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具有高平β-葡聚糖的小麦

阅读:688发布:2021-06-28

专利汇可以提供具有高平β-葡聚糖的小麦专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含(1,3;1,4)?β?D?葡聚糖(BG)的小麦籽粒。所述小麦籽粒特征在于以下特征中的一个或更多个:至少3%(w/w)的BG含量;所述籽粒的所述BG具有在约1.0和约2.0之间或在约1.0和2.3之间的DP3/DP4比;以及所述BG是部分 水 溶性的,使得在8.0%和约25%之间或在约10%和约25%之间的所述籽粒的所述BG是 水溶性 的。本发明还提供了该籽粒的用途。,下面是具有高平β-葡聚糖的小麦专利的具体信息内容。

1.小麦籽粒,所述小麦籽粒包含(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖(BG),所述小麦籽粒特征在于以下的一个或更多个或全部:
a)其中所述籽粒的BG含量是至少3%(w/w);
b)其中所述籽粒的所述BG具有在约1.0和约2.0之间或在约1.0和2.3之间的DP3/DP4比;以及
c)其中所述BG是部分溶性的,使得在8.0%和约25%之间或在约10%和约25%之间的所述籽粒的所述BG是水溶性的。
2.如权利要求1所述的籽粒,其中所述小麦籽粒的所述BG含量是至少4%(w/w)、至少
5%(w/w)、至少6%(w/w)、在3%(w/w)和约8%(w/w)之间、在约4%(w/w)和约8%(w/w)之间、在约5%(w/w)和约8%(w/w)之间、约4%(w/w)、约5%(w/w)、约6%(w/w)、约7%(w/w)或约8%(w/w)。
3.如权利要求1或权利要求2所述的籽粒,其中通过用以下处理从所述籽粒获得的全麦面粉的样品确定:(i)在80℃用80%乙醇处理1小时,随后是(ii)在37℃在水性缓冲液中溶解BG 2小时,以及(iii)确定从所述样品溶解的BG的水平,所述BG相对于相应野生型籽粒包含增加比例的水溶性BG。
4.如权利要求3所述的籽粒,其中所述籽粒的所述BG含量的至少6%、优选地至少8%、至少10%、至少12%、至少14%、、至少16%、至少18%、约6%、约8%、约10%、约12%、约
14%、约16%、约18%或在6%和约20%之间是水溶性的。
5.如权利要求1至4的任一项所述的籽粒,其中所述籽粒的所述BG具有小于约2.5、优选地小于约2.4、小于约2.3、小于约2.2、小于约2.1、小于约2.0、小于约1.9、小于约1.8、约
2.5、约2.4、约2.3、约2.2、约2.1、约2.0、约1.9、约1.8或在约1.6和约2.5之间的DP3/DP4比。
6.如权利要求1至5的任一项所述的籽粒,其中所述籽粒包含主要具有至少约100kDa、优选地至少约500kDa的分子量的BG。
7.如权利要求1至6的任一项所述的籽粒,所述籽粒是转基因的,诸如包含编码一种或更多种CslF多肽和/或CslH多肽、除草剂耐受性基因的一种或更多种外源多核苷酸,或编码沉默RNA分子的多核苷酸。
8.如权利要求7所述的籽粒,所述籽粒包含外源CslF6多肽。
9.如权利要求8所述的籽粒,其中所述CslF6多肽包含序列与来自植物,优选地谷物植物或科禾本科(Poaceae)中植物,的CslF6多肽的基酸序列至少95%同一的氨基酸。
10.如权利要求9所述的籽粒,其中来自植物的所述CslF6多肽是(i)燕麦、玉米、高粱或水稻CslF6多肽或(ii)来自天然籽粒BG具有小于2.3的DP3/DP4比的植物的CslF6多肽。
11.如权利要求1至10的任一项所述的籽粒,所述籽粒还包含外源CslH多肽。
12.如权利要求1至11的任一项所述的籽粒,所述籽粒是非皱缩的和/或具有至少25mg、优选地至少约30mg或至少约35mg、或者在约30mg和约50mg之间的重量。
13.如权利要求1至12的任一项所述的籽粒,所述籽粒能够产生雄性和雌性能育的小麦植物,或与相应野生型植物在形态上和/或生长速率上基本上相同的小麦植物。
14.如权利要求1至14的任一项所述的籽粒,其中所述籽粒具有相对于相应野生型籽粒的发芽率约70%至约90%或约90%至约100%的发芽率。
15.如权利要求1至14的任一项所述的籽粒,所述籽粒包含淀粉,其中所述籽粒的所述淀粉按所述籽粒的可提取淀粉的比例具有至少60%(w/w)、或至少67%(w/w)或至少70%(w/w)的直链淀粉含量。
16.如权利要求1至15的任一项所述的籽粒,所述籽粒不含编码减少内源CslF基因的表达的RNA的任何外源核酸。
17.如权利要求1至16的任一项所述的籽粒,其中所述籽粒的所述淀粉含量按总籽粒重量的百分比是至少30%、优选地至少35%、至少40%或至少45%。
18.如权利要求1至17的任一项所述的籽粒,其中所述植物是六倍体小麦,优选地普通小麦(Triticum aestivum)。
19.如权利要求1至18的任一项所述的籽粒,其中所述籽粒的所述淀粉特征在于选自由以下组成的组的一个或更多个特性:
a.包含至少2%的抗性淀粉;
b.包括少于55的血糖指数(GI);
c.按所述籽粒的所述淀粉含量的比例包含少于20%的支链淀粉;
d.包含在相对于野生型小麦淀粉颗粒具有改变的形态的淀粉颗粒中;
e.包含在相对于野生型小麦淀粉颗粒展现出在偏振光下减小的颗粒双折射的淀粉颗粒中;
f.当所述籽粒被碾磨成面粉时,此类面粉展现出减小的膨胀体积;
g.相对于野生型小麦淀粉改变的链长度分布和/或支化频率
h.凝胶化温度和更高的峰值温度的延迟结束;
i.降低的粘度(峰值粘度、糊化温度);
j.增加的支链淀粉分子量;以及
k.相对于野生型小麦淀粉颗粒或淀粉改变的%结晶度或%A型淀粉或%B型淀粉。
20.如权利要求1至20的任一项所述的籽粒,所述籽粒被加工使得它不再能够发芽,诸如粗磨的、破裂的、半煮的、揉捻的、制成粉粒的、碾磨的或研磨的籽粒。
21.如权利要求1至19的任一项所述的籽粒,所述籽粒被包含在小麦植物中。
22.一种能够产生权利要求1至19的任一项所述的籽粒的小麦植物,优选地所述小麦植物包含编码CslF6多肽和/或CslH多肽的一种或更多种外源多核苷酸。
23.如权利要求22所述的小麦植物,所述小麦植物是雄性和雌性能育的。
24.从权利要求1至20的任一项所述的籽粒产生的面粉诸如全麦面粉或胚乳面粉。
25.包含BG和一种或更多种外源Csl多肽的小麦胚乳或小麦胚乳面粉,其中如果所述一种或更多种Csl多肽包含CslF6多肽,所述胚乳或所述胚乳面粉的BG含量是按重量计至少
0.3%或至少0.4%,或者如果所述一种或更多种Csl多肽包含CslH多肽,所述胚乳或所述胚乳面粉的BG含量是至少1.2%。
26.如权利要求25所述的小麦胚乳或小麦胚乳面粉,所述小麦胚乳或小麦胚乳面粉包含CslF6多肽。
27.一种组合物,所述组合物包含从权利要求1至20的任一项所述的籽粒产生的分离的小麦BG和阿拉伯糖基木聚糖(AX),所述BG和所述AX在水性介质中是可溶的,且所述BG具有小于2.0的DP3/DP4比和主要至少约100kDa的分子量。
28.如权利要求1至20的任一项所述的小麦籽粒、或权利要求24至26的任一项所述的面粉、或权利要求27所述的组合物,用在或用于在产生产物以增加所述产物中BG水平。
29.一种食品成分,所述食品成分包含权利要求1至20的任一项所述的籽粒,或所述食品成分是或包含权利要求24至26的任一项所述的面粉、优选地全麦面粉,或所述食品成分是或包含权利要求27所述的组合物,优选地所述食品成分被包装准备出售。
30.如权利要求29所述的食品成分,其中所述籽粒被加工使得它不再能够发芽,诸如煮熟的、粗磨的、破裂的、半煮的、揉捻的、制成粉粒的、碾磨的或研磨的籽粒或这些的任何组合。
31.一种以基于干重的至少1%的水平包含食品成分的食品产品,或以基于干重的至少
0.1%的水平包含饮料成分的饮料产品,其中所述食品成分是权利要求1至20的任一项所述的小麦籽粒、权利要求24至26的任一项所述的面粉、权利要求27所述的组合物或权利要求
29或30所述的成分,且其中所述饮料成分是权利要求27所述的组合物。
32.权利要求31所述的食品产品或饮料产品,用于改变动物中的一种或更多种生理参数,优选地代谢健康、肠道健康或心血管健康,或预防或减少动物中代谢、肠道或心血管疾病的严重程度或发生率的生理参数。
33.如权利要求32所述的食品产品或饮料产品,其中所述动物是人。
34.一种组合物,所述组合物包含权利要求1至20的任一项所述的籽粒、或权利要求24至26的任一项所述的面粉,以及BG含量少于2%(w/w)的小麦籽粒或由其获得的面粉,其中权利要求1至20的任一项所述的籽粒或权利要求24至26的任一项所述的面粉构成按重量计所述组合物的至少1%。
35.一种产生小麦植物的方法,所述小麦植物产生根据权利要求1至19的任一项的籽粒,所述方法包括以下步骤:(i)将编码一种或更多种CslF多肽或者CslF多肽和CslH多肽的一种或更多种外源多核苷酸引入进祖先小麦细胞,以及(ii)从(i)的所述小麦细胞产生小麦植物。
36.如权利要求35所述的方法,所述方法还包括以下步骤:(iii)从所述小麦植物获得籽粒以及(iv)测试所述籽粒以确定所述籽粒中BG的水平或类型。
37.一种产生小麦植物的方法,所述小麦植物产生根据权利要求1至19的任一项的籽粒,所述方法包括以下步骤:(i)将包含编码一种或更多种CslF多肽的一种或更多种外源多核苷酸的第一小麦植物与第二小麦植物杂交,以及(ii)从(i)的杂交选择产生根据权利要求1至19的任一项的籽粒的后代小麦植物。
38.一种选择小麦植物的方法,所述方法包括(i)确定从至少两株小麦植物的每株获得的籽粒中的BG的量,以及(ii)从(i)选择产生根据权利要求1至19的任一项的籽粒的植物。
39.一种产生根据权利要求1至20的任一项的籽粒的方法,所述方法包括以下步骤:从权利要求23所述的小麦植物,优选地从至少1000株此类小麦植物的群体,用机械收割机收获小麦籽粒,以及ii)任选地,加工所述籽粒。
40.一种产生小麦籽粒的箱的方法,所述方法包括:
a)收割包含在权利要求1至19的任一项中定义的小麦籽粒的小麦秸秆;
b)将所述秸秆脱粒和/或选以从谷壳分离籽粒;以及
c)筛选和/或分类在步骤b)中分离的所述籽粒,并将所筛选和/或分类的籽粒负载进箱,从而产生小麦籽粒的箱。
41.一种交易小麦籽粒的方法,所述方法包括获得权利要求1至20的任一项所述的小麦籽粒,以及交易所获得的小麦籽粒用于金钱获利。
42.如权利要求41所述的方法,其中获得所述小麦籽粒包括培养根据权利要求23所述的小麦植物,优选地培养至少1000株此类小麦植物的群体以及从所述植物收获小麦籽粒。
43.如权利要求41所述的方法,所述方法还包括储存所述小麦籽粒的步骤。
44.如权利要求40至43的任一项所述的方法,所述方法还包括将所述小麦籽粒运输至不同的位置
45.一种鉴定包含根据权利要求1至19的任一项的小麦籽粒的容器的方法,所述方法包括(i)确定来自包含小麦籽粒的容器的小麦籽粒的样品中BG的量和/或特性,或确定存在于所述样品中的Csl多肽的量,或确定编码所述样品中Csl多肽的多核苷酸的存在,以及(ii)如果所述样品中所述BG的量和/或特性在权利要求1至19的任一项中被定义,或所述Csl多肽或多核苷酸以期望的量存在,从而鉴定根据权利要求1至19的任一项的小麦籽粒的所述容器。
46.一种产生碾磨的小麦产品的方法,所述方法包括以下步骤:(i)碾磨根据权利要求1至20的任一项的籽粒,以产生全麦面粉、面粉或麸,以及(ii)任选地,从所述全麦面粉或面粉分离任何麸,或筛分、漂白或稳定所述全麦面粉或面粉。
47.一种产生至少部分纯化的BG或淀粉的方法,所述方法包括以下步骤:i)获得根据权利要求1至20的任一项的小麦籽粒,以及ii)从所述籽粒提取BG或淀粉,从而产生所述BG或所述淀粉。
48.一种产生包含BG的产品的方法,其中所述方法包括以下步骤:(i)加工根据权利要求1至20的任一项的小麦籽粒或来自其的全麦面粉或面粉,从而产生所述产品。
49.如权利要求48所述的方法,所述方法还包括评估步骤(i)的所述小麦籽粒或所述面粉中的BG的水平或类型的步骤,或将来自步骤(i)的加工的小麦籽粒、全麦面粉或面粉添加至另一食品成分,从而产生包含BG的产品的步骤。
50.如权利要求48或权利要求49所述的方法,其中所述产品是食品或饮料产品或药物组合物,或者分离的BG。
51.如权利要求45至50的任一项所述的方法,其中所述小麦籽粒包含一种或更多种外源Csl多肽,优选地包含CslF6多肽。
52.如权利要求31至33的任一项所述的食品产品,或如权利要求50所述的方法,其中所述食品产品是面包、早餐谷物诸如即食谷物、饼干、松饼诸如英式松饼、麦片条、面条、百吉饼、小圆面包、羊面包、饺子、皮塔饼、快速面包、冷藏或冷冻面团产品、生面团、烘豆、卷饼、辣椒、墨西哥卷饼、玉米粉蒸肉、玉米粉圆饼、波特派、填料、可用于微波炉加热的餐、布朗尼、蛋糕诸如奶酪蛋糕或咖啡蛋糕、曲奇饼、甜点、糕点、小甜面包、状糖、派皮、饼馅、婴儿食品、烘烤混合物、面糊、面包屑、肉汁混合物、肉增量剂、肉类替代品、调味品混合物、汤混合物、肉汁、乳酪面粉糊、色拉酱调料、汤、酸奶油、面食、拉面、炒面面条、捞面面条、淇淋内含物、冰淇淋棒、冰淇淋蛋卷、冰淇淋三明治、薄脆饼、油煎面包块、甜甜圈、鸡蛋卷、膨化食品、水果和谷物棒、可用于微波炉加热的快餐产品、营养棒、煎饼、平价烘焙的烘焙产品、椒盐卷饼、布丁、基于格兰诺拉燕麦产品、快餐薄片、快餐食品、快餐混合物、华夫饼干、比萨饼外皮、动物食品诸如宠物食品
53.从根据权利要求1至20的任一项的小麦籽粒分离的BG作为低卡路里食品添加剂、填充剂、膳食纤维增稠剂防腐剂益生菌剂或这些的任何组合的用途。
54.一种改变动物的一种或更多种生理参数,或预防或减少疾病的严重程度或发生率的方法,所述方法包括向所述动物,优选地人,提供权利要求1至21的任一项所述的籽粒、权利要求22或23所述的小麦植物、权利要求27或权利要求34所述的组合物、权利要求31或32的产品或通过根据权利要求46至52的任一项的方法产生的产品,其中所生理参数或减少的疾病的严重程度或发生率是相对于向所述动物提供相同量的相应野生型小麦籽粒、小麦植物或由其制成的组合物或产品。
55.如权利要求55所述的方法,其中所述生理参数是代谢健康、肠道健康或心血管健康的参数,诸如糖尿病、肠道疾病、肥胖、高血压、便秘、骨质疏松症、癌症或心血管疾病的减少的发生率或严重程度。
56.如权利要求55或56所述的方法,其中所述生理参数是以下的一种或更多种:增加的有益肠道细菌的数目、减少的肠中异常隐窝病灶的数目、增加的来自肠的矿物质的吸收、减少的血液中胰岛素的水平、减少的血糖指数反应、减少的血糖负荷反应、减少的血糖水平、减少的血压、减少的体重、减少的血液胆固醇水平或LDL胆固醇水平、增加的血液HDL胆固醇水平、增加的骨密度或更频繁的肠运动。
57.如权利要求57所述的方法,其中所述生理参数选自由以下组成的组:减少的血糖指数反应、减少的血液中胰岛素的水平、减少的血糖负荷反应、减少的血糖水平、减少的血液胆固醇水平或LDL胆固醇水平以及增加的血液HDL胆固醇水平。
58.如权利要求55至58的任一项所述的方法,其中所述动物是人,且向所述人提供的籽粒或者由其产生的食品或饮料的量是每天至少10g所述籽粒或籽粒等同物。

说明书全文

具有高平β-葡聚糖的小麦

[0001] 提交数据
[0002] 本申请与以下相关并要求以下的优先权:2013年8月6日提交的澳大利亚专利申请号2013902937和2014年6月12日提交的澳大利亚专利申请号2014902241,这些申请的每个的全部内容通过引用并入本文。发明领域
[0003] 本发明涉及具有高水平β-葡聚糖的转化的小麦以及该小麦的用途。
[0004] 发明背景
[0005] 谷物籽粒的细胞壁多糖是人类营养的重要膳食组分,是膳食纤维的显著源(Topping,2007)。其中细胞壁多糖构成约10%干重的全粒谷物的摄入,与减少发展疾病诸如2型糖尿病、心血管疾病和结肠直肠癌的险,以及与其他健康益处诸如改善肠胃健康相关(在Jonnalagadda等,2011中综述的)。全籽粒还具有相对低的血糖指数,并且是其他膳食组分包括维生素、抗化剂和矿物质的丰富来源,以及淀粉作为能量来源。
[0006] 包括谷物籽粒的禾本种(grasses)(禾本科(Poaceae))的细胞壁特征在于混合的键(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖(在下文中简称为BG)的存在(Trethewey等,2005)。BG连同其他多糖诸如阿拉伯糖-(1,4)-β-D-木聚糖(在下文中的AX)主要在谷物细胞壁中被发现。BG的结构在细胞壁聚合物当中是独特的,由于它由通过1-3和1-4键共价连接的葡萄糖残基的线性聚合物(以非重复但非随机方式排列)组成(Fincher,2009a,b)。它可被认为是主要β-1-4连接的纤维三糖(cellotriosyl)(每个具有3个葡萄糖残基)和通过单β-1-3键连接的纤维四糖(cellotetrosyl)(每个具有4个葡萄糖残基)单元的聚合物。来自大麦籽粒的多糖还具有约10%较长的β-1-4连接的纤维糊精单元(Fincher和Stone,2004)。该分子的构象不对称性使聚合物能够形成植物细胞壁的基质中的粘性多孔凝胶样结构。BG以低水平被发现于大部分营养组织(Trethewey和Harris,2002)中并以较高水平被发现于延伸细胞诸如生长中的
胚芽鞘(Carpita等,2001;Gibeaut等,2005)中。与营养组织的细胞相比,大部分谷物籽粒的胚乳细胞壁包含非常少的纤维素,且主要细胞壁组分是AX和/或BG,尽管水稻和其他谷物籽粒也包含其他细胞壁多糖。(Stone,2006)。
[0007] 籽粒的BG含量在谷物当中变化相当大,大麦、燕麦和黑麦具有最高量,且小麦、玉米和水稻具有相对低的水平(Fincher和Stone,2004)。在小麦胚乳中,细胞壁包含约70%AX和15-25%BG,连同约4%纤维素((1,4)-β-D-葡聚糖)以及约7%(1,4)-β-D-葡甘露聚糖。相比之下,大麦胚乳细胞壁具有约20%AX和70%BG。水稻籽粒细胞壁也具有显著水平的纤维素(20%)。大麦和燕麦中较高水平的BG在减少冠状动脉心脏病中具有益处,但小麦BG是否提供相同益处是未知的。因此,显然一种谷物中的细胞壁多糖的特性不能容易地推广至其他谷物。
[0008] BG的水溶解度也在谷物内变化。燕麦BG比具有相对低的水溶解度的来自大麦和小麦的BG更可溶(Aman和Graham,1987;Beresford和Stone,1983;Lazaridou和Biliaderis,2007)。来自每种谷物籽粒的BG具有如通过用地衣聚糖酶消化和通过HPLC分离低聚糖所指示的特征性和不同的精细结构(Lazaridou和Biliaderis,2007)。在(β,1-3)键之后,地衣聚糖酶特异性切割在(β,1-4)键上的BG,主要释放聚合程度的低聚糖(DP3和DP4,分别具有3个和4个葡糖基单元)。燕麦BG在谷物籽粒BG当中具有最低的DP3/DP4比,通常在1.5-2.3的范围内,而大麦BG具有在2.3-3.2的范围内的DP3/DP4比(Lazaridou和Biliaderis,2007)。由于小麦籽粒中BG水平是非常低的(<1.0%),且在小麦胚乳中甚至更低,BG结构尚未被详细表征。小麦麸BG已被报道为具有3.7-4.5的DP3/DP4比(Cui等,2000;Li等,2006),然而当用地衣聚糖酶测定时,来自小麦全麦粉的BG具有3.0-3.8的DP3/DP4比(Wood等,1991)。最近的报道,使用不同的方法,给出小麦粉BG的2.3至2.5的较低值(Nemeth等,2010)。
[0009] 单独细胞壁聚合物的生物合成尚不很清楚。牵涉的酶是整合膜蛋白,且尽管一些可被生化测定(Buckeridge等,2004;Tsuchiya等,2005),没有已被纯化至同质性,且编码的基因的分离已牵涉遗传方法或异源表达。因此,纤维素合酶(CesA)和纤维素合酶样(Csl)基因家族已被证明编码制造β-连接的多糖的酶。CesA基因编码纤维素合酶,并存在称为CslA-J的九个Csl基因家族(Fincher,2009a;Hazen等,2002)。CslA基因的一些成员编码β-甘露聚糖合酶和葡甘露聚糖合酶,(Dhugga等,2004;Liepman等,2007),且CslC基因编码被认为合成木葡聚糖的(1,4)-β-D-葡聚糖骨架的酶(Cocuron等,2007)。CslB家族和CslG家族限于双子叶植物,而CslF家族和CslH家族迄今仅在禾本的单子叶植物中被报道。在完全测序的水稻基因组中,存在九个CslF基因和三个CslH基因,而在大麦中至少七个CslF基因和单个CslH基因已被表征(Burton等,2008;Doblin等,2009)。
[0010] 参与BG生物合成的基因中的一些最近已被鉴定为属于纤维素合酶样CslF和CslH基因家族。水稻OsCslF2或OsCslF4在转基因拟南芥(Arabidopsis)植物中的异源表达产生BG,其可被免疫检测到,尽管产生的绝对量很低(Burton等,2006)。在其他研究中,Doblin等,(2009)证明了大麦CslH的过表达导致转基因拟南芥中低水平的BG合成。这表明,多个Csl基因可编码合成BG的酶,并且或许不同的谷物使用不同的、或多个Csl活性合成BG。来自cDNA文库的EST计数表明,在小麦中存在至少七个表达的CslF基因,相应于水稻CslF1、
CslF2、CslF3、CslF4、CslF6、CslF8和CslF9基因(Nemeth等,2010)。
[0011] 证明了内源性大麦HvCslF6基因以胚乳特异性方式的过表达将转基因大麦中的BG水平增加了多达80%(Burton等,2011)。相比之下,HvCslF3、HvCslF4、HvCslF8或HvCslF9基因的胚乳特异性过表达对BG水平没有显著影响。这些结果表明,在大麦中,单独的CslF或CslH基因可对胚乳中合成的BG的水平具有不同的影响。Nemeth等,(2010)证明,通过RNAi方法CslF6基因表达在小麦中的下调将胚乳中BG水平减少了30%和52%之间,表明CslF6表达于小麦籽粒中并有助于该谷物中的BG合成。即,小麦包含有功能的内源CslF6基因。然而,哪些基因可被需要表达以增加小麦中BG水平是未知的。另外,哪个基因或基因的组合可提供用于营养功能的具有最佳结构的足够水平的BG是未知的。
[0012] 为什么小麦籽粒具有相对低的BG水平,比大麦或燕麦低得多,以及为什么小麦BG比起其他谷物BG具有不同的结构的原因是未知的。这可由于缺乏一种或更多种Csl基因或一些其他类的基因,其他结构特征的存在,或其任何组合。
[0013] 存在对具有增加的BG水平,特别是具有增加的水可提取(可溶性)BG水平用于改善营养功能的小麦的需求。
[0014] 发明概述
[0015] 在第一方面,本发明提供了小麦籽粒,所述小麦籽粒包含(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖(BG),所述小麦籽粒特征在于以下特征中的一个或更多个或全部:
[0016] (a)其中所述籽粒的BG含量是至少3%(w/w);
[0017] (b)其中所述籽粒的BG具有在约1.0和约2.0之间或在约1.0和2.3之间的DP3/DP4比;以及
[0018] (c)其中所述BG是部分水溶性的,使得在8.0%和约25%之间、在8.0%和约50%之间、在约10%和50%之间或在约10%和约25%之间的所述籽粒的BG是水溶性的。
[0019] 在一些实施方案中,所述小麦籽粒包含特征(a)和(b),或特征(a)和(c),或(b)和(c)。在这些实施方案中,第三特征是任选地存在的。在一个实施方案中,当BG含量少于3%(w/w)时,BG含量相对于野生型小麦籽粒被增加,和/或BG的溶解度相对于野生型小麦籽粒被增加。籽粒还可包括如下面描述的另外的特征。
[0020] 在第二个方面,本发明提供了小麦籽粒,所述小麦籽粒包含(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖(BG)和CslF6多肽,所述CslF6多肽在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽中相应的基酸位置上包含除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地在该位置上具有亮氨酸(L)。在一个实施方案中,BG具有相对于野生型小麦籽粒中BG的水溶解度被增加的水溶解度,诸如,例如,在8.0%和约25%之间、在8.0%和约50%之间、在约10%和50%之间或在约10%和约25%之间的BG是水溶性的。在一个优选的实施方案中,籽粒的BG含量是至少3%(w/w),和/或籽粒的BG具有在约1.0和约2.0之间或在约1.0和2.3之间的DP3/DP4比。
[0021] 在这些方面的实施方案中,所述小麦籽粒包含特征(a)和(b),或特征(a)和(c),或(b)和(c)。在这些实施方案中,第三特征是任选地存在的。在一个实施方案中,当BG含量少于3%(w/w)时,BG含量相对于野生型小麦籽粒被增加,和/或BG的溶解度相对于野生型小麦籽粒被增加。籽粒还可包括如下面描述的另外的特征。
[0022] 在本发明的某些实施方案中,小麦籽粒的BG含量(特征(a))是至少4%(w/w)、至少5%(w/w)或至少6%(w/w)。与这些最低水平组合,本发明的小麦籽粒的BG含量可具有约
10%(w/w)或12%(w/w)的最大值。在实施方案中,BG含量在3%(w/w)和约8%(w/w)之间、在约4%(w/w)和约8%(w/w)之间、在约5%(w/w)和约8%(w/w)之间、约3%(w/w)、约4%(w/w)、约5%(w/w)、约6%(w/w)、约7%(w/w)或约8%(w/w)。籽粒的BG含量通常对从该籽粒获得的全麦面粉来测量,该全麦面粉代表整个籽粒的BG含量和其他组分诸如籽粒蛋白、淀粉和DNA方面。优选地,BG含量如实施例1中所述来测量。
[0023] 在实施方案中,籽粒的BG具有以下的DP3/DP4比(特征(b)):小于约2.5、优选地小于约2.4、小于约2.3、小于约2.2、小于约2.1、小于约2.0、小于约1.9、小于约1.8、约2.5、约2.4、约2.3、约2.2、约2.1、约2.0、约1.9、约1.8、或在约1.8和约2.5之间。在这些实施方案中,DP3/DP4比可具有约1.0的最小值。优选地,DP3/DP4比如实施例1中所述来测量。
[0024] 在实施方案中,小麦籽粒的BG包含相对于相应野生型籽粒增加比例的水溶性BG(特征(c)),如通过以下方法确定的,或通过以下方法可确定的:所述方法包括通过以下处理从籽粒获得的全麦面粉的样品:(i)用80%乙醇在80℃处理1小时,随后是(ii)将BG在37℃于水性缓冲液中溶解约2小时,以及(iii)确定从该样品溶解的BG水平。优选地,如通过此类方法确定的或通过此类方法可确定的,籽粒的BG含量的至少6%、优选地至少8%、至少
10%、至少12%、至少14%、至少16%、至少18%、约6%、约8%、约10%、约12%、约14%、约
16%或约18%是水溶性的。在这些实施方案中,水溶性BG的比例可具有约30%或约40%或约50%的最大值。应当理解,水溶性BG的比例是相对于前述段落中定义的籽粒的总BG含量。
[0025] 在实施方案中,BG特征在于具有至少10kDa、优选地至少100kDa或500kDa、或在约500kDa和5000kDa之间的分子量,如通过按照尺寸排阻色谱法的峰值分子量的位置确定的。
峰值分子量可以是,或小于,约0.5x 106Da、或约1.0x 106Da、或约2.0x 106Da。在优选的实施方案中,BG的分子量主要(即BG的至少50%)在约0.5x 106Da至约2.0x 106Da的范围内。
[0026] 在本发明的一个优选的形式中,籽粒是转基因的,即包含一种或更多种外源多核苷酸。在实施方案中,多核苷酸编码一种或更多种Csl多肽,优选地包括CslF6多肽,更优选地除了大麦CslF6多肽以外的CslF6多肽,和/或编码除了Csl多肽以外的外源多肽,诸如除草剂耐受性多肽或沉默RNA分子。在一个实施方案中,沉默RNA分子能够减少本发明的小麦植物中,诸如在植物的发育中的种子或胚乳中,的一种或更多种内源小麦基因的表达。外源多核苷酸可以可操作地连接至在植物的发育中的种子或胚乳中优先表达的启动子。
[0027] 在一个实施方案中,小麦籽粒包含在A、B和D基因组中的其天然位置中的CslF6基因且缺乏基因组中的别处的外源CslF6基因。在一个优选的实施方案中,在其天然位置中的CslF6基因的一种或更多种各自编码包含相对于相应的野生型CslF6多肽的氨基酸置换的变体CslF6多肽。在一个更优选的实施方案中,氨基酸置换是在关于SEQ ID NO:18的氨基酸位置756上或在其他CslF6多肽的相应的氨基酸位置上。在一个最优选的实施方案中,氨基酸置换是关于SEQ ID NO:18的I756L置换或在其他CslF6多肽的相应的氨基酸上的相同氨
基酸置换。
[0028] 在优选的形式中,籽粒包含外源CslF6多肽。该外源CslF6多肽的氨基酸序列优选地与来自植物的CslF6多肽,即与天然存在的CslF6多肽,的氨基酸序列至少95%相同,更优选地至少99%相同。所述植物可以是谷物植物或科禾本科中的植物。在一个实施方案中,外源多肽是除了大麦CslF6多肽以外的CslF6多肽,该大麦CslF6多肽相应于SEQ ID NO:43的氨基酸12-958的HvCslF6或与SEQ ID NO:43的氨基酸12-958至少99%相同的多肽。在优选的实施方案中,外源CslF6多肽是燕麦(AsCslF6)、玉米(ZmCslF6)、高粱(SbCslF6)或水稻(OsCslF6)CslF6多肽。外源CslF6多肽还可来自籽粒BG具有少于2.3或少于2.1的DP3/DP4比的植物,或是植物中除了籽粒以外的组织中最高表达的CslF6多肽。CslF6多肽的氨基酸序列可与天然存在的植物CslF6多肽诸如燕麦、玉米、高粱或水稻CslF6多肽的氨基酸序列相同,或可与其相差不多于10个保守氨基酸置换,优选地不多于5个保守氨基酸置换,诸如当与燕麦、玉米、高粱或水稻CslF6多肽相比时。参见例如SEQ ID NO 18-20、55-57、59和61。在一个优选的实施方案中,CslF6多肽在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽中相应的氨基酸位置上包含除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地在该位置上具有亮氨酸(L)。
[0029] 在实施方案中,籽粒还包含外源CslH多肽。该外源CslH多肽的氨基酸序列优选地与来自植物,优选地谷物植物或科禾本科中的植物,的CslH多肽的氨基酸序列至少95%相同。参见,例如,SEQ ID NO 37-39和50。
[0030] 本发明的籽粒特征还可在于以下特征中的一个或更多个,且这构思了些特征的可能组合的全部。籽粒优选地是非褶皱的,且/或具有至少25mg或至少28mg、优选地至少30mg、至少35mg或至少40mg的重量。通常,籽粒重量在25mg和40mg之间、在25mg和45mg之间、在25mg和50mg之间、在25mg和55mg之间、在25mg和60mg之间、在35mg和55mg之间、在35mg和
60mg之间、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg或约55mg。籽粒重量优选地对至少100个籽粒的样品来测量,在这种情况下籽粒重量被表示为平均籽粒重量。籽粒优选地具有约8%至约14%之间,更优选地约10%的水分含量。在实施方案中,籽粒能够产生雄性和雌性能育的小麦植物,或与相应野生型植物在形态上基本上相同的小麦植物。例如,从籽粒产生的小麦植物是绿色的,具有与相应的野生型植物相同的幼苗,和/或产生具有与相应的野生型植物相同的存活力的花粉。期望谷物的发芽率与野生型籽粒的发芽率类似或基本上相
同。在某些实施方案中,本发明的籽粒具有相对于相应野生型籽粒的发芽率约70%至约
90%或约90%至约100%的发芽率。通常这在低光条件(例如在黑暗中)下在室温吸涨之后
7-10天时来测量,或作为在田间播种之后引起露出的幼苗的籽粒的百分比。
[0031] 本发明的小麦籽粒还包含淀粉。优选的是,籽粒的淀粉含量按总籽粒重量的百分比是至少30%、更优选地至少35%、或至少40%。与这些最少量组合,籽粒的最大淀粉含量可以是关于野生型籽粒的约60%或甚至70%。在一个实施方案中,籽粒的淀粉的直链淀粉含量按该籽粒的可提取的淀粉的比例是至少50%(w/w)、至少60%(w/w)、至少67%(w/w)、或至少70%(w/w)。本发明的籽粒的淀粉通常特征在于选自由以下组成的组的一个或更多个特性:
[0032] ·包含至少2%的抗性淀粉;
[0033] ·包括少于55的血糖指数(GI);
[0034] ·按籽粒的淀粉含量的比例包含少于20%的支链淀粉;
[0035] ·包含在相对于野生型小麦淀粉颗粒具有改变的形态学的淀粉颗粒中;
[0036] ·包含在相对于野生型小麦淀粉颗粒展现出在偏振光下减小的颗粒双折射的淀粉颗粒中;
[0037] ·当所述籽粒被碾磨成面粉时,此类面粉展现出减小的膨胀体积;
[0038] ·相对于野生型小麦淀粉改变的链长度分布和/或支化频率
[0039] ·凝胶化温度和更高的峰值温度的延迟结束;
[0040] ·降低的粘度(峰值粘度、糊化温度);
[0041] ·增加的支链淀粉分子量;
[0042] ·改变的结晶淀粉的百分比;以及
[0043] ·在相对于野生型小麦淀粉颗粒、面粉或淀粉的每个情况下,改变的A型或B型结晶淀粉的百分比。
[0044] 在一个实施方案中,籽粒还优选地不含编码减少内源CslF基因表达的RNA的任何外源核酸。
[0045] 优选地,籽粒来自六倍体小麦,优选地普通小麦(Triticum aestivumL.)或来自四倍体小麦诸如硬粒小麦(T.durum)。
[0046] 在本发明的某些形式中,籽粒被加工,使得它不再能够发芽。此类加工的籽粒包括粗磨的、破裂的、烤的、煮的、半煮(par-boiled)的、揉捻(rolled)的、制成粉粒(pearled)的、碾磨的或研磨的籽粒。
[0047] 本发明还涉及包含本发明的籽粒或能够产生本发明的籽粒的小麦植物,优选地普通小麦或硬粒小麦,以及由此类籽粒产生的植物。优选的是小麦植物是雄性和雌性能育的。在一个实施方案中,小麦植物是除了Bob White 26以外的栽培品种。小麦植物可以是冬季类型或春季类型,并优选地是半矮杆高度,诸如包含提供半矮秆高度的Rht基因的突变等位基因的小麦植物。植物可在温室或在田间生长。植物可以是生长在田间的遗传上相同或基本相同的小麦植物的至少1000株的群体中的一株。
[0048] 本发明还延及小麦面粉,诸如全麦面粉,或从该籽粒获得的其他加工的产品诸如粗面粉(semolina)、分离的小麦淀粉颗粒、分离的小麦淀粉或由本发明的籽粒产生的小麦麸。全麦面粉的BG含量与对于如以上描述的小麦籽粒的基本相同。在一个实施方案中,面粉或其他加工的产品包含一种或更多种外源CslF多肽,优选地包括CslF6多肽,更优选地燕麦、玉米、高粱或水稻CslF6多肽,该多肽源自本发明的籽粒。在一个优选的实施方案中,在面粉或加工的产品中的CslF6多肽在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽中相应氨基酸位置上包含除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地在该位置上具有亮氨酸(L)。多肽是通过本领域任何已知方法诸如免疫学方法例如ELISA或蛋白印记分析或质谱可检测的。面粉或加工的产品还可包含源自该籽粒的编码CslF多肽的一种或多种外源多核苷酸。所述多核苷酸可以是通过PCR可检测的。在一个实施方案中,面粉是包含BG和一种或更多种外源Csl多肽的小麦胚乳面粉(白面粉),其中面粉的BG含量在0.3%至约3%(w/w)之
间。白面粉具有比获得其的全麦面粉更低的麸含量。面粉或麸可以通过热处理来稳定化。
[0049] 本发明提供了变体CslF6多肽,其在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽中相应氨基酸位置上包含氨基酸置换,其中存在于位置756上的氨基酸是除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地是亮氨酸(L)。此类多肽优选地是非天然存在的和/或存在于不天然包含该多肽的细胞中。在一个实施方案中,多肽包含其序列如SEQ ID NO:178所列的氨基酸。在一个优选的实施方案中,变体CslF6多肽能够产生增加的量的BG或产生具有相对于由野生型CslF6多肽产生的BG增加的水溶解度的BG,诸如,例如,具有在8.0%和约25%之间、在8.0%和约50%之间、在约10%和50%之间或在约10%和约25%之间的BG是水溶性的水溶解度。在一个优选的实施方案中,由变体CslF6多肽产生的BG具有在约1.0和约2.0之间或在约1.0和2.3之间的DP3/DP4比。变体多肽可以是分离的多肽,或它可在细胞诸如小麦细胞中。本发明还提供了编码变体CslF6多肽的CslF6多核苷酸和包含此类CslF6多核苷酸的细胞,以及产生这些或使用这些的方法。
[0050] 本发明还延及由本发明的籽粒产生的分离的小麦BG。通常BG连同小麦AX一起被分离,并因此本发明提供包含BG和AX的组合物。在一个实施方案中,组合物中少于50%的AX是阿魏酸化的(feruloylated)。优选地,基于重量,组合物中的至少50%的水化合物是BG或AX或其组合。在一个实施方案中,分离的BG具有如以上在小麦籽粒的上下文中定义的BG的一个或更多个特征。
[0051] 本发明还提供了本发明的小麦籽粒或面粉或BG用于产生产品以增加所述产品中BG水平,降低该产品中总BG的DP3/DP4比和/或增加该产品中总BG的溶解度的用途。BG的增加的水平或降低的DP3/DP4比或溶解度分别相对于使用等量的野生型小麦籽粒、来自其的面粉或BG。
