利用共振光散射的集成视觉形态和细胞蛋白表达
阅读：581发布：2021-09-07
专利汇可以提供利用共振光散射的集成视觉形态和细胞蛋白表达专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及通过检测功能化 纳米粒子 的共振光散射来检测细胞 生物 标记物签名和集成细胞生物标记物形态轮廓。，下面是利用共振光散射的集成视觉形态和细胞蛋白表达专利的具体信息内容。
1.一种检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的所述功能化纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
(c)将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
(d)用落射照明或瞬逝光照射所述功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合功能化纳米粒子的共振光散射，以获得每一成像细胞的生物标记物签名；
(e)使所述衬底粘着的细胞与光学对比剂接触；
(f)使所述接触细胞的形态特征成像；和
(g)使所述接触细胞的所述形态特征与每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名相关联以检测每一细胞的所述生物标记物形态轮廓。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记物存在于所述细胞表面上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记物存在于所述细胞内。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记物选自以下各项：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT和FMC-7。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学对比剂是隐色染料。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述隐色染料是红色隐色染料、亚甲基蓝、结晶紫、酚酞、百里酚酞或亚甲基绿。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学对比剂是选自以下的细胞染色剂：吉姆萨染色剂、赖德染色剂、赖德-吉姆萨染色剂、迈-格林华染色剂、马氏三色、过碘酸-希夫反应染色剂、魏格特氏弹性纤维染色剂、海登汉氏AZAN三色染色剂、地衣红染色剂、马森三色、阿新蓝染色剂、迈-格林华-吉姆萨、万吉森染色剂、汉氏染色剂、网硬蛋白染色剂、革兰氏染色剂、比尔朔夫斯基染色剂、铁蛋白染色剂、丰塔纳-马森染色剂、希尔胶体铁染色剂、五色染色剂、阿赞染色剂、罗克沙尔固蓝染色剂、高尔基氏法(还原银)、还原金、铬钒/苏木素染色剂、艾沙明蓝染色剂、亲银性染色剂、瓦辛斯-泰雷银染色剂、尼氏染色剂、苏丹黑和锇染色剂、四氧化锇染色剂、苏木素染色剂、乙酸双氧铀染色剂、柠檬酸铅染色剂、卡红染色剂、番红精染色剂和齐-尼染色剂。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述光学对比剂是选自以下的染料或着色剂：伊红Y、伊红B、天青B、派洛宁G、孔雀石绿、甲苯胺蓝、酞菁铜、阿新蓝、金胺-玫瑰红、酸性品红、苯胺蓝、橙黄G、酸性品红、中性红、苏丹黑B、吖啶橙、油红O、刚果红、固绿FCF、波尔斯普鲁士蓝反应、核固红、碱性红霉素B和萘黑。
9.根据权利要求1所述的方法，其中使所述与一或多种功能化纳米粒子物质接触的细胞经受外力以增加所述功能化纳米粒子和所述细胞的局部浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述外力是重力、电力或磁力。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述重力是通过离心生成。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述磁力是由顺磁性纳米粒子实现，其中所述纳米粒子的核心包含顺磁性区域且所述纳米粒子的外壳包含Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se、SiO2或其混合物或合金。
13.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(a)后将带电聚合物添加到所述细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中使所述接触细胞的形态特征成像包含测量所述光学对比剂的光学性质。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述光学对比剂的光学性质选自以下各项：吸光度、散射、荧光、光致发光、拉曼发射和光致发光寿命。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包含使用显微镜在亮视野照明下测量所述光学对比剂的光学性质。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述用瞬逝光照射所述功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到的功能化复合纳米粒子的所述共振光散射是使用显微镜在暗视野照明下进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其进一步包含使用经照射的载玻片架来代替所述显微镜中的暗视野聚光器。
19.根据权利要求18所述的方法，所述经照射的载玻片架进一步利用全内反射来照射所述载玻片架。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述经照射的载玻片架包含光纤以将光递送到载玻片的边缘。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子的直径为10nm到200nm。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子包含Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se或其混合物或合金。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述合金是Au和Ag的合金。
24.根据权利要求22所述的方法，其中包含所列示金属的混合物的所述纳米粒子进一步包含多个离散外壳或层。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述纳米粒子为球形、管形、圆柱形、锥形、立方体形、卵形、t骨形、海胆或玫瑰状(具有尖钉状不均匀表面)或中空形。
26.根据权利要求22所述的方法，其中包含Si的所述纳米粒子具有Si或SiO2外壳。
27.根据权利要求22所述的方法，其中包含Si的所述纳米粒子具有Au核心。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记物结合部分选自以下各项：抗体或其片段、纳米抗体、DNA适配体、DNA寡核苷酸、RNA适配体、PNA适配体、肽适配体、LNA适配体、碳水化合物和凝集素。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种功能化纳米粒子物质为2到50种不同种类的功能化纳米粒子物质。
30.根据权利要求29所述的方法，其中每种功能化纳米粒子物质经不同种类的生物标记物结合部分功能化。
31.根据权利要求30所述的方法，其中每种功能化纳米粒子物质经不同抗体功能化。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗体是单克隆或多克隆抗体或其片段或ScFv或单域抗体(纳米抗体)。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述单克隆抗体是针对细胞表面表达蛋白、蛋白片段、蛋白糖基化模式或蛋白碳水化合物的抗体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述单克隆抗体选自结合到以下的抗体：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD43、CD44、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、Her-2、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT和FMC-7。
35.根据权利要求30所述的方法，当所述功能化纳米粒子物质利用选自结合到以下中的一者的以下抗体的抗体功能化时：CD3、CD22、CD79a、κ、λ、Pax-5、ZAP-70、MPO和TdT，所述功能化纳米粒子物质进入所述细胞且结合到其相应细胞内生物标记物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞内生物标记物位于胞质液和/或核中或核膜上。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述功能化纳米粒子小到足以进入所述细胞而不破坏细胞膜。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述功能化纳米粒子小于16nm。
39.根据权利要求30所述的方法，其中每种功能化纳米粒子物质经不同DNA寡核苷酸功能化。
40.根据权利要求1所述的方法，其中所述形态特征包含细胞表面形状、细胞核形状、染色质形状、核仁形状、核仁数量或前述各者的组合。
41.根据权利要求40所述的方法，其进一步包含：
(h)基于每一细胞的所述生物标记物形态轮廓诊断所述个体的病况。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述个体的病况为患有血液癌症、非恶性血液病症、实体肿瘤、肾病、膀胱疾病、肝病或传染病。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述血液癌症选自：白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述非恶性血液病症选自：贫血和镰状细胞疾病。
45.根据权利要求42所述的方法，其中所述实体肿瘤选自：乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和膀胱癌。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述实体肿瘤是乳癌且所述生物标记物是Her2。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述肾病选自：急性肾损伤、慢性肾病、狼疮性肾炎、肾排斥和子痫前症。
48.根据权利要求42所述的方法，其中所述传染病选自：HIV、肝炎、性传播疾病和败血症。
49.根据权利要求42所述的方法，其中所述血液癌症进一步包含循环癌细胞。
50.根据权利要求42所述的方法，其中所述个体的病况进一步通过恶性病谱系来鉴别。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述恶性病的所述谱系是阴性、骨髓系、淋巴T细胞系或淋巴B细胞系。
52.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是白细胞。
53.根据权利要求1所述的方法，其中在使所述细胞与多种功能化纳米粒子物质接触之前去除至少50％的红细胞。
54.根据权利要求1所述的方法，其中获得所述生物标记物签名进一步包含对每个细胞的所述功能化纳米粒子物质中每一者的数量或比例进行计数。
55.根据权利要求54所述的方法，其中合计所述样品中已鉴别出正常或异常形态轮廓的细胞的数量或比例。
56.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所述功能化纳米粒子细胞复合物粘着到衬底进一步包含添加封固剂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述封固剂的体积为2微升。
58.根据权利要求55所述的方法，其中在步骤(d)中检测来自每一所观察到复合功能化纳米粒子的所述共振光散射进一步包含：
(i)使用软件程序对每个细胞的所述功能化纳米粒子物质中每一者的数量计数并处理视野中每一细胞的图像；
(ii)以数字方式移动所述视野；
(iii)使用软件程序对下一视野中每个细胞的所述功能化纳米粒子物质中每一者的数量计数并重复步骤(ii)和(iii)直到分析整个衬底区为止；
(iv)以数字方式组合所获得的所有图像以生成覆盖所述整个衬底区的单一图像；和(v)根据所获得的所述整个衬底区的数据生成每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述视野为5微米×5微米到100mm×100mm。
60.根据权利要求58所述的方法，其中在步骤(f)中使所述接触细胞的形态特征成像进一步包含：
(i)使用软件程序处理所述视野中每一细胞的形态特征的图像；
(ii)以数字方式移动所述视野；
(iii)使用软件程序处理所述下一视野中每一细胞的形态特征的图像并重复步骤(ii)和(iii)直到分析所述整个衬底区为止；
(iv)以数字方式组合所获得的所有图像以生成覆盖整个所选衬底区的单一图像；和(v)根据所获得的所述整个衬底区的所述数据生成每一衬底粘着细胞的所述形态特征以检测每一细胞的所述生物标记物形态轮廓。
