含有红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物专利检索-骨密度解剖与生理专利检索查询-专利查询网

含有红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物

阅读：1026发布：2020-07-28

专利汇可以提供含有红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及以由红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物组成的复合物作为有效成分含有的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，本发明的食品组合物以由天然提取物组成的复合物作为有效成分含有，因而无毒性和副作用，且对人体无害。并且，本发明的食品组合物具有优秀的造骨细胞增进效果、促进造骨细胞活性及分化效果，增加胰岛素样生长激素 ‑1(IGF‑1)基因及骨形态发生蛋白‑2(BMP‑2)基因的表达效果，因而可有助于促进生长期儿童的身高增长。，下面是含有红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，其特征在于，含有由50重量百分比的红花籽提取物、33.3重量百分比的乳香提取物及16.7重量百分比的黄芩提取物组成的复合物，或者，由50重量百分比的红花籽提取物、16.7重量百分比的乳香提取物及33.3重量百分比的黄芩提取物组成的复合物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，其特征在于，上述红花籽提取物、乳香提取物或黄芩提取物以水、碳数为1至4的低级醇或它们的混合物作为提取溶剂提取而成。
3.根据权利要求1所述的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，其特征在于，在食品组合物总量中，包含0.01～50重量百分比的上述复合物。

说明书全文

含有红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物作为有效成分

的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，更加具体地，含有由红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物组成的复合物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物。

背景技术

[0002] 随着对外貌关注度的提高，当前社会成为高个儿具有竞争力的时代。这种社会氛围表现为身高对儿童造成压力，父母关注儿童的身高增长。但是，虽然许多生长期儿童希望长到男180cm、女165cm，但韩国成人男女的平均身高为男174cm、女161cm，因而实际情况为所期望的身高与实际平均身高之间存在差异。并且，现代社会西方化的饮食习惯使方便食品、精加工食品增加，因而在加工食品的制造过程中导致微量营养素消失等营养不均衡。并且，因过量使用化学调味料、发色剂、防腐剂等而造成体内动态平衡的扭曲，从而出现幼儿或生长期儿童的身高增长受阻，或促进成人病的早期发生等副作用。

[0003] 另一方面，生长是指细胞的数量得到增加、骨骼和肌肉得到增强，并且不仅仅带来身高的增加，还使身体各个器官的解剖学及形态学方面的大小和功能得到增加。如上所述的生长通过激素的作用来实现。由脑垂体生成的生长激素重点作用于肝，但除此之外，通过作用于骨头的生长板、性腺、脂肪组织等来诱导作为中间产物的胰岛素样生长因子(胰岛素样生长激素-1(IGF-1)，Insulin-likegrowth Factor-1)的生成。生长激素通过作用于靶细胞来诱导胰岛素样生长激素-1的生成和细胞的分化，之后，胰岛素样生长激素-1诱导细胞的增殖(Waters MJ et al.Clin Exp Pharmacol Physiol.1999.26：760-764)。因此，众所周知，生长激素的生理活性在很多方面与胰岛素样生长激素-1有关。

[0004] 一般情况下，在人的身高增长的过程中，被视为遗传方面的影响最大，但据有关研究结果报道，实际上遗传方面的影响占23％，剩余77％由后天的影响而定。因受到后天的影响而生长的身高通过接收适当的营养和体内激素的复合作用来实现，在这种外部、内部作用机理中，哪怕一种机理发生异常，也无法期待正常的生长。因此，为了实现正常的生长，重要的一点在于使激素分泌正常，并供给适当的营养。