[0052] 本发明还提供了包含本发明的籽粒、面粉、分离的BG或包含本发明的BG和AX的组合物的食品成分,或包含本发明的分离的BG或包含本发明的BG和AX的组合物的饮料成分。优选的是食品或饮料成分被包装准备出售。食品或饮料成分可被掺入进具有另一种食品或饮料成分的混合物,诸如,例如,蛋糕混合物、薄烤饼混合物或生面团。食品成分可以以基于干重至少1%,优选地至少10%的水平用于食品产品,且饮料成分可以以基于重量至少
0.1%的水平用于饮料产品。如果该食品产品是早餐谷物食品、面包、蛋糕或其他含淀粉产品,更高的掺入比是优选的,诸如以至少20%或至少30%的水平。食品产品中多达100%的成分(籽粒、面粉诸如全麦面粉等等)可以是本发明的成分。优选地,当准备摄入时,该食品或饮料产品以基本上未改变的形式包含源自该食品或饮料成分的BG。
[0053] 本发明的食品或饮料产品可以用以改变动物,优选地人中的一种或更多种生理参数。生理参数可以是,例如,代谢健康、肠道健康或心血管健康,或预防或减少动物中代谢、肠道或心血管疾病的严重程度或发生率的生理参数。人可以是儿童或成人、男性或女性。可选地,动物可以是牲畜动物诸如猪、绵羊,宠物动物诸如狗或猫,或农场动物诸如鱼,家禽类诸如鸡、鸭或火鸡。
[0054] 本发明的籽粒以及从其获得的成分可与野生型籽粒或其他成分基本上共混。因此,本发明提供了除了本发明的小麦籽粒或从其获得的成分以外,包含未修饰的小麦籽粒或从其获得的成分的组合物,所述未修饰的小麦籽粒具有少于2%(w/w)的BG水平。在此类组合物中,优选的是本发明的籽粒和/或从其获得的成分包含按重量计组合物的至少10%。
未修饰的成分可以是,例如,面粉诸如全麦面粉、粗面粉、包含淀粉的成分、纯化的淀粉或麸。
[0055] 本发明还提供了产生小麦植物的方法,所述小麦植物产生本发明的籽粒。在一个实施方案中,该方法包括以下的步骤:(i)将编码一种或更多种Csl多肽,优选地包括CslF多肽诸如CslF6多肽,的一种或更多种外源多核苷酸引入祖先小麦细胞,以及(ii)由(i)的小麦细胞产生转基因小麦植物。优选的CslF6多肽是燕麦、玉米、高粱或水稻CslF6多肽或其变体。在一个优选的实施方案中,细胞中的CslF6多肽在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽中相应氨基酸位置上包含除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地在该位置上具有亮氨酸(L)。外源多核苷酸可以可操作地连接至启动子序列,相对于在小麦植物的另一个组织或器官,诸如在叶片中,所述启动子序列在小麦植物的发育中的种子中优先表达。启动子序列可优先地表达于小麦植物的胚乳中。方法还可包括从在步骤(ii)中产生的转基因小麦植物获得籽粒,或另外从转基因小麦植物产生后代植物或将转基因植物与第二小麦植物杂交的步骤。可产生第三代或随后世代的后代植物。该方法还将通常包括确定外源多核苷酸在转基因小麦植物或其后代中的表达水平、Csl多肽在小麦植物或其后代的籽粒中的水平、或BG在小麦植物或其后代的籽粒中的量或类型的步骤。该方法可包括从根据步骤(i)和(ii)产生的多个小麦植物鉴定在其籽粒中具有可期望水平的BG的转基因小麦植物,和/或鉴定对于外源多核苷酸纯合的后代植物的步骤。该方法可包括选择步骤,其中产生具有期望的特性的籽粒的转基因小麦植物选自多个候选者。确定、鉴定或选择步骤可在一个或更多个后代转基因小麦植物在温室或田间(田间试验)生长之后进行发生。
[0056] 在一个实施方案中,本发明提供了方法,所述方法包括以下的步骤:(i)将核苷酸变异引入祖先小麦细胞的CslF6基因中,使得该变体基因编码变体CslF6多肽,以及(ii)由(i)的小麦细胞产生小麦植物。在优选的实施方中,该变体CslF6多肽在关于SEQ ID NO:18的位置756或其他CslF6多肽的相应氨基酸位置上包含除了异亮氨酸(I)以外的氨基酸,且更优选地在该位置上具有亮氨酸(L)。该方法还可包括从在步骤(ii)中产生的小麦植物获得籽粒,或另外从该小麦植物产生后代植物或将该小麦植物与第二小麦植物杂交的步骤。可产生第三代或随后世代的后代植物。该方法还将通常包括确定多核苷酸在小麦植物或其后代中的表达水平、CslF6多肽在小麦植物或其后代的籽粒中的水平、或BG在小麦植物或其后代的籽粒中的量或类型,诸如测量BG的水溶解度的步骤。该方法可包括从根据步骤(i)和(ii)产生的多个小麦细胞或植物鉴定在其籽粒中具有可期望水平BG的小麦细胞或源自其
的植物,和/或鉴定对于变体CslF6基因纯合的后代植物的步骤。该方法可包括选择步骤,其中产生具有期望的特性的籽粒的小麦植物选自多个候选者。确定、鉴定或选择步骤可在一种或更多种后代小麦植物在温室或田间(田间试验)生长之后进行发生。
[0057] 本发明还提供了产生了产生本发明的籽粒的小麦植物的方法,所述方法包括以下的步骤:(i)将包含编码一种或更多种Csl多肽,优选地包括CslF多肽诸如CslF6多肽,的一种或更多种外源多核苷酸或变体CslF6基因的第一小麦植物与第二小麦植物杂交,以及(ii)从(i)的杂交选择产生本发明的籽粒的后代小麦植物。该方法可包括如在前述段落中描述的确定、鉴定或选择步骤。
[0058] 本发明还提供了鉴定或选择小麦植物的方法,所述方法包括(i)确定BG在从至少两个小麦植物的每个获得的籽粒中的量,以及(ii)从(i)选择产生包含BG的籽粒的植物,其中所述籽粒是本发明的籽粒,优选地具有至少3%(w/w)的BG含量的籽粒。该方法可包括如前述段落中描述的确定步骤。
[0059] 本发明还提供了产生本发明的籽粒的方法,所述方法包括以下的步骤:i)从本发明的植物收获小麦籽粒,以及ii)任选地,加工该籽粒。该方法还可包括在步骤i)之前培养小麦植物,从而获得该小麦植物的步骤。小麦植物可生长在田间,优选地作为遗传上基本相同的至少1000株小麦植物的群体的一部分。优选地,籽粒使用机械收割机来收获。
[0060] 本发明还提供产生小麦籽粒的箱的方法,所述方法包括:
[0061] a)收割包含本发明的小麦籽粒的小麦秸秆;
[0062] b)将秸秆脱粒和/或风选以从谷壳分离籽粒;以及
[0063] c)筛选和/或分类在步骤b)中分离的所述籽粒,并将所筛分和/或排序的籽粒负载进箱,从而产生小麦籽粒的箱。
[0064] 如将被理解的,本发明的小麦籽粒可被交易用于金钱获利。另外,本发明的方法通常将包括培养本发明的小麦植物,或收获小麦籽粒,储存小麦籽粒和/或运输小麦籽粒至不同的位置。
[0065] 本发明还提供了鉴定包含本发明的小麦籽粒的容器的方法,所述方法包括(i)确定来自所述容器的小麦籽粒的样品中BG的量和/或特性,或确定存在于所述样品中的Csl多肽的量,或确定编码所述样品中Csl多肽的多核苷酸的存在,以及(ii)如果所述样品中所述BG的量和/或特性如以上被描述的,或所述Csl多肽或多核苷酸以期望的量存在,从而鉴定所述籽粒样品来自其的所述容器。
[0066] 本发明的籽粒还可被碾磨以产生碾磨的小麦产品。这将通常包括获得小麦籽粒,碾磨籽粒以产生面粉,且任选地从面粉分离任何麸。碾磨籽粒可以是通过干磨或湿磨。籽粒可在碾磨之前被调整以具有期望的水分含量,优选地基于重量的约10%或约14%,或碾磨的产品诸如面粉或麸可通过用热处理来加工以稳定碾磨的产品。如将理解的是,碾磨的产品的BG含量相应于小麦籽粒中的BG含量或碾磨的产品中代表的小麦籽粒成分中的BG含量。
[0067] BG、包含BG加AX的组合物、淀粉颗粒或淀粉还可从本发明的籽粒来提取以产生BG、BG加AX、淀粉颗粒或淀粉,并且本发明因此提供了产生这些的方法。提取过程通常包括从籽粒获得碾磨的产品,并可包括该碾磨的产品的水溶性提取,该提取可在中性(pH约6-8)或性条件下。所提取的产品可包含AX。淀粉特征可在于如对于本发明的籽粒中的淀粉描述的一个或更多个特性。通过该方法产生的BG、淀粉颗粒或淀粉是基于干重优选地至少60%纯的,更优选地至少90%纯的。如果BG通过水溶解来提取,所提取的组合物优选地包含基于干重的至少60%BG加AX,更优选地至少90%纯的BG加AX。BG或BG加AX可从本发明的籽粒来提取,作为从该籽粒提取谷蛋白或淀粉的加工中的第二产品。
[0068] 本发明还提供了产生包含BG、或BG加AX的产品的方法,其中所述方法包括(i)获得或产生本发明的小麦籽粒,或来自其的面粉,以及(ii)加工所述小麦籽粒或来自其的面粉以产生所述产品。该方法还可包括评估步骤(i)的所述小麦籽粒或面粉中或步骤(ii)的所述产品中的BG的水平或类型的步骤,或将来自步骤(ii)的加工的小麦籽粒或面粉添加至另一食品或饮料成分从而产生包含BG的产品的步骤。产品可以是食品或饮料产品或药物组合物或分离的BG,或分离的BG加AX。优选的食品产品包括面包、早餐谷物、饼干、松饼、燕麦坚果能量棒(muesli bars)、面条。
[0069] 在另外的实施方案中,全籽粒面粉(whole grain flour)、粗级分或精面粉可以是食品产品的组分(成分),且可被用来产生食品产品。例如,食品产品可以是百吉饼、饼干、面包、小圆面包、羊面包、饺子、英式松饼、松饼、皮塔饼(pita bread)、快速面包(quickbread)、冷藏/冷冻面团产品、生面团、烘豆、卷饼(burrito)、辣椒(chili)、墨西哥卷饼(taco)、玉米粉蒸肉(tamale)、玉米粉圆饼(tortilla)、波特派(pot pie)、即食谷物、即食餐(ready to eat meal)、填料、可用于微波炉加热的餐、布朗尼(brownie)、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇饼(cookie)、甜点、糕点、小甜面包(sweet roll)、状糖(candy bar)、派皮(pie crust)、饼馅、婴儿食品、烘烤混合物、面糊、面包屑、肉汁混合物、肉增量剂(meat extender)、肉类替代品(meat substitute)、调味品混合物(seasoning mix)、汤混合物(soup mix)、肉汁、乳酪面粉糊(roux)、色拉酱调料(salad dressing)、汤、酸奶油、面条、面食(pasta)、拉面(ramen noodles)、炒面面条(chow mein noodles)、捞面面条(lo mein noodles)、淇淋内含物(ice cream inclusion)、冰淇淋棒(ice cream bar)、冰淇淋蛋卷(ice cream cone)、冰淇淋三明治、薄脆饼(cracker)、油煎面包块、甜甜圈、鸡蛋卷、膨化食品(extruded snack)、水果和谷物棒(fruit and grain bar)、可用于微波炉加热的快餐产品(microwaveable snack product)、营养棒、煎饼(pancake)、平价烘焙的烘焙产品(par-baked bakery product)、椒盐卷饼、布丁、基于格兰诺拉燕麦产品(granola-based 
product)、快餐薄片(snack chip)、快餐食品、快餐混合物、华夫饼干、比萨饼外皮、动物食品或宠物食品
[0070] 本发明还提供了从本发明的小麦籽粒分离的BG或BG加AX组合物的用途,其可被用作低卡路里(calorie)食品添加剂、填充剂(bulking agent)、膳食纤维、增稠剂(texturizing agent)、防腐剂益生菌剂或这些用途的任何组合。优选地,这些用途通过将BG或BG加AX掺入在食品产品中体现在本发明的食品产品中。因此,本发明还提供了产品,优选地食品产品,其包含出于上述用途已被掺入的BG或BG加AX。
[0071] 本发明还提供了改变动物的一种或更多种生理参数,或预防或减少疾病的严重程度或发生率的方法,所述方法包括向动物提供本发明的籽粒或由其制成的食品或饮料产品,其中改变的生理参数或减少的疾病的严重程度或发生率是相对于向动物提供相同量的相应野生型籽粒或由其制成的食品或饮料产品。优选的是,生理参数是代谢健康、肠道健康或心血管健康的参数,诸如糖尿病、肠道疾病、肥胖、高血压、便秘、骨质疏松症、癌症或心血管疾病的减少的发生率或严重程度。生理参数可以是以下的一种或更多种:增加的有益肠道细菌的数目、减少的肠中异常隐窝病灶的数目、增加的来自肠的矿物质的吸收、减少的血液中胰岛素的水平、减少的血糖指数反应、减少的血糖负荷反应、减少的血糖水平、减少的血压、减少的体重、减少的血液胆固醇水平或LDL胆固醇水平、增加的血液HDL胆固醇水平、增加的骨密度或更频繁的肠运动。
[0072] 优选的是,动物是人,且向人提供的籽粒或由其制成的食品或饮料的量是每天至少10g籽粒或籽粒等同物。
[0073] 附图简述
[0074] 图1.小麦TaCslF和TaCslH基因开放阅读框的结构的示意图。长条代表TaCslF和TaCslH基因从ATG翻译起始密码子至终止密码子的开放阅读框,且短黑条指示编码蛋白中预测的跨膜域的序列的位置。编码蛋白中保守的D、DxD、ED和QxxRW基序的序列的大致位置仅在CslF3的大中心结构域中被指示,尽管它们出现在所有示出的开放阅读框中。三角形示出了以上示出的三种小麦基因组(A、B和D)的每个的核苷酸中的内含子的位置与长度(问号指示该内含子还未被分离或确定)。来自大麦的相应内含子的长度示于括号内。
[0075] 图2.内源小麦TaCslF6(图A)、TaCslF9(图B)和TaCslH(图C)基因在胚芽鞘和叶片组织中的表达谱。表达通过实时PCR在指示的组织(Col3,在发芽之后3天的胚芽鞘,等等,ColM成熟的胚芽鞘,L0-1距离基部0-1cm的叶片组织,E0,0DPA的小麦胚乳)中来分析。在该实验中未分析E0样品的CslH,但在其他实验中CslH在E0中的表达是在Col3样品中的大约
0.25倍水平。表达相对于第一样品(E0或Col3)被示出。误差棒显示一式三份测量的标准差。
[0076] 图3.CslF6(图A)、CslF9(图B)和CslH(图C)基因在发育中的小麦和大麦胚乳组织中的表达谱。表达通过实时PCR在指示的组织(Ta=小麦;Hv=大麦;TaE0=在0DPA时的小麦胚乳,等等,HvE0=在0DPA时的大麦胚乳,等等)中来分析。表达相对于每组中第一样品(TaE0)被示出。误差棒显示一式三份测量的标准差。
[0077] 图4.表达编码HvCslH的嵌合基因的单独的T3小麦籽粒的BG含量。来自系H1-6A5、H1-10B1、H1-10B3和H1-10B7的单独的T3种子的全麦面粉的BG含量使用Megazyme试剂盒来确定。系用HvCslH转基因在汇集的(pooled)T3中期发育籽粒中的相对表达水平来鉴定,针对括号中所示的α-微管蛋白来归一化。正或负指示T2幼苗叶片阶段的PCR阳性或PCR阴性筛选。灰色实心三角形代表PCR阴性系,黑色实心三角形是潜在的纯合子系且空心三角形是分离系(混合的纯合子/杂合子)。
[0078] 图5.在T4纯合小麦HvCslH系的胚乳粉中的总BG含量和可溶性的BG含量。来自三种纯合T4系H1-10B7.4、H1-10B7.6和H1-10B1.9以及阴性分离系H1-10B7.3的胚乳粉的BG含量使用Megazyme试剂盒来确定(前四柱)。通过在40℃水洗2小时溶解的BG的量也被示出,通过在样品名称之后的S来指示(棒5-8)。误差棒显示一式三份测量的标准差。
[0079] 图6.用表达HvCslF6的嵌合基因转化的单独的小麦T2的籽粒中的BG水平。BG在来自五种成熟籽粒(来自如所示的每个系)的面粉中被确定。HvCslF6基因的表达通过从由三种汇集的在约15DPA时的籽粒制备的cDNA的实时PCR来测量,并相对于内源β微管蛋白表达来示出(在系数字之后的括号内)。系F6-1D1和F6-1D2是PCR阴性T1植物(空分离子(null 
segregants)=野生型)。所有其他系表达HvCslF6转基因。
[0080] 图7.用表达HvCslF6的嵌合基因转化的单独的小麦T3籽粒中的BG水平。BG在来自五种成熟籽粒(来自如所示的每个系)的面粉中被确定。HvCslF6基因的表达通过从由三种汇集的在约15DPA时的籽粒制备的cDNA的实时PCR来测量,并相对于内源β微管蛋白表达来示出(在系数字之后的括号内)。系F6-1G6.13和F6-1K5.13是PCR阴性T1植物,且所有其他系表达HvCslF6转基因。
[0081] 图8.具有HvCslF6T7和AsCslF6T7基因的T0小麦系的平均T1籽粒重量。T0系的平均T1籽粒重量。系F6-74至F6-119用HvCslF6T7来转化且系F6-121至F6-151用AsCslF6T7来转化。在单独的T1籽粒中显示增加的BG的系用在系数字之后的+示出。系F6-121是PCR阴性的植物。
[0082] 图9.来自表达编码外源谷物CslF6多肽的嵌合基因的本氏烟(N.benthamiana)叶片的BG的溶解度。溶解度通过在37℃2小时水提取来确定。图示出了溶解的总BG的百分比。
外源CslF6多肽是:Hv(大麦)、Ta(小麦)、As(燕麦)、Bd(短柄草属(Brachypodium))以及Os(水稻)。
[0083] 图10.用表达外源AsCslF6的嵌合基因转化的单独的T1小麦籽粒中的BG的DP3/DP4比。从两个系(142和151)的单独的成熟籽粒提取的BG的DP3/DP4比被示出。每种籽粒的BG含量在每个柱下面示出。来自系142d的籽粒是具有高DP3/DP4比的BG的阴性分离子(野生型)。
所有其他籽粒具有增加的BG含量与减少的DP3/DP4比。
[0084] 图11.如实施例17中所述由精细面粉或全麦面粉制成的测试松饼(“测试”)饲喂的大鼠与用对照、野生型精细面粉或全麦面粉(“对照”)制成的松饼饲喂的大鼠中的血糖影响(GI,其是在饲喂之后120min的曲线下面积)进行比较。1-尾t检验被用来比较处理效应;对于每个松饼类型n=7-9。
[0085] 图12.对于如实施例17中所述测试松饼或对照松饼饲喂的大鼠的胃排空率。对于每个类型松饼n=8-10。
[0086] 图13.如通过实施例21中所述的方法确定的来自野生型面粉(来自不同籽粒)的BG的水溶解度(无热灭活步骤)。
[0087] 图14.示出相关限制性位点的pSJ226的质粒图。
[0088] 图15.示出相关限制性位点的pSJ195的质粒图。
[0089] 图16.HvCslF6和ZmCslF6-2嵌合基因的示意图。HvCslF6区以实心条示出,且ZmCslF6-2区以空条示出。在克隆中使用的限制性位点被指示。HindIII和EcoRI位点在载体中CaMV 35S启动子和Nos聚A位点的上游和下游。由这些构建体在本氏烟叶片中产生的BG的DP3/DP4比在右侧示出。
[0090] 发明详述
[0091] 遍及本说明书,词“包含(comprise)”或变形诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”,将被理解为隐含包括陈述的要素、整数或步骤,或者要素、整数或步骤的组,但不排除任何其他要素、整数或步骤,或者要素、整数或步骤的组。
[0092] 在本说明书中提及的所有出版物在本文通过引用并入。已被包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、物品或类似物的任何讨论仅是为了提供本发明的背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或由于它在本申请的每个权利要求优先权日期之前存在于澳大利亚或其他地方是本发明相关的技术领域的公知
常识。
[0093] 除非上下文另外清楚地规定,否则如本说明书中所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数方面。因此,例如,提及"一(a)"包括单个以及两个或更多个;提及"一(an)"包括单个以及两个或更多个;提及“该(the)”包括单个以及两个或更多个等等。
[0094] 本发明基于本文描述的实验,其证明实质上增加的BG水平可以以比可从在其他谷物实验期望的高得多的水平在小麦籽粒中被产生,以及具有相对于野生型小麦中产生的BG修饰的特性的增加水平的BG可被产生。优选地BG相对于天然小麦籽粒BG被修饰为具有在水性介质中更大的溶解度和/或降低的DP3/DP4比。
[0095] 包括谷物的禾本种(禾本科)的细胞壁是复杂的和动态结构,其由多种多糖诸如纤维素、木葡聚糖(xyloglucans)、果胶(富含半乳糖酸残基)、胼胝质(1,3-β-D-葡聚糖)、阿拉伯糖基木聚糖(阿拉伯糖基-(1,4)-β-D-木聚糖,在下文中的AX)和BG以及多酚类诸如木质素构成。在禾本种和一些其他单子叶植物的细胞壁中,葡糖醛酸-阿拉伯木聚糖(glucuronoarabinoxylans)和BG占优势,且果胶多糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的水平是相对低的(Carpita等,1993)。这些多糖由大量不同的多糖合酶和糖基转移酶来合成,所述多糖合酶和糖基转移酶存在于植物中的至少70个基因家族,且在许多情况下,基因家族的多个成员。
[0096] 如本文所用,还称为“β-葡聚糖”以及在本文中简称为“BG”的术语“(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖”指主要通过(1,4)-键与一些(1,3)-键共价连接的未被取代和基本无支链的β-吡喃葡萄糖基单体的基本上线性聚合物。通过(1-3)-键和(1-4)-键连接的吡喃葡萄糖基残基以非重复但非随机方式来排列,-即(1-4)-键和(1-3)-键不随机排列,但同样地它们不以规则、重复序列排列(Fincher,2009a,b)。在燕麦和大麦BG中大多数(约90%)(1-3)-连接的残基跟随2个或3个(1-4)-连接的残基。BG因此可被认为是,主要β-1-4连接的纤维三糖(每个具有3个吡喃葡萄糖基残基)和通过单β-1-3键连接在一起的纤维四糖(每个具有4个吡喃葡萄糖基残基)单元与4个至约10个(1-4)-连接的吡喃葡萄糖基残基的约10%较长的β-1-4连接的纤维糊精单元的链(Fincher和Stone,2004)。通常,BG聚合物具有至少1000个糖基残基,并在含水介质中采取延长的构象。三个与四个糖单元的比(DP3/DP4比)在物种当中变化,并因此是来自物种的BG的特征。然而,应该指出的是,大部分结构研究用大麦籽粒或燕麦籽粒BG而不用来自其他谷物的BG来完成。
[0097] 在野生型谷物籽粒中,BG水平在全籽粒中比在胚乳中更大,除了在大麦籽粒中,其中BG以类似的浓度存在于全籽粒和胚乳中(Henry,1987)。与大麦的约4.2%、燕麦的3.9%和黑麦的2.5%相比,野生型整个小麦籽粒的BG含量是基于重量的约0.6%(Henry 1987)。应该理解,来自不同小麦品种的CslF和CslH基因的序列中存在自然变异。同源基因可被本领域技术人员基于序列同一性容易地识别。同源CslF基因或蛋白之间的序列同一性的程度被认为是至少90%,对于CslH基因或蛋白类似。
[0098] 如本文所用,术语“按重量计”或“基于重量”指物质,例如,BG的重量,作为包含该物质的材料或物品(item)的重量的百分比。这在本文中被缩写为“w/w”。通常,BG的重量被确定为小麦全麦面粉的重量的百分比,假定全麦面粉具有10%的水分含量。该确定是根据用于测量BG的Megazyme试剂盒。
[0099] 植物如本文所用的术语“植物”和“小麦植物”作为名词,通常指全植物,但当“植物”或“小麦”被用作形容词时,该术语指存在于、获自、源自或涉及植物或小麦植物的任何物质,诸如例如,植物器官(例如叶片、茎、根、花),单细胞(例如花粉),种子或籽粒,植物细胞(包括例如组织培养的细胞),从植物产生的产物诸如“小麦面粉”,“小麦籽粒”,“小麦淀粉”,“小麦淀粉颗粒”等。根和嫩枝已经从其出现的幼小植物和发芽的种子也包括在“植物”的含义内。如本文所用的术语“植物部分”指从全植物,优选地小麦植物获得的一个或更多个植物组织或器官。植物部分包括营养结构(例如,叶片、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、胚乳和种皮)、植物组织(例如,维管组织、基本组织等)、细胞和它们的子代。如本文所用的术语“植物细胞”指从植物或在植物,优选地小麦植物中获得的细胞,并且包括源自植物的原生质体或其他细胞、产生配子的细胞以及再生为全植物的细胞。植物细胞可以是培养的细胞。就“植物组织”而言意指在植物中或从植物获得的分化的组织(“外植体”)或源自未成熟的或成熟的胚、种子、根、嫩枝、果实、花粉的未分化的组织,以及培养中植物细胞的各种形式的聚集体,诸如愈伤组织。在或来自种子诸如小麦籽粒的植物组织是种皮、胚乳、盾片、糊粉层和胚。当从籽粒去除时,小麦麸是混合在一起的种皮、糊粉层和胚。
[0100] 如本文所用,术语“小麦”指属小麦属(Triticum)中的任何物种,包括其祖先,以及其通过与其他物种杂交产生的后代。小麦包括具有由42条染色体构成的AABBDD的基因组结构的“六倍体小麦”,以及具有由28条染色体构成的AABB的基因组结构的“四倍体小麦”。六倍体小麦包括普通小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、卡小麦(T.macha)、密穗小麦(T.compactum)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)以及其种间杂交。四倍体小麦包括硬粒小麦(T.durum)(还称为硬粒小麦或圆锥小麦硬粒亚种(Triticum turgidum ssp.durum))、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)以及其种间杂交。另外,术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属物种(Triticum sp.)的可能祖先,诸如A基因组的T.uartu、栽培一粒小麦
(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum),B基因组的拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides),以及D基因组的节节麦(T.tauschii)(还称为节节麦(Aegilops squarrosa)或粗山羊草(Aegilops tauschii))。本发明的小麦植物或籽粒可属于,但不限于,任何以上列出的物种。还包括通过常规技术使用小麦属物种作为有性杂交中的亲本与非小麦属物种诸如黑麦黑麦(Secale cereale)产生的植物,包括但不限于黑小麦。优选地小麦植物适合于商业产生籽粒,诸如具有本领域技术人员已知的适合的农艺学特性的六倍体小麦或硬粒小麦的商业品种。更优选地,小麦是普通小麦普通亚种(Triticum aestivum 
ssp.aestivum)或圆锥小麦硬粒亚种,且最优选地小麦是在本文中还称为“面包小麦”的普通小麦普通亚种。
[0101] 如本领域中理解的,六倍体小麦诸如面包小麦包括通常称为A、B和D基因组的三个基因组,而四倍体小麦诸如硬粒小麦包括通常称为A和B基因组的两个基因组。每个基因组包含可在减数分裂期间通过细胞学方法观察到的且由此鉴定的7对染色体,正如本领域中众所周知的。
[0102] 本发明的小麦植物可与包含更期望的遗传背景的其他小麦植物杂交。为了选择高BG表型与回归亲本品种的另外轮的回交可被进行以回收所期望的遗传背景,如本领域已知的。所期望的遗传背景可包括提供商业产量和其他特征诸如农艺学性能或非生物胁迫耐受性的基因的适当组合。遗传背景还可包括其他改变的淀粉生物合成或修饰基因,例如来自其他小麦系的基因。遗传背景可包括一个或更多个转基因,诸如,例如,赋予对除草剂诸如草甘膦的耐受性的基因。小麦植物的期望的遗传背景将包括农艺学产量和其他特征的考虑。此类特征可包括是否期望具有冬季类型或春季类型、农艺性能、疾病耐受性以及非生物胁迫耐受性。对于澳大利亚使用,人们可想要将本发明的小麦植物的改变的淀粉性状杂交进小麦栽培品种诸如巴克斯特(Baxter)、肯尼迪(Kennedy)、詹兹(Janz)、弗雷姆(Frame)、露茜娜(Rosella)、卡杜(Cadoux)、钻石(Diamondbird)或其他普遍生长品种。其他品种将适用于其他生长区。
[0103] 优选的是,在至少一些生长区中,本发明的小麦植物提供了相对生长在相同条件下的相应野生型品种的产量的至少70%或至少80%的籽粒产量,更优选地相对于具有约相同遗传背景的野生型品种的至少85%或至少90%且甚至更优选地至少95%的籽粒产量。最优选地,本发明的小麦植物的籽粒产量至少与生长在相同条件下具有约相同遗传背景的野生型小麦植物的产量一样大。如本文在该上下文中所用的“相同条件”包括植物在相同种植密度以及水有效性、温度、光条件等等生长。产量可在控制的田间试验,或在温室中模拟田间试验,优选在田间容易地被测量。籽粒产量通常被表示为公吨/公顷或表示为克/植物。
[0104] 标志物辅助选择是选择当在典型育种程序中与回归亲本回交时获得的杂合子植物的公认方法。每个回交代中的植物群体将是通常以1:1比存在于回交群体中的感兴趣基因的杂合子,且分子标志物可被用来区分该基因的两个等位基因。通过从,例如,幼小嫩枝提取DNA,并用基因渗入期望性状的特定标志物测试,进行用于进一步回交的植物的早期选择,同时将能量和资源集中于较少的植物。
[0105] 程序诸如杂交小麦植物、自受精小麦植物或标志物辅助选择是标准程序并是本领域熟知的。将等位基因从四倍体小麦诸如硬粒小麦转移至六倍体,或其他形式的杂交是更困难的,但也是本领域已知的。
[0106] 为了鉴定期望的表型特征,用CslF基因和/或CslH基因转化并拥有其他期望基因的小麦植物通常与对照植物进行比较。当评价与酶活性相关的表型特征诸如籽粒中BG含量时,待测试的植物和对照植物在生长室、温室、开顶室(open top chamber)和/或田间条件下生长。特定表型性状的鉴定和与对照的比较是基于常规统计分析和评分。植物系之间的统计差异可通过比较植物系之间在表达该酶的每个组织类型内的酶活性来评估。表达和活性与生长、发育和产量参数进行比较,生长、发育和产量参数包括植物部分的形态、色泽、穗(heads)的数目、分蘖或籽粒、籽粒重量、大小、尺寸、干湿株重、成熟持续时间、地上和地下生物量比,以及生长至衰老的不同阶段(包括营养生长、结果、开花)的时机、比率和持续时间,以及可溶性碳水化合物含量(包括蔗糖、葡萄糖、果糖和淀粉水平)以及内源性淀粉水平。优选地,本发明的小麦植物与野生型植物当在相同条件下生长时,在这些参数中的一个或更多个相差少于50%、更优选地少于40%、少于30%、少于20%、少于15%、少于10%、少于5%、少于2%或少于1%。
[0107] 如本文所用,术语“连”指在染色体上足够接近的标志物基因座和第二基因座使得它们在多于50%的减数分裂中一起遗传(例如,非随机)。该定义包括标志物基因座和第二基因座形成相同基因的一部分的情况。此外,该定义包括标志物基因座包含负责目的性状的多态性的情况(换言之,标志物基因座与表型直接“连锁”)。如本文所用的术语“遗传连锁”是比较狭窄的,仅用于涉及标志物基因座和第二基因座在染色体上足够接近使得它们在多于50%的减数分裂中一起遗传的情况。因此,在每代的基因座之间观察到的重组的百分比(厘摩(cM))将少于50。在本发明的具体实施方案中,遗传连锁的基因座可在染色体上相距45cM、35cM、25cM、15cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、或1cM或更少的cM。优选地,标志物相距少于5cM或2cM,且最优选地相距约0cM。
[0108] 如本文所用,“其他遗传标志物”可以是与本发明的小麦植株中期望的性状连锁的任何分子。此类标志物是本领域技术人员熟知的,并且包括与决定性状的基因连锁的分子标志物,性状诸如疾病耐受性,产量,植物形态,籽粒质量,其他休眠性状诸如籽粒颜色、种子中赤霉酸含量、株高、面粉颜色等。此类基因的实例是茎耐锈蚀性基因Sr2或Sr38,条锈病耐受性基因Yr10或Yr17,线虫耐受性基因诸如Cre1和Cre3,在决定生面团强度的麦谷蛋白基因座上的等位基因诸如Ax、Bx、Dx、Ay、By和Dy等位基因,决定半矮秆生长习性并由此决定耐倒伏性的Rht基因(Eagles等,2001;Langridge等,2001;Sharp等,2001)。
[0109] 如本文所用的术语“转基因植物”和“转基因小麦植物”指包含在相同物种、品种或栽培品种的野生型植物中未发现的基因构建体(“转基因”)的植物,并且包括所谓的基因内植物和顺式基因(cisgenic)植物。即,转基因植物(转化的植物)包含它们在转化之前不包含的遗传材料。如本文提及的“转基因”具有生物技术领域中的通常含义,并指已通过重组DNA或RNA技术产生或改变和已被引入进植物细胞的遗传序列。转基因可包括获自或源自植物细胞、或除了小麦以外的植物细胞、或非植物来源,或者合成序列的遗传序列。通常,转基因已通过人为操作诸如,例如,通过转化被引入进小麦植物,但可使用如本领域技术人员认识到的任何方法。通常,将遗传材料稳定地整合进植物的基因组。引入的遗传材料可包含天然存在于相同物种但以重新排列的顺序或以元件的不同排列的序列,例如反义序列。包含此类序列的植物包括在本文的“转基因植物”内。如本文定义的转基因植物包括已使用重组技术被遗传修饰的初始转化和再生的植物(本文中称为T0植物)的所有后代,其中所述后代包含转基因。此类后代可通过初代转基因植物自受精或通过将此类植物与相同物种的另一植物杂交来获得。在一个实施方案中,转基因植物是已被引入(转基因)的每个和每一个基因的纯合子,使得它们的后代对期望的表型不分离。优选地,在转基因植物中的转基因存在于仅单基因的基因座上,使得它们在所有后代中一起遗传。转基因植物部分包括包含转基因的所述植物的所有部分和细胞,诸如,例如,籽粒、培养的组织、愈伤组织和原生质体。“非转基因植物”,优选地非转基因小麦植物,是尚未通过重组DNA技术引入遗传材料被遗传修饰的植物。
[0110] 如本文所用,术语“相应的非转基因植物”指其相对于转基因植物在大多数特征中是相同或类似的,优选地是等基因或近等基因,但没有感兴趣的转基因的植物。优选地,相应的非转基因植物是感兴趣的转基因植物的祖先的相同栽培品种或品种,或缺乏构建体,通常称为“空分离子”的亲缘植物系(sibling plant line),或用“空载体”构建体转化的相同栽培品种或品种的植物,且可以是非转基因植物。如本文所用,“野生型”,指尚未被根据本发明修饰的细胞、组织、籽粒或植物,或源自其的产品诸如面粉等等。本领域已知的野生型小麦细胞、组织、籽粒或植物可被用作对照,以与如本文所述修饰的小麦细胞、组织、籽粒或植物比较外源核酸的表达水平或性状修饰的程度和性质。如本文所用,“野生型小麦籽粒”意指相应的非诱变的、非转基因的小麦籽粒,且“野生型小麦植物”意指相应的非诱变的、非转基因的小麦植物。如本文所用的特定野生型小麦籽粒或植物包括但不限于栽培品种魏斯顿贝(Westonia)、Sunstate和卡杜的那些,其的每个商购可得。
[0111] 几种方法的任一种可被用来确定转基因在转化的植物中的存在。例如,聚合酶链式反应(PCR)可被用来扩增对转化的植物是独特的序列,通过凝胶电泳或其他方法检测扩增产物。DNA可使用常规方法从植物中来提取,且PCR反应使用将区分转化的植物和未转化的植物的引物来进行。确认阳性转化体的另一种方法是通过本领域熟知的DNA印迹杂交。被转化的小麦植物还可被鉴定,即通过例如,可选择标志物基因的存在赋予的它们的表型,或通过检测或定量由转基因编码的酶的表达的免疫测定,或由转基因赋予的任何其他表型从未转化的小麦植物或野生型小麦植物区分。
[0112] 本发明的小麦植物可以生长或收获籽粒,主要用作食品供人摄入或作为动物饲料,或用于发酵或工业原料生产诸如乙醇生产,以及其他用途。优选地,小麦籽粒被加工成食品成分,诸如,例如,可用作食品制造中的成分的面粉(包括全麦)或小麦麸。可选地,小麦植物可直接用作饲料,诸如,例如,放牧动物,或产生干草或秸秆作为饲料。优选地,本发明的植物和籽粒可用于食品生产,特别是可用于商业食品生产。此类食品生产可包括由籽粒制造可以是商业食品生产中的成分的面粉、生面团、粗面粉或其他产品。本发明的小麦植物或籽粒具有除了用于食品或动物饲料用途以外的用途,例如在研究或育种中的用途。
[0113] 在种子繁殖的农作物诸如小麦中,植物可自交以产生是期望基因的纯合子的植物,或单倍体组织诸如发育中的生殖细胞可被诱导使染色体组加倍以产生纯合子植物。这些种子可生长以产生将具有选择的表型诸如,例如,高水平BG的植物。
[0114] 如本文所用,短语“其能够产生植物,所述植物产生其BG含量包括…的籽粒”或其变形意指,由本发明的籽粒产生的小麦植物当在最佳条件下,例如在温室条件诸如在实施例中提及的那些中生长时具有在其籽粒中产生具有定义的组分BG的能力。当拥有来自植物的籽粒时,从籽粒的至少一个在适合的温室条件下生长后代植物,并使用标准程序诸如本文描述的那些测试该后代籽粒中的BG含量是常规的。因此,如本领域技术人员将理解的,由于特定年诸如高温、寒冷、干旱、洪涝、霜冻、虫害应力等等的不利条件,尽管在田间生长的籽粒可无法满足本文限定的所有要求,然而如果该籽粒包含根据本发明的转基因并当在更有利条件下生长时能够产生后代植物(所述后代植物产生限定的BG含量或组成),此类籽粒仍然被本发明所包括。
[0115] 籽粒如本文所用,术语“籽粒”通常指植物的成熟的、收获的种子,但根据上下文还可指在吸涨或发芽之后,或在诸如通过研磨或碾磨加工之后的籽粒。通常,当小麦植物已开始衰老并失去所有绿色且籽粒已经干燥和变硬时,将小麦籽粒收获。成熟谷物籽粒诸如小麦通常具有按重量计少于约18%的水分含量。在一个实施方案中,本发明的籽粒具有在约8%和约14%之间,并且优选地为约10%或约12%的水分含量。如本文所用,术语“种子”意指收获的种子,以及在开花后在植物中发育的种子和在收获之前包含在植物中的成熟种
子。