61.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包含以下步骤：(d)(2)去除第一多个功能化纳米粒子；和(d)(3)使所述细胞与第二多个功能化纳米粒子物质接触。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述方法进一步包含在使所述细胞与第二多个功能化纳米粒子物质接触后，(d)(4)去除所述第二多个功能化纳米粒子；(d)(5)使所述细胞与第三多个功能化纳米粒子物质接触；和任选地(d)(6)去除先前多种功能化纳米粒子物质；和(d)(7)使所述细胞与下一种多个功能化纳米粒子接触，和任选地将步骤(d)(6)和(d)(7)重复0到10次的次数。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述去除第一多个功能化纳米粒子是通过裂解每种功能化纳米粒子与每种功能化纳米粒子相关生物标记物结合部分之间的可裂解连接体来实现。
64.根据权利要求61所述的方法，其中所述去除第一多个功能化纳米粒子是通过从所述生物标记物结合部分置换所述第一多个功能化纳米粒子来实现。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述去除所述第二或先前多种功能化纳米粒子是通过从所述生物标记物结合部分置换所述第二或先前多种功能化纳米粒子来实现。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述第一多个功能化纳米粒子中的每一纳米粒子物质与其相应生物标记物结合部分之间的连接体包含结合到第一纳米粒子物质的第一寡核苷酸和结合到其相应生物标记物结合部分的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸包含与所述第一寡核苷酸的一部分互补的部分且所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交形成包含双链核酸的连接体。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第二或下一种多个功能化纳米粒子中的每一功能化纳米粒子物质与其相应生物标记物结合部分之间的连接体包含分别结合到第二或下一功能化纳米粒子物质的第二或下一寡核苷酸和结合到其相应生物标记物结合部分的第三或下一寡核苷酸，其中所述第三或下一寡核苷酸包含与所述第二或下一寡核苷酸的一部分互补的部分且所述第二或下一寡核苷酸与所述第三或下一寡核苷酸杂交形成包含双链核酸的连接体。
68.根据权利要求64所述的方法，其中通过使第三寡核苷酸结合到所述第一寡核苷酸使每一功能化纳米粒子物质从其相应生物标记物结合部分置换，其中通过所述第三寡核苷酸和所述第一寡核苷酸杂交形成的所述杂合体展现高于通过所述第一和所述第二寡核苷酸杂交形成的所述双链核酸的熔融温度的熔融温度。
69.根据权利要求68所述的方法，其中将所述步骤(b)-(d)重复最多1次、2次、3次、4次、
5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次、30次、40次或50次或更多次。
70.根据权利要求65所述的方法，其中在从所述生物标记物结合部分置换所述第二或先前多种功能化纳米粒子后，进行以下步骤：
(i)使结合到所述细胞的所述功能化纳米粒子的所述生物标记物结合部分与经分类的所述生物标记物结合部分功能化纳米粒子相关联，和
(ii)使所述细胞与经不同生物标记物结合部分功能化的下一种多个纳米粒子接触，且所述下一种多个纳米粒子的每一功能化纳米粒子物质经不同生物标记物结合部分功能化，所述不同生物标记物结合部分结合到怀疑与其中存在第一生物标记物的样品相关的生物标记物。
71.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞彼此可为相同类型或不同类型。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述细胞彼此为不同类型。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞可来自不同病况。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述不同病况选自：患有血液癌症、非恶性血液病症、实体肿瘤、膀胱疾病、肝病、肾病或传染病。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述不同病况为患有不同类型的实体肿瘤。
76.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标记物结合部分是抗CD45，且所获得的所述生物标记物签名是白细胞计数。
77.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是活细胞。
78.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是经固定的。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述细胞用甲醛固定。
80.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬底选自：二氧化硅玻璃、透明聚合物、金或氧化铝。
81.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬底经功能化。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述衬底功能化是图案化。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述功能化是硅烷连接的细胞生物标记物、聚合物连接的细胞生物标记物、硅烷连接的胺、硅烷连接的羧酸、聚合物连接的胺、聚合物连接的羧酸、聚乙二醇PEG、氨基功能化聚葡萄糖、金、银、氧化铝或二氧化硅玻璃。
84.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品来自血液、骨髓、细针抽出物或组织。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述组织样品是FFPE(福尔马林固定、石蜡包埋)组织样品。
86.根据权利要求84所述的方法，其中当所述样品是组织时，所述光学对比剂是H&E(苏木素和伊红)染色剂。
87.一种检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的所述纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
(c)将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
(d)用非瞬逝光照射所述功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；
(e)使所述衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
(f)使所述接触细胞的形态特征成像；和
(g)使所述接触细胞的所述形态特征与每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名相关联以检测每一细胞的所述生物标记物形态轮廓。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述非瞬逝光为透射光。
89.一种检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)将所述细胞粘着到衬底；
(c)使所述衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
(d)使所述接触细胞的形态特征成像；
(e)将所述光学对比剂转化成无色形式；
(f)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，以形成纳米粒子-细胞复合物；
(g)用瞬逝光照射所述纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
(h)使所述接触细胞的所述形态特征与每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名相关联以检测每一细胞的所述生物标记物形态轮廓。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述光学对比剂是隐色染料。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述隐色染料是亚甲基蓝、亚甲基绿、红色隐色染料、结晶紫、酚酞或百里酚酞。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述隐色染料通过将一或多个电子添加到所述染料转化成无色形式。
93.根据权利要求91所述的方法，其中所述隐色染料通过从所述染料去除一或多个电子转化成有色形式。
94.一种检测生物标记物签名的试剂盒，组合包含多种生物标记物结合部分功能化纳米粒子物质。
95.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述功能化纳米粒子物质进一步包含：
(a)结合到第一寡核苷酸的纳米粒子物质；和
(b)结合到第二寡核苷酸的生物标记物结合部分，
其中所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的一部分互补，且所述第一和所述第二寡核苷酸形成杂交双链体。
96.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述功能化纳米粒子物质进一步包含：
(a)经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；
(b)经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分；和
第三寡核苷酸，
其中所述第一寡核苷酸与所述第三寡核苷酸的一部分互补，所述第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸的不同部分互补，且所述第一和所述第二寡核苷酸与所述第三寡核苷酸形成杂交的双链体。
97.一种检测生物标记物形态轮廓的试剂盒，组合包含多种功能化纳米粒子物质和光学对比剂。
98.根据权利要求94或97中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述多种功能化纳米粒子物质包含混合物。
99.根据权利要求94或97中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述多种功能化纳米粒子物质在使用前是分开的。
100.一种试剂盒，其包含多种功能化纳米粒子物质和封固剂。
101.根据权利要求100所述的试剂盒，其中所述封固剂具有在经固定细胞折射率的0.1内的折射率。
102.根据权利要求56所述的方法，其中所述封固剂具有在经固定细胞折射率的0.1内的折射率。
103.根据权利要求100到102中任一权利要求所述的试剂盒，其进一步包含光学对比剂。
104.一种增加功能化纳米粒子负载到细胞上的量的方法，其是通过使用外力增加所述功能化纳米粒子和所述细胞的局部浓度来进行。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述外力是离心力、电力或磁力。
106.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种纳米粒子展现400nm到900nm之间的纳米粒子等离子体共振的峰值共振波长。
107.一种检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，其中使用外力以加速纳米粒子-细胞复合物通过使包含生物标记物结合部分的所述纳米粒子物质结合到其相应生物标记物的形成；
(c)将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
(d)通过用瞬逝光照射所述纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测所述功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
(e)使每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的所述细胞的疾病、病况或状态。
108.一种检测功能化纳米粒子细胞复合物的均质分析，所述分析包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的所述纳米粒子物质结合到其相应生物标记物来形成功能化纳米粒子-细胞复合物；
(c)将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
(d)用瞬逝光照射所述功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名，
其中未从视野去除未结合的功能化纳米粒子。
109.一种检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使已固定的细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的所述纳米粒子物质结合到其相应生物标记物来形成纳米粒子-细胞复合物；
(c)将所述纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底，其中使所述粘着的功能化纳米粒子-细胞复合物与封固剂接触，其中所述封固剂的折射率在所述经固定细胞折射率的约0.1内；
(d)通过用瞬逝光照射所述纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测所述功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
(e)使每一衬底粘着细胞的所述生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的所述细胞的疾病、病况或状态。
110.根据权利要求109所述的方法，其中所述封固剂具有1.51到1.54的折射率。
111.一种检测功能化纳米粒子细胞复合物以获得生物标记物签名的方法，所述方法包含：
(a)提供包含来自个体的细胞的样品；
