本发明的实施方案通常针对生物学和药学。特别地，本发明针对 联合使用AAVP和成像给受试者提供治疗的基因治疗领域。

许多生物学疗法的一个限制是不能将生物活性分子可控地并且有 效地运输到胂瘤细胞或其周围基质中。进行基因疗法的目标是将生物 产物（作为基因表达的结果）有效地递送到其在细胞中的作用位点。 基因疗法还能通过在转移的遗传物质中加入特异性启动子/激活子元 件，对这些生物活性产物发挥作用的水平、时间和持续时间进行控制， 来产生更有效的治疗干涉。正在开发使用DNA新剂型向多种体细胞组 织和肿瘤可控地运输基因的方法，以及使用细胞特异性的、复制激活 的和药物控制的表达系统控制基因表达的方法。
一种方式是，基因治疗尝试以特殊的方式靶向细胞。因此，治疗 基因以某种方式被连接到乾向分子上，来运输该基因到靶细胞或组织
中。典型的，目前的方法涉及连上一种靶向分子，例如识别针对棵DNA 或含有所需基因的哺乳动物细胞病毒的内化受体的配基或抗体。当使
用棵DNA时，必须将其在体外凝缩为紧密几何形状来进入细胞。通常 使用多聚阳离子，例如多聚赖氨酸，来中和DNA上的电荷并将其凝缩 为超环面结构。但是，人们对这种凝缩过程还不清楚，并且难以控制，因此，导致同质基因治疗药物的制备极为困难。
偶尔试图使用噬菌体，例如X和丝状噬菌体，来转移DNA进入哺 乳动物细胞。总体上，已经发现入的转导是相对罕见事件，并且报告 基因的表达微弱。在试图增强转导效率的努力中，结合使用了入和采 用磷酸钓或脂质体（不特异性靶向细胞表面受体）的方法。已经观察 到使用磷酸钙共沉淀基因通过入噬菌体进行了转移，或者使用二乙氨 基乙基葡聚糖(DEAE-dextran)或脂多胺(1 ipopolyamine )，基因通 过丝状噬菌体进行了转移。但是，这些将DNA引入哺乳动物细胞的方
法不能用于基因治疗的实践应用中，因为转染效率有可能是较低的、 非特异性的，并且转染不仅是麻烦的，并且对于不同的细胞类型是杂乱的。
目前，真核病毒无疑地提供了更好的转基因运输和转导（Kootstra 和Verma， 2003; Machida, 2003 ),但是这种载体的配基定向靶向通 常需要去除其对细胞膜受体的天然趋向性（Miller等人，2003; Mizuguchi和Hayakawa, 2004; White等人，2004 )。相反，通常认 为原核病毒，例如噬菌体，不是哺乳动物细胞转导的良好载体。但是， 尽管其作为"真核"病毒具有内在缺陷，但是噬菌体颗粒对哺乳动物 细胞没有趋向性(Zacher等人，1980; Barrow和Soothill, 1997; Barbas等人，2001 )，并且尽管效率低但是已被用于这些细胞的转导 中（Ivanenkov等人，1999; Larocca等人，1999; Poul和Marks, 1999; Piersanti等人，2004)。
因此，需要更可靠的将载体靶向到特定细胞（或受体）的方法， 以及能够确保基因的运输和表达达到治疗有效程度的方法，这样才能 使载体用于治疗应用中。
发明概述
本发明的实施方案通常针对以位点特异性方式运输一种或多种转 基因到靼细胞来增强表达的组合物和方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞，
以及针对用于该用途的组分和组合物。在某些方面，在对受试者进行
治疗或诊断程序之前，可以对治疗性核酸的表达进行估定。在进一步的方面，对在需要治疗收益的区域或位置中的表达进行测定或估定， 并且可以停止任何非必须的或边际收益疗法，来代替替代疗法。
不受任何特定理论或机制所约束的，本公开基于了如下观察：当 一个以上的多重转基因被整合到基因組中时，转基因表达有可能增加。 让人特别感兴趣的是嵌合AAVP颗粒向细胞转导一个拷贝以上的转基 因（通常以串联体形式）的能力。还可以通过嵌合AAVP颗粒所携带的 报告基因的表达来监测转导细胞。在本公开中可以包括任何转基因， 并可以从AAVP颗粒中表达。
本发明的特定实施方案包括用于检测转移到受试者靶组织中的基 因和/或在受试者靶组织中表达的基因的方法和组合物，包括如下的一 个或多个步骤：
(a) 在本方法中可能使用的一个步骤，包括向受试者靶组织中运 输含有报告基因（可以是在宿主受试者中天然存在或非天然存在的） 的AAVP载体。典型的，该报告基因不会在待成像区域和/或待处理区 域内表达。在某些方面，该报告基因是一种野生的、突变的、或遗传 工程改造过的激酶。在进一步的方面，该激酶是胸苷激酶。在更进一 步的方面，该激酶是单纯疱療病毒-胸苷激酶基因或2型人胸苷激酶。 典型的，转移载体或AAVP被引入到靶组织中的细胞中，并且报告基因 在靶组织中的细胞中表达，因此产生只在被AAVP载体有效转染的细胞 中积累的报告基因产物（蛋白质）。
(b) 可以使用的另一个步骤是，向宿主受试者中给予标记的报告 底物，表达报告基因产物的细胞代谢该标记的报告底物，产生标记的 报告代谢产物，其中所述的标记的报告底物包括放射标记的核苷类似 物。
(c)而在本方法中可以使用的另一个步骤包括对含有标记的报告 底物代谢产物的靶组织或细胞进行非侵入式成像。在某些方面，受试 者在清除未被报告基因产物从宿主受试者中代谢去除的残留报告底物 后接受成像，藉此检测转移到靶组织中并在其中表达的基因。在进一 步的方面中，受试者或受试组织在1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10
10或更多分钟、小时、天或周后接受成像，这依赖于未代谢的报告底物 的清除代谢。
该方法可以进一步包括在步骤（b)后等待一段时间，该时间足以使 大约、至少或最多60、 65、 67、 70、 75、 77、 80、 85、 87、 90、 95、 97%或更多的、包括其中所有数值和范围的未代谢物（未被表达产物代 谢掉的报告底物）被报告基因产物从受试者中清除。未代谢底物可以 包括衍生自未代谢的残留报告底物的非特异性标记物。可以通过体外 或体内转染（或转导）将AAVP载体引入到靶组织细胞中。在某些方面， 通过静脉内、瘤内、动脉内、胸膜内、支气管内和/或经口给药AAVP。
在某些方面，用适用于正电子发射断层摄影术、伽马照相或单光 子发射计算体层摄影成像的放射性同位素标记^^艮告底物。该报告底物 和/或报告底物的代谢产物是含有一个稳定同位素的核素的化合物，包 括但不限于2H， 13C, 15N和"F。在进一步的方面，通过正电子发射断
层摄影对标记的报告代谢产物进行成像。在更进一步的方面，通过伽 马照相或单光子发射计算体层摄影对标记的报告代谢产物进行成像。
在仍然更进一步的方面，通过磁共振成像对标记的报告代谢产物进行 成像。
AAVP载体可以掺入报告基因和合适转录启动子和增强元件，来确 保报告基因和治疗基因共表达的组织特异性的、组织选择性的或转录 因子特异性的、或信号转导特异性的转录激活。在某些方面，在将多 个或单个细胞给予到受试者之前，在体外用偶联到转录调控元件（例 如启动子和/或增强子元件）上的报告基因转染器官、组织、多个或单 个细胞。标记的2'-氟-核苷类似物包括，但不限于，5-[1231]- 2'-氟 -5-捵-l P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[1241]-2'-氟-5-碘-1 p -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-[1311]-2'-氟-5-碘-1 P-D-阿拉伯呋喃糖 基-尿嘧啶，5- [18F] -2'-氟-5-氟-1- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶； 2- [1311] - -2'-氟-5-曱基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5- ([UC]— 甲基)-2'-氟-5-甲基-l-p-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；2-["C]- 2'-氟-5-乙基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5-(["C]一乙基）-2'-氟
ii-5-乙基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5- (2- [18F]-乙基)-2' -氟 -5-（2-氟-乙基）-1-p-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[1231]- 2'-氟 -5-碘代乙烯基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5- [1241] -2'-氟-5-碘代乙烯基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶；5- [1311] -2'-氟-5-碘代 乙烯基-l-p-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶;5-[1231]- 2'-氟-5-碘-l-P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5- [1241] - 2'-氟-5-碘-1- P -D-呋核亚硝脲 -尿嘧啶；5-[1311]-?-氟-5-碘-l-p-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[1231]-2'-氟-5-碘代乙烯基-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5-[124 I]- 2'-氟 -5-多舆代乙烯基-l- P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；5- [131 I] -2'-氟-5-碘代 乙烯基-l-p-D-呋核亚硝脲-尿嘧啶；或9-4-["F]氟-3-(羟甲基）丁 基]鸟噪呤。
成像数据可以体现，但不限于，获得的用磁共振成像（MRI)、核医 学、正电子发射断层摄影（PET)、计算机断层扫描（CT)、超声检查（US)、 光学成像、红外成像、体内显微镜检查和X射线摄影所得到成像。可 以将成像和可用于从成像中获得额外信息的医疗设备、药物或化合物、 造影剂或其它试剂或刺激剂联用。使用损伤、组织、样本、系统、有 机体、受试者或患者的这些形态所获得的成像可以是在时间和/或空间 上静止或动态的成像。
可以将成像和从中获得大规模生物数据的组织、样本、系统、有 机体、或患者相匹配。从每个成像、 一个或多个成像实验或检查中提 取成像信息，并且所述成像信息可以包括定量的或定性的影像表现， 可以体现但不限于损伤、组织、样本、系统、有机体或患者的形态学、 组成、结构、生理学、基因表达或功能的差异。成像信息的范例包括 但不限于可以从多相反差增强动态CT、功能成像、磁共振波谱分析、 弥散张量成像、基于扩散或灌注的成像以及被核医学或PET包裹的目 标成像中所提取出的影像表现。范例可以参见美国专利公布号 20030033616和20060223141，在此处将它们整体引用作为参考。
在某些实施方案中，本发明包括治疗受试者的方法，包括如下的 一个和多个步骤：
12(a) 向患有、怀疑患有病理或疾病情况或具有发生病理或疾病情 况的危险的受试者给予编码报告分子的治疗性AAVP;以及
(b) 通过检测编码的报告分子或报告分子的活性来评价治疗性 AAVP在治疗所耙向的组织或细胞中的原位表达。
在某些方面，所述方法可以进一步包括：根据利用AAVP核酸在靼 器官、组织或细胞中进行治疗上足够水平的治疗基因的表达，给予受 试者癌症治疗。在进一步的方面，如果第一治疗性AAVP的表达未达到 治疗上的有效水平，给予第二治疗性AAVP。第二治疗性AAVP可以包 含第二个耙向配基或一个结合体或多个配基。并且，第二 AAVP可以包 含第二个用于在靶器官、组织、多个细胞或一个细胞中表达的控制元 件。可以通过对报告分子或报告分子的活性进行非侵入式检测（例如， 检测报告蛋白代谢的标记的底物）来进行对AAVP表达的评价。在某些 方面，报告分子是治疗性蛋白质。在进一步的一个方面，所述治疗性 蛋白质是前体药物转化酶。在更进一步的一个方面，所述报告分子是 酶，并且特别是一种激酶。在某些实施方案中，所述激酶是胸苷激酶， 例如，HSV-tk或人tk2。典型的，激酶能修饰或代谢可检测的标记的 化合物或标记的底物。在某些方面，所述底物或化合物包括可通过如 下方法检测到的可检测标记：荧光、化学发光、表面增强拉曼光镨 (SERS)、磁共振成像(MRI)、计算机体层扫描摄影（CT)或正电子发射断 层摄影（PET)。在某些方面，可检测的标记的化合物是核苷类似物。所 述可检测的标记的化合物可以包括，但不限于，氟脱氧葡萄糖（FDG)、 2'-氟-2'脱氧-1 P -0-阿拉伯呋喃糖基-5-乙基-尿嘧啶（FEAU)、 5-[1231]- 2'-氟-5-碘-10-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[1241]- 2'-氟-5-碘-1 p-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[1311]-2'-氟-5-碘-l P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[18F]-2'-氟-5-氟-l-p-D-阿拉伯呋 喃糖基-尿嘧啶、2-[111]-和5-(["C]-甲基)-2'-氟-5-曱基-l-p-D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、 2-[nC]- 2'-氟-5-乙基-l-p-D-阿拉伯呋 喃糖基-尿嘧啶、5- (["C〗 一 乙基）-2'-氟-5-乙基-l- P -D-阿拉伯呋喃 糖基-尿嘧啶、5- (2- [18F]-乙基）-2'-氟-5- (2-氟-乙基）-1- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶，5-[1231]-2'-氟-5-碘代乙烯基-l-p-D-阿拉伯呋 喃糖基-尿嘧啶、5- [1241] -2'-氟-5-碘代乙烯基-l- p -D-阿拉伯呋喃糖 基-尿嘧啶、5- [1311] -2'-氟-5-碘代乙烯基-l- P -D-阿拉伯呋喃糖基-尿嘧啶、5-[1231]-2'-氟-5-碘-1- p -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、 5- [1241] -2'-氟-5-碘-1- P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5- [1311〗-2'-氟-5-碘-l- P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5- [1231] -2'-氟-5-碘代乙烯基-l- P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、5- ri] -2'-氟-5-碘代乙烯基-l- P 呋核 亚硝脲-尿嘧啶、5- [1311] -2'-氟-5-碘代乙烯基-1- P -D-呋核亚硝脲-尿嘧啶、或9-4-["F]氟-3-(羟甲基）丁基]鸟噤呤。
在进一步的一个方面，标记的底物或化合物可以用18F、 277Ac、 mAt、 128Ba、 131Ba、 7Be、 2°4Bi、 2°5Bi、 2°6Bi、 76Br、 "Br、 82Br、 ，Cd、 47Ca、 UC、 13C、 14C、 36C1、 48Cr、 51Cr、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 165Dy、 155Eu、 153Gd、 "Ga、 67Ga、 68Ga、 72Ga、 198Au、 2H、 3H、 166Ho、 luIn、 113In、 115In、 123I、 125I、 131I、 189Ir、 191Ir、 192Ir、 "4Ir、 19F、 52Fe、 55Fe、 59Fe、 177Lu、 150、 1910s、 ，Pd、 "P、 "P、 "K、 226Ra、 186Re、 mRe、 82Rb、 153Sm、 "Sc、 47Sc、 72Se、 75Se、 I05Ag、 15N、 22Na、 "Na、 S9Sr、 35S、 3SS、 177Ta、 96Tc、 99aTc、 2"T1、 2°2T1、 mSn、 117mSn、 121Sn、 166Yb、 169Yb、 175Yb、 88Y、 9°Y、 62Zn、或65Zn标记。 在特别的方面，可检测的标记是1311、 125I、 mI、 mI、 99raTc、 9°Y、 186Re、 mRe、 32P、 153Sm、 67Ga、 2D1T1、 "Br、或18F标记。
本发明的AAVP可以包含选择性靼向治疗所针对的一种组织或细 胞的组分。在某些方面，所述组分被编码或偶联到AAVP的衣壳蛋白和 /或重组衣壳蛋白上。在某些方面，所述衣壳蛋白包含乾向肽。靼向肽 可以是环状肽、二环的、和/或线形的肽。靶向肽选择性地结合到在细 胞表面表达表达整联蛋白的细胞上。整联蛋白可以是avp3或avp5整 联蛋白。在进一步的一个方面，肽包含RGD基序。在更进一步的一个 方面，肽可以选择性地结合到表达转铁蛋白受体的细胞上，这种肽可 以包含含有CRTIGPSVC的氨基酸序列。
在某些方面，受试者可以患有、怀疑患有过增生疾病、或者具有 发生过增生疾病的风险。过增生疾病包括，但不限于，纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、 淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平 滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、胃癌、食道癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、 前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、 乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肺癌、肾细胞癌、肝细胞
瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母肿瘤（Wi s tumor )、 子宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、 胶质瘤、星形胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、；险果 体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经 母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、或卡波西氏肉瘤。在 某一特定的方面、过增生疾病是脑胶质瘤。
在进一步的实施方案中，报告分子和/或治疗基因被操作偶联到组 织或细胞选择性启动子上，或偶联到组织或细胞特异性启动子上。在 某些方面，对表达的评价包括给予标记的化合物或底物，所述标记的 化合物或底物被表达AAVP核酸的细胞代谢，并且典型的不被非耙组织 显著代谢。
治疗性AAVP还可以编码第二个治疗基因。第二个治疗基因可以 是，但不限于，胂瘤抑制子、抑制RNA、抑制DNA、或前导药物转化酶。
在更进一步的实施方案中，本发明的组合物可以包括治疗性AAVP 核酸，所述治疗性A A VP核酸包含含有抑制RNA或抑制DNA的核酸片段。 抑制RNA可以是siRNA、 miRNA或反义RNA或DNA。在某些方面，AAVP 核酸被包含到噬菌体颗粒中。在进一步的方面，所迷颗粒包含如此处 所述的靼向配基。
