即使代谢完成的目的，能有效的应用在食管癌等 恶性肿瘤 放疗的靶区病灶确定及局部加量中。本 申请 标记物可实现长时间显影 位置 跟踪 疗效，可以减少药物浪费，减轻病人的身体损伤和经济负担。，下面是一种新型肿瘤放疗参考标记物专利的具体信息内容。
1.一种新型肿瘤放疗参考标记物，其特征在于，所述标记物为NBCA和碘化油的混合液。
2.根据权利要求1所述的标记物，其特征在于，所述NBCA和碘化油的混合液的体积比为
1：1—1：3，总体积为0.1—0.15ml。
3.根据权利要求1或2所述的标记物，其特征在于，所述NBCA和碘化油的混合液的体积比为1：3，总体积为0.15ml。
4.根据权利要求1所述标记物的制备方法，其特征在于，将NBCA和碘化油机械混匀即得混合物。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，NBCA和碘化油的体积比为1：3，总体积为
0.15ml。
6.权利要求1所述标记物在新型肿瘤放疗中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，标记物通过显影使恶性肿瘤放疗的靶区病灶确定及局部加量。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述恶性肿瘤为食管癌，但不限于食管癌。
9.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述标记物NBCA和碘化油的体积比为1：1—
1：3，总体积为0.1—0.15ml。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，NBCA和碘化油的混合液的体积比为1：3，总体积为0.15ml。
一种新型肿瘤放疗参考标记物
技术领域
背景技术
[0002] 肿瘤放射治疗追求病灶受照射的最大化和危及器官受照射的最小化。靶区勾画和调整、计划设置及局部加量是非常重要的举措。目前CT定位下宏观辨认肿瘤边界在部分癌症中较适用，如肺癌、淋巴瘤等，但在食管癌中，但有研究发现对于食管鳞癌，内镜和X线钡餐检查优于CT，更接近于手术病理下的食管癌大体边界，而对食管腺癌，内镜和CT更接近手术标本的大体边界。内镜结合影像学是较优化的选择，其中之一原因是在肿瘤边界置入可于CT下现象的标记物，如较成熟的是乳腺癌的钛夹，其余几种如食管胃癌中的钛夹、膀胱癌中的碘化油注射等均处于试验阶段。固体标记物需放置于表面，食物会对标记物造成磨损或损坏，引起丢失，且较难吸收和代谢，部分会终生携带。同时金属标记物会产生伪影，对病灶边界的辨识产生障碍，这是无法接受的一点。碘化油等液体注入方便，但是较难固定，容易移位切流失较快，持续显影成功率较低，部分实验显示碘化油会引起微血栓形成。钟延强等，专利CN 101972493 A公开一种具有缓释作用的可显影碘化油-5-氟尿嘧啶聚乳酸微球中公开通过缓释作用实现长时间显影，但在体内代谢效果不好。
[0003] 因此，亟需寻找一种能将碘化油通过某一方法固定于病灶边缘的粘膜下，且可以被代谢掉的物质。NBCA(氰基丙烯酸粘合剂的一种)现已经被允许应用于外科部分皮肤伤口的粘合中，达到了缝线的效果，同时操作方便，美容效果较好；目前还公开，NBCA和碘化油共同应用于肝癌和胃底食管静脉曲张出血中，碘化油起到稀释胶体及显像造影的效果，但并未公开NBCA和和碘化油结合可以延长显影时间。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明的目的在于提供一种新型肿瘤放疗参考标记物。本发明提供了一种综合固体和液体显像优势的一种物质NBCA，通过研究发现，通过找到合适的NBCA和碘化油的浓度和体积，可以达到对组织的影响最小，且能达到放疗过程持续显影及放疗结束后即代谢完成的目的，能有效的应用在食管癌等恶性肿瘤放疗的靶区病灶确定及局部加量中。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 本发明提供一种新型肿瘤放疗参考标记物，该标记物为NBCA和碘化油的混合液。
[0007] 优选地，NBCA和碘化油的混合液的浓度配比从1∶1～1∶3，体积最佳范围约0.1～0.15ml。