(b)使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的所述纳米粒子物质结合到其相应生物标记物来形成纳米粒子-细胞复合物；
(c)将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
(d)用瞬逝光照射所述功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
(e)使来自所述个体的成像细胞的所述生物标记物签名与展现与所述成像细胞生物标记物签名大体上相同的生物标记物签名的参考细胞的生物标记物签名相关联，其中在所述参考细胞生物标记物签名与参考个体的疾病、病症、病况或状态之间已建立诊断一致性。
112.根据权利要求1、87、89、104、108、109或111中任一权利要求所述的方法，其中提供包含来自个体的细胞的样品、使所述细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触和将所述功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底的所述步骤是通过自动化液体处置系统来执行。
113.根据权利要求107、108、109或111中任一权利要求所述的方法，其进一步包含获得并存储每一所观察到细胞的位置信息。
114.根据权利要求1、87或89中任一权利要求所述的方法，其进一步包含获得并存储每一所观察到和成像细胞的位置信息。
115.根据权利要求1所述的方法，其中所述纳米粒子制剂具有窄大小分布，使得个别纳米粒子制剂具有半最大全宽介于5nm到150nm范围内的散射光谱。
116.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能化纳米粒子存在于所述细胞表面上。
117.根据权利要求1所述的方法，其中所述功能化纳米粒子存在于所述细胞内。
利用共振光散射的集成视觉形态和细胞蛋白表达
[0001] 相关申请案
[0002] 本申请案主张于2015年10月7日提出申请的美国临时申请案第62/238,605号的权益，所述临时申请案的全部内容的全文均以引用方式并入本文中。
技术领域
[0003] 当前所揭示的标的物涉及用于集成视觉形态和细胞蛋白表达分析的组合物和方法。发明内容
[0004] 细胞分析是帮助诊断个体的医学病况的重要组织病理学工具。临床医师用于细胞分析的两种病理学工具是利用显微术的细胞样品的形态分析和利用诸如流式细胞术等方法的细胞生物标记物检测。细胞样品的形态分析涉及以视觉方式鉴别细胞的特征或特性和使那些特征或特性与细胞的已知疾病或病况状态相关联。通常，形态分析不足以诊断出细胞的疾病状态或病况，且分析组织或样品的与已知疾病或病况相关的生物标记物的存在。尽管生物标记物可为指示生物状态的任一分子，但其最常为肽或蛋白质。这些肽或蛋白质参与身体中的许多作用，包括细胞内信号传导和代谢。细胞信号传导和代谢是指常见疾病状态背后的机制且相关标记物可用于测量和监测所述可观察到结果作为疾病进展和药物反应。
[0005] 通常，生物标记物是通过其CD命名法来命名。CD(分化簇)分子是可用于鉴别和表征白细胞的细胞表面生物标记物。CD命名法是由HLDA(人类白细胞分化抗原)工作组研发和维护。鉴别细胞表面上的CD分子的各种组合通常用于细胞类型和表面分子的分类，所述细胞类型和表面分子是细胞免疫分型的靶标。(陈(Chan),J.等人，组织病理学(Histopathology)12(5):461-480(1988))。
[0006] 共振光散射是一种物理现象，其中直径小于入射光波长的粒子展现粒子周围的表面等离子体波且所述波与粒子的圆周相干。粒子电子与入射光同相共振，形成发射呈散射光形式的能量的电磁偶极子。反射(散射)光的波长是组成、形状和粒径的函数。通常，粒子的组成是贵金属，例如金或银。通常，粒子的大小低于白光的波长(低于200nm)。大小在1000nm以下的粒子通常称为“纳米粒子”。
[0007] 使用波长小于光波长的粒子利用粒子的共振光散射性质进行细胞分析的优点是：(a)可利用暗视野照明使用简单照明器(例如白光照明器)以低至10×的放大倍数对纳米粒子进行检测和成像，(b)纳米粒子提供非漂白信号，(c)可通过改变用于多色多路复用的纳米粒径和/或组成来改变散射光的色彩，(d)纳米粒子可与用于特异性分析物检测的生物标记物结合部分偶联以产生功能化纳米粒子，(e)与功能化纳米粒子接触的生物样品是可存档的，和(f)功能化纳米粒子在存在于细胞上时展现较大的检测线性范围，这是因为粒子不会自我淬灭。在一些实施例中，与荧光标记系统相比，本发明方法可用于在无需使用暗室的环境条件下获得细胞-功能化纳米粒子复合物的图像。在一些实施例中，可在医师或病理学家的办公室中在显微镜上观察样品。
[0008] 在一些方面中，本发明涉及用于检测细胞-功能化纳米粒子结合部分复合物的方法和组合物，所述复合物可用于检测细胞的生物标记物签名(signature)。在一些方面中，所述方法和组合物还可用于检测成像细胞的生物标记物形态轮廓。
[0009] 在本发明的一些方面中，经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子可用于检测功能化纳米粒子细胞复合物，其可用于例如鉴别和量化存在于细胞上的生物标记物。在一些实施例中，可使细胞成像以检测与功能化纳米粒子复合的细胞的形态特征。在一些实施例中，功能化纳米粒子可与通过形态成像分析分析的相同细胞接触。
[0010] 在一些实施例中，本发明方法可用于改良生物标记物签名分析的信号生成、检测限值、动态范围、自动化和/或性能特性。例如，在一些实施例中，本发明涉及通过使用外力增加功能化纳米粒子和细胞的局部浓度来增加生物标记物结合部分负载到细胞上的量的方法。在一些方面中，生物标记物结合部分可为功能化纳米粒子或包含非纳米粒子标记的生物标记物结合部分。“功能化纳米粒子”是直接或间接呈递官能团的纳米粒子。在一些方面中，外力可为离心力、电磁力或磁力。
[0011] 在本发明的一些方面中，检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法可包含：
[0012] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0013] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，其中使用外力以加速纳米粒子-细胞复合物通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物的形成；
[0014] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0015] (d)通过用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0016] (e)使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同或相似的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别出来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0017] 在获得生物标记物或生物标记物形态轮廓的本文所揭示方法中的任一种中，检测成像细胞上的细胞-功能化纳米粒子复合物任选地包括存储每一成像细胞的位置信息。
[0018] 在一些实施例中，细胞的疾病、病况或状态可通过形成并检测功能化纳米粒子与细胞之间的复合物来鉴别。所述方法可包含使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同或相似的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0019] 在一些实施例中，细胞的生物标记物签名可在均质分析中进行检测，所述分析包含以下步骤：
[0020] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0021] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成功能化纳米粒子-细胞复合物；
[0022] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0023] (d)用瞬逝光照射功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名，
[0024] 其中未从视野去除未结合的功能化纳米粒子。
[0025] 通常，从靶标洗掉未结合的物质以减少背景噪声。在一些实施例中省略洗涤步骤，从而使未结合的功能化纳米粒子留在视野中。此实施例可用于例如高通量分析和/或自动化分析的一些实施例中。功能化纳米粒子对细胞上的生物标记物具有特异性，且可大体上接触细胞使得对未结合的功能化纳米粒子观察到极少或无法观察到信号。
[0026] 在检测生物标记物签名的本发明的一些方面中，检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射包含使与封固剂接触的细胞-功能化纳米粒子复合物成像。在本发明的一些方面中，封固剂可包含具有大约细胞折射率的溶液。在本发明的一些方面中，封固剂可在细胞折射率的约0.1内，其中细胞被固定。在一些实施例中，经固定细胞的折射率为约1.52或1.52。在一些方面中，封固剂的折射率为1.51到1.54。在一些方面中，使用RI在经固定细胞折射率的0.1内的封固剂可用于减少白光散射的量，并获得来自细胞-功能化纳米粒子复合物的共振散射的较好图像。在一方面中，本发明涉及用于检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法，所述方法包含：
[0027] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0028] (b)使已固定的细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0029] (c)将纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底，其中使粘着的纳米粒子-细胞复合物与封固剂接触，其中封固剂的折射率在经固定细胞折射率的约0.1内；
[0030] (d)通过用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0031] (e)使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0032] 在一些方面中，封固剂可具有约1.52的折射率。
[0033] 在一些方面中，使用本发明组合物和方法关联个别细胞的生物标记物签名和在一些实施例中与其形态图像/特征的能力极大地增强诊断和监测异常病况或病症的能力。
[0034] 如本文所述，本发明者已令人惊讶地确定，经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子可用于检测细胞-功能化纳米粒子复合物以及鉴别和量化存在于成像细胞上的生物标记物，例如当功能化纳米粒子与通过形态成像分析分析的相同细胞接触时。使用本发明组合物和方法关联个别细胞的生物标记物签名与其形态图像/特征的能力极大地增强诊断和监测异常病况或病症的能力。
[0035] 在一方面中，本发明涉及用于获得成像细胞的生物标记物签名的组合物和方法，所述成像细胞的生物标记物签名在一些实施例中与从细胞成像获得的细胞的经检测形态特征组合使用。在一些方面中，包含功能化纳米粒子物质(各自包含特异性生物标记物结合部分)的组合物用于检测成像细胞的生物标记物签名。在本发明的一些方面中，在本发明方法中制备或使用所述组合物的组合。组合和包含所述组合的试剂盒可为所述组合物的混合物，或可包含在使用前分开的组合物。
[0036] 在所述方法的一方面中包含以下步骤：
[0037] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0038] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其细胞上的相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0039] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0040] (d)用瞬逝光照射功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合功能化纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；
[0041] (e)使衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
[0042] (f)使接触细胞的形态特征成像；和
[0043] (g)使接触细胞的形态特征与每一衬底粘着细胞的生物标记物签名相关联以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。
[0044] 在一些方面中，生物标记物形态轮廓可用于获得参考细胞生物标记物签名与参考个体的疾病、病症、病况或状态之间的诊断一致性。在一些实施例中，可获得经诊断个体的生物标记物签名与疾病、病症、病况或状态的一致性数据库。诊断一致性包括基于参考生物标记物签名和/或参考生物标记物形态轮廓与参考个体的疾病、病症、病况或状态之间的关联的关联。在一些实施例中，诊断一致性或关联可独立于任何治疗决策、例如使用从尸体剖检和/或基于存档的组织样品和患者记录获得的数据得到。
[0045] 在一些方面中，本发明涉及用于检测功能化纳米粒子细胞复合物以获得生物标记物签名的方法，所述方法包含：
[0046] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0047] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的功能化纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0048] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0049] (d)用瞬逝光照射功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0050] (e)使个体成像细胞的生物标记物签名与展现与成像细胞生物标记物签名大体上相同的生物标记物签名的参考细胞的生物标记物签名相关联，其中在参考细胞生物标记物签名与参考个体的疾病、病症、病况或状态之间已建立诊断一致性。