[0116] 如本文所用,“发芽”指在吸涨之后根尖从种皮出现。“发芽率”指在吸涨之后的一段时间,例如7天或10天内群体中已发芽的种子的百分比。发芽率可使用本领域已知的技术来计算。例如,种子的群体可在数天内被每日评估,以确定随时间的发芽百分比。发芽通常在室温和黑暗中通过将籽粒放置在润湿滤纸之间来测量。关于本发明的籽粒,如本文所用的术语“实质上是相同的发芽率”意指,该籽粒的发芽率相对于相应的野生型籽粒的发芽率至少为70%。这可在4天和7天之间的时间点来确定。在一个实施方案中,本发明的籽粒已被加工,使得它不再能发芽,诸如,例如,胚已通过碾磨被去除,或者通过热处理以稳定籽粒。
[0117] 本发明还提供了从小麦籽粒产生的面粉、粗粉(meal)或其他产品。这些可以是未加工的或加工的,例如通过分级或漂白,或热处理以稳定产品诸如面粉。本发明包括从籽粒或从中间产品诸如面粉产生面粉、粗粉、淀粉颗粒、淀粉或分离的BG的方法。此类方法包括,例如,碾磨、研磨、轧制、剥落和破裂籽粒。本发明还提供了来自包含增加的量的膳食纤维的例示小麦植物的籽粒的淀粉,所述增加的量的膳食纤维可通过本文描述的方法来测量。在优选的实施方案中,这些产品包括提高的BG水平,诸如按重量计至少3%、至少4%、或在约4%至约10%之间。在一个实施方案中,面粉中可溶性纤维含量相对于以相同方式产生的野生型面粉增加了至少50%,优选地至少100%。可选地,或与增加的可溶性纤维组合,不溶性纤维含量相对于野生型面粉增加了至少20%,优选地至少40%。此外,可溶性NNSP和不溶性NNSP含量的每个相对于野生型面粉可增加了至少20%,优选地至少40%。
[0118] 如本文所用的术语“膳食纤维”包括在健康人的小肠未被吸收但进入大肠的碳水化合物和碳水化合物消化产物。这包括抗性淀粉和其他可溶性和不溶性的碳水化合物聚合物。意图包括可在大肠中至少部分地被驻留微生物群落发酵的碳水化合物的那部分。膳食纤维含量可如本文所述来测量。
[0119] 本发明的小麦籽粒或其他植物部分可使用本领域已知的任何技术被加工,以产生食品成分、食品或非食品产品。在一个实施方案中,产品是全籽粒面粉(全麦粉),诸如,例如,超细碾磨的全籽粒面粉,或由约100%籽粒制成的面粉。全籽粒面粉包括精面粉成分(精面粉(refined flour)或精面粉(refined flour))和粗级分(超细碾磨的粗级分)。
[0120] 精面粉可以是例如通过研磨和筛选干净籽粒制备的面粉。精面粉的粒度被描述为其中不少于98%通过具有不大于称为“212微米(U.S.Wire 70)”的编织网布的开口的开口的布的面粉。粗级分包含以下的至少一个:麸和胚芽。例如,胚芽是在籽粒内核之内发现的植物胚。胚芽包括脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素诸如类黄。麸包括几个细胞层,并具有显著量的脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素诸如类黄酮。此外,粗级分可包括糊粉层,所述糊粉层还包括脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素诸如类黄酮。糊粉层,尽管在技术上被认为是胚乳的一部分,展现出许多与麸相同的特性,并因此通常在研磨过程中与麸和胚芽一起被去除。糊粉层中包含蛋白、维生素以及植物营养素诸如阿魏酸。
[0121] 此外,粗级分可与精面粉成分共混。粗级分可与精面粉成分混合形成全籽粒面粉,由此提供了与精面粉相比具有增加的营养价值、纤维含量以及抗氧化能力的全籽粒面粉。例如,粗级分或全籽粒面粉可以以各种量被使用,以在焙烤食品、快餐产品和食品产品中代替精制或全籽粒面粉。本发明的全籽粒面粉(即-超细碾磨的全籽粒面粉)也可直接销售至消费者用于在其自制焙烤产品中使用。在一个示例性实施方案中,全籽粒面粉的粒化谱
(granulation profile)是这样的,按全籽粒面粉重量计98%的颗粒少于212微米。
[0122] 在另外的实施方案中,在全籽粒面粉和/或粗级分的麸和胚芽内发现的酶被灭活,以稳定全籽粒面粉和/或粗级分。稳定化是使用蒸汽、热、辐射或其他处理以灭活在麸和胚芽层中发现的酶的过程。已被稳定的面粉保留其烹饪特性并具有更长的保质期。
[0123] 在另外的实施方案中,全籽粒面粉(whole grain flour)、粗级分或精面粉可以是食品产品的组分(成分),且可被用来产生食品产品。例如,食品产品可以是百吉饼、饼干、面包、小圆面包、羊角面包、饺子、英式松饼、松饼、皮塔饼(pita bread)、快速面包、冷藏/冷冻面团产品、生面团、烘豆、卷饼(burrito)、辣椒、墨西哥卷饼(taco)、玉米粉蒸肉(tamale)、玉米粉圆饼(tortilla)、波特派(pot pie)、即食谷物、即食餐(ready to eat meal)、填料、可用于微波炉加热的餐、布朗尼(brownie)、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、曲奇饼(cookie)、甜点、糕点、小甜面包(sweet roll)、块状糖(candy bar)、派皮(pie crust)、饼馅、婴儿食品、烘烤混合物、面糊、面包屑、肉汁混合物、肉增量剂(meat extender)、肉类替代品(meat substitute)、调味品混合物(seasoning mix)、汤混合物(soup mix)、肉汁、乳酪面粉糊(roux)、色拉酱调料(salad dressing)、汤、酸奶油、面条、面食(pasta)、拉面(ramen noodles)、炒面面条(chow mein noodles)、捞面面条(lo mein noodles)、冰淇淋内含物(ice cream inclusion)、冰淇淋棒(ice cream bar)、冰淇淋蛋卷(ice cream cone)、冰淇淋三明治、薄脆饼(cracker)、油煎面包块、甜甜圈、鸡蛋卷、膨化食品(extruded snack)、水果和谷物棒(fruit and grain bar)、可用于微波炉加热的快餐产品(microwaveable snack product)、营养棒、煎饼(pancake)、平价烘焙的烘焙产品(par-baked bakery 
product)、椒盐卷饼、布丁、基于格兰诺拉燕麦产品(granola-based product)、快餐薄片(snack chip)、快餐食品、快餐混合物、华夫饼干、比萨饼外皮、动物食品或宠物食品。
[0124] 在替代性实施方案中,全籽粒面粉、精面粉或粗级分可以是营养补充剂的组分。例如,营养补充剂可以是被添加至包含一种或更多种另外的成分的膳食的产品,通常包括:维生素、矿物质、草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、草药、调味料、益生菌、提取物、益生元和纤维。本发明的全籽粒面粉、精面粉或粗级分包括维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。例如,粗级分包含浓缩量的膳食纤维以及其他必需营养素,诸如健康膳食所必需的维生素B、硒、铬、锰、镁和抗氧化剂。例如22克本发明的粗级分递送个体的每日推荐摄入的纤维的33%。营养补充剂可包括将有助于个体的整体健康的任何已知的营养成分,实例包括但不限于维生素、矿物质、其他纤维组分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、肽、蛋白、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸,和/或其他营养成分。补充剂可被以,但不限于以下形式递送:速溶饮料混合、立即可饮的饮料、营养棒、煎饼、曲奇饼、薄脆饼、凝胶杆(gel shots)、胶囊、咀嚼物、咀嚼片剂和丸剂。一个实施方案以调味摇动或麦芽类型饮料的形式递送纤维补充剂,该实施方案可作为纤维补充剂对儿童特别有吸引力。
[0125] 在另外的实施方案中,碾磨过程可被用来制成多籽粒面粉或多籽粒粗级分。例如,来自一种类型籽粒的麸和胚芽可被研磨并与另一类型谷物的磨碎的胚乳或全籽粒谷物粉共混。可选地,一种类型籽粒的麸和胚芽可被研磨并与另一类型籽粒的磨碎的胚乳或全籽粒面粉共混。预期的是,本发明包括混合一个或更多个籽粒的一种或更多种麸、胚芽、胚乳以及全籽粒面粉的任何组合。该多籽粒方法可被用来制成定制的面粉并利用多类型谷物籽粒的质量和营养成分制成一种面粉。
[0126] 预期的是,本发明的全籽粒面粉、粗级分和/或籽粒产品可通过本领域已知的任何碾磨过程来产生。一个示例性实施方案包括在单流中研磨籽粒,而不将该籽粒的胚乳、麸和胚芽分离为单独的流。清洗和调节的籽粒被输送至第一通道研磨机,诸如锤磨机辊磨机、针磨机、冲击磨机、圆盘磨机、空气碾磨机(air attrition mill)、缝磨机(gap mill)等。在研磨之后,籽粒被排出并输送至筛子。此外,预期的是,本发明的全籽粒面粉、粗级分和/或籽粒产品可通过许多其他过程诸如:发酵、速溶化、挤出、包封、烘焙、烘烤等的方式来修改或增强。
[0127] 尽管本发明可在人类治疗或预防中特别有用,但应该理解,本发明还可适用于非人受试者,非人受试者包括但不限于农业动物诸如奶牛、绵羊、猪,家禽诸如鸡等,家养动物诸如狗或猫,实验动物诸如兔或啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠,或者可被用于运动的动物诸如马。
[0128] 治疗受试者,特别是人的方法可包括以下步骤:将改变的小麦籽粒、面粉、淀粉、分离的BG或包含BG和AX的组合物,或者如本文定义的食品产品或饮料产品以一个或更多个剂量、以一个量施用至受试者并持续一个时间段,从而生理参数被修改。例如,在受试者大肠中的胆固醇摄取的水平被减少,其导致受试者血流中降低的胆固醇水平。
[0129] 剂量可取决于被治疗或预防的状况变化,但对于人设想每天在至少1g本发明的小麦籽粒或面粉,更优选地每天至少2g,优选地每天至少10g或至少20g中的BG。每天大于约100克籽粒或面粉的施用可需要递送相当大的体积并减少依从性。最优选地,用于人的剂量在0.2g BG和5g BG之间,其可呈包含本发明的籽粒或面粉的食品产品的形式,其相当于每天在约5g和约60g小麦籽粒或面粉之间,或者对于成人每天在约5g和100g之间。
[0130] 将理解的是,本发明的一个益处是,提供了具有特别营养益处的产品诸如面包,并且因此如此做无需在收获之后修饰小麦籽粒的成分。
[0131] 多肽术语“多肽”和“蛋白”在本文通常可互换地使用。如本文所用的术语“蛋白”和“多肽”还包括如本文所述的本发明的多肽的变体、突变体、修饰和/或衍生物。如本文所用,“实质上纯化的多肽”指已从在它的天然状态中与其缔合的脂质、核酸、其他肽和其他分子分离的多肽。优选地,实质上纯化的多肽至少60%不含,更优选地至少75%不含,且更优选地至少90%不含与其天然缔合的其他组分。就“重组多肽”而言意指使用重组技术,即通过重组多核苷酸在细胞,优选地植物细胞,且更优选地小麦细胞中的表达制备的多肽。术语“外来多肽(foreign polypeptide)”或“外源多肽(exogenous polypeptide)”或“异源多肽(heterologous polypeptide)”等指在细胞,优选地小麦细胞中通过外源多核苷酸在该细胞中的表达(转录和翻译)产生的任何多肽。在一个优选的实施方案中,外源多肽是来自小麦以外的植物物种的β-葡聚糖合酶诸如CslF或CslH多肽,更优选地外源CslF6多肽,最优选地CslF6多肽。在一个实施方案中,小麦细胞包含两个或更多个外源多肽诸如,例如,外源CslF6多肽和外源CslH多肽。
[0132] 如本文所用的“生物活性”片段是保持全长多肽的定义的活性的本发明的多肽的一部分。在一个特别优选的实施方案中,生物活性片段具有β-葡聚糖合酶(合成BG)酶活性。只要生物活性片段保持定义的活性,它们可以是任何大小,但优选地,诸如对于CslH和CslF多肽分别是至少700个或800个氨基酸残基长。
[0133] 多肽相对于另一个多肽的%同一性可通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)来确定,空位产生罚分=5和空位延伸罚分=0.3。查询序列长度是至少50个氨基酸,并且GAP分析在至少50个氨基酸区内比对两个序列。更优选地,查询序列长度是至少100个氨基酸,并且GAP分析在至少100个氨基酸区内比对两个序列。甚至更优选地,查询序列长度是至少250个氨基酸,并且GAP分析在至少250个氨基酸区内比对两个序列。当例如通过Blastp比较氨基酸序列以确定同一性百分比时,全长序列将被比较,并且序列中的缺口被视为氨基酸差异。
[0134] 关于定义的多肽,将理解,高于以上提供的那些的%同一性数字将包括优选的实施方案。因此,在适用情况下,根据最小%同一性数字,优选的是,多肽包含与相关指定的SEQ ID NO至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、且甚至更优选地至少99.9%相同的氨基酸序列。
[0135] 本发明的多肽的氨基酸序列突变体可通过将适当的核苷酸变化引入进本发明的核酸或通过体内诱变,诸如通过化学或辐射处理来制备,只要它们保留β-葡聚糖合酶的酶活性。此类突变体包括,例如,残基在氨基酸序列内的缺失、插入或置换。本发明的多核苷酸可经历如由Harayama,1998描述的DNA改组技术,或其他体外方法以产生编码多肽变体的改变的多核苷酸。酶活性可容易地在系统诸如本文描述的本氏烟叶片瞬时表达系统中被测
试。
[0136] 氨基酸序列缺失通常范围从约1个至15个残基,更优选地约1个至10个残基且通常约1个至5个连续的残基。
[0137] 置换突变体已在多肽分子中去除至少一个氨基酸残基并在其位置插入不同的残基。置换诱变最感兴趣的位点包括除了鉴定为活性位点那些以外的位点。为保留活性,从多种菌株或物种获得的Csl多肽中相同的,即保守的氨基酸残基通常是待保留的。这些位置对生物活性可以是重要的。其他残基可被置换,优选地为保守氨基酸置换。
[0138] 多肽变体可通过定向进化过程来生成。在定向进化中,随机诱变被应用于蛋白,且选择机制(regime)被用来挑选出具有期望的性质,例如,增加的β-葡聚糖合酶活性的变体。然后,突变和选择的进一步几轮被应用。代表性定向进化策略包括三个步骤:
[0139] 多样化。编码感兴趣的蛋白的基因被随机突变和/或重组以创造基因变体的大文库。变体基因文库可通过易错PCR(参见,例如,Leung,1989;Cadwell和Joyce,1992),从由亲本模板制备的DNA酶I消化的片段池(Stemmer,1994a;Stemmer,1994b;Crameri等,1998;
Coco等,2001),从简并寡核苷酸(Ness等,2002,Coco,2002)或从两者的混合物,或者甚至从未消化的亲本模板(Zhao等,1998;Eggert等,2005;Jézéquel等,2008)来构建并通常通过PCR来组装。文库还可由通过同源或非同源重组在体内或体外重组亲本序列来做出
(Ostermeier等,1999;Volkov等,1999;Sieber等,2001)。变体基因文库还可通过将感兴趣的基因亚克隆进适合的载体,将该载体转化进“增变基因”菌株诸如大肠杆菌(E.coli)XL-
1red(Stratagene)以及将所转化的细菌繁殖适合数目的世代来构建。变体基因文库还可通过使感兴趣的基因经历如由Harayama(1998)广泛描述的DNA改组(即,通过随机片段化和重组装选择的突变基因的池的体外同源重组)来构建。
[0140] 选择。使用筛选或选择对文库测试拥有所期望特性的突变体(变体)的存在。筛选使通过手工鉴定和分离高表现突变体同时选择自动消除所有无功能的突变体成为可能。筛选可包括筛选已知的保守氨基酸基序的存在。可选地,或另外,筛选可包括在宿主生物体或其部分中表达所突变的多核苷酸并测定活性水平。
[0141] 扩增。在选择或筛选中鉴定的变体被复制许多倍,使研究人员能够测序它们的DNA,以了解已发生了什么突变。
[0142] 这三个步骤一起被称为定向进化的“轮”。大多数实验将需要多于一轮。在这些实验中,先前一轮的“成功者(winners)”在下一轮中多元化以创造新文库。在实验结束时,所有进化的蛋白或多核苷酸突变体使用生化方法来表征。
[0143] 蛋白可基于关于蛋白结构和折叠的已知信息被合理设计。这可通过从头开始设计(从头设计)或通过基于天然支架的设计来完成(参见,例如,Hellinga,1997;以及Lu和Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins 2,1153-
1157(2007))。蛋白设计通常包括鉴定折叠成给定的结构或靶结构的序列并可使用计算机模型来实现。计算蛋白设计算法对当折叠成靶结构时能量低的序列搜索序列-构象间隔。计算蛋白设计算法使用蛋白能量学模型来评估突变将如何影响蛋白的结构和功能。这些能量函数通常包括分子力学、统计(即,基于知识的)以及其他经验方面的组合。适当可用的软件包括IPRO(交互式蛋白重新设计和优化)、EGAD(蛋白设计的遗传算法)、Rosetta设计、
Sharpen以及Abalone。
[0144] 在一个实施方案中,本发明的外源多肽或重组多肽当在小麦细胞中产生时具有β-葡聚糖合酶(合成BG)酶活性并包含具有如在SEQ ID NO:2、9、10、11、18、19、20、23、30、37、38、39、41、43、45、47、50、55、56、57、59、61的任一个中提供的序列、其生物活性片段的氨基酸,或者与SEQ ID NO:NO:2、9、10、11、18、19、20、23、30、37、38、39、41、43、45、47、50、55、56、
57、59、61的任一个或更多个至少40%相同、或至少70%相同、或至少90%相同或至少95%相同或至少98.2%相同的氨基酸序列。优选地,外源多肽或重组多肽包含具有如在SEQ ID NO:18、19、20、55、56、57、59或61的任一个中提供的序列、其生物活性片段的氨基酸,或者与SEQ ID NO:NO:18、19、20、55、56、57、59或61的任一个或更多个至少40%相同、或至少70%相同、或至少90%相同或至少95%相同或至少98.2%相同的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,外源多肽是CslF6多肽,其长度是约940-952个氨基酸残基,更优选地943个、944个或950个氨基酸残基,此类长度包括约90个氨基酸残基的信号序列。在一个实施方案中,外源多肽是其长度包括其90个氨基酸的信号序列的CslF6多肽,不是947个氨基酸。在一个实施方案中,外源CslF6多肽具有8个预测的跨膜结构域,包括,例如,在用于SEQ ID NO:55、
56、57、59或61的任一个或更多个的序列ID NO的列表中描述的跨膜结构域的一个或更多个。CslF多肽优选地包含已知对于SEQ ID NO:55、56、57、59或61的一个或更多个的如本文描述的活性关键的氨基酸,诸如在SEQ ID NO:55中的D228、DxD(430-432)、D636和QxxRW(674-678)氨基酸基序或在其他SEQ ID NO中的相应氨基酸位置。在优选的实施方案中,外源CslF6多肽是燕麦(AsCslF6)、玉米(ZmCslF6)、高粱(SbCslF6)或水稻(OsCslF6)CslF6多肽。如本文所用,燕麦CslF6多肽被定义为其氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:55-57或其氨基酸序列与SEQ ID NO:55-57至少95%相同、优选地至少98%相同的多肽。在一个实施方案中,燕麦CslF6多肽被其核苷酸序列被列出为SEQ ID NO:51-54的任一个或其蛋白编码区的多核苷酸、或编码与SEQ ID NO:51-54的任一个相同的多肽的多核苷酸来编码。如本文所用,水稻CslF6多肽被定义为其氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:61或其氨基酸序列与SEQ ID NO:61至少95%相同、优选地至少98%相同的多肽。在一个实施方案中,水稻CslF6多肽被其核苷酸序列被列出为SEQ ID NO:60或其蛋白编码区的多核苷酸、或编码与SEQ ID NO:
60相同的多肽的多核苷酸来编码。如本文所用,短柄草属CslF6多肽被定义为其氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:59或其氨基酸序列与SEQ ID NO:59至少95%相同、优选地至少98%相同的多肽。在一个实施方案中,短柄草属CslF6多肽被其核苷酸序列被列出为SEQ ID NO:58或其蛋白编码区的多核苷酸、或编码与SEQ ID NO:58相同的多肽的多核苷酸来编码。如本文所用,大麦CslF6多肽被定义为其氨基酸序列被列出为SEQ ID NO:175或其氨基酸序列是大麦中SEQ ID NO:175的天然存在的变体的多肽。此类变体在氨基酸序列上与SEQ ID NO:
175至少99%相同。在一个实施方案中,外源多肽是除了大麦CslF6多肽以外的CslF6多肽。
[0145] 多核苷酸本发明涉及多种多核苷酸。如本文所用,“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”意指可以是DNA或RNA或其组合的核苷酸的聚合物,例如DNA和RNA的异源双链核酸分子,并包括例如mRNA、cRNA、cDNA、tRNA、siRNA、shRNA、hpRNA以及单链DNA或双链DNA。它可以是细胞、基因组或合成来源例如在自动化合成仪上做出的DNA或RNA,并且可与碳水化合物、脂质、蛋白或其他材料组合,用荧光或其他基团标记,或附连至固体支持物,以进行本文定义的特定活性。优选地,当出现在细胞中时,多核苷酸是单独的DNA或单独的RNA,并且当出现在小麦细胞中时一些碱基可被甲基化或以其他方式被修饰。聚合物可以是单链的,基本上双链或部分双链的。部分双链RNA分子的实例是发卡RNA(hpRNA)、短发卡RNA(hpRNA)或自身互补RNA,包括通过在核苷酸序列与其互补物之间碱基配对形成的双链茎和共价连接核苷酸序列与其互补物的环序列。如本文所用的碱基配对指在核苷酸之间的标准碱基配对,包括在RNA分子中的G:U碱基配对。“互补”意指两个多核苷酸能够沿它们的长度的一部分,或者沿一个或两个的全长碱基配对。
[0146] 就“分离的”而言意指实质上或基本上不含在它天然状态中通常伴随它的组分的材料。如本文所用,“分离的多核苷酸”或“分离的核酸分子”意指至少部分地分离自,优选地实质上或基本上不含在它天然状态或细胞中它与其缔合或连接的相同类型的多核苷酸序列的多核苷酸。例如,“分离的多核苷酸”包括已从在天然存在的状态中位于它侧翼的序列纯化或分离的多核苷酸,例如,已从通常邻近该片段的序列取出的DNA片段。优选地,分离的多核苷酸还至少90%不含其他组分诸如蛋白、碳水化合物、脂质等等。如本文所用的术语“重组多核苷酸”指在体外通过将核酸操作进通常在自然界中未发现的形式而形成的多核苷酸。例如,重组多核苷酸可以在表达载体的形式中。通常,此类表达载体包括可操作地连接至在细胞中待转录的核苷酸序列的转录和翻译调控核酸。
[0147] 本发明涉及可被用作“探针”或“引物”的寡核苷酸的使用。如本文所用,“寡核苷酸”是长度多达50个核苷酸的多核苷酸。它们可以是RNA、DNA,或者任一的组合或衍生物。寡核苷酸通常是10个至30个核苷酸,通常15-25个核苷酸长度的相对短的单链分子,通常包含10-30个或15-25个与CslF基因或CslH基因或者相应于CslF基因或CslH基因的cDNA的部分
相同或者互补的核苷酸。当在扩增反应中用作探针或用作引物时,此类寡核苷酸的最小大小是形成在该寡核苷酸与靶核酸分子上的互补序列之间的稳定杂交体所需的大小。优选
地,寡核苷酸长度是至少15个核苷酸、更优选地至少18个核苷酸、更优选地至少19个核苷酸、更优选地至少20个核苷酸、甚至更优选地至少25个核苷酸。用作探针的多核苷酸通常与可检测的标记物诸如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子缀合。本发明的寡核苷酸和探针在检测CslF、CslH或与感兴趣的性状相关的其他基因的等位基因的方法中有用。此类方法采用核酸杂交,并在许多情况下包括通过例如如在野生型或突变等位基因的检测或鉴定的PCR中使用的适合的聚合酶的寡核苷酸引物延伸。优选的寡核苷酸对是跨越一个或更多个内含子,或者内含子的一部分并因此可被用来在PCR反应中扩增内含子序列的那些。许多实例被提供在本文的实施例中。
[0148] 术语“多核苷酸变体”和“变体”等指展示与参考多核苷酸序列实质上序列同一性且能够以与该参考序列类似的方式发挥作用,或者具有与该参考序列相同的活性的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸与参考多核苷酸不同,或者当与天然存在的分子比较时具有一个或更多个突变的多核苷酸。因此,术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或更多个核苷酸已被添加或缺失,或者用不同的核苷酸代替的多核苷酸。在这方面,本领域充分理解,包括突变、添加、缺失和取代的某些改变可对参考多核苷酸做出,从而改变的多核苷酸保留了该参考多核苷酸的生物学功能或活性。因此,这些术语包括编码展现出酶活性或其他调控活性的多肽的多核苷酸,或者能够用作选择性探针或其他杂交试剂的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体。突变体可以是天然存在的(即,从天然来源分离的)或合成的(例如,通过对核酸进行定点诱变)。优选地,编码具有酶活性的多肽的本发明的多核苷酸变体的长度大于400个、更优选地大于500个、更优选地大于600个、更优选地大于700个、更优选地大于800个、更优选地大于900个、且甚至更优选地大于1,000个核苷酸,多达该基因的全长。
[0149] 本发明的寡核苷酸的变体包括能够与例如,小麦基因组在接近本文定义的特定寡核苷酸分子的位置的位置上杂交的变化尺寸的分子。例如,变体可包含另外的核苷酸(诸如1个、2个、3个、4个、或更多个),或更少的核苷酸,只要它们仍然与靶区杂交。此外,几个核苷酸可被取代而不影响寡核苷酸与靶区杂交的能力。另外,变体可容易地被设计出,所述变体与接近本文定义的特定寡核苷酸杂交的植物基因组的区(例如,但不限于,在50个核苷酸内)杂交。
[0150] 在多核苷酸或多肽的背景下“相应于(corresponds to)”或“相应于(corresponding to)”意指多核苷酸(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分实质上相同或互补的核苷酸序列或者(b)编码与肽或蛋白中的氨基酸序列相同的氨基酸序列。该短语在其范围内还包括具有与参考肽或蛋白中的氨基酸序列实质上相同的氨基酸序列的
肽或多肽。用来描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序
列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”、“实质上同一性”以及“相同”,并相对于核苷酸或氨基酸残基的定义的最小数目或者优选地相对于全长来定义。术语“序列同一性”和“同一性”在本文中可互换使用以指在比较窗内基于一个核苷酸接着一个核苷酸或基于一个氨基酸接着一个氨基酸是相同的序列的程度。因此,“序列同一性百分比”如下计算:
通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列,确定两个序列中出现相同的核酸碱基(例如,A、T、C、G、U)或相同的氨基酸残基(例如,Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以产生匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即,窗大小),并将该结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
[0151] 多核苷酸的%同一性可通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)来确定,空位产生罚分=5和空位延伸罚分=0.3。除非另外指明,查询序列长度是至少45个核苷酸,并且GAP分析在至少45个核苷酸区内比对两个序列。优选地,查询序列长度是至少150个核苷酸,并且GAP分析在至少150个核苷酸区内比对两个序列。更优选地,查询序列长度是至少300个核苷酸,并且GAP分析在每个情况下在至少300个核苷酸,或至少400个、500个或600个核苷酸区内比对两个序列。还可参考如例如由Altschul等,1997公开的BLAST程序家族。
序列分析的详细讨论可在Ausubel等,1994-1998,15章的19.3单元被发现。
[0152] 当核苷酸或氨基酸序列具有至少约95%、特别地至少约98%、更特别地至少约98.5%、相当特别地约99%、特别地约99.5%、更特别地约100%、相当特别地是相同的序列同一性时,此类序列被指示为“基本上类似的”。清楚的是,当RNA序列被描述为与DNA序列基本上类似,或与DNA序列具有某种程度的序列同一性时,DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
[0153] 关于定义的多核苷酸,将理解,高于以上提供的那些的%同一性数字将构成优选的实施方案。因此,在适用情况下,根据最小%同一性数字,优选的是,多核苷酸包含与相关指定的SEQ ID NO至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、且甚至更优选地至少99.9%相同的多核苷酸序列。
[0154] 在一些实施方案中,本发明涉及杂交条件的严格性以定义两个多核苷酸的互补性的程度。如本文所用的“严格性”是指在杂交期间温度和离子强度条件,以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格性越高,靶核苷酸序列和所标记的多核苷酸序列之间的互补性程度越高。“严格条件”指在其下仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。如本文所用,术语“在低严格、中等严格、高严格或非常高严格条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可在通过引用并入本文的Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中被发
现。本文提及的具体杂交条件如下:1)在约45℃在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中的低严格杂交条件,随后是在50-55℃在0.2X SSC、0.1%SDS中的两次洗涤;2)在约45℃在6X SSC中的中度严格杂交条件,随后是在60℃在0.2X SSC、0.1%SDS中的一次或更多次洗涤;3)在约45℃在6X SSC中的高度严格杂交条件,随后是在65℃在0.2X SSC、0.1%SDS中的一次或更多次洗涤;以及4)非常高严格杂交条件是在65℃0.5M磷酸钠、7%SDS,随后是在65℃在0.2X SSC、1%SDS的一次或更多次洗涤。
[0155] 基因在一些实施方案中,本发明牵涉基因活性,特别是CslF基因活性的修饰,变体基因的组合,以及嵌合基因的构建和用途。如本文所用,术语“基因”包括包含蛋白编码区或在细胞中转录但不被翻译,连同缔合的非编码和调控区一起的任何脱氧核糖核苷酸序列。此类缔合区通常位于邻近编码区在5'末端和3'末端两者上在任一侧上约2kb的距离。在这方面,基因包含与给定基因天然缔合的控制信号诸如启动子,增强子,转录终止和/或多聚腺苷酸化信号,或异源控制信号(在该情况下基因被称为“嵌合基因”)。位于蛋白编码区的
5'并存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于蛋白编码区的3'或下游并存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式两者。术语“基因”包括编码本文描述的本发明的蛋白的合成或融合分子。基因通常在小麦基因组中作为双链DNA存在。嵌合基因可被引入适当的载体用于细胞中染色体外维持或用于整合进宿主基因组。
[0156] Csl基因或编码Csl多肽的基因的蛋白编码区的序列的实例包括SEQ ID NO 1-8、12-17、21、22、24-29、31-36、40-42、44、46、48、49、51-54、58和60。
[0157] 包含编码区的基因的基因组形式或克隆可被称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断。如本文所用的“内含子”是被转录为初级RNA转录本的一部分,但不存在于成熟的mRNA分子中的基因的区段。内含子从核或初级转录本去除或“剪接掉”;因此内含子不存在于信使RNA(mRNA)中。内含子可包含调控元件诸如增强子。如本文所用的“外显子”指相应于存在于成熟mRNA或在RNA分子未被翻译的情况下存在于成熟RNA分子的RNA序列的DNA区。在翻译期间mRNA其作用以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
[0158] 如本文所用,“嵌合基因”或“遗传构建体”指不是其天然位置中的天然基因即它已被人工操作的任何基因,包括被整合进小麦基因组的嵌合基因或遗传构建体。通常嵌合基因或遗传构建体包含在自然界中未一起被发现的调控序列和转录序列或蛋白编码序列。因此,嵌合基因或遗传构建体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列,或者源自相同来源但以不同于在自然界中被发现的方式的方式排列的调控序列和编码序列。术语“内源”在本文中用来指在未修饰的植物在与研究中的植物优选地小麦植物相同的发育阶段通常产生的物质。“内源基因”指在生物体,优选地小麦植物的基因组中的其天然位置中的天然基因。如本文所用,“重组核酸分子”指已通过重组DNA技术构建或修饰的核酸分子。术语“外来多核苷酸”或“外源多核苷酸”或“异源多核苷酸”等指通过实验操作引入细胞基因组,优选地小麦基因组,但不天然存在于该细胞的任何核酸。这些包括在该细胞中发现的基因序列的修饰的形式,只要引入的基因相对于天然存在的基因包含一些修饰,例如引入的突变或可选择标志物基因的存在。外来基因或外源基因可以是在自然界中发现的被插入进非天然生物体的基因,引入进天然宿主中的新位置的天然基因、或嵌合基因或遗传构建体。“转基因”是已通过转化程序被引入进基因组的基因。术语“遗传修饰”包括将基因引入进细胞,在细胞中突变基因和改变或调制基因在这些行为已被完成的细胞或生物体或者它们的后代
中的调控。
[0159] 本发明涉及可操作地连接(connected)或连锁(linked)的元件。“可操作地连接”或“可操作地连锁”等指多核苷酸元件在功能关系中的连接。通常,可操作地连接的核酸序列被连续地连接,且当需要连接两个蛋白编码区时,是连续的并在阅读框中。编码序列被“可操作地连接至”另一个编码序列,此时RNA聚合酶将把两个编码序列转录成单个RNA,其如果被翻译,则被翻译成具有源自两个编码序列的氨基酸的单个多肽。只要表达的序列最终被加工以产生期望的蛋白,编码序列不需要是彼此连续的。
[0160] 如本文所用,术语“顺式作用序列”、“顺式作用元件”或“顺式调控区”或“调控区”或类似术语应该被理解为意指调控遗传序列表达的任何核苷酸序列。这可以是在其天然环境中天然存在的顺式作用序列,例如调控小麦CslF基因或CslH基因,或者在遗传构建体中的序列,其当相对于可表达遗传序列适当地被放置时调控可表达遗传序列的表达。此类顺式调控区可能够活化、沉默、增强、抑制或以其他方式改变表达水平和/或细胞类型特异性和/或基因序列在转录或转录后水平的发育特异性。在本发明的优选的实施方案中,顺式作用序列是增强或刺激可表达遗传序列,诸如启动子的表达的活化因子(activator)序列。基因的5'-前导序列(UTR)中内含子的存在已被证明增强基因在单子叶植物诸如小麦中的表达(Tanaka等,1990)。另一种类型的顺式作用序列是可通过将活性染色质结构域锚定至核基质来影响基因表达的基质附着区(MAR)。
[0161] 将启动子或增强子元件“可操作地连接”至可转录的多核苷酸意指将可转录的多核苷酸(例如,编码蛋白的多核苷酸或其它转录本)放置在启动子的调控控制下,然后启动子控制该多核苷酸的转录。在异源启动子/结构基因组合的构建中,通常优选的是,将启动子或其变体放置在离可转录多核苷酸的转录起始位点的一些距离处,所述距离与该启动子和在它的天然环境中它控制的基因即启动子源自的基因之间的距离大致相同。如本领域所知,该距离中的一些变化可被调整而不损失功能。
[0162] 载体本发明利用载体产生、操作或转移嵌合基因或遗传构建体。就“载体”而言意指,例如,源自核酸序列可被插入进的质粒、噬菌体或植物病毒的核酸分子,优选地DNA分子。优选地,载体包含一个或更多个独特的限制性位点,并且可能够在定义的宿主细胞包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织中自主复制,或被整合进定义的宿主的基因组中,使得所克隆的序列可繁殖。因此,载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体存在的载体,其的复制独立于染色体复制,例如,线性质粒或闭合环状质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于确保自我复制的任何工具(means)。可选地,载体可以是当被引入进细胞时其被整合进受体细胞的基因组中并连同它已被整合进的染色体一起复制的载体。载体系统可包含单个载体或质粒、共同包含待引入进宿主细胞的基因组的总DNA或转座子的两个或更多个载体或质粒。载体的选择通常将取决于载体与该载体待引入进的细胞的相容性。载体还可包括选择标志物诸如可被用于选择适合的转化体的抗生素耐受性基