[0008] 进一步，优选地，所述NBCA和碘化油的混合液的体积比为1∶3，总体积为0.15ml。
[0009] 发明人在前期预试验研究发现大于1∶3的体积配比，在注射后粘膜下体积较大，且外形以扁平状为主，同时体积大于0.15ml形成体积过大，注射过程中容易溢出，引起误差较大，难以符合作为放疗标记点的临床需要。
[0010] 本发明还提供了一种新型肿瘤放疗参考标记物的制备方法，将NBCA和碘化油机械混匀即得混合物。
[0011] 优选地，NBCA和碘化油的混合液的浓度配比从1∶1～1∶3，体积最佳范围约0.1～0.15ml。
[0012] 进一步，优选地，所述NBCA和碘化油的混合液的体积比为1∶3，总体积为0.15ml。
[0013] 本发明还提供一种NBCA和碘化油混合标记物在新型肿瘤放疗中的应用。
[0014] 所述应用为通过显影使恶性肿瘤放疗的靶区病灶确定及局部加量。
[0015] 进一步，优选地，所述恶性肿瘤为食管癌，但不限于食管癌。
[0016] 优选地，所述NBCA和碘化油联合的浓度比为1∶1～1∶3，总体积为0.1～0.15ml。
[0017] 进一步，优选地，所述NBCA和碘化油的混合液的浓度比为1∶3，总体积为0.15ml。
[0018] 本发明通过研究发现，NBCA能够将混合的碘化油固定于粘膜下，能够延长显影持续所需时间，即可持续性显影7周，且注入3月后完全代谢掉，且镜下过程显示经适度的异物反应后被纤维组织包绕，慢慢逐渐代谢，此外，还发现高浓度的混合物会引起组织机化且代谢较慢。所以将本发明筛选出的浓度和体积应用在新型肿瘤放疗中，其操作性和安全性高，显影稳定及持续性好。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1)碘化油显影容易发生移位，不具备放疗基准物的条件。本发明首次公开NBCA和碘化油混合物作为肿瘤放疗参考标记物，充分发挥固体和液体显像优势，将易流动的碘化油通过易聚合固化的NBCA固定于粘膜下，延长了显影持续所需时间，值得在临床中应用推广。
[0021] 2)不同浓度和体积的混合物的代谢速度不同，对粘膜的损伤不同，研究发现，NBCA和碘化油的混合液的体积比为1∶3，0.15ml/组，安全性可耐受，毒副作用低，可以安全使用，标准的生物相容性检验在山东省医疗器械检测中心进行中，试验报告见附图。
[0022] 3)研究发现，NBCA和碘化油的混合液的体积比为1∶3，注入体积为0.15ml时，可持续性显影7周，且注入3月后完全代谢掉。所以可实现长时间显影位置跟踪疗效，可以减少药物浪费，可以提高放疗处方剂量精度，减轻病人的身体损伤和经济负担。
[0023] 4)研究发现，从第1周到第7周，1∶3-0.15ml搭配组产生的结节硬度明显高于周围组织，在内镜下标记后，若部分手术病人术中的探查微小病灶如原位癌的切除有指导价值。
附图说明
[0024] 图1是NBCA和碘化油的体积比是1∶3，注射体积为0.15ml的组内同一只小鼠连续显影图。
[0025] 图2是巨噬细胞和中性粒细胞早期反应(2nd week)免疫组化染色图。
[0026] 图3是巨噬细胞和中性粒细胞晚期反应(7th week)免疫组化染色图。
[0027] 图4是靠近混合物的皮肤组织的早期反应(2th week)HE染色。
[0028] 图5是靠近混合物的皮肤组织的晚期反应(7th week)HE染色。
[0029] 图6是迟发型超敏反应试验中皮内诱导阶段注射部位图，其中1-头部；2-0.lmL皮内注射点：3-去毛的肩胛骨内侧部位；4-尾部。
[0030] 图7是内皮反应实验中注射点排列。
具体实施方式
[0031] 以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
[0032] NBCA：液体，为一种胶体，颜色为蓝色(栓塞型为无色)，主要性质为遇水中的-OH离子会聚合成多聚体，一旦形成多聚体形成一层薄膜，起到粘合伤口作用，凝固时间为0-30s，可阻挡金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，并抑制革兰氏阳性菌生长；