[0051] 在本发明的一些方面中，样品可为生物样品。例如，在一些实施例中，样品可为任何含细胞的样品。在一些实施例中，样品可来自血液、骨髓、细针抽出物或组织。组织样品可从例如生检获得。在一些实施例中，组织样品可从FFPE(福尔马林固定、石蜡包埋)组织样品获得。在本发明的一些方面中，生物样品可经处理。例如，样品可包含白细胞。在一些实施例中，在使细胞与多种功能化纳米粒子物质接触之前去除至少50％的红细胞。
[0052] 在本发明的一些方面中，细胞可为活的、经固定的和/或大体上完整的。在一些实施例中，询问的经检测细胞可为相同类型或不同类型。当细胞为不同类型时，其可具有不同的组织或肿瘤来源、不同的癌症进展阶段、转移和非转移癌细胞，且可包含传染原或细胞、受感染细胞和未受感染细胞，或表达在正常或参考细胞上发现的生物标记物的不同水平、类型、变体、突变体、形式和/或翻译后修饰形式。在一些实施例中，不同细胞可展现不同于正常或参考细胞的病理和/或不同形态。
[0053] 在本发明的一些方面中，细胞用固定剂固定。固定剂可为例如甲醛、戊二醛或另一交联剂。在其它实施例中，可使用水溶性防腐剂，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、二羟甲基脲、山梨酸、2-吡啶硫醇-1-氧化物或山梨酸钾。在一些实施例中，可通过表面活性剂对细胞进行可渗透化处理。
[0054] 在本发明的一些方面中，可使粘着到衬底的功能化纳米粒子细胞复合物与封固剂接触。封固剂的体积可为约2微升到约15微升。
[0055] 在本发明的一些方面中，经检测生物标记物可存在于细胞表面上、细胞内或表面上和细胞内两者均有。在一些实施例中，细胞中的生物标记物可存在于一或多个细胞特征中或上，所述细胞特征是例如胞质液、核、核膜、核仁、内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、线粒体或其它蜂窝状结构、隔室或特征。
[0056] 在本发明的一些方面中，经检测生物标记物可为通过抗原决定簇(CD)和或其它分子/抗原位点鉴别的生物分子。例如，生物标记物可包括或不包括以下生物标记物中的任一种：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT和FMC-7。在一些实施例中，例如，生物标记物可包括或不包括由肾细胞、传染原、实体肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或可用于诊断或预后的任何其它细胞表达的标记物。在一些实施例中，例如，生物标记物可包括或不包括在肾细胞、传染原(例如细菌或病毒)、实体肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的表面上或其内表达的生物标记物。在一些实施例中，例如，生物标记物可包括或不包括HER2、NEU、前列腺干细胞抗原(PSCA)、上皮特异性抗原(ESA)、上皮细胞粘着分子(EpCAM)、α2β1、VEGFR-1、VEGFR-2、CD133或AC133抗原。
[0057] 在本发明的一些方面中，生物标记物结合部分可选自或包含以下各项：抗体或抗体片段、纳米抗体、受体片段、DNA适配体、DNA/RNA寡核苷酸、RNA适配体、PNA适配体、肽适配体、LNA适配体、碳水化合物和凝集素。
[0058] 在生物标记物结合部分包含抗体的实施例中，抗体可为单克隆或多克隆抗体。在一些实施例中，生物标记物结合部分可包含抗体片段、ScFv或单域抗体(纳米抗体)。生物标记物结合部分可结合到蛋白质、蛋白片段、糖基化部分或模式或碳水化合物。生物标记物结合部分可包括或不包括结合到例如以下各项的生物标记物结合部分，例如抗体或其片段或其它生物标记物结合部分：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT和FMC-7。在一些实施例中，当生物标记物结合部分是抗CD45时，所获得的生物标记物签名是白细胞计数。白细胞计数可分别作为样品质量或体积的质量或体积的函数来测量。
[0059] 在一些实施例中，光学对比剂可为隐色染料、细胞染色剂或可用于形态分析成像的任何染料，包括例如可用于组织学、细胞学、细胞病理学或组织病理学成像的任何染料。在一些实施例中，光学对比剂通过对细胞差别染色提供细胞的视觉分类和鉴别。隐色染料可为红色隐色染料、亚甲基蓝、结晶紫、酚酞、百里酚酞或亚甲基绿。
[0060] 在一些实施例中，光学对比剂可包括或不包括选自例如以下的细胞染色剂：吉姆萨染色剂(Giemsa stain)、赖德染色剂(Wright stain)、赖德-吉姆萨染色剂、迈-格林华染色剂(May-Grünwald stain)、马氏三色(Mallory trichrome)、过碘酸-希夫反应染色剂(Periodic acid-Schiff reaction stain)、魏格特氏弹性纤维染色剂(Weigert's elastic stain)、海登汉氏AZAN三色染色剂(Heidenhain's AZAN trichrome stain)、地衣红染色剂(Orcein stain)、马森三色(Masson's trichrome)、阿新蓝染色剂(Alcian blue stain)、迈-格林华-吉姆萨(May-Grünwald-Giemsa)、万吉森染色剂(van Gieson stain)、汉氏染色剂(Hansel stain)、网硬蛋白染色剂(Reticulin Stain)、革兰氏染色剂(Gram stain)、比尔朔夫斯基染色剂(Bielschowsky stain)、铁蛋白染色剂、丰塔纳-马森染色剂(Fontana-Masson stain)、希尔胶体铁染色剂(Hales colloidal iron stain)、五色染色剂(Pentachrome stain)、阿赞染色剂(Azan stain)、罗克沙尔固蓝染色剂(Luxol fast blue stain)、高尔基氏法(Golgi’s method)(还原银)、还原金、铬钒/苏木素染色剂(chrome alum/haematoxylin stain)、艾沙明蓝染色剂(Isamin blue stain)、亲银性染色剂(Argentaffin stain)、瓦辛斯-泰雷银染色剂(Warthin-Starry silver stain)、尼氏染色剂(Nissl stain)、苏丹黑和锇染色剂(Sudan Black and osmium stain)、四氧化锇染色剂、苏木素染色剂(hematoxylin stain)、乙酸双氧铀染色剂、柠檬酸铅染色剂、卡红染色剂(Carmine stain)、番红精染色剂(safranin stain)和齐-尼染色剂(Ziehl-Neelsen stain)。
[0061] 在一些实施例中，光学对比剂可为可包括或不包括例如以下各项的染料或着色剂：伊红(eosin)Y、伊红B、天青(azure)B、派洛宁(pyronin)G、孔雀石绿、甲苯胺蓝、酞菁铜、阿新蓝(alcian blue)、金胺-玫瑰红(auramine-rhodamine)、酸性品红(acid fuschin)、苯胺蓝、橙黄G、酸性品红、中性红、苏丹黑(Sudan Black)B、吖啶橙、油红(Oil Red)O、刚果红(Congo Red)、固绿FCF、波尔斯普鲁士蓝反应(Perls Prussian blue reaction)、核固红、碱性红霉素B和萘黑。
[0062] 当样品来自组织时，光学对比剂可为H&E(苏木素和伊红)染色剂。在一方面中，光学对比剂可适于超活染色。
[0063] 在一些实施例中，可通过使细胞和功能化纳米粒子经受外力以增加功能化纳米粒子和细胞的局部浓度使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触。外力可为重力、电力或磁力。重力可通过离心生成。磁力可通过顺磁性纳米粒子实现。顺磁性功能化纳米粒子的核心包含顺磁性区域且纳米粒子的外壳可包括或不包括Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se或其混合物或合金。在一些实施例中，可在首先提供包含来自个体的细胞的样品后将带电聚合物添加到细胞。这些方法可用于例如检测细胞-生物标记物结合部分的方法，例如用于检测本文所揭示细胞-功能化纳米粒子复合物的任一实施例中。在一些实施例中，样品可在两次或更多次施加外力之间再混合。作为力是离心力的一个非限制性实例，力可正向施加以浓缩细胞和功能化纳米粒子，且然后反向施加以重悬浮细胞和功能化纳米粒子。离心力也可施加和反向两次或更多次。作为力是电力的一个非限制性实例，力可通过电泳施加于导电或半导电表面上，其中功能化纳米粒子和细胞在电势偏压下通过其不同的相对电泳迁移率混合(参见苏(Su),H.等人，电泳(Electrophoresis),23 1551-1557(2002)和美国专利申请公开案第US 2003/0119028号)。电力也可施加和反向两次或更多次。
[0064] 在一些实施例中，使接触细胞的形态特征成像可包含测量光学对比剂的光学性质。光学对比剂的光学性质可包括或不包括例如：吸光度、散射、荧光、光致发光、拉曼发射(Raman emission)和光致发光寿命。光学对比剂的光学性质可在显微镜下使用亮视野照明或暗视野照明来测量。
[0065] 在一些实施例中，从细胞鉴别出的形态特征可包括或不包括例如：细胞特征的形状(例如细胞表面形状、细胞核形状、染色质形状、核仁形状)、细胞特征的数量(例如核仁或线粒体的数量)、细胞特征的染色密度或前述任一者的任一组合或任何其它成像细胞特征或隔室。
[0066] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可进一步包含：(h)基于每一细胞的生物标记物形态轮廓来诊断个体的病况。在一些方面中，个体的病况可包括或不包括例如存在血液癌症、非恶性血液病症、实体肿瘤、肾病、膀胱疾病、肝病或传染病。血液癌症可包括或不包括白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。非恶性血液病症可为贫血或镰状细胞疾病。实体肿瘤可包括或不包括乳癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌或膀胱癌。当实体肿瘤是乳癌时，生物标记物可包括或不包括例如Her2或Neu。在一些实施例中，肾病可包括或不包括急性肾损伤、慢性肾病、狼疮性肾炎、肾排斥或子痫前症。在一些实施例中，传染病可包括或不包括例如：HIV、肝炎、性传播疾病或败血症。在一些实施例中，血液癌症可进一步包含循环癌细胞。
[0067] 在一些实施例中，当个体的病况是癌症时，个体的病况可进一步通过恶性病谱系、阶段或缓和状态来鉴别。例如，恶性病谱系可包括或不包括例如：阴性、骨髓系、淋巴T细胞系或淋巴B细胞系。
[0068] 在一些方面中，来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射可使用瞬逝或非瞬逝光来检测。在一些方面中，非瞬逝光可为透射光。复合纳米粒子的共振光散射可在暗视野照明下成像时进行检测。在一些方面中，经照射的载玻片架可代替显微镜中的暗视野聚光器。经照射的载玻片架可利用全内反射来照射载玻片架。经照射的载玻片架可包含光纤以将光递送到载玻片的边缘。
[0069] 在一些实施例中，检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射可在例如1秒、500毫秒或200毫秒中完成。
[0070] 在一些实施例中，一或多种功能化纳米粒子物质可包含直径为10nm到200nm的纳米粒子。在一些实施例中，纳米粒子可包含例如Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se或其混合物或合金。合金可为金(Au)和银(Ag)的合金。合金可具有铜(Cu)和金(Au)。纳米粒子可包含离散外壳或层中的所列示金属的混合物。当纳米粒子包含Si时，纳米粒子可具有Si外壳、SiO2外壳(二氧化硅)或Si核心。在一些实施例中，纳米粒子可为球形、管形、圆柱形、锥形、立方体形、卵形、t骨形、海胆或玫瑰状(具有尖钉状不均匀表面)或中空形。在一些实施例中，纳米粒子可具有圆形、卵圆形、三角形、正方形、卵形或t骨形横切面。
[0071] 在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可为2到50种不同种类的功能化纳米粒子物质。每种功能化纳米粒子物质可被不同种类的生物标记物结合部分功能化。例如，在本发明的一些方面中，每种功能化纳米粒子物质被不同的生物标记物结合部分功能化。在本发明的一些方面中，用于细胞与不同多种功能化纳米粒子物质的连续接触的不同生物标记物结合部分可结合到同一功能化纳米粒子，如本文所揭示。
[0072] 在一些实施例中，当用结合到以下中的一者的生物标记物结合部分(例如抗体或抗体片段或其它生物标记物结合部分)功能化纳米粒子物质时：CD3、CD22、CD79a、κ、λ、Pax-5、ZAP-70、MPO或TdT，功能化纳米粒子物质可进入细胞且结合到其相应细胞内生物标记物。
细胞内生物标记物可位于可包括或不包括例如胞质液、核的细胞区域中、核膜上或另一细胞隔室或结构中或上。在一些实施例中，功能化纳米粒子小到足以进入细胞而不破坏细胞膜。细胞可用可渗透化处理器处理以容许功能化纳米粒子进入细胞而不破坏细胞膜。在一些实施例中，生物标记物签名可通过对每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量或比例计数来获得。可合计、加权或以其它方式测定样品中已鉴别出正常或异常形态轮廓的细胞数。
细胞内生物标记物可位于可包括或不包括例如胞质液、核的细胞区域中、核膜上或另一细胞隔室或结构中或上。在一些实施例中，功能化纳米粒子小到足以进入细胞而不破坏细胞膜。细胞可用可渗透化处理器处理以容许功能化纳米粒子进入细胞而不破坏细胞膜。在一些实施例中，生物标记物签名可通过对每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量或比例计数来获得。可合计、加权或以其它方式测定样品中已鉴别出正常或异常形态轮廓的细胞数。