因,或增强原核细胞或真核(特别是小麦)细胞的转化的序列诸如T-DNA序列或P-DNA序列。
此类耐受性基因以及序列的实例是本领域技术人员熟知的。
[0163] 就“标志物基因”而言意指赋予表达该标志物基因的细胞独特的表型并由此允许此类转化的细胞与不具有该标志物的细胞区分开的基因。“可选择标志物基因”赋予性状,对于该性状,人们可基于对选择试剂(例如,除草剂、抗生素、辐射、热或损害未转化的细胞的其他处理)的耐受性或基于在可代谢物质的存在下的生长优势进行‘选择’。可筛选标志物基因(或报道物基因)赋予性状,对于该性状,人们可通过观察或测试,即,通过‘筛选’(例如,β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、GFP或不存在于未转化的细胞中的其他酶活性)进行鉴定。标志物基因和感兴趣的核苷酸序列不需要被连接。
[0164] 细菌可选择标志物的实例是赋予抗生素耐受性诸如氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素或四环素耐受性的标志物。用于选择植物转化体的示例性可选择标志物包括,但不限于,赋予对潮霉素B的耐受性的hyg基因;如,例如,由Potrykus等,1985描述的赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418等的耐受性的新霉素磷酸转移酶(npt)基因等;如,例如,在EP-A-256223中描述的来自大鼠肝脏的赋予对谷胱甘肽来源的除草剂耐受性的谷胱甘肽-S-转移酶基因;如,例如,WO87/05327描述的过表达后赋予对谷氨酰胺合酶抑制剂诸如草胺膦耐受性的谷氨酰胺合酶基因,如,例如,在EP-A-275957中描述的来自绿色产色链霉菌
(Streptomyces viridochromogenes)的赋予对选择性试剂草胺膦耐受性的乙酰转移酶基
因,如,例如,由Hinchee等,1988描述的编码赋予对N-(膦酰甲基)甘氨酸(N-
phosphonomethylglycine)耐受性的5-烯醇式丙酮酸草酸-3-磷酸合酶(5-
enolshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS))的基因,如,例如,在WO91/02071中描述的赋予针对双丙氨膦的耐受性的bar基因;来自克雷伯臭鼻杆菌(Klebsiella ozaenae)的赋予对溴苯腈耐受性的腈水解酶基因诸如bxn(Stalker等,1988);赋予对氨甲蝶呤耐受性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等,1988);赋予对咪唑啉酮、磺酰脲类或其他ALS-抑制化学物质的突变体乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP-A-154204);赋予对5-甲基色氨酸耐受性的突变的邻氨基苯甲酸合酶基因;或者赋予对除草剂的耐受性的茅草枯脱卤素酶基因。
[0165] 优选的可筛选标志物包括,但不限于,编码对于其多种显色底物是已知的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)酶的uidA基因,编码对于其显色底物是已知的酶的β-半乳糖苷酶基因,可被应用于敏感的生物发光检测中的水母发光蛋白基因(aequorin gene)(Prasher等,1985);绿色荧光蛋白基因(GFP,Niedz等,1995)或它的变体中的一个;允许生物发光检测的荧光素酶(luc)基因(Ow等,1986),以及本领域已知的其他的。
[0166] 在一些实施方案中,内源酶活性的水平通过降低编码参与小麦植物中BG产生的蛋白的基因表达水平,或增加编码参与小麦植物中BG合成的酶的核苷酸序列的表达水平来调制。增加的表达可在转录水平通过使用能够控制从编码序列表达的转录本的水平的不同强度的启动子或诱导型启动子来实现。异源序列可被引入,该异源序列编码调制或增强其产物下调淀粉支化的基因的表达的转录因子。基因的表达的水平可通过改变包含编码序列和可操作地连接至该编码序列并在细胞中是有功能的转录控制元件的构建体的每细胞拷贝数目来调制。可选地,多个转化体可被选择,且筛选具有起因于转基因整合位点附近的内源序列的影响的有利水平和/或特异性转基因表达的那些。有利水平和模式的转基因表达是导致小麦植物中BG含量实质增加的转基因表达。这可通过转化体的简单测试来检测。
[0167] 减少基因表达减少基因表达可通过被引入小麦植物中的“基因沉默嵌合DNA”或“基因沉默嵌合核酸”的引入和转录,或通过包含相对于野生型基因减少感兴趣基因的表达和/或活性的感兴趣基因中突变的突变体的分离来实现。基因沉默嵌合DNA是外源多核苷
酸,所述外源多核苷酸优选地被引入稳定整合进小麦基因组,优选地小麦核基因组中,使得它作为小麦基因组的一部分在后代籽粒和植物中稳定遗传。如本文所用的“基因沉默效应”指靶核酸在小麦细胞、优选地种子细胞、更优选地胚乳细胞中表达的减少,所述表达的减少可通过沉默RNA的引入来实现。在一个优选的实施方案中,基因沉默嵌合DNA被引入,其编码减少一个或更多个内源基因的表达的RNA分子。此类减少可以是转录减少的结果,包括经由染色质重塑的甲基化,或从内源基因转录的RNA分子的转录后修饰,包括通过RNA降解,或两者。如本文所用的“基因沉默”包括在一些但不是所有的基因表达或活性中的减少-部分减少-以及靶核酸或基因的表达的废除。靶核酸在沉默RNA的存在下低于在其不存在下(例如在缺乏基因沉默嵌合DNA的相应细胞)的表达水平是足够的。靶向的基因的表达和/或活性的水平可被减少了至少约40%或至少约45%或至少约50%或至少约55%或至少约60%或
至少约65%或至少约70%或至少约75%或至少约80%或至少约85%或至少约90%或至少
约95%或有效废除至基本上检测不到的水平。
[0168] 反义。反义技术可被用来减少小麦细胞中的基因表达。术语“反义RNA”应该被理解为意指与特定mRNA分子的至少一部分互补并能够减少编码mRNA的基因的表达的RNA分子。此类减少通常以序列依赖性方式发生,并被认为是通过干扰转录后事件诸如将mRNA从细胞核转运至细胞质,mRNA稳定性或翻译抑制来发生。反义方法的使用是本领域熟知的(参见例如,Hartmann和Endres,1999)。反义方法现在是用于在植物中操作基因表达的完善建立的技术。
[0169] 反义分子通常包含相应于靶基因的转录区的部分的序列或实现在基因表达或剪接事件内控制的序列。例如,反义序列可相应于本发明的基因的所靶向的蛋白编码区,或者
5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或这些的组合,优选地仅相应于靶基因的外显子。鉴于相关基因的UTR之间的通常较大的分歧,靶向这些区提供了基因抑制的较大的特异性。反义序列的长度应该是待抑制的基因的至少19个连续的核苷酸、优选地至少50个核苷酸、且更优选地至少100个、200个、500个或1000个核苷酸,多达全长的最大值。与整个基因转录本互补的全长序列可被使用。长度最优选地是100-2000个核苷酸。反义序列与靶向的转录本的同一性程度应该是至少90%,且更优选地是95%-100%。当然,反义RNA分子可包括可起稳定分子作用的无关的序列。
[0170] 表达反义RNA的遗传构建体可通过将启动子序列以“反义”方向连接至靶基因区来容易地做出,所述“反义”方向如本文所用指相对于靶基因序列在植物细胞中的转录和翻译(如果它发生)的方向的相反方向。优选地,反义RNA通过使用胚乳特异性启动子在小麦植物胚乳中优先表达。
[0171] 术语“核酶”指特异性识别独特底物RNA并催化其裂解的RNA分子。通常,核酶包含用于特异性识别靶核酸的反义序列,和在本文中称为“催化结构域”的酶促区。在本发明中特别有用的核酶类型是锤头状核酶(Haseloff和Gerlach,1988;Perriman等,1992)以及发夹核酶(Shippy等,1999)。
[0172] DsRNA。如本文所用,“人工引入dsRNA分子”指引入双链RNA(dsRNA)分子,其优选地在小麦细胞中通过从编码此类dsRNA分子的嵌合基因转录来合成。RNA干扰(RNAi)还对特异性减少基因表达或抑制也在小麦中的特定蛋白的产生特别有用(Regina等,2006)。该技术依赖于包含与感兴趣的基因或其部分的mRNA基本上相同的序列的dsRNA分子以及其互补物的存在,从而形成dsRNA。便利地,dsRNA可由宿主细胞中的单启动子产生,在所述宿主细胞中有义序列和反义序列被转录以产生发夹RNA,其中有义序列和反义序列杂交以形成具有形成环结构的相关的或无关的序列的dsRNA区,所以发夹RNA包含茎环结构。用于本发明的适合的dsRNA分子的设计和产生充分在本领域技术人员的能力内,特别地考虑Waterhouse等,1998;Smith等,2000;WO 99/32619;WO 99/53050;WO 99/49029;以及WO 01/34815。
[0173] 编码dsRNA的DNA通常包括排列为反向重复序列的有义序列和反义序列。在一个优选的实施方案中,有义序列和反义序列被包含当转录成RNA时被剪接掉的内含子的间隔区分开。这种排列已被证明导致更高效率的基因沉默(Smith等,2000)。双链区可包含从任一个DNA区或两个转录的一个或两个RNA分子。dsRNA可被归类为具有长的可以很大程度上互补但不需要完全互补的有义区和反义区的长hpRNA(通常大于约200bp,范围在200-1000bp之间)。hpRNA还可以是相当小的,其中双链部分大小范围从约30至约42bp,但不长于94bp(参见WO04/073390)。双链RNA区的存在被认为触发来自破坏双链RNA两者的内源植物系统以及还来自靶植物基因的同源RNA转录本的反应,有效减少或消除靶基因活性。
[0174] 杂交的有义序列和反义序列的长度应该各自是至少19个连续的核苷酸,优选地至少30个或50个核苷酸,且更优选地至少100个、200个、500个或1000个核苷酸。相应于整个基因转录本的全长序列可被使用。长度最优选地是100-2000个核苷酸。有义序列和反义序列与靶向的转录本的同一性程度应该是至少85%,优选地是至少90%,且更优选地是95%-100%。序列越长,整体序列同一性需要的严格性越低。当然,RNA分子可包括可起稳定分子作用的无关的序列。用来表达形成dsRNA的构建体的启动子可以是在表达靶基因的细胞中被表达的任何类型的启动子。
[0175] 其他沉默RNA可以是包含与靶基因的RNA转录本的核苷酸序列的互补物具有至少95%序列同一性的至少20个连续的核苷酸的“非多聚腺苷酸化的RNA”,诸如在WO01/12824或US6423885中描述的。又另一种类型的沉默RNA是如在WO03/076619(通过引用并入本文)中描述的RNA分子,包含与靶核酸序列或其互补物具有至少95%序列同一性的至少20个连续的核苷酸,并且还包含如在WO03/076619中描述的大双链区。
[0176] 如本文所用,“沉默RNA”是具有与从靶基因转录的mRNA区互补的21个至24个连续核苷酸的RNA分子。21个至24个核苷酸的序列优选地与mRNA的21个至24个连续核苷酸序列完全互补,即与mRNA区的21个至24个核苷酸的互补物相同。然而,在mRNA区具有多达五个错配的miRNA序列还可被使用(Palatnik等,2003),且碱基配对可包括一个或两个G-U碱基配对。当不是沉默RNA的所有21个至24个核苷酸能够与mRNA碱基配对时,优选的是,在沉默RNA的21个至24个核苷酸和mRNA区之间仅存在一个或两个错配。关于miRNA,优选的是,多达最大五个的任何错配被发现朝向miRNA的3'末端。在一个优选的实施方案中,在沉默RNA序列和其靶mRNA之间存在不多于一个或两个错配。
[0177] 沉默RNA源自由本发明的嵌合DNA编码的较长RNA分子。本文中还称为“前体RNA”的较长RNA分子是通过从小麦细胞中的嵌合DNA转录产生的最初产物,并具有通过在互补区之间的分子内碱基配对形成的部分双链特性。前体RNA被通常称为"切酶"的专类的RNA酶加工成通常21个至24个核苷酸长的沉默RNA。如本文所用的沉默RNA包括在其生物合成中不同的短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。SiRNA源自具有至少21个连续碱基对,包括可能的G-U碱基对,没有错配或未碱基配对的核苷酸从双链区凸出的完全或部分双链RNA。这些双链RNA由通过自身折回来并形成茎环结构形成的单一、自身互补的转录本形成,本文中称为“发夹RNA”,或由是至少部分互补的并杂交以形成双链RNA区的两个单独的RNA构成。MiRNA通过加工包含不完全互补的互补区并因此形成不完全碱基配对的结构的较长的单链转录本来产生,所以在部分双链结构内具有错配或未碱基配对的核苷酸。碱基配对结构还可包括G-U碱基对。形成miRNA的前体RNA的加工导致具有特定序列的一个独特的小RNA,miRNA的优先积累。它源自前体RNA的一条链,通常源自前体RNA的“反义”链,然而,形成siRNA的长互补前体RNA的加工产生siRNA的群,所述siRNA的群在序列上是不均匀的但相应于前体的许多部分并来自前体的两条链。
[0178] MiRNA。MiRNA首次作为控制秀丽线虫(C.elegans)中的lin-4基因的小调控RNA被发现(Lee等,1993)。自那时起,大量其他天然存在的miRNA被报道参与动物和植物中的基因功能调控。在本文中还称为“人工miRNA前体”的本发明的MiRNA前体RNA通常源自天然存在的miRNA前体,通过改变天然存在的前体的miRNA部分的核苷酸序列使得它与靶mRNA的21个至24核苷酸区互补,优选地完全互补,且改变与miRNA序列碱基配对的miRNA前体的互补区的核苷酸序列以保持碱基配对。剩余的miRNA前体RNA可不被改变,并因此具有与天然存在的miRNA前体相同的序列,或剩余的miRNA前体RNA还可在序列中通过核苷酸取代、核苷酸插入,或优选地核苷酸缺失或其任何组合来改变。剩余的miRNA前体RNA被认为参与由被称为切酶样1(DCL1)的切酶酶识别结构,并因此优选的是几乎不对剩余的结构做任何改变。例如,碱基配对的核苷酸可取代其他碱基配对的核苷酸,而整体结构没有主要改变。本发明的人工miRNA前体源自的天然存在的miRNA前体可来自小麦、另一种植物诸如另一种谷物植物或来自非植物来源。此类前体RNA的实例是水稻mi395前体、拟南芥(Arabidopsis)mi159b前体或mi172前体。
[0179] 例如,Alvarez等,2006;Parizotto等,2004;Schwab等,2006已证明人工miRNA在植物中。
[0180] 共抑制。可被使用的另一种分子生物学方法是共抑制。共抑制的机制还不是很清楚,但被认为牵涉转录后基因沉默(PTGS),并在该方面可与反义抑制的许多实例非常类似。它包括将额外拷贝的基因或其片段在相对于用于它的表达的启动子的“有义方向”引入进植物中,所述“有义方向”如在本文用来指与相对于靶基因中序列的序列的转录和翻译(如果它发生)相同的方向。有义片段的大小、它与靶基因区的相应性,以及它与靶基因同源性的程度如同以上描述的反义序列。在一些情况下,另外拷贝的基因序列干扰靶植物基因的表达。参考专利说明书WO 97/20936和欧洲专利说明书0465572用于实施共抑制途径的方
法。反义、共抑制或双链RNA分子还可包含优选地包含核定位信号的主要双链RNA区,如在WO 
03/076619中所述的。
[0181] 用于减少基因表达的这些技术中的任一个可被用来协调减少多个基因的活性。例如,一种RNA分子可通过靶向基因共同区来靶向一个家族的相关基因。可选地,不相关的基因可通过在一种RNA分子中包含多个区来靶向,每个区靶向不同基因。这可容易地通过在单启动子的控制下融合多个区来完成。
[0182] 转化本领域技术人员熟知的许多技术可用于将核酸分子引入进小麦细胞。如本文所用的术语“转化”意指通过引入外来或外源核酸,改变例如细菌或植物,特别是小麦植物的细胞基因型。就“转化体”而言意指这样改变的生物体。DNA通过使亲本植物杂交或通过诱变本身进入小麦植物的引入不被包括在转化中。如本文所用的术语“转基因”指遗传修饰的植物,其中内源基因组通过被引入的外来或外源基因或序列的随机或定点整合,或者以可复制的非整合的形式稳定保持来补充或修饰。就“转基因”而言意指被引入进植物中的外来或外源基因或序列。核酸分子可作为染色体外元件被复制或优选地被稳定整合进植物的基因组中。就“基因组”而言意指细胞、植物或植物部分的整个遗传的遗传互补物,并包括染色体DNA、质粒DNA、线粒体DNA以及染色体外DNA分子。在一个实施方案中,转基因被整合进小麦核基因组,六倍体小麦中的所述小麦核基因组包括A、B和D子基因组,本文称为A、B和D“基因组”。
[0183] 产生能育的转基因小麦植物最常用的方法包括两个步骤:递送DNA进入可再生小麦细胞,以及通过体外组织培养的植物再生。尽管其他方法已被用来将DNA序列整合进小麦或其他谷物,两种方法通常被用来递送DNA:使用根癌农杆菌(Agrobacterium 
tumefaciens)或相关的细菌T-DNA转移,和经由基因枪法(particle bombardment)直接引入DNA。对本领域技术人员将明显的是,只要它实现可接受水平的核酸转移,将核酸构建体引入进植物细胞的转化系统的具体选择不是本发明必不可少的或者不是本发明的限制。用于小麦的此类技术是本领域熟知的。
[0184] 转化的小麦植物可通过以下来产生:将根据本发明的核酸构建体引入进感受态细胞,并且使包含和表达根据本发明的多核苷酸的新植物生长。新植物从处于细胞培养中的转化的细胞生长的过程在本文中被称为“再生”。可再生的小麦细胞包括包括成熟的胚、分生组织的细胞诸如叶基的叶肉的细胞,或优选地来自在开花后12-20天获得的未成熟的胚的盾片的细胞,或源自这些的任一个的愈伤组织的细胞。回收再生的小麦植物的最常用的路线是使用培养基诸如用植物生长素诸如2,4-D和低水平的细胞分裂素补充的MS-琼脂的体细胞胚胎发生,参见Sparks和Jones,2004)。
[0185] 农杆菌(Agrobacterium)介导的小麦转化可通过以下的方法来进行:Cheng等,1997;Weir等,2001;Kanna和Daggard,2003或Wu等,2003。具有足够毒力的任何农杆菌菌株,优选地具有另外的毒力基因功能的菌株诸如LBA4404、AGL0或AGL1(Lazo等,1991)或C58的版本可被使用。与农杆菌相关的细菌还可被使用。从农杆菌转移至受体小麦细胞的DNA(T-DNA)被包含在遗传构建体(嵌合质粒)中,所述遗传构建体(嵌合质粒)包含位于待转移的核酸侧翼的野生型Ti质粒的T-DNA区的一个或两个边界区。遗传构建体可包含两个或更多个T-DNA,例如其中一个T-DNA包含感兴趣的基因且第二个T-DNA包含可选择的标志物基因,条件是两个T-DNA的独立插入和可选择的标志物基因远离感兴趣的转基因的可能分离。
[0186] 任何可再生的小麦类型可被使用;品种Bob White、Fielder、Veery-5、Cadenza以及Florida已被成功报道。在这些更容易可再生品种的一种中的转化事件可通过标准回交被转移至包括优良品种的任何其他小麦栽培品种。使用农杆菌的替代性方法利用体内接种方法,随后是使用组织培养再生和选择转化的植物,并证明是有效的,参见WO00/63398。牵涉使用农杆菌的其他方法包括:农杆菌与培养的分离的原生质体的共培养;用农杆菌转化种子、顶端或分生组织,或者原位接种(in planta)诸如,如由Bechtold等,1993描述的拟南芥的花浸染方法。该后一种方法是基于农杆菌细胞悬液的真空渗入。可选地,嵌合构建体可使用农杆菌的根诱导(Ri)质粒作为载体来引入。
[0187] 通常用于将核酸构建体引入进植物细胞的另一种方法是如,例如由Klein等,1987描述的通过具有包含在小珠或粒子的基质内或在其表面上的待引入的核酸的小粒子的高速弹道渗透(high velocity ballistic penetration)(还称为基因枪法或微粒轰击)。该方法已适用于小麦(Vasil,1990)。引入伤害的微粒轰击随后与农杆菌共培养可被使用(EP-A-486233)。遗传构建体还可通过如,例如,由Fromm等,1985以及Shimamoto等,1989描述的电穿孔引入进植物细胞。可选地,核酸构建体可使用机械或化学工具通过使细胞与核酸接触被引入进小麦细胞诸如花粉细胞。
[0188] 用于在小麦的转化中使用的优选的可选择的标志物基因包括结合使用除草剂草胺膦选择的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicusbar)bar基因或pat基因,结合抗生素潮霉素的hpt基因,或者结合卡那霉素或G418的nptII基因。可选地,阳性可选择标志物诸如编码以糖甘露糖-6-磷酸作为唯一C源的磷酸甘露糖异构酶(PMI)的manA基因可被使用。
[0189] 诱变程序用于产生突变体植物系的技术是本领域已知的。可用于产生突变体植物的诱变剂的实例包括辐射诱变和化学诱变。突变体还可通过技术诸如T-DNA插入和转座子诱导的诱变来产生。诱变程序可对小麦植物的任何亲本细胞,例如种子或组织培养中的亲本细胞来进行。优选的诱变方法是重离子轰击或另一种辐射方法,或者使用如本领域已知的锌指核酸酶或TAL效应物(TAL effector)。
[0190] 化学诱变剂可由化学特性,例如,烷基化剂、交联剂等等来分类。有用的化学诱变剂包括,但不限于,N-乙基-N-亚硝基脲(ENU);N-甲基-N-亚硝基脲(MNU);盐酸甲基苄肼;苯丁酸氮芥;环磷酰胺;甲磺酸甲酯(MMS);甲磺酸乙酯(EMS);硫酸二乙酯;丙烯酰胺单体;三乙撑蜜胺(TEM);美法仑;氮芥;长春新碱;二甲基亚硝胺;N-甲基-N'-硝基亚硝基胍-啶(N-methyl-N'-nitro-Nitrosoguani-dine)(MNNG);7,12二甲基苯丙蒽(DMBA);环氧乙烷;六甲基磷酰胺;和二甲磺酸丁酯。
[0191] 诱导突变的适合的辐射的实例是通过诸如由铯137源提供的伽玛辐射。伽玛辐射优选地以大约60Krad至200Krad的剂量,且最优选地以大约60Krad至90Krad的剂量被提供至植物细胞。
[0192] 将植物通常暴露于诱变剂足够的持续时间,以实现所期望的遗传修饰,但不足以完全破坏细胞的存活力以及它们被再生为植物的能力。
[0193] 突变还可使用用于检测基因中除了外源多核苷酸以外的突变的称为TILLING(靶向诱导基因组局部损伤技术(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))的过程被引入进本发明的小麦植物。在第一个步骤中,引入的突变诸如新颖的单碱基对改变通过用化学诱变剂处理种子或花粉被引入植物群体,并然后推进植物至突变将被稳定遗传的世
代。DNA被提取,并将来自群体的所有成员的种子储存,以创造可随时间反复存取的资源。
[0194] 对于TILLING测定,PCR引物被设计为特异性扩增感兴趣的单个基因靶。如果靶是基因家族的成员或多倍体基因组的一部分,特异性是特别重要的。接下来,染料标记的引物可用来从多个个体的汇集的DNA扩增PCR产物。将这些PCR产物变性并再退火,允许错配的碱基对的形成。错配或异源双链体代表天然存在的单核苷酸多态性(SNP)(即,来自群体的几个植物可能携带相同的多态性)和诱导的SNP(即,仅稀有的单株可能展示突变)。在异源双链体形成之后,识别并切割错配的DNA的核酸内切酶诸如Cel I的使用是发现在TILLING群体之内的新颖SNP的关键。
[0195] 使用该方法,成千上万的植物可被筛选以鉴定具有在任何基因或基因组的特定区的单碱基改变以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。被测定的基因组片段大小范围可在从0.3kb至1.6kb的任何处。在8倍汇集,1.4kb片段(扣除由于噪音SNP检测有问题的片段的末端)和每测定96个泳道,该组合允许每单测定多达一百万个碱基对的基因组DNA被筛选,使TILLING成为高通量技术。TILLING还在Slade和Knauf(2005),以及Henikoff等(2004)中被描述。
[0196] 除了允许有效检测突变以外,高通量TILLING技术对于检测自然多态性是理想的。因此,通过与已知序列异源双链体化询问未知同源DNA揭示了多态位点的数目和位置。核苷酸改变和小的插入和缺失二者被鉴定,包括至少一些重复数目的多态性。
[0197] 已一般性描述了本发明,通过参考以下实施例将更容易理解本发明,以下实施例通过说明性方式来提供,而不意图作为限制。
[0198] 本发明实施例
[0199] 实施例1.材料和方法
[0200] 植物材料和生长条件
[0201] 将包括未转化的(野生型)和转基因衍生物两者的大麦(青稞(Hordeum vulgare))栽培品种喜马拉雅(Himalaya)和小麦(普通小麦普通物种(Triticum aestivum 
sp.aestivum))栽培品种Bob White26,或者栽培品种魏斯顿贝(Westonia)的植物在标准温室条件与自然采光和在白天期间25℃最大值及在夜里15℃最小值的温度状况下生长在
15cm盆中。为提供大麦叶片组织用于基因表达研究,使籽粒在实验室在蛭石中发芽,并且第一叶(first leaf)在7天之后被收获。相应的小麦叶片在第9天之后从植物来收获。对于籽粒发育基因表达研究,温室生长的植物的穗在花期被标记且籽粒在开花后每4天(DPA)被收获。整个颖果在0天和开花后第4天被使用,并且除了果皮不可从其被去除的第28天样品以外,胚和果皮从所有其他样品中被去除。对于胚芽鞘基因表达研究,使籽粒在黑暗中在水中在蛭石上发芽并且胚芽鞘在吸涨后第3、4、5、6和7天被收获。成熟的胚芽鞘在第一叶出现之后从光下发芽的籽粒来获得。与黑暗生长的胚芽鞘不同,成熟的胚芽鞘是短的和绿色的。
[0202] DNA、RNA分离以及cDNA合成
[0203] 植物DNA使用根据Murray和Thompson(1980)基于CTAB的方法从完全展开的叶片组织中来分离。简言之,将在液氮中冷冻并研磨的一克组织在60℃用5ml CTAB提取缓冲液提取一小时,随后用5ml氯仿提取,倒置3分钟并以5,000g离心10分钟。将上清液取出并且DNA通过添加2/3体积的异丙醇随后以2,000g离心5分钟来沉淀。将团块用70%乙醇洗涤并风
干,然后重悬于0.5ml 10mM Tris、1mM EDTApH 8.0与20μg/ml RNA酶A中。DNA的浓度和完整性通过琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色来确定。
[0204] 总RNA根据制造商的说明书使用RNAeasy试剂盒(Qiagen,目录号74904)从营养组织来分离。RNA使用苯酚-SDS提取溶液从发育中的胚乳来分离,并且根据Clarke等,(2008)使用LiCl从水相沉淀RNA。制剂中的RNA浓度通过分光光度法来确定且RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳和用溴化乙锭染色来确定。RNA使用“无DNA”试剂盒(Ambion,目录号1906)用DNA酶来处理,以去除制剂中任何剩余的DNA,并且然后cDNA根据制造商的说明书使用
SuperscriptIII逆转录酶(Invitrogen,目录号18080-044)从RNA模板来合成。
[0205] 碾磨小麦面粉
[0206] 小麦籽粒的含水量根据制造商的说明书使用FOSS 5000机器通过NIR来测量,并然后通过与所需量的水混合过夜来调整至14%水分,并然后在Brabender Quadrumat Junior磨粉机上碾磨成精面粉和麸级分。将级分组合,并然后通过300μm和150μm筛网筛选。在300μm筛网收集的材料被认为是麸,且通过150μm筛网保留的材料是糠(pollard)并被丢弃,而穿过150μm筛网的材料被认为是白面粉(胚乳)。全麦小麦面粉通过将调整过的籽粒在配备有1mm筛网的cylcone磨粉机上碾磨来制备。
[0207] 谷物籽粒中BG含量的分析
[0208] 由于碾磨的全籽粒面粉源自全籽粒并代表全籽粒,籽粒的BG含量通过如下所述测量碾磨的全籽粒面粉的BG含量(w/w)来测量。将单籽粒用牙科医生汞合金混合器(WIG-L-BUG,Dentsply)中的单滚珠轴承研磨成精细全麦面粉。来自成熟单籽粒的此类面粉使用按比例缩小形式的地衣聚糖酶酶促方法(AACC方法32-33、Megazyme测量试剂盒、McCleary和Glennie-Holmes 1985)分析BG含量。简言之,将20mg在2ml螺帽微量离心管(Eppendorf 
tube)中的面粉重悬于1ml磷酸钠缓冲液中并在90℃震摇孵育一小时。将样品冷却至42℃,并且添加40μl地衣聚糖酶(50U/ml),且样品伴随偶然震摇孵育一小时。在以13,000g离心
5min后,10μl的上清液样品(或对于低BG样品诸如小麦20μl)一式三份被转移至96孔微量滴定板。在每个一式三份中的一份样品通过添加10μl乙酸钠缓冲液被作为空白处理,同时其他两份在42℃各自用10μlβ-葡糖苷酶(2U/ml)处理15min。每个样品中释放的葡萄糖的量通过添加200μl GOPOD试剂来测量,然后显色被允许在42℃进行20分钟,且吸光度在510nm处来测量。BG的量参考葡萄糖标准来计算并针对Megazyme测定试剂盒提供的大麦参考标准来归一化。BG含量使用Megazyme试剂盒中提供的公式基于干重被表示为碾磨的全籽粒面粉的重量百分比(w/w)。
[0209] BG的结构分析
[0210] BG的精细结构通过地衣聚糖酶消化以及荧光标记低聚糖随后通过毛细管电泳分离来检查。该方法比传统的HPAEC方法(Wood等,1991)更灵敏,并具有被量化的另外的优势。
在地衣聚糖酶/荧光标记方法中,每个低聚糖仅用一个荧光标签在还原末端被标记,因此信号强度独立于低聚糖长度,且低聚糖的摩尔比因此与荧光信号成正比。
[0211] 在小麦面粉在如以上描述的Megazyme测定中用地衣聚糖酶消化处理之后,将样品以10,000g离心一分钟。100μl上清液的样品在Speedivac中被干燥。低聚糖然后通过与8-氨基-1,3,6-芘三磺酸(8-amino-1,3,6-pyrenetrisulfonic acid)(APTS)还原胺化被荧光标记,并通过如在O’Shea等,1998中描述的荧光团-辅助的-毛细管电泳(FACE)与激光感生荧光检测来分离。在相应于DP3和DP4低聚糖的每个峰值中的荧光信号被整合,且这些面积的比被计算以提供DP3/DP4的比(DP3除以DP4)。当通过该荧光方法确定时,该比是摩尔比,而不是重量/重量比。该方法还被用于燕麦BG结构的分析(Colleoni-Sirghie等,2003)。
[0212] 面粉样品中BG的水溶解度
[0213] 在第一种方法中,面粉样品中的BG水溶解度使用包括如下所述的灭活内源酶的热灭活步骤的方法来确定。100mg面粉的样品在Eppendorf Thermomixer中在80℃在螺帽管中在1.8ml 80%乙醇中震摇加热1小时。该步骤灭活将在后续步骤中分解聚合的细胞壁材料的任何内源酶,同时溶剂的乙醇性质防止任何聚合物被溶解和去除。然而,糖和其他乙醇可溶性低聚糖将在该乙醇处理步骤中从面粉样品中去除。在以10,000g离心1min后,将成团块的面粉重悬于1ml 20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中并在37℃震摇孵育2小时以提取水溶性组分。将样品再次离心并将上清液取出,并收集-该水级分包含水溶性(水可提取)BG。将团块(水不溶性级分)重悬于1ml相同缓冲液中。水溶性和水不溶性两种级分的等分试样使用以上描述的按比例缩小Megazyme测定进行BG含量测定。一式两份样品被测定。可溶性和不溶性的BG含量被计算为面粉的干重的%,即1%干重的BG含量等于每克干重面粉10mg BG。在计算中,假定面粉包含10%(w/w)水分–来自充分干燥的籽粒的几个面粉样品的水分含量通过近红外(NIR)光谱来确定并且发现是约10%(w/w)。总BG被计算为可溶性和不溶性的BG的总和。
[0214] 在通常较少使用的第二种方法中,面粉样品中BG的水溶解度如由Aman等,(1987)所述来确定。该方法不使用热灭活步骤。
[0215] 膳食纤维的确定
[0216] 谷物面粉的总的和可溶性的膳食纤维通过具有稍作修改的AOAC官方方法991.43(Lee等,1992)来确定。修改是使用总计25ml己烷用于脂质提取(不是每克25ml),使用80%乙醇和无水乙醇代替78%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗涤剩余物,且在60℃而不是如AOAC方法中所述的70℃洗涤剩余物。
[0217] 包含提高的BG的小麦的理化特性和营养特性的确定。
[0218] 纤维增强的小麦面粉的营养组成,包括纤维含量和组成,营养素水平,抗氧化能力和其他相关的属性使用标准化的分析程序(AOAC国际分析的官方方法(AOAC;2002)来确定。脂质水平在用氯仿:甲醇(1:1,v/v)的混合物提取之后使用Daugherty(1983)方法,(AOAC方法983.23)重量分析地确定。总氮水平使用Kirsten等(1984)的方法与Carlo Erba氮分析仪通过Dumas氧化技术来确定。在样品的完全和瞬时氧化之后,将所得气体经过还原炉和一系列洗涤柱,然后氮使用热导检测器来测量。蛋白值通过应用6.25的乘法因数
(multiplication factor)来计算。对于中性NSP(NNSP),Theander等的修改版本GC方法,(1995;AOAC方法994.13)被使用,所述方法应用按比例缩小程序,使用稀硫酸(1M)2小时水解,随后离心不溶性NNSP,且对于可溶性NNSP使用2M三氟乙酸进一步水解。总淀粉根据
McCleary等(1994)的酶方法,使用商业测定试剂盒(K-TSTA,Megazyme International 
Ireland Ltd.,Bray,Ireland)来确定。灰分含量如在AOAC方法923.03(1923)中概述的通过在马弗炉(muffle furnace)中在540℃点燃大约1g至4g冷冻干燥的样品持续15h来确定。灰分的重量通过差来确定。简单糖使用官方分析化学师协会(the Association of Official Analytical Chemists)的方法982.14来提取,并使用适当的标准通过HPLC来定量。总淀粉在α-淀粉酶&淀粉转葡糖苷酶消化之后使用基于McCleary等(1994)的方法的商业程序(总淀粉测定试剂盒,Megazyme Ltd,Melbourne,Australia)作为游离葡萄糖来分析。抗性淀粉(RS)含量和血糖指数(GI)使用体外孵育系统来预测,所述体外孵育系统模仿如发生在人上消化道的食物消化的口腔、胃部和胰腺阶段(Bird,Usher,Klingner,Topping和Morell,参见WO2006/069422)。测试面粉和相关参考食物的一式两份样品被放置在烧瓶中,并在pH 
7.0与人工唾液(250U/mLα-淀粉酶)混合。在15-20s之后,将混合物与酸化(0.02M HCl)胃蛋白酶(1mg/mL)在37℃孵育30min。然后将溶液调整至pH 6.0,且样品在震摇水浴中在37℃在
0.2M乙酸盐缓冲液(pH 6.0)中用胰酶(2mg/mL)和淀粉转葡糖苷酶(28U/mL)来处理。对于血糖指数(GI),将上清液的等分试样在指定的时间点取样直至5h,且葡萄糖浓度使用自动化电化学程序来确定。预测的样品GI被计算为在孵育时间过程期间转化为葡萄糖和释放的可用碳水化合物百分比。对于抗性淀粉(RS),孵育周期被延长了更多几个小时,并且在当时样品中剩余淀粉的量使用常规的酶和分光光度技术来确定。预测的样品RS含量被计算为消化中剩余淀粉的量作为样品重量的百分比。
[0219] 实施例2.小麦CslF基因和CslH基因的克隆
[0220] 介绍。谷物籽粒的(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖(本文为BG)含量在谷物物种当中变化,大麦、燕麦和黑麦具有最高的量,且小麦、玉米和水稻具有相对低的水平(Fincher和Stone,2004)。例如,基于干重,野生型大麦通常具有约4%的BG,一些大麦系具有相当多的BG,然而小麦籽粒通常具有小于1%的BG,通常约为0.5-0.8%。在大麦中,BG形成发育中的胚乳和成熟的胚乳两者中的细胞壁的主要组分(Izydorczyk和Dexter,2008)。相比之下,BG仅在早期籽粒发育阶段是小麦胚乳的主要细胞壁组分,而阿拉伯糖基木聚糖在细胞分化的开始积累并占籽粒成熟形式70-80%的胚乳细胞壁(Philippe等,2006a,2006b)。
[0221] 在大麦中CelF6基因被证明编码活性BG合酶(Burton等,2008)。最近,Doblin等,(2009)证明了,大麦CslH基因还编码BG合酶,并且作者得出结论认为,CslF和CslH两个基因家族有助于大麦中的BG合成。在大麦中,HvCslF6的过表达导致了转基因籽粒中BG水平增加了多达约80%(Burton等,2011)。相比之下,在小麦中,CslH在发育中的胚乳中的过表达导致在成熟籽粒中BG水平约100%的增加,从籽粒重量的约0.69%增加至1.9%的最大值(WO2009/079714)。作者们评论,该水平BG以前在小麦中从未见过。Nemeth等(2010)示出了,内源CslF6基因被表达于小麦中并是产生存在于野生型小麦胚乳中的正常水平的BG所需
的。然而,它们在小麦中不过表达CslF6,且不存在小麦中CslF6表达水平是否限制BG积累或小麦中其他基因是否限制的指示。
[0222] 在本研究开始时,不知道除了CslH以外的基因当由小麦胚乳中的转基因表达时是否将增加BG水平,并因此本发明人在转基因小麦中测试了几个CslF基因,特别是,CslF4、CslF6、CslF7和CslF9基因。因此本发明人首次克隆了候选小麦Csl基因并如下所述确定了它们在小麦植物中的表达模式。