[0005] 另一方面，作为针对小儿生长激素缺乏症、特纳综合症、因慢性肾功能衰竭而引起的身材矮小、普拉德-威利综合症、努南综合症、因子宫内发育迟缓而引起的身材矮小等生长激素缺乏症的治疗，使用生长激素治疗方法，这种方法被视为比较安全的治疗方法。并且，在现代医学上，在生长状态相同的年龄和性别组中若属于3个百分位数以内，则将其诊断为身材矮小症，并实施打生长激素的疗法。但是在使用于身材矮小症的激素疗法的情况下，被提出如下问题，即，可引起白血病、中枢神经类肿瘤、甲状腺功能减退症、癫痫、高血糖及糖尿病等多种副作用(Yang.J Korean Soc Endocrinol.2003.18：561-570)，在效果方面，个人之间的差异大，因而被提出相对于高价的治疗费，在生长效果方面的经济效率低下的问题。除此之外，需要每周打5～7次，这可能对需要几乎每天打针的儿童带来心理负担，并且治疗期间越长，生长效果越下降，因而需要继续增加以高用量使用的生长激素的用量，并且因无疾病的儿童使用治疗药剂而引起的伦理问题等。

[0006] 为了代替被提出上述问题的儿童身高增长用激素疗法，开发出可通过辅助营养均衡来促进身高增长的多种健康辅助食品，但仅仅停留在组合有助于生长的多种成分，因而不仅效果甚微，而且未考虑到因仅过于重视骨骼的生长而可能非正常地使服用人员的体内代谢活性化的副作用，因而实际上无法利用。

[0007] 另一方面，作为现有专利，在韩国公开专利第10-2009-0011654号(公开日：2009年02月02日)中记载有与含有黄芪、白术、白茯苓、陈皮、砂仁、当归及甘草的复合生药材提取物的生长促进食品组合物有关的技术。并且，在韩国授权专利第10-1376052号(授权日：
2014年03月13日)中记载有与骨长度增长促进用食品组合物有关的记载。上述骨长度增长促进用食品组合物含有在覆盆子中添加70％(v/v)乙醇并经过8小时的回流、加热来提取而成的覆盆子提取物作为有效成分。并且，在韩国授权专利第10-0890991号(授权日：2009年
03月23日)中记载有与骨长度增长促进用健康辅助食品有关的记载。上述骨长度增长促进用健康辅助食品含有由利用C1至C4的低级醇或及其水溶液提取的2重量份的续断及1重量份的杜仲组成的复合生药材提取物作为有效成分。

发明内容

[0008] 技术问题

[0009] 本发明的目的在于，开发并提供含有由红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物组成的复合物作为有效成分，从而具有优秀的骨长度增长促进效果及骨密度增加效果的食品组合物。

[0010] 解决问题的手段

[0011] 为了实现上述目的，本发明提供如下的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物，即，上述骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物的特征在于，含有由30～65重量百分比的红花籽提取物、10～40重量百分比的乳香提取物及10～55重量百分比的黄芩提取物组成的复合物。以如上所述的方式组成的复合物发挥优秀的造骨细胞增殖效果、增进造骨细胞分化及活性的效果，增加胰岛素样生长激素-1及骨形态发生蛋白-2基因的表达的效果。并且，相对于单一提取物的红花籽提取物、乳香提取物、黄芩提取物，以如上所述的方式组成的复合物呈现出更加优秀的活性。

[0012] 造骨细胞由间充质干细胞形成，通过造骨细胞的分化来形成钙等矿化不仅维持骨头的强度，而且对整个身体的钙及激素代谢的动态平衡也起到非常重要的作用。通过造骨细胞的分化来形成的钙由维生素D及甲状旁腺激素(parathyroid hormone)等进行调节。众所周知，以如下方式通过造骨细胞的分化来形成骨头，即，在细胞内通过骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein；BMP)、细胞外因子(Wnt)、细胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase)、钙调神经磷酸-钙调蛋白激酶(calcineurin-calmodulin kinase)、核转录因子(NF-kB，kB nuclear factor kappa B)、激活蛋白(AP-1，activator protein 1)等多种信号传递体系的相互作用，在初期分化阶段合成与造骨细胞的分化有关的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase；ALP)之后，合成与矿化有关的骨桥蛋白(osteopontin)、骨钙素(osteocalcin)、I型胶原等。作为用于激活如上所述的造骨细胞的促进剂，由于需要长期投药给患者，因而一般情况下优选毒性小且可以口服的促进剂，并要求开发无毒性的造骨细胞的活性促进用功能性食品。为此，本发明从无毒性及副作用的天然物质中研究发挥出促进造骨细胞活性效果的新的食品原料，最终导出了红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物的最佳配料比，并确认到由30～65重量百分比的红花籽提取物、10～40重量百分比的乳香提取物及10～55重量百分比的黄芩提取物组成的复合物具有优秀的骨长度增长促进效果及骨密度增加效果。