[0073] 在一些实施例中，在检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法中(d)用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名的步骤可进一步包含：
[0075] (ii)以数字方式移动视野；
[0076] (iii)使用软件程序对下一视野中每个成像细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量计数并重复步骤(ii)和(iii)直到分析整个衬底区为止；
[0077] (iv)以数字方式组合所获得的所有图像以生成覆盖整个衬底区的单一图像；和[0078] (v)根据所获得的整个衬底区的数据(即每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量)生成每一衬底粘着细胞的生物标记物签名。
[0079] 在一些实施例中，软件程序还存储每一所观察到和/或成像细胞的位置信息。
[0080] 在一些实施例中，视野为约0.25μm2到约2.5cm2。在一些实施例中，视野可为约100μm2到约1000mm2。在一些实施例中，视野是5微米×5微米。在一些实施例中，视野是100mm×100mm。在一些实施例中，视野为正方形。正方形视野的边可为0.25微米到2.5厘米。视野可覆盖一个细胞或多个细胞。在一些实施例中，视野可覆盖整个载玻片的区域。
[0081] 在一些实施例中，在检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法中(f)使接触细胞的形态特征成像的步骤可进一步包含：
[0082] (i)使用软件程序处理视野中每一细胞的形态特征的图像；
[0083] (ii)以数字方式移动视野；
[0084] (iii)使用软件程序处理下一视野中每一细胞的形态特征的图像并重复步骤(ii)和(iii)直到分析整个衬底区为止；
[0085] (iv)以数字方式组合所获得的所有图像以生成覆盖整个衬底区的单一图像；和[0086] (v)根据所获得的整个衬底区的数据生成每一衬底粘着细胞的形态特征以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。
[0087] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可包含：
[0088] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0089] (b)将细胞粘着到衬底；
[0090] (c)使衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
[0091] (d)使接触细胞的形态特征成像；
[0092] (e)将光学对比剂转化成无色形式；
[0093] (f)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，以形成纳米粒子-细胞复合物；
[0094] (g)用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一成像细胞纳米粒子复合物的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0095] (h)使接触细胞的形态特征与每一衬底粘着细胞的生物标记物签名相关联以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。
[0096] 在一些实施例中，光学对比剂可为隐色染料。隐色染料可为亚甲基蓝、亚甲基绿、红色隐色染料、结晶紫、酚酞或百里酚酞。隐色染料可通过将一或多个电子添加到染料转化成无色形式。电子可通过还原方法添加到染料。还原方法可通过电化学还原、光还原或与还原剂反应来实现。在一些实施例中，隐色染料可通过从染料去除一或多个电子转化成有色形式。一或多个电子可通过氧化方法从染料去除。氧化方法可通过电化学氧化、光氧化或与氧化剂反应来实现。
[0097] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可进一步包含：(d)(2)去除第一多个功能化纳米粒子；和(d)(3)使细胞与第二多个功能化纳米粒子物质接触。在一些实施例中，去除第一多个功能化纳米粒子可通过裂解每种功能化纳米粒子与每种功能化纳米粒子相关生物标记物结合部分之间的连接体来实现。在本发明的一些方面中，用于细胞与不同多种功能化纳米粒子物质的连续接触的不同生物标记物结合部分可结合到相同功能化纳米粒子。例如，抗CD3结合部分可结合到10nm金粒子用于使第一多个功能化纳米粒子物质与细胞接触，且抗CD8抗体可结合到10nm金粒子以在第一多个功能化纳米粒子释放后用于第二多个功能化纳米粒子物质。在本发明的一些方面中，不同多种功能化纳米粒子物质可检测指示两种或更多种疾病或病况的生物标记物。
[0098] 在本发明的一些实施例中，细胞彼此可为相同类型或不同类型。在一些实施例中，细胞可与不同病况相关。例如，细胞可与以下病况中的一或多种相关：血液癌症、非恶性血液病症、实体肿瘤、膀胱疾病、肝病、肾病或传染病。在一些方面中，细胞可与两种或更多种类型的实体肿瘤相关。
[0099] 在一些实施例中，可通过从生物标记物结合部分释放第一多个功能化纳米粒子去除第一多个功能化纳米粒子。功能化纳米粒子可通过使纳米粒子从生物标记物结合部分置换、裂解、分离、断开、水解或解离来释放。在一些实施例中，第一多个纳米粒子中的每一纳米粒子物质与其相应生物标记物结合部分之间的连接体包含结合到第一纳米粒子物质的第一寡核苷酸和结合到其相应生物标记物结合部分的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸的至少一部分互补的部分，且在这些寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交形成包含双链核酸的连接体。在一些实施例中，用于第一多个纳米粒子中的每一纳米粒子物质和相应生物标记物结合部分的第一、第二和第三寡核苷酸可相同。每一纳米粒子物质可通过使第三寡核苷酸结合到第一寡核苷酸从其相应生物标记物结合部分释放，其中通过第三寡核苷酸和第一寡核苷酸杂交形成的杂合体展现高于通过第一和第二寡核苷酸杂交形成的双链核酸的熔融温度的熔融温度。在其它实施例中，对于每一纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分，与每一纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分相关的第一、第二和第三寡核苷酸可不同。例如，在第一多个纳米粒子中，第二纳米粒子物质可包含第四寡核苷酸，其相应生物标记物结合部分可包含第五寡核苷酸，且置换寡核苷酸可为第六寡核苷酸。
[0100] 在本发明的一些方面中，每种功能化纳米粒子物质可被不同的DNA寡核苷酸释放系统功能化。在其它方面中，多种功能化纳米粒子物质中的所有功能化纳米粒子物质可被相同的DNA寡核苷酸释放系统功能化。在一些方面中，所用所有功能化纳米粒子物质均可被相同或不同的DNA寡核苷酸释放系统功能化。
[0101] 在一些实施例中，询问细胞和检测生物标记物的一或多个迭代可通过与至少第二、第三、直到10个或更多个多种纳米粒子物质连续接触来实现。在一些实施例中，询问生物标记物的一或多次迭代可为1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次、30次、40次、50次、60次、70次或更多次。在使用寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子的实施例中，每一多种纳米粒子物质和相应生物标记物结合部分可包含用于给定多种寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质中的每一寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质的相同的第一、第二和第三寡核苷酸。或者，每一多种寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质中的每一寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分可包含第一、第二和第三寡核苷酸的独特集合，使得每一生物标记物结合部分与第一、第二和第三寡核苷酸的独特集合相关联。在此实施例中，可进行置换和与新的多种寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质接触的1个到10个或更多个连续周期。
[0102] 在一些实施例中，在从生物标记物结合部分释放第二或先前多种功能化纳米粒子后，进行以下步骤：
[0103] (i)对通过功能化纳米粒子的生物标记物结合部分结合于细胞上或细胞中的生物标记物分类，和
[0104] (ii)使细胞与经不同生物标记物结合部分功能化的下一种多个纳米粒子接触，其中下一种多个纳米粒子的每一纳米粒子物质经生物标记物结合部分功能化，所述生物标记物结合部分结合到怀疑与样品或病况、疾病或病症相关的生物标记物，所述样品或病况、疾病或病症也与第一生物标记物相关。
[0105] 在此方面中，本发明方法可用于检测相关生物标记物是存在于相同或不同细胞上或还是细胞群体上。
[0106] 在一些实施例中，可通过裂解纳米粒子与生物标记物结合部分之间的连接体去除第一多个功能化纳米粒子。连接体可包含多核苷酸、经修饰多核苷酸、多核糖核苷酸、经修饰多核糖核苷酸、肽、聚葡萄糖或聚糖。多核苷酸可包含DNA限制酶序列。经修饰多核苷酸可包含多核苷酸序列内的二-硫醇、二醇、无碱基或尿嘧啶部分。
[0107] 在一些实施例中，连接体可包含肽，其进一步包含蛋白酶序列。蛋白酶序列可为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶识别序列。在一些实施例中，连接体可包含聚糖，其进一步包含α-岩藻糖苷酶识别位点。α-岩藻糖苷酶识别位点可为α-1,2糖苷键。在一些方面中，可用肽酶、DNA酶和/或RNA酶裂解连接体。
[0108] 在一些实施例中，衬底可为二氧化硅玻璃、透明聚合物、金或氧化铝。衬底可经功能化。衬底功能化可为图案化。衬底功能化可为硅烷连接的细胞生物标记物、聚合物连接的细胞生物标记物、硅烷连接的胺、硅烷连接的羧酸、聚合物连接的胺、聚合物连接的羧酸、聚乙二醇(PEG)、金、银、氧化铝、聚葡萄糖或二氧化硅玻璃。
[0109] 描述用于检测细胞生物标记物签名的组合或试剂盒，所述组合包含多种生物标记物结合部分功能化纳米粒子。
[0110] 描述用于检测细胞生物标记物签名的组合或试剂盒。在一些实施例中，组合可包含多种生物标记物结合部分功能化纳米粒子，其中所述功能化纳米粒子可包含混合物或可为分开的。在一些实施例中，功能化纳米粒子可进一步包含：经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分，且第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的一部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成杂交双链体。在替代性实施例中，功能化纳米粒子可进一步包含经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分；和第三寡核苷酸，其中第一寡核苷酸与第三寡核苷酸的一部分互补，第二寡核苷酸与第三寡核苷酸的不同部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成与第三寡核苷酸杂交的双链体。
[0111] 在一些方面中，本发明涉及用于检测生物标记物签名的试剂盒，所述试剂盒包含包括多种功能化纳米粒子物质的组合，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分。在一些方面中，试剂盒可包含多种功能化纳米粒子和光学对比剂。光学对比剂可为本文所述的光学对比剂。
[0112] 在一些方面中，包含包括多种功能化纳米粒子物质的组合的用于检测生物标记物签名的试剂盒还可包含封固剂，其具有与欲成像细胞大体上相同的折射率。在一些方面中，封固剂可具有在欲成像细胞折射率的0.1内的折射率。封固剂可为本文所述的任一封固剂。作为非限制性实例，封固剂可具有1.52的折射率。
[0113] 在一些实施例中，试剂盒可包含多种生物标记物结合部分功能化纳米粒子，其中所述纳米粒子可包含混合物或可为分开的。在一些实施例中，例如，功能化纳米粒子可进一步包含纳米粒子可从生物标记物结合部分释放的功能化纳米粒子。在一些方面中，第一纳米粒子物质经第一寡核苷酸功能化；生物标记物结合部分经第二寡核苷酸功能化，且第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的一部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成杂交双链体。在替代性实施例中，功能化纳米粒子可进一步包含经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分；和第三寡核苷酸，其中第一寡核苷酸与第三寡核苷酸的一部分互补，第二寡核苷酸与第三寡核苷酸的不同部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成与第三寡核苷酸杂交的双链体。
[0115] 本专利档案含有若干彩色绘制的图式。在要求并支付必要费用之后专利事务局将提供专利申请公开案带彩图的复本。
[0116] 图1绘示连续置换功能化纳米粒子的一般方法。
[0117] 图2绘示置换功能化纳米粒子的一实施例。
[0118] 图3绘示使用桥接寡核苷酸置换功能化纳米粒子的一实施例。
[0119] 图4绘示制备经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子的方法。在图中“b”表示生物素，“SAv”表示链霉抗生物素蛋白。
