ADAM12m作为肿瘤标记物和靶分子在肿瘤诊断和治疗中的应用
阅读：59发布：2020-05-15
专利汇可以提供ADAM12m作为肿瘤标记物和靶分子在肿瘤诊断和治疗中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及ADAM12m作为 肿瘤 标记物 和靶分子在肿瘤诊断和 治疗 中的应用。ADAM12m作为肿瘤侵袭转移的标志，参与肿瘤的生长、侵袭转移过程，因此可以作为癌症诊断和/或治疗中的靶点，用于筛选抗肿瘤侵袭转移药物。，下面是ADAM12m作为肿瘤标记物和靶分子在肿瘤诊断和治疗中的应用专利的具体信息内容。
1.细胞膜蛋白形式的ADAM12m蛋白在制备诊断肿瘤药物中的用途。
2.与ADAM12m蛋白结合的物质在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的与ADAM12m蛋白结合的物质能够抑制肿瘤细胞侵袭和转移。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述的与ADAM12m蛋白结合的物质是抗ADAM12m蛋白的单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述的与ADAM12m蛋白结合的物质是靶向ADAM12m蛋白的shRNA。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用途，其中所述肿瘤为食管癌。
7.抗ADAM12m蛋白的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，其特征为该抗体抑制肿瘤的侵袭转移。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述肿瘤为食管癌。
9.用于诊断或治疗肿瘤的药物组合物，其包含抗ADAM12m蛋白的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
ADAM12m作为肿瘤标记物和靶分子在肿瘤诊断和治疗中的
应用
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤侵袭、转移靶蛋白和靶向药物。具体的说，本发明涉及一种新的肿瘤侵袭、转移的靶向蛋白ADAM12m以及其在筛选和/或制备用于治疗和诊断肿瘤侵袭转移的药物中的用途。本发明还涉及该蛋白的特异性抗体及其应用。
背景技术
[0002] 肿瘤是人类最常见的疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。在我国随着社会的发展，肿瘤的发病率还在逐年上升。我国目前有癌症患者约450万人，死亡率在30％以上，而且每年新增的患者人数高达200万人以上。有效地医治癌症已是科学研究中的当务之急。肿瘤治疗失败的关键因素是肿瘤组织对临近组织的侵袭和远端组织转移。因此治疗肿瘤的核心问题是抑制肿瘤的局部侵袭和远端转移。临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗，但是对于肿瘤的局部侵袭和远端转移，这些治疗方法疗效不佳；而且，放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。因此，目前治疗恶性肿瘤的手术，放疗，化疗三大常规治疗手段并不能明显地降低肿瘤的死亡率，其5年生存率仍然仅达 。因此全世界各国均在始终不懈的探索，力图寻找出更有效抑制肿瘤侵袭转移的治疗手段。随着对肿瘤侵袭转移研究的不断深入，人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤侵袭转移发展进程中的不同层面进行治疗并且已经取得了一定效果，靶向肿瘤侵袭转移的生物靶向治疗将是最有前景和最活跃的领域。