[0223] 相应于TaCslF基因和TaCslH基因的cDNA克隆的分离。
[0224] 总RNA使用RNAeasy试剂盒从小麦栽培品种Saratovskaya29的一周龄叶片和幼苗组织来分离。这被用于SMART cDNA文库构建。RNA还使用如在实施例1中描述的LiCl沉淀RNA通过苯酚/SDS方法从小麦栽培品种Westonia的发育中的籽粒来分离,并用于cDNA合成。互补DNA(cDNA)根据制造商说明书(Invitrogen)在50℃使用Superscript III逆转录酶来合
成,且5’和3’SMART RACE如所述(Burton等,2008)来进行。
[0225] 表达序列标签序列和相应的共有序列使用来自大麦的可用CslF序列和CslH序列(Burton等,2008)通过BLAST搜索从NCBI数据库和TIGR数据库来鉴定。小麦EST TC276200和TC261037与CslF3的3’半部同源,TC244207和TC256381与CslF4的3’半部同源,且TC275889和TC250370与CslF6的5’末端和3’末端同源。单碱基差异(singleton)TC255929相应于CslH的3’末端,且BJ280995相应于CslF8的中间部分。在数据库中不存在与HvCslF7同源的EST序列。有义引物基于大麦序列在起始甲硫氨酸密码子(SJ114、SJ115、SJ116、SJ117、SJ118、SJ30和SJ163分别对于CslF3、CslF4、CslF6、CslF7、CslF8、CslF9和CslH,序列参见表1)周围来设计以分离相应于这些基因的cDNA。为分离包括5’-UTR和3’-UTR的全长cDNA,编码小麦CslF10的cDNA的5’末端使用巢式引物对UPM-SJ150和NUP-SJ155通过5’RACE来分离。用于通过3’RACE分离cDNA的3’末端的巢式引物对是:用于CslF4的UPM-SJ60和NUP-SJ14、用于CslF6的UPM-SJ113和NUP-SJ48、用于CslF8的UPM-SJ61和NUP-SJ56以及用于CslF9的UPM-
SJ113和NUP-SJ03(表1中的引物序列)。对于所有引物退火在55℃进行。有义引物和反义引物被设计成共有序列或3’RACE序列,并用于分离基因组和cDNA片段,以使对于每个基因能够组装全长蛋白编码共有序列。
[0226] 全长cDNA使用引物对SJ116-SJ156(CslF6)、SJ118-SJ158(CslF8)、SJ165-SJ166(CslF10)和SJ163-SJ164(CslH)从小麦栽培品种魏斯顿贝胚乳cDNA(开花后4天)来分离。
[0227] 在数据库中未发现相应于水稻CslF1、CslF2或CslF5基因的小麦序列或EST。
[0228] TaCslF基因和TaCslH基因的基因组克隆的分离。
[0229] 扩增对从来自栽培品种中国春(Chinese Spring)小麦植物的叶片分离的DNA来进行,以分离包含其内含子的基因组CslF和CslH序列。从面包小麦克隆基因由于如下事实复杂化:普通小麦是具有通常被称为A、B和D基因组的三个子基因组的六倍体。然而,包括全长蛋白编码区的基因组克隆使用引物对用于CslF6的SJ162-SJ156、用于CslF7的SJ278-SJ147以及用于CslH的SJ163-SJ164从小麦栽培品种中国春成功分离。对于大部分,但不是所有的CslF基因和CslH基因,全长cDNA和基因组克隆从三个基因组的每个来获得。对于每个基因,内含子的位置和大小通过将cDNA序列和基因组序列进行比较来确定。与相应的大麦基因相比,内含子的位置和大小在图1中示例性示出。
[0230] CslF3共有核苷酸序列由来自cDNA(用引物对SJ114-SJ38扩增的)和基因组序列(用引物对SJ114-139和SJ44-SJ31扩增的)的核苷酸序列来组装。TaCslF3cDNA序列被提供为SEQ ID NO:1,且TaCslF3多肽氨基酸序列被提供为SEQ ID NO:2。CslF4共有核苷酸序列由cDNA序列(用引物对SJ115-SJ13和SJ14-NUP扩增的)和基因组序列(用引物对SJ115-
SJ140和SJ115-SJ157扩增的)来组装。相应于三个小麦CslF4基因的cDNA序列在SEQ ID NO:
3-5中给出,包含两个内含子的相应的CslF4基因组序列各自为SEQ ID NO:6-8,以及编码的CslF4氨基酸序列为SEQ ID NO:9-11。相应于三个小麦CslF6基因的cDNA序列在SEQ ID NO:
12-14中给出,包含内含子(当分离时)的相应的CslF6基因组序列各自为SEQ ID NO:15-17,以及编码的CslF6氨基酸序列为SEQ ID NO:18-20。这些按顺序可能代表了来自A、B和D基因组的CslF6基因。SEQ ID NO:21、22和23分别是编码CslF7的cDNA的核苷酸序列、基因组(部分长度)克隆和编码的氨基酸序列。CslF9共有核苷酸序列由来自cDNA(用引物对SJ30-
SJ135和SJ03-NUP扩增的)和基因组序列(用引物对SJ30-101和SJ152-SJ37扩增的)的序列
来组装。相应于三个小麦CslF9基因的部分长度或全长cDNA序列在SEQ ID NO:24-26中给
出,包含内含子(当分离时)的相应的CslF9基因组序列各自为SEQ ID NO:27-29,以及编码的CslF9氨基酸序列为SEQ ID NO:30。相应于三个小麦CslH基因的cDNA序列在SEQ ID NO:
31-33中给出,包含内含子(当分离时)的相应的CslH基因组序列各自为SEQ ID NO:34-36,以及编码的CslH氨基酸序列为SEQ ID NO:37-39。这些按顺序可能代表了来自A、B和D基因组的CslH基因。
[0231] 小麦基因和多肽的讨论。
[0232] 如大麦类似,六倍体小麦的每个基因组具有七个CslF基因(CslF3、CslF4、CSlF6、CslF7、CslF8、CslF9和CslF10)和一个单CslH基因。内含子的位置和剪接点(GT…AG)序列在小麦和大麦中是保守的。通常,内含子的大小在相应小麦和大麦基因之间是类似的,且差异中的一些可通过重复序列或转座子序列的存在或不存在来解释。例如,大麦HvCslF9基因的第二内含子与小麦序列相比具有一个拉岛(Islay)MITE插入物,且小麦TaCslF3的第一内含子比大麦中相应的基因稍大,并具有在其他大麦基因中发现的30bp序列。小麦和大麦两者CslF8基因的第一内含子比所有其他内含子大得多,部分地由于反转录转座子的存在-在小麦中序列与来自山羊草(Aegilops tauschii)的偷渡者(Stowaway)MITE同源,且在大麦中与偷渡者MITE哈得斯(Hades)同源。内含子序列中的差异并未表现为影响内含子的剪接。对于相应于正确剪接的mRNA的所有基因,cDNA序列被获得。然而,对于相对于相应大麦基因的小麦基因,不确定内含子剪接效率是否是相同的。
[0233] 所有小麦基因编码的蛋白大小与相应大麦蛋白类似(表2),都具有相同数目的预测的跨膜域,且对于每多肽的总计八个,两个朝向氨基末端且六个朝向羧基末端(图1)。所有报道的氨基酸是糖基转移酶活性必需的,即D、DxD、ED和QxxRW氨基酸(Pear等,1996),在小麦蛋白中是保守的。类似于大麦HvCslF6蛋白,与其他CslF蛋白比较,小麦TaCslF6蛋白具有约50个另外的氨基酸的延伸的环。50个另外的氨基酸分别是A、B和D基因组编码的CslF6蛋白的氨基酸517-566、513-561和516-565。所有蛋白具有将它们导向高尔基体膜系统的信号序列,但该序列不被切除
[0234] 小麦TaCslH基因具有八个内含子,内含子的数目与水稻OsCslH1基因相同,且比从大麦栽培品种Golden Promise分离的HvCslH基因多一个(Doblin等,2009)分离,该HvCslH基因缺乏倒数第二个内含子。从去壳大麦栽培品种喜马拉雅分离HvCslH基因证实了,它具有如同小麦和水稻基因的八个内含子(图1)。
[0235] 实施例3.CslF基因和CslH基因在小麦中的表达分析
[0236] 对于内源基因表达的分析,半定量RT-PCR用HotStar Taq(Qiagen)DNA聚合酶来进行。为了不使扩增饱和,对于Csl基因和CesA基因,每个PCR反应中的循环的数目在28-35的范围内调整,且对于作为定量RNA载量的对照的α-微管蛋白基因24个循环被使用。更定量的实时PCR用Platinum Taq和SyBR绿在Rotorgene6000(Qiagen)上来进行。机器软件被用来基于比较定量计算表达差异。使用的引物的核苷酸序列在表1中给出。
[0237] CslF和CslH基因在小麦-胚芽鞘和叶片组织中的表达分析
[0238] 基于半定量RT-PCR结果,更高表达的小麦CslF基因,即TaCslF6和TaCslF9及TaCslH基因的表达使用实时PCR来检查。这些基因沿着延伸的叶并在过程时间内在胚芽鞘组织(发芽后3-7天)中以及在成熟胚芽鞘中的表达的数据在图2中示出。在这些基因中,小麦TaCslF6基因目前在所有检查的营养组织中是最高表达的TaCslF基因,表达在叶片中比在胚芽鞘中更高。TaCslF6表达在延伸的组织、幼小的胚芽鞘和下部叶片区段中是高的,且在成熟的胚芽鞘中和朝向叶尖下降。表达还在幼小胚乳组织中是较低的(图2A)。小麦
TaCslF9基因在延伸的组织中在最幼小的胚芽鞘中最高表达,且在最下部叶区段最低(图
2B),且在叶中比在胚芽鞘中更低,且在发育中的籽粒中仍然更低。相比之下,小麦TaCslH基因以最高水平在具有完全延伸诸如成熟的胚芽鞘和叶尖的成熟组织中表达(图2C)。
[0239] CslF和CslH基因在发育中的小麦和大麦籽粒中的表达
[0240] 为研究在籽粒发育期间的基因表达,以及为比较小麦和大麦中的表达,实时PCR对由从在距离开花日期(分别标记为TaE0、HvE0)多达至开花后28天的4天间隔的小麦和大麦胚乳提取的RNA制备的cDNA并使用在表1中列出的引物来进行。数据在图3中示出,显示了相对于E0样品(E0=在0DPA的胚乳)的表达水平,其中,由于组织之间发育阶段中的大差异,数据针对输入(input)RNA的量而不是针对对照内源基因的表达被归一化。由看家基因诸如蔗糖合酶1和α-微管蛋白表达的mRNA的水平还被测定,并且在约4-12DPA的早期种子发育中最大。这些表达谱是可重复的,并反映了发育中籽粒随着它通过发育阶段进行的代谢状态,所述发育阶段从(i)在(0-14DPA)的多细胞化(cellularisation)和分裂早期,随后是(ii)具有最大淀粉和细胞壁合成的分化阶段(14-28DPA),以及然后(iii)较慢成熟和干燥阶段(28天以及之后)。小麦TaCslF6基因是发育中的籽粒中最高表达的基因,并在整个发育中以高水平表达(图3A),在开花后4天的样品中具有最大表达。大麦HvCslF6基因以类似尽管轻微较高的最大水平,以比小麦TaCslF6基因的约1.5倍大水平表达,且表达还在籽粒发育后期下降(图3A)。下一个最高表达的基因TaCslF9在小麦中在8DPA附近达到峰值,并且表达在这之后急剧跌落(图3B)。尽管在12DPA的表达高于小麦中的,大麦HvCslF9基因显示类似的表达水平和模式(图3B)。其他HvCslF基因在发育中的大麦籽粒中的表达低了十至百倍,接近可重复检测的限值,且没有明显的表达模式可被识别(Burton等,2008)。小麦中的情况也是如此,且无共同差异可被检测到。总之,发育中的小麦籽粒中的单独CslF基因以与大麦CslF基因类似的模式表达,且认为,由于在籽粒发育期间CslF基因表达中的差异,在小麦和大麦籽粒之间在BG含量中实质差异是不可能的。
[0241] 在发育中的小麦和大麦籽粒之间观察到的主要差异是CslH基因的表达(图3C)。在大麦中,HvCslH基因的表达在最幼小的阶段是最低的,且在发育期间表达增加,在28DPA达到顶峰。相比之下,在小麦中,TaCslH基因的表达在最幼小的组织中是最高的,并从8DPA以及后续阶段,表达是非常低的,使得观察到小麦胚乳中的表达水平以比大麦在发育后期低约10倍水平(图3C)。因此,TaCslH基因与HvCslH基因的表达谱相反,且因此该基因被认为是解释在这些物种之间籽粒中BG积累中差异的可能的原因。
[0242] 讨论。与大麦和一些其他谷物相比,小麦在胚乳中具有低得多水平的BG。以上描述的实验着手确定用于这的可能原因。进行了小麦和大麦中的CslF和CslH基因比较分析,包括小麦基因的分离(实施例2)以及营养组织和发育中的籽粒两者中的基因表达的分析(实施例3)。这显示了,小麦具有全套(a full complement of)的CslF和CslH基因,其的每个被表达,因此相对大麦BG在小麦中的低水平不归因于缺乏特定CslF或CslH基因或者特定基因的表达。从小麦分离的全长基因全部编码与大麦同源物类似长度的蛋白。尽管在物种之间存在一些氨基酸差异,这些中没有一个处于完全保守的残基中,使得它们可能影响编码的蛋白的酶活性。
[0243] 最丰富的小麦CslF和CslH基因在营养组织中的表达还表现为与大麦的类似。TaCslF6基因以高水平组成性地表达,尽管表达在叶片的上半部分低得多,且在叶尖中特别低。TaCslF9基因以最高水平在延伸的组织诸如叶基和幼小的胚芽鞘中表达,而TaCslH的情况正好相反,TaCslH在分化的组织诸如成熟的胚芽鞘和叶尖中是最高的。在发育中的胚乳中,TaCslF6和TaCslF9基因显示与大麦同系物类似的表达模式,尽管以轻微较低的水平但很可能不足够不同以解释物种之间胚乳的BG组分中的大差异。与营养组织中的表达不同,在发育中的胚乳中TaCslH基因与大麦HvCslH基因相比在时间模式和丰度两者中以不同的
方式表达。然而,当胚乳成熟时HvCslH基因表达增加并且在28DPA达到最大值,TaCslH基因在0和4DPA最大表达,且表达在那之后急剧下降,使得在28DPA存在约10倍低的TaCslH基因表达。在大麦中,BG生物合成主要地发生在发育后期在约19天之后(Coles,1979;Seefeldt等,2009),因此CslH基因在小麦和大麦之间的表达中的该差异表明CslH基因在控制籽粒的BG水平中的作用。
[0244] 在实施例2和3中,小麦CslF和CslH基因家族中的基因被分离,并且它们的表达谱与大麦基因的那些进行比较。发现了,小麦具有全套CslF基因和CslH基因,并且在胚乳发育晚期期间CslH的低水平被假设解释籽粒中BG的低水平。这如在以下实施例中所述来测试。
[0245] 实施例4.编码大麦HvCslH的嵌合基因在小麦胚乳中的表达
[0246] 为测试TaCslH基因在发育中的小麦籽粒中与大麦中HvCslH基因相比的表达模式中观察到的差异,即较低水平和改变的时机是否有助于成熟小麦籽粒中低得多水平的BG,构建体如下所述被设计并使用胚乳特异性启动子制备以在转基因小麦籽粒中过表达大麦
HvCslH蛋白。基因组HvCslH序列(SEQ ID NO:49)在存在包含在大麦基因的内含子中的任何调控序列的情况下使用,所述任何调控序列可影响基因的表达并有助于表达中的差异。
[0247] 载体构建以及植物转化
[0248] HvCslH基因的全长cDNA序列在WO2009/079714中被描述。包含HvCslH的蛋白编码区的嵌合基因从基因组DNA来分离并用来转化小麦植物。基于cDNA序列,寡核苷酸引物SJ91和SJ85(表1)分别对于基因的蛋白编码序列的5’末端和3’末端来设计。这些用来使用从栽培品种喜马拉雅的大麦植物获得的基因组DNA作为扩增反应中的模板序列,扩增包含
3203bp大麦DNA的DNA片段。将片段插入进质粒载体pCRBluntII TOPO(Invitrogen)中。该片段的核苷酸序列加上作为EcoRI片段的侧翼的来自载体的12bp核苷酸序列在SEQ ID NO:49中给出。基因中的内含子相应于SEQ ID NO:49中的339-437、769-867、994-1107、1228-
1331、1545-1637、1759-1817、2048-2081、2505-2655。基因组HvCslH序列从载体切离并作为EcoRI片段插入在pZLBx17nosCas载体中的高分子量麦谷蛋白Bx17启动子(pBx17)的1.9kb
片段和nos3’聚腺苷酸化/终止子区之间。pBx17启动子被用于构建体中,由于已知它在发育中的胚乳中赋予高水平和优先表达(“endosperm-specific promoter”,Reddy和Appels,
1993)。所得的嵌合DNA构建体被用来使用Pellegrineschi等,(2004)的基因枪方法转化Bob White 26栽培品种的小麦植物,使用50mg/L G418作为选择转化的细胞的选择试剂。为做到这一点,编码HvCslH的表达载体和包含在CaMV35S启动子序列的控制下的NPTII可选择标志物基因的第二质粒(pCMSTSL2neo)以等摩尔量混合,并被共轰击进Bob White 26植物的未TM
成熟胚乳的盾片。对再生的植物使用从幼小叶片组织用来自Sigma的RedExtractnAmp 试剂盒提取的DNA通过PCR测定筛选转基因的存在。
[0249] 在抗生素选择后,十四个独立转化的小麦植物被生成,并生长在温室中,以在自受精之后产生种子。这些植物中的十一个通过PCR被证实对于编码大麦HvCslH蛋白的表达构建体是转基因的。所有的转化系出现表型正常。在开花之后大约十五天,RNA从来自每个植物的三个发育中的籽粒(T1种子)的池来提取,并且引入的编码大麦HvCslH的基因的表达使用对HvCslH转基因特异的引物(SJ183和SJ85,表1)通过实时PCR来监测。作为用于归一化导入的基因的表达水平的对照基因,内源α-微管蛋白的表达也被测定。植物的至少五个显示编码大麦HvCslH的嵌合基因的表达。观察到的表达水平(表5)大于被假设是经历转化过程的未转化的系的最低表达PCR阴性系的数百倍多达约2000倍。大麦HvCslH转基因转录本的全长cDNA克隆从系H1-5B用引物SJ163和SJ164(表1)来分离并测序,以证明大麦内含子在转化的小麦植物内被正确剪接。
[0250] 转基因的表达通过来自单或一式两份汇集的T1发育中的籽粒样品(大约15DPA)的cDNA的实时PCR来分析。表达水平针对微管蛋白基因的表达来归一化,并相对于具有代表野生型表达水平的最低水平的样品(系H1-2)被示出(表5)。另外,BG水平对来自相同植物的单成熟T1籽粒的全麦面粉来确定。来自PCR阴性植物即非转基因植物的籽粒的BG含量多达
1.0%的最大值。相比之下,表达编码HvCslH系的嵌合基因的植物中的两个具有几个具有
1.9%(w/w)BG的籽粒,代表BG水平中至少90%的增加。平均地,来自PCR阳性系的T1籽粒具有比PCR阴性系(分别为0.96%与0.69%(w/w))显著更高的BG含量。然而,该分析不区分引入转基因的纯合子和杂合子。
[0251] 每个系的六个至八个单独的T1植物生长,自受精并且T2种子被生成。对T2种子PCR筛选编码HvCslH的嵌合基因的存在。系9显示所有的PCR阳性后代,表明该系是纯合子,并且这在更进一步世代中被证实。其他系也可能是纯合子,但第一测试的结果是不确定的。
[0252] 在籽粒发育的约中点,对来自每个T1植物的三个汇集的T2种子分析转基因的表达,并且在成熟期对3-5个单种子分析BG含量。系6、9和10以在大于由用作定量对照的内源α-微管蛋白基因表达的RNA水平的4倍和6倍之间的水平显示最高的转基因表达。大部分成熟的籽粒具有多达最大2.4%的增加的BG含量。系H1-6A5也表现为是转基因的纯合子,由于来自该系的所有籽粒具有增加的BG水平。
[0253] 基于基因表达数据和BG结果,四个T2系(系H1-6A5、H1-9B2、H1-10B1和H1-10B7)的种子被播种,并且所得的植物自受精以获得纯合T3系。T3籽粒的嵌合基因表达水平和BG水平被测定;数据在图4中示出。野生型BG水平如PCR阴性系(图4中灰色实心三角形)指示的通常在范围0.6%至约1.0%内。除了H1-6A5系的一个T3籽粒,所有的都具有增加的BG含量。来自系H1-10B1.9和H1-10B7.4和H1-10B7.6(图4中黑色实心三角形)的所有T3籽粒具有增加的BG含量,表明那些籽粒中转基因的纯合性。更进一步世代的筛选证实了所有这些系的纯合性。这些系连同作为阴性分离子(即野生型)的系H1-10B7.3被扩大(bulked up)以获得多于200g汇集的T4籽粒用于如在实施例5中描述的进一步分析。
[0254] 实施例5.用编码HvCslH的外源基因转化的小麦籽粒中的BG水平的分析
[0255] 除了作为100个籽粒的平均重量确定的平均籽粒重量从每野生型籽粒约44mg至每转基因籽粒约32-35mg的约18-20%降低以外,来自HvCslH过表达系的T4籽粒看上去表型正常。该籽粒的样品被(i)球磨以产生全麦面粉或(ii)用从白胚乳面粉分离薄片麸的Buhler Quadrumat辊磨机来碾磨,因此产生胚乳面粉(“白面粉”),并如实施例1中所述对每个级分分析BG含量。这对于来自一个阴性分离子(H1-10B7.3作为野生型对照)以及对于三个纯合HvCslH过表达系的T4小麦籽粒来进行。一式两份样品的BG水平用Megazyme试剂盒来分析。
地衣聚糖酶消化这些样品的部分被荧光标记并通过FACE来分析,以确定DP3和DP4低聚糖的比。白面粉的膳食纤维水平根据酶重量法(enzymatic-gravimetric)AOAC官方方法991.43来确定。数据记录在表6中。
[0256] 来自阴性分离子籽粒(即野生型系H1-10B7.3)的全麦面粉具有0.8%BG,而麸级分具有在1.78%的较高的BG水平。该野生型的胚乳面粉具有基于干重的0.26%的低的BG含量。相比之下,来自表达嵌合HvCslH基因的植物的面粉相对于野生型具有增加的BG含量。与对照相比,来自最高表达系的全麦面粉的BG含量增加了一倍达约1.6%(w/w)(表6),且胚乳面粉增加至0.9%(w/w)多达3.5倍。麸的BG含量还从1.78%增加至2.39%(w/w),可能由于至少部分因为被附着的胚乳碎片污染,其作为大麸片上的白色斑点可见。胚乳从麸的该不完全分离通常见于小规模碾磨,由于这些机器比商业化碾磨器效力低。
[0257] 由于阿拉伯糖基木聚糖(AX)是小麦胚乳细胞壁的主要组分,胚乳和麸级分的戊聚糖含量也被确定。这表明,与阴性分离子对照系相比,在高BG系中胚乳的戊聚糖水平存在轻微增加,且来自相同系的麸的戊聚糖水平存在相应降低。
[0258] 转基因籽粒中BG的精细结构及水溶解度
[0259] 从通过在实施例1中描述的方法分离的转基因籽粒分离的BG的结构在地衣聚糖酶消化和FACE分析之后来检查(O'Shea等,1998)。来自阴性分离子籽粒的全麦面粉的BG具有约2.4的DP3/DP4比,而对于来自麸的BG,该比是约2.6。来自胚乳面粉的BG的比是低的,在约
1.9(表6)。从来自三个过表达HvCslH的小麦系的籽粒分离的BG的DP3/DP4比显示彼此轻微变化,但总体上值不显著不同于对于野生型全麦面粉、麸和胚乳面粉观察到的比。来自全籽粒的BG的DP3/DP4中的范围是2.30-2.44,而对于来自胚乳的BG,它是1.89-1.99。
[0260] 在野生型小麦籽粒中,很少的BG是可溶性的(Beresford和Stone,1983)。来自HsCslH转基因籽粒的小麦胚乳面粉的BG的溶解度通过如实施例1中所述在40℃在水性缓冲液中提取2小时来确定。在这些条件下,系H1-10B7.3的对照籽粒中约7%的BG是水溶性的(图5)。类似水平的水溶性BG在转基因HvCslH籽粒的胚乳面粉中被发现,尽管作为比例,这代表籽粒中在1%和3%之间的总BG。
[0261] 结论是,尽管BG含量在HsCslH转基因籽粒中显著增加,BG中DP3/DP4的比以及水溶性BG的量未改变。
[0262] 胚乳面粉中膳食纤维水平的分析
[0263] 尽管可溶性BG在转基因HvCslH籽粒中的比例表现为未增加,膳食纤维在白面粉中水平也通过Prosky AOAC官方方法991.43(Lee等,1992)来确定。该标准方法使用高温和热稳定的淀粉水解酶和蛋白酶,以模拟煮熟的食物在人消化道中的消化。对照胚乳面粉的分析证实了,白面粉具有低水平的可溶性和总膳食纤维,分别在干重的0.7%和2.4%(表6)。相比之下,且出乎意料的是,所有三个转基因HvCslH系显示白面粉中可溶性和总膳食纤维两者的大量增加。系H1-10B1.9的籽粒显示了多于两倍的增加,1.8%可溶性和5.3%总膳食纤维。
[0264] 讨论。当内源TaCslH基因表达在胚乳发育后期中的低水平通过引入和表达包含如在天然大麦基因中发现的内含子的编码HvCslH的嵌合基因来补充时,籽粒的BG含量与在野生型籽粒中的0.6%至1.0%相比在转基因籽粒中实质上增加至2.1%(w/w)。此类水平的BG在未转化的小麦或其野生祖先中是未知的(Pritchard等,2010)。在来自纯合HvCslH转基因系的成批的T4籽粒中,存在全麦面粉中BG含量的两倍增加,且在白(胚乳)面粉中从0.26%至约0.9%BG的3.5倍增加。BG在地衣聚糖酶消化之后的结构分析显示,在DP3/DP4比中不存在改变,表明胚乳中额外的BG具有与野生型BG类似的结构。在水溶性BG的比例中也不存在改变,由于野生型和高BG系两者仅显示低水平的可溶性BG。令人惊奇地,与正常小麦面粉相比,在胚乳面粉中存在约2倍增加水平的可溶性和总膳食纤维。在两个测定之间,溶解度中的差异可通过提取条件来解释,由于BG溶解度测定的第一步包括在80%乙醇溶液中加热面粉悬液以灭活内源酶,而膳食纤维测定没有灭活步骤且内源水解酶可作用于细胞壁并释放更多的碳水化合物。纤维测定还测量了阿拉伯糖基木聚糖和其他纤维组分。
[0265] 实施例6.编码多种HvCslF蛋白和CslH蛋白的序列的分离以及在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中测试它们的功能性
[0266] 几个大麦CslF基因在WO2007/014433中被描述。为了制备用于转化小麦以异源表达大麦CslF蛋白的构建体,如下所述编码区从cDNA或基因组DNA分离并插入进表达构建体中。几个构建体包括在蛋白编码区的5’末端上的编码11个具有氨基酸序列MASMTGGQQMG的氨基酸的T7表位标签的核苷酸序列,从而将该11个氨基酸添加至所编码的蛋白的N-末端。
由于对该表位特异性的商业化抗体是可用的,该表位被包括,以通过蛋白印迹分析辅助检测和定量表达于转基因籽粒中的蛋白。如下面所示,与野生型蛋白相比,T7标签的添加不影响添加T7-的蛋白的酶活性。除T7标签以外,编码的蛋白相对于栽培品种喜马拉雅中的野生型大麦蛋白在氨基酸序列中不被修饰。
[0267] 编码HvCslF4的cDNA的克隆
[0268] 总RNA使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)从大麦栽培品种喜马拉雅的叶片和幼苗组织中分离。RNA样品用无RNA酶的DNA酶(Ambion)来处理,然后cDNA合成。五微克RNA制品被用来使用10pmol RoRidT17引物和Superscript III逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的说明
书在20μl反应中在50℃一小时制备cDNA。相应于HvCslF4的全长cDNA使用引物SJ253和
SJ254以及Advantage 2Taq DNA聚合酶混合物(Clontech目录号639201)根据制造商的说明书从叶片cDNA来扩增。扩增反应使用绿缓冲液(green buffer)与在94℃2min的初始循环,随后是94℃持续20秒、58℃持续20秒和68℃3min的30个循环。该扩增将编码十一个氨基酸T7表位标签的核苷酸序列在相同阅读框中添加在HvCslF4蛋白的N-末端。将cDNA产物克隆进pCR2.1-TOPO载体并测序。基因的3’末端中的测序错误通过替代来自另一个克隆在相同方向和载体中的HvCslF4 3’RACE构建体的SpeI-ClaI片段来校正。
[0269] 编码HvCslF6的cDNA的克隆
[0270] 两个各自包含来自相应于HvCslF6基因的cDNA的全长蛋白编码区的核酸片段用(i)引物SJ116和SJ77,或(ii)引物SJ277和SJ77来扩增。5’引物SJ277包括编码T7表位标签(如以上)的核苷酸序列,同时3’引物(SJ77)特异于3’非翻译区。第二扩增因此包含T7表位标签序列,而第一扩增不包含。模板核酸是由从栽培品种喜马拉雅(cv.Himalaya)(如以上)的大麦植物获得的RNA制备的大麦叶片cDNA。扩增根据制造商的说明书使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,目录号F-530S)与GC缓冲液和3%DMSO。扩增中的循环条件是:
98℃持续30秒,随后是98℃持续7秒、在63℃15秒和72℃持续1min的30个循环,随后是在72℃延伸5min。GC缓冲液和DMSO的使用对扩增全长克隆区必不可少,由于如果没有PCR条件的这一优化,所有获得的克隆将具有在编码区的5’末端的缺失。这可能是由Taq聚合酶跳过由大麦CslF6编码区的5’末端附近的GC富集区形成的发卡结构引起的。大约3kb PCR产物使用Illustra(GE Healthcare)试剂盒进行凝胶纯化并被插入进pCRBluntII TOPO克隆载体
(Invitrogen)中并测序。一个名为HvCslF6_277-77_23的克隆包含完整的开放阅读框。
[0271] 编码HvCslF7的基因组区的克隆
[0272] 包含HvCslF7基因的蛋白编码区的全长克隆(基因组克隆)用引物SJ112和SJ111从大麦栽培品种喜马拉雅来扩增。扩增根据制造商的说明书使用Phusion DNA聚合酶与HF缓冲液。PCR反应使用在98℃30秒的初始变性条件,随后是98℃持续7秒、57℃持续15秒和72℃持续2min的35个循环。扩增的片段根据Invitrogen手册用HotStarTaq(Qiagen)加dA尾,并克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。克隆被命名为HvCslF7g_112-111_1。
[0273] 编码HvCslF9的基因组区的克隆
[0274] 包含HvCslF9基因的蛋白编码区的全长克隆(基因组克隆)还用引物SJ30和SJ99从大麦栽培品种喜马拉雅来扩增。扩增根据制造商的说明书使用Phusion聚合酶与HF缓冲液。
PCR反应使用在98℃30秒的初始变性条件,随后是98℃持续7秒、56.5℃持续15秒和72℃持续2min的32个循环。扩增的片段根据Invitrogen手册用HotStarTaq(Qiagen)加dA尾,并克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。克隆被命名为HvCslF9g_30-99_2。
[0275] 小麦中全长编码区的表达
[0276] 以上描述的全长HvCslF基因如在实施例7中详细所述被表达在小麦胚乳中。
[0277] 用于在本氏烟叶片中表达的全长cDNA的分离
[0278] 全长CslF和CslH编码序列通过使用BDTaq或Phusion DNA聚合酶用如在表7中详细说明的引物从大麦、小麦和燕麦幼苗或4DPA胚乳cDNA来扩增。将扩增的DNA片段插入进TOPO载体、测序并然后如下面所述插入进植物表达载体。全长CslF6编码序列的克隆和功能分析在实施例2、9和10中被描述。
[0279] 通过在本氏烟叶片中瞬时表达评估编码大麦CslF蛋白的序列的功能
[0280] 大麦、小麦和燕麦的CslF和CslH编码区的功能通过在本氏烟叶片中瞬时表达35S驱动的构建体并分析来自叶片的细胞壁级分中的BG含量进行初始评估。简言之,将全长
CslF或CslH蛋白编码区从TOPO载体切离,并连接在二元表达载体pORE0235S中的CaMV 35S启动子和nos3’聚腺苷酸化/终止子区之间,所述二元表达载体pORE0235S是具有在多衔接子的5’末端的SfoI位点上插入的CaMV 35S启动子的pORE02的衍生物(Wood等,2009)。此类质粒的实例是pSJ38。
[0281] 将二元载体构建体电穿孔进根癌农杆菌菌株AGL1中,并且转化的菌落在包含100mg/L卡那霉素和5mg/L利福平的培养基上来选择。在本氏烟叶片中的瞬时表达基本上如在Wood等,(2009)中所述来进行。农杆菌培养物以0.4的光密度(A600)来使用。将它们与包含用于表达P19病毒沉默抑制子的T-DNA的农杆菌菌株pGV3101混合,P19病毒沉默抑制子被包括以在将T-DNA瞬时引入进叶片组织之后减少小RNA-诱导的基因沉默并从而增加转基因的表达水平和持续性。每个基因在CaMV 35S启动子的控制下。农杆菌细胞的混合物渗入进生长在24℃在16/8光暗循环中的五周龄本氏烟叶片的顶部三个完全扩展的叶片的下侧。将叶片在五天之后收获并冷冻干燥。
[0282] 接种的叶片样品的BG含量测定如下。首先,干燥的叶片样品被研磨成粉,且粗制细胞壁制品由20mg研磨的叶片材料来制成,通过将它在80℃在2ml管中在1.8ml 80%乙醇中搅拌加热30min。每种上清液在以10,000rpm离心5min之后去除,且成团的剩余物在80℃在相同体积80%乙醇中再提取持续10min。在离心之后,团块在室温在50%乙醇中洗涤10min,在20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中洗涤最后5min。将团块重悬于0.5ml相同的缓冲液,且材料通过在90℃搅拌加热30min来溶解。将样品冷却至50℃,且BG用Megazyme试剂盒来测定。简言之,样品与20μl(1U)地衣聚糖酶(Megazyme)孵育2小时以消化BG,以10,000rpm离心5min,并且将样品取出,用于通过与β-葡糖苷酶进一步消化进行BG测定。释放的葡萄糖针对如在Megazyme试剂盒方案中描述的葡萄糖标准进行分光光度法定量。
[0283] 双子叶植物通常不制造BG,因此BG在本氏烟叶片中的存在还通过FACE检测地衣聚糖酶消化中释放的低聚糖来测定(O'Shea等,1998)。地衣聚糖酶仅在(1,3)-β-D-糖苷键后的(1,4)-β-D-糖苷键上切割,从BG释放主要DP3和DP4(G4G3G和G4G4G3G)的聚合作用程度(DP)的低聚糖(Lazaridou和Biliaderis,2007)。为确定通过地衣聚糖酶消化释放的DP3和DP4低聚糖的比例,以及由此DP3:DP4的比,将100μl如在先前段落描述制备的但没有β-葡糖苷酶消化的样品在Speedivac中干燥,且每个样品中的低聚糖通过与8-氨基-1,3,6-芘三磺酸(APTS)还原胺化被荧光标记。标记的产物然后通过如O’Shea等,(1998)描述的荧光团-辅助的-毛细管电泳(FACE)与激光感生荧光检测来分离。该方法的优势是,每个低聚糖具有附连的单荧光团,且来自检测器的信号响应因此独立于低聚糖长度,不像用脉冲安培检测器的HPAEC方法,在HPAEC方法中每个低聚糖具有取决于长度的不同的响应因数。通过该方法,低聚糖容易被定量。
[0284] 在几个独立的实验中,编码大麦CslF6蛋白的构建体指导如通过Megazyme测定测量的相当大量的BG的合成(表8和9)。相比之下,当引入用于表达除了CslF6以外的任何谷物CslF多肽的构建体时,BG未被检测到。对照叶片在Megazyme测定中始终显示零水平BG,且在地衣聚糖酶消化或FACE分析之后没有BG来源的低聚糖(即DP3和DP4)可被检测到。相比之
下,非常少量的DP3和DP4低聚糖从本氏烟叶片中大麦CslH编码序列的表达被检测到,但这低于通过Megazyme测定检测的限值。为检测这些低聚糖,还需要在石墨化碳SPE暗盒上浓缩地衣聚糖酶消化,然后荧光团标记和FACE分析。
[0285] 实施例7.在发育中的胚乳中过表达大麦CslF基因的转基因小麦植物的产生。
[0286] HvCslF9载体构建
[0287] 在用DNA聚合酶I-Klenow片段处理BamHI位点之后,将来自pCR2.1TOPO载体的HvCslF9的全长编码区作为EcoRV-KpnI片段插入进pZLBx17CasNK的BamHI-KpnI位点。所得的质粒被命名为pSJ2。该引入的EcoRI位点在被用于进一步克隆的Bx17启动子和nos3’末端之间。pSJ2的EcoRI HvCslF9片段被切离,且该载体被再连接,以创造pSJ5。该表达载体从而具有包含位于多克隆位点(MCS)侧翼的高分子量麦谷蛋白Bx17启动子和胭脂碱合酶聚腺苷酸化区/终止子(nos3’)的1.9kb片段,因此提供用于在发育中的小麦胚乳中表达任何蛋白编码区的调控区。MCS具有BamHI、SmaI、KpnI、SacI和AflII位点。Bx17启动子被优先表达,并赋予在谷物诸如小麦的发育中的胚乳组织中高水平表达(Reddy&Appels 1993)。表达盒两侧是XbaI、HindIII和NotI限制性位点,因此整个盒可被切离并插入进其他载体。
[0288] HvCslF6载体构建
[0289] 包含在N-末端上的T7表位标签的全长大麦HvCslF6编码区从pCRBluntII TOPO载体切离作为EcoRI片段并插入进质粒pSJ5的EcoRI位点。具有T7-HvCslF6编码区的所得的质粒被命名为pSJ33。
[0290] HvCslF4-T7载体构建
[0291] 带有N-末端T7标签的编码HvCslF4的DNA区从pCR2.1TOPO载体被切离作为AflII片段,并被插入进pSJ5的相同位点,以创造pSJ11。
[0292] HvCslF7载体构建
[0293] HvCslF7的全长编码区从pCR2.1TOPO载体被切离作为EcoRI片段并被克隆进pSJ2的EcoRI位点,以创造pSJ3。
[0294] 每个编码的多肽的长度如在表10中详细说明。
[0295] 过表达HvCslF4、F6、F7和F9的转基因小麦植物的产生
[0296] 用于表达大麦CslF蛋白的构建体的每个被用来如以上对HvCslH构建体所述的使用基因枪方法(Pellegrineschi等2002)用50mg/L G418作为选择试剂产生栽培品种Bob 