[0120] 图5A和5B：图5a绘示通过可置换寡核苷酸重叠制备经寡核苷酸功能化的纳米粒子和制备经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子的方法。图5a.绘示通过在EDC催化剂存在下偶合胺功能化寡核苷酸与羧酸功能化纳米粒子形成功能化纳米粒子。图5a还绘示通过在EDC催化剂存在下将链霉抗生物素蛋白偶合到羧酸功能化纳米粒子、随后将生物素功能化寡核苷酸偶合到链霉抗生物素蛋白涂布的纳米粒子形成功能化纳米粒子。图5b绘示通过使马来酰亚胺功能化寡核苷酸与抗体上的硫醇(来自半胱氨酸氨基酸)反应、然后使寡核苷酸功能化抗体与含有连接到抗体的寡核苷酸序列的部分反向补体序列的寡核苷酸功能化纳米粒子杂交形成功能化纳米粒子。
[0121] 图6绘示通过可置换桥接寡核苷酸制备经寡核苷酸功能化的纳米粒子和制备经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子的方法。
[0122] 图7是在亮视野中使用20×物镜、奥林巴斯(Olympus)BX60M显微镜和DP71彩色照相机的经染色功能化纳米粒子标记的细胞检测的亮视野图像。
[0123] 图8A和8B：图8a是在奥林巴斯BX60M显微镜上的20×物镜下在暗视野中利用达科莱特照明器(DarkLite Illuminator)光源的经染色功能化纳米粒子标记的细胞的暗视野图像。图8b显示图8a的两个所选经染色功能化纳米粒子标记的细胞的展开视图。
[0124] 图9显示在亮视野中使用20×物镜、奥林巴斯BX60M显微镜和DP71彩色照相机成像用于形态检测的经吉姆萨染色的血液涂片染色的细胞的初始亮视野图像。
[0125] 图10显示在血细胞脱色处理后使用20×物镜、奥林巴斯BX60M显微镜和DP71彩色照相机的亮视野图像。
[0126] 图11显示使用奥林巴斯BX60M显微镜上的20×物镜在暗视野中利用达科莱特照明器光源成像用于残余吉姆萨染色(图4)的同一视野的脱色血液涂片的暗视野图像(100ms曝光)。
[0127] 图12显示经三种色彩的纳米粒子标记的CEM细胞的暗视野图像(40×物镜、200ms曝光、400％缩放)。
[0128] 图13显示经吉姆萨染色且经4种色彩的纳米粒子标记的CEM细胞的亮视野图像(40×物镜、0.1ms曝光、200％缩放)。
[0129] 图14显示经4种色彩的纳米粒子标记的CEM细胞的暗视野图像(40×物镜、100ms曝光、200％缩放)。
[0130] 图15显示在没有RI匹配的封固剂下与功能化纳米粒子接触的细胞的暗视野图像(40×物镜、100ms曝光)。
[0131] 图16显示细胞样品的暗视野图像，其中所述细胞是在未施加额外力下经标记(被动标记)。
[0132] 图17显示细胞样品的暗视野图像，其中所述细胞是利用离心(额外重力)经功能化纳米粒子标记。
[0133] 图18显示血液涂片的组合相位对比和暗视野图像，其中细胞是利用离心(额外重力)标记。
[0134] 图19A-J显示血液涂片的亮视野图像(图19A)，其中细胞是使用多路复用标记和吉姆萨染色标记。图19B显示同一血液涂片在同一视野下的暗视野图像，其中细胞是使用多路复用标记和吉姆萨染色标记。图19D和图19C显示所选经标记细胞的展开视图，所述经标记细胞还经吉姆萨染色且在亮视野图像的相同位置观察。在视野中，Au抗CD-3(黄色/较亮)和Ag抗CD4(蓝色/较暗)功能化纳米粒子结合到四个淋巴细胞。未检测到功能化纳米粒子与嗜中性粒细胞结合(图19F)，而在使用吉姆萨染色剂的亮视野图像中观察到嗜中性粒细胞(图19E)。在视野中，Au抗CD-3(黄色/较亮)和Ag抗CD4(蓝色/较暗)功能化纳米粒子结合到四个淋巴细胞(图19H和图19J)。图19G和图19I显示如分别在图19H和图19J中所观察到的经吉姆萨染色的淋巴细胞的相应亮视野图像。
[0135] 图20A-D显示全血细胞悬浮液的亮视野图像，其中细胞经Au抗CD3标记。图20A显示暗视野图像，且图20B显示同一血液涂片在同一视野下的相应亮视野图像。在视野中，Au抗CD3(黄色/亮色)功能化纳米粒子结合到14个淋巴细胞中的13个，如通过比较图20A中的经标记细胞与图20B中的经吉姆萨染色的细胞所观察到。图20C和图20D显示经功能化抗CD3Au纳米粒子标记的淋巴细胞的展开视图。未检测到功能化纳米粒子与嗜中性粒细胞结合。
[0136] 图21A和21B显示被动培育的载玻片(A)和功能化纳米粒子密度以电子方式增强的载玻片(B)。
[0137] 图22显示FFPE组织上的50nm(绿色/较暗)和70nm(黄色/较亮)Au纳米粒子。
具体实施方式
[0138] 下文参照随附描述和图式更全面地描述当前所揭示的标的物，其中显示当前所揭示的标的物的一些但非所有实施例。当前所揭示的标的物可以许多不同形式体现且不应理解为限于本文所述的实施例；而是，提供所述实施例以使得本发明将符合适用法规。通篇中相似编号指代相似元件。
[0139] 当前所揭示的标的物的所属领域技术人员将理解本文所述的当前所揭示标的物的许多修改和其它实施例，其具有前述描述和附图中所呈现的教示的益处。因此，当前所揭示的标的物不打算限于所揭示的具体实施例，且所属领域技术人员将了解修改和其它实施例包括在随附权利要求书的范围内。尽管本文采用特定术语，但其仅以一般和描述性意义且并非出于限制目的使用。本发明使用下文所显示的缩写。
[0140] 缩写
[0141] DNA-脱氧核糖核酸
[0142] RNA-核糖核酸
[0143] TIRF-全内反射荧光
[0144] PEG-聚乙二醇
[0145] CD-决定簇
[0146] ScFv-单链可变片段
[0147] DPX-邻苯二甲酸二丁酯-二甲苯封固剂
[0148] RI-折射率
[0149] NADH-还原型烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸
[0150] NAD+-氧化型烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸
[0151] NADP+-烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
[0152] DTT-二硫赤藻糖醇
[0153] EDC-1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺
[0154] DMSO-二甲亚砜
[0155] 除非提供具体定义，否则所述命名法是结合本文所述的实验室程序、技术和方法使用，且本文所述的实验室程序、技术和方法是其所属领域中已知的那些。标准化学符号和缩写可与所述符号所代表的全名互换使用。因此，例如，术语“氢”和“H”应理解为具有相同含义。可将标准技术用于化学合成、化学分析、医药制备、调配、递送和患者治疗。可将标准技术用于重组DNA方法、寡核苷酸合成、组织培养等。可例如使用试剂盒根据制造商说明书进行反应和纯化技术，如业内通常实现或如本文所述。
[0156] 尽管描述本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，但尽可能精确地报告具体实例中所述的数值。然而，任一数值固有地含有必然由其相应测试测量中存在的标准偏差所引起的某些误差。此外，应理解，本文所揭示的所有范围均涵盖任何和所有归入其中的子范围。例如，所述范围“1到10”应视为包括介于最小值1与最大值10之间(包含最小值1和最大值10)的任何和所有子范围；即，所有子范围开始于最小值1或更大(例如1到6.1)且结束于最大值10或更小(例如5.5到10)。另外，称为“并入本文中”的所有参考文献应理解为全文并入。此外，多个值的任一列表应理解为包括任两个所列示值之间的任一范围。
[0157] 术语“一(a、an)”和“所述”在用于本申请案(包括权利要求书)中时是指“一或多个”。因此，例如，除非上下文明确说明相反情形(例如多个细胞)，否则提到“一个细胞”包括多个所述细胞等。
[0158] 如果没有另外指明且若适用，那么术语“大体上”在结合数值术语使用时可指85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
99.5％。例如，术语“大体上”降低可指所列举性质的85％或更大的降低。出于此定义的目的，术语“生物标记物签名”或“生物标记物轮廓”并非数值术语。
99.5％。例如，术语“大体上”降低可指所列举性质的85％或更大的降低。出于此定义的目的，术语“生物标记物签名”或“生物标记物轮廓”并非数值术语。
[0159] 利用共振光散射检测细胞生物标记物签名和生物标记物形态轮廓
[0160] 在一些实施例中，本发明的特征在于用于检测细胞-纳米粒子结合部分复合物的方法和组合物，所述复合物可用于检测细胞的生物标记物签名。在一些实施例中，所述方法和组合物还可用于检测成像细胞的生物标记物形态轮廓。
[0161] 在一些实施例中，可使用经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子来检测功能化纳米粒子细胞复合物，所述复合物可用于例如鉴别和量化存在于细胞上的生物标记物。在一些实施例中，还可使细胞成像来检测与功能化纳米粒子复合的细胞的形态特征。在一些实施例中，可使功能化纳米粒子与通过形态成像分析分析的相同细胞接触以获得所述细胞的生物标记物形态轮廓。
[0162] 在一些实施例中，本发明方法可用于改良生物标记物签名分析的信号生成、检测限值、动态范围和/或性能特性。例如，在一些实施例中，本发明涉及通过使用外力增加功能化纳米粒子和细胞的局部浓度来增加生物标记物结合部分负载到细胞上的量的方法。在一些实施例中，生物标记物结合部分可为功能化纳米粒子物质。在一些方面中，外力可为离心力或磁力。在本发明的一些方面中，检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法可包含：
[0163] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0164] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，其中使用外力以加速纳米粒子-细胞复合物通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物的形成；
[0165] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0166] (d)通过用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0167] (e)使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0168] 在一些方面中，片语大体上相同或相似的生物标记物签名或生物标记物形态轮廓可指包含相似水平和/或类型的生物标记物和/或生物标记物形态的生物标记物签名或轮廓，所述生物标记物签名或轮廓对于相同疾病、病况、状态或病症已建立一致性或为合理预期的。
[0169] 在一些实施例中，细胞的生物标记物签名可在均质分析中进行检测，所述分析包含以下步骤：
[0170] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0171] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成功能化纳米粒子-细胞复合物；
[0172] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0173] (d)用瞬逝光照射功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名，
[0174] 其中未从视野去除未结合的功能化纳米粒子。
[0175] 通常，从靶标洗掉未结合的物质以减少背景噪声。在一些实施例中省略洗涤步骤，从而使未结合的功能化纳米粒子留在视野中。此实施例可用于例如高通量分析和/或自动化分析的一些实施例中。功能化纳米粒子对细胞上的生物标记物具有特异性，且可大体上接触细胞使得对未结合的功能化纳米粒子观察到极少或无法观察到信号。
[0176] 在一些实施例中，细胞的疾病、病况或状态可通过形成并检测功能化纳米粒子与细胞之间的复合物来鉴别。所述方法可包含使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0177] 在检测生物标记物签名的本发明的一些实施例中，检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射包含使与封固剂接触的细胞-功能化纳米粒子复合物成像。在一些实施例中，可通过使用包含具有大约细胞折射率的溶液的封固剂来减少或大体上消除背景和/或干涉白光散射。在本发明的一些实施例中，封固剂可在细胞折射率的约0.1内，其中细胞被固定。在一些实施例中，经固定细胞的折射率为约1.52或1.52。在一些实施例中，封固剂的折射率可为1.51到1.54。在一些实施例中，使用RI在经固定细胞折射率的0.1内的封固剂可用于减少白光散射的量，并获得来自细胞-功能化纳米粒子复合物的共振散射的较好图像。在一方面中，本发明涉及用于检测功能化纳米粒子细胞复合物的方法，所述方法包含：
[0178] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0179] (b)使已固定的细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0180] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底，其中使粘着的纳米粒子-细胞复合物与封固剂接触，其中封固剂的折射率在经固定细胞折射率的约0.1内；
[0181] (d)通过用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到功能化纳米粒子细胞复合物的共振光散射来检测功能化纳米粒子细胞复合物，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0182] (e)使每一衬底粘着细胞的生物标记物签名与展现大体上相同的生物标记物签名的细胞的已知疾病、病况或状态相关联以鉴别来自个体的细胞的疾病、病况或状态。
[0183] 在一些实施例中，封固剂可具有约1.52的折射率。
[0184] 在一些实施例中，使用本发明组合物和方法关联个别细胞的生物标记物签名和在一些实施例中与其形态图像/特征的能力极大地增强诊断和监测异常病况或病症的能力。