[0003] 癌症的靶向治疗很重要，“靶向”是癌症治疗中必须遵守的原则，高效、准确地命中癌症这个“靶”，实现有的放矢是癌症治疗的关键所在。因此，找到高效、特异的侵袭转移相关靶点是靶向治疗肿瘤的关键。目前，已经公开报道了一些肿瘤侵袭转移治疗靶点，它们参与或者调控了肿瘤的侵袭转移过程，并且针对所述靶点也设计了一些新的药物，例如针对HER2分子的抗体类乳腺癌、肺癌转移的靶向药物Herceptin，针对VEGF分子的抗体类结肠癌转移的靶向药物Avastin。但是，目前开发的抗肿瘤侵袭转移药物对临床的需要来说仍然是远远不够的，因此仍然亟需发展更多的抗体类抗肿瘤侵袭转移药物。
[0004] 根据业界已有的经验，肿瘤的治疗靶点需要具备以下特点：
[0005] (1)在肿瘤细胞中表达明显高于正常细胞；
[0006] (2)其表达方式与亚细胞定位易于抗肿瘤药物与其结合，如位于细胞膜表面；
[0007] (3)肿瘤药物通过适当的方式进入人体后，肿瘤药物能选择性的结合肿瘤靶位，产生抗肿瘤作用，如抑制肿瘤生长或转移；
[0008] (4)抗肿瘤药物即使与正常细胞内少量的靶点结合也没有明显的副作用；
[0009] (5)如果是位于肿瘤细胞的靶点，其在肿瘤病人血清中的含量不能太高。
[0010] 现有技术中，ADAM12m为单次跨膜蛋白，是ADAM12的膜型剪接变异体。
[0011] ADAM12在大多数成体组织中低表达，但是在多数肿瘤组织中上调，如恶性胶质瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌，而且ADAM12m是肿瘤组织主要的上调ADAM12m剪接形式。人们发现，ADAM12m在肿瘤组织上调，参与肿瘤的增殖、凋亡，但目前没有该蛋白在肿瘤靶标方面的研究。而本发明人发现，ADAM12m可以作为肿瘤侵袭、淋巴结转移、独立的预后标志，并且参与了肿瘤的侵袭转移过程，抑制该蛋白的功能能够抑制肿瘤的侵袭转移。
[0012] 本领域技术人员理解，筛选抗肿瘤侵袭转移靶向药物的关键是药物筛选用什么蛋白作为靶标蛋白。不管是要获得模拟或是拮抗该靶标蛋白的靶向药物，均需使用该蛋白作为筛选工具，获得与该蛋白特异高度亲和的药物，如单抗、多肽或者小分子化合物等肿瘤靶向药物。因此，只要知道了靶标蛋白就能较容易的设计出如何得到针对该蛋白的靶向药物。而靶向药物的功能实际是由该靶标蛋白决定的。正如“开发小肽，筛选新药”(王克夷等，中国生化药物杂志2003年第24卷第1期，48-50页)一文中结尾处所说：“如果有了更多的生物分子作为筛选药物的靶标，就能够很容易得到先导药物”。而针对先导药物进一步优化得到临床可用的药物的方法也是业内公知的。因此抗肿瘤靶向新药的开发，关键在于靶标。
本发明人恰恰发现了侵袭转移相关细胞膜蛋白靶标ADAM12m。
本发明人恰恰发现了侵袭转移相关细胞膜蛋白靶标ADAM12m。
[0013] 本领域技术人员可以采用现有技术的方法得到ADAM12m，进一步结合本发明的技术方案作为肿瘤标记物和靶分子来使用。
发明内容
[0014] 本发明基于以下新发现：ADAM12m作为肿瘤侵袭转移的标志，参与肿瘤的生长、侵袭转移过程，因此可以作为癌症诊断和/或治疗中的靶点，用于筛选抗肿瘤侵袭转移药物。
[0015] 在一个方面，本发明涉及细胞膜蛋白形式的ADAM12m作为肿瘤标记物在筛选抗肿瘤侵袭转移药物中的应用。
[0016] 在另一个方面，本发明涉及细胞膜ADAM12m蛋白的制备，例如可通过重组方法进行制备。在一个优选的实施方案中，细胞膜ADAM12m蛋白通过如下方法制备并纯化：
[0017] (1)构建ADAM12m基因的cDNA的表达序列；
[0018] (2)将所述cDNA克隆入表达载体，并将所述表达载体转入原核细胞或真核细胞中；
[0019] (3)使ADAM12m蛋白在所述的宿主细胞中表达；
[0020] (4)纯化所表达的ADAM12m蛋白。
[0021] 其中，所述表达载体优选PET-30b载体或其它真核载体。所述宿主细胞是本领域常用的原核或真核宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如BL21E3细菌，中国仓鼠卵巢癌细胞CHO。所述的克隆以及纯化方法可采用本领域常规的方法，例如参见实施例1。
[0022] 根据本发明的一个方面，细胞膜ADAM12m蛋白可作为新的肿瘤侵袭转移诊断和/或治疗靶点。