White 26的转化的小麦植物。例如,HvCslF6表达载体pSJ33和具有驱动NPTII可选择标志物的表达的CaMV 35S启动子的第二质粒(pCMSTSL2neo)以等摩尔量混合并被共轰击进未成熟TM
的小麦胚。对再生的植物通过如下筛选转基因的存在:使用RedExtract-N-Amp 试剂盒
(Sigma)从幼小叶片组织提取DNA并使用基因特异性和载体特异性引物对针对DNA制品进行PCR反应,随后在琼脂糖凝胶上电泳产物。在凝胶上以下尺寸大小的DNA片段的出现表明转基因在植物中的存在:
[0297]
[0298] 实施例8.包含HvCslF基因的转基因小麦植物的分析
[0299] HvCslF转基因在小麦中通过实时PCR的表达分析
[0300] 为了测量HvCslF转基因在转化的小麦系中的表达水平,总RNA从来自每个植物的开花后大约15天(DPA)收集的三个发育中的籽粒来分离。RNA制品被DNA酶处理,以去除任何污染DNA,且RNA样品用Superscript III根据制造商的说明书(Invitrogen)进行逆转录。
PCR反应使用Platinum Taq DNA聚合酶来进行。cDNA被稀释,并以相当于每微升1ng原始RNA的水平在PCR反应中被使用。定量实时PCR在Rotorgene6000机器上对一式三份样品使用
Platinum Taq、SybrGreen和用于HvCslF6转基因的引物SJ242和SJ77(表1)以及用于内源α-微管蛋白参考基因(登录号Y0840)的HvTUBF的HvTUBR引物以及60℃的退火温度来进行。编码HvCslF6的基因的表达水平使用机器软件来计算并与相同样品中的α-微管蛋白基因的表达水平进行比较。使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen目录号10966-034)根据制造商的说明书循环条件是在95℃变性15秒,随后是94℃持续20秒、60℃持续20秒和72℃持续30秒的45个循环。
[0301] 在这些PCR反应中使用的3’引物(SJ77)对HvCslF6转基因是特异性的,由于它相应于转基因的3’非翻译区中的在小麦和大麦之间不是保守的区,并因此不与内源小麦CslF6基因或转录本退火。因此,在实时PCR中生成的任何扩增产物,并因此输出信号对转基因是特异的。
[0302] 分别用HvCslF9、HvCslF4T7和HvCslF7构建体转化的十五个、五个和四个PCR阳性T0小麦植物被获得。HvCslF9植物用引物对SJ97和SJ93的实时PCR证明了,它们中的五个以高水平(PCR阴性植物的2,000至10,000倍)在大约15DPA时发育中的胚乳中表达HvCslF9转基因。该表达水平在T2代中是稳定的,但在T3代的纯合子植物已使转基因沉默,且表达在背景水平。与对照或PCR阴性系相比,来自任何世代的单籽粒的BG含量的分析未显示任何增加。类似地,来自HvCslF4T7和HvCslF7PCR阳性系的籽粒的BG含量未显示与对照不同,且这些系不被任何进一步研究,转基因的表达水平也不被确定。
[0303] 在籽粒中表达HvCslF6的小麦植物的生成
[0304] 在pSJ33中具有在N-末端的T7表位标签的全长大麦HvCslF6编码区(HvCslF6_277-77_23)被用来使用基因枪方法转化Bob White 26小麦植物。HvCslF6表达载体pSJ33和具有驱动NPTII可选择标志物的表达的CaMV35S启动子的第二质粒(pCMSTSL2neo)以等摩尔量混合并被共轰击进未成熟的小麦胚。使用幼小叶子组织和RedExtractnAmpTM试剂盒(Sigma)以及引物SJ242和nosR对转基因植物筛选转基因的存在。五个植物通过PCR被证实是关于编码HvCslF6转基因和NPTII基因转基因的,并与来自转化过程的PCR阴性对照植物一起生长在温室中至成熟。互补DNA由在开花后大约15天(DPA)取样的汇集的T1籽粒制成,且转基因的表达通过实时PCR来监测,并与β-微管蛋白的水平进行比较。内源小麦CslF6基因以β-微管蛋白的约0.005水平表达,且初级转化体的三个显示在微管蛋白的1.52、0.92和0.22水平的HvCslF6mRNA的显著增加水平(分别为系F6-1、F6-6和F6-21)。
[0305] T1小麦籽粒中BG含量的分析如实施例1中所述来确定,并被表示为来自该籽粒的碾磨的全籽粒面粉的重量百分比(w/w)。该1%(w/w)相当于每克材料10mg BG。
[0306] 单成熟T1籽粒的BG含量显示,PCR阴性对照(即相当于野生型)且系F6-21具有约0.9%(w/w)的BG水平,而系F6-6具有多达约1.7%的增加的水平。此外,来自系F6-1的七个籽粒中的六个具有多于3%BG,最大多达约4.1%。
[0307] 使来自系F6-1、F6-6和F6-21的总计24个T1籽粒发芽,并通过PCR测试HvCslF6转基因的存在,且如以前生长在温室中。在T2籽粒的中成熟期的转基因表达监测显示,系F6-21不再表达HvCslF6基因,而系F6-6显示以相对于微管蛋白的0.12倍轻微降低的表达。来自系F6-1的大部分籽粒具有在相对于微管蛋白的约0.2-1.39倍的高水平HvCslF6表达,尽管一些系(例如,F6-1C1、F6-1D3和F6-1K2)显示低得多水平的HvCslF6表达(图6,括号中的数字)。注意到转基因在这些系中仍分离。F6-1和F6-6两者显示大约3:1分离比,且当仅三个籽粒被汇集以制备cDNA时,表达水平仅是纯合子状态的表达水平的近似值。来自这些植物的成熟单T2籽粒中的BG水平的分析确实显示,大部分系仍分离,其中一些籽粒具有接近于PCR阴性系F6-1D1和F6-1D2的BG含量(图6)。通常,具有高水平HvCslF6表达的那些系具有最高水平的BG;F6-6系通常具有比F6-1系更低的表达,且这些具有显著较高的BG水平,其中许多具有多于4%BG,且对于系F6-1K5所有五个籽粒具有在4.4%和最大5.5%之间的BG。
[0308] 为了获得表达转基因的纯合系,使来自十二个F6-1和一个F6-6T1植物的每个的5个和10个之间的T2籽粒发芽,PCR测试并生长在温室中。在籽粒发育中期的转基因表达和成熟籽粒的BG含量被测定。HvCslF6转基因的表达表现为是稳定的,由于大部分系继续显示类似于或高于内源微管蛋白基因的表达水平的高水平的表达。这些T2植物的大部分的T3籽粒中的BG含量在3%和5%之间,其中偶然籽粒显示大于5%的BG(图7)。这些系的大部分表现为仍然分离,由于一些籽粒具有类似于四个阴性PCR系的BG水平。然而,系F6-1G6.2、F6-
1G6.8和F6-1D4.4可能是纯合子,由于所有籽粒具有高的BG(图7)。F6-1系再次具有比F6-6系更高的mRNA水平和BG水平。
[0309] 籽粒的表型外观在以高水平表达HvCslF6的一些系中被改变
[0310] 原始T0植物具有相对不良的种子成形(seed set)和减少的籽粒大小,由于该植物在一年中温室中最热的时候开花,尽管这在显示编码HvCslF6的转基因的表达的那些系中是最明显的。来自植物F6-1的成熟籽粒中的许多展现出减少的尺寸和褶皱的外观。这对于植物F6-1是最明显的,并还在后续世代的许多但非全部高BG后代中被观察到。T2植物F6-1D4.4和F6-1G6.8的所有T3籽粒具有高BG含量与褶皱和皱缩的外观两者,而仍分离为低和高BG的系F6-1G6.4形态上表现正常,具有野生型水平BG的来自阴性分离系F6-1K3.2的籽粒同样地。F6-6籽粒及其后代籽粒在形态上不是褶皱或皱缩的,且这些籽粒中的BG水平不与F6-1系中的一样高。阴性分离子的成熟籽粒都具有正常的外观,表明皱缩的表型与F6-1系中的HvCslF6转基因连锁。
[0311] BG结构在高BG HvCslF6系中被改变
[0312] BG的精细结构通过地衣聚糖酶消化以及荧光标记低聚糖随后通过毛细管电泳分离来检查。小麦面粉BG的地衣聚糖酶消化释放主要是DP3和DP4(G4G3G和G4G4G3G)的低聚糖,分别带有少量的多达DP9的较长的低聚糖。计算DP3和DP4峰值的摩尔比表明,来自野生型小麦的胚乳面粉的BG具有轻微低于来自Megazyme的大麦标准面粉的DP3/DP4比的2.5的DP3/
DP4比,同时如期望的,来自燕麦的全麦面粉具有1.8的较低的比。在转基因HvCslF6小麦T2单籽粒面粉中,对照阴性分离子具有与野生型相同的在2.5和3之间的比。然而,在具有增加的BG水平的那些系中,该比在一些情况下降低至少于2(表9)。来自纯合子HvCslF6小麦T3系的汇集(十个籽粒)面粉的分析清楚地显示,高BG系具有低至1.67的低DP3/DP4比(表9),其甚至低于燕麦BG的DP3/DP4比。这与阴性分离子中平均2.49的DP3/DP4比进行比较,并显示,BG结构与高BG系中显著不同。
[0313] 较少的皱缩与增加的BG水平的籽粒的选择
[0314] 如前面指出的,几个具有高BG含量的纯合子HvCslF6系的籽粒是皱缩的和形态上异常的。由于这些都源自单转化的系F6-1,进一步转化实验用质粒pSJ33开始进行以确定是否可能获得具有提高的BG水平的非皱缩、正常的籽粒。二十九个新的T0HvCslF6植物被生成,其中的十四个被证明具有增加的BG含量的单独的T1籽粒。尽管大部分高BG系具有低于平均的籽粒重量,获得具有高的平均籽粒重量的一些高BG系例如系F6-87、F6-89和F6-106(图8)是可能的。单籽粒的最大BG含量是来自系F6-90的5.9%、来自F6-103的5.7%以及来自系F6-87的4.7%。这些结果表明,产生包含高水平的BG和具有非皱缩形态学的小麦籽粒是可能的。
[0315] 实施例9.从其他物种克隆CslF6基因
[0316] 小麦CslF6
[0317] 编码部分长度的与大麦CslF6具有类似性的多肽的两个序列在可用数据库中被鉴定,即,表现为包含小麦CslF6的5’末端的EST TC275889和表现为包含小麦CslF6的3’末端的EST TC250370。为分离全长小麦序列,总RNA使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)从小麦栽培品种魏斯顿贝的植物的幼苗组织来分离。RNA用无RNA酶的DNA酶(Ambion)来处理,然后cDNA合成。3’RACE文库使用Clontech SMART cDNA试剂盒根据制造商的说明书从RNA制备。cDNA然后用三甲基甘氨酸-EDTA被稀释至100微升并储存在4℃。随后的PCR反应用Advantage 2聚合酶(Clontech)根据制造商的说明书使用通用引物混合物(UPM)和基因特异性引物SJ113
来进行。温度循环条件是:在94℃变性1min,然后94℃持续30秒、在55℃30秒和72℃持续
2min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。将所得的PCR反应混合物稀释100倍,并用作巢式PCR中的模板,使用巢式通用引物(NUP)和第二内部基因特异性引物(SJ123),循环条件:在
94℃变性1min,然后94℃持续30秒、在58℃30秒和72℃持续90秒的30个循环,随后是在72℃
5min延伸。
[0318] 几个约800bp的3’RACE扩增产物使用Illustra(GE Healthcare)试剂盒进行凝胶纯化,并被克隆进pCR2.1TOPO T/A克隆载体并被测序。三个不同序列类型被获得。这些被推定为相应于来自三个小麦基因组(A、B和D)的每个的转录本。反义引物(SJ156)在3’非翻译区中被设计,其将匹配所有三个类型并与5’引物(SJ162)一起用来扩增包含相应于三个小麦基因组的每个的转录本的全长蛋白编码区的cDNA。
[0319] 五微克幼苗RNA被用来使用10pmol RoRidT17引物和Superscript III逆转录酶(Invitrogen)根据制造商的说明书在20微升反应中在50℃一小时制备cDNA。cDNA然后用三甲基甘氨酸EDTA被稀释至100微升并储存在4℃。全长cDNA使用来自Finnzymes(现购自NEB)的Phusion非常高保真度度校对Taq聚合酶从第一链幼苗cDNA来扩增。一微升稀释的cDNA根据制造商的说明书用引物SJ162和SJ156或SJ274和SJ156或SJ277和SJ156在20微升具有GC
缓冲液和3%(w/v)DMSO的PCR反应中来扩增。循环条件是:98℃持续30秒,随后是98℃持续7秒、在63℃15秒和72℃持续2min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。大约3kb大小的PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离,凝胶纯化并克隆进pCRBluntII II TOPO克隆载体并测序。三个克隆名为TaCslF6_277-156_23、TaCslF6_277-325_18和TaCslF6_274-156_10,每个包含编码小麦CslF6多肽的完整的开发阅读框,并相应于来自三个小麦基因组的CslF6基
因。它们的核苷酸序列在SEQ ID NO:12-14给出,且氨基酸序列在SEQ ID NO:18-20中给出。
它们在本氏烟和转基因植物中被用于功能表达研究(下文)。
[0320] 燕麦CslF6
[0321] 燕麦CslF基因的序列在公开的可用数据库中未被鉴定,因此该基因使用如下保守区的引物来克隆。这使用5’和3’RACE以及常规PCR。基于CslF6将表达于燕麦幼苗的叶片组织的可能性,总RNA使用RNAeasy柱(Qiagen)根据制造商的说明书从12天龄燕麦幼苗(栽培品种Matika)的叶尖的2cm区以及整个6-7天龄的整个幼苗来分离。该制品不进行DNA酶处理。五微克每种RNA制品被用来使用10pmol RoRidT17引物和Superscript III逆转录酶在
20μl反应中制备cDNA。这包括将引物与RNA在70℃退火10min,在冰上冷却,然后添加剩余试剂并在50℃孵育一个小时。该反应通过在70℃加热10min来终止,并且RNA模板用1.5个单位RNA酶H在室温降解20min。cDNA在70℃再次加热10min,并然后用TE pH 8稀释至100μl并储存在4℃。
[0322] PCR用GoTaq聚合酶(Promega)使用一微升燕麦幼苗cDNA在20μl PCR反应(1x无色缓冲液、5pmol每种引物、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl2)中以及以下循环条件来进行:在95℃变性2min,然后95℃持续30秒、在58℃30秒和72℃持续2min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。引物对SJ17和SJ37扩增几个如在1.0%TBE琼脂糖凝胶电泳分析的大约一kb大小的片
段。这些片段被凝胶纯化并克隆进pCRII TOPO T/A克隆载体并测序。一种PCR产物具有
983bp与小麦CslF6具有同源性的核苷酸序列。从同源性的区,序列跨越燕麦CslF6基因的第二和第三外显子。
[0323] 该序列使用5’和3’RACE来延伸以克隆全长燕麦CslF6cDNA。5’和3’RACE cDNA文库使用Clontech SMART cDNA试剂盒根据制造商的说明书由来自叶尖和幼苗的RNA的混合物在十微升反应中来制成。cDNA然后用三甲基甘氨酸-EDTA被稀释至100μl并储存在4℃。随后的PCR反应用Advantage 2聚合酶(Clontech)根据制造商的说明书使用通用引物混合物
(UPM)和基因特异性引物来进行。循环条件是:在95℃变性2min,然后94℃持续30秒、在60℃
30秒和72℃持续90秒的35个循环,随后是在72℃10min延伸。将所得的PCR反应混合物稀释
100倍,并用作巢式PCR中的模板,用巢式通用引物(NUP)和第二内部基因特异性引物,循环条件:在95℃变性10min,然后94℃持续25秒、在57℃30秒和72℃持续2min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。
[0324] 来自大麦、小麦和水稻的全长CslF6cDNA的比对鉴定了是保守的几个区,且有义和反义引物、一些简并引物针对这些区来设计。对于3’RACE,用引物对SJ113-UPM的PCR和用SJ123-NUP的巢式PCR使扩增约1000bp长度的燕麦CslF6 3’RACE产物成为可能。对于5’RACE,以引物对SJ37-UPM使用相同PCR条件和以SJ19-NUP使用巢式PCR。这使扩增约600bp长度的燕麦CslF6 5’RACE产物成为可能。该RACE产物不包含燕麦基因的5’末端,因此另外轮的5’RACE用针对SJ19-NUP扩增的片段的特别设计的新的反义引物来进行。用引物SJ265-UPM和SJ270-NUP的巢式PCR将序列延伸至在全长基因的预测的ATG甲硫氨酸起始的大约
30bp内。另外的反义引物SJ272更接近5’末端来设计,尽管重复尝试,但这未能任何更进一步延伸序列。注意的是,燕麦CslF6基因的5’区是GC非常丰富的,且这被认为可能产生可能干扰Taq聚合酶通过该区的延伸的显著二级结构。5’RACE程序被重复,但包含3%DMSO以尝试和减少GC丰富的二级结构的效应。另外,初始PCR方案通过在高的退火/延伸温度的两步PCR来修改。PCR用引物对SJ265-UPM和以下的循环条件来进行:在95℃变性2min,在94℃持续25秒和在72℃2min的七个循环,然后94℃持续25秒和67℃持续2min的32个循环,随后是在67℃7min延伸。巢式PCR用引物对SJ272-NUP与3%DMSO和以下的循环条件来进行:在94℃变性1min,然后94℃持续25秒、在60℃25秒和72℃1min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。克隆的PCR产物的测序表明,这些克隆包含燕麦CslF6基因的5’末端,由于终止密码子存在于预测的起始ATG甲硫氨酸密码子的上游。最长的克隆具有多于370bp的5’非翻译前导序列。克隆的PCR产物包含来自三个燕麦基因组的CslF6基因的序列。在鉴定全长燕麦CslF6基因之后立即将部分长度燕麦CslF6cDNA序列储存在Genbank中。该序列(登录号ACX85725)编码891个氨基酸的多肽,并缺失来自该蛋白的N-末端的53个氨基酸,进一步表明在分离全长燕麦CslF6基因中的难度,由于该基因的5’末端的非常富含GC性质,在多于300bp的区内是
73-75%GC。
[0325] 基于该5’序列,新引物针对起始甲硫氨酸密码子周围的序列来设计,即SJ116和SJ277,该后者引物包含紧接ATG上游的编码11个氨基酸T7表位标签MASMTGGQQMG的另外的33个碱基。这些与在3’非翻译区中的引物(SJ243)一起用来扩增大约3kb包含943个或944个氨基酸的全长燕麦CslF6开放阅读框的cDNA。燕麦幼苗cDNA使用Advantage 2聚合酶
(Clontech)根据制造商的说明书用3%DMSO和以下的循环条件来进行扩增:在94℃变性
2min,然后94℃持续25秒、在58℃25秒和72℃持续3min的35个循环,随后是在72℃5min延伸。大约3kb大小的PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离,凝胶纯化并克隆进
pCR2.1TOPO T/A克隆载体并测序。几个全长cDNA表现为包含PCR引入的单碱基改变。因此,另外的全长cDNA使用Phusion Taq聚合酶从第一链幼苗cDNA来扩增。一微升稀释的幼苗
cDNA用引物SJ277和SJ243在20μl具有HF缓冲液和3%(w/v)DMSO的PCR反应中根据制造商的说明书用以下循环条件来进行扩增:98℃持续30秒,随后是98℃持续7秒、在63℃15秒和72℃持续1min的30个循环,随后是在72℃5min延伸。DMSO的包含改进反应产物的产量和特异性两者。约3kb大小的PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离、凝胶纯化并克隆进
pCRBluntII II TOPO克隆载体并测序。两个测序的克隆被命名为AsCslF6_277-243_28和
AsCslF6_277-243_29,每个包含完整的开放阅读框,并随后通过在本氏烟叶片中瞬时表达来示出编码功能Csl多肽(见下文)。
[0326] 所有克隆的燕麦CslF6片段的序列在Bioedit软件程序中被手动比对。相应于六倍体燕麦基因组的三个基因组变体的三个共有cDNA序列被产生,且这些被命名为AsCslF6-1、AsCslF6-2和AsCslF6-3。每个cDNA分别具有编码944个、943个和944个氨基酸的多肽的长开放阅读框。AsCslF6-2蛋白序列相对于其他两个具有距离在信号肽结构域内的N-末端大约20个氨基酸的一个氨基酸的缺失。
[0327] AsCslF6的全长基因组克隆分离如下。基因组DNA使用CTAB方法(Murray和Thompson,1980)从幼苗组织来分离。大约100ng稀释的基因组DNA被用作模板DNA,在20μl具有Phusion聚合酶、引物SJ274和SJ243、HF缓冲液和3%(w/v)DMSO的扩增反应中根据制造商的说明书用以下循环条件:98℃持续30秒,随后是98℃持续7秒、在63℃15秒和72℃2min的
35个循环,随后是在72℃5min延伸。约5.2kb大小的最大PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离、凝胶纯化并克隆进pCRBluntII II TOPO克隆载体并测序。被命名为AsCslF6_274-
243_11的一个克隆被测序;它包含5244bp的序列。与cDNA序列的比较显示,在该基因中存在两个内含子,第一个为1627个核苷酸,且第二个为691个核苷酸。外显子的核苷酸序列与来自AsCslF6-2的cDNA的核苷酸序列相同。燕麦基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列在SEQ ID NO:51-57中给出。
[0328] 水稻(水稻(Oryzae sativa))
[0329] RNA使用Nucleospin RNA植物提取试剂盒根据制造商的说明书(Macherey-Nagel)从大约100mg来自水稻品种日本晴(Oryzae sativa cv.Nipponbare)的一周龄幼苗的组织
来分离。未经DNA酶处理的五微克RNA使用5pmol RoRidT17引物和水稻基因特异性3’引物SJ321用Superscript III逆转录酶在55℃在20μl反应中逆转录一小时。在70℃热灭活
15min之后,RNA链通过用1.5个单位的RNA酶H在37℃消化15分钟来去除。该反应用TE稀释至
100μl。一微升该稀释的幼苗cDNA用Phusion聚合酶、引物SJ69和SJ324与HF缓冲液和7%(w/v)DMSO与以下循环条件来扩增:98℃持续30秒,随后是98℃持续10秒、在62℃15秒和72℃持续90秒的35个循环,随后是在72℃5min延伸。由于甚至用3%DMSO也不形成全长PCR产物,至少5%DMSO的包含对特异性扩增必不可少。最佳扩增以7%和10%(w/v)之间的DMSO浓度发生。约3kb大小的PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离、凝胶纯化并克隆进pCRBluntII II TOPO克隆载体并测序。被命名为OsCslF6_69-324_15的一个cDNA克隆被测序,它的核苷酸序列(SEQ ID No:60)准确相应于公开的水稻基因组中的OsCslF6基因的序列,且编码的多肽具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列。
[0330] 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)
[0331] RNA使用Nucleospin RNA植物提取试剂盒从大约100mg来自二穗短柄草BD21的一周龄幼苗的组织来分离。cDNA如以上对于水稻所述的来制备。两微升幼苗cDNA使用Phusion Hot Start聚合酶在PCR中与引物SJ116和SJ357或SJ277和SJ357一起被使用。该PCR反应包含7%(w/v)DMSO与以下循环条件:98℃持续30秒,随后是98℃持续7秒、在62℃15秒和72℃持续90秒的36个循环,随后是在72℃5min延伸。约3kb大小的PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶上被分离、凝胶纯化并克隆进pCRBluntII II TOPO克隆载体并测序。被命名为BdCslF6_
116-357_1BdCslF6_277-357_10的两个克隆被测序。核苷酸序列准确相应于公开的基因组序列中的BdCslF6基因的序列。一个核苷酸序列被给出为SEQ ID NO:58,且多肽氨基酸序列为SEQ ID NO:59。
[0332] 实施例10.通过在本氏烟叶片中瞬时表达评估编码小麦、燕麦、水稻和短柄草属CslF6蛋白的序列的功能
[0333] 来自小麦、燕麦、水稻和短柄草属的CslF6编码区的功能通过在本氏烟叶片中瞬时表达35S驱动的构建体并分析来自叶片的细胞壁级分中的BG含量进行初始评估。所用的方法如在实施例1和6中所述的。
[0334] 制备和使用的构建体被列在表10中。在瞬时表达嵌合CslF6基因后,本氏烟叶片中BG的存在还通过地衣聚糖酶消化粗制的细胞壁制品和通过FACE检测释放的低聚糖来测定(O'Shea等,1998)。
[0335] 在几个独立的实验中,编码小麦、燕麦、水稻和短柄草属CslF6蛋白的构建体指导如通过Megazyme测定测量的显著量的BG的合成(表11和12)。这些嵌合基因还与大麦CslF6基因进行比较。
[0336] 产生的BG的量在实验之间有所不同,编码燕麦CslF6蛋白的基因产生最少量。在这些瞬时测定中产生的BG的量与相应籽粒中BG水平不良好相关,例如,水稻籽粒具有约0.02%的低内源水平,然而嵌合基因在BG合成是有效的,而短柄草属具有大约40%的相对高水平(Guillon等,2011),但该基因仅比其他基因在产生BG方面轻微更有效。因此,在瞬时测定中观察到的量(表12)可反映来自每个嵌合基因的信使RNA的转录和/或翻译的效率。然而,在质粒中克隆的燕麦CslF6序列的更进一步检查揭示了,这些PCR产物来自多于一个的燕麦基因组(pSJ79)或具有与共有序列相比的一个PCR错误(pSJ78,其将位置445上的氨基酸C改变为Y),且这可能对产生的BG的量有影响。
[0337] T7表位标签在小麦和短柄草属CslF6蛋白的N-末端上的添加对该蛋白的活性无明显影响。
[0338] 明显的是,来自每个物种的CslF6基因产生具有特定结构的BG,如由不同的DP3/DP4低聚糖比证明的。短柄草属CslF6产生具有最高DP3/DP4比(1.6-1.7)的BG,随后是小麦(1.5-1.6),然后是大麦(1.37),而燕麦和水稻两者产生具有约1.0的非常低的DP3/DP4比的BG。用来分析这些低聚糖的毛细管电泳系统是既非常灵敏又非常准确的(参见表12中的标准差),给出每个嵌合CslF6转基因产生具有独特DP3/DP4比的BG的高置信。
[0339] 在本氏烟叶片中产生的BG的DP3/DP4比还远低于在谷物籽粒中发现的天然BG的那些。通过FACE分析,大麦和小麦酶产生具有2.55的DP3/DP4比的BG,燕麦酶产生具有约1.9的显著更低比的BG,而短柄草属酶产生具有约8.0的高DP3/DP4比的BG。大量BG结构研究显示大麦、小麦和燕麦中1.7-3.8典型范围的DP3/DP4比(Lazaridou和Biliaderis,2007)。一些研究已表明DP3/DP4比在该范围之外,且这可受以下影响:分析的方法(例如HPLC、HPAEC或FACE)、摩尔比的计算、不同长度的低聚糖的检测响应中的差异,或全籽粒还是子级分(例如麸或白面粉)被使用以及在分析(水、碱温度等等)中使用的提取方法。
[0340] 本发明人认为,本氏烟叶片中从每种CslF6基因产生的BG的精细结构中的观察的大差异将相当地影响聚合物的物理性质,特别是粘度和溶解度。存在纤维三糖单元的连续串导致在聚合物链之间形成螺旋或连接区,导致聚集和不溶性的证据(Tosh等,2004)。燕麦籽粒BG比大麦籽粒BG在使用的提取条件(在80℃在80%乙醇中酶灭活一小时,随后在37℃在20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中提取2小时)下更可溶。分别大约50%和27%的野生型燕麦和大麦籽粒BG是可提取的,而很少(2-5%)的小麦籽粒BG或短柄草属籽粒BG在相同条件下是可溶的。在DP3/DP4比和BG溶解度之间存在相反关系,即最可溶的BG具有最低的DP3/DP4比。在由不同CslF6基因表达的本氏烟叶片中产生的BG的溶解度的量级与野生型籽粒BG中观察到的量级相同(图9)。短柄草属CslF6基因产生最少的可溶性BG且这具有最高的DP3/
DP4比(1.6),大麦和小麦CslF6基因具有中间溶解度和DP3/DP4比(1.4-1.5),而燕麦和水稻CslF6基因产生最暖水溶性BG且这些具有1.0的最低的DP3/DP4比。
[0341] 实施例11.通过过表达CslF6基因操作小麦籽粒中的BG水平和结构
[0342] 不同的CslF6多肽当被异源表达时可产生具有独特结构的BG的观察结果打开了通过过表达用于表达特定的选择的CslF6的嵌合基因操作转基因植物中的BG结构和量的机
会。
[0343] 在籽粒中表达编码燕麦AsCslF6的遗传构建体的小麦植物的生成
[0344] 带有在N-末端上的T7表位标签的编码燕麦CslF6的全长cDNA(AsCslF6_277-243_29)和全长燕麦基因组编码区(AsCslF6_274_243_11)从基于pCRBluntII的克隆EcoRI片段
被各自切离并插入在高分子量麦谷蛋白Bx17启动子的1.9kb片段和胭脂碱合酶(nos3’)聚腺苷酸化区/转录终止子之间以分别创造遗传构建体pSJ127和pSJ124。这些构建体被用来TM
使用基因枪方法转化Bob White 26植物的未成熟的胚。通过使用RedExtractnAmp 试剂盒(Sigma)从幼小叶片组织提取DNA和使用引物SJ242和nosR的PCR反应对转基因植物筛选转
基因的存在。
[0345] 二十七个再生的植物(T0植物)被证实是对于编码AsCslF6转基因的转基因的,并与来自转化过程的未转化的对照植物(F6-121)一起生长在温室中至成熟。互补DNA由来自每个植物的在开花后大约15天(DPA)取样的汇集的发育中的T1籽粒制成,且转基因在发育中的籽粒中的表达用引物SJ242和SJ243通过实时PCR来监测。每个转化的系中的转基因表达水平与内源微管蛋白基因的表达水平进行比较。十一个初级转化体显示AsCslF6转基因以从相对于微管蛋白基因表达水平约0.01倍多达至约1.9倍的程度表达的显著水平(表
13)。从来自转化体的单成熟籽粒获得的全麦面粉的BG含量的分析表明,大部分表达系在籽粒中具有增加的多达至约4.4%的BG水平。来自用包含燕麦基因组AsCslF6序列的pSJ124转化的一个植物显示转基因的表达和增加的BG水平(表13,最后行)。表达AsCslF6构建体的籽粒的籽粒重量还被测量,且一些高BG系(F6-124、F6-133和F6-139)具有等于或大于PCR阴性系F6-121的平均籽粒重量(图8)。这些单籽粒的最高BG含量来自系F6-142(4.4%)和系F6-
139(4.0%)。在T2籽粒中,AsCslF6系F6-122.8具有4.11%的平均BG含量与28mg的平均籽粒重量(表14)。在该实验中,未转化的对照籽粒(F6-121)中的(内源)BG的水平是0.7-1.4%。
[0346] 如期望的,T1籽粒表现为对于转基因和提高的BG含量的观察到的表型两者分离。即,T1籽粒是转基因的纯合子和杂合子的混合物或空分离子。
[0347] 在来自用AsCslF6构建体转化的两个植物的单种子中的BG的精细结构通过地衣聚糖酶消化以及荧光标记低聚糖随后通过毛细管电泳分离来检查。图10示出了观察到的DP3/DP4比。被命名为F6-142d的小麦种子具有类似于未转化的对照的正常BG水平(1.0%)和结构(2.5的DP3/DP4比)两者;它是空分离子。相比之下,来自F6-142的其他籽粒具有至少4%的BG含量。在那些籽粒中,DP3/DP4比显著降低了,低至约1.30。具有这样低DP3/DP4比的小麦BG在先前从未被报道过。
[0348] 来自两个AsCslF6植物(F6-122和F6-124)的种子被播种并且所得的植物生长在温室中。AsCslF6-PCR阳性系生长至成熟。来自几个后代植物的十个T2籽粒被汇集并且每个池被研磨成面粉。对于每个池,BG含量和DP3/DP4比被确定(表14)。所有池显示多达约4.11%的高BG含量和显著低于Megazyme试剂盒提供的野生型大麦对照面粉的约1.4至1.5的低
DP3/DP4比(表14)。这表明,高BG性状是稳定遗传的。
[0349] 实施例12.来自转基因小麦籽粒的BG的溶解度
[0350] 文献中描述了几个用于确定BG溶解度的方法,一些牵涉水提取,且一些以诸如包含碳酸钠或碱性液的其他水性溶剂。另外可使用提取的不同温度和时间,有或没有在高温在乙醇溶液中回流。不同的方法不都给出相同的溶解度值。因此,限定做出有意义的测量的溶解条件是重要的。用于确定在本发明人的实验中的籽粒样品的BG溶解度的方法如下。每个100mg面粉样品-在这种情况下是从来自每个系的汇集的籽粒球磨的全麦面粉-在螺帽管中在1.8ml 80%乙醇中在Eppendorf Thermomixer(或类似的)中在80℃以1000rpm震摇加热1小时。该步骤灭活否则可以分解聚合的细胞壁材料的任何内源酶,同时溶剂的乙醇性质防止任何聚合物被溶解和去除。然而,在该乙醇处理步骤中单糖和二糖和低聚糖将从面粉样品中去除。在以10,000g离心1min和倾析上清液后,将成团块的面粉重悬于1ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中并且悬液在37℃以1000rpm震摇孵育2小时以提取水溶性组分。将样品以10,000g离心1min并且上清液用移液管仔细地取出,并收集-该水性级分包含水溶性(水可提取)BG。将包含水不溶性BG级分的团块重悬于1ml相同缓冲液中。水溶性和水不溶性两种级分的等分试样使用以上描述的按比例缩小Megazyme测定进行BG含量测定。一式两份样品被测定。可溶性和不溶性BG含量被计算为面粉干重的百分比。
[0351] 在野生型大麦和燕麦籽粒中,BG含量的显著级分被报道为是水溶性的,而在小麦中,很少BG是可溶性的(Beresford和Stone,1983)。当无乙醇热灭活步骤地测量时,对于21种不同的品种,当在38℃水中溶解2小时时,与50%的大麦BG相比,80%的燕麦BG是可溶性的(Aman和Graham,1987)。当通过以上描述的本发明人的方法测量时,对于未转化的燕麦(栽培品种Mitika)和大麦BG,分别获得了50%和27%的水溶性水平。因此,Aman和Graham使用的方法过高估计了真实的水溶性BG水平,且本发明人的方法使用通过乙醇处理灭活内源酶避免了该过高估计。
[0352] 使用包括热灭活步骤的测定方法(实施例1),系H1-10B7.3的对照小麦的胚乳面粉中的约7%BG是水溶性的。类似低水平的水溶性BG在纯合子转基因HvCslH表达系H1-10B7.4、7.6和1.9的胚乳面粉中被发现,尽管作为比例,这代表胚乳面粉中在1%和3%之间的总BG。结论是,尽管BG含量在表达HvCslH构建体的转基因籽粒中显著增加,BG的DP3/DP4比以及水溶性BG的比例未增加。这个结论是显著的。
[0353] 在野生型小麦全籽粒面粉中,BG含量的少于约5%是水溶性的-考虑到小麦面粉的干重的约0.6%至约1%是BG,小麦面粉中水溶性BG的量是非常低的。此外,需要BG转化为葡萄糖的BG测定,包括从通过地衣聚糖酶来源的BG低聚糖的β-葡糖苷酶处理释放的葡萄糖减去背景葡萄糖,因此背景中的小变化可调和(compound)BG值在该非常低的水平的不确定度。
[0354] 表15示出了来自许多转化的和对照小麦籽粒的面粉的BG含量的溶解度百分比。对照籽粒F6-1K3.2具有0.91%的BG含量,其中约5%是可溶性的,类似于具有轻微较高但仍低的溶解度百分比的PCR阴性系F6-121的。来自这些籽粒的不溶性BG具有2.45的正常DP3/DP4比,同时可溶性BG具有大约2.15的较低比。来自纯合子转化系F6-1G6.1.8和F6-1K5.9的籽粒具有皱缩外观并具有大约4%的高BG含量。尽管不溶性和可溶性BG两者具有比对照更低的DP3/DP4比,来自这些系的BG的溶解度百分比与对照的类似(表15)。来自HvCslF6系F6-87的T1籽粒具有正常的外观和约3%的增加的BG含量与2.1的低DP3/DP4比。尽管DP3/DP4比与系F6-1K5.9类似,该系显示增加的达约10%的可溶性BG的百分比。这可通过该非皱缩籽粒中胚乳BG对麸BG的增加的比来解释,由于已知胚乳BG比麸BG是更可溶的(Izydorczyk和Dexter,2008)。相比之下,AsCslF6表达系展现出增加的达至少15%的可溶性BG的百分比,其中最佳系具有18.5%可溶性BG。在转基因籽粒的下一个世代,来自系F6-124.1和F6-
124.2的十个T2汇集的籽粒的碾磨的面粉具有大约3.8%的BG含量,其中多达20.55%是水溶性的。这些籽粒不是转基因的一致纯合子,因此BG含量的进一步增加被期望。具有该水平可溶性BG的小麦籽粒以前从未被报道。
[0355] 实施例13.通过过表达编码水稻OsCslF6和短柄草属BdCslF6的嵌合基因操作小麦籽粒中BG水平和结构