[0013] 另一方面，红花(safflower)为被称之为刺红花且属于菊科的一年生草本，在韩国、日本、中国等地以药用为主要目的来栽培红花。红花籽具有丰富的维生素(维生素E、B1、B2)及无机质(K、P、Ca、Mg)，并具有15～30％的脂质，若观察其脂肪酸的组成，则含有作为饱和脂肪酸的棕榈酸(palmitic acid)、棕榈油酸(palmitoeic acid)、硬脂酸(stearic acid)等和作为不饱和脂肪酸的油酸(oleic acid)、亚油酸(linoleic acid)、亚麻酸(linolenic acid)等，不饱和脂肪酸的含量为83～87％，这属于较高程度。尤其，含有69～79％的亚油酸，众所周知，亚油酸对降低成为诱发高血压和动脉硬化原因的胆固醇浓度方面具有很大的效果。

[0014] 乳香(boswellia)为从生长在印度高山地带的一种矮灌木树脂中提取的颗粒树脂，在印度，乳香在糖尿病、皮肤病、解热、神经性疾病、风湿病、腹泻等方面以药用来使用。当前，乳香被认定为具有非甾体抗炎镇痛效果的功能性食品。公知的乳香的主要成分有β-乳香酸(β-boswellic acid)、3-O-乙酰基-11-酮基-Β-乳香酸(AKBA)、萜类化合物(terpenoid)等，其中，β-乳香酸与防软骨细胞坏死、促进软骨细胞的增殖、抗炎反应等有关。

[0015] 黄芩(Scutellaria baicalensis)指黄芩的根，黄芩属于双子叶植物及唇形科的多年生草本植物的黄芩的根。其毒性小，主要成分分为30余种黄酮类化合物。作为这种黄芩的药理作用，具有解热作用、利尿作用、抗病毒作用、抗菌作用、镇静作用、降血压作用、提高血糖作用、利胆作用、肠道运动抑制作用、过敏反应(anaphylaxis)作用、抗炎作用、抗过敏作用、抗氧化作用及细胞免疫促进作用等，在中医学上，以这些作用为基础，作为各种中药的常用处方药，使用于70多种黄芩汤等。

[0016] 另一方面，优选地，上述红花籽提取物、乳香提取物或黄芩提取物以水、碳数为1至4的低级醇或它们的混合物作为提取溶剂提取而成。

[0017] 并且，作为上述红花籽提取物、乳香提取物或黄芩提取物的提取方法，可利用热水提取、冷浸提取、回流冷却提取或超声波提取方法来提取。

[0018] 并且，优选地，上述提取物包含在提取之后进行过滤、减压浓缩或真空浓缩来获取的浓缩物，可以呈通过冻结干燥或热风干燥来获取的粉末形态。

[0019] 并且，优选地，在食品组合物总量中，包含0.01～50重量百分比的上述复合物。若小于0.01重量百分比，则促进骨长度增长以及增加骨密度的效果甚微，若超过50重量百分比，则效果相对于使用量的增加甚微，因而并不经济。

[0020] 另一方面，优选地，本发明的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物为选自肉类、谷类、含咖啡因饮料、普通饮料、巧克力、面包类、点心类、饼干类、比萨、果冻、面类、口香糖类、冰淇淋类、维生素复合剂及其他健康辅助食品类中的一种，但并不局限于此。