[0185] 如本文所述，本发明者已令人惊讶地发现，经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子可用于检测细胞-功能化纳米粒子复合物以及鉴别和量化存在于成像细胞上的生物标记物，例如当功能化纳米粒子与通过形态成像分析分析的相同细胞接触时。使用本发明组合物和方法关联个别细胞的生物标记物签名与其形态图像/特征的能力极大地增强诊断和监测异常病况或病症的能力。
[0186] 在一些实施例中，本发明涉及用于获得成像细胞的生物标记物签名的组合物和方法，所述成像细胞的生物标记物签名在一些实施例中与从细胞成像获得的细胞的经检测形态特征组合使用。在一些方面中，包含功能化纳米粒子物质(各自包含特异性生物标记物结合部分)的组合物用于检测成像细胞的生物标记物签名。在本发明的一些实施例中，在本发明方法中制备或使用所述组合物的组合。所述组合可为所述组合物的混合物，或可包含在使用前分开的组合物。
[0187] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可包含以下步骤[0188] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0189] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其细胞上的相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0190] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0191] (d)用瞬逝光照射功能化纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；
[0192] (e)使衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
[0193] (f)使接触细胞的形态特征成像；和
[0194] (g)使接触细胞的形态特征与每一衬底粘着细胞的生物标记物签名相关联以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。
[0195] 另外，可能需要检测患者的正常或患病组织或细胞。例如，存在或不存在某些循环癌细胞或其它细胞可诊断疾病。因此，人类患者的内源细胞是可有利地使用本发明的组合物、方法和试剂盒检测的细胞。
[0196] 样品来源
[0197] 如本文所用的术语“样品”是指材料的等份，通常为衍生自生物材料的水溶液或水性悬浮液。在一些实施例中，样品可为生物样品。生物样品可来自活的个体。例如，在一些实施例中，样品可为含有细胞的任何样品。在一些实施例中，样品可来自例如全血、骨髓、血清、血浆、脑脊髓液、痰、支气管冲洗液、支气管抽出物、尿液、淋巴液和呼吸、肠和泌尿生殖道的各种外分泌物、眼泪、唾液、乳、白细胞、骨髓瘤等；生物液，例如细胞培养上清液、可固定或可不固定的组织样本和可固定或可不固定的细胞样本或细针抽出物。欲通过本发明方法分析分析物的存在的样品包括例如细胞、组织、均质物、溶解物、提取物、经纯化或部分纯化的蛋白质和其它生物分子和其混合物。作为非限制性实例，组织样品可为来自生检的组织样品(例如FFPE(福尔马林固定、石蜡包埋)组织样品)、抽出物或手术去除的组织样品。FFPE样品可源自诊疗所或实验室。用于本发明方法中的样品将基于分析形式和欲分析组织、细胞、提取物或其它材料、尤其生物材料的性质而变化。
[0198] 在一些实施例中，生物样品可经处理。所述处理可为例如样品中的去除所选物质。在一些实施例中，样品可包含白细胞。在一些实施例中，在使细胞与多种功能化纳米粒子物质接触之前去除至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的红细胞。在一些实施例中，在使细胞与多种功能化纳米粒子物质接触之前去除至少50％的红细胞。
[0199] 如本文所用的“个体”是指任何哺乳动物，可包括或不包括人类、家养和农场动物以及动物园动物或宠物，例如狗、马、猫、小鼠、大鼠、骆马、绵羊、猪、牛等。本文的优选哺乳动物是人类，包括成人、儿童和老人。优选体育动物是马和狗。优选宠物是狗和猫。个体可为例如水上公园动物，例如海豚、鲸、海豹或海象。在某些实施例中，个体(subject、individual)或患者是人类。用于本发明中的细胞可从任一上文所提到的个体获得。
[0200] 在一些实施例中，来自个体的细胞可包含生物标记物，其可用于帮助鉴别细胞状态、属性、生长速率、谱系、突变、变体、表达水平、癌症阶段或缓和状况和/或潜在或活动性感染。所述细胞可包括或不包括例如哺乳动物细胞、免疫调节细胞、淋巴细胞、单核细胞、多形体、T细胞、肿瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞、传染原、寄生虫、植物细胞、经转染细胞(例如NS0、CHO、COS、293细胞)。
[0201] 在一些实施例中，细胞可为活的、死的、固定的和/或大体上完整的。在一些实施例中，细胞可为相同类型或不同类型。当细胞为不同类型时，所述细胞可来自不同的组织或肿瘤来源，展现不同的病理，表达不同或突变的生物标记物，表达不同水平的生物标记物，表达具有不同翻译后修饰的生物标记物或展现不同的形态。在一些实施例中，生物标记物结合部分能够区分突变体生物标记物与野生型生物标记物。当细胞来自不同肿瘤来源时，细胞可来自肿瘤，可包括或不包括例如乳癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌、肝癌、胰脏癌、甲状腺癌、膀胱癌或其它癌症类型。
[0202] 如本文所用的术语“细胞增生性病症”和“增生性病症”是指与一定程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施例中，细胞增生性病症是癌症。
[0203] 如本文所用的术语“肿瘤”是指所有肿瘤性细胞生长和增殖(无论是恶性的还是良性的)以及所有癌前和癌性细胞和组织。如本文所提到的术语“癌症”、“癌性”、“细胞增生性病症”、“增生性病症”和“肿瘤”并不相互排斥。
[0204] 如本文所用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中特征通常在于细胞生长和/或增殖失调的生理病况。一些癌症是由快速分裂的细胞构成，而另一些是由分裂慢于正常细胞的细胞构成。癌症实例的类型可包括或不包括例如癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更具体实例可包括或不包括例如鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌瘤、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌瘤、唾液腺癌瘤、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌瘤、白血病和其它淋巴组织增生性病症和各种类型的头颈癌。
[0205] 在一些实施例中，局部癌症转移可侵入淋巴系统，导致远端转移。远端转移通常涉及脑、肺、骨骼和肝。每一癌症具有独特的转移模式(例如前列腺癌可转移到骨骼，但很少转移到脑)。转移可发生在癌症生长的任一时间，且可发生在去除原发性肿瘤之前或之后。转移的癌细胞可保留原始癌细胞的许多特性。例如，在一些实施例中，本发明方法可检测转移癌症的来源。转移癌症的来源可通过以下方式来确定：鉴别远端位置的肿瘤细胞的生物标记物签名和/或生物标记物形态轮廓，并检测所述生物标记物签名和/或生物标记物形态轮廓与其原始位置的原发性癌症的生物标记物签名和/或生物标记物形态轮廓相同或相似。在一些实施例中，组织中的癌细胞可展现多种肿瘤。在一些实施例中，可分开询问组织细胞，使得可在检测细胞的生物标记物或生物标记物形态轮廓期间鉴别出一或多种癌细胞类型(或肿瘤)。
[0206] 组织病理学方法
[0207] 组织病理学成像通常要求细胞不动，使得可在同一区域中的细胞经受不同成像方式后分析所述区域以使来自一种成像方式的细胞与另一成像方式相关联。在一些实施例中，细胞用固定剂固定。固定剂可为例如甲醛、戊二醛或另一交联剂。在其它实施例中，可使用水溶性防腐剂，例如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯、二羟甲基脲、山梨酸、2-吡啶硫醇-1-氧化物或山梨酸钾。在一些实施例中，通过表面活性剂对细胞进行可渗透化处理。
[0208] 在一些实施例中，可使粘着到衬底的功能化纳米粒子细胞复合物与封固剂接触成像。如本文所用的“封固剂”是其中使样本悬浮于载玻片与盖玻片之间以供显微镜检查的任何物质。封固剂可用于维持检测期间的图像保真度。显微术的图像退化的一个主要原因是由于浸没介质与封固剂之间的折射率不适当匹配(迪亚斯普罗A(Diaspro A)等人，应用光学(Appl Opt)2002；41(4):685-690)。然而，如果封固剂折射率不同于功能化纳米粒子细胞复合物，那么将发生白光散射。
[0209] 在一些实施例中，封固剂可包含具有与细胞折射率相似的折射率的溶液。细胞的折射率可根据细胞类型变化，且还可在细胞区域内变化。在一些方面中，细胞的折射率可从1.2到1.6变化。在一些方面中，折射率可从1.4到1.5变化。在一些实施例中，经固定细胞的折射率可为1.52。在一些实施例中，封固剂可在经固定细胞折射率的0.1内。在一些实施例中，封固剂可在经固定细胞折射率的0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01内。在一些实施例中，封固剂可在经固定细胞折射率的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、
8％、9％或10％内。在一些实施例中，封固剂可为浸没油、DPX、溶解聚苯乙烯(于二甲苯中)、Valap(在60℃加热板上混合的凡士林、羊毛脂和石蜡的等量混合物)、Gel/Mount、
Fluoromount-G、Fluorsave、Prolong、Vectashield、MOWIOL、改进的Apathy封固剂、Permount或Entellan。封固剂的体积可为约2微升到约40微升。在一些实施例中，封固剂的体积可为5微升到15微升。在一些实施例中，封固剂的体积可为约10微升。在一些实施例中，封固剂可进一步包含抗褪色试剂，其防止光学对比剂的光降解。在一些实施例中，封固剂可进一步包含间隔物或接合垫料。在一些方面中，间隔物或接合垫料可经调整以将液体流引导到细胞。在一些实施例中，可使用算法来最小化来自白光散射的光噪声。
8％、9％或10％内。在一些实施例中，封固剂可为浸没油、DPX、溶解聚苯乙烯(于二甲苯中)、Valap(在60℃加热板上混合的凡士林、羊毛脂和石蜡的等量混合物)、Gel/Mount、
Fluoromount-G、Fluorsave、Prolong、Vectashield、MOWIOL、改进的Apathy封固剂、Permount或Entellan。封固剂的体积可为约2微升到约40微升。在一些实施例中，封固剂的体积可为5微升到15微升。在一些实施例中，封固剂的体积可为约10微升。在一些实施例中，封固剂可进一步包含抗褪色试剂，其防止光学对比剂的光降解。在一些实施例中，封固剂可进一步包含间隔物或接合垫料。在一些方面中，间隔物或接合垫料可经调整以将液体流引导到细胞。在一些实施例中，可使用算法来最小化来自白光散射的光噪声。
[0210] 生物标记物结合部分
[0211] 如本文所用的术语“生物标记物”是指在细胞上或内发现的任何区分元件。所述区分元件可为由生物标记物结合部分识别的抗原或另一结合伴侣。如本文所用的术语“抗原”或“结合伴侣”是指可由抗体或其它生物标记物结合部分识别的任何已知或未知物质。术语“抗原”或“结合伴侣”可包括例如蛋白质、肽、糖蛋白和碳水化合物。在一些实施例中，抗原在细胞表面上表达。优选地，这些抗原包括生物活性蛋白，例如激素、细胞因子和其细胞表面受体或细菌或寄生细胞、因子或抗原、膜或其经纯化组分和病毒抗原或结合伴侣。所述细胞或药剂可为在其表面上天然表达抗原或结合伴侣的那些或在其表面上表达抗原的经转变细胞。在一些实施例中，可用致癌基因转染经转变细胞，所述致癌基因整合到所述细胞中。在一些实施例中，经转变细胞可包括或不包括例如哺乳动物细胞、免疫调节细胞、淋巴细胞、单核细胞、多形体、T细胞、肿瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞、传染原、寄生虫、植物细胞、经转染细胞(例如NS0、CHO、COS、293细胞)。细胞(例如NS0、CHO、COS和293细胞)的转变可通过一方法实现，所述方法可包括或不包括电穿孔和核转染。在一些实施例中，所检测生物标记物可存在于细胞表面上、细胞内或表面上和细胞内两者均有。在一些实施例中，细胞中的生物标记物可存在于一或多个细胞特征中或上，所述细胞特征是例如胞质液、核、核膜、核仁、内质网、高尔基体或线粒体。在一些实施例中，生物标记物可表达并运输到外部生物标记物结合部分可接近的细胞表面。
[0212] 如本文所用的术语“特异性结合(specifically binding和specific binding)”意指抗体或其它分子、尤其本发明的生物标记物结合部分结合到靶标(例如抗原、配体或其它分析物)，且具有大于其在本发明指定条件下结合到其它分子的亲和力。在本发明的多个实施例中，“特异性结合”可意指抗体或其它特异性分子结合到靶分析物分子，且具有比其结合与靶分子不相关的分子大至少约106倍的亲和力、优选地至少大约107倍的亲和力、更优选大至少约108倍的亲和力、且最优选大至少约109倍的亲和力。通常，特异性结合是指比非特异性结合大约106倍到约109倍的范围内的亲和力。在一些实施例中，特异性结合的特征可在于比非特异性结合大109倍的亲和力。每当本文中出现范围时，如在“1-10或1到10”中，所述范围是指(但不限于)给定范围内的每一整数或测量单位。因此，1-10意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和其间的子单位中的每一者。
[0213] 在一些实施例中，生物标记物可为由抗原决定簇(CD)和或其它分子/抗原位点鉴别的生物分子。
[0214] 在一些实施例中，生物标记物可包括或不包括例如表1中所列示的那些。
[0215] 表1.