某些实施方案包括调节基因表达的组合物和方法，包括给予AAVP 核酸或包含这种核酸的颗粒。
根据本发明，选择的基因或多肽可以指向任何蛋白质、多肽或肽。 治疗基因或多肽是能够被给予到受试者中用于治疗或预防疾病的基因 或多肽。例如，治疗基因可以是给予到受试者中用于治疗或预防癌症 的基因。治疗基因的例子包括，但不限于，Rb、 CFTR、 p16、 p21、 p27、p57、 p73、 C-CAM、 APC、 CTS-1、 zacl、 scFVras、 DCC、 NF-1、 NF-2、 WT-1、 MEN-I、 MEN-II、 BRCA1、 VHL、 MMAC1、 FCC、 MCC、 BRCA2、 IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll IL-12、 GM-CSF、 G-CSF、胸苷激酶、Bax、 Bak、 Bik、 Bim、 Bid、 Bad、 Harakiri、 Fas-L、 mda-7、 fus、干扰素a、干扰素p、干扰素 Y、 p53、 ABLI、 BLC1、 BLC6、 CBFA1、 CBL、 CSFIR、 ERBA、 ERBB、 EBRB2、 ETS1、 ETS2、 ETV6、 FGR、 F0X、 FYN、 HCR、 HRAS、 ■、 KRAS、 LCK、 LYN、 MDM2、 MLL、 MYB、 MYC、 MYCL1、 MYCN、 NRAS、 PIM1、 PML、 RET、 SRC、 TAL1、 TCL3、 YES、 MADH4、 RB1、 TP53、 WT1、 TNF、 BDNF、 CNTF、 NGF、 IGF、 GMF、 aFGF、 bFGF、 NT3、 NT5、 ApoAI、 ApoAIV、 ApoE、 RaplA、 胞嘧梵脱氨酶、Fab、 ScFv、 BRCA2、 zacl、 ATM、 HIC-1、 DPC-4、 FHIT、 PTEN、 ING1、 N0EY1、 N0BY2、 0VCA1、 MADR2、 53BP2、 IRF-1、 zacl、 DBCCR-1、 rks-3、 C0X-1、 TFPI、 PGS、 Dp、 E2F、 ras、 myc、 neu、 raf、 erb、 fms、 trk、 ret、 gsp、 hst、 abl、 E1A、 p300、 VEGF、 FGF、凝 血酶敏感蛋白、BAI-1、 GDAIF、或MCC。
治疗基因的其它例子包括编码酶的基因。例子包括，但不限于， ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophorylase)、三磷酸腺苷酶（ATPase)、乙醇脱氢酶、淀粉酶、 淀粉葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧合酶、脱羧酶、糊精 酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸合成酶（hyaluron synthase)、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、鸟苷三磷酸酶 (GTPase)、螺旋酶、半纤维素酶、半纤维素酶、整合酶、转化酶、 异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂肪氧化酶、分解酶、溶菌酶、果 胶脂酶、过氧物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、 蛋白水解酶、肽水解酶（peptidease)、普鲁兰酶（pullanase)、重组 酶、逆转录酶、拓朴异构酶、木聚糖酶、报告基因、白（细胞）介素或 细胞因子。
治疗基因的进一步的例子包括编码氨基甲酰合成酶I、鸟氨酸转 氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸盐合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、oc-l胰蛋白酶抑制剂、 葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、胆色素原脱氨酶、因子VIII、 因子IX、胱石危醚P合酶（cystathione beta.-synthase)、支链酮酸 脱羧酶、白蛋白、异戊酰辅酶A脱氢酶、丙酰辅酶A羧化酶、曱基丙 二酸单酰辅酶A、戊二酰-辅酶A脱氢酶、胰岛素、-葡糖苷酶、丙酮 酸羧化酶、肝脏磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、 T-蛋白、门克斯病铜运输ATPase、肝豆状核变性铜运输ATPase、胞嘧 啶脱氨酶、次黄嘌呤-鸟噤呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸半乳糖尿苷酸转 移酶、苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、-L-艾杜糖醛酸酶、 6-磷酸葡糖脱氩酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的基因。
治疗基因还包括编码激素的基因。例子包括，但不限于，编码生 长激素，催乳素，胎盘生乳素，促黄体激素，卵泡刺激素，绒毛膜促 性腺激素，促甲状腺激素，瘦素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素I， 血管紧张素II, p黑素细胞刺激素，胆囊收缩素，内皮缩血管肽，肠 抑胃肽，胰高血糖素，胰岛素，促脂解素，后叶激素运载蛋白类、生 长抑素、降钙素，降钙素基因相关肽，（5-降钙素基因相关肽，恶性因 子的高钩血症，甲状旁腺激素相关蛋白，曱状旁腺激素相关蛋白，胰 高血糖素样多肽，胰抑素，胰多肽，肽YY， PHM，分泌素、血管活性 肠肽，催产素，加压素，加压催产素，脑啡肽酰胺（enkephalinamide)， 曱硫脑啡肽酰胺（metorphinamide) ， ot黑素细胞刺激素，心钠素， 淀粉素，淀粉样蛋白P成分，促肾上腺皮质释放激素，生长激素释放 因子，促黄体激素释放激素，神经肽Y， K物质，P物质，或促甲状腺 素释放激素的基因。
本申请全文还讨论了本发明的其它实施方案。就本发明的一个方 面而进行讨论的任何实施方案都可以应用于本发明的其它方面，反之 亦然。可以理解，实施例部分的实施方案是可以应用于本发明所有方 面的本发明的实施方案。
术语"抑制"，或"减少"，或"预防"，或这些术语的任何变 体，当用于4又利要求和/或i兌明^咖时白'括^壬斩"^T
17抑制，来得到所需结果。
当在权利要求书和/或说明书中术语"a"或者"an"与术语"包 含"结合使用时，其表示"一个"，不过它也和"一个或者多个"， "至少一个，，，"一个或者一个以上"的意思是一致的。
可以预想在此讨论的涉及本发明的任何方法或组合物的任何实施 方案都是能够实现的，反之亦然。而且，本发明的组合物和试剂盒可 以在实现本发明的方法中使用。
在整个申请中，术语"大约"用于表明数值包括了所采用的用于 测量数值的仪器或方法的误差标准偏差。
在权利要求中术语"或者"的使用用于表达"和/或"，除非明确 地表明指的是仅仅两者选一或者所述二者择一是互相排斥的，所述公 开支持指的是仅仅两者选一和"和/或"的定义。
如在本说明书和权利要求中所用，单词"包含"（以及任何形式 的包含，例如单数第三人称形式或复数形式）、"具有，，（以及任何 形式的具有，例如单数第三人称形式或复数形式）、"包括"（以及 任何形式的包括，例如单数第三人称形式或复数形式）或"含有，，（以 及任何形式的含有，例如单数第三人称形式或复数形式）是包括在内 的或可扩充的，并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。
根据后面的详细描述，本发明的其它目标、特征和优点是明显的。 可以理解，指示本发明中特定的实施方案的详细描述和特定例子仅用 于举例阐述，因为根据本发明的详细描述，在本发明的宗旨和范围内 的多种改变和修饰对于本领域的技术人员而言是很明显的。
附图简述
本说明书包括以下图例，并用其进一步说明本发明。结合一个或 多个图例并参考本文所述具体实施案例可更好的理解本发明。为理解 公开的某些具体实施案例（部分）可参考以下附图及描述。
图1A-1E:图1A所示柱形图表示RGD-4C AAVP与表达ctv整合素 的哺乳细胞相结合，对照组为无靶点的AAVP或是携带阴性对照肽的
18AAVP (阴性对照肽可为RGE-4C或RGD-4C序列的多种错乱版本）。图 1B显示RGD-4C AAVP携带报道基因，显示其配体介导的内化。图1C 表示由RGD-4C AAVP-P-半乳糖苷酶（病毒）介导的靶基因向KS 17617 细胞的转移。图1D表示合成的RGD-4C多肽抑制转导（transduction), 而非相关对照多肽不抑制转导；用无靶点的AAVP检测非特异性转导水 平。用免疫荧光检测基因表达，用抗P-gal抗体复染。图1E表示感 染RGD-4C AAVP的细胞对重组AAV的拯救。用靶定的RGD-4C AAVP-GFP
(106转导单位/细胞）或用阴性对照（靶定的非嵌合RGD-4C噬菌体 -GFP，无耙点的AAVP-GFP)孵育人293细胞。感染4天后，用AAV rep-和cap-表达质粒转染细胞，并用5型腺病毒（Ad)重复感染细胞。腺 病毒感染72小时后收集细胞，用上清感染其他293细胞。48小时后 用流式细胞术分析GFP的表达。图例所示为相对于背景值，各构建体 在拯救实验中产生的重组AAV-GFP平均值增高情况。
图2A-2C:柱形图2A概述了稳定转导的293克隆的流式细胞分析， 该克隆被导入AAVP-GFPneo ( n=9 )或噬菌体-GFPneo ( n-9 )。空白三 角形表示绿色荧光蛋白（GFP)阳性细胞的百分率，黑色条柱表示GFP 的表达7JC平（平均荧光密度（MFI: mean fluorescent intensity))。 图2B为RGD-4C AAVP-GFPneo或RGD-4C谨菌体-GFPneo稳定转导细胞 林的Southlrn印记分析，以显示克隆细胞系中转基因盒的持久性。用 Aflll-Xhol双酶切非转导293母细胞的总细胞DM或各转导细胞抹
(#1-9组）的总细胞DNA (携带转基因盒的构建DNA中仅有一个该酶 的限制性酶切位点）。图2C显示用Southern印记分析转基因盒潜 在的头尾相连串联体结构。Southern印记之前先用Xho-1消化总细胞 DM (转基因盒3， ITR附近只有单个限制性酶切位点）。
图3A-3B:图3A为KS1767衍生移植瘤的噬菌体免疫组化染色结 果。将RGD-4C AAVP (5 x 101。 TU)或阴性对照（无耙点的AAVP、错 乱的RGD-4C AAVP或RGE-4C AAVP)经全身给药（尾静脉注射）注入 携带KS1767衍生移植瘤的深度麻醉棵鼠，让AAVP病毒载体在体内循 环5分钟，而后灌注并手术移除肿瘤。用抗噬菌体的多克隆抗体对石蜡包埋的胂瘤切片进行染色。箭头表示肿瘤血管中的噬菌体染色。图
3B为用RGD-4C AAVP-GFP或阴性对照（无乾点、错乱的或突变的结构） 全身给药7天后，KS1767衍生移植瘤中GFP表达的免疫荧光分析。
图4A-4E:图4A为用靶定AAVP全身给药后萤火虫荧光素酶的体 内生物发光成像结果。携带DU145衍生移植瘤的棵鼠被全身施用单剂 量的RGD-4C AAVP-Luc (5 x 1011 TU，静脉注射）或对照物（无靼点 的AAVP-Luc或错乱的RGD-4C AAVP-Luc ) 。 10天后，用生物发光成像
(BLI， bioluminescence imaging)来分析携带肺瘤小鼠中转基因的 表达情况。附图显示较准标度（calibration scale)。图4B为靶定 的RGD-4C AAVP-HSVtk全身给药后携带肺瘤小鼠的多轨PET成像结果
(multi-tracer PET imaging)。携带DU145 f汴生移植瘤的棵鼠(每 组11=9只携带肿瘤小鼠）被全身施用单剂量的（5xlO"TU,静脉注 射）RGD-4C AAVP-HSVtk或无靼点AAVP-HSVtk。图中所示为GCV处理 前后的rF]-FDG和rF]-FEAUPET图像。T:肿瘤；H:心脏；BR:脑； BL:膀胱。附图显示较准标度。代表性肿瘤携带小鼠的PET图像和摄 影图像用于简化说明[18F]-FDG和["F]-FEAU的生物分布。图4C显示 施用AAVP后单个移植瘤的生长曲线。图4D表示HSVtk基因表达的时 间动态曲线，根据施用AAVP后不同天数的[18F]-FEAU PET图像制定。 图4E表示用["F]-FDGPET图像评估的GCV处理前后肿瘤活力的变化。 图5A-5G:图5A表示不同时间点肿瘤体积平均值士标准偏差（SD )。 多组携带人移植瘤（衍生于KS1767细胞，大小约为50mm2)的免疫缺 陷棵鼠被检测。棵鼠被全身施用单剂量（5 x 10"TU，静脉注射）的 RGD-4C AAVP-HSVtk或对照物（无乾点的AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-GFP 或空载体）。从处理后第二天直到实验结束，向小鼠施用更昔洛韦（GCV， gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后除了对照组不服用GCV 外，所有小鼠都接受GCV处理。图5B表示不同时间点肿瘤体积平均值 士标准偏差（SD)。多组携带人移植瘤（衍生于膀胱UC3癌细胞，大 小约为50mm2)的免疫缺陷棵鼠被检测。棵鼠被全身施用单剂量（5 x IO1。 TU，静脉注射）的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照物（无靶点的AAVP-HSVtk、RGD-4C AAVP-GFP或空载体）。从处理后第二天直到实验结束，向小 鼠施用更昔洛韦（GCV， gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理 后除了对照组不服用GCV外，所有小鼠都接受GCV处理。图5C表示不 同时间点肿瘤体积平均值土标准偏差（SD)。多组携带人移植瘤（衍 生于前列腺DU145癌细胞，大小约为50mm2)的免疫缺陷裸鼠被检测。 棵鼠被全身施用单剂量（5 x 10"TU，静脉注射）的RGD-4C AAVP-HSVtk 或对照物（无靶点的AAVP-HSVtk、 RGD-4C AAVP-GFP或空载体）。从 处理后第二天直到实验结束，向小鼠施用更昔洛韦（GCV， gancyclovir)。用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后除了对照组不服用GCV 外，所有小鼠都接受GCV处理。所示图为不同时间点肿瘤体积平均值 土标准偏差（SD)。图5D表示全身施用单剂量（5 x 1(TTU，静脉注 射）的RGD-4C AAVP-HSVtk对大型DU145衍生移植瘤（约150mm2)的 生长抑制。图5E表示向免疫活性BALB/c小鼠单剂量（5 x 10"TU)静 脉注射RGD-4C AAVP-HSVtk对EF43-FGF4小鼠乳腺癌(大小匹配在大 约50mm2)的生长抑制。图5F为RGD-4C AAVP-HSVtk和GCV的长期效 应，通过向携带等基因EF43-FGF4肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠重复施 用AAVP (每次5 x 10"TU,静脉注射）而得。多组肿瘤携带小鼠（每 组11=10只小鼠）的独立实验所得治疗结果一致。箭头指示AAVP的施 用时间。图5G显示用RGD-4C AAVP-HSVtk处理后针对噬菌体的体液免 疫应答效应。先用RGD-4C AAVP-GFP向BALB/c免疫活性小鼠（每组 n-7只小鼠）全身给药三次（每星期l(TTU，持续三星期，静脉注射）。 而后将EF43-FGF4细胞移植入小鼠。肿瘤形成后（约50mm2 )，将RGD-4C AAVP-HSVtk或无靶点AAVP-HSVtk单剂量全身施用于肿瘤携带小鼠， 并持续施用GCV (起始于施用AAVP后的第二天）。在接种开始前后及 接种末期AAVP施用前收集小鼠的血清样本，用ELISA确定体内循环的 抗噬菌体IgG是否为高效价（可约为1: 10， QOO )。尽管抗噬菌体抗体 存在，预先接种并不影响病毒的抗肿瘤效应。
图6A-6B:图6A上层图为肿瘤携带小鼠，下层为从所有治疗组手 术移除的相应肿瘤（BALB/c免疫活性小鼠的EF43-FGF4乳腺癌）。图
216B为处理组EF43-FGF4肺瘤的组织病理分析。EF43-FGF4肿瘤回收后， 切片并染色。高倍放大图源于系列肿瘤切片低倍放大图中插入框选定 区域的高倍图像。其中左侧图片为无靶点AAVP-HSVtk处理的肿瘤、中 间图片为外缘和肺瘤中心区之间区域、右侧图片为RGD-4C AAVP-HSVtk 处理的肿瘤中心区域。图示包括肿瘤切片的苏木精-伊红染色（H&E， hematoxylin and eosin)、抗CD31免疫染色和TUNEL染色。箭头指 示肿瘤血管和凋亡细胞。
图7:图7为图解说明RGD-4C AAVP的构建、克隆策略和所得载 体的结构。
图8A-8C:图8A为RGD-4C AAVP-GFPneo或RGD-4C噬菌体-GFPneo 转导的293细胞株的DNA Southern印记分析。从非转导的293母细胞 或各稳定转导细胞林（每载体#1-9)中提得的总细胞DNA与Stul(载 体DNA中无此限制性酶切位点）、Xba-1 (载体DNA中只有一个此限制 性酶切位点）或Sacl-Mlul —起辨育。用0. 8%琼脂糖胶分离所得DNA 片断、转到尼龙膜上并用标记的neo探针杂交。消化的载体质粒也用 作对照。图8B显示用RGD-4C噬菌体-GFPneo或RGD-4C AAVPGFPneo 稳定转导的293细胞林中，转基因盒串联体的PCR分析。用非转导的 293母细胞作为阴性对照；图中也显示了其他阴性对照和100bp的分 子量标记（Invitrogen)。用引物在转基因盒5'和3'端附近退火的 巢式PCR鉴定RGD-4C AAVP和RGD-4C噬菌体相应DNA的串联体结构。 箭头指示引物（H:头；T:尾）。用2%琼脂糖胶检测PCR扩增产物， 串联载体DNA仅存在于AAVP转导的细胞林。图8C显示AAVPDNA不同 串联形式的测序结果（大写字母表示转基因盒的3，端、斜体字母表 示转基因盒的5'端），结果显示出敲除ITRs后的头尾串联结构。
图9:图9显示小鼠静脉注入（5 x 101。 TU ) RGD-4C AAVP-GFP或 无靶点AAVP-GFP的第七天，其对照器官：脑、肝、胰腺和肾中报道基 因GFP表达的的免疫染色。
图10A-10B:图IOA为肿瘤组织针对AAVP的免疫组化染色结果。 向携带EF43-FGF4肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠静脉注入RGD-4C AAVP(右侧图片）或无靼点的AAVP (中间图片），让构建物在体内循环5 分钟，而后如所述进行灌注和组织回收。用噬菌体的多克隆抗体染色。 左侧图片显示用抗CD31抗体对肿瘤血管的染色。箭头标示肿瘤血管。 图10B显示对携带EF43-FGF4肺瘤的小鼠静脉注射无靶点AAVP-GFP
(左侧图片）或RGD-4C AAVP-GFP (中间图片），1周后EF43-FGF4 肿瘤中GFP表达的免疫荧光分析。右侧图片显示EF43-FGF4肿瘤中抗
av-整合素的免疫染色（右侧图片）。
图11:图11显示用无粑点AAVP-HSVtk、 RGD-4C AAVP-HSVtk载 体或空载体处理并用GCV维持的小鼠中，其对照器官：肝、心和肾的 组织化学分析。这些器官的H&E染色未发现毒性组化信号。