[0021] 并且，优选地，本发明的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物还可包含通常使用于食品制造的适当的载体、赋形剂及稀释剂。作为载体、赋形剂及稀释剂，例如，可以为乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、蜂蜜、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁及矿物油。在进行制剂化的情况下，可使用通常使用的填充剂、重剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来配制。用于口服的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂通过在上述组合物中混合至少一种赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶来配制。并且，除了简单的赋形剂之外，还使用硬脂酸镁等多种润滑剂。悬浮剂、内用液剂、乳剂、糖浆剂等属于用于口服的液体制剂，除了作为通常使用的简单稀释剂的水、液体石蜡之外，还可包括多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保鲜剂等。

[0022] 并且，本发明的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物可含有多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、使用于碳酸饮料的碳化剂等。除此之外，还可含有用于制作天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这种成分可以独立或通过组合来使用。这种添加剂的比率不太重要，但相对于100重量份的本发明的复合物，通常会在0～50重量份的范围内进行选择。

[0023] 发明的效果

[0024] 本发明可提供含有由红花籽提取物、乳香提取物及黄芩提取物组成的复合物作为有效成分，从而具有优秀的骨长度增长促进效果及骨密度增加效果的食品组合物。

[0025] 并且，本发明可提供含有由无毒性及副作用、且对人体无害的天然提取物组成的复合物作为有效成分的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物。

[0026] 并且，本发明的骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物具有优秀的造骨细胞增进效果、促进造骨细胞的活性及分化的效果、增加胰岛素样生长激素-1基因及骨形态发生蛋白-2基因的表达效果，因而可有助于促进生长期儿童的身高增长。附图说明

[0027] 图1为确认复合物对造骨细胞的增殖产生的影响的实验结果的图表。

[0028] 图2为为了确认复合物对造骨细胞活性产生的影响而对碱性磷酸酶(碱性磷酸酶)的活性进行测定的实验结果的图表。

[0029] 图3为为了确认复合物对造骨细胞的分化产生的影响而通过茜素红染色对钙化程度进行测定的实验结果的图表。

[0030] 图4为确认复合物对胰岛素样生长激素-1基因的表达产生的影响的实验结果的图表。

[0031] 图5为确认复合物对骨形态发生蛋白-1(BMP-1)基因的表达产生的影响的实验结果的图表。

具体实施方式

[0032] 以下，通过以下实施例具体说明本发明的结构。但是，本发明的权利范围并不仅仅局限于以下实施例，还将与其等同的技术思想的变形也包括在内。

[0033] 制备例1：红花籽提取物的制备

[0034] 在干燥1kg红花籽之后，将经磨碎而成的300g粉末装在集气瓶，之后投入3L的水，并在90℃下经过6小时的时间反复提取3次，由此获得了红花籽提取物。之后，在用滤纸(whatman No.1，England)减压、过滤之后，利用真空旋转浓缩机在60℃下进行减压并浓缩，之后，进行热风干燥来制备出红花籽提取粉末。

[0035] 制备例2：乳香提取物的制备

[0036] 在将300g乳香树胶脂装在集气瓶之后，投入1.8L的95％酒精，并在70℃下经过6小时的时间反复提取3次，由此制备出乳香提取物。之后，在利用滤纸进行减压、过滤之后，利用真空旋转浓缩机在60℃下进行减压并浓缩，之后进行热风干燥来制备出乳香提取粉末。

[0037] 制备例3：黄芩提取物的制备

[0038] 在干燥1kg黄芩之后，将经磨碎而成的300g粉末装在集气瓶，之后投入3L的水，并在90℃下经过6小时的时间反复提取3次，由此获得了黄芩提取物。之后，在用滤纸减压、过滤之后，利用真空旋转浓缩机在60℃下进行减压并浓缩，之后，进行热风干燥来制备出黄芩提取粉末。

[0039] 实施例1至4：复合物的制备

[0040] 对于通过上述制备例1至3制备的红花籽提取粉末、乳香提取粉末、黄芩提取粉末，按重量比以如下表1的方式改变配料比来制备出复合物。

[0041] 表1

[0042]