[0023] 一个实施方案中，利用本发明的细胞膜ADAM12m蛋白作为肿瘤靶蛋白筛选用于治疗肿瘤的药物。所述的筛选得到的抗肿瘤药物可以是例如单克隆抗体，或者与ADAM12m蛋白结合的其它类型的分子，如多肽或其它小分子药物等。此外，可以将一些治疗性物质偶联于与细胞膜ADAM12m蛋白具有高亲和力的靶向药物上以达到治疗的效果，如将放射性核素偶联于抗ADAM12m蛋白单克隆抗体上。所述的筛选方法是本领域技术人员已知的，例如参见“开发小肽，筛选新药”，王克夷等，中国生化药物杂志2003年第24卷第1期，48-50页；“噬菌体随机肽库的应用”，免疫学杂志2000年第5期第16卷，李华朱锡华等；“小分子活性肽筛选方法”，《生命的化学》2004年24卷1期，第16-18页，罗以勤，王梁华，焦炳华等。
[0024] 本发明的另一个方面提供了利用所述细胞膜ADAM12m蛋白制备的靶向ADAM12m蛋白治疗肿瘤的抗体，其中所述抗体优选是单克隆抗体。所述的单克隆抗体可用于治疗肿瘤。在一个实施方案中，所述的单克隆抗体的制备和纯化包括如下步骤：
[0025] (1)用通过本发明所述方法制备并纯化的ADAM12m蛋白免疫动物，获得免疫血清；
[0026] (2)利用间接ELISA测定免疫血清中抗ADAM12m蛋白抗体的滴度；
[0027] (3)收集其中所述抗体的滴度达到108以上的免疫血清；
[0028] (4)通过亲和层析法纯化所得的免疫血清。
[0030] 本发明的另一个方面涉及用于治疗肿瘤的药物组合物，所述组合物包含药学上有效量的抗ADAM12m蛋白单克隆抗体及其它治疗性药物，从而提高治疗效果。其可体现为使得达到相同的治疗效果所用的ADAM12m蛋白单克隆抗体或其它治疗性药物的剂量更少或ADAM12m蛋白单克隆抗体与其它治疗性药物组合后可以得到更好的肿瘤抑制效果。在一个优选实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗食管癌。根据业内公知的规律，本发明所述的组合物还可以用于其它高表达ADAM12m蛋白肿瘤的治疗，包括：卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌，肺癌、子宫癌、前列腺癌、脑癌、胸腺癌、胃肠道肿瘤等。所述组合物可以通过常规给药途径给予受试者。所述的给药途径例如经胃肠外给药，例如经静脉、经输注、口服等。附图说明
[0031] 图1显示用ADAM12m蛋白多抗免疫组化检测食管癌组织芯片中ADAM12m蛋白表达情况
[0032] 图2显示用ADAM12m蛋白多抗免疫组化检测ADAM12m蛋白在人食管癌旁正常、食管癌组织、食管癌侵袭前缘、淋巴结转移灶的表达情况
[0033] 图3显示用ADAM12m蛋白多抗免疫荧光检测ADAM12m蛋白在人食管癌细胞系EC9706-P4的表达情况
[0034] 图4显示采用ADAM12m蛋白多抗免疫荧光共聚焦检测在人食管癌细胞系EC9706外源性表达ADAM12m的分布情况
[0035] 图5显示用ADAM12m蛋白多抗免疫沉淀-细胞膜生物素化分析ADAM12m在质膜上的分布情况
[0036] 图6显示采用ADAM12m shRNA抑制食管癌细胞侵袭和体内转移。
[0037] 图7显示采用ADAM12m抗体抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移
[0038] 图8显示采用ADAM12m的功能肽段抑制肿瘤细胞侵袭
具体实施方式
[0039] 实施例1肿瘤抗原的制备
[0040] 按照现有技术，克隆ADAM12m基因的cDNA编码序列，构建在表达载体PET-30b上，在原核细胞中表达ADAM12m蛋白。
[0041] 表达得到的ADAM12m蛋白氨基酸序列为：