图12A-12C:用RGD靶定的AAVP感染哺乳细胞，其细胞可表达功 能基因产物。（图12A)用AAVP、表达TNF-oc的无靶点噬菌体fdTNF-a (上层图片）和表达TNF-oc的靶定噬菌体RGDTNF-oc (下层图片） 感染人黑色素瘤细胞M21，用fd特异性一抗检测，用FITC标记的二 抗显色。（图UB)用PBS、无靶点空病毒（fd)、靶定空病毒（RGD)、 表达TNF-a的无靼点噬菌体fdTNF-a和表达TNF-a的乾定噬菌体 RGDTNF-a感染M21细胞。感染5天后，用ELISA检测培养液上清中 TNF-a含量。图中也显示了感染12天后培养液上清的数据。（图12C) 用多种物质感染M21细胞，如：PBS、 fd(无靶点空病毒）、RGD (靶 定空病毒）、fdTNF (无靶点TNF-oc表达病毒）和RGDTNF (靶定TNF-cc表达病毒） 。 收集感染第五天的M21细胞上清，用其处理人脐带静 脉内皮细胞（HUVEC， h醒n umbilical vein endothelial cell)并分 析组织因子（TF， tissue factor)产物。用重组TNF-ot作为阳性对 照。为检测特异性，在用于HUVEC前，用TNF-oc特异性抗体孵育RGDTNF 感染的M21细胞上清。同时检测了感染后第23天上清中TF的分泌情 况。
图13A-13H: AAVP特异性靶定肿瘤血管。用细菌噬菌体特异性抗 体和CD31血管抗体对注入PBS或RGDTNF- ot的人黑色素移植瘤进行染 色。用Alexa Flour 488、 Alexa Flour 594和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核（250X)。注入PBS的动物在任何时间都不显示 AAVP。从注入PBS 15分钟后的动物中获得的代表性肿瘤切片列于图 13A。将表达RGDTNF-a的AAVP注射入动物后，仅15分钟就显示病毒 颗粒和血管壁的共定位（图13B)，该共定位也显示在后续时间点：第一 天（图13C)、第二天（图13D)、第三天（图UE)、第四天（图13F)、 第八天（图13G)和第十天（图13H)。
图14A-14E:在正常肝组织中检测不到AAVP颗粒。肝样取自携带 人黑色素瘤的动物，该动物被注入RGDTNF-oc并用细菌噬菌体特异性 抗体和CD31血管抗体染色。用Alexa Flour 488、 Alexa Flour 594 和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核（250X )。将表达RGDTNF-ct的AAVP注射入动物后，其肝组织在第一天就可见一些病毒颗粒染色 (图14A)。然而，第二天其染色的病毒就减少到最小水平（图14B)， 在第三天（图14C)、第八天（图14D)和第十天（图l化）未见病毒 染色。所有肝组织在不同的时间点都显示出很好的血管染色。
图15A-15E:在正常肾组织中检测不到AAVP颗粒。肾样取自携带 人黑色素瘤的动物，该动物被注入RGDTNF-ct并用细菌噬菌体特异性 抗体和CD31血管抗体染色。用Alexa Flour 488、 Alexa Flour 594 和DAPI来分别标记检测血管、AAVP和细胞核（250X)。检测的任何 时间点在肾样里都观测不到AAVP，图示为第一天（图15A)、第二天（图 "B)、第三天（图15C)、第八天（图UD)和第十天（图UE)。然 而，所有肾组织在不同的时间点都显示出很好的血管染色。
图16: AAVP在体内表达特异性基因产物。携带人黑色素移植瘤并 被注入PBS或RGDTNF-oc的动物，其冷冻切片被用来提取总蛋白。用 ELISA检测50lig总蛋白中TNF-oc的蛋白水平两次。在所有检测的组 织中都可见内源TNF- ot的本底表达水平。在任一检测时间点，注入PBS 的动物都没有高于内源水平的表达。而注入RGDTNF-aAAVP的小鼠在 第四天可见TNF-a的表达，而后表达水平逐步升高至直第十天。
图17A-l7B: AAVP在血管中表达TNF- a并诱导体内细胞凋亡。（图 17A)用TNF-ct特异性抗体对冷冻切片染色进行免疫组化分析，该切片来自于携带人黑色素移植瘤并被注入RGDTNF-ocAAVP的动物。TNF-cx染色可见于环绕血管的棕色染色（左侧图片，100X;右侧图片，400X )。
(图17B)染色冷冻切片用于检测凋亡细胞，该切片来自于携带人黑色素移植瘤并被注入RGDTNF-aAAVP的动物。用TACS蓝色标记染色血管及周围凋亡的肿瘤细胞，此类细胞显示为蓝色（左侧图片，200X)。样本用核固红（nuclear fast red)复染。右侧图片显示用CD31特异性抗体染色的血管（200X)。
图18A-18B:用AAVP处理TNF-oc敏感性人黑色素瘤M21(图18A)和TNF-ct抗性人黑色素瘤Pmel (图18B)。对皮下植入M21/Pmel肿瘤的棵鼠尾静脉注射AAVP，在不同时间点测量肿瘤体积。对处理后不同天数的肿瘤体积作图。（图18A)用RGDTNF-ot处理的动物肿瘤体积在第二十天明显减小，具有统计学意义（p〈0. 05)。（图18B)用AAVP传送EMAP-II并用重组TNF-oc处理可4吏TNF-oc抗性人黑色素瘤对TNF- ct疗法敏感。用rTNF-oc或靶定表达EMAP-II的AAVP
(RG画AP-II )单独处理小鼠，该小鼠与PBS或f纖AP-II组相比仅显示微弱的效果，但无显著性差异。用RGD-EMAP-II病毒和rTNF-ot联合处理的小鼠显示出肿瘤体积的明显减小（p=0. 007 )。
图19A-19B:用CRTIGPSVC ( SEQ ID NO: 1) AAVP-Luc U87体外转导人胶质瘤细胞，人源胶质瘤细胞以每孔40， 000细胞的浓度接种于24孔板，37X:培养过夜。第二天，根据Nature Method氏流程，用AAVP培育细胞。用RGD-4C AAVP GFP和RGD-4C AAVP Luc作为转导效率的阳性对照。在第七天成像。噬菌体摄入较低，但当细胞用AAVP铁凝胶
(Iron AAVP hydrogel )培育时，噬菌体摄入明显增高（最后一个平板及柱图）。
本公开适于各种改良和替换形式，在附图中显示了特定的实施例并在文中对其进行了更为详细的介绍。然而，应当理解描述特定的实施例的用意并不是将本发明局限于公开的特定形式。相反，本公开涵盖所有变更及通过权利要求书中而附加的其局部等同形式。
25发明详述
本公开，根据特定的实施方案，通常针对以位点特异性方式运输一种或多种转基因到靶细胞来增强表达的组合物和方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞，以及针对用于该用途的组分和组合物。在某些方面，在对受试者进行治疗或诊断程序之前，可以对治疗性核酸的表达进行估定。在进一步的方面，对在需要治疗收益的区域或位置中的表达进行测定或估定，并且可以停止任何非必须的或边际收益疗法，来代替替代疗法。
不受任何特定理论或机制所约束的，本公开基于如下观察：当一个以上的多重转基因被整合到基因组中时，转基因表达有可能增加。让人特别感兴趣的是嵌合AAVP颗粒向细胞转导一个拷贝以上的转基因（通常以串联体形式）的能力。还可以通过嵌合AAVP颗粒所携带的报告基因的表达来监测转导细胞。在本公开中可以包括任何转基因，并可以从AAVP颗粒中表达。
l.腺伴随病毒/噬菌体（AAVP)颗粒
腺伴随病毒（AAV)是细小病毒家族中的有缺陷成员。AAV基因组被包装为带有正或负极性的单链DNA分子。两种极性的链都被包装，但被包装到不同的病毒颗粒中，并且两种链都具有感染性。2型人腺伴随病毒（AAV2)的单链DNA基因组长为4681个碱基，侧面为反向末端重复序列（ITRs)，每个长为145个碱基对。此外，病毒rep蛋白好像通过ITRs介导了非同源重组。相应的，因为微小病毒的基因组的每个末端都具有ITRs，所述ITRs在重组中扮演一定角色的，并且通常是微小病毒复制和包装所需要的，本公开的AAVP通常含有至少一个ITR或其功能等同物的所有或一部分。
可以容易地获得AAV,并且已经在，例如，Muzyczka， 1992;美国专利4, 797, 368，和PCT公开号W0 91/18088中描述了 AAV用作载体用于基因的运输。在一些发表物中描述了 AAV载体的构建，包括Lebkowski 等人，1988 ; Tratschin等人，1985 ; Hermonat 和Muzyczka， 1984。本公开提供了在细菌中产生的腺伴随病毒的（AAV)噬菌体载体（例如AAV-M13载体）（AAVPs)，和通过向细胞中引入AAVP，在靶细胞中表达转基因的方法，所述靶细胞例如肿瘤细胞。经纯化后，用靶向的含有噬菌体序列和带有转基因盒的AAV序列的噬菌体颗粒转染哺乳动物细胞。载体内化到哺乳动物细胞中后，转基因被整合到靶细胞的基因组中。此处所用的术语"载体"被定义为用于将感兴趣的核酸运输到细胞中的核酸载体。载体可以是线性分子或环形分子。
将AAVP和噬菌体与AAV载体系统的选择元件相结合，得到一种容易在细菌中生产、没有包装限制的载体，并能感染哺乳动物细胞并整合到宿主染色体中。可以购买到含有许多合适元件的载体，并且可以采用标准方法进一步修饰所述栽体来引入必要序列。至少，使用本公开的方法时，载体必须接受含有启动子和转基因的盒。本公开的AAVP栽体能够通过整合到靶细胞基因组中来增强转基因表达。在某些实施方案中，转基因可以以串联体被整合到靶细胞基因组中。
在其它方面，AAVP不需要辅助病毒或反式作用因子。此外，因为没有形成AAV衣壳，所以AAV对于哺乳动物细胞的天然趋向性也被去除了。
A. AAVP靼向
本公开的AAVP可以通过在噬菌体颗粒表面表达配体来靶向特定受体。在某些实施方案中，可以整合能够允许或促进载体（以及附着其上或包裹于其中的任何分子）从内涵体中逃脱的肽或其它組分，并在噬菌体表面表达。所述"其它组分"包括本身不是肽但是具有破坏内涵体膜的能力的分子，因此促进载体的逃脱，还包括在其它方面模拟所述肽序列（参见，例如，已发表的PCT公布号WO 96/10038和Wagner等人，1992 )的内体逃脱特性的分子。
本公开的AAVP通常包括在颗粒表面表达一种或多种预先选定的配基（无论配基以何种方式附着）的丝状噬菌体。因此，无论配基的附着方式是共价方式还是通过衣壳蛋白，本公开的AAVP都能够通过配基结合受体随后通过载体的内摄，将一种或多种转基因运输到靶细胞
27该肽选择性结合av卩3和avp5整联蛋白。这些整联蛋白在侵袭肿瘤内皮细胞细胞上高度过表达。如此处所用，
"丝状噬菌体颗粒"指的是含有噬菌体基因组或嗜菌粒基因组的颗粒。该颗粒可以含有除了丝状衣壳蛋白以外的其它分子。如此处所用，"配基，，指的是能够结合细胞表面分子并内在化的任意肽、多肽、蛋白或非蛋白，所述非蛋白例如素拟肽。如此处所用，"结合到受体上"指的是以标准的体外或体内检测方法检测，配基特异性地识别并可检测的结合到受体上的能力。
典型的，本公开的AAVP包含了编码靶向肽的、插入在噬菌体质粒基因组中的寡核苷酸，该肽使栽体具有了配基-受体靶向特性。
可以通过将衣壳蛋白多核苷酸或该多核酸编码的蛋白质的整个部分或一部分偶联或融合到靶向配基上来修饰噬菌体衣壳蛋白。所述靶向配基可以直接的、间接的、把向或增强本发明的AAVP结合到特定的细胞、组织和/或器官。
最初创建靶向的病毒是为了解决基因治疗载体的天然宿主细胞趋向性问题。近年来，已经通过了许多基因治疗专利，其中含有用于使载体靶向到特定细胞的异源多肽的载体，例如含有嵌合融合糖蛋白的载体（Kayman等人，美国专利5， 643,756，此处引用作为参考）和含有针对病毒衣壳蛋白的抗体的载体（Cotten等人，美国专利5, 693, 509)。可以以这样的方式对本发明的AAVP进行遗传修饰，使其靶向特定的细胞类型（例如，平滑肌细胞、肝细胞、肾细胞、成纤维细胞、角质化细胞、干细胞、间质干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、上皮细胞、肠细胞、肿瘤或癌细胞和领域已知的其它细胞），因此核酸基因组被运输到非分裂目标细胞、正在分裂的目标细胞、或具有增殖或其它疾病的目标细胞。使病毒靶向的一种方法是通过优先结合到在细胞外表面具有某种分子的细胞上来指引病毒到达目标细胞。这种使病毒靼向的方法通过l吏乾向配基在病毒衣壳上表达或掺入到病毒衣壳，来协助病毒靶向到具有受体或结合分子的细胞或组织上，所迷受
28体或结合分子能和病毒表面上的靶向配基相互作用。在病毒感染细胞之后，遗传物质得到处理，并在宿主细胞中表达。遗传物质有可能被整合到宿主细胞的基因组中，或者游离地保存于宿主细胞中。
在本发明的某些实施方案中，可以对衣壳蛋白进行修饰使其包含
靶向组分，这样AAVP就可以被运输到特定的细胞类型或组织中。基于配基的运输系统的靶向特异性根源于配基受体在不同细胞类型中的分布。把向配基可以非共价的或共价的结合到衣壳蛋白上。
在某些实施方案中，感兴趣的异源核酸序列可以被插入到本发明的病毒载体中。例如，可以将衣壳蛋白有效地偶联到针对特定目标细胞上的受体的配基上。
靶向配基是特异性针对目标区域特征组分的任意配基。优选的靶向配基包括蛋白质，例如多克隆或单克隆抗体、抗体片段、或嵌合抗体、酶、肽或激素、或糖例如单-、寡-和多糖。在本发明的某些实施方案中，设想了靶向配基和整联蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、受体或转运蛋白的相互作用。合适的配基包括对于目标器官中的细胞、或对于
由于局部病理而暴露于循环中的目标器官结构具有特异性或选择性的任意配基。
在本发明的某些实施方案中，为了增强抗性细胞的转导、增强靶细胞的转导、或者限制非所需细胞的转导，可以将抗体或环肽靶向组分（配基）连到AAVP上。在特定的实施例中，抗体靶向组分是单克隆抗-EGF受体抗体。EGF受体分布在多种器官的细胞表面上，并且出现于灼伤、创伤、真皮和肿瘤中。肽靶向组分还可以是其序列中含有RGD整联蛋白结合基序的环肽。和细胞表面上的整联蛋白相结合的配基例如RGD肽可以介导内化，因此增强乾向复合物的运输效率。所述把向肽可以包括RGDFV (SEQ ID N0:3)序列，其中所述肽包括RGD序列，其中肽长度为3到30个氨基酸。在其它实施方案中，RGD整联蛋白结合基序的长度为3到20个氨基酸，或4到10个氨基酸。在本发明的特定的实施方案中，RGD整联蛋白结合基序是长度为5个氨基酸的肽。虽然优选在其序列中含有RGD整联蛋白结合基序的环肽，但是在本发
29明中也可以使用线性肽。20060239968使用靶向肽用于人癌症的诊断和治疗的方法和组合物：美国专利公布号20060094672、 20050191294、20050187161 、 20050074812 、 20050074747 、 20050037417 、20050003466 、 20040170955 、 20040131623 、 20040096441 、20040071689 、 20040048243 、 20030152578 、 20030113320 、 和20010046498、以及PCT公开WO 2006/060171、 WO 2006/010070、 W02005/065418、 WO 2005/026195、 WO 2004/020999、 WO 2003/022991、WO 2002/020822 、 WO 2002/020769 、 WO 2002/020723 、 和 WO2002/020722，描述了多种鉴定耙向配基的组合物和方法，在此处全部整体引用作为参考。
如此处所用，"配基"指的是能够结合细胞表面分子并内化的任意肽、多肽、蛋白质或非蛋白质，例如素拟肽。如此处所用，"结合到受体上"指的是配基特异性识别受体、并且以标准的体外或体内检测方法进行检测可以检测出的结合受体的能力。
在本发明的上下文中，所述配基被偶联到噬菌体蛋白（例如，衣壳蛋白）上（或者以融合蛋白或者通过化学结合），并用于将核酸运输到细胞中。在本发明中可以使用配基片段，只需要该片段保留有结合到合适的细胞表面分子的能力。同样，也可以使用带有置换或其它改变、但是保留有结合能力的配基。并且，特定的配基也适用于具有天然配基氨基酸序列的、以及修饰序列（例如，和天然蛋白相比发生了氨基酸置换、删除、插入或增加（突变蛋白））的多肽，只要该配基保留有结合位于内皮细胞上的它的受体、并将核酸运输到细胞中的能力。
配基还包括具有和细胞表达的其受体相结合并内化的能力的突变蛋白。这种突变蛋白包括，但不限于，用丝氨酸置换一个或多个半胱氨酸所得到的蛋白。典型的，这种突变蛋白将具有保守的氨基酸改变。在至少是低严紧性条件下，编码这种突变蛋白的DNA将，除非通过简并密码子置换进行修饰，和编码野生型配基的天然DNA序列杂交。
可以根据已知的氨基酸或DNA序列，合成制备编码配基的DNA，
30使用本领域技术人员已知的方法分离（例如，PCR扩增），或者从市 场中或其它来源来获得。通过简并密码子置换或通过编码不同的氨基 酸，编码配基的DNA可以和上面的序列不同。氨基酸序列的差异是可 忍受的，例如在不同物种的同源配基中、以及在个别有机体或物种中 所发生的差异，只要所述配基结合其受体。可以从天然来源中分离配 基，或者合成制备配基，例如通过重组体方法或化学合成。
在本发明上下文中使用的配基不必保留其任何体内活性，只有结 合细胞上的受体并被内化除外。如果已经修饰该配基来去除一种或多 种生物活性，结合并内化仍应容易地检出，例如，采用下述检测或本 领域已知的其它检测。通常，这些检测包括标记配基、使其和靶细胞 醉育、以及显影或检测细胞内标记。例如，简而言之，可以用FITC 焚光标记配基或用1251放射性标记配基，使其和细胞孵育，并用荧光 显微镜或共聚焦显微镜显微检测内化情况。
可以通过重组体或其它方法制备配基，使其联接到噬菌体衣壳蛋 白上。DNA序列以及获得这些配基的序列的方法是熟知的。根据DNA 序列，可以通过合成（对于小蛋白）、从细胞基因组或cDNA中扩增、 从基因組或cDNA文库中分离等方法合成所述基因。可以掺入用于帮助 克隆进入噬菌体或嗜菌粒载体的限制性位点，例如在扩增引物中。
这种分子包括，非限定，结合癌细胞、内皮细胞、基质细胞等的 蛋白质。这种配基包括生长因子和细胞因子。许多生长因子和生长因 子家族享有相同的结构和功能特征，并且可用于本发明中。生长因子 家族包括成纤维细胞生长因子FGF-1到FGF-15,和血管内皮生长因子 (VEGF)。其它生长因子，例如PDGF(血小板衍生的生长因子）、TGF-a (转化生长因子）、TGF-p、 HB-EGF、血管紧缩素、蛙皮素、 erythopoietin、干细胞因子、M-CSF、 G-CSF、 GM-CSF、和endoglin 也和细胞表面上的特异性鉴别的受体相结合，并且可以用于本发明中。 细胞因子，包括白细胞介素、CSFs (集落刺激因子）、和干扰素，具有 特异性受体，并且可以如此处所述进行使用。
例如，配基和配基/受体对包括尿激酶/尿激酶受体（GenBank登
31记号s. X02760/X74309 ) ; a-l， 3岩藻糖转移酶、al-抗胰蛋白酶/E-选择蛋白（GenBank登记号M98825, D38257/M87862); P-选择蛋白糖 蛋白配基、P-选择蛋白配基/P-选择蛋白（GenBank登记号1125"5， U02297/L23088) ， VCAM1/VLA-4 (GenBank登记号X53051/X16983); E9抗原（Blann等人，Atherosclerosis 120:221, 1996)/TGF卩受体； 纤维结合蛋白（GenBank登记号.X02761); I型al-胶原（GenBank登 记号.Z74615), I型（52-胶原（GenBank登记号.Z74616)、透明质酸 /CD44 (GenBank登记号.M59040) ; CD4Q配基（GenBank登记号. L07414)/CD40 (GenBank登记号.M83312) ; EFL-3 、对于elk-l (GenBank登记号.M25269)的LERTK-2配基（GenBank登记号L37361, U09304); VE-钓粘蛋白（GenBank登记号.X79981);对于链蛋白的配 基；对于LFA-1的ICAM-3 (GenBank登记号.X69819)配基、和血管 假性血友病因子（GenBank登记号.X04385)、对于ou(}3整联蛋白 (GenBank登记号.U07375, L28832)的纤维蛋白原和纤维结合蛋白 (GenBank登记号.X92461)配基。