[0043] 实验例1：确认复合物对造骨细胞生存率产生的影响

[0044] 本实施例中所要确认通过制备例1制备的单一提取物和通过实施例1至4制备的复合物对造骨细胞生存率产生的影响。

[0045] (1)造骨细胞的培养

[0046] 造骨细胞的MG-63细胞株从美国组织细胞收藏中心(ATCC，American Tissue Culture Collection)购进并用于实验。以如下方式培养出MG-63细胞，即，在10％的空腹血糖(FBS)(HycloneLaboratories，Logan，Utah，USA)和最低必需培养基(MEM，minimal essential medium)(美国组织细胞收藏中心)中添加1％的青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin，HycloneLaboratories，Logan，Utah，USA)、1％的L-谷氨酰胺(L-glutamine，HycloneLaboratories，Logan，Utah，USA)、0.1％的庆大霉素(Gentamycin，Gibco，Grand Island，N.Y，USA)，并装入于75T烧瓶后在37℃、5％CO2的条件下进行了培养。之后，通过每两天更换一次培养基，并约在第4～5天时进行传代来使用细胞。

[0047] (2)确认复合物对造骨细胞生存率产生的影响

[0048] 将MG-63细胞分株于以1×104细胞/孔(cells/well)的浓度在96-孔板(96-well plate)内添加10％空腹血糖的最低必需培养基的培养液，并在经过12小时的稳定化之后，通过使试样(制备例1至3、实施例1至4)溶解于0.2％的二甲基亚砜来处理成5μg/ml的浓度，之后进行48小时的培养。经过培养之后，利用20μl的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)试液对各个孔(well)进行了处理，并在37℃的培养箱(incubator)内最长培养3小时，之后，去除培养基和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐试液，并添加200μl的二甲基亚砜(DMSO)，之后在560nm下利用酶标仪(ELISAreader)(VERSAMAXSL-20Molecular Devices，Seoul，Korea)测定出吸光度，通过测定3次来计算出其平均值和标准误差。将未处理试样的组作为对照组，并将其结果示出在下表2中。

[0049] 表2

[0050] 细胞生存率(％)
对照组 100±10.4
实施例1 118.4±12.1
实施例2 162.9±8.1
实施例3 130.5±5.0
实施例4 108.4±12.9
制备例1 117.5±7.1
制备例2 110.5±9.2
制备例3 102.7±13.3

[0051] 实验结果，可以确认到复合物相对于单一提取物(红花籽提取物、乳香提取物、黄芩提取物)呈现出更高的造骨细胞生存率。并且，在复合物中可以确认到实施例2(50重量百分比的红花籽提取物、33.3重量百分比的乳香提取物、16.7重量百分比的黄芩提取物)呈现出最高的造骨细胞生存率。以下，利用呈现出最优秀效果的实施例2来进行实验。

[0052] 实验例2：确认复合物对造骨细胞增殖产生的影响

[0053] 本实施例中所要确认复合物对造骨细胞的增殖产生的影响。

[0054] 将MG-63细胞分株于以1×104细胞/孔的浓度在96-孔板内添加10％的空腹血糖的最低必需培养基的培养液，并在经过12小时的稳定化之后，通过使复合物(实施例2)溶解于0.2％的二甲基亚砜来分别以0、1、5、10、20、30、40μg/μl的浓度进行处理，之后进行48小时的培养。经过培养之后，利用20μl的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐试液对各个孔进行了处理，并在37℃的培养箱内最长培养3小时，之后，去除培养基和3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐试液，并添加200μl的二甲基亚砜，之后在560nm下利用酶标仪测定出吸光度，通过测定3次来计算出其平均值和标准误差。将未处理试样的组作为对照组。

[0055] 实验结果，以未处理复合物的对照组为基准，可以确认到MG-63细胞的增殖在处理复合物的所有浓度下均有增加。尤其可以确认到除了40μg/μl浓度之外的所有处理浓度细胞的增殖比对照组显著增加。可从如上所述的结果确认到复合物不呈现细胞毒性，且具有优秀的造骨细胞增殖效果(图1)。