[0033] 碘化油：液体，为一种X线诊断用阳性造影剂，淡黄色至黄色的澄明油状液体微有类似蒜的臭气，含碘复方制剂，主要组分：植物油与碘结合的一种有机碘化合物，含碘(37％-41％)，每支含碘2.96g-3.28g。可析出至肺泡或腹腔内形成肉芽肿，注入血管内可引起栓塞。液体较粘稠，注射时需要用较大号针头，避免使用塑料注射器。本品不宜久置入光线和空气中，析出游离碘后，色泽变棕或棕褐色者不可使用。
[0034] 本发明前期实验是与山东省肿瘤医院放射科及病理科合作完成。
[0035] 本发明通过对小鼠宏观指标和病理变化研究安全且效应较好的NBCA和碘化油的体积及其总体积。其中宏观指标中包括小鼠行为变化、体重、皮肤得分和显影质量及显影结节的体积变化，对4个实验组和1个对照组进行研究，总共60只实验小鼠；病理变化包括HE染色镜下观察病理过程，和利用CD68和LY6G免疫组化染色巨噬细胞和中性粒细胞进一步量化不同搭配的炎症反应水平，对4个实验组进行研究，总共120只实验小鼠。通过这两部分最终确定其最适合的放疗标记物。
[0036] 实施例1：
[0037] 本发明根据NBCA与碘化油的体积比以及总体积设置4个实验组和一个对照组，实验组具体为：第一组为NBCA和碘化油的体积比是1∶1，体积为0.1ml；第二组为体积比是1∶1，体积为0.15ml；第三组为体积比是1∶3，总体积为0.1ml；第四组体积比是1∶3，总体积为0.15ml，对照组为生理盐水组。
[0038] 1、将上述设置的5组对照分别皮下注入小鼠体内，持续1～7周观察对小鼠体重变化、皮肤得分、显影体积(所述显影体积即通过CT扫描后勾画显影混合物，计算的混合物的体积变化)、巨噬细胞和中性粒细胞的影响，来研究对小鼠组织损伤情况、生长生活影响以及显影质量(随着持续时间的显影对显影体积消减情况判断)。表1为持续1～7周检测的各项指标变化，
[0039] 表1不同时间小鼠各项指标变化表
[0040]
[0041] 注：“/”代表未收集数据，因为总体反应分为急性炎症反应和慢反应，根据常识慢反应持续时间长且病理变化改变不大，所以发明人在3周后进行隔2周活检一次，即对1，2，3，5，7周进行活检。重量的单位是克；尺寸单位是立方厘米；皮肤的评分体系是根据红斑和肿胀情况设计的评分体系，参照GB/T 16886.10-2005/ISO 10993-10：2002标准；其中ap＜b
0.05代表与1∶1-0.1ml组相比较存在显著差异，p＜0.05代表与1∶1-0.15ml组相比较存在显著差异，cp＜0.05代表与1∶3-0.1ml组相比较存在显著差异，dp＜0.05代表与1∶3-0.15ml组相比较存在显著差异。
0.05代表与1∶1-0.1ml组相比较存在显著差异，p＜0.05代表与1∶1-0.15ml组相比较存在显著差异，cp＜0.05代表与1∶3-0.1ml组相比较存在显著差异，dp＜0.05代表与1∶3-0.15ml组相比较存在显著差异。
[0042] 从上述表格可知，体重结果显示，1∶3-0.15ml组与对照组相比无明显差别，但均明显高于其余3组实验组，这说明1∶3-0.15ml搭配对小鼠体重增长影响最小；皮肤的评估结果显示各组之间没有明显差别，但是从总体皮肤状态来看，1∶1-0.15ml和1∶3-0.1ml这两个搭配组合的皮肤状态最差；从CT上根据显影体积来计算混合物的代谢情况显示，1∶3-0.1ml搭配组的体积最小，说明降解最快，到第7周的时候明显小，不足以达到作为放疗基准点标记物的要求；从巨噬细胞符合中性粒细胞反应的炎症水平上来说，并没有发现各搭配组合之间的区别；
[0043] 2、不同设置组CT扫描显影情况：将4个实验组采用22号针头斜45度角注入小鼠皮下组织，尽量以形成以球形突起调节注入速度，注入后，对4种搭配组合中的12只小鼠分别在1-7周每周固定时间行CT扫描，具体实施是先将小鼠行麻醉和止疼处理，利用MICRO-CT行CT扫描，扫描完成后，将扫描CT图像上传至M.D Anderson肿瘤中心开发的开源软件IBEX上对显像结节进行感兴趣区域勾画(调节显像灰度级窗宽，对小于300hu的部分不进行包括)，计算结节显影体积7周的变化。如图1为NBCA和碘化油的体积比是1∶3，总体积为0.1ml的显影图，图A～I分别代表第1，2，3，4，5，6，7周，第2月，第3月的CT图。研究发现，从注入小鼠体内后从第1周到第7周(本领域技术人员只对7周内的显像质量关心，超过7周的扫描只是为了完善降解数据)的显象变化图可见，图像清晰显示且无明显伪影，说明显影效果好。
[0044] 实施例2