其它配基包括CSF-l (GenBank登记号.M11038, M37435); GM-CSF (GenBank登记号.X03021) ; IFN-a (干扰素）（GenBank登记号. A02076; WO 8502862-A) ; IFN-y (GenBank登记号.A02137 ; WO 8502624-A); IL-l-p (白细胞介素la) (GenBank登记号.X02531, M15329); IL-1-(3 (白细胞介素lp) (GenBank登记号.X02532 , M15330, M15840) ; IL-1 (GenBank登记号.K02770 , M54933 ， M38756) ; IL-2 (GenBank登记号.A14844 , A21785 ， X00695 ， X00200, X00201 , X00202) ; IL-3 (GenBank登记号.M14743 , M20137); IL-4 (GenBank登记号.M13982); IL-5 (GenBank登记号. X04688 ， J03478) ; IL-6 (GenBank登记号.Y00081 ， X04602 ， M54894, M38669, M14584); IL-7 (GenBank登记号.J04156); IL-8 (GenBank登记号.Z11686) ; IL-10 (GenBank登记号.X78437 , M57627); IL-11 (GenBank登记号.M57765 M37006); IL-13 (GenBank 登记号.X69079, U10307); TNF-a (肿瘤坏死因子)(GenBank登记号.A21522); TNF-p (GenBank登记号.D12614);对于erbB2的GP30配基 (S68256);和对于转铁蛋白受体的转铁蛋白（GenBank登记号. DQ923758)。
其它配基还包括PDGF (GenBank登记号.X03795, X02811)，血管 紧缩素（GenBank登记号.K02215)，以及所有含RGD的肽和蛋白，例如 和整联蛋白受体结合的ICAM-1 (GenBank登记号.X06990)和VCAM-1 (GenBank登记号，X53051)。其它配基包括TNFa (GenBank登记号. A21522, X01394), IFN， （GenBank登记号.A11033, A11034), IGF-I (GenBank登记号.A29117, X56773, S61841, X56774, S61860) ， IGF-II (GenBank登记号.A00738, X06159, Y00693)，心房钠尿肽（GenBank 登记号.X54669),内皮缩血管肽-l (GenBank登记号.Y00749)，凝 血因子Xa (GenBank登记号.L00395, L00396, L29433, N00045, M14327), TGF-卩l (GenBank登记号.A23751) ， IL-ip (GenBank登记 号.X03833) ，IL-ip (GenBank登记号.M15330)，和内皮因子(GenBank 登记号.X72012)。
目前，FGF蛋白家族包括FGF-1 (酸性FGF或aFGF) ， FGF-2 (碱 性FGF或bFGF) ， FGF-3 (int-2) ， FGF-4 (hst-l/K-FGF) ， FGF-5， FGF-6 (hst-2), FGF-7 (角质化细胞生长因子或KGF) ， FGF-8， FGF-9， FGF-ll (W0 96/39507)， FGF-13 (W0 96/39508), FGF-14 (W0 96/39506)， 和FGF-15 (W0 96/39509)。在本发明中如下的其它多肽也是合适的， 所述多肽和FGF受体反应，是能够特异性地和FGF受体（优选高亲和 力FGF受体）相互作用的任意多肽，并由于其和FGF受体相互作用而 通过内颗粒途径运输到细胞中。配基还包括此处鉴定的配基的4， 5， 6， 7， 8, 9， 10， 15， 20， 25， 30或更多的氨基酸片段。
还设想了靼向部分是抗体及其片段。可以使用单克隆抗体片段来 靶向运输到哺乳动物中的特定器官，包括脑、心脏、肺或肝。使病毒 颗粒耙向到缺乏单独的细胞特异性标记的细胞的示例性方法已经被描 述（美国专利5, 849, 718)。例如，抗体A可以对肿瘤有特异性，但是 对正常心脏和肺组织也有，而抗体B对肺瘤和正常肝细胞有特异性。
33显然，单独使用抗体A或抗体B来向肿瘤运输抗增殖核酸将有可能导 致对心脏和肺或者肝细胞带来不想要的损伤。但是，可以一起使用抗 体A和抗体B来增强细胞靼向。因此，将抗体A偶联到编码抗增殖核 酸的基因上，并通过受体介导的摄取系统运输到肿瘤以及心脏和肺组 织中。但是，该基因在这些细胞中未转录或激活。可以将抗体B偶联 到激活子或编码对于抗增殖核酸的转录或激活所需要的因子的核酸的 普通活化基因上，并运输到肿瘤和肝细胞中。因此，在心脏和肺细胞 中，只有未激活的抗增殖核酸被运输，而其未被转录，导致不产生副 作用。在肝细胞中，编码激活因子的基因得到运输，但是没有效果， 因为不存在抗增殖核酸基因。但是在肿瘤细胞中，两种基因都被运输， 而激活因子可以激活抗增殖核酸，导致肿瘤特异性的毒性作用。
在本发明的上下文中，针对在细胞表面表达的分子的抗体是有用 的。这种抗体包括，但不限于，针对FGF受体、VEGF受体、尿激酶受 体、E-和P-selectins、 VCAM-1、 PDGF受体、TGF受体、内皮唾（液） 酸蛋白、ou(33整联蛋白、LFA-1、 E9抗原、CD40、钙粘着糖蛋白、和 elk-l的抗体。可以以单克隆或多克隆抗血清形式容易地制备特异性 针对细胞表达的细胞表面分子的抗体。目前已有许多这种抗体（例如， 从美国马里兰州Rockville的美国标准培养收集所）。此外，还可以 使用针对结合/内化配基的抗体。在此策略中，噬菌体颗粒将在其表面 具有抗体，于是和配基形成复合物。
可以使用其它许多配基用于AAVP制剂的靶向步骤，依赖于AAVP 运输的靶向位置。在某些实施方案中，设想了通过受体介导的胞吞作 用使AAVP靶向到特定的细胞类型中。例如，乳糖基酰基鞘氨醇，和靶 向LDL受体相关蛋白的肽，例如已经使用载脂蛋白E3("Apo E")使脂 质体乾向到肝中（Spanjer和Scherphof ， 1983; W0 98/0748)。还证 明，含有末端半乳糖残基的脱唾液酸糖蛋白、无涎胎球蛋白 (asialofetuin)可以使脂质体靶向到肝中（Spanjer和Scherphof ， 1983; Hara等人，1995)。当将糖：类甘露糖基（mannosyl)、岩藻糖 基（fucosyl)或N-乙酰葡糖胺偶联到多肽骨架上时，和高亲和力甘露糖受体结合（美国专利5, 432, 260，此处特别整体引用作为参考）。 因此，可以将这些糖蛋白结合到本发明的AAVP上，设想用于靶向特定 细胞（例如，巨嗟细胞）。
叶酸盐和叶酸盐受体也被描述能用于细胞靶向（美国专利 5， 871， 727 )。在该范例中，维生素叶酸盐被偶联到AAVP衣壳蛋白上。 所述叶酸盐受体对其配基具有高亲和力，并且在数种恶性细胞系表面 高表达，包括肺肿瘤、乳房肿瘤和脑肿瘤。转铁蛋白介导的运输系统 靶向范围广泛的、正在复制的、表达转铁蛋白受体的细胞（Gilliland 等人，1980)。
加入靶向配基用于基因运输来治疗过度增殖疾病能够运输其基因 产物的毒性大于非靶向系统的基因。可以运输的毒性更大的基因的例 子包括前凋亡基因，例如来自病毒和其它病原体例如腺病毒E4或f4 的Bax和Bak加基因，以及大肠杆菌噪呤核苷磷酸化酶， 一种所谓的 "自杀基因"，该基因将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷转化为有毒的 嘌呤6-甲基嘌呤。前药治疗使用的自杀基因的其它例子为大肠杆菌胞 嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。
在某些方面，AAVP可用于靶向肿瘤脉管系统。肿瘤内皮是癌症治 疗中重要的靶点。将感兴趣的治疗性基因靶向于肿瘤内皮，而对其它 组织毒性极小，仍然是抗血管基因疗法的主要目标。最近，已经描述 了靶向肺瘤内皮的AAVP。发明者研究了这种载体将潜在的抗血管试剂 人肺瘤坏死因子-ct (TNF-a)运输到黑素瘤中的能力。通过AAVP运 输内皮单核细胞激活多肽-I I (EMAP-I I)，使TNF- a抗性黑素瘤对TNF-a治疗敏感。
在体外和体内对携带有两种基因（TNF-a和EMAP-I I)的AAVP载 体进行了评价。利用人黑素瘤细胞（M21)研究了 AAVP内化和TNF-a基 因在体外的表达。通过尾静脉注射，对M21/Pmel皮下生长肿瘤的棵鼠 进行系统性治疗。使用免疫荧光染色、TaqMan RT-PCR和免疫组织化 学分析对靶向肿瘤脉管系统的AAVP的定位、TNF-oc基因表达和凋亡 进行了检测。在M21细胞中观察到了靶向AAVP的内化，导致TNF-a在培养基 上清中功能活性的高水平。在这些细胞中未观察到非靶向载体的内化。 系统注射AAVP显示出肺瘤靶向的病毒运输，并且只要极少的病毒定位 到正常器官中。AAVP运输导致TNF- a基因产物的表达。TNF- cx的表达， 诱导了血管和周围肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤明显消退。此外，表达 EMAP-II的AAVP的靼向运输使TNF-ot抗性人黑素瘤对TNF-oc治疗敏 感。耙向AAVP栽体可用于将抗血管试剂特异性地运输到肿瘤脉管系统 中，因此降低系统毒性。
可以通过结合特定的乾向配基，将本发明的AAVP靶向到躯体的特 定区域，从而在指定组织中提供AAVP以及相对应的核酸分子的快速积 累和浓度。可以通过多种方法将设想中的本发明所使用配基连接到 AAVP上。在本领域中已知多种将耙向配基偶联到衣壳蛋白的组合物和 方法。
II.核酸
本公开的AAVP具有将一种或多种转基因运输到靶细胞核中的能 力，因此增强转基因在靶细胞中的表达。AAVP还可以通过形成转基因 盒串联体，改变转基因盒的命运的方式，来增强基因表达，从而在基 因表达中具有优势。
如此处所用，术语"转基因（transgene)"指的是从一种有机体转 移另一种中的基因或遗传物质。转基因可以包括一个或多个基因和/ 或一个或多个寡核苷酸。例如，转基因可以包括受体基因、自杀基因、 前药转化酶、和/或一个或多个治疗性基因。如此处所用，"寡核苷酸" 指的是具有20或更少碱基对的短的核酸序列。如此处所用，术语"治 疗性基因"的定义是，为疾病、医疗条件、器官、组织、细胞或有机 体生理特征提供治疗效果的一种核酸区域。如此处所用，术语"盒" 是一种能够表达感兴趣的蛋白质、多肽或RNA的核酸。
除了配基以外，AAVP可以包含含有报告基因的转基因，所述报告 基因的产物能被选择或检测。如此处所述，"报告基因"是一种编码 能被检测的产物的核酸区域，例如通过荧光、对可检测的标记的化合
36物或生色底物或荧光底物的酶活性、等等进行检测；或者用于通过生 长条件进行选择的核酸区域。这种报告基因包括，非限定，绿色荧光
蛋白（GFP)、 p-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶（CAT)、萤光素酶， 新霉素磷酸转移酶、分泌型碱性磷酸酶（SEAP)、人生长激素（HGH)， 胸苷激酶等等。在某些实施方案中，可以使用编码能在血液、其它体 液或组织中检测的分泌蛋白的报告基因，来检测报告基因的表达水平。
在报告基因以外，转基因还可以包括治疗性基因。携带这种转基 因的AAVP可以对受试对象（例如，人类）进行体外或体内成像（以及 其它事情）。在体外成像中，可以用于整个受试者的非侵入成像或受 试者耙区域的成像。在引入这些转基因后，可以使用本领域已知的成 像技术（例如，BLI成像、PET成像、应该成像等等）对表达进行成像。 如此处所用，"受试者"指的是任意哺乳动物实体，例如，受试者可 以是需要基因治疗或其它治疗的人体。
在其它实施方案中，AAVP可以包含自杀基因。如此处所用，术语 "自杀基因，，被定义为通过给予前药，影响基因产物转变为杀死其宿 主细胞的化合物的一种核酸。可以使用自杀基因/前药组合的例子为单 纯疱渗病毒-胸苷激酶（HSV-tk)和更昔洛韦（ganciclovir)、阿昔洛 韦（acyclovir)或FIAU;氧化还原酶和氧化还原酶；胞嘧啶脱氨酶 和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酰胺激酶（Tdk: : Tmk)和AZT;以及脱氧 胞苷激酶和胞嘧啶阿糖核苷。在某些实施方案中，自杀基因杀死其宿 主细胞，因此为疾病或医疗条件提供了治疗效果，所以可以以治疗基 因方式发挥作用。
术语"核酸"是本领域所熟知的。如此处所用，"核酸"通常指 的是DNA、 RNA或其衍生物或类似物分子，包括核碱基（核碱基）。核 碱基包括，例如，在DNA中发现的天然产生的嘌呤或嘧啶碱基（例如， 腺嘌呤"A"，鸟嘌呤"G"，胸腺嘧咬"T"或胞嘧咬"C")或RNA (例如， A， G，尿嘧啶"U"或"C")。术语"核酸"包括了术语"寡核苷酸" 和"多核苷酸，，，后两者都是术语"核酸，，的亚属。术语"寡核苷酸" 指的是长度介于大约8和大约IOO个核碱基之间的分子。术语"多核苷酸"指的是长度至少大于ioo个核碱基的分子。
在此处的某些实施方案中，"基因"指的是转录的核酸。在某些 方面，基因包括涉及到转录、或信息产物或组合物的调控序列。本领
域技术人员将能理解，这个有用的术语"基因"包括基因组序列、RNA 或cDNA序列或较小的工程设计的核酸片段，包括基因的非转录部分核 酸片段，包括但不限于基因的非转录的启动子或增强子区域。采用核 酸操作技术，较小的工程设计的基因核酸片段可以表达，或可以适合 表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白、突变体和/或等等。
本发明的多核苷酸可以形成"表达盒"。"表达盒"是提供用于 表达特定转录单位的多核苷酸。即它包括了启动子元件和其它多种在 基因或转录单位转录中发挥作用的元件。表达盒还可以是更大的复制
多核苷酸或表达载体或构造的部分。
这些定义通常指的是单链分子，但是在特定的实施方案中也包括 额外的、和所述单链分子局部、大体上的或完全互补的一条链。因此， 核酸可以包括包含一条或多条互补链的双链分子，或特定序列的"互 补体"，包括一个分子。
"和其它编码序列实质性地分离"的意思是，感兴趣的基因形成 了核酸编码区的重要部分，或者指的是该核酸不含有天然产生的编码 核酸的大部分，例如大的染色体片段、其它功能基因、RM或cDNA编 码区域。当然，这指的是最初分离的核酸，并且不排除后来通过人工 加入到核酸中的基因或编码区域。
如此处所用，"核碱基"指的是杂环碱基，例如在至少一种天然产 生的核酸（即，DNA和RNA)中发现的天然产生的核碱基（即，A， T， G,C或U)，以及这种核碱基的天然或非天然产生的衍生物和模拟物。 核碱基通常能够以替代天然产生的核碱基配对（例如，A和T、 G和C、 以及A和U之间的氩键）的方式，和至少一个天然产生的核碱基形成 一个或多个氢键（"退火"或"杂交"）。
如此处所用，"核苷"指的是进一步包含"骨架部分"的核苷。 骨架部分通常将一个核苷共价地附加到另一个包含核苷的分子上，或
38者附加到另一个核苷上，来形成一个核酸。在天然产生的核苷中，"骨
架部分"典型地包含磷部分，所述磷部分被共价附加到5-碳糖上。"骨 架部分"的附加典型地发生在5-碳糖的3'-或5'-位置上。但是，在 本领域中已经其它类型的附加，特别是当核苷包含天然产生的5-碳糖 或磷部分的衍生物或模拟物的时候。
A. 表达结构体
本发明的表达结构体可包括编码治疗性核酸和/或成像蛋白的核 酸。在其它方面，所述表达结构体可以是可用于治疗组合物和本发明 的方法中的治疗性表达结构体。在特定的实施方案中，可以操作遗传 物质来产生编码成像蛋白、靶向蛋白和/或治疗性基因的表达盒和/或 表达结构体。
本发明的实施方案可包括两种单独类型的表达盒或包含表达盒的 表达结构体。 一个盒用于表达成像蛋白，即，可直接检测的蛋白质或 具有间接检测活性特征的蛋白。另 一个表达盒可以编码治疗性基因。 在治疗载体背景下，治疗性基因可以是此处讨论的用于疾病条件的预 防或治疗疗法的治疗性基因。在基因治疗背景下，所述基因可以是异 源MA,意味着包括了来自于病毒基因组以外来源的DNA，所述病毒基 因组提供了栽体的骨架。该基因可来自于原核或真核来源，例如细菌、 病毒、酵母、寄生虫、植物或甚至动物。异源DM还可来自于一个来 源以上，即，多基因结构或融合蛋白。所述异源DNA还可以包括可能
来自于一个来源的调控序列和
B. 控制区
本发明的表达盒和/或结构，无论其编码成像蛋白或治疗性基因， 将典型的包含多种控制区。这些调控区典型地控制感兴趣基因的表达。 1.启动子
在整个申请中，术语"表达结构体"意味着包括任意类型的含有 编码基因产物的核酸的遗传结构，其中部分或整个的所述核酸编码序 列能被转录，即，整个的或部分的成像蛋白或治疗性蛋白。所述转录 本可被翻译为蛋白质，但是不需要。在某些实施方案中，表达包括基。在其它实施方案中，表达只包括治疗 性核酸的转录，例如抑制性RNA或DNA。
编码基因产物的核酸受启动子的转录调控。"启动子"指的是被 细胞机器、或引入的机器所识别的DNA序列，是起始基因特异性转录 所需要的。在特定的方面，转录可以是组成型的、可诱导的、和/或可 抑制的。短语"受转录调控"意味着相对于该核酸，该启动子位于正 确的位置并且定向正确，来调控RNA聚合酶的启动以及基因的表达。
在此处将使用术语启动子来表述集簇在RNA聚合酶11起始位点周 围的一组转录调控模块。通过分析数种病毒启动子，包括对多种逆转 录启动子、HSV胸苷激酶（tk)和SV40早期转录单元的分析，人们对启 动子是如何组织的进行很多研究。
另外，启动子元件调控转录起始的频率。典型的，它们位于起始 位点上游30-110 bp区域，但是最近发现一些启动子在起始位点下游 也含有功能元件。启动子元件的间距经常是可变的，因此当元件互相 倒置或移动时启动子功能仍能保持。依赖于所述启动子，元件可以或 者以合作方式或者单独发挥功能，来激活转录。
用于调控感兴趣的核酸序列表达的特定的启动子被认为是不重要 的，只要它能指导核酸在靶细胞中的表达就可以。因此，在靶向的人 细胞中，优选将核酸编码区域定位于能够在靶向人细胞中得到表达的 启动子旁边并受其调控。总之，这种启动子有可能包括人、病毒启动 子或其组合。
在几个实施方案中，可以使用人巨细胞包含体病毒即刻早期基因 启动子（CMVIE) 、 SV40早期启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复序列、p-肌动蛋白、大鼠胰岛素启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶来获得感兴趣的 编码序列的高水平表达。假如对于指定目的表达水平是足够的，还设 想了使用本领域所熟知的其它病毒、逆转录病毒或哺乳动物细胞或细 菌噬菌体启动子，来获得感兴趣的编码序列的表达。通过采用已熟知 其特性的启动子，可以优化转染或转化后感兴趣蛋白质的表达水平和 模式。
40和在非诱导条件下的细胞相比，选择根据特定的生理或合成信号 受到调控的启动子能使基因产物发生可诱导表达。例如，当一个或多 个（当使用多顺反子载体时）转基因的表达对产生载体的细胞有毒时， 希望抑制或减少一个或多个转基因的表达。有可能对生产者细胞系有 毒的转基因的例子是凋亡前和细胞因子基因。已有一些可诱导启动子 系统，用于生产病毒载体，其中转基因产物有可能有毒。