[0356] 由于水稻OsCslF6基因以低DP3/DP4比在本氏烟叶片中产生BG且短柄草属BdCslF6基因以约1.6的最高比产生BG,编码这些酶的嵌合基因被表达于小麦胚乳中以确定进一步操作BG水平或组分是否是可能的。全长OsCslF6基因(OsCslF6_69-324_15)和BdCslF6T7基因(BdCslF6_277-357_10)从pCRBluntII载体上被切离作为EcoRI片段并被插入在高分子量麦谷蛋白Bx17启动子的1.9kb片段和胭脂碱合酶终止子之间以分别创造质粒pSJ148和
pSJ149。启动子-CslF6编码区-nos终止子/聚腺苷酸化区作为表达盒然后作为NotI片段被克隆进农杆菌载体pVecDRB的NotI位点以分别创造质粒pSJ151和pSJ152。然后,这些构建体被用来通过农杆菌介导的方法转化小麦。
[0357] 转化的植物针对G418来选择且植物用引物SJ242和nosR通过PCR来筛选。BG含量和DP3/DP4比针对汇集的T1籽粒如在前述实施例中所述来确定且使显示增加的BG水平的植物生长以获得纯合子植物用于进一步扩大、籽粒组成分析及营养性状。用表达OsCslF6的构建体转化的汇集的T1籽粒在43个转化系的15个中显示增加的BG。一个系显示基于干重的3.32%BG(w/w),具有在范围1.66-1.75内的DP3/DP4比。在用表达BdCslF6T7的构建体转化的T1籽粒中,54个转化系中的42个显示增加的BG含量,其中一个系显示基于干重的4.9%BG(w/w)。
[0358] 实施例14.来自HvCslH T4籽粒和CslF6籽粒的胚乳面粉中膳食纤维水平的分析
[0359] 胚乳面粉的总的和可溶性的膳食纤维水平如在实施例1中所述通过具有稍作修改的Prosky AOAC官方方法991.43(Lee等,1992)来确定。该方法使用高温和热稳定淀粉水解酶和蛋白酶,以模拟煮熟的食物在人消化道中的消化。对照胚乳面粉的分析证实了白面粉具有低水平的可溶性和总膳食纤维,在干重的0.7%和2.4%(表6)。相比之下,且出乎意料地考虑到增加的BG的溶解度未改变,所有三个转基因HvCslH系(H1-10B7.4、7.6和1.9)显示胚乳面粉中可溶性和总膳食纤维两者的大的增加。来自系H1-10B1.9的籽粒的胚乳面粉显示多于2倍的增加,以1.8%可溶性和5.3%总膳食纤维。如在测定中测量的BG溶解度百分比和DF量中的差异可通过提取条件来解释,由于BG溶解度测定的第一步包括在80%乙醇溶液中加热面粉悬液以灭活内源酶,而膳食纤维测定没有此类灭活步骤。因此,内源水解酶可在DF测定中作用于细胞壁并释放更多的碳水化合物。纤维测定还测量了阿拉伯糖基木聚糖和其他纤维组分。鉴于HvCslF6籽粒的DF的增加,本发明人预期较高BG系的DF的水平的更大增加,特别是包含高水平可溶性BG的那些系中可溶性DF的。
[0360] 源自转化系F6-1(实施例8)的后代植物在温室中繁殖以提供T4代的籽粒。这些包括是表达HvCslF6T7(包含在N-末端上的T7表位标签)的转基因的纯合子的系和是转基因的阴性分离子并因此与野生型相同的系。系F6-1G和F6-1K以及它们的子系源自相同初始转化的植株F6-1的不同的穗。系F6-1G6.1.8的汇集的籽粒具有29.7mg的平均籽粒重量,颜色是非常暗的(棕色)且外观是轻微褶皱的,并显示4.36%(w/w)BG,其中约7%是可溶性的(用乙醇热处理步骤确定的)。系F6-1K5.9的汇集的T3籽粒具有28.8mg的平均籽粒重量,颜色是正常的且外观是非皱缩的,并显示4.03%BG,其中6.2%是可溶性的。系F6-1G6.7的汇集的T3籽粒具有36.5mg的平均种子重量并具有1.8%BG,其中约7%是可溶性的。阴性分离系F6-
1K3.2具有34.7mg的平均籽粒重量和0.77%BG,其中2%是可溶性的。来自用表达燕麦F6蛋白的转基因转化的系F6-124.4的籽粒具有3%BG,其中约20%是可溶性的。
[0361] 在具有1mm筛网的旋风磨粉机上碾磨提供精细面粉之后,对于从系F6-1K5.9的这些籽粒和随后T5代获得的面粉,确定纤维和纤维组分。淀粉含量、蛋白含量和糖的含量也被确定。数据在表16中示出。参数中的每个,即可溶性纤维、不溶性纤维、中性非淀粉多糖(可溶性NNSP和不溶性NNSP)以及在一些情况下,果聚糖水平被增加。这些面粉被用来制备用于如在实施例17中所述的动物喂养试验的松饼。
[0362] 实施例15.通过使HvCslF6和HvCslH过表达系杂交改变BG结构
[0363] 更修改的籽粒组成可通过产生在胚乳中表达编码CslF6和CslH的转基因两者例如来自大麦的CslF6和CslH的转基因小麦植物来获得。表达HvCslH基因的转基因系因此与表达HvCslF6基因的系杂交,并如在先前实施例中所述对后代通过PCR筛选两个转基因的存
在。是HvCslF6和HvCslH基因两者的纯合子的两个系被获得:F6H1-19.2.1(H1-10B1.9和F6-
6D1亲本)和H1F6-6.2.9.7(H1-10B7.4和F6-6D1亲本)。与野生型对照相比,来自这些系的所有籽粒不是皱缩的,但具有有角的外观、增加的BG含量和较低的DP3/DP4比,且根据本发明人的方法轻微较少的BG是水溶性的(表17)。另一个杂交系F6H1-17(亲本H1-10B1.9和F6-
1G6.3)仍然分离,并且来自从阴性分离子(F6H1-17.1.18)、HvCslF6分离系(F6H1-17.1.23)和具有HvCslF6和HvCslH两者的一个系(F6H1-17.1.16)的十个汇集的籽粒的碾磨的面粉的分析的结果还在表17中示出。
[0364] 讨论。本发明人不知晓来自一个物种的CslF6基因已被用来改变另一物种谷物籽粒中的BG水平或结构的任何报道的实例。Burton等(2006)证明了水稻CslF基因家族
(OsCslF2和/或OsCslF4和OsCslF9)的一些成员在拟南芥的营养组织中的异源表达可产生
非常少量(相当地少于0.1%w/w)的BG。拟南芥叶片中过表达HvCslH的类似实验还产生非常低水平的BG,估计最大是细胞壁的0.016%(Doblin等,2009)。这些实验证明了,一些CslF和CslH基因可制造BG,但在制造诸如本文描述的实质水平的BG中是困难的。
[0365] 考虑到内源CslF和CslH基因表达于小麦中,但小麦籽粒仅具有相当低水平的BG,HvCslF6基因在小麦中的异源表达是否将产生增加的BG水平是未知的,由于一些其他基因功能在这些籽粒中缺失或受限是可能的。
[0366] 本发明人已证明了,通过过表达编码HvCslH的基因使小麦籽粒中BG的量大约加倍是可能的。此外,HvCslF6在小麦籽粒中的过表达相当多地增加了合成的BG的量,增加了多于6倍,其比在用HvCslF6构建体转化的大麦籽粒中的增加大得多。当类似的实验在水稻籽粒中执行时,确定了HvCslH过表达不增加BG水平。此外,在至少一个转化的小麦系中,HvCslF6表达的高水平表现为对胚乳发育是有毒的,由于来自转基因系的具有最高BG水平的许多籽粒是皱缩的。此类籽粒表现为最初发育正常,但胚乳的中间部位然后未能像正常那样发育和膨胀,且籽粒当它们成熟时在弄干后倒塌。皱缩的籽粒因此具有低得多的胚乳/麸比。然而,本发明人能够选择具有高水平BG、同时对籽粒大小或形态具有最小影响的小麦籽粒。这通过生成看上去大小和/或形状相对正常(即,不皱缩)的大量另外的新HvCslF6转基因小麦系并使这些生长,丢弃显示严重收缩籽粒的那些系来完成。
[0367] 在这是特异于HvCslF6基因的表型的情况下,其他CslF6基因还被分离和转化进小麦。燕麦AsCslF6基因事实上产生少得多的皱缩的高BG系,尽管一些系确实展现出皱缩的表型且这些不被进一步研究。使高表达HvCslF6系与高表达HvCslH系杂交还产生具有高BG含量且不像原始HvCslF6系一样皱缩(尽管这产生具有不同结构和溶解度的BG)的籽粒。然而,一些仅具有HvCslF6转基因的非皱缩籽粒(例如系F6H1-17.1.23)通过杂交和分离HvCslH基因座来产生,且该系不仅具有高BG且BG是高度可溶的,在总BG的大约13%。因此,通过与其他精英小麦品种杂交和选择具有期望的BG和籽粒尺寸特性的那些系创造类似系是可能的。
[0368] 本发明人还证明了,小麦籽粒中AsCslF6过表达既增加了BG水平又产生了具有相当地低于用HvCslF6基因所见的约1.3的低DP3/DP4比的BG结构。此外,来自AsCslF6表达小麦籽粒的BG比来自野生型或HvCslF6表达小麦籽粒的BG可溶得多。该籽粒被期望提供相当大的健康益处,由于BG的胆固醇降低特性与它的水溶解度和在肠内形成粘性溶液的能力相关(在Lazaridou和Biliaderis,2007;Theuwissen和Mensink,2008中综述)。
[0369] 实施例16.测试发酵参数
[0370] 包含增加的BG的小麦产生可能改进人健康的大肠发酵模式并减少几个常见慢性疾病的风险的潜力使用模拟人结肠发酵的高通量厌氧分批培养系统来研究。完全随机实验设计被用来研究测试底物和发酵标准(底物)。人类粪便被用作模拟人体大肠发酵的接种
物。新鲜排泄的粪便将源自在先前6个月内摄入他们的习惯饮食并没有抗生素调解的三个健康成人受试者。在收集之后,粪便样品被匀浆化并以10%w/v重悬于无菌厌氧磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中。对于测试产物、标准底物和对照(空白),孵育以一式四份在厌氧培养室中来进行。简言之,标准和测试面粉被预称重进无菌发酵容器中,且包含碳酸盐缓冲液的限碳发酵培养基和大量元素和微粒元素被添加以实现设定的体积和中性pH。在平衡之后,10%人粪便接种物的等分试样被添加至每个底物悬液,管加盖、密封并然后在37℃连续震摇孵育。在指定的间隔之后,发酵被采样并立即冷冻在-20℃以等待使用适当的常规和分子方法进行细菌计数(Abell等,2004;Bird等,2008&2009)。消化物中的DNA如Yu和Morrison(2004)所述通过重复珠打击和试剂盒纯化来提取。
[0371] 实施例17.新颖小麦抑制大鼠餐后血糖反应的潜力的确定
[0372] 急性喂养试验被设计并使用长期插管喂餐大鼠模型来进行以评价小麦衰减餐后血糖过多的生理学功能。该研究还探讨了β-葡聚糖富集的小麦如全麦面粉或精白面粉可藉以有助于减缓葡萄糖吸收并促进血糖水平的更好控制的机械学基础。
[0373] 餐喂大鼠模型专门用来表征从包含增加的BG的小麦制造的原型食品的血糖特性(血糖浓度,IAUC)。来自转基因小麦和常规(对照)小麦(表18中所示的组分)的全麦面粉和精白面粉被用来制造包含以下成分的测试松饼:312g面粉、100g葡萄糖粉、310g牛奶、50g鸡蛋和90g黄油。13C-碘苯腈辛酸盐(0.91mg/g松饼)也包含在制剂中,作为确定胃排空率的定量标准。松饼在180℃烘烤20min,且其组分如表18所示。四种不同的松饼以随机顺序进行测试。大鼠自由获取水和标准商业化大鼠饮食5d,然后对于剩余研究给予标准AIN-93G饮食。
使它们习惯于在设定的时间内进食规定量的食品。每只大鼠的上腔静脉在无菌条件下经由外部左颈静脉插入导管,并且导管定期地使用无菌技术冲洗。在从手术中恢复并适应实验方案之后,10-mL呼吸样品从每个大鼠来收集作为基线测量值。血液样品也在那个时候来采取。然后每只大鼠给予预定量的测试松饼和/或对照松饼,且呼吸样品和血液样品在大鼠完成食用其早晨配给量之后多达3h的规定时间点来收集。测试松饼和对照松饼各自在任何给定动物中研究一次。血糖浓度使用自动血糖监测仪来定量。剩余血液被收集进包含抗凝剂的管中,离心(3000rpm持续10min),且血浆上清液被取出并储存在-80℃以等待使用肠激素多重试剂盒(Millipore,St.Charles,MO,USA)分析胰岛素、GLP-1、GIP和PYY。呼吸样本的13C含量通过质谱来分析并计算胃排空率。结果示于图11和12中。图11示出了,被定义为在喂养之后至120分钟的血糖浓度曲线下面积的血糖指数(GI),在喂食由包含增加水平BG和增加的总膳食纤维(TDF)水平的小麦面粉制成的松饼的大鼠中比用野生型面粉制成的对照松饼喂食的大鼠中显著更低。图12示出了,喂食测试松饼的大鼠的胃排空率未显著不同于喂食相应对照松饼的大鼠的胃排空率,表明减少的血糖浓度和血糖指数与胃排空率中的差异不相关。如预期的,与全面小麦面粉相比,当比较由精小麦面粉制成的松饼的使用时,胃排空率中存在差异(图12)。
[0374] 实施例18.小麦改进瘦和肥胖大鼠中的心血管健康指数的潜力的确定
[0375] 6周饮食干预,以确定由包含增加BG的小麦制成的食品是否减少活体体重增加、减少肥胖并且对代谢健康指数具有有利的影响,诸如例如增加的胰岛素敏感度,心血管健康诸如例如降低血压和减少的LDL-胆固醇水平,以及肠道健康诸如例如增加的消化物质量、益生元(prebiosis)和改进的发酵模式。介导心血管代谢和其他健康益处的生理、生化和激素的机制也被确定。
[0376] 简言之,成年肥胖Zucker大鼠和它们的瘦的对应大鼠将在有可控加热和照明的房间(23℃;12-h光照/黑暗周期)中在丝底笼中以组来保持,并在研究的持续时间内自由获取食物和引用水。在7天的驯化之后,大鼠将被随机分配至每组约12只动物的四组中的一组,并供给两种饮食中的一种。饮食是基于AIN-93G配方,并将包含约50%的由转基因小麦或标准小麦制成的全麦面粉。饮食被配制以提供等量的大量元素、能量和淀粉。在1周实验饮食之后,将大鼠转移至代谢笼4天,以确定饲料和水的摄取以及粪便和尿液的排泄,且然后返回至它们的分组笼中。在4周实验饮食之后,将大鼠使用氧气中4%异氟烷麻醉以允许来自腹主动脉的血液被收集至vacuette管(血清、EDTA-NaFl和EDTA-血浆与10uL/mL DPPIV抑制剂被添加),然后将该acuette管离心(3,000x g)并取出上清液并储存在-80℃直至分析。然后,盲肠和结肠消化物被收集并称重,并将等分试样储存在-20℃以等待分析短链脂肪酸(SCFA)、pH、酚、对甲苯酚和氨。大肠消化物中的微生物群的组成使用定量分子微生物学技术来确定。
[0377] 血糖、甘油三酯、非酯化游离脂肪酸和总胆固醇浓度使用自动分析仪结合专有酶试剂盒(Roche Diagnostics Co,Indianapolis,IN)来测量。包括胰多肽、GIP、GLP-1、PYY、胰岛素和瘦蛋白的多种激素的血浆浓度将使用相关肠激素多重试剂盒(Millipore,St.Charles,MO,USA)来确定(Belobrajdic等,2011)。
[0378] 将对粪便以及盲肠和结肠消化物样品使用公开的方法(Bird等,2007,2008,2009)分析总的和主要的单独SCFA(乙酸、丙酸和丁酸)以及其他代谢产物。
[0379] 实施例19.由小麦制成的原型食物的血糖指数的确定
[0380] 根据它们的餐后血糖反应,基于重量对重量GI排列包含碳水化合物的食物。转基因小麦和比较器(标准)小麦将被碾磨以产生全麦面粉,所述全面面粉然后被制作成一系列适合的原型食物(面包、面团、松饼、饼干)。测试食品的营养组成使用以上描述的分析方法来确定。测试食品的可用的碳水化合物含量被直接测定,如,作为全部淀粉和简单糖含量的总和。这些成分使用标准化程序来测定(方法;分别为AACC,76-12和AOAC,982.14)。
[0381] 标准化体内测试方案(澳大利亚标准AS 4694-2007:食品的血糖指数;国际标准ISO 26642)如下面更详细所述被用来确定基于小麦的测试食品的GI。
[0382] 在测试中使用的食品的食用分量是基于50g可用的碳水化合物,所述碳水化合物通过如较早被提及的直接分析来确定。待使用的参考食品是葡萄糖。所有GI测试和相关的实验室分析将在Adelaide的CSIRO动物、食品与健康科学的临床研究单位(Clinical 
Research Unit at CSIRO Animal,Food and Health Sciences in Adelaide)中来进行。
对于GI测试,约12名符合选择标准的参与者将被招募。参与者在每个测试之前除水以外不允许摄入任何食物或饮料,持续最少10小时。志愿者还被要求在测试之前即刻或在测试期间避免进行剧烈运动。在测试的当天,二个空腹血液样品通过手指刺相距约5分钟来采取,分析葡萄糖,且平均结果被用作基线血糖浓度。每个参与者然后摄入分配给他们的测试餐,其的分量包含相当于50克可用的碳水化合物。进一步手指刺血液样品在测试食品第一口之后立即开始的15、30、45、60、90和120分钟时来采取。参与者还被提供250mL的水以摄入测试食品。
[0383] 对于参考食品(葡萄糖饮料),将50克无水葡萄糖粉末溶解于250ml水中。该饮料供应与标准分量测试食品完全相同量的可用碳水化合物,并将在测试小麦早餐谷物之前在三个先前场合在最接近3个月周期内在每个参与者中被测试。
[0384] 血液样品中的葡萄糖浓度将使用自动化酶和分光光度技术来测定,该技术具有<3.0%的批间变异系数。在摄入标准量的测试食物之后,GI将作为血糖反应(测量为增加的血糖反应曲线下面积)被确定,表示为在一个单独的场合平均血糖反应(IAUC)与来自被同一参与者摄入的参考食品(葡萄糖饮料)的相同量的碳水化合物的百分比。试验食品的GI相当于≥10个受试者的平均GI。提供试验食品中碳水化合物的量和质量两者的指示的血糖负荷(GL),将根据以下公式来计算:
[0385] GL=(GI x碳水化合物的量(克))除以100。
[0386] 实施例20.新颖小麦对‘风险’群体中的心血管健康益处的确定
[0387] 中期、完全随机、可控平行研究将研究新颖小麦对自由生活、轻微的高胆固醇血但在其他方面健康的成年人(n=60)中的心血管健康的益处。志愿者将通过公共广告招募来参与12周的研究。排除标准包括心血管、肝、外周血管、呼吸、肠或肾疾病或恶性肿瘤史。所有的研究程序将由联邦科学与工业研究组织的人类伦理委员会(Human Ethics Committee of the Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation)批准。
[0388] 约60名志愿者将被随机分至三个饮食组中的一个以每日摄取从转基因小麦或常规小麦(作为全麦面粉)或精小麦制成的食品。在研究的持续期间,志愿者将摄取经过修改的他们的习惯饮食,以适应基于谷物食品的研究食物(研究营养学家将帮助他们满足此要求)。据预计,每一天试验约100g的谷物面粉将被吃掉。食品记录和其他信息以及血液和粪便样品将在基线和此后在研究剩余时间内以3周间隔来收集,以评估在以下方面的变化:血脂谱(总的和LDL和HDL胆固醇,载脂蛋白B和TAG)和血糖对照(HbA1c和空腹血糖)、TNF-α和高半胱氨酸含量、食品和能量摄入、体重管理、腰围、血压、粪便质量、细菌计数、胆汁酸和SCFA水平、胰岛素敏感度(空腹胰岛素和稳态模型评估胰岛素耐受性)和选择的激素的循环水平,包括GLP-1和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)。志愿者将被要求完成一个3天的食品日记和肠运动习惯,以及每三个星期的舒适和健康调查问卷。粪便和血液将使用文献中描述的标准方法来分析。
[0389] 实施例21.无乙醇热处理的面粉样品中的BG的水溶解度。
[0390] 省略了如实施例1中所述的第一乙醇热灭活步骤的第二BG水溶解度测定被开发,作为在正常食品加工方法期间面粉中BG的溶解度的指示。对20mg面粉样品的总BG测定如先前所述使用按比例缩小Megazyme试剂盒方法来进行,并且面粉的第二个相同的样品经历在
37℃在1ml磷酸钠缓冲液中震摇溶解2小时。不溶性材料通过以10,000g离心1min来沉淀,将上清液丢弃,团块在1ml磷酸盐缓冲液中洗涤,并然后在进一步离心和丢弃上清液之后,团块的BG含量如对于第一样品来确定,以给出面粉中不溶性BG的量。样品的可溶性BG含量通过减去来自面粉的总BG的团块中的不溶性BG值来计算。双份样品被测量。
[0391] 没有乙醇热灭活步骤,燕麦和大麦面粉显示增加的溶解的BG的量,其中分别与实施例12中所述的50%和27%的水平相比,燕麦显示约80%的非常高的溶解度且大麦仅低于40%(图13)。相比之下,小麦面粉和大麦面粉两者具有约8%的低水平水溶性的BG。发明人注意到,与源自Bob White 26栽培品种的“硬小麦”的转化品系的籽粒相比,小麦栽培品种Fielder的籽粒被视为“软小麦”籽粒。
[0392] 具有增加的BG水平的选择的转基因系的BG水溶解度使用新的测定来确定,并且结果在表19中示出。每个样品集包括阴性分离子作为具有大约0.7%至0.8%的BG水平的对照。对照的一半显示大约20%的BG溶解度,而另一半具有大约10%的可溶性BG。在田间生长的样品中,与阴性分离子中的10%相比,HvCslF6高BG系显示增加的多达40%的BG溶解度。
具有增加的多达3.9%BG含量的AsCslF6表达系还显著将BG溶解度从31%增加至多于50%
的范围。
[0393] 与HvCslF6系不同,由于表达HvCslH基因的具有更高BG水平的转基因系显示减少水平的水溶性BG(将H1-10B7.3与H1-10B1.9和7.4进行比较)。在HvCslH表达系中降低的BG溶解度,也可见于HvCslF6x HvCslH杂交系。具有HvCslF6和HvCslH两个基因的系(F6H1-
7.1.16和F6H1-7.1.24)显示比阴性分离子(F6H1-7.1.18,11%可溶性BG)高的17%和23%的溶解度,但显著低于仅包含HvCslF6基因的系(F6H1-7.1.23),其具有多于50%可溶性BG。
如先前所述,该系源自皱缩籽粒HvCslF6系的一个。然而,随着杂交和从HvCslH基因的分离,来自该系的籽粒不再皱缩,尽管它比野生型籽粒稍轻,但仍然具有显著增加的BG含量。
[0394] 因此,具有大范围水溶解度BG含量的小麦籽粒通过在植物生长期间在发育中的小麦籽粒中表达不同的CslF基因和/或CslH基因或基因的组合来产生。
[0395] 实施例22.在控制BG结构和溶解度的CslF6蛋白内的氨基酸的确定。
[0396] 如实施例10中所述,当在本氏烟叶片系统中表达时,来自燕麦和水稻的CslF6多肽,以及还有玉米和高粱(见下文)的那些,产生了具有约1或更小的低DP3/DP4比的BG。该BG具有比从大麦、小麦或短柄草属CslF6多肽的表达产生的BG高得多的溶解度,其中DP3/DP4比是约1.4或更高。当编码那些特定CslF6多肽的基因被表达于谷物籽粒中时,产生具有较低DP3/DP4比的BG的CslF6多肽也产生较高溶解度的BG。因此,嵌合基因构建体通过将来自一个基因的蛋白编码区(大麦CslF6,较高DP3/DP4比)的一部分与第二编码区(玉米CslF6,较低DP3/DP4比)的其他部分连接来制备。这些嵌合基因如实施例6所述被表达于本氏烟系统中,且产生的BG的DP3/DP4比被确定,以确定控制比以及由此控制BG结构的CslF6多肽的部分。如下所述使用该方法和多种此类融合体,得出的结论是,在CslF6多肽的八个预测的跨膜结构域的一个中的单个氨基酸差异控制BG结构以及由此控制DP3/DP4比。
[0397] 比较来自不同物种的CslF6基因的序列,注意到在可被用来交换CslF6基因的区并因此在植物细胞中表达嵌合多肽的CslF6cDNA的编码区内存在几个保守的限制性位点。例如,在HvCslF6基因和ZmCslF6-2基因两者中都存在保守的ApaI、BglII和SacI位点。
[0398] 相应于大麦CslF6基因(HvCslF6,cDNA的核苷酸序列是SEQ ID NO:169)、玉米CslF6基因(ZmCslF6-1,SEQ ID NO:166;ZmCslF6-2,SEQ ID NO:167)和高粱CslF6基因
(SbCslF6,Sb07g004110;SEQ ID NO:168)的全长cDNA使用实施例13中描述的方法使用
Phusion聚合酶并使用引物对(正向和反向)SJ116和SJ77、SJ391和SJ392、SJ393和SJ392以及SJ387和SJ389分别地从幼苗cDNA来扩增,并如(Cheng等,2009年)中所述克隆进二元载体pCXSN以创造质粒pSJ226、pSJ192、pSJ195和pSJ197。扩增的cDNA序列与公布的序列在几个位置中稍有不同(将SEQ ID NO:164和165与SEQ ID NO:166和167进行比较),可能反映品种差异。这些差异不在决定BG的DP3/DP4比的多肽的区内(见下文)。然而,由分离的cDNA编码的ZmCslF6-1多肽的氨基酸序列被发现在近5’端的编码序列中具有25个氨基酸缺失,但是这不影响基因的活性(见下文)。由于CslF6基因的5’末端的极度GC丰富度,尽管在扩增反应中高DMSO浓度被使用,该缺失可能作为Phusion聚合酶跳过二级DNA环结构的结果发生。这已被本发明人用其他几个CslF6基因观察到。
[0399] 表20.引物的核苷酸序列
[0400]引物 基因 序列
SJ387 SbCslF6 5’ GAGGGCGCAGCCGGCATTATGG
SJ388 SbCslF6 3’ CTTCACGGCCAGTTGTAGGAGAGGTTG
SJ391 ZmCslF6-1 5’ CCGCCAGGCAGGCAGAGAGG
SJ392 ZmCslF6-2 5’ TCACGGCCAGAGGTAGTAGCCGT
SJ393 ZmCslF6 3’ GCCAGGCAGGCAGGCATTATGG
[0401] 在第一个实例中,嵌合基因使用HvCslF6和ZmCslF6-2来源的质粒pSJ226和pSJ195来制备,由于这些具有最多共同的限制性位点(图14)。限制性酶SacI(核苷酸位置821和856)、ApaI(1501和1536)和BglII(2060和2077)的位点存在于大麦基因和玉米基因的编码序列内的相同位置上。因此第一嵌合基因集使用那些位点和分别为CaMV35S启动子和Nos多腺苷酸化区的5’和3’的独特的HindIII和EcoRI位点来制备。构建体的示意图和在本氏烟中表达之后产生的BG的DP3/DP4比的结果概要在图16中示出。
[0402] 当在本氏烟细胞中表达时,亲本HvCslF6多肽产生具有约1.4的相对高的DP3/DP4比的BG,而亲本ZmCslF6-2多肽产生约1.1的相对低的DP3/DP4比。来自测定的数据的标准差在范围0.01-0.02,所以尽管从实验至实验的绝对值取决于植物年龄略微变化,观察到的差异是显著的。这些实验重复多次,且两个多肽之间的差异是一致的。当BglII-EcoRI片段在HvCslF6基因和ZmCslF6-2基因之间交换时,DP3/DP4比被改变–Hv-ZmCslF6-2多肽具有类似于由ZmCslF6-2多肽赋予的较低的比,而Zm-HvCslF6-2嵌合多肽产生类似于HvCSlF6多肽的更高的比。得出的结论是,基因的BglII-EcoRI区域(即3’区)赋予由编码多肽产生的特征性DP3/DP4比。当基因的其他区诸如5’区被交换时,对BG的DP3/DP4比不存在影响,尽管SacI-ApaI片段交换产生了是在HvCslF6和ZmCslF6-2基因之间的中间的DP3/DP4比,表明该区在该特定嵌合蛋白的环境下可能也对BG结构发挥一定影响。
[0403] 为了证实这些结果,BglII-EcoRI片段在如表21中所示的其他CslF6基因之间被交换。BglII位点在所有列出的CslF6基因中是保守的。天然BdCslF6多肽和HvCslF6多肽两者分别产生具有约1.4和约1.74的相对高的DP3/DP4比的BG,而AsCslF6、ZmCslF6-2和SbCslF6多肽产生具有约0.9至约1.09的相对低的DP3/DP4比的BG。当BglII-EcoRI片段在这些基因之间交换时,DP3/DP4比和因此的BG的结构相应于该片段的源-如果其来自产生低DP3/DP4比的基因,则嵌合基因也产生低DP3/DP4比,且反之对于高DP3/DP4比CslF6基因亦然。在DP3/DP4比类内例如在Bd与Hv CslF6基因之间或As和Zm CslF6基因之间交换BglII-EcoRI片段对BG结构没有影响,由于DP3/DP4比分别保持高的或低的。因此,CslF6多肽的该区最后被证明控制BG的DP3/DP4比。
[0404] CslF6多肽的该羧基末端区包含预测的胞质区的一小部分和形成如通过与相关细菌纤维素合酶蛋白的最近公布的3D晶体结构的比较所预测的膜通道的一部分的六个预测
的跨膜结构域(Morgan等,2013)。为了进一步定义控制DP3/DP4比的区,XbaI位点被引入进编码HvCslF6和ZmCslF6多肽(分别为质粒pSJ245和pSJ246)的TM5和TM6跨膜结构域的该区
的中间。这使用合成gBlock方法(IDT,USA)通过将不改变多肽氨基酸序列的核苷酸变化来实现。这允许在HvCslF6基因和ZmCslF6基因之间的BglII-XbaI和XbaI-EcoRI片段的交换。
当在植物细胞中表达时,这些嵌合基因产生从其确定每个基因决定DP3/DP4比的BglII-
XbaI区的BG(表22)。
[0405] HvCslF6多肽和ZmCslF6多肽的羧基末端半的氨基酸序列和纤维素合酶蛋白CesA的那些氨基酸序列被比对。HvCSlF6多肽和ZmCslF6多肽之间在由BglII-XbaI区编码的区中的差异被鉴定。在该区存在十二个氨基酸差异,其中大部分被预测位于TM3-TM6域。
[0406] 合成的BglII-XbaI gBlock DNA片段被设计以创造仅在ZmCslF序列中的PvuII位置的上游融合的嵌合Hv-ZmCslF6多肽,由于这将两个多肽中该区中的差异分为两半-包含TM3和TM4跨膜结构域的区的N-末端半和包含TM5和TM6结构域的C-末端半。这些嵌合Hv-
ZmCslF6多肽在本氏烟细胞中的表达从而定义控制BG的DP3/DP4比的区至该区的N末端半
(比较pSJ253、pSJ254、pSJ255和pSJ256,表21)。该区包括TM3和TM4结构域,以及在BglII位点和PstI位点之间的CslF6多肽的中央胞质域中的两个氨基酸差异。后两者差异对DP3/DP4比没有影响,由于质粒pSJ226和pSJ195中的HvCslF6基因和ZmCslF6基因之间的PstI片段的交换对BG结构(pSJ252,表23)没有影响。因此,得出结论是,在TM4跨膜结构域中的四个氨基酸的差异决定在由HvCslF6多肽和ZmCSlF6多肽产生的BG的DP3/DP4比中的差异。编码该结构域的基因的区位于CslF6基因的PstI位点和XbaI位点之间。
[0407] 为了简化进一步克隆,在pSJ226和pSJ195中的CaMV 35S启动子上游的PstI位点通过用SbfI切割来破坏并用T4-DNA聚合酶修复末端,从而留下CslF6编码序列的PstI位点作为一个独特的PstI位点,并使gBlock片段能够被克隆进pSJ257和pSJ258(分别编码HvCslF6和ZmCslF6-2)的PstI-XbaI位点。将来自质粒pSJ254和pSJ255的PstI-XbaI片段克隆进入pSJ257和pSJ258产生仅在PstI-XbaI区不同的CslF6基因,并且这些基因(pSJ259和pSJ260)在本氏烟细胞中的表达证实了,该区单独地决定BG的DP3/DP4比(表22)。
[0408] 在HvCslF6多肽和ZmCslF6-2多肽之间的TM4结构域中存在四个单氨基酸差异。为确定这四个氨基酸改变中的哪一个决定BG结构和DP3/DP4比,四个合成的PstI-XbaI 
gBlock片段被设计和测试,每个相对于HvCslF6多肽仅包含一个氨基酸差异(关于SEQ ID NO:175的G748A、S752A、V756I和I757L,单字母氨基酸代码)。该实验被设计以证明这些单氨基酸改变本身的任一个是否可影响由HvCSlF6多肽产生的BG的DP3/DP4比,并基本上是否将它转化为具有ZmCslF6多肽的特性的多肽。当这些突变体HvCslF6基因被表达于本氏烟叶片中时,仅I757L(异亮氨酸置换亮氨酸)置换影响DP3/DP4比,产生具有类似于ZmCslF6多肽的结构的BG(表24)。该发现是非常令人惊讶的,由于该氨基酸置换是非常保守的置换;I置换L。令人惊讶的是,这看似微小的改变具有这样重大的影响。
[0409] 该氨基酸置换通过基因组编辑技术被引入进大麦的内源CslF6基因和三个小麦CslF6基因中的一个或更多个,以产生大麦籽粒或小麦籽粒,所述大麦籽粒或小麦籽粒的BG是改变的DP3/DP4比和因此在由此获得的籽粒或面粉或全麦面粉中增加的BG溶解度。这提供了具有增加的可溶性膳食纤维的食品成分和食品产品。
[0410] 序列ID NO的列表
[0411] SEQ ID NO:1,TaCslF3B型2618个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸7-9,翻译终止密码子TAG是核苷酸2560-2562。
[0412] SEQ ID NO:2,TaCslF3B型851个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-57,预测的跨膜结构域是氨基酸72-93、101-120、630-651、664-686、701-721、752-774、791-813和822-841。已知对活性是关键的氨基酸是D195、DxD(395-397)、D556和QxxRW基序(594-598)。
[0413] SEQ ID NO:3,TaCslF4 1型2726个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TAG是核苷酸2608-2610。
[0414] SEQ ID NO:4,TaCslF4 2型2725个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TAG是核苷酸2608-2610。
[0415] SEQ ID NO:5,TaCslF4 3型2728个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TAG是核苷酸2608-2610。
[0416] SEQ ID NO:6,TaCslF4 1型3022个核苷酸的基因。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TAG是核苷酸2904-2906。内含子序列(GT...AG)是核苷酸246-356、1804-1268。
[0417] SEQ ID NO:7,TaCslF4 2型3015个核苷酸的基因。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子是核苷酸2898-2900。内含子序列是核苷酸246-349和1077-1262。
[0418] SEQ ID NO:8,TaCslF4 3型2992个核苷酸的基因。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TAG是核苷酸2872-2874。内含子序列是核苷酸246-341和1069-1236。
[0419] SEQ ID NO:9,TaCslF4 1型869个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-62,预测的跨膜结构域是79-101、108-127、635-656、669-691、706-726、757-779、794-816和825-845。已知对活性是关键的氨基酸是D198、DxD(398-400)、D561和QxxRW基序(599-603)。
[0420] SEQ ID NO:10,TaCslF4 2型869个氨基酸的多肽。信号序列、预测的跨膜结构域和D、DxD、D和QxxRW基序在对于SEQ ID NO:8相同的位置。
[0421] SEQ ID NO:11,TaCslF4 3型869个氨基酸的多肽。信号序列、预测的跨膜结构域和D、DxD、D和QxxRW基序在对于SEQ ID NO:8相同的位置。
[0422] SEQ ID NO:12,TaCslF6A型3082个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸2-4,翻译终止密码子TGA是核苷酸2837-2839。
[0423] SEQ ID NO:13,TaCslF6B型3156个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是97-99,翻译终止密码子TGA是核苷酸2920-2922。
[0424] SEQ ID NO:14,TaCslF6D型3193个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸101-103,翻译终止密码子TGA是核苷酸2933-2935。
[0425] SEQ ID NO:15,TaCslF6A型3813个核苷酸的基因。起始ATG起始密码子是核苷酸2-4,翻译终止密码子TGA是核苷酸3568-3570。第一内含子不被分离且不存在于该序列内。第二内含子序列是核苷酸1070-1800。
[0426] SEQ ID NO:16,TaCslF6B型基因,没有第一内含子且第二内含子的3’部分从引物SJ180至剪接位点,3741个核苷酸。起始甲硫氨酸ATG起始密码子是核苷酸97-99。内含子序列是核苷酸1153-1737。
[0427] SEQ ID NO:17,TaCslF6D型5520个核苷酸的基因。ATG起始密码子是核苷酸101-103,翻译终止密码子TGA是核苷酸5260-5262。内含子序列是核苷酸421-2047和2793-3492。
[0428] SEQ ID NO:18,TaCslF6A型945个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-91,预测的跨膜结构域是氨基酸105-126、134-153、707-728、741-763、778-798、831-852、865-887和894-915。已知对活性是关键的氨基酸是D228、DxD(430-432)、D633和QxxRW基序(671-675)。
[0429] SEQ ID NO:19,TaCslF6B型941个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-87,预测的跨膜结构域是氨基酸101-122、130-149、703-724、737-759、774-794、827-848、861-883和890-911。已知对活性是关键的氨基酸是D224、DxD(426-428)、D629和QxxRW基序(667-671)。