[0042] H2N-MAARPLPVSPARALLLALAGALLAPCEARGVSLWNQGRADEVVSASVGSGDLWIPVKSFDSKNHPEVLNIRLQRESKELIINLERNEGLIASSFTETHYLQDGTDVSLARNYTVILGHCYYHGHVRGYSDSAVSLSTCSGLRGLIVFENESYVLEPMKSATNRYKLFPAKKLKSVRGSCGSHHNTPNLAAKNVFPPPSQTWARRHKRETLKATKYVELVIVADNREFQRQGKDLEKVKQRLIEIANHVDKFYRPLNIRIVLVGVEVWNDMDKCSVSQDPFTSLHEFLDWRKMKLLPRKSHDNAQLVSGVYFQGTTIGMAPIMSMCTADQSGGIVMDHSDNPLGAAVTLAHELGHNFGMNHDTLDRGCSCQMAVEKGGCIMNASTGYPFPMVFSSCSRKDLETSLEKGMGVCLFNLPEVRESFGGQKCGNRFVEEGEECDCGEPEECMNRCCNATTCTLKPDAVCAHGLCCEDCQLKPAGTACRDSSNSCDLPEFCTGASPHCPANVYLHDGHSCQDVDGYCYNGICQTHEQQCVTLWGPGAKPAPGICFERVNSAGDPYGNCGKVSKSSFAKCEMRDAKCGKIQCQGGASRPVIGTNAVSIETNIPLQQGGRILCRGTHVYLGDDMPDPGLVLAGTKCADGKICLNRQCQNISVFGVHECAMQCHGRGVCNNRKNCHCEAHWAPPFCDKFGFGGSTDSGPIRQADNQGLTIGILVTILCLLAAGFVVYLKRKTLIRLLFTNKKTTIEKLRCVRPSRPPRGFQPCQAHLGHLGKGLMRKPPDSYPPKDNPRRLLQCQNVDISRPLNGLNVPQPQSTQRVLPPLHRAPRAPSVPARPLPAKPALRQAQGTCKPNPPQKPLPADPLARTTRLTHALARTPGQWETGLRLAPLRPAPQYPHQVPRSTHTAYIK-COOH。
[0043] 实施例2ADAM12m蛋白多克隆抗体的制备
[0044] 本研究采用实施例1中表达的ADAM12m蛋白免疫家兔制备抗ADAM12m蛋白多克隆抗体。取免疫前血清：免疫前自兔耳缘静脉取血备检，第一次免疫：ADAM12m蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1的比例充分混匀后经皮内注射免疫家兔，每只200μg383多肽KLH偶联物。第二次免疫：第一次免疫后14d，取200μg ADAM12m蛋白与弗氏不完全佐剂充分混匀后再次经皮内注射免疫家兔。注射卡介苗：第二次免疫后5d，按每只兔子50mg卡介苗的剂量经趾皮下多点注射免疫家兔。第三次免疫：自注射卡介苗之日算起10d后，按每只兔子200μgADAM12m蛋白的剂量与弗氏不完全佐剂充分混匀后经腘窝淋巴结注射免疫家兔。效价测定：第三次免疫后10d自兔耳缘静脉取血，以测定免疫血清的抗体滴度。当免疫血清中目标抗体的滴度达到108以上时，自兔颈动脉取血，并置于直径为180mm的干净平皿中，
4℃过夜。次日，离心分离血清.由于获得的免疫血清中还含有大量的针对其它抗原的免疫球蛋白，直接用免疫血清进行免疫组化等研究将产生非特异性反应，影响对结果的判断，因此我们用偶联有ADAM12m蛋白的亲和层析柱纯化了得到的免疫兔血清，从中分离出只与ADAM12m蛋白结合的抗体。
4℃过夜。次日，离心分离血清.由于获得的免疫血清中还含有大量的针对其它抗原的免疫球蛋白，直接用免疫血清进行免疫组化等研究将产生非特异性反应，影响对结果的判断，因此我们用偶联有ADAM12m蛋白的亲和层析柱纯化了得到的免疫兔血清，从中分离出只与ADAM12m蛋白结合的抗体。
[0045] 实施例3ADAM12m蛋白在肿瘤组织中的表达升高(组织芯片分析)
[0046] 石蜡包埋的食管癌组织制备组织芯片，进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。3％过氧化氢室温10min，阻断内源性过氧化物酶的活性。切片在枸橼酸缓冲液(0.01M，pH6.0)中用微波加热法进行抗原修复。用10％正常山羊血清室温封闭30min。弃封闭液，加入1ug/ml的抗ADAM12m蛋白多克隆抗体，4℃孵育过夜。然后用PBS洗3遍，每遍5min。加入适当浓度生物素标记的羊抗兔二抗室温孵育30min。然后PBS洗3遍，每遍5min，加入HRP标记的链霉卵白素，室温孵育30min。DAB染色，苏木素复染，封片，显微镜下观察结果。在食管癌组织芯片中染色如图所示(图1)，ADAM12m蛋白的表达明显高于对应的正常组织。而且ADAM12m在肿瘤中的表达与肿瘤侵袭深度(T)、淋巴结转移(N)和病理分期显著正相关(表1)。