蜕皮激素系统（Invitrogen公司，Carlsbad， CA)就是这样的一种 系统。该系统被设计为能使感兴趣基因在哺乳动物细胞中调控表达。 它包含一种严紧调控的表达机制，使得事实上没有转基因的基础水平 表达，但具有超过200倍的诱导能力。另一种可使用的可诱导系统是 Tet一OffTM或Tet一OnTM系、统（Clontech， PaloAlto， CA)，最^刀由Gossen 和Bujard开发（Gossen和Bujard， 1992; Gossen等人_, 1995)。该 系统也能使高水平的基因表达受到四环素或四环素衍生物例如多西环 素(doxycycl ine )的调控。
在一些情况下，希望对治疗性表达载体中的转基因的表达进行调 控。例如，根据所需表达水平，可以使用具有不同活力强度的不同的 病毒启动子。在哺乳动物细胞中，经常使用CMV立即早期启动子来提 供强转录活性。当需要降低转基因的表达水平时，也使用效果差一些 的修饰版本的CMV启动子。当希望在造血细胞中表达转基因时，经常 使用逆转录病毒启动子，例如来自于MLV或匪TV ^LTR。根据所需 效果可以使用其它的病毒启动子，包括SV40、 RSVLTR、 HIV-1和HIV-2 LTR、腺病毒启动子例如来自于E1A、 E2A、或MLP区域、AAV LTR、 花椰菜花叶病毒、HSV-TK和禽肉瘤病毒。
类似的，可以使用组织特异性或选择性启动子来影响在特定组织 或细胞中的表达，来降低对于非靶组织的潜在毒性或不良效果。例如， 可以使用启动子例如PSA,前列腺碱性蛋白，前列腺酸性磷酸酶或前 列腺-特异性腺体激肽释放酶（hK2),使基因在前列腺中靶向表达。相 似的，可以使用下面的启动子，使基因在其它組织中靶向表达（表l)。
在某些实施方案中，希望在给予基因治疗载体后的特定时间里激
41活转录。这可以通过使用可受激素或细胞因子调控的启动子来得以实 现。例如在适应症部位为性腺组织的治疗应用中，该部位产生或传递 特异性甾类，使用雄激素或雌激素调控的启动子有可能是有益的。这
种可受激素调控的启动子包括MMTV， MT-l,蜕皮激素和RuBisco。预 计在本发明中其它可受激素调控的启动子例如对甲状腺、脑下垂体和 肾上腺激素响应的启动子也是有用的。可以使用的细胞因子和炎性蛋 白响应启动子包括K和T激肽原（Kageyama等人，1987) c-fos， TNF-a， C-反应蛋白（Arcone等人，1988),触珠蛋白（Oliviero等人， 1987)，血清淀粉样A2， C/EBPa, IL-l, IL-6 (Poli和Cortese， 1989)，补体C3 (Wilson等人，1990) ， IL-8， a-l酸性糖蛋白（Prowse and Baumann， 1988)， ct-l抗胰蛋白酶，脂蛋白脂肪酶（Zechner等 人，1988),血管紧张素原（Ron等人，1990)，纤维蛋白原，c-jun (受 佛波醇酯，TNF-ot ，紫外线辐射，维a酸和过氧化氢诱导），胶原酶（受 佛波醇酯和维a酸的诱导），金属硫蛋白（可受重金属和糖皮质激素 诱导），基质降解酶（受佛波醇酯，白细胞介素-l和EGF诱导），a-2 巨球蛋白和oc-l抗胰凝乳蛋白酶。还可以使用肿瘤特异性启动子例如 骨钙素，缺氧-效应元件（HRE) ， MAGE-4， CEA，甲胎蛋白，GRP78/BiP和 酪氨酸酶来调控基因在肿瘤细胞中的表达。
可以想像，根据本发明，依赖于所需活性可以单独使用或结合使 用上述任意启动子。此外，该启动子列表不应被解释为详尽的或限制 性的，本领域技术人员会知道其它的可用于此处揭示的方法中的启动 子。table see original document page 43
2.增强子
增强子是位于和启动子相同的DM分子上的远离位置、增强从启 动子的转录的遗传元件。增强子的组织结构类似于启动子。即。它们 都由许多单独元件组成，每个都结合一个或多个转录蛋白。增强子和 启动子之间的基础距离是可操作的。整个增强子区域必须能够刺激一 段距离处的转录；这对启动子区域或其组成元件不需要适用。另一方 面，启动子必须具有一个或多个在特定位点、以特定方向直接起始RNA 合成的元件，而增强子缺乏这些特异性。启动子和增强子经常重叠或 邻接，看起来经常具有非常相似的调控组织结构。
表，在表达结构中可以将细胞启动子/增强子和可诱导启动子/增强子 与编码感兴趣的基因结合使用（表2和表3)。此外，还可以使用任 意的启动子/增强子组合（按照Eukaryotic Promoter Data Base EPDB) 来驱使基因表达。如果提供合适的细菌聚合酶，或者以运输复合物的 部分，或者以附加的遗传表达结构，真核细胞可支持从特定细菌启动 子的胞质转录。
在本发明优选的实施方案中，治疗性表达结构包括病毒或来自于 病毒基因组的改造结构。某些病毒具有的能够通过受体介导的胞吞作 用进入细胞并整合到宿主基因组中、并稳定有效地表达病毒基因的能 力使其成为有吸引力的、转移外源基因进入哺乳动物细胞的候选物 (Ridgeway， 1988; Nicolas 和 Rubenstein， 1988; Baichwal 和 Sugden， 1986; Temin， 1986)。增强子 免疫球蛋白重链 免疫球蛋白轻链 T细胞受体 HLA DQ a和DQ P
P -干扰素 —
_白细胞介素2_
白细胞介素-2受体 II 5类MHC MHC类II HLA-DRcc P -肌动蛋白 肌肉肌酸激酶 前白蛋白（转甲状腺素蛋白)一 弹性蛋白酶I 金属硫蛋白
_胶原酶_
白蛋白基因
_a -铁蛋白_
-珠蛋白 P-珠蛋白
_e-fos_
_c一HA-ras_
胰岛素 神经细胞粘附分子（NCAM) al-抗胰蛋白酵素 H2B (TH2B)组蛋白 小鼠或I型胶原 葡萄糖调节蛋白（GRP94和GRP78) 大鼠生长激素 — 人血清淀粉样蛋白A (SAA) 肌钙蛋白I (TN I) 血小板来源的生长因子 Duchenne肌营养不良症 SV40
多瘤 —
_反转录病毒_
乳头状瘤病毒 乙型肝炎病毒 人免疫缺陷病毒
巨细胞病毒 长臂猿白血病病毒
45表3
table see original document page 46
c.多腺苷酸化信号
可在治疗和/或成像载体中使用多腺苷酸化信号。在采用cDNA插 入时，典型地希望包括多腺苷酸化信号来产生正常的基因转录的多腺 苷酸化。多腺苷酸化信号的性质未被认为对所述发明的成功实施是关 键的，并且可以釆用任意的这种序列，例如人或牛生长激素和SV40 多腺苷酸化信号。还设想为表达盒元件的是终止子。这些元件可用于 增加信息水平并且使从盒到其它序列的通读最小化。
D.治疗性基因
本发明的AAVP颗粒可用于运输多种治疗或成像试剂，包括治疗性 表达载体。本发明设想了使用多种不同的治疗基因。例如，设想了编 码酶、激素、细胞因子、癌基因、受体、离子通道、肿瘤抑制子、转 录因子、药物选择性标志物、毒素和多种抗原的基因来作为适合于根据本发明的使用的基因。此外，源自癌基因的反义和抑制RNA结构是 根据本发明感兴趣的其它"基因"。
依据本发明，选择的基因或多肽可以指任意的蛋白质、多肽或肽。 治疗基因或多肽是能够给予受试者用于治疗或预防疾病目的的基因或 多肽。例如，治疗基因可以是给予受试者用于治疗或预防癌症的基因。 治疗基因的例子包括，但不限于，Rb、 CFTR、 p16、 p21、 p27、 p57、 p73、 C-CAM、 APC、 CTS-1、 zacl、 scFV ras、 DCC、 NF-1、 NF-2、 WT-1、 MEN-I、 MEN-II、 BRCA1、 VHL、 MMAC1、 FCC、 MCC、 BRCA2、 IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll IL-12、 GM-CSF、 G-CSF、胸普激酶、Bax、 Bak、 Bik、 Bim、 Bid、 Bad、 Harakiri、 Fas-L、 mda-7、 fus、干扰素a、干扰素（5、干扰素 Y、 ADP、 p53、 ABLI、 BLC1、 BLC6、 CBFA1、 CBL、 CSFIR、 ERBA、 ERBB、 EBRB2、 ETS1、 ETS2、 ETV6、 FGR、 FOX、 FYN、 HCR、 HRAS、 JUN、 KRAS、 LCK、 LYN、 MDM2、 MLL、 MYB、 MYC、 MYCL1、 MYCN、 NRAS、 P頂l、 PML、 RET、 SRC、 TAL1、 TCL3、 YES、 MADH4、 RB1、 TP53、 WT1、 TNF、 BDNF、 CNTF、 NGF、 IGF、 GMF、 aFGF、 bFGF、 NT3、 NT5、 ApoAI、 ApoAIV、 ApoE、 RaplA、 胞嘧咬脱氨酶、Fab、 ScFv、 BRCA2、 zacl、 ATM、 HIC-1、 DPC-4、 FHIT、 PTEN、 ING1、 N0EY1、 N0EY2、 0VCA1、 MADR2、 53BP2、 IRF-1、 zacl、 DBCCR-1、 rks-3、 C0X-1、 TFPI、 PGS、 Dp、 E2F、 ras、 myc、 neu、 raf、 erb、 fms、 trk、 ret、 gsp、 hst、 abl、 E1A、 p300、 VEGF、 FGF、凝 血酶敏感蛋白、BAI-1、 GDAIF、或MCC。
治疗基因的其它例子包括编码酶的基因。例子包括，但不限于， ACP去饱和酶、ACP羟化酶、ADP-葡糖焦磷酸化酶、ATPase、醇脱氬 酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氩酶、纤维素酶、环加氧酶、脱 羧酶、糊精酶、酯酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、透明质酸酶合成酶、 半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡糖氧化酶、GTPase、解链酶、半纤维素酶、 玻璃酸酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂氧 合酶、分解酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、 磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶、肽水解酶、普鲁兰酶
47(pullanase)、重组酶、逆转录酶、拓朴易构酶、木聚糖酶、报告基因、 白介素或细胞因子。
治疗基因的进一步的例子包括编码氨基曱酰合成酶I,鸟氨酸转 氨曱酰酶，精氨酸琥珀酸盐合成酶，精氨琥珀酸裂解酶，精氨酸酶， 延胡索酰乙酰乙酸水解酶，苯丙氨酸羟化酶，cx -l抗胰蛋白酶，葡 萄糖-6 -磷酸酶，低密度脂蛋白受体，胆色素原脱氨酶，因子VIII， 因子IX，胱硫醚p-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰-CoA脱 氢酶，丙酰CoA羧化酶，丙二酰CoA变位酶，戊二酰-辅酶A脱氢酶， 胰岛素，葡萄糖苷酶，丙酮酸羧化酶，肝磷酸，磷酸激酶，甘氨酸脱 羧酶，H-蛋白，T-蛋白，门克斯病铜转运ATP酶，肝豆状核变性铜转 运ATP酶，胞嘧啶脱氨酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、1-磷酸 半乳糖尿苦酸转移酶，苯丙氨酸羟化酶、葡糖脑苷脂酶、鞘磷脂酶、 -L-艾杜糖醛酸酶、6-磷酸葡糖脱氢酶、HSV胸苷激酶或人胸苷激酶的 基因。
治疗基因还包括编码激素的基因。例子包括，但不限于，编码生 长激素，催乳素，胎盘生乳素，促黄体激素，卵泡刺激素，绒毛膜促 性腺激素，促曱状腺激素，瘦素，促肾上腺皮质激素，血管紧张素I， 血管紧张素II, p黑素细胞刺激素，p-胆嚢收缩素，内皮缩血管肽， 肠抑胃肽，胰高血糖素，胰岛素，促脂解素，后叶激素运栽蛋白类、 生长抑素、降钙素，降钙素基因相关肽，p-降钙素基因相关肽，恶性 因子的高钙血症，曱状旁腺激素相关蛋白，甲状旁腺激素相关蛋白， 胰高血糖素样多肽，胰抑素，胰多肽，肽YY， PHM，分泌素、血管活 性肠肽，催产素，加压素，加压催产素，脑啡肽酰胺，甲硫脑啡肽酰 胺，a黑素细胞刺激素，心钠素，淀粉素，淀粉样蛋白P成分，促肾 上腺皮质释放激素，生长激素释放因子，促黄体激素释放激素，神经 肽Y， K物质，P物质，或促曱状腺素释放激素的基因。
而在另一个实施方案中，异源基因可以包括单链抗体。产生单链 抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。对于这种方法，技术人员可 参考美国专利号5， 359， 046 (此处引用作为参考）。使用短肽联接子
48将重链和轻链的可变结构域融合在一起产生单链抗体，因此在单个分 子上重建了抗原结合位点。
E. 多基因结构和IRES
在本发明的某些实施方案中，使用内部核糖体结合位点（IRES)元 件来创建多基因多顺反子信息（Pelletier和Sonenberg， 1988)。已经 描述了来自于细小核糖核酸病毒（picanovirus)家族的两个成员（脊 髓灰质炎和脑心肌炎）的IRES元件 （Pelletier和Sonenberg， 1988)，以及来自于哺乳动物信息的IRES (Macejak和Sar廳，1991)。 IRES元件可被交联到异源开放阅读框上。多开放阅读框可一起转录， 每个都被一个IRES间隔，产生多顺反子信息。由于IRES元件，每个 开放阅读框都容易接近核糖体来进行有效转录。使用单一的启动子/ 增强子来转录单一的信息，可以是多基因得到有效表达。任何异源开 放阅读框都可以交联到IRES元件上。这包括分泌蛋白基因、多亚基蛋 白基因、独立基因编码的基因、细胞内或膜结合蛋白基因和可选择标 志物基因。以这种方法，可以用一个结构和一个选择标记同时将数种 蛋白的表达设计到细胞中。
F. 核酸的制备
可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术制备核酸，例如， 化学合成、酶生产或生物生产。酶生产核酸的非限制性例子包括利用 扩增反应例如中的酶进行生产，所述扩增反应例如PCRTM (参见例如， 美国专利4, 683,202和美国专利4, 682,195,在此处每个都被引用作 为参考），或者如在美国专利5， 645， 897所述合成寡核苷酸，在此处引 用作为参考。生物生产的非限定性例子包括在活细胞中的重组核酸生 产（即，复制的），例如在细菌中复制的重组DNA载体（参加例如， Sambrook等人2001，在此处引用作为参考）。
III.药物组合物和给药途径
当设想临床应用时，需要准备AAVP组合物（治疗组合物）的、釆 用适合于预期应用的形式的药物组合物。通常，需要制备基本不含热 原和其它对人或动物有害的杂质的组合物。人们通常希望使用合适的盐和緩冲剂来使所述組合物适合于引入
到病人中。本发明的水的组合物包含有效量的AAVP或其它溶解于或分 散于药物可接受载体或水介质中的试剂。短语"药物或药物可接受的" 指的是在给予动物或人时不产生有害的、过敏性的、或其它不良反应 的分子实体和组合物。
如此处所用，"药物可接受载体"包括任意的和所有的溶剂、分 散介质、包被、抗细菌的和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂等等。 使用这种用于药物活性成分的介质和试剂是本领域所熟知的。任何常 规介质或试剂，只要不是与本发明的AAVP组合物不相容的，其作为成 像试剂或在治疗组合物中的使用都被设想了 。也可以将补充的活性成 分（例如其它抗癌试剂）掺入到该组合物中。在普通储存和使用条件 下，这些制剂含有保存剂来防止微生物的生长。静脉内运输工具包括 流体和营养补充剂。保存剂包括抗微生物试剂、抗氧化剂、螯合剂和 惰性气体。根据熟知额参数调整药物中的pH和多种组合物的确切浓 度。
根据预期目标确定所述組合物的有效量，所述预期目标例如成像 和/或改善状况或疾病，例如癌症。术语"单位剂量"指的是适合在受 试者中使用的物理离散单位，每个单位包含预订量的、经计算将其给 药后会产生所需反应的治疗组合物，所述给药即合适的途径和治疗用 药法。待给药的量，都根据治疗数量和单位剂量，依赖于待治疗受试 者、受试者的状态和所需保护。治疗组合物的精确的量还依赖于从业 医生的判断，并且对每个个体都是特有的。
还设想了含有两种活性成分的联合组合物。特别的，本发明提供 了含有AAVP组合物和至少第二种治疗药物的组合物，所述第二种治疗 药物例如，抗肿瘤药。
A.肠胃外投药
本发明的活性组合物可按照肠胃外投药配方制备，即，按配方制 备用于静脉内注射、肌内注射、皮下注射、或甚至采用腹腔进入途径。 依据本公开制备含有第二种试剂作为活性成分的含水組合物是本领域技术人员所已知的。典型的，可将这种组合物制备成可注射的，或以
液体溶液形式或以悬浮液形式；还可以制备为适用于通过在注射前加 入液体制备成溶液或悬浮液的固体形式；并且该制剂还可以被乳化。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；成分包括 芝麻油、花生油或水丙二醇；以及用于即时制备无菌注射液或分散液 的无菌粉末。在所有情况下所述形式都必须是无菌的，并且必须是流 体的，达到易于注射流出的程度。
所述载体还可以是含有例如水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙 二醇和液体聚乙二醇等）、其合适的混合物和蔬菜油的溶剂或分散介 质。在分散剂中可以通过维持所需的颗粒大小并通过使用表面活性剂 维持适当的流动性，例如，通过使用包被，例如卵磷脂。可以通过多 种抗细菌和抗真菌剂实现防止^t生物的作用，所述抗细菌和抗真菌剂 例如，对羟苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多 情况下，优选包括等渗试剂，例如，糖或氯化钠。可以通过在组合物 中使用延迟吸收试剂来实现注射组合物的延长吸收，所述延迟吸收试 剂例如，单硬脂酸铝和明胶。
通过在合适的、含有上面列举的多种其它成分（按照需求）的溶 剂中掺入所需量的活性化合物来制备无菌注射液，随后进行过滤除菌。 通常，通过将多种无菌活性成分掺入到含有基础分散介质和上面列举 的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。对于用于制备无菌注射 液的无菌粉末，其特别的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，产生 所述活性成分以友所有添加的所需成分的粉末，所述的添加的所需成 分来自于其上述过滤除菌溶液。
对于以水溶液形式进行肠胃外投药，例如，如果必须，所述溶液 应被合适地緩冲，并且首先用足够的盐或葡萄糖对液体稀释剂进行等 渗。这些特别的水溶液尤其适用于静脉注射、肌内注射、皮下注射和 腹膜内注射。在这一点上，本领域技术人员依照本发明将会知道可以 采用的无菌水介质。例如， 一次剂量可以溶解于l ml等渗NaCl溶液 中，随后或者加入到1000 ml皮下灌注液体中或者在目标灌输部位注
51射(参见例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences"第15th版， 1035-1038页和1570-1580页）。根据待治疗的受试者的条件必须对剂 量进行一些变化。无论如何，负责给药的人员将要确定对于个别受试 者的合适的剂量。
为了便于更好地理解本发明，给出了特定实施方案的下面的实施 例。下面的实施例决不能被阅读为对发明整个范围的限制或对定义。
IV.实施例
给予下面的实施例的目的是说明所述发明的多种实施方案，而不 意味着以任何方式对本发明进行限制。本领域技术人员将会容易地理 解，本发明非常适合于实现目标并达到最终目的和所提到的优势，以 及此处所固有的那些目标、目的和优势。提出的实施例，以及此处所 述的方法是优选的实施方案的当前代表，是示例，并且意图对发明的 范围进行限制。本领域技术人员将能想到包含在权利要求的范围所确 定的发明的精神中的其中的变化和其它使用。
实施例1: AAVP射靼 A. 实验方法
设计、构建及制备定耙AAVP粒子