[0430] SEQ ID NO:20,TaCslF6D型944个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-90,预测的跨膜结构域是氨基酸104-125、133-152、706-727、740-762、777-797、830-851、864-886和893-914。已知对活性是关键的氨基酸是D227、DxD(429-431)、D632和QxxRW基序(670-674)。
[0431] SEQ ID NO:21,TaCslF7 3型2444个核苷酸的cDNA序列。ATG起始密码子是核苷酸11-13,翻译终止密码子TAA是核苷酸2435-2437。
[0432] SEQ ID NO:22,TaCslF7 3型基因,3327个核苷酸的部分序列。起始ATG起始密码子是核苷酸11-13。内含子序列是核苷酸157-1039。
[0433] SEQ ID NO:23,TaCslF7 3型808个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-32,预测的跨膜结构域是氨基酸46-67、81-101、590-612、631-653、667-688、723-745、755-777和783-805。已知对活性是关键的氨基酸是D168、DxD(342-344)、D447和QxxRW基序(555-559)。
[0434] SEQ ID NO:24,TaCslF9A型cDNA,2162个核苷酸的不分离3’末端的部分长度。起始ATG甲硫氨酸是在核苷酸41-43。
[0435] SEQ ID NO:25,TaCslF9B型cDNA序列,2159个核苷酸的不分离3’末端的部分长度。起始ATG甲硫氨酸码子是核苷酸41-43。
[0436] SEQ ID NO:26,TaCslF9D型2760个核苷酸的cDNA。ATG起始密码子是核苷酸41-43,翻译终止密码子TAA是核苷酸2612-2614。
[0437] SEQ ID NO:27,TaCslF9A型基因,3370个核苷酸的不分离3’末端的部分长度。起始ATG起始密码子是核苷酸41-43。内含子序列是核苷酸1223-1375和2130-2211。
[0438] SEQ ID NO:28,TaCslF9B型基因,3348个核苷酸的不分离3’末端的部分长度。起始ATG起始密码子是核苷酸41-43。内含子序列是核苷酸253-1351。
[0439] SEQ ID NO:29,TaCslF9D型基因,不存在第一内含子的2847个核苷酸。ATG起始密码子核苷酸41-43,翻译终止密码子TAA是核苷酸2699-2701。内含子序列是1004-1090。
[0440] SEQ ID NO:30,TaCslF9D型857个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-51,预测的跨膜结构域是氨基酸67-89、96-115、634-655、668-690、793-851和822-844。已知对活性是关键的氨基酸是D190、DxD(395-397)、D560和QxxRW基序(598-602)。
[0441] SEQ ID NO:31,TaCslF6A型2284个核苷酸的cDNA。起始ATG起始密码子是核苷酸19-21,翻译终止密码子TAA是核苷酸2275-2277。
[0442] SEQ ID NO:32,TaCslH B型2421个核苷酸的cDNA。起始ATG起始密码子是核苷酸156-158,翻译终止密码子TAA是核苷酸2412-2414。
[0443] SEQ ID NO:33,TaCslH 3型2284个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸19-21,翻译终止密码子是核苷酸2275-2277。
[0444] SEQ ID NO:34,TaCslH A型3236个核苷酸的基因。ATG起始密码子是核苷酸141-143,翻译终止密码子TAA是核苷酸3227-3229。内含子序列是核苷酸392-492、824-918、
1045-1143、1264-1337、1627-1715、1837-1948、2134-2165和2595-2668。
[0445] SEQ ID NO:35,TaCslH B型3316个核苷酸的基因。ATG起始密码子是核苷酸156-158,翻译终止密码子是核苷酸3307-3309。内含子序列在相对于SEQ ID NO:33的相应位置。
[0446] SEQ ID NO:36,TaCslH 3型3181个核苷酸的基因。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸19-21,翻译终止密码子TAA是核苷酸3172-3174。内含子序列在相对于SEQ ID NO:33的相应位置。
[0447] SEQ ID NO:37,TaCslH A型752个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-9,预测的跨膜结构域是氨基酸17-37、44-66、530-553、572-596、666-687和701-721。已知对活性是关键的氨基酸是D133、DxD(293-295)、D460和QxxRW基序(498-502)。
[0448] SEQ ID NO:38,TaCslH B型752个氨基酸的多肽。信号序列、预测的跨膜结构域和氨基酸D、DxD、D和QxxRW基序在相对于SEQ ID NO:36的相应位置。
[0449] SEQ ID NO:39,TaCslH 3型,752个氨基酸的多肽。信号序列、预测的跨膜结构域和氨基酸D、DxD、D和QxxRW基序在相对于SEQ ID NO:36的相应位置。
[0450] SEQ ID NO:40。在pSJ11中的嵌合HvCslF4T7基因,AflII片段,2888个核苷酸。T7标签氨基酸的起始甲硫氨酸ATG是核苷酸7-9,CslF4多肽的ATG是核苷酸34-36,翻译终止密码子TAG是核苷酸2653-2655。
[0451] SEQ ID NO:41,由pSJ11编码的882个氨基酸的嵌合HvCslF4T7多肽。T7标签由氨基酸1-11组成,信号肽序列是氨基酸10-70,预测的跨膜结构域是氨基酸89-110、118-137、648-669、682-704、718-739、770-792、807-829和836-858。已知对活性是关键的氨基酸是D211、DxD(411-413)、D574和QxxRW基序(612-616)。
[0452] SEQ ID NO:42,pSJ33中的嵌合HvCslF6T7基因,AflII,2977个核苷酸片段,T7标签的起始甲硫氨酸是核苷酸6-9,CslF6多肽的ATG是核苷酸34-36,翻译终止密码子TGA是核苷酸2884-2886。
[0453] SEQ ID NO:43,由pSJ33编码的958个氨基酸的嵌合HvCslF6T7多肽。T7标签是氨基酸1-11,信号序列是氨基酸12-101,预测的跨膜结构域是氨基酸117-138、146-165、719-740、753-775、789-810、842-864、877-899和906-927。已知对活性是关键的氨基酸是D240、DxD(442-444)、D645和QxxRW基序(683-687)。
[0454] SEQ ID NO:44,pSJ2中的HvCslF9基因组片段,EcoRI片段,3984个核苷酸。ATG起始密码子是核苷酸54-56,翻译终止密码子TAA是核苷酸3942-3944。内含子序列是核苷酸269-1220和1972-2336。
[0455] SEQ ID NO:45,857个氨基酸的HvCslF9多肽。信号序列是氨基酸1-52,预测的跨膜结构域是氨基酸69-90、98-117、634-655、668-690、704-726、757-778、793-815和822-844。已知对活性是关键的氨基酸是D192、DxD(396-398)、D560和QxxRW基序(598-602)。
[0456] SEQ ID NO:46,pSJ3中的嵌合HvCslF7基因组片段,EcoRI片段,3620个核苷酸。ATG起始密码子是核苷酸35-37,翻译终止密码子TAA是核苷酸3570-3572。内含子序列是核苷酸181-1285。
[0457] SEQ ID NO:47,pSJ3中编码的810个氨基酸的HvCslF7多肽。信号序列是氨基酸1-32,预测的跨膜结构域是氨基酸46-66、82-101、590-612、631-654、668-689、725-747、757-
780和786-806。已知对活性是关键的氨基酸是D168、DxD(343-345)、D517和QxxRW基序(555-
559)。
[0458] SEQ ID NO:48,HvCslH全长cDNA(2333个核苷酸)ATG起始密码子是核苷酸76-78,翻译终止密码子TAA是核苷酸2329-2331。
[0459] SEQ ID NO:49,在pSJ6中3227个核苷酸的HvCslH基因组EcoRI片段。起始ATG起始密码子是核苷酸88-90,翻译终止密码子TAA是核苷酸3211-3213。内含子序列是核苷酸:339-437、769-867、994-1107、1228-1331、1545-1637、1759-1817、2048-2081、2505-2655。
[0460] SEQ ID NO:50,由pSJ6编码的751个氨基酸的HvCslH多肽。信号序列是氨基酸1-10,预测的跨膜结构域是氨基酸17-38、44-66、530-553、572-595、608-630、665-688、700-
721和726-748。已知对活性是关键的氨基酸是D133、DxD(293-295)、D460和QxxRW基序(498-
502)。
[0461] SEQ ID NO:51,燕麦AsCslF6 1型3002个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸1-3,翻译终止密码子TGA是核苷酸2833-2835。
[0462] SEQ ID NO:52,燕麦AsCslF6 2型3424个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸347-349,翻译终止密码子TGA是核苷酸3175-3177。
[0463] SEQ ID NO:53,燕麦AsCslF6 3型3269个核苷酸的cDNA。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸178-180,翻译终止密码子TGA是核苷酸3010-3012。
[0464] SEQ ID NO:54,燕麦AsCslF6 2型5244个核苷酸的基因组片段AsCslF6_274_243_11。ATG起始密码子是核苷酸18-20,翻译终止密码子是核苷酸5165-5167。内含子序列是核苷酸338-1964和2710-3400。
[0465] SEQ ID NO:55,燕麦AsCslF6 1型944个氨基酸的多肽氨基酸序列。信号序列是氨基酸1-91,预测的跨膜结构域是氨基酸105-126、134-153、708-731、744-766、780-801、834-853、868-890和897-918。已知对活性是关键的氨基酸是D228、DxD(430-432)、D636和QxxRW基序(674-678)。
[0466] SEQ ID NO:56,燕麦AsCslF6 2型943个氨基酸的多肽。信号序列是氨基酸1-90,预测的跨膜结构域是氨基酸104-125、133-152、707-730、743-765、779-800、833-852、867-889和896-917。已知对活性是关键的氨基酸是D227、DxD(429-431)、D635和QxxRW基序(673-677)。
[0467] SEQ ID NO:57,燕麦AsCslF6 3型944个氨基酸的多肽。基序如同SEQ ID NO:55。
[0468] SEQ ID NO:58,2933个核苷酸的BdCslF6_277-357_10cDNA。前12个核苷酸和最后12个核苷酸是来自pCRBluntII的载体序列。T7表位标签序列是核苷酸16-48,且翻译终止密码子TGA是核苷酸2866-2868。
[0469] SEQ ID NO:59,950个氨基酸的BdCslF6T7多肽。T7标签是氨基酸1-11。信号序列是氨基酸12-93,预测的跨膜结构域是氨基酸107-128、135-155、713-735、747-769、783-804、837-856、871-893和900-920。已知对活性是关键的氨基酸是D230、DxD(433-435)、D639和QxxRW基序(677-681)。
[0470] SEQ ID NO:60,水稻3115个核苷酸的OsCslF6_69-324_15cDNA。前12个核苷酸和最后12个核苷酸是来自pCR BluntII的载体序列。起始甲硫氨酸ATG是核苷酸244-246,翻译终止密码子TGA是核苷酸3100-3102。
[0471] SEQ ID NO:61,水稻952个氨基酸的OsCslF6多肽。信号序列是氨基酸1-90,预测的跨膜结构域是氨基酸104-125、132-152、712-732、744-766、780-801、834-853、868-890和897-918。已知对活性是关键的氨基酸是D227、DxD(429-431)、D636和QxxRW基序(674-678)。
[0472] SEQ ID NO:62-163。寡核苷酸引物(表1)。
[0473] SEQ ID NO:164相应于ZmCslF6-1GRMZM2G110145的玉米(Zea mays)cDNA
[0474] SEQ ID NO:165相应于ZmCslF6-2GRMZM2G122277-T01的玉米cDNA
[0475] SEQ ID NO:166相应于ZmCslF6-1_391-392_14的玉米cDNA
[0476] SEQ ID NO:167相应于ZmCslF6-2 393-392_6的玉米cDNA
[0477] SEQ ID NO:168相应于SbCslF6Sb07g004110|Sb07g004110.1的高粱(Sorghum biclor)cDNA
[0478] SEQ ID NO:169HvCslF6_116-77(pSJ226)
[0479] SEQ ID NO:170玉米CslF6多肽GRMZM2G110145_T01前体的氨基酸序列
[0480] SEQ ID NO:171玉米CslF6多肽GRMZM2G122277-T01前体的氨基酸序列
[0481] SEQ ID NO:172玉米CslF6多肽ZmCslF6-1 391-392_14前体的氨基酸序列
[0482] SEQ ID NO:173玉米CslF6多肽玉米CslF6ZmCslF6-2 393-392_6前体的氨基酸序列
[0483] SEQ ID NO:174高粱CslF6多肽-高粱(Sorghum bicolor)|Sb07g004110|Sb07g004110.1的氨基酸序列
[0484] SEQ ID NO:175大麦(Hordeum vulgare)CslF6多肽HvCslF6(pSJ226)的氨基酸序列。信号序列是氨基酸1-90,预测的跨膜结构域是氨基酸105-127、134-153、714-736、743-
765、778-800、830-852、867-889和896-918。
[0485] SEQ ID NO:176天然HvCslF6TM4的氨基酸序列
[0486] SEQ ID NO:177天然ZmCslF6TM4的氨基酸序列
[0487] SEQ ID NO:178HvCslF6TM4氨基酸置换突变体的氨基酸序列
[0488] 表1.在克隆CslF序列和CslH序列以及在RT-PCR实验中使用的引物的核苷酸序列
[0489]
[0490]
[0491]
[0492]
[0493] 表2.来自大麦和小麦的CslF和CslH多肽的长度(氨基酸数目)
[0494]  CslF3 CslF4 CslF6 CslF7 CslF8 CslF9 CslF10 CslH
大麦 851 870 947 810 897 857 879 751
小麦 n/a 869 945 n/a 897 n/a 878 752
小麦 851 869 941 808 897 n/a n/a 752
小麦 847 869 944 808 897 857 n/a 752
[0495] n/a全长cDNA不可用。
[0496] 表3.大麦和小麦CslF基因之间的核苷酸序列同一性百分比。全长或近全长DNA序列用Muscle软件来比对。当多于一个的小麦全长基因是可用的时,%同一性的范围被示出。
[0497]  TaCslF3 TaCslF4 TaCslF6 TaCslF7 TaCslF8 TaCslF9 TaCslF10
HvCslF3 89.8-90.4 60.5-60.6 48.7-55.7 49.6 61.3-62.0 65.5-60.5 64.5-70.8
HvCslF4 60.3-60.6 91.2-91.7 53.6-61.4 56.2 60.6-62.1 65.1-69.2 57.1-62.2
HvCslF6 48.8-49.0 53.9-54.5 84.6-92.9 50.8 52.1-52.8 55.3-60.3 47.2-52.8
HvCslF7 48.7-49.1 55.8-56.2 49.9-50.2 89.3 50.9-51.0 55.2-56.0 46.1-49.7
HvCslF8 60.8-61.2 62.3-62.5 51.5-57.7 51.4 95.6-96.0 64.2-66.9 58.1-64.1
HvCslF9 57.5-57.9 66.0-66.8 54.7-59.8 55.5 64.2-64.3 89.8-93.6 56.5-59.3
HvCslF10 62.5-62.6 56.3-56.7 46.2-53.1 46.5 58.0-58.2 53.7-56.8 83.2-93.1
[0498] 表4.大麦和小麦CslF基因之间的氨基酸序列同一性百分比。全长多肽用Muscle软件来比对。当多于一个的小麦ORF是可用的时,同一性的范围被示出。
[0499]
[0500]
[0501] 表5.在来自用编码HvCslH的嵌合基因转化的小麦植物的T1发育中籽粒中的相对转基因表达水平(单或多个汇集的在大约15DPA的T1籽粒样品)以及成熟籽粒中的BG水平
[0502]
[0503] 表6.来自用编码HvCslH的构建体转化的T4籽粒的小麦面粉的BG和纤维分析。标准差在各个值下面示出。
[0504]
[0505] 表7.在克隆谷物CslF基因和CslH基因中使用的引物
[0506]
[0507]
[0508] 表8.具有增加的BG含量的HvCslF6小麦T2籽粒具有改变的结构与降低的DP3/DP4比。
[0509]系 BG含量w/w DP3/DP4比
F6-1G4a 0.9 2.53
F6-1G4b 1.1 3.05
F6-1G4c 4.0 2.17
F6-1G4d 4.3 1.98
F6-1G4e 0.8 2.46
小麦 0.82 2.45,2.37
燕麦 4.45 1.75,1.8
大麦 4.2 2.59,2.59
[0510] 表9.来自汇集的HvCslF6小麦T3全麦面粉的BG的DP3/DP4比
[0511]
[0512] 表10.用于在本氏烟叶片中瞬时表达Csl蛋白的二元载体的概述
[0513]
[0514] 表11.来自本氏烟叶片中瞬时表达的异源CslF6基因的BG的量和结构。
[0515]
[0516] 表12.来自本氏烟叶片中表达的CslF6基因的BG的量和结构(每构建体4个生物重复的平均值,(+/-s.d.))。
[0517]
[0518] 表13.再生的小麦植物的PCR分析和T1籽粒中AsCslF6转基因表达以及BG含量
[0519]
[0520]
[0521] 表14.表达AsCslF6的T2小麦籽粒的BG含量、DP3/DP4比和平均籽粒重量
[0522]
[0523] 表15.来自HvCslF6和AsCslF6全籽粒面粉的BG的溶解度
[0524]
[0525] 表16.来自用表达HvCslF6或AsCslF6的构建体转化的小麦籽粒的面粉中的纤维和纤维组分(%w/w=g/100g)
[0526]
[0527]
[0528] 表17.用CslF6和CslH两种构建体转化的籽粒的组成
[0529]
[0530] 表18.由用表达HvCslH的构建体转化的小麦籽粒制成的小麦面粉和松饼的组成
[0531]
[0532] 表19.从用表达来自大麦或燕麦的CslF6多肽的构建体转化的籽粒制成的转基因小麦面粉中BG的水溶解度,如无热灭活步骤确定的(实施例21)。
[0533]
[0534]
[0535] 表21.通过嵌合CslF6基因(BglII-EcoRI片段)产生的BG的DP3/DP4比
[0536]质粒 基因或BglII-EcoRI融合体 DP3/DP4 标准差
pSJ226 Hv CslF6wt 1.40 0.01
pSJ195 Zm CslF6wt 1.07 0.01
pSJ197 Sb CslF6wt 0.90 0.01
pSJ175 As CslF6wt 1.09 0.00
pSJ135 Bd CslF6wt 1.74 0.01
pSJ227 Hv-Zm CslF6 1.11 0.01
pSJ228 Zm-Hv CslF6 1.48 0.00
pSJ237 Sb-Bd CslF6 1.32 0.01
pSJ238 As-Hv CslF6 1.44 0.01
pSJ239 As-Bd CslF6 1.54 0.01
pSJ240 Bd-Zm CslF6 1.18 0.01
pSJ241 Bd-Hv CslF6 1.51 0.01
pSJ242 Zm-Bd CslF6 1.46 0.00
pSJ243 As-Zm CslF6 1.18 0.01
[0537] 表22.通过嵌合CslF6基因(BglII-XbaI or XbaI-EcoRI片段)产生的BG的DP3/DP4比
[0538]质粒 基因融合体 DP3/DP4 标准差
pSJ226 HvCslF6wt 1.41 0.01
pSJ227 Hv/Zm CslF6BglII-EcoRI 1.09 0.05
pSJ247 Hv/Zm CslF6XbaI-EcoRI 1.44 0.08
pSJ249 Hv/Zm/Hv CslF6BglII-XbaI 1.03 0.04
pSJ195 ZmCslF6-2wt 1.10 0.01
pSJ228 Zm/Hv CslF6BglII-EcoRI 1.47 0.08
pSJ248 Zm/Hv CslF6XbaI-EcoRI 1.12 0.01
pSJ250 Zm/Hv/Zm CslF6BglII-XbaI 1.45 0.04
- 大麦面粉 2.51 0.01
[0539] 表23.通过嵌合CslF6基因(BglII-XbaI gBlock片段)产生的BG的DP3/DP4比
[0540]质粒 基因融合体 DP3/DP4 标准差
pSJ195 ZmCslF6-2wt 1.04 0.05
pSJ226 HvCSlF6wt 1.39 0.01
pSJ253 HvCslF6+HvZmbx 1.24 0.03
pSJ254 HvCslF6+ZmHvbx 1.10 0.02
pSJ255 ZmCslF6-2+HvZmbx 1.35 0.01
pSJ256 ZmCslF6-2+ZmHvbx 1.09 0.04
pSJ245 HvCslF6+XbaI 1.37 0.01
pSJ246 ZmCslF6-2+XbaI 1.06 0.01
pSJ252 HvZmCslF6PstI交换 1.02 0.00
标准 大麦面粉 2.55 0.01
[0541] 表24.通过嵌合CslF6基因(PstI-XbaI gBlock片段)产生的BG的DP3/DP4比。
[0542]质粒 基因 融合体 DP3/DP4 标准差 BG%
pSJ245 HvCslF6 wt 1.37 0.02 0.95
pSJ246 ZmCslF6 wt 1.09 0.01 1.40
pSJ259 HvZmCslF6 5'半PstI-XbaI 1.06 0.02 1.33
pSJ260 ZmHvCslF6 5'半PstI-XbaI 1.36 0.02 0.63
pSJ265 HvCslF6 G-A 1.41 0.00 1.01
pSJ266 HvCslF6 S-A 1.35 0.01 0.70
pSJ267 HvCslF6 V-I 1.39 0.02 1.36
pSJ268 HvCslF6 I-L 1.13 0.01 1.47
pSJ269 HvCslF6 GS-AA 1.38 0.01 0.73
           
标准 大麦面粉   2.58 0.02 4.10
[0543] 参考文献:
[0544] Abell等(2004).Br J Nutr 105:1480-1485。
[0545] Alvarez等,(2006).Plant Cell 18:1134-1151。
[0546] Aman等(1987).Journal of Agricultural and Food Chemistry35:704-709。
[0547] Bechtold等,(1993).C.R.Acad.Sci.Paris,316:1194-1199。
[0548] Beresford等(1983).Journal of Cereal Science1:111-114。
[0549] Bird等(2007)Br J Nutr97:134-144。
[0550] Bird等(2008).Br J Nutr99:1032-1040。
[0551] Bird等(2009).Digestive Diseases and Sciences54:947-954。
[0552] Buckeridge等(2004).Cereal Chemistry81:115-127。
[0553] Burton等,(2011).Plant Biotechnol J9:117-135。
[0554] Burton等,(2008).Plant Physiology146:1821-1833。
[0555] Burton等(2006).Science311:1940-1942。
[0556] Cadwell and Joyce(1992)PCR Methods Appl.2:28-33。
[0557] Carpita等,(2007).Proc Nat Acad of Sci USA104:8550-8555。
[0558] Chen等,(2009)Plant Physiology 150:1111-1121。
[0559] Cheng等,(1997).Plant Physiol 115:971-980。
[0560] Clarke等,(2008).Funct Integr Genomics8:211-221。
[0561] Coco等(2001)Nature Biotechnology19:354-359。
[0562] Coco等(2002)Nature Biotechnology20:1246-1250。
[0563] Coles.(1979).Carlsberg Research Communications44:439-453。
[0564] Colleoni-Sirghie et al.,(2003).Carbohydrate Polymers54:237-249。
[0565] Crameri等(1998)Nature391:288–291。
[0566] Cui等(2000).Carbohydrate Polymers41:249-258。
[0567] Dhugga等(2004).Science303:363-366。
[0568] Doblin等(2009).Proc Nat Acad of SciUSA106:5996-6001。
[0569] Eagles等(2001).Aust J Agric Res.52:1349-1356。
[0570] Eggert等(2005)Chembiochem6:1062-1067。
[0571] Fincher and Stone.(2004).In:Wrigley C,Corke H,Walker C,编著Encyclopedia of Grain Science卷1.Oxford:Elsevier Academic Press,206-223页。
[0572] Fincher.(2009a).Current Opinion in Plant Biology12:140-147。
[0573] Fincher.(2009b).Plant Physiology149:27-37。
[0574] Frommet al.,(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A,82:5824-5828.
[0575] Gibeaut等(2005).Planta221:729-738。
[0576] Guillon等(2011).Journal of Experimental Botany62:1001-1015。
[0577] Harayama(1998)Trends Biotechnol.16:76-82。
[0578] Hartmann和Endres,(1999).Manual of Antisense Methodology,Kluwer
[0579] Haseloff和Gerlach(1988).Nature334:585-591。
[0580] Hazen等(2002).Plant Physiology128:336-340。
[0581] Hellinga(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:10015-10017。
[0582] Henikoff等(2004)Plant Physiol.135:630-636。
[0583] Henry(1987).J.Cereal Science6:253-258。
[0584] Hinchee等(1988)Biotech.6:915-922。
[0585] Izydorczykand Dexter(2008).Food Res Internat41:850-868。
[0586] Jézéquel等(2008)Biotechniques45:523–532。
[0587] Jonnalagadda等(2011).Journal of Nutrition141:1011S-1022S。
[0588] Kanna and Daggard(2003).Plant Cell Rep 21:429-436。
[0589] Klein等,(1987).Nature327:70-73。
[0590] Kirsten等,(1984).J.Agric.Food.Chem.32:279-284。
[0591] Langridge等,(2001)Aust J Agric Res52:1043-1077
[0592] Lazaridou等(2007).Journal of Cereal Science46:101-118。
[0593] Lazo et al.,(1991).Biotechnology(N Y).9:963-967。
[0594] Lee等(1992).Journal of AOAC International75:395-416。
[0595] Leung等(1989)Technique1:11-15。
[0596] Liepman等(2007).Plant Physiology143:1881-1893。
[0597] McCleary等(1985).J.Inst.Brew.91:285-295。
[0598] McCleary等,(1994).J.Cereal Science20:51-58.
[0599] Morgan等(2013)Nature493:181-187。
[0600] Murray等(1980).Nucleic Acids Res8:4321-4325.
[0601] Needleman and Wunsch(1970).J Mol Biol.48:443-453。
[0602] Nemeth等(2010).Plant Physiology152:1209-1218。
[0603] Ness等(2002)Nature Biotechnology20:1251-1255。
[0604] Niedz等(1995)Plant Cell Reports14:403-406。
[0605] O'Shea等(1998).Carbohydrate Research307:1-12。
[0606] Ostermeier等(1999)Nature Biotechnology17:1205-1209。
[0607] Ow等(1986)Science234:856-859。
[0608] Palatnik等,(2003).Nature 425:257-263。
[0609] Parizotto等,(2004).Genes Dev 18:2237-2242。
[0610] Pellegrineschi等(2004).Genome47:493-500。
[0611] Perriman等(1992)Gene113:157-163。
[0612] Philippe等(2006a).Journal of Agricultural and Food Chemistry54:2303-2308。
[0613] Philippe等(2006b).Planta224:449-461。
[0614] Prasher等(1985)Biochem.Biophys.Res.Comm.126:1259-1268。
[0615] Reddy and Appels.(1993).Theoretical and Applied Genetics85:616-624。
[0616] Regina等(2006).Proc Natl Acd Sci USA103:3546-3551。
[0617] Schwab et al.,(2006).Plant Cell 18:1121-1133。
[0618] Seefeldt等(2009).Journal of Cereal Science49:24-31。
[0619] Sharp et al(2001).Aust J Agric Res.52:1357-1366。
[0620] Shimamotoet al.,(1989).Nature 338:274-276。
[0621] Shippy等,(1999)Mol.Biotech.12:117-129。
[0622] Sieber等(2001)Nature Biotechnology19:456-460。
[0623] Slade和Knauf(2005)Transgenic Res.14:109-115。
[0624] Smith等(2000).Nature407:319-320。
[0625] Sparks和Jones(2004).In Transgenic Crops of the World-Essential protocols,Ed.IP Curtis,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,Netherlands,19-34页。
[0626] Stemmer(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751。
[0627] Stemmer(1994b)Nature370:389-391。
[0628] Stone BA.(2006).Cereal Foods World51:62-65。
[0629] Tanaka等(1990).Nucl Acids Res.18:6767-6770。
[0630] Theanderet al.,(1995).J of AOAC International.78:1030-1044。
[0631] Topping D.(2007).Journal of Cereal Science46:220-229。
[0632] Tosh等(2004).Carbohydrate Polymers57:249-259。
[0633] Trethewey等(2005).American Journal of Botany92:1660-1674。
[0634] Trethewey和Harris.(2002).New Phytologist154:347-358。
[0635] Tsuchiya等(2005).Physiologia Plantarum125:181-191。
[0636] Vasil等(1990).Bio/Technol8:429-434。
[0637] Volkov等(1999)Nucleic Acids Research27:e18。
[0638] Waterhouse等(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964。
[0639] Weiret al.,(2001).Aust J Plant Physiol 28:807-818。
[0640] Wood等(2009).Plant Biotechnology Journal7:914-924。
[0641] Wood等(1991).Cereal Chemistry68:31-39。
[0642] Wu等,(2003).Plant Cell Rep 21:659-668。
[0643] Yu和Morrison(2004).BioTechniques36:808-812。
[0644] Zhao等(1998)Nature Biotechnology16:258–261。
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