[0045] 实施例1部分研究为探究小鼠的宏观反应，如整体临床行为变化，体重变化，皮肤变化，以及可行性，持续7周显影能否在CT上实现，包括代谢速度合适和显影质量较高。本部分为微观镜下研究，研究过程为利用小鼠动物实验皮下植入上述不同浓度及不同比例混合物，在第1，2、3、5、7周时杀死每组一批小鼠，利用HE染色及免疫组化试验探究其镜下细胞种类及组织结构变化，探究植入混合物后引起组织病理变化。对巨噬细胞和中性粒细胞进行免疫组化进一步分析对炎症的影响，如图2和3，图2为早期反应(2nd week)免疫组化染色图，图3为晚期反应(7th week)免疫组化染色图。如图4和5所示，图4为早期反应(2th week)HE染色，图5为晚期反应(7th week)HE染色。
[0046] 免疫组化显示利用CD68和LY6G对巨噬细胞和中性粒细胞染色计数来反应炎症水平的变化，并没有发现各组之间的差别没有明显意义。但是从HE和免疫组化上，通过HE染色可见早期：1∶1组的皮肤组织反应程度较大，可见大量的中性粒细胞浸润和成熟的肉芽组织，均较1∶3组剧烈；晚期：大部分炎性细胞消失，可见1∶1比1∶3组的小鼠皮肤组织纤维细胞增殖较多，形成的纤维组织囊较厚。
[0047] 通过上述试验得出的结论：通过对混合浓度和体积进行分析发现，试验所用四种搭配组合在安全性方面均被小鼠耐受，并未引起明显行为异常，且无临床表现异常及严重并发症，对体重、皮肤的研究发现1∶3-0.15ml组对小鼠体重影响最小，1∶3-0.1ml，1∶1-0.15ml小鼠的皮肤得分较高，皮肤状态较差；通过对小鼠体内结节代谢研究发现，1∶3-
0.1ml组合的体积在第七周显像率成功率最低，总体体积最小；对组织病理HE及免疫组化发现，各组的炎症反应水平在炎性细胞定量上差别无显著性，但是HE显示组织修复过程中镜下发现NBCA和碘化油的混合比例为1∶1比1∶3的组织反应产生的肉芽肿组织更剧烈，且后期转化形成的纤维组织更厚，降解需要6月左右。因此，根据以上两部分试验，其中1.3-0.15ml组合的体重均优于其他四组，皮肤反应中等，7周的显影情况较好且组织反应水平较低，所以1∶3-0.15ml具有在安全性，有效性方面的优势，最终其最适合作为放疗标记物行生物相容性检测。
0.1ml组合的体积在第七周显像率成功率最低，总体体积最小；对组织病理HE及免疫组化发现，各组的炎症反应水平在炎性细胞定量上差别无显著性，但是HE显示组织修复过程中镜下发现NBCA和碘化油的混合比例为1∶1比1∶3的组织反应产生的肉芽肿组织更剧烈，且后期转化形成的纤维组织更厚，降解需要6月左右。因此，根据以上两部分试验，其中1.3-0.15ml组合的体重均优于其他四组，皮肤反应中等，7周的显影情况较好且组织反应水平较低，所以1∶3-0.15ml具有在安全性，有效性方面的优势，最终其最适合作为放疗标记物行生物相容性检测。
[0048] 实施例3生物相容性试验
[0049] 通过实施例1确定合适的搭配后，进行生物相容性试验，本发明委托食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心进行检测。生物相容性实验包括急性全身毒性试验(按照GB/T16886.11-2011规定试验方法进行)、细胞毒性试验(按照GB/T14233.2-2005规定评级)、迟发型超敏反应(按照GB/T16886.10-2005中规定的最大剂量试验方法进行)、内皮反应(按照GB/T16886.10-2005规中规定实验方法进行)。
[0050] 一、急性全身毒性试验
[0051] 该试验依据国家标准GB/T 16886,11-2011《医疗器械生物学评价第11部分：全身毒性试验》方法，对试验样品的0.9％氯化钠注射液(SC)和棉籽油SCO)样品试验液进行了小鼠急性全身毒性试验。该试验使用SC和CSO对试验样品进行浸提，分别采用尾静脉注射(IV)和腹腔注射(IP)法给予试验动物。注射后分别立即、4h、24h、48h和72h观察和记录所有动物状态和死亡动物数。在注射后24h、48h和72h对所有动物进行称重，并做好记录。
[0052] 1、样品制备
[0053] 浸提介质；0.9％氯化钠注射液(SC，山东华鲁制药有限公司，D17030901，无色)；棉籽油(CSO，ACROS，A0394328.浅黄色).