用两步法制备了 RGD-4C噬菌体和RGD-4C AAVP:制备中间体 (RGD-4C fUSE5-MCS )，随即制备RGD-4C噬菌体构建体和RGD-4C AAVP。 RGD-4C fUSE5-MCS含有编码特异性靼肽RGD-4C的寡核苷酸插入子和 含有用于插入真核生物表达盒的多克隆位点（MCS)的fMCS质粒的片 段。从大肠杆菌（E. coli) (MC1061)溶解物中純化源于RGD-4C噬 菌体的fUSE5 DNA和源于噬菌体的fMCS DNA。我们通过连接RGD-4C fUSE5质粒的5. 4kb的BamHIISaclI片段和fMCS质粒的4. lkb的 BamHI/Sac11片段得到了中间体RGD-4C fUSE5-MCS。接下来，我们通 过将pAAV-eGFP(增强型GFP, Stratagene )质粒的Pacl片段（2. 8kb) 从两个ITR之间克隆到RGD 4C fUSE5-MCS的Pstl位点中而制备了定 耙AAVP-GFP。简言之，用Pacl消化pAAV以释放2. 8kb的片段，用DM
52聚合酶将其粘末端补成平末端，并克隆到RGD-4C fUSE5-MCS的平末端 Pstl位点中。为制备无ITR的定靶噬菌体构建体，通过EcoRI消化释 放位于pAAV-eGFP的ITR之间，且含有pCMV-GFP和SV40多聚A的2. 3kb 的片段，用DNA聚合酶补成平末端，然后克隆到RGD-4C fUSE5-MCS 的MCS中。为篩选表达GFP的细胞，将pQBI磷酸甘油酸激酶l (PGK, QBI0gene)启动子的BamHI-Sacl片段且含有GFPneo融合序列的克隆 到AAVP或对照噬菌体构建体的Notl位点，以保证表达GFP的细胞具 有G418抗性。通过BamHI和Sacl消化释放pQBI PGK的GFPneo片段， 用DNA聚合酶补成平末端后添加连接到Notl的磷酸化的接头。用Notl 消化后，将1. 57kb GFPneo片段克隆到AAVP或非嵌合噬菌体构建体的 Notl位点。最后，为制备携带HSVtk基因或Luc基因的定靶AAVP粒 子，将含有HSVtk或Luc的BamHI-Notl片段亚克隆到pAAV质粒的 BamHI-Notl位点中，替换GFP。从pAAV-HSVtk和pAAV-Luc中摘除 ITR-HSVtk-ITR或ITR-Luc-ITR片段后插入到RGD-4C f羅5-MCS中。 通过DNA测序和限制性分析检验构建体，从宿主大肠杆菌（E. coli) (MC1061)的培养上清中纯化所述构建体，重悬于PBS,并离心。将 得到的上清滴到大肠杆菌（E. coli) (k91Kan)。将其连续稀释液平 板接种于含有四环素和卡那霉素的Luria-Bertani ( LB )琼脂平板上， 通过菌落计数测定转导单位（TU)。
哺乳动物细胞表面结合和内化实验
发明人使用生物淘筛和选择性相互作用配体快速分析法（称为 BRASIL) (Giordano et al. , 2001 )评估了噬菌体与完整细胞的结合。 简言之，用乙二胺四乙酸（EDTA)使KS1767细胞离壁，并以4 x 106 细胞/ml重悬于含有1% BSA的达尔伯克改良的伊格尔培养液（DMEM) 中。使细胞悬液（50 in 1 )与109 TU的RGD-4C AAVP或表达乱序RGD-4C (CDCFGDCRC ( SEQ ID NO: 2 ) 、 CDCGFDCRC ( SEQ ID NO: 3 ) 、 CRCDGFCDC (SEQ ID NO: 4))的AAVP克隆、RGE-4C突变肽或非定靶对照温育。 2小时后，将AAVP/细胞混合物（水相）转移到由邻苯二曱酸二丁酯：
53环己烷（9:1 [v:v]， D - 1. 03 g/ml)组成的非混相有机相（200 jn 1 溶液于400jn 1的Eppendorf离心管中）上部，以10， 000g，于4"C下 离心10分钟。将离心管于液氮冷冻，切下离心管底部，分离出细胞 -AAVP沉淀，回收膜结合的AAVP (Giordano et al. ， 2001 )。
通过将KS1767培养于组织室玻片（Lab-Tek II Chamber Slide System; Nalge Nunc International Corp)中，用PBS洗两遍，在 含有1% BSA的DMEM中于37X:下与109 TU的RGD-4C AAVP或表达乱 序RGD-4C的对照AAVP或RGE-4C温育，温育4小时后，用PBS漂洗以 除去未结合的AAVP来进行细胞内化。通过用20mM甘氨酸（pH 2.3) 漂洗细胞来化学洗脱结合于细胞膜的克隆。然后，用PBS漂洗细胞三 次，于室温下用含有4%多聚甲醛（PFA)的PBS固定15分钟，用PBS 漂洗，用0.2% Triton X-100渗透，用PBS漂洗，再用含有1% BSA 的PBS阻断。然后将细胞于室温下与含有1% BSA的PBS中的抗-M13 细菌噬菌体第一抗体（Amersham)的1: 200稀释液温育2小时，用PBS 漂洗，再于室温下与含有1。/。BSA的PBS中的缀合Cy3的抗兔第二抗体 的1:200稀释液温育1小时。最后用PBS漂洗细胞，用含有4% PFA 的PBS固定，封片，于光学荧光显微镜下观察。
从转到AAVP粒子的细胞中回收重组AAV
用RGD-4C AAVP-GFPneo或GRD-4C嗟菌体-GFPneo感染人293细 胞。感染后4天，用表达AAV rep和cap的质粒（pXX2 )转染细胞（Xiao et al.， 1998 )，再用野生型5型腺病毒（Ad)超感染。从而通过转 染递送了 AAVrep和cap基因，并通过超感染提供了腺病毒辅助功能。 腺病毒感染后72小时时收获细胞，再将上清用于感染新的293细胞。 48小时后通过FACS分析GFP表达。此实验中，仅在转导RGD 4C AAVP-GFP嵌合体的细胞中产生有功能的重组AAV,而未在转导非嵌合 嗟菌体-GFP或几个对照的细胞中产生。在所有RGD-4C AAVP克隆中， 而非噬菌体克隆中得到类似结果。克隆哺乳动物细胞系的建立
用RGD-4C AAVP-GFPneo或GRD-4C噬菌体-GFPneo感染人293细 胞（均以106 TU/细胞）。G418筛选下分离单个克隆（n = 9/组）， 并于筛选后12周通过FACS分析了 GFP表达。将稳定克隆称为噬菌体 克隆#1-9(对于噬菌体-GFPneo )和AAVP克隆#1-9(对于AAVP-GFPneo )。
肺瘤模型
动物实验得到美国动物研究委员会（Institutional Animal Research Committee )的评审并批准。制备荷瘤小鼠（Pasqualini et al.， 1997; Arap et al. ， 1998; Ellerby et al. ， 1999; Hajitou et al.， 2001; Arap et al.， 2004; Marchib et al. ， 2004 )。通过腹 膜内实施阿佛丁 B或通过吸入气体（2%异氟醚和98°/。氧气）麻醉小鼠。 静脉内实施定耙构建体或对照。肿瘤细胞经胰酶消化、计数、离心并 重悬于无血清的培养液中。用来自Kaposi肉瘤（KS 1767 )、膀胱癌
(UC3)或前列腺癌（DU145)系的共106细胞皮下接种6周龄的免疫 缺陷棵鼠。用EF43-FGF4小鼠乳腺癌细胞（5xl04)皮下接种6周龄 的免疫活性BALBIc雌鼠。计算肿瘤体积（Pasqualini et al. ， 1997; Arapetal., 1998; Ellerby et al. ， 1999; Hajitou et al. ， 2001; Arap et al.， 2004; Marchib et al. ， 2004 )，并用平均肿瘤体积* 标准偏差（SD)表示。当肿瘤体积达到50mm2 (设定为小）或150 mm2
(设定为大）时，来自DU145的移植物（0日）、荷瘤小鼠静脉内接 受单次剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk或对照。两天后开始对大小符合的 荷瘤小鼠同期组群实施GVC治疗（每天80 mg/kg，腹膜内给药）。
荷瘤小鼠的分子遗传成像
为得到非感染性分子图像，我们使用了基于人细胞系DU145的前 列腺癌模型，其中使用了在右肩皮下区荷带肿瘤移植物雌性棵鼠。为 得到萤火虫Luc基因的表达图像，给荷瘤小鼠腹膜内实施单次剂量 (150迈g/kg)的底物D-荧光素（Xenogen)。尾静脉实施携带Luc基
55因的定靶RGD-4C AAVP或对照（非定靶AAVP-Luc或乱序RGD-4C AAVPLuc)后，使用活体成像系统200 ( IVIS200; Xenogen， CA)描绘 光子发射。成像参数：图像采集时间，l分钟；面元，2;无滤波器； flstop， 1;视场，10cm。手动定义肿瘤中测量信号强度（以光子/秒 /cm7sr表示）的兴趣区域（ROI)。
尽管在实验系统中BLI可估计表达转基因的细胞的活力，其不可 临床应用。因此，为估计建立的肿瘤移植物的活力，静脉实施100 p Ci/小鼠的[18F]-FDG后，使用 microPET扫描4义（Concorde Microsystems, TN)扫描小鼠。[18F]-FDG是市售品（PETNet， Houston, TX)。为得到HSVtk基因表达的图像，静脉实施放射性标记的核苷类 似物「F]-FEAU后1 - 2小时时进行PET成像。用配备有电脑控制的定 位床（视场（F0V)长10. 8cm，宽8cm的，无光谱，且仅限在3维表 模式下操作)的microPET R4 (Concorde Microsystems, Inc.)进行 PET成像。使用350 - 750keV的能量窗和6ns的时间窗收集完整的3 维表模式数据。首先将全部原始数据分类整理成3维正弦图，然后使 用ASIP0R VM软件（Concord Microsystems, TN )进行傅立叶面元重 建和0SEM图像重建。图像的象素大小约长lmm，层厚1. 2mm。
如Alauddin等人首先报道（2003 ),使用作为用于作为与l-溴 -2-脱氧-2-[18F]氟-3， 5-二-0-苯曱酰-a -D-阿拉伯呋喃糖冷凝的嘧 啶碱的5-乙基尿嘧啶-2， 5-双-三甲基甲硅烷醚合成了放射化学纯度 大于99%的放射性标记的[18F]-FEAU。为定量肿瘤和其他器官和组织中 源于[18F]-FEAU或["F]-FDG的放射性浓度，在图像上拖动兴趣区域， 并将测量值由nCi/mm2转化为。/。注射剂量/克（y。ID/g， Tjuvajev et al.， 1998 )。如上所述，在实施携带HSVtk基因的定靶AAVP或对照非定乾 AAVP后第3、 5、 10和16天时重复进行rF]-FEAUPET成像；在第11 天和19天之间实施GCV治疗。注意，16天时的PET成像在实施GCV 后24小时时进行，以使GCV充分消失，否则，所述GCV会与FEAU竟 争由HSVtk酶的磷酸化。在实施AAVP后用[18F]-FDG重复第17天时的 PET成像，以估计残留肿瘤（如果有）的活力。免疫组织化学实验
杀死麻醉的小鼠，并用含有4% PFA的PBS灌注。使用大鼠-抗-小鼠CD31抗体（BD Biosciences )评价了冷冻切片的肿瘤血管化。使 用TUNEL试剂盒（Promega)对石蜡包埋的切片进行凋亡分析。通过使 石蜡切片与兔抗噬菌体第一抗体（Sigma )温育，然后再与缀合过氧化 物酶的抗兔第二抗体（Dako)温育对组织中的噬菌体进行免疫检测。 用底物-色素原3， 3， -二氨基联苯胺染色切片，并用苏木精复染。通 过将器官和组织在含有2% PFA的PBS中固定2小时，再用含有15%蔗 糖的PBS平衡48小时来进行GFP免疫染色。用含有4% PFA的PBS后 固定冰冻切片20分钟后，用含有1。/。BSA和0. 1°/。 Triton X-100的PBS (PBS-T)中的5%山羊血清阻断。接下来，使组织切片与2%山羊血清 和1% BSA中的兔亲和纯化GFP抗体（Molecular Probes )温育。然后 用含有1% BSA的PBS-T中的缀合AlexaFluor 488山羊-抗-兔第二抗 体（Molecular Probes)染色切片。对丙酮固定的从用灌注PBS的动 物中摘除的肿瘤的冷冻切片进行oc v整合素免疫染色。使切片与大鼠 抗整合素otv单克隆第一抗体（Chemicon)温育1小时，再与缀合Cy3 的山羊抗大鼠第二抗体(Jackson ImmunoResearch )温育。
配体引导的粒子在哺乳动物细胞中有功能
构建了由重组AAV和表达双环肽CDCRGDCFC ( SEQ ID NO: 2 )的 fd-tet噬菌体克隆(称为RGD-4C噬菌体(Pasqualini et al. ， 1997; Arap et al.， 1998 ))构成的定粑嵌合病毒。RGD-4C肽结合oc v整 合素，所述ot v整合素是在肿瘤细胞和肿瘤血管的新生成血管内皮细 胞中过表达的细胞表面受体（Brooks et al.， 1994; Pasqualini et al.， 1997; Arap et al., 1998; Sipkins et al., 1998; Ellerby et al.， 1999; Hood et al. ， 2002 )。为得到嵌合病毒（还称为AAV/ 噬菌体；AAVP),发明人将来自重组AAV的真核基因盒插入RGD-4C 噬菌体（RGD-4C AAVP)、无插入子的噬菌体（非定靶AAVP)或表达
57对照肽（如乱序RGD-4C AAVP或D至E突变体（称为RGE-4C ) AAVP ) 的噬菌体的基因组间区内，并将其与噬菌体DNA —并包装到噬菌体衣 壳中（图7)。为显示得到的ot v整合素定靶嵌合病毒的反式元件仍 具有功能，发明人评估了 AAVP中RGD-4C肽的配体性质和反向末端重 复（ITR)的回收性质。首先，为评估肽特异性，有显示RGD一C AAVP 结合表达ct v整合素的哺乳动物细胞，这与非定靶AAVP或表达阴性对 照肽（例如RGE-4C或几种RGD-4C乱序序列）的AAVP相反（图1A )， 它们既不结合，也不影响哺乳动物细胞。也证实携带报告基因的 RGD-4C AAVP相比对照可介导配体引导的内化（图1B)和哺乳动物细 胞的转导（图1C)。细胞内化实验中使用的阴性对照包括非定靶AAVP、 多种RGD-4C乱序AAVP或RGE-4C AAVP (图1B);细胞转导实验中使 用的阴性对照则包括非定靶AAVP(图1C )、乱序RGD-4C AAVP或RGE-4C AAVP。与这些结果相同，发明人之前还证实，合成的RGD-4C肽特异性 抑制多种基于定靶RGD-4C噬菌体的构建体的细胞结合和内化
(Giordano et al. ， 2001; Chen et al. ， 2004，及未/>示的结果）。 最后显示，相比阴性对照，例如非定靶AAVP (图1D)、乱序RGD-4C 或RGE-4C，哺乳动物细胞转导也可被合成的RGD-4C肽特异性竟争。 为排除其中一些结果（图1A和1B)是由从细胞膜除去AAVP的甘氨酸
(低pH)漂洗步骤的选择性失误造成的假象的可能性，进行温度（冰 冷）控制实验（Giordano et al. ， 2001 )，其中观察到细胞结合，但 未观察到RGD-4C AAVP介导的内化。
接下来，为评估AAVP粒子中的ITR是否仍有功能，我们进行了回 收实验。结果显示，仅在转导RGD-4C AAVP的哺乳动物细胞中产生有 功能的重组AAV粒子，而非转导阴性对照构建体的细胞（图1E)。这 些结果表明，通过基因嵌合制备RGD-4C AAVP粒子不在根本上改变（1) 配体引导的RGD-4C噬菌体的肽定靶性质或（2)从转导RGD-4C AAVP 的哺乳动物细胞回收重组AAV粒子的能力。报告转基因表达的并行时 间进程表明，相比RGD-4C噬菌体，可更持久检测到RGD-4C AAVP的转 导（表4)。表4体外转基因表达
感染后天数 0 5 10 15 20 30 35 40 45 50 55 60
RGD-4C吸菌体 - ++ + 一 — - 一 一 一 — 一
RGD-4C AAVP - ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + +
两个独立的观察者于每个时间点以半定量的方式对三个平行孔中
的293细胞的GFP表达进行了评分。
转基因表达的分子机制
为洞悉AAVP粒子介导的转基因表达的分子机制，发明人研究了哺 乳动物细胞中转导基因组的命运。首先，使用表达GFPneo的AAVP产 生稳定转导的细胞系，以筛选单个转导细胞克隆。将RGD-4C AAVP-GFPneo或缺失AAV ITR的RGD-4C噬菌体-GFPneo用于转导表达 a v整合素的人293细胞（Nakafflura et al. ， 2002 )，在G418婶选 下分离克隆。回收实验显示，所有RGD-4C AAVP-GFPneo 293细胞克隆 产生有功能的重组AAV-GFPneo，但RGD-4C噬菌体-GFPneo克隆则不产 生，因此证实，嵌合的单个克隆含有有功能的ITR。尽管用非嵌合 RGD-4C谨菌体-GFPneo转导的细胞保有G418抗性，但GFP表达一般比 RGD-4C AAVP-GFPneo克隆弱（图2A )。然后发明人着手通过综合限制 性内切酶消化基因组DNA及随后的DNA印记和基于聚合酶链式反应 (PCR)的分析测定了稳定转导的克隆中的GFPneo转基因盒的命运（图 2、图3和表5)。为证明转基因盒的持久性，用AflII和XhoI消化 基因组DNA，以检测分析前的全长转基因盒的释放。在100%的RGD-4C AAVP转导的克隆中观察到所迷释放（9个克隆中n-9)，与此相比， 只在33%的非嵌合RGD-4C噬菌体构建体转导的克隆（9个克隆中n=3 ) 中观察到所述释放（图2B)。设计另一个基因组DNA的限制性内切酶 消化，以检测潜在的转基因盒的串联形式（Lieberetal.， 1999; Hsiao et al.， 2001 )。在67%的RGD-4C AAVP转导的克隆中检测到转基因 盒头尾串联体的存在（9个克隆中n-6)，而未在非嵌合RGD-4C噬菌 体构建体转导的克隆中检测到所迷串联体（图2C)。为鉴定转基因盒 的可能的另外的串联形式，使用定位于构建体的5，和3，末端侧翼的 引物进行多重PCR。仍未在非嵌合RGD-4C噬菌体构建体转导的克隆中
59_4C AAVP转导的克隆中含有串联形式（9 个克隆中n=9)，发现所有的串联形式都是头尾串联（图8B)。小PCR 产物的T0P0克隆也显示了缺失ITR的转基因盒的头尾串联（图8C) (Yangetal.， 1997 )。最终，尽管不能对大PCR产物进行测序，其 大尺寸提示，存在于连接位点含有完整ITR的串联体。还对个别DNA 的单个克隆做了详细分析（表5)。无意被理论或机理束缚，这些数 据提示，AAVP通过维持整个哺乳动物转基因盒，更好的游离DNA持久 性、转基因盒串联体的形成或也许通过结合这些非相互排斥的机理在 通过改变转基因盒的命运的方法的基因表达中具有优点。这些发现与 有关AAV认识的最新进展一致（McCarty et al.， 2004 )。 表5:载体DNA在稳定转导RGD-4C AAVP-GFneo或RGD-4C噬菌体-GFneo
的293细胞克隆中的命运
RGD-4C谨 菌体或 含有 整合 含有 游离 含有 串联 保存了 转基因 注释
RGD-4C 形式 形式 形式 盒
AAVP(穂定 的构 的构 的转
转导的克 建体 建体 基因
隆名称） 盒
嗟菌体1 是 否 否 否
谨菌体2 是 是 否 是（游 离的） 游离形式的全长噬菌体栽体
噬菌体3 是 否 否 是
噬菌体4 是 否 否 否
噬菌体5 是 否 否 否
噬菌体6 是 是 否 是 (游离 的） 游离形式的全长噬菌体栽体
噬菌体7 是 否 否 否
噬菌体8 是 否 否 否
噬菌体9 是 否 否 否
AAVP1 是 是 是 是 检测到非串联游离形式的全长AAVP栽体。缺失 Xhol位点的串联整合形式。
AAVP2 是 否 是 是 在连接位点缺失ITR的头尾串联形式.ITR位 于串联体侧翼，保存了相邻AAVP序列。
AAVP3 是 是 是 是 非串联游离形式的全长AAVP栽体，至少一种整 合形式含有头尾串联体，ITR位于串联体侧翼， 保存了相邻AAVP序列。至少一种整合形式含有 在连接位点缺失ITR的头尾串联体.