[0047] 表1在109例食管癌组织芯片中ADAM12m表达与食管癌临床病理特征的相关性[0048]
[0049]
[0050] *统计学分析采用χ2检验
[0051] 实施例4ADAM12m蛋白伴随肿瘤的侵袭转移升高
[0052] 我们用纯化的ADAM12m蛋白多克隆抗体检测了ADAM12m基因在食管癌正常、食管癌组织(中心、前缘)和转移淋巴结中的表达情况。如图2所示，正常组织中，ADAM12m在癌旁正常上皮弱表达(1.82％，1/55≥level 2)，与肿瘤中心相比(16.33％，16/98≥level2)，ADAM12m在肿瘤侵袭前缘(44.90％，44/98≥level 2)和配对的转移淋巴结(56.12％，
55/98≥level 2)显著上调表达。而且，44.9％(44/98)的淋巴结转移灶与肿瘤侵袭前缘相比，ADAM12m仍显著上调。而且ADAM12m在肿瘤中的表达与T分期和临床分期显著相关。
55/98≥level 2)显著上调表达。而且，44.9％(44/98)的淋巴结转移灶与肿瘤侵袭前缘相比，ADAM12m仍显著上调。而且ADAM12m在肿瘤中的表达与T分期和临床分期显著相关。
[0053] 实施例5免疫荧光检测ADAM12m蛋白在肿瘤细胞系表达情况
[0054] 应用ADAM12m蛋白多肽抗体检测了肿瘤细胞中ADAM12m基因表达在不同的基质培养时的亚细胞定位。我们采用免疫荧光研究了ADAM12m蛋白在不同的基质上的表达情况。通过上述实验，如图3所示，发明人发现，ADAM12m蛋白在基质中培养时上调表达，并表现为点状聚集表达。
[0055] 实施例6采用ADAM12m蛋白多抗免疫荧光共聚焦检测在人食管癌细胞系EC9706外源性表达ADAM12m的分布情况
[0056] EC9706或者KYSE150细胞转染野生型(WT)或者胞内端缺失(ΔCyt)ADAM12m质粒后，采用标签抗体9E10(c-Myc标签抗体)检测外源性ADAM12m表达的定位。如图4所示，发明人发现，野生型ADAM12m(WT)表现为典型的点状聚集表达，胞内端缺失ADAM12m(ΔCyt)表达表现为弥散性表达。
[0057] 实施例7ADAM12m蛋白多抗免疫沉淀-细胞膜生物素化分析ADAM12m在质膜上的分布情况
[0058] 按照如下实施细则分析内源性表达ADAM12m蛋白可以定位到细胞质膜，而且ADAM12m蛋白主要定位于细胞基质接触面。EC9706细胞转染野生型(WT)或者胞内端缺失(ΔCyt)ADAM12m质粒后或者EC9706-P4细胞，接种于Matrigel包被的平板后，进行生物素化分析。全细胞表面生物素化时，当细胞生长至70％饱和密度收获，倒去培养液，4℃PBS洗三次；在4℃PBS中刮下细胞，加入EZ-LinkNHS-LC-Biotin，终浓度为2-5mM；冰上反应颠倒混匀反应30min；4℃PBS洗三次，加入蛋白质裂解液提取蛋白。细胞顶层膜表面生物素化时，细胞生长至70％饱和密度收获，倒去培养液，4℃PBS洗三次；加入EZ-Link NHS-LC-Biotin，终浓度为2-5mM；冰上反应颠倒混匀反应30min；4℃PBS洗三次，加入蛋白质裂解液提取蛋白。生物素化蛋白免疫沉淀时，提取全细胞表面生物素化、细胞顶层膜表面生物素化。在细胞总蛋白裂解液中加入Protein G偶联Sepharose，4℃预清除3小时。
12,000转/分离心15分钟后，将上清转移到一个新的离心管中，加入ADAM12m兔多抗，4℃孵育过夜。蛋白裂解液小心地洗沉淀3～5次。加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟，离心取上清，进行Westernblotting分析，采用HRP-Avdin检测生物素标记的ADAM12m蛋白。
如图5所示，EC9706-P4细胞表达的ADAM12m蛋白定位到细胞质膜，而且外源性表达的WT型ADAM12m主要定位到细胞与基质接触面，而ΔCyt型ADAM12m则表现为整个细胞膜均有分布。