[0054] 试验液制备：将A(NBCA)、B(碘化油)以1∶3比例混合，混匀即为RFM混合物，放置2分钟后，取0.15mL样品加20mL浸提介质浸提，控制介质加入速度，使样品凝同成型为宣。取0.15mL的试验样品在20.0mL SC浸提介质中制备；取0.15mL的试验样品在20.0mL CSO浸提介质中制备。试验样晶在浸提介质中于(37±1)℃条件下，60rpm振荡浸提(72±2)h制各试验液。
[0055] 介质对照：浸提介质(不含有试验样品)以相同的方式制备作为介质对照。
[0056]
[0057] 2、试验方法
[0058] (1)试验动物
[0059] 名称：小鼠(昆明种)；品种：昆明种；来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，[0060] 体重范围：17g—23g；周龄：6—8周；适应时期：至少5d；动物数日：20只；标记方法：3～5％苦味酸溶液涂染法
[0061] (2)试验系统的合理性
[0062] 在毒理学研究中，昆明种小鼠被广泛用子急性全身毒性试验，其背景资料丰富。本试验是按照国家标准GB/T 16886.11-2011中的规定进行的，试验样品试验液经尾静脉注射和腹腔注射两种途径给予试验动物，符合测试标准中对医疗器械进行评价的要求。
[0063] (3)实验步骤
[0064] 试验前先将小鼠标记并称重，随机分为SC、CSO试验组和SC、CSO介质对照组，每组5只小鼠。SC试验液和SC介质对照采用小鼠尾静脉注射法(IV)，CSO试验液和CSO介质对熙采用腹腔注射法(IP)。每只小鼠注射剂最为50mL/kg。
[0065] 注射后立即观察小鼠所有行为表现，然后分别在4、24、48、72h继续观察行为表现和有无死亡动物，并在24、48、72h记录动物的体重。
[0066] (4)结果评价：
[0067] 在观察过程中，如果试验组小鼠所表现出的反应不大于介质对照组小鼠，则该试验样品符合试验要求。如果试验组小鼠两只或两只以上出现死亡、或两只或两只以上出现抽搐或俯卧、或三只或三只以上山现体重下降超过l0％，则试验样品不符合试验要求。如果试验组小鼠反应轻微，不超过一只小鼠出现生物学反应症状或死亡，则用10只小鼠重复试验。如果在重复试验中全部试验组小鼠所表现出的反应不大于介质对照组小鼠，则该试验样品符合试验要求。
[0068] (5)评价标准：给予试验样品不同试验液后，动物表现出的临床症状与观察项目见表2：
[0069] 表2常见症状观察与观察项目
[0070]
[0071] 3、试验结果：
[0072] 体重：0h、24h、48h、72h的动物体重结果见表3.
[0073] 死亡率：试验过程中没有发生死亡，结果见表3.
[0074] 临床观察：整个试验过程中，所有动物的临床表现均正常，结果见表4.[0075] 临床病理学和大体病理学评价：由于未出现临床症状，所以未进行临床病理学和大体病理学评价。
[0076] 表3给予试验液后试验动物不同时间的体重及死亡数
[0077]
[0078] 表4给予试验液后试验动物临床观察结果
[0079]
[0080] AN＝表现正常
[0081] U＝萎靡不振，其他均正常。
[0082] 4、结论：在本次试验条件下，试验组与对照组动物均未见死亡，所有试验小鼠未出现中毒症状，小鼠体重均有增加。试验结果表明，本发明产品RFM试验液对试验小鼠无急性全身毒性。
[0083] 二、细胞毒性试验
[0084] 细胞毒性试验是用体外细胞培养方法进行毒理学风险评价。本次试验是按国家标准GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》以及GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》的规定进行。
[0085] 将样品试验液，阴性对照、阳性对照的试验液及介质对照分别放于6个培养着L929小鼠成纤维细胞的细胞培养板孔内，在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养，分别于24h和48h后显微镜下观察试验样品组、阴性对照组、阳性对照组及介质对照组培养后的细胞形态学改变，'48h后用MTT法测定各供试品组(样品组、阴性对照组、阳性对照组)相对于介质对照组的细胞相对增殖率。
[0086] 1、样品制备
[0087] 细胞培养液：含10％新生牛血清(四季青@，批号：20170412)的MEM(HyClone@，批号：AC10249345)，粉红色。
[0088] 样品制备：将A(NBCA)、B(碘化油)以1∶3比例混合，混匀即为RFM混合物，放置2分钟后，取0.15mL样品加20mL浸提介质浸提，控制介质加入速度，使样品凝固成型为宜。取0.15mL混合物加20.0mL细胞培养液中，于(37+1)℃条件下，60rpm振荡浸提(24+2)h制各试验液。
[0089] 阳性对照：10％DMSO(Sigma，批号：RNBC9663)溶液，现配现埘。
[0090] 阴性对照：聚乙烯。按每6cm2阴性对照加ImL细胞培养液的比例，在60rpm条件下(37+1)℃浸提(24士2)h。