[0056] 实验例3：确认复合物对造骨细胞的活性产生的影响-对碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性的测定

[0057] 本实施例中为了确认复合物对造骨细胞的活性产生的影响而对碱性磷酸酶的活性进行了测定。

[0058] 造骨细胞在细胞膜具有碱性磷酸酶(ALP)，上述酶在细胞的外膜和钙化组织中以高浓度被发现，因而在钙化过程中起到搬运、细胞分裂及分化的调节作用，并被公知为造骨细胞的活性标志基因(Cancedda et al.Int Rev Cytol.1995.159：265-358)。

[0059] MG-63细胞分株于以1×104细胞/孔的浓度在96-孔板内添加10％空腹血糖的最低必需培养基的培养液，并在经过12小时的稳定化之后，通过将复合物(实施例2)分别以0、5、10、20、30μg/μl的浓度进行处理，之后进行48小时的培养。经过48小时的培养之后，去除培养基，并利用碱性磷酸酶测定试剂盒(Kit)对碱性磷酸酶的活性进行了测定。为了进行测定，利用abcam公司的碱性磷酸酶测定试剂盒(Alkaline Phosphatase Assay Kit)(abcam，Massachusetts，USA)来按照制备公司的方法进行实验，之后利用酶标仪进行了测定。

[0060] 实验结果，可以确认到未处理复合物的对照组的碱性磷酸酶活性为56.31U/ml，与此相比，在按浓度处理复合物的细胞中，碱性磷酸酶的活性增加了20％以上。尤其可以确认到在10μg/μl和20μg/μl下，碱性磷酸的酶活性分别为76.88U/ml和75.88U/ml，因而增加了25％以上。可从如上所述的结果确认到复合物具有优秀的促进造骨细胞活性的效果(图2)。

[0061] 实验例4：确认复合物对造骨细胞的分化产生的影响-通过茜素红染色(Alizarin-red staining)测定钙化(mineralization)

[0062] 本实施例中为了确认复合物对造骨细胞分化产生的影响而通过茜素红染色(Alizarin-red staining)测定出钙化(mineralization)程度。

[0063] 随着骨长度增长而形成骨头，从而发生造骨细胞的分化，此时出现的钙化程度成为细胞分化的重要指标(Goldstein et al.New York：McGraw-Hill.2001.2863-2913)。

[0064] 将MG-63细胞分株于以5×105细胞/孔的浓度在6-孔板(6-well plate)内添加10％的空腹血糖的最低必需培养基的培养液，并在经过12小时的稳定化之后，通过使复合物(实施例2)分别以0、5、10、20、30μg/μl的浓度进行处理，之后进行6天的培养。经过培养之后，去除培养基并利用磷酸缓冲液(PBS)进行清洗，之后利用4％的多聚甲醛
(paraformaldehyde)溶液在常温下固定15分钟，并去除多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液，之后进行了再一次清洗。在清洗完后，利用1ml的2％的茜素红S(Alizarin Red S)溶液进行处理，之后在常温下放置20分钟并进行了染色。之后，在利用磷酸缓冲液进行3～4次清洗之后向各个孔添加1ml的添加有10％(w/v)氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride)的10mM磷酸钠(sodium phosphate)溶液(pH＝7.0)，之后进行10分钟的溶解，并针对染色的程度，利用酶标仪在570nm下测定了吸光度。以未处理复合物的组作为对照组，并以对照组的吸光度为基准来计算出钙化程度。

[0065] 实验结果，可以确认到在按浓度处理复合物的细胞中，钙化程度相对于未处理复合物的对照组显著增加，尤其在10μg/μl和20μg/μl下，钙化度分别增加了22.49％及27.36％。可从如上所述的结果确认到复合物的处理可使基于造骨细胞分化的钙化显著增加(图3)。

[0066] 实验例5：确认复合物对胰岛素样生长激素-1(Insulin-likegrowth Factor-1)、骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2)基因的表达产生的影响