12,000转/分离心15分钟后，将上清转移到一个新的离心管中，加入ADAM12m兔多抗，4℃孵育过夜。蛋白裂解液小心地洗沉淀3～5次。加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸5分钟，离心取上清，进行Westernblotting分析，采用HRP-Avdin检测生物素标记的ADAM12m蛋白。
如图5所示，EC9706-P4细胞表达的ADAM12m蛋白定位到细胞质膜，而且外源性表达的WT型ADAM12m主要定位到细胞与基质接触面，而ΔCyt型ADAM12m则表现为整个细胞膜均有分布。
[0059] 实施例8采用ADAM12m shRNA抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移
[0060] 采用靶向ADAM12m的两条shRNA序列：
[0061] Sh1#(5’-CTCGCTGCAAAGAATGTGT-3’)和
[0062] Sh2#(5’-GACCTTGATACGACTGCTGTT-3’)构建shRNA质粒，转染肿瘤细胞均能够显著抑制ADAM12m的表达。ADAM12m shRNA转染肿瘤细胞侵袭能力的影响时，采用Sh1#或者Sh2#转染肿瘤细胞72h后，消化细胞重悬于含0.1％FBS的RPMI 1640，接种于50ugMatrigel包被的Matrigel中，采用600μl10％FBS的RPMI 1640培养基加入Transwell下室趋化24h。随后，取出上室，用棉球蘸PBS擦去上室肿瘤细胞，采用甲醇和丙酮等体积混合配成固定液，固定20分钟，将膜取下后，采用2ug/ml DAPI 50％PBS/甘油将膜封片，100倍荧光显微镜镜检拍照计数穿过Transwell膜的细胞。ADAM12m的两条如图6A所示，shRNA序列(Sh1#、Sh2#)均显著抑制肿瘤细胞侵袭约50％。
[0063] 评价ADAM12m敲降对于肿瘤细胞体内转移地影响时，挑取稳定敲降的单克隆细6
胞，扩增后以1×10 细胞/0.2ml PBS接种于每只裸鼠后背部右侧皮下，每组16只。实验分为转移观察和生存期观察两批。一批50天后处死，解剖观察各脏器转移情况，取肺组织拍照，Bouin′s液固定后进行石蜡包埋切片。另一批饲养至衰竭死亡，死亡后立即解剖，确定其死因是否为肿瘤转移。采用SPSS软件分析生存期。转移分析时如图6B所示，shRNA序列(Sh1#、Sh2#)均显著抑制肿瘤细胞侵袭约50％。而且，敲降ADAM12m能够显著延长荷瘤小鼠的生存期(89.5d和75d vs 105d和102.5d，log rank P＝0.0137，图6C)。
胞，扩增后以1×10 细胞/0.2ml PBS接种于每只裸鼠后背部右侧皮下，每组16只。实验分为转移观察和生存期观察两批。一批50天后处死，解剖观察各脏器转移情况，取肺组织拍照，Bouin′s液固定后进行石蜡包埋切片。另一批饲养至衰竭死亡，死亡后立即解剖，确定其死因是否为肿瘤转移。采用SPSS软件分析生存期。转移分析时如图6B所示，shRNA序列(Sh1#、Sh2#)均显著抑制肿瘤细胞侵袭约50％。而且，敲降ADAM12m能够显著延长荷瘤小鼠的生存期(89.5d和75d vs 105d和102.5d，log rank P＝0.0137，图6C)。
[0064] 实施例9采用ADAM12m抗体抑制肿瘤细胞侵袭和体内转移
[0065] 评价ADAM12m抗体对于肿瘤细胞侵袭和体内转移时采用抗原亲和纯化的兔多抗。分析体外肿瘤细胞侵袭时，兔多抗加入到Transwell上层小室和下层小室中，24小时后，刮去上层细胞后，分析穿过小室的肿瘤细胞。ADAM12m兔多抗在25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、
200ug/ml的浓度时，相对于正常兔多抗对照的抑制率分别为8.65％、17.72％、28.19％、
46％(图7A)。
200ug/ml的浓度时，相对于正常兔多抗对照的抑制率分别为8.65％、17.72％、28.19％、
46％(图7A)。
[0066] 评价ADAM12m抗体对于肿瘤细胞体内生长转移的影响时，肿瘤细胞以6