[0091] 介质对照；不舍试验样品的细胞培养液，处理同试验组。
[0092]
[0093] 2、试验方法
[0094] (1)试验系统：
[0095] 细胞株：小鼠成纤维细胞L929，购自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。试验采用传代48h～72h生长旺盛的细胞。
[0096] MTT溶液：MTT粉末(Sigma，批号：MKBH9792V)用无血清MEM稀释至浓皮为1mg/mL的溶液，经注射过滤器(孔径≤0.22μm)无菌过滤除菌。溶液现用现配，且当天使用。
[0097] 异丙醇：国药集团化学试剂有限公司，20150930在5％CO2，37℃的细胞培养箱中用细胞培养液培养小鼠成纤维细胞(贮存细胞解冻后，要传代2～3次用于试验)。全部试验过程在生物安全柜的无菌环境中进行，试验所用溶液、器皿等均为无菌。
[0098] (2)试验系统的确立：
[0100] (3)试验步骤：
[0101] 收集生长状态良好的L929细胞并用细胞培养液制备细胞悬液，调整细胞浓度为lxl05个细胞/mL，于96孔细胞培养板中加入100μL/孔细胞悬液。置于细胞培养箱(5％CO2，37℃)中孵育24h，形成近融合单层细胞。在显微镜下检查每个板孔，确保各板孔细胞增长相对相等，吸出原培养液，每列各6孔(除外围孔)分别加入100μL试验液，阴性对照液、阳性对照液、介质对照液(加到96孔板的第2列和第11列)。置于细胞培养箱中培养，分别于24h和
48h在显微镜下观察每个扳孔的细胞形态。48h后小心移除培养液，每孔加入50yL MTT溶液，在细胞培养箱中继续培养2h后弃去孔内液体，每孔加入100μL异丙醇，震荡平板后，用酶标仪测定570nm波长下吸光度(参照波长650nm)，按下式计算相对增殖率(％)。
48h在显微镜下观察每个扳孔的细胞形态。48h后小心移除培养液，每孔加入50yL MTT溶液，在细胞培养箱中继续培养2h后弃去孔内液体，每孔加入100μL异丙醇，震荡平板后，用酶标仪测定570nm波长下吸光度(参照波长650nm)，按下式计算相对增殖率(％)。
[0102]
[0103] 式中：
[0104] ODe各供试品组(样品组、阴性对照纽、阳性对照组)吸光度；
[0105] ODb-介质对照组吸光度。
[0106] (4)结果评价：
[0107] 细胞毒性反应分级
[0108]级别 相对增值率
0 ≥100
1 80～99
2 50～79
3 30～49
4 0～29
0 ≥100
1 80～99
2 50～79
3 30～49
4 0～29
[0109] 介质对照ODb平均值如≥0.2，且左、右两列介质对照平均值与全部介质对照平均值相差如不大于15％，则试验符合接受标准。阴性对照组的反应应不大于1级，阳性对照组至少为3级反应。如阴性对照组和阳性对照组反应不成立时应重新试验。
[0110] 3、试验结果：介质对照ODb平蚂值为0.950，左、右两列介质对照平均值与全部介质对照平均值相差为3％，试验符合接受标准。
[0111] 显微镜下观察，24h试验组绝大部分细胞形态正常，少量细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解。阴性对照组绝大部分细胞形态正常，少量细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解。阳性对照组细胞层几乎完全破坏。
[0112] 48h试验组绝大部分细胞形态正常，少量细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解。阴性对照组绝大部分细胞形态正常，少量细胞呈圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒或显示形态学方面的改变；偶见细胞溶解。阳性对照组细胞层几乎完全破坏48h MfT法测定试验结果见下表5。
[0113] 表5细胞毒性试验结果
[0114]
[0115] 4、结论：在本次试验条件下，基于MTT定量测量法，本发明RFM试验液的细胞相对增值率为95％，细胞毒性反应分级为1级。
[0116] 三、迟发型超敏反应试验
[0117] 本次试验依据国家标准GB/T16886.I0-2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》，对试验样品的0.9g％氯化钠注射液(SC)和棉籽油(CSO＞试验液进行了迟发型超敏反应最大剂量试验，以评价试验样品在试验条件下使豚鼠产生皮肤致敏反应的满能。
[0118] 使用SC和CSO对试验样品进行浸提。每种试验液皮内注射井封闭固定于试验组豚鼠背部剃毛区用以诱导皮肤致敏反应；在诱导期后，将试验液浸透的滤纸片封闭固定于试验组动物的腹部剃毛区激发24h。去除滤纸片后24h和48h观察并记录所有动物激发部位皮肤情况，按Magnusson和Kligman分级标准进行描述并分级。对照纽动物同法操作。
[0119] 1、样品制备：