AAVP4 是 是 是 是 非串联游离形式的全长AAVP栽体。至少一种整
合形式含有头尾串联体，ITR位于串联体侧翼， 保存了相邻AAVP序列.至少一种整合形式含有 在连接位点缺失ITR的头尾串联体。
60AAVP5 是 是 是 是 非串联游离形式的全长AAVP栽体.至少一种整 合形式含有头尾串联体，ITR位于串联体侧翼， 保存了相邻AAVP序列。至少一种整合形式含有 在连接位点缺失ITR的头尾串联体。
AAVP6 是 否 是 是 缺失ITR和XhoI位点的头尾串联体。ITR位于 (串联）转基因盒侧翼，保存了相邻AAVP序列。
AAVP7 是 否 是 是 保存了 ITR的头尾串联体。其他串联体缺失 ITR。
AAVP8 是 否 是 是 至少一种整合形式含有头尾串联体，ITR位于 串联体侧翼，保存了相邻AAVP序列。至少一种 整合形式含有在连接位点缺失ITR的头尾串联 体。
AAVP9 是 是 是 是 非串联游离形式的全长AAVP栽体。至少一种整
合形式含有头尾串联体，ITR位于串联体側翼， 保存了相邻AAVP序列。至少一种整合形式含有 在连接位点缺失ITR的头尾串联体。
体内肺瘤射耙和分子遗传成像
在证实定靶嵌合病毒粒子的中心元件（即RGD-4C肽和AAV ITR) 是完整且有功能后，且在阐明哺乳动物细胞中AAVP介导的基因表达的 分子机制后，评价了全身实施AAVP后基因递送至肿瘤的特异性和效 力。将荷带源于人Kaposi肉瘤KS 1767细胞的皮下肿瘤移植物的棵鼠 用作初始临床前模型(Arapetal.， 1998; Ellerby et al. ， 1999 )。 首先，为检验病毒构建体靶向小鼠的源于KS1767的移植物，静脉内实 施RGD-4C AAVP或几个阴性对照（非定靶AAVP、乱序RGD-4C AAVP或 RGE-4C AAVP )之一。血循环3 - 5分钟后，在接受RGD-4C AAVP的小 鼠，而非对照小鼠的肿瘤血管中观察到强抗AAVP着色（图3)。将编 码绿色荧光蛋白（GFP)基因的RGD-4CAAVP变体用作报告分子，使用 原位免疫荧光显微成像法测定此载体（RGD-4C AAVP-GFP)是否可转导 源于KS 1767的移植物。给荷瘤小鼠全身实施RGD-4C AAVP-GFP或阴 性对照构建体后7天时进行抗肿瘤和不同器官中的GFP的免疫染色。 免疫荧光实验显示，GFP在接受RGD-4C AAVP的小鼠的肿瘤血管及周 围肿瘤细胞中大量表达。与此相反，未在接受非定靶、乱序或突变 AAVP-GFP的对照小鼠的肿瘤中检测到GFP着色（图3B)。此着色模式 提示，配体引导的转导受ot v整合素靶向肿瘤血管内皮细胞的介导 (Brooks et al. ， 1994; Pasqualini et al. ， 1997; Arap et al.，1998; SipHns et al. ， 1998; Ellerby et al. ， 1999; Giordano et al.， 2001; Hood et al.， 2002; Chen et al.， 2004 )。几个非定 靶对照器官（脑、肝脏、胰和肾）组织中仍缺乏GFP表达（图9)。 综上，这些结果表明，RGD-4C AAVP粒子经体内全身实施后，可通过 配体引导的机制特异性靶向肿瘤移植物并予转导。
接下来，发明人为对活体荷瘤小鼠中萤火虫荧光素酶（Luc)和 HSVtk报告基因表达的时间动力学性质和空间异质性分别进行非侵染 性监控，在全身实施RGD-4C AAVP后，使用[18F] -FEAU估计了临床前 生物发光成像（BLI )和可临床应用的分子遗传PET成像的效力。在人 前列腺癌临床前模型中进行这些分子遗传成像研究，因为适当成像患 者的此常见肿瘤仍是挑战。发明人首先使用标准实验装置对荷瘤小鼠 的萤火虫荧光素酶（Luc)转基因报告基因进行了体内成像（图4A)。 发明人选择了 Luc表达的BLI,因为其是用于小鼠报告基因成像的非 常敏感的方法，且图像中事实上无非特异性背景活性（Gross and Piwnica-Worms， 2005a; Gelovani and Blasberg， 2003; Uhrbom et al.， 2004; Walensky et al. ， 2004 )。在接受RGD-4C AAVP-Luc的 小鼠的DU145肿瘤中观察到Luc的非常肿瘤特异性的表达。相反，不 能在接受非定靶AAVP-Luc或乱序RGD-4C AAVP-Luc的对照小鼠中观察 到伴随肺瘤的生物发光信号。使用所有类型的AAVP载体（非定靶 AAVP-Luc 、乱序RGD-4C AAVP-Luc 、 RGE-4C AAVP-Luc或RGD-4C AAVP-Luc),未在正常器官（如肝、脾或肾）中观察到生物发光。这 些数据证实RGD-4C AAVP介导的射靶的肿瘤特异性，及免疫荧光显微 成像研究观察到的使用RGD-4C AAVP的转寄因表达。与之前给出的结 果一致（图9)，分布动力学研究提示，尽管存在噬菌体粒子的非特 异性肝清除(Geier et al. ， 1973; Pasqualini et al.， 1997; Arap et al., 1998; Barbas et al. ， 2001 )，该现象不导致不期望的肝 基因转导。这些观察结果与哺乳动物病毒基因递送栽体非特异性转导 正常器官（如肝）的记载（Shayakhmetov et al.， 2OO5 )形成鲜明对 比。通过体内^f吏用BLI,在实施AAVP后3天时可清晰检测到肿瘤中Luc
62报告转基因的表达，并逐渐增多，于io天时达到最大值。隔日进行
Luc报告基因表达的重复2维BLI，并提供初始的费用有效的策略，以 研究AAVP介导的报告转基因表达的特异性、时间动力学性质和空间异 质性。但因为Luc报告基因表达的BLI不可临床应用，发明人接下来 将HSVtk基因导入AAVP载体，所述HSVtk基因可用作自杀基因（当结 合丙氧鸟苷（GCV)时），且可用作用HSVtk特异性放射性标记的核苷 类似物（如["卞]-FAIU、 ["F]-FHBG和TF]-FEAU)进行的可临床应用 的PET成像的报告基因。
之前的研究证实，HSVtk表达的PET成像提供确定转寄因表达的 -f立置、量和持续时间的能力（Tjuvajev et al.， 1998; Tjuvajev et al.， 1999; Ray et al.， 2001; Massoud and Gambhir， 2003)。之 前也确定转导HSVtk的细胞系和肿瘤中放射性标记的示踪物的体内蓄 积量与HSVtk表达7jc平相关（Blasberg and Tjuvajev, 2003; Gross and Piwnica-Worms， 2005a; Tai and Laforest， 2005 )。本研究中， 发明人选择、合成并使用了放射性标记的核苷类似物2， -[18F]-氟-2， -脱氧-1-p-D-阿拉伯-吹喃糖基-5-乙基-尿嘧啶（[18F]-FEAU)，尤 其从药物动力学角度考虑（在所有正常器官和组织中非常低的背景活 性），其是HSVtk酶的相比其他核苷类似物更好的放射性标记的底物 (Kang etal.， 2005 )。通过用[1SF〗-FEAU (在第0、 3、 5、 10和16 天）进行重复PET成像，发明人将RGD-4C AAVP-HSVtk或非定靶 AAVP-HSVtk单次全身实施到棵鼠的源于DU145的肿瘤移植物和其他器 官和组织中后，观察并定量了 HSVtk基因表达的时间动力学性质和空 间异质性（图4B)。实施RGD4C AAVP-HSVtk或非定靶AAVP-HSVtk之 前的肿瘤移植物大小（约150咖2)及实施之后的肿瘤生长率在两个同 期组群小鼠中相似（图4C)。用["F]-FEAU成像显示，实施RGD-4C AAVP-HSVtk后的头五天肿瘤中HSVtk转基因表达水平逐渐升高（升高 %静脉内实施剂量/克），然后HSVtk表达水平逐渐稳定至实施栽体后 的第10天。相比之下，接受非定靶AAVP-HSVtk的对照荷瘤小鼠中仅 观察到在第3天时肿瘤中的["F]-FEAU蓄积量有少量增加，其很快降低到背景水平（图4D)。与之前的BLI实验一致，未在非定靶器官或 组织中观察到TF]-FEAUPET可检测的HSVtk表达（图4B )。事实上， PET成像中的低水平的异源活性代表正常的背景活性，其在图像中强 度加强，说明未截断低水平放射性，以人工"提高"相比非定靶组织， 在肿瘤中的HSVtk表达特异性。当肿瘤生长到可靠的可触及大小（约 350-400 mm2)时，肺瘤中HSVtk表达达到平台期，开始用GCV治疗所 有同期组群动物（图4C)。用["F]-氟脱氧葡萄糖（["F]-FDG)进行 PET成像，以监控葡萄糖代谢和GCV诱导的肿瘤活力变化。开始GCV 治疗前2天（实施载体后第9天），两组小鼠的DU145肿瘤是有活力 的且活跃地蓄积[18F]-FDG (图4E ) 。 GCV治疗后，接受RGD-4C AAVP-HSVtk的小鼠的肿瘤体积比接受非定靶AAVP-HSVtk的小鼠显著 小（p〈0.05;图4C)。 rF]-FDG蓄积减少也证明，肿瘤移植物也被 代谢性地抑制。最后一次实施GCV后24小时时（以避免与FEAU竟争） PET成像中["F]-FDG蓄积锐减证明，GCV治疗后，实施RGD-4C AAVP-HSVtk的小鼠肿瘤中HSVtk的表达水平也显著降低（图4D )。这 些研究证实RGD-4C AAVP靶向肿瘤的特异性，并显示HSVtk转基因表 达水平足够高，以有效活化GCV药物前体。
为横向评估在其他临床前模型中的效力，我们集合了 一组来自不 同种和组织源的肿瘤细胞系，并在免疫抑制小鼠或免疫活性小鼠中制 造肿瘤。荷带源于Kaposi肉瘤（KS 1767 )的荷瘤小鼠同期组群全身 性接受单次静脉内剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk或非定靶AAVP-HSVtk
(对照），所有组再接受GCV处理。相比用赋形剂处理的小鼠或接受 非定靶AAVP的小鼠，在接受RGD-4C AAVP-HSVtk的荷瘤小鼠中观察到 显著的胂瘤生长抑制（图5A)。在棵鼠的源于UC3的膀胱癌（图5B) 和源于DU145的前列腺癌（图5C)中，即便处理更大的肿瘤移植物（图 5D)，也观察到类似的肿瘤生长抑制效应，并与成像结果显示的一致
(图4)。为排除所观察的抗肿瘤效应是种特异性或异种特异性的可 能性，我们在标准小鼠肿瘤模型中分析了 RGD-4CAAVP-HSVtk的效力。 我们选择等基因肿瘤，其中将EF43-FGF4小鼠的乳腺细胞皮下实施给免疫活性小鼠，以诱导高带血管蒂肿瘤快速生长（Hajitou et al.， 2001 )。首先，抗噬菌体免疫染色显示，RGD-4C AAVP在配体引导下 乾向源于EF43 FGF4的肿瘤（图IO)。给荷带等基因乳腺癌的小鼠静 脉内实施RGD-4C AAVP-GFP或非定靶AAVP-GFP 3 一 5分钟的循环时间。 不同于非定靶AAVP-GFP， RGD-4C AAVP GFP在肿瘤中呈现强抗噬菌体 着色（图10A)。接下来，我们在静脉内实施后7天时用抗GFP抗体 进行了免疫荧光实验，以揭示接受RGD-4C AAVP-GFP的小鼠肿瘤中的 强GFP表达；相比之下，未在接受非定靶AAVPGFP的小鼠肿瘤中检测 到GFP着色；仍检测到抗av整合素抗体在EF43-FGF4肿瘤中的强表达
(图10B)。再次实施单次全身剂量的RGD-4CAAVP-HSVtk后实施GCV， 发现显著抑制EF43-FGF-4肿瘤生长（图5E ~图5G和图6 )。不仅如 此，当终止治疗后肿瘤重新增大时，重复实施RGD-4C AAVP-HSVtk再 一次抑制EF43-FGF4肿瘤生长，并提高荷瘤小鼠的生存率（图5F )。 基于噬菌体的粒子被认为具有免疫原性，但可通过乾向自身调节此特 性（Trepel et al, ， 2001 )。实际上，尽管血循环中抗噬菌体IgG 的滴度极高，RGD-4C AAVP-HSVtk + GCV在接种噬菌体的免疫活性小 鼠中仍令人惊讶地有效（图5G)。筛选实验中，使用了各种阴性实验 对照组合，包括：仅赋形剂、赋形剂+GCV、非定靼AAVP、非定耙AAVP + GCV、定把RGD-4C AAVP、定耙RGD-4C AAVP-GFP及定把RGD-4C AAVP-GFP + GCV (模拟转导）（图6A )。
未检查治疗后效应，发明人对治疗后7天回收的EF43 FGF4肿瘤 进行了详细的组织病理学分析。观察到由单次全身剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk + GCV引起的增强的肿瘤破坏。特别是通过苏木精和曙红
(H&E )染色显示，肺瘤的中央区域和只有小的有活力的外边缘均匀破 坏；相比之下，非定靶AAVP-HSVtk没有该效应（图6B)。用抗CD31 抗体染色证实，肿瘤中心区域的肿瘤血管被破坏，伸向外边缘的脉管 系统被保存，但未在用非定靶AAVP-HSVtk处理的肿瘤中观察到破坏作 用（图6B)。发明人还评估了肿瘤的标记凋亡细胞的末端脱氧核苷酸 转移酶介导的dUTP生物素切口末端标记（TUNEL )染色，因为HSVtk/GCV
65策略与细胞凋亡性死亡有关（Hamel et al. ， l"6)。在用RGD—C AAVP-HSVtk + GCV处理的肿瘤中，TUNEL染色检测到了肿瘤中心区域， 而非外边缘的凋亡，也未在接受非定靶AAVP-HSVtk嵌合体的小鼠肿瘤 中观察到凋亡（图6B)。从用相同的实验方法处理的荷瘤小鼠摘除的 对照器官未显示出组织病理性异常（图11)。综上，这些结果显示， 维持单次全身剂量的RGD-4C AAVP-HSVtk + GCV可抑制肿瘤生长。
靶向肿瘤不同部分的倾向（即是肿瘤细胞，还是肿瘤血管内皮细 胞和/或间质）取决于配体-受体系统和所使用的模型。例如，肿瘤细 胞中膜靶物（即ot v整合素）的表达从弱（EF43 FGF4 )到强（KS1767 ) 变化。然而暂且不论每个所用模型转导（和应用）的特异性最佳剂量， 还有检查转基因表达的最佳时间。换言之，报告基因表达的化学计量 学性质不仅依赖于个体细胞中报告基因表达的水平和模式，还依赖于 增殖的表达转基因的细胞相比死亡的表达转基因的细胞的相对数量。 因此，尽管发明人在这些实例中使用了固定的参数，仍可基于个案将 这些参数用于进一步确定定靶AAVP的最佳剂量和时帧。
发明人认为通过定靶AAVP (尤其是将其与不同的临床前和临床分 子遗传成像设备结合）可解决目前分子癌症学研究中难解的广泛的生 物学问题。例如，通过向靶点全身递送含有组织和/或疾病特异性启动 子（替换CMV启动子）的配体引导的构建体，可监控其相应体内天然 基因的表达；报告分子的所述启动子驱动的转录活性可用于研究细胞 运输和移植。几个非侵染性成像应用可通过报告基因反式激活、互补 或重构策略用于实验监控细胞内和整个动物内的如底物特异性降解、 蛋白-蛋白相互作用及其他分子事件（Luker et al. ， 2004; De and Gambhir， 2005; Gross and Piwnica-Worms 2005b)。发明人最近描 述了将金纳米粒子和细菌噬菌体用作生物传感器和细胞射靶制剂的网 络（Souza et al.， 2006 )，该技术可与配体引导的AAVP结合，以进 一步改进分子遗传成像。换个角度来说，AAVP本身（相比AAV载体） 可提供适合的制剂，以研究ITR结构在转基因持久性和染色体整合中 的机械原理，因为基于噬菌体的无ITR的构建体可用作阴性实验对照。
66因此，将很多其他全身性射靶和分子成像的平台及其衍生工具用于相 对短的时帧中也相继成为可能。
实施例2: AAVP在将TNF-ot靶向肿瘤血管中的用途
A. 方法
细胞培养
从Cambrex ( Walkersvi 1 le, Maryland)得到人胯静脉内皮细胞 (HUVEC)，并如上所述培养于内皮细胞生长培养液-2(Tandle et al.， 2005 )。所有实验在HUVEC传至第3-5代时进行。将M21人黑色素瘤 细胞培养于含有10%血清、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100jig/ml 链霉素、100jag/ml庆大霉素和两性霉素的RPMI1640中。将Pmel细 胞培养于含有10%血清、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100jag/ml 链霉素、100jug/ml庆大霉素和两性霉素的DMEM培养液中。
构建表达TNF-oc/EMAP-I1的定靼AAVP
AAVP骨架的总体设计和构建描述于Hajitou等人（2006 )的文献 中。两步构建表达TNF-oc的AAVP构建体。第一步，消化来自pGlSiTNF 的880bp的Notl/Hindl11片段，并连接到替换了 GFP基因序列的 pAAV-eGFP/Notl/Hindlll载体中（Hwu et al. ， 1993 )。第二步，用 PvuII消化fMCS/RGDMCS和AAV-TNF。然后将具有反向末端重复（ITR ) 的AAV-TNF- ot重新连接到fMCS-/RGDMCS的Pvul I位点，从而得到AAVP 载体。因此，pfdTNF-ot是非定靶载体，而pRGDTNF是具有向细胞表面 a v整合素受体的结合亲和力的定靶载体。
三步构建表达EMAP-II的AAVP构建体。表达成熟EMAP-II的 pET-20b质粒来自位于美国加州拉霍亚的斯克利普斯研究院的Paul Schimmel的捐赠。第一步，从pET-20bEMAP-II扩增EMAP-II序列， 使用3个引物合并PCR产物中的限制性内切酶位点和可分泌的信号序 列。引物1是在5，末端具有NotI限制性内切酶位点，随后是用于基 因产物胞外分泌的信号序列（从pSecTag2载体中设计，Invitrogen，