1×10/0.2ml PBS接种于每只裸鼠后背部右侧皮下，每组6只。肿瘤细胞接种后第二天，抗体以50μg、100μg、200μg只/次的量腹腔注射至荷瘤小鼠，其后每周两次治疗，连续治疗直到实验结束。实验结果表明，抗体在100μg、200μg只/次的量治疗时，均显著抑制肿瘤生长(图7B)。50天后，分析抗体治疗对荷瘤小鼠转移的影响。50μg、100μg、200μg只/次的抗体治疗量对于肺转移的抑制率分别为12.50％、39.10％、51.92％(图7C)。
1×10/0.2ml PBS接种于每只裸鼠后背部右侧皮下，每组6只。肿瘤细胞接种后第二天，抗体以50μg、100μg、200μg只/次的量腹腔注射至荷瘤小鼠，其后每周两次治疗，连续治疗直到实验结束。实验结果表明，抗体在100μg、200μg只/次的量治疗时，均显著抑制肿瘤生长(图7B)。50天后，分析抗体治疗对荷瘤小鼠转移的影响。50μg、100μg、200μg只/次的抗体治疗量对于肺转移的抑制率分别为12.50％、39.10％、51.92％(图7C)。
[0067] 实施例10采用ADAM12m的功能肽段抑制肿瘤细胞侵袭
[0068] 本发明人发现采用ADAM12m的兔多抗可以显著抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。随后，我们评价一个功能肽段对于肿瘤细胞的侵袭的影响。EC9706细胞转染野生型(WT)或者胞内端缺失(ΔCyt)ADAM12m以及对照质粒(Vector)后，接种Transwell。肽段1(peptide1：CSRKDLETSLEKGMGV)和肽段1(peptide 2：REFQRQGKDLEKVKQR)以200μg/ml的浓度加入到Transwell小室的上层和下层中，24h后分析肽段对肿瘤细胞侵袭的影响。结果如图8所示，功能性肽段1(peptide 1)能够显著抑制ADAM12m介导的迁移和侵袭。
[0069] 实施例11ADAM12m蛋白单克隆抗体的制备
[0070] 本发明也可以采用其他的现有技术的方法制备ADAM12m蛋白单克隆抗体，而本实施例采用实施例1得到100μg人肿瘤抗原蛋白，混合完全福氏佐剂皮下免疫BALB/C小鼠(5-6周龄的雌性BALB/c裸小鼠(nu/nu)，购于维通利华生物公司，清洁饲养于中国协和医科大学实验动物研究所)，4周后采用50μg抗原蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50μg抗原蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫。10天6
后，利用间接ELISA法测定免疫血清抗体滴度，测定所述抗体的效价＞1∶10。处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50％的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养基对杂交瘤细胞进行筛选培养。培养
1周后采用人肿瘤抗原蛋白包被的ELISA进行筛选，对阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，从而获得了稳定分泌抗ADAM12m单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。
后，利用间接ELISA法测定免疫血清抗体滴度，测定所述抗体的效价＞1∶10。处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50％的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养基对杂交瘤细胞进行筛选培养。培养
1周后采用人肿瘤抗原蛋白包被的ELISA进行筛选，对阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，从而获得了稳定分泌抗ADAM12m单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。
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