[0120] 浸提介质：0.9％氯化钠注射液(SC.山东华鲁制药有限公司，D17030901，无色)；棉籽油(CSO.ACROS.A0387833，浅黄色)。
[0121] 试验液制备：将A(NBCA)、B(碘化油)以1∶3比例混合，混匀即为RFM混合物，放置2分钟后，取0.15mL样品加20mL浸提介质浸提，控制介质加入速度，使样品凝固成型为宜。试验样品在浸提介质中于(37±1)℃条件下，60rpm振荡浸提(72±2)h制备试验液。每个阶段采用新鲜制备的试验液进行试验。
[0122] 阳性对照：1-氯-2,4-二硝基苯(DNCB，西亚试剂)。为了保证试验步骤的重现性和敏感性，本实验室每6个月做一次阳性对照试验。
[0123] 介质对照：浸提介质(不含有试验样品)以相同的方式制备作为介质对照。
[0124] 其他试剂：弗氏完全佐剂(FCA，SIGMA)；十二烷基硫酸钠(SDS，长东汕头市西陇化工厂)。
[0125]
[0126] 2、试验方法
[0127] 1)试验动物
[0128] 名称：豚鼠；品种：Hartley白化豚鼠；来源：济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20140006；性别雌雄不限，雌性应未产并无孕；体重范围：300--400g；适应时间：至少5天；动物数目：30只；标记方法：苦味酸溶液涂染法。
[0129] 2)试验系统的合理性
[0130] GBfT 16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》指定白化豚鼠作为皮肤致敏实验动物。Hartley白化豚鼠作为皮肤致敏实验动物历史悠久，积累了丰富的试验资料。所以，选用Hartley白化豚鼠作为皮肤致敏实验动物是合理的。
[0131] 3)试验步骤
[0132] 试验前ld，对每只动物编号和称重后，用电剃刀剃去豚鼠背部的毛发，井观察每只动物总体健康状况。
[0133] 皮内诱导阶段：
[0134] 按图6所示(A、B和C)，在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射0.1mL。
[0135] 部位A：注射以50∶50(v/v)FCA/浸提介质混合的稳定性乳化剂。
[0136] 部位B：注射试验样品(未经稀释的试验液)；对照组动物仅注射介质对照。
[0137] 部位C：试验样品(部位B中采用的浓度)以50∶50(v/v)与FCA和浸提介质(50％)配成的
[0138] 稳定性乳化剂混合后进行皮内注射；对照组注射介质对照与FCA配制成的乳化剂。
[0139] 局部诱导阶段：
[0140] 皮内诱导阶段后第8d，将约8ctr12的滤纸片用试验液(部位B中采用的浓度)浸透，覆盖皮内注射点，用胶带封闭固定，在局部敷贴前(24±2)h，试验区川10％的SDS进行预处理，按摩导入皮肤，(48±2)h后去除固定胶带及滤纸片。对照组动物使用介质对照同法操作。
[0141] 激发阶段：
[0142] 局部诱导阶段后13d，用试验液激发全部试验动物。按部位C选定的浓度，将适宜的敷贴片置于试验液中浸透，贴敷于每只动物的腹部剃毛区，用胶带封闭固定，(24±2)h后去除同定胶带及滤纸片。对照组动物使用介质对照同法操作。
[0143] 动物观察：
[0144] 除去滤纸片后(24±2)h和(48±2)h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况及皮肤反应。按Magnusson和Kligman分级标准对每一激发部位和每一观察时间的皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。
[0145] 结果评价
[0146] 按Magnusson和Kligman分级标准(表6)，对照组动物分级小于1，而试验组中分级大于或等于1时一般提示致敏。如对照组动物分级大于成等于1时，试验组动物反应超过对照组中最严重的反应则认为致敏。如为疑似反应，推荐进行再激发以确认首次激发结果。试验结果显示为试验和对照动物中的阳性激发结果的发生率。
[0147] 表6Magnusson和Kligman分级标准
[0148]敷贴试验反应 等级
无明显改变 0
散发性或斑点状红斑 l
中度融合性红斑 2
重度红斑和/或红肿 3
无明显改变 0
散发性或斑点状红斑 l
中度融合性红斑 2
重度红斑和/或红肿 3
[0149] 3、实验结果：
[0150] 症状观察结果：SC试验组和SC对照组动物症状观察结果见表7。CSO试验组和CSO对照组动物症状观察结果见表8。在试验过程中所有动物皮肤反廊外未见异常表现。
[0151] 致敏反应结果：SC试验组和SC对照组激发后皮肤反应结果见表9，CSO试验组和CSO对照组激发后皮肤反应结果见表10。各试验组动物激发部位皮肤未出现红斑和水肿，未观察到明显的致敏反应。
[0152] 表7SC试验组和SC对照组动物症状观察结果
[0153]
[0154] 表8CSO试验组和CSO对照组动物症状观察结果
[0155]
[0156]
[0157] 表9SC试验组和SC对照组激发后皮肤反应结果
[0158]