67Carlsbad, Cal if ornia )及EMAP-II序列的132bp的正向引物。引物 2是引物1的截短型，用于辅助PCR产物扩增。引物3是在3，末端具 有Hindlll限制性内切酶位点的反向引物。PCR扩增产生具有Norl和 Hindlll酶切位点和信号肽的667bp的产物。第二步，将EMAP-II PCR 产物克隆到pCRII-T0P0克隆载体（Invitrogen， Carlsbad, California)中。测序得到的克隆，然后如上所述将667bp的 Notl/Hindlll片段连接到pAAV-eGFP/Notl/Hindlll载体中。第三步， 用PvuII消化fMCS/RG匿S和AAV-腿P-II并连接得到AAVP载体。 因此，pfdEMAP-II是非定耙载体，而pRGDEMAP-II是具有向细胞表面
ccv整合素受体的结合亲和力的定靶载体。引物1: 5' ATTTGCGGCCGCTTTACCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGG GTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCCAGCCGGCCAGGCGCGCCGTAATGTCTAAGCCAATA GATGTT3， （ SEQ ID NO: 4);引物2: 5， ATTTGCGGCCGCTTTACCACCATGG3，
(SEQIDNO: 5);引物3: 5， CCCAAGCTTGGGTTATTTGATTCCACTGTTGC3，
(SEQ ID NO: 6)。
AAVP粒子纯化
为得到非定靶和定靶AAVP粒子，将DM电转染到MC1061大肠杆 菌（E. Coli)中。从培养物上清中纯化细胞和病毒粒子。从渗透性 k91Kan细胞纯化大型AAVP粒子。为测定细菌转导单位（TU )的数量， 用噬菌体粒子的连续稀释液感染k91细胞，并平板接种于含有四环素 和卡那霉素的Luria-Bertani琼脂平板上，然后通过细菌菌落计数测 定TU。
体外噬菌体内化实验
在6-孔组织培养板中过夜培养M21细胞。为研究栽体内化，用培 养液漂洗细胞，然后用病毒粒子于37X:下感染3小时。温育后，将平 板放在冰上5分钟，以中止病毒内化。通过再用Hank， s平衡盐溶液 (HBSS)漂洗细胞除去未结合粒子。通过用枯草杆菌蛋白酶（3mg/ml枯草杆菌蛋白酶、20mM Tris pH7. 5、 2mM EDTA pH8. 0,溶于无钙和 镁的HBSS中）在水上处理1小时灭活胞外病毒粒子（Ivanenkow et al.， 1999 )。然后通过轻轻吹打使细胞离壁，并用2mMEDTA在水上灭活枯 草杆菌蛋白酶15分钟。用溶解緩冲液（lOmM Tris pH7. 5、 2mM EDTA pH8. 0和2%正钒酸钠）溶解细胞，释放内化的AAVP粒子。如上所述测 定内化的AAVP浓度作为TU。
免疫荧光（IF)测定
用IF观察M21细胞中内化的病毒粒子。简言之，于37'C下在含 有10%血清的DMEM中用AAVP粒子感染培养于8孔Lab-Tek室玻片 (Nunc, Rochester, New York)中的细胞16小时。感染后，用PBS 洗细胞，移开小室，用3. 7%的多聚曱醛固定细胞10分钟。用含有0. 1% 急苷（Sigma， St. Louis, Missouri )的PBS 、渗透细胞，然后用阻断 緩沖液（含有1% BSA、 0. 025°/。叠氮化钠和0. 1%皂苷的PBS)阻断15 分钟。用渗透緩冲液漂洗后，将细胞与小鼠抗细菌噬菌体抗体温育1 小时，再与缀合FITC的抗小鼠IgG抗体温育1小时。分开衬垫，用抗 衰剂（Antifade) (MP Biomedicals, Solon, Ohio)给细胞封片， 并在Zeiss Axiovert荧光显微镜下检查。 由噬菌体的基因表达
如内化实验，用AAVP粒子感染M21细胞。48小时时更换培养液。 第4天和12天时收集培养上清，通过ELISA测量可分泌的细胞因子水 平(Invitrogen， Carlsbad, California)。
组织因子（TF)测定
为检测分泌的TNF- a /EMAP-II是否有功能，我们检测了其在内皮 细胞（ECs)中诱导TF合成中的能力。简言之，将2xl(T细胞/孔的 HUVEC平板接种于6孔组织培养板上。第二天用M21培养上清在无血 清的RPMI培养液中处理细胞6小时。用PBS漂洗细胞，并于室温下与 25mMTris pH 7. 5温育10分钟。将培养板于-80X:下温育2小时。用 组织因子测定緩沖液（20mM Tris pH 7.5、 150mM NaCl和0. 1% BSA)
69制备总细胞溶解物。于13， 000rpm下离心澄清溶解物IO分钟。取100 ji 1溶解物，通过用 Amelung KC 4A Micro Coagulation Analyzer (Sigma， St， Louis, Missouri )测量CaCl2存在下缺乏因子VIII的 血浆(Geroge King Biomedical Inc， Overland Park, Kansas)的 凝固所需时间分析了组织因子的存在。使用已知浓度的组织因子标绘 的标准曲线将缺乏因子VIII的血浆的凝固所需时间转化为组织因子 单位。
体内AAVP递送和免疫荧光染色检测
根据NIH动物实验管理委员会批准的流程进行了所有动物实验。 无胸腺雌性棵鼠得自Jackson实验室，并饲养于美国癌症研究所的动 物伺养设施中。将人黑色素瘤细胞（4xl06)皮下接种于棵鼠右胁。 测量肿瘤三维，并以长x宽x高x 0. 52计算肺瘤体积（mm3)。当肿瘤 体积达到约100 ~ 150 mm3时，静脉注射（通过尾静脉）1 x 1011 AAVP 粒子。在不同的时间段给动物实施安乐死。将切下来的肺瘤组织和对 照组织（肾和肝）冷冻，以做进一步分析。
为检测AAVP的存在，对5 juM厚的冰冻切片进行双重IF染色。简 言之，用4%的多聚甲醛固定切片5分钟，然后用PBS洗两遍10分钟。 用含有1% Triton-X-100的PBS渗透10分钟。将切片与成像-iT FX 信号增强剂于室温（RT)下温育30分钟，然后用含有l%Triton-X-100 的PBS洗三遍。用5%山羊血清于室温下阻断非特异性结合30分钟。 于4匸过夜温育第一抗体：抗fd细菌噬菌体抗体（Sigma, St， Louis, Missouri )的1: 2000稀释液和抗小鼠CD31( BD Biosciences, San Jose, California)的1: 50稀释液。用含有1% Triton-X-100的PBS洗三 遍10分钟，然后与第二抗体（Invitrogen， Carlsbad, California): 山羊抗兔Alexa Fluor 594的1: 400稀释液和山羊抗大鼠Alexa Fluor 488的1: 400稀释液避光温育30分钟。用含有1% Triton-X-100的PBS 洗三遍10分钟，再用PBS洗一遍后，用含有DAPI的Vectashield封 片液(Vector labs, Burlingame， Cal ifornia )封片。TNF-a体内表达
为检测TNF-a蛋白表达，用含有蛋白酶抑制剂混合物（Roche, Branchburg, New Jersey)的溶解緩冲液（50mMTris pH 7.4、 140mM NaCl、 0.1%SDS、 1。/。NP40和0. 5°/。脱氧胆酸钠）从5pM冷冻组织切片 制备总细胞溶解物。于13，000rpm离心10分钟澄清溶解物。 一使用 BioRAD的蛋白测定试剂定量蛋白量。通过ELISA测定相当于5Q ji g总 蛋白量的溶解物中的人TNF-cc。
为检测TNF-oc表达定位，如下染色5 juM冰冻组织。筒言之，用 4%的多聚甲醛固定切片20分钟，然后用PBS洗三遍，每次5分钟，并 用5。/。山羊血清阻断非特异性结合20分钟。切片与抗fd抗体（Sigma， St， Louis ， Missouri)的1:200稀释液或TNF-ot抗体（Novus Biologicals, Littleton, Colorado)的1:100稀释液，或大鼠抗小 鼠CD31 ( BD Biosciences, San Jose, California )温育1小时，然 后用漂洗緩沖液（含有50mM Tris pH 7. 6和0. 02%吐温-20的PBS) 洗三遍，每次5分钟。用3%过氧化氩阻断内原性过氧化物酶5分钟后， 漂洗并与抗小鼠-HRP或生物素化的驴抗大鼠第二抗体的1: 200稀释液 温育30分钟。用二氨基联苯胺四盐酸盐底物（Dako, Carpinteria, California )染色切片5分钟，再用苏木精复染30秒，用自来水漂洗， 脱水、清洁并封片。
凋亡测定
4吏用原位凋亡检测试剂盒TACS TdT (R&D System, Minneapolis, Minnesota)，才艮据生产商的建议检测凋亡。 肿瘤生长分析
将人黑色素瘤细胞（3x 106)皮下接种于棵鼠右胁。当肿瘤体积 达到约100 mi^时，通过尾静脉实施1 x 1011 AAVP粒子。7天后再重复 实施一次AAVP粒子。然后每三天以动物不知情的方式测量荷瘤小鼠的 肿瘤体积。统计分析
通过方差分析(A,A )和Tukey comparison post test( GraphPad Instat Software, Inc， San Diego， California)比较各组。将P 值<0. 05视为统计学显著。
B. 结果
哺乳动物细胞内化AAVP粒子
之前的研究显示，噬菌体粒子可由整合素介导的受体内化而内化 (Hajitou et al. ， 2006 ) 。 M21细胞在其细胞表面表达oc v P 3受体 (数据未显示）。为检测M21细胞是否可内化AAVP粒子，我们用AAVP 粒子感染细胞后，对内化的噬菌体计数。感染后，通过枯草杆菌蛋白 酶处理灭活整个胞外病毒，溶解细胞并回收溶解物中的内化噬菌体。 以TU测量内化的AAVP浓度（表6)。相比用定靼空载体（RGD)或表 达TNF-oc的定乾AAVP (RGDTNF-oc )感染的M21细胞，用非定靶空载 体（fd)或表达TNF-a的非定靶病毒（fdTNF-a )感染的细胞的AAVP 内化最小。
表6噬菌体内化测定
table see original document page 72

使用IF显示M21细胞中内化AAVP粒子的定位。用表达TNF-ct的 非定靶病毒（fdTNF-a )感染的细胞未显示噬菌体定位（图12A，上 图）。相比之下，用表达TNF-cx的定靶AAVP (RGDTNF-oc )感染的细 胞显示在M21细胞内的增强的定位（图12A，下图）。
AAVP介导的基因表达
测定定靶AAVP可感染并定位于哺乳动物细胞内后，我们研究了病 毒感染是否可导致基因产物的表达。再用表达TNF-a的AAVP感染M21 细胞，并通过ELISA测定了 TNF-oc基因产物的产生。所述基因产物是可分泌的，且可在培养上清中检测到（图UB) 。 5天的感染后检测上 清显示TNF-a水平是800pg/ml。 12天时检测到的基因产物高于4天 时。用稀释剂对照（PBS)，非定靶空载体（fd)、表达TNF-oc的非 定乾病毒（fdTNF-oc )和定靶空载AAVP (RGD)感染无可检测水平的 TNF-oc分泌（图12B)。
为检测AAVP感染的M21细胞分泌的TNF-ot是否有功能，我们检 测了其在ECs内诱导组织因子（TF)合成的能力。分泌的TNF-oc可在 ECs内诱导TF表达（图12C)。将重组TNF-ct用作阳性对照。可通过 温育含有TNF-ot单克隆抗体的培养上清阻断TF诱导。感染后23天分 析培养上清仍显示有功能的TNF-a分泌（图UC)。因此，用AAVP 单次感染直到感染后23天仍可至有功能的基因产物产生。
AAVP体内耙向肿瘤
我们观察到AAVP体外感染哺乳动物细胞及TNF-a基因产物的体 外功能性表达。为评估AAVP的体内射靶，将病毒通过尾静脉全身注射 给荷瘤棵鼠。
对注射了稀释剂（PBS)或RGDTNF-ct AAVP的小鼠于注射后15 分钟、l天、2天、3天、4天、8天和10天时实施安乐死。通过双重 IF染色分析了肿瘤组织的冷冻切片中病毒粒子的存在。如图13显示， AAVP粒子被染成红色（Alexa Flour 594 )，血管被染成绿色（Alexa Flour 488 ) ， DAPI显示核着色。未在注射了 PBS的动物于任何时间 点观察到AAVP的存在。显示了注射PBS后15分钟的动物肿瘤的有代 表性的切片（图13A)。注射了表达RGDTNF-ot的AAVP的动物显示病 毒粒子在血管中的共定位（图13B-H)。在注射15分钟后的动物中检 测到病毒粒子的最多蓄积（图13B)。在所有,皮检时间点检测到AAVP 的存在：1天（图13C) 、 2天（13D) 、 3天（图13E ) 、 4天（图13F )、 8天（图13G)和10天（图13H)。但我们注意到期间可检测到的病 毒粒子逐渐减少。
AAVP不体内靼向正常组织
为检测AAVP在体内靶向肿瘤血管的特异性，我们检测了于不同时
73间点注射了 PBS或表达RGDTNF-a的AAVP的棵鼠的两个对照组织（图 14和图15)。如上所述，使用双重IF染色检测了病毒的存在。
如图14所示，我们于第1天观察到肝组织中一些病毒粒子着色（图 14A)。但在第2天病毒着色降到最低水平（图l化），到第3天（图 14C)、第8天（图14D)和第10天（图l化）就检测不到病毒着色。 图15显示肾切片着色，表明存在病毒粒子。但未在任何被检时间点（第 l天（图15A)、第2天（图15B)、第3天（图15C)、第8天（图 15D)和第10天（图15E))检测到肾中存在AAVP病毒粒子。然而所 有肾组织于不同时间点都显示血管被较好着色。
由AAVP的有功能的基因产物的体内表达
为检测靼向胂瘤血管的AAVP粒子是否可表达基因产物，我们通过 ELISA重复分析了第3天、第4天、第8天和第IO天的肿瘤组织中的 TNF-a蛋白水平（图16C)。我们观察了所有被检组织中内原性TNF-cc表达的基础水平。注射了 PBS的动物未在任何时间点显示任何内原 性水平升高。注射了 RGDTNF-a AAVP的小鼠在第4天观察到TNF-oc 表达着色，并逐渐升高至第10天（图16)。
为检测基因产物产生的细胞类型，我们用TNF-ot特异性抗体染色 了组织切片。我们观察到血管周围存在TNF-a着色（图17A)。为观 察对TNF-ot表达的影响，我们染色了胂瘤切片的凋亡。用TACS蓝色 标记检测到DNA片段化。凋亡细胞被染成蓝色（图17B，左图）。为 区别凋亡细胞与坏死细胞，用核坚牢红复染样品，以用形态辅助确认 凋亡。我们观察到血管和周围的肿瘤细胞在凋亡。右图显示了用CD31 特异性抗体染色的血管（图17B，右图）。
肿瘤生长分析
我们在两个不同肿瘤模型（TNF-a敏感型（M21)和TNF-ot耐受 型（Pmel))中分析了 AAVP对棵鼠的肿瘤移植物生长的影响，以检测 表达TNF-a的AAVP的治疗效力。使人黑色素瘤M21肿瘤（其对TNF-oc 敏感）在棵鼠皮下生长。 胂瘤发生后，通过尾静脉注射不同的AAVP 构建体或PBS全身处理小鼠。观察所述动物27天。用表达TNF-a的定耙AAVP (RGDTNF-a )处理M21肿瘤显示特有的中心肿瘤坏死和肿 瘤皱缩。在第27天（不同同期组群的最后的检测时间点），经PBS 处理的组的肺瘤体积平均值为743 ± 383 ( 土SD) mm3,非定靶fdTNF 组的肿瘤体积平均值为613 士 155 ( 士SD)mm3，定靶空载RGD噬菌体组 的肿瘤体积平均值为622 ±141 ( ±SD) mm3，及表达TNFa的定耙组的 肿瘤体积平均值为359 ±98( ±SD)mm3(p<0. 048 )(图18A)。 RGDTNF-oc组的肿瘤体积减小从第20天开始统计学显著。
在TNF-a耐受型肿瘤模型中，通过在实施TNF-ot前用表达 EMAP-II的AAVP预处理人黑色素瘤Pmel肺瘤，将其致敏为TNF-ot有 效型。我们在之前的研究中证实，用病毒载体递送EMAP-II可将耐受 型肿瘤致敏为对全身递送的TNF-ct有效。用表达EMAP-II的AAVP全 身治疗棵鼠肿瘤皮下生长，再用重组TNF-a (rTNF-ot)全身治疗。 治疗后对肿瘤观察2周。如图18B所示，用表达EMAP-II的非定靶AAVP (fdEMAP)治疗的小鼠相比仅用PBS处理的小鼠显示出类似的肿瘤生 长。仅用rTNF-a或表达EMAP-II的定靼AAVP (RGDEMAP-II)治疗的 小鼠显示出很小的效应，与PBS或fdEMAP-II组无显著不同。但经 RGD-EMAP-II病毒和rTNF-a联合处理的小鼠显示出胂瘤体积的显著 减小(p=0. 007 )。
实施例3:人转铁蛋白肽靶向转铁蛋白/转铁蛋白受体系统 用CRTIGPSVC ( SEQ ID NO: 1) AAVP-Luc转导培养的人神经胶质 瘤细胞，将U87人源神经胶质瘤细胞以40， 000细胞/孔的密度接种于 24孔平板，并于37C过夜培养。第二天，根据Nature Method的方法 将细胞与AAVP温育。将RGD-4C AAVP GFP和RGD-4C AAVP Luc用作 测定转导效率的阳性对照。于第7天时成像。噬菌体吸收少，但当细 胞培养于铁AAVP水凝胶（平板和图的末栏）（图19A-19B)中时显著 升高。我们在向荷带U87源神经胶质瘤细胞的动物全身实施CRTIGPSVC (SEQ ID NO: l)AAVP-Luc后，评估了其特异性和效率。注射噬菌体 7天后测量了焚光素酶活性。参考文献
下述参考文献详细地引入此处作为参考以扩展此处所引用的示
例性的方法或者作为其它细节的补充。
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