[0067] 本实施例中为了确认复合物对胰岛素样生长激素-1和骨形态发生蛋白-2基因的表达产生的影响而实施了实时聚合酶链反应(Real-Time PCR)。

[0068] 胰岛素样生长激素-1作为与生长激素(growth hormone)具有很大关系的生长基因，由受到生长激素刺激的脑垂体分泌。众所周知，胰岛素样生长激素-1尤其在生长板对软骨细胞的增殖产生影响(Hallahan et al.Nat Med.2003.9：1033-1038)。并且，还通过对生长激素的表达机理进行干预来调节生长激素的表达过程，在人体大部分部位中对细胞的分化(differentiation)、增殖(proliferation)、成熟(maturation)进行调节(Schiller et al.Bone.2001.28：362-369)。

[0069] 骨形态发生蛋白-2作为属于转化生长因子-β(TGF-β，Transforminggrowth factor-β)总科(superfamily)的生长基因，对骨头的形成产生重要的影响(Stein et al.FASEB J.1990.4：3111-3123)。众所周知，尤其对称之为维甲酸(retinoid)的负责软骨细胞的增殖的物质进行调节(Wang EA et al.Proc Natl Acad SciUSA.1990.87：2220-2224)，还通过抑制称之为重组人头蛋白(noggins)的骨形成抑制基因来促进骨形成(Stein et al.FASEB J.1990.4：3111-3123)。

[0070] 将MG-63细胞分株于以5×105细胞/孔的浓度在6-孔板内添加10％的空腹血糖的最低必需培养基的培养液，并在经过12小时的稳定化之后，通过使复合物(实施例2)分别以0、5、10、20、30μg/μl的浓度进行处理，之后进行6天的培养。之后收集细胞并以RNeasy试剂盒(RNeasy extraction kit)(QIAGEN，Germantown，Maryland，USA)制造公司的方法提取出总核糖核酸(total RNA)。之后，为了合成互补脱氧核糖核酸(cDNA)而利用选择型互补脱氧核糖核酸合成试剂盒(iScript Select cDNASynthesis Kit)(BIO-RAD，Singapore，Singapore)来在5μg的总核糖核酸中分别放入4μl的5×选择型反应混合物(iScript select reaction mix)、2μl的Oligo(dT)引物组、5μl的RNA样本(sample)及8μl的无核酸酶水(Nuclease-Free Water)，并在最后放入1μl的iScript Reverse Transcriptase之后进行了均匀的混合。之后，在42℃下进行60分钟的反应，在85℃下进行5分钟的反应，将由此合成的互补脱氧核糖核酸使用于聚合酶链式反应(PCR)。作为在进行实时定量荧光(Real-Time)PCR实验时所使用的机器为“Step One Real-Time PCR system(Applied
Biosystems，Foster，CA，USA)”，并根据“iQ SYBRgreen Supermix(BIO-RAD，Singapore，Singapore)”的方法进行。作为用于聚合酶链式反应的混合液的最终浓度，使互补脱氧核糖核酸达到2μl(10～100ng)，使2×iQ SYBRgreen Supermix达到10μl，使正向和反向引物分别达到1μl(250nm)，使H2O达到7μl。在95℃下进行10分钟的热处理之后，以分别在95℃下进行15秒钟，在58℃下进行15秒钟，在72℃下进行30秒钟的方式进行40个循环(cycling)的聚合酶链式反应，并在最后分别在95℃进行15秒钟，在60℃下进行1分钟，在95℃下进行15秒钟的收尾过程来对聚合酶链式反应进行了分析。使用于反应的引物(Primer)如下表3。

[0071] 表3

[0072]

[0073] 对胰岛素样生长激素-1进行测定的结果，可以确认到相对于对照组，在分别以20μg/μl和30μg/μl处理复合物的细胞中，胰岛素样生长激素-1的表达分别增加1.3倍及1.5倍(图4)。