[0159] 表10CSO试验组和CSO对照组激发后皮肤反应结果
[0160]
[0161] 4、结论：在本次试验条件下，各试验组动物激发部位皮肤未出现红斑和水肿，按Magnusson和Kligman分级标准，等级小于1。试验结果表明，在本试验条件下，本发明RFM试验液未导致豚鼠出现皮肤致敏反应。
[0162] 四、内皮反应实验
[0163] 采用家兔进行皮内反应试验，以评价试验样品在试验条件下产生刺激反应的潜能。本次试验是根据国家标准GB/T 16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》的规定进行的。
[0164] 采用0.9％氯化钠注射液(SC)和棉籽油(CSO)对试验样品进行浸提，并同法制备不加试验样品的溶剂对照液。在家兔脊椎两侧皮内注射试验液及对照液，于注射后(24士2)h、(48+2)h和(72土2)h，对注射部位红斑和水肿进行评分，并计算试验样品和对应溶剂对照的皮内反应平均记分之差。
[0165] 1、样品制备
[0166] 浸捉介质：0.9％氯化钠注射液(sc，山东华鲁制药有限公司，D17030901，无色；棉籽油(cso，ACROS，A0394328，浅黄色。
[0167] 试验液制备：将A(NBCA)、B(碘化油)以1∶3比例混合，混匀即为RFM混合物，放置2分钟后，取0.15mL样品加20mL浸提介质浸提，控制介质加入速度，使样品凝固成型为宜。取0.15mL的试验样品在20.0mL SC浸提介质中制各；取0.15mL的试验样品在20.0mL CSO浸提介质中制备。试验样品在浸提介质中于(37±1)℃条件下，60rpm振荡浸提(72土2)h制备试验液。
[0168] 溶剂对照：浸提介质(不合试验样品)以相同的方式制备作为溶剂对照。
[0169]
[0170] 2、试验方法
[0171] (1)试验动物
[0172] 名称：家兔；品种：新西兰白兔；来源：济南金丰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20140006；性别：本试验对此无特殊要求；体重范围：不低于2kg；年龄：初成年；适应时期：至少5d；动物数目：2只；鉴定方法：笼签法。
[0173] (2)试验系统的合理性
[0174] 家兔的皮内反应试验在GB/T 16886.10-2005中已提到，证实该方法是目前最为灵敏的方法，已广泛应用于医疗器械，材料的皮内反应评价。
[0175] (3)实验步骤：
[0176] 家兔于试验前4h～18h称重，彻底除去背部脊柱两侧足够面积的被毛，作为试验和观察部位。
[0177] 在每只家兔脊椎右侧去毛区前5个点(见图7)皮内备注射0.2mL CSO试验液；右侧后5个点(见图7)皮内注射CSO对照液，在同一只家兔脊椎左侧去毛区前5个点(见图7)皮内注射0.2mL SC试验液；左侧后5个点(见图7)皮内注射0.2mLSC对照液。
[0178] 照射后立即观察注射点即使反应，并于注射后(24士2)h、(48士2)h、(72士2)h观察并记录注射点红斑和水肿反应记分。记分从0到4，注射点的其他反应也一并记录，按下表标准(表11)进行评分：
[0179] 表11评分标准
[0180]
[0181] (4)结果评价
[0182] 在72h评分厅，分别将每一试验样品和溶剂对照的全部红斑与水肿记分相加，再除以12[2(动物数)×3(观察期)×2(记分类型)]计算出每一试验样品和每一对应溶剂对照的综合平均记分。如试验样品和溶剂对照平均记分之差不大于1.0，则符合试验要求。在任何观察期，如果试验样品一般反应疑似大于溶剂对照反应，应另取家兔重新进行试验，试验样品最终记分之差不大于1.0则符合试验要求。
[0183] 3、实验结果：
[0184] (1)SC组数据(如表12)：
[0185] 表12SC组数据
[0186]
[0187]
[0188] 注：ER：红斑；ED：水肿
[0189] SC试验组综合平均记分＝(0+0)/12＝0.0
[0190] SC对照组综合平均记分＝(0+0)/12＝0.0
[0191] SC试验组最终记分之差＝0.0
[0192] (2)CSO组数据(如表13)：
[0193] 表13CSO组数据
[0194]
[0195]
[0196] 注：ER：红斑；ED：水肿
[0197] CSO试验组综合平均记分＝(0+0)/12＝0.0
[0198] CSO对照组综合平均记分＝(0+0)/12＝0.0
[0199] CSO试验组最终记分之差＝0.0
[0200] 4、结论：在本次试验条件下，本发明RFM9.9％氯化钠注射液(SC)和棉籽油(CSO)试验液的家兔内皮反应最终记分之差均不大于1.0，符合实验要求。
[0201] 综上所述，通过根据GB/T16886相关规定及方法，进行四项生物相容性检测，四项检测结果显示，无论是经皮，经腹腔还是经静脉，试验动物均对混合材料耐受，未出现死亡或严重副作用出现，生物相容性检测证明本材料通过急性毒性反应，迟发型超敏反应，细胞毒试验及皮下试验反应。
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