[0074] 在对骨形态发生蛋白-2的表达量的测定结果，可以确认到相对于对照组，在分别以20μg/μl和30μg/μl处理复合的细胞中，骨形态发生蛋白-2的表达分别增加1.6倍及1.7倍(图5)。

[0075] 可从如上所述的结果确认到复合物发挥优秀的造骨细胞的分化及增殖效果。

[0076] 实施例5：骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物的制备

[0077] 本实施例中以如下方式制备出骨长度增长促进及骨密度增加用食品组合物。

[0078] (1)禅食的制作

[0079] 通过公知的方法对糙米、大麦、糯米、薏米进行糊化、干燥并分配，之后利用粉碎机准备成粒度为60目的粉末。在通过公知的方法分别对黑豆、黑芝麻及苏子进行蒸、干燥，之后经过分配及粉碎来准备成粒度为60目的粉末。之后，对30重量百分比的糙米、15重量百分比的薏米、20重量百分比的大麦、9重量百分比的糯米、7重量百分比的苏子、8重量百分比的黑豆、7重量百分比的黑芝麻、3重量百分比的复合物(实施例2)、0.5重量百分比的灵芝及0.5重量百分比的地黄进行混合来制作出禅食。

[0080] (2)口香糖的制作

[0081] 对20重量百分比的胶基、76.9重量百分比的砂糖、1重量百分比的香料、2重量百分比的水及0.1重量百分比的复合物(实施例2)进行配合，并以通常的方法制作出口香糖。

[0082] (3)糖果的制作

[0083] 对60重量百分比的砂糖、39.8重量百分比的糖稀、0.1重量百分比的香料及0.1重量百分比的复合物(实施例2)进行配合，并以通常的方法制作出糖果。

[0084] (4)饼干的制作

[0085] 对25.59重量百分比的1级低筋粉、22.22重量百分比的1级中筋粉、4.80重量百分比的精白糖、0.73重量百分比的食盐、0.78重量百分比的葡萄、11.78重量百分比的棕榈起酥油、1.54重量百分比的铵、0.17重量百分比的碳酸氢钠、0.16重量百分比的亚硫酸氢钠、1.45重量百分比的米粉、0.0001重量百分比的维生素B1、0.0001重量百分比的维生素B2、
0.04重量百分比的奶香粉、20.6998重量百分比的水、1.16重量百分比的全脂奶粉、0.29重量百分比的代乳奶粉、0.03重量百分比的过磷酸钙、0.29重量百分比的撒布盐、7.27重量百分比的喷雾油及1重量百分比的复合物(实施例2)进行配合，并以通常的方法制作出饼干。

[0086] (5)健康饮料的制作

[0087] 对0.26重量百分比的蜂蜜、0.0002重量百分比的硫辛酰胺、0.0004重量百分比的烟酰胺、0.0001重量百分比的核黄素盐酸钠、0.0001重量百分比的盐酸吡哆醇、0.001重量百分比的肌醇、0.002重量百分比的邻位酸、98.7362重量百分比的水及1重量百分比的复合物(实施例2)进行配合，并以通常的方法制作出健康饮料。

[0088] (6)香肠的制作

[0089] 对65.18重量百分比的猪肉、25重量百分比的鸡肉、3.5重量百分比的淀粉、1.7重量百分比的大豆蛋白、1.62重量百分比的食盐、0.5重量百分比的葡萄糖、1.5重量百分比的甘油及1重量百分比的复合物(实施例2)进行配合，并以通常的方法制作出香肠。

[0090] (7)健康辅助食品的制作

[0091] 对50重量百分比的复合物(实施例2)、16重量百分比的瓜尔豆酶解物、0.01重量百分比的维生素B1盐酸盐、0.01重量百分比的维生素B6盐酸盐、0.23重量百分比的DL-蛋氨酸、0.7重量百分比的硬脂酸镁、31.2重量百分比的乳糖及1.85重量百分比的玉米淀粉进行配合，并以通常的方法制作出片剂型健康辅助食品。

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