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]
[0232]
[0233]
[0234]
[0235]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243] 在一些实施例中，生物标记物可包括或不包括例如：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT、FMC-7、Pro2PSA、ROMA(HE4+CA-125)、OVA1(多蛋白)、HE4、纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物(DR-70)、AFP-L3％、循环肿瘤细胞(EpCAM、CD45、细胞角蛋白8、18+、19+)、HER2、NEU、前列腺干细胞抗原(PSCA)、上皮特异性抗原(ESA)、上皮细胞粘着分子(EpCAM)、α2β1、VEGFR-1、VEGFR-2、CD133、AC133抗原、p63蛋白、c-Kit、CA19-9、雌激素受体(ER)、助孕酮受体(PR)、Pro2PSA、HER-2/neu、CA-125、CA15-3、CA27.29、游离PSA、甲状腺球蛋白、核有丝分裂器蛋白(NuMA、NMP22)、α-胎儿蛋白(AFP)b、ROMA(HE4+CA-125)、OVA1、HE4、DR-70、p63蛋白、c-Kit、CA19-9、总PSA、α-甲基酰基-CoA消旋酶/AMACR、CA125/MUC16、ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、胸苷激酶1、AG-2、BRCA1、BRCA2、CA15-3/MUC-1、小窝蛋白-1、CD117/c-Kit、CEACAM-5/CD66e、细胞角蛋白14、EGF R/ErbB1、HIN-1/SCGB3A1、Ki-67/MKI67、MKP-3、巢蛋白、NGF R/TNFRSF16、NM23-H1、PARP、PP4、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1/PAI-1、14-3-3β、14-3-3σ、14-3-3ζ、15-PGDH/HPGD、5T4、A33、ABCB5、ABCB6、ABCG2、ACE/CD143、ACLP、ACP6、胞粘蛋白/AF-6、α白蛋白、AG-2、AG-3、Akt、醛-酮还原酶1C3/AKR1C3、α1B-糖蛋白、α1-微球蛋白、αB晶体蛋白/CRYAB、α-胎儿蛋白/AFP、α-甲基酰基-CoA消旋酶/AMACR、AMFR/gp78、膜联蛋白A3、膜联蛋白A8/ANXA8、APC、载脂蛋白A-I/ApoA1、载脂蛋白A-II/ApoA2、载脂蛋白E/ApoE、APRIL/TNFSF13、ASCL1/Mash1、ATBF1/ZFHX3、吸引蛋白、有丝分裂激酶A、BAP1、Bcl-2、Bcl-
6、β2-微球蛋白、β-1,3-葡糖醛酸基转移酶1/B3GAT1、β-连环蛋白、β-III微管蛋白、比库宁蛋白(Bikunin)、BMI-1、B-Raf、BRCA1、BRCA2、Brk、C4.4A/LYPD3、CA15-3/MUC-1、c-Abl、钙粘蛋白-13、钙质介素/CALD1、钙调理蛋白1、钙视网膜蛋白、碳酸酐酶IX/CA9、过氧化氢酶、组织蛋白酶D、小窝蛋白-1、小窝蛋白-2、CBFB、CCR7、CCR9、CEACAM-19、CEACAM-20、CEACAM-4、CHD1L、壳多糖酶3样1、胆囊收缩素-B R/CCKBR、绒毛膜促性腺激素α链(αHCG)、绒毛膜促性腺激素α/β(HCG)、CKAP4/p63、密连蛋白-18、簇连蛋白、c-Maf、c-Myc、毛状样蛋白1/CotL1、COMMD1、热休克蛋白58抗体(Cornulin)、皮层肌动蛋白、COX-2、CRISP-3、CTCF、CTL1/SLC44A1、CXCL17/VCC-1、CXCL8/IL-8、CXCL9/MIG、CXCR4、细胞周期蛋白A1、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、CYLD、Cyr61/CCN1、细胞角蛋白14、细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、DAB2、DCBLD2/ESDN、DC-LAMP、Dkk-1、DLL3、DMBT1、DNMT1、DPPA2、DPPA4、E6、E-钙粘蛋白、ECM-1、EGF、EGF R/ErbB1、ELF3、ELTD1、EMMPRIN/CD147、EMP2、内皮因子/CD105、内皮唾液酸蛋白/CD248、烯醇酶2/神经元特异性烯醇酶、EpCAM/TROP1、Eps15、ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ERCC1、ERK1、ERK5/BMK1、Ets-1、多发性外生骨疣蛋白
1、EZH2、埃兹蛋白(Ezrin)、FABP5/E-FABP、肌成束蛋白、FATP3、FCRLA、胎球蛋白A/AHSG、酸性FGF、碱性FGF、FGF R3、FGF R4、纤维蛋白原、纤维母细胞活化蛋白α/FAP、滤泡抑素样1/FSTL1、FOLR1、FOLR2、FOLR3、FOLR4、FosB/G0S3、FoxM1、FoxO3、FRAT2、FXYD5/抗粘附素、GABA-A Rα1、GADD153、GADD45α、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-3BP/MAC-2BP、γ-谷氨酰基环化转移酶/CRF21、Gas1、胃泌素释放肽R/GRPR、胃动蛋白1、钙结合微丝蛋白/GSN、GFAP、GLI-2、谷胱甘肽过氧化酶3/GPX3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、高尔基体糖蛋白1/GLG1、gp96/HSP90B1、GPR10、GPR110、GPR18、GPR31、GPR87、GPRC5A、GPRC6A、GRP78/HSPA5、HE4/WFDC2、类肝素酶/HPSE、丝氨酸穿膜蛋白酶、Her2、HGF R/c-MET、HIF-2α/EPAS1、HIN-1/SCGB3A1、HLA-DR、HOXB13、HOXB7、HSP70/HSPA1A、HSP90、玻尿酸酶1/HYAL1、ID1、IgE、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I R、IGF-II、IGFL-3、IGFLR1、IL-1β/IL-1F2、IL-17E/IL-25、IL-2、IL-6、IMP脱氢酶1/IMPDH1、核转运蛋白α2/KPNA2、ING1、整联蛋白β1/CD29、整联蛋白β
3/CD61、IQGAP1、异柠檬酸脱氢酶1/IDH1、ITIH4、ITM2C、锯齿蛋白1、JNK、JunB、JunD、激肽释放酶2、激肽释放酶6/甘油磷酸钙、KCC2/SLC12A5、Ki-67/MKI67、KiSS1R/GPR54、KLF10、KLF17、L1CAM、乳酸脱氢酶A/LDHA、核纤层蛋白B1、LEF1、瘦素/OB、LIN-28A、LIN-28B、脂质运载蛋白-2/NGAL、LKB1/STK11、LPAR3/LPA3/EDG-7、LRMP、LRP-1B、LRRC3B、LRRC4、LRRN1/NLRR-1、LRRN3/NLRR-3、Ly6K、LYPD1、LYPD8、MAP2、丝氨酸蛋白酶/ST14、MCAM/CD146、M-CSF、MDM2/HDM2、黑素-A/MART-1、黑皮质素-1R/MC1R、黑素运铁蛋白/CD228、褪黑激素、Mer、间皮素、异粘蛋白、转移素/KiSS1、甲硫氨酸氨基肽酶、甲硫氨酸氨基肽酶2/METAP2、MFAP3L、MGMT、MIA、MIF、MINA、智能弹2/MIB2、细胞外基质蛋白、MITF、MKK4、MKP-1、MKP-3、MMP-1、MMP-10、MMP-13、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MRP1、MRP4/ABCC4、MS4A12、MSH2、MSP R/Ron、MSX2、MUC-4、Musashi-1、NAC1、天冬氨酸蛋白酶A、NCAM-1/CD56、NCOA3、NDRG1、NEK2、NELL1、NELL2、厌食肽-1/核连蛋白-2、巢蛋白、NFkB2、NF-L、NG2/MCSP、NGF R/TNFRSF16、烟碱酰胺N-甲基转移酶/NNMT、NKX2.2、NKX3.1、NM23-H1、NM23-H2、Notch-3、NPDC-1、NTS1/NTSR1、NTS2/NTSR2、OGR1、Olig2、骨桥蛋白/OPN、卵膜蛋白酶、OXGR1/GPR80/P2Y15、p130Cas、p15INK4b/CDKN2B、p16INK4a/CDKN2A、p18INK4c/CDKN2C、p21/CIP1/CDKN1A、p27/Kip1、P2X5/P2RX5、p53、PARP、PAUF/ZG16B、PBEF/内脏脂肪素、PDCD4、PDCD5、PDGF Rα、PDGF Rβ、PDZD2、PEA-15、胃蛋白酶原A5/PGA5、肽酶抑制剂16/PI16、过氧化物酶2、PGCP、PI 3-激酶p85α、PIWIL2、PKM2、PLK1、PLRP1、PP4、P-Rex1、PRMT1、抑制蛋白1、助孕酮R B/NR3C3、助孕酮R/NR3C3、颗粒蛋白前体/PGRN、泌乳素、前列腺素E合酶2/PTGES2、PSAP、PSCA、PSMA/FOLH1/NAALAD酶I、PSMA1、PSMA2、PSMB7、PSP94/MSMB、PTEN、PTEN、PTH1R/PTHR1、PTK7/CCK4、PTPβ/ζ/PTPRZ、Rab25、RARRES1、RARRES3、Ras、Reg4、Ret、RNF2、RNF43、S100A1、S100A10、S100A16、S100A2、S100A4、S100A6、S100A7、S100A9、S100B、S100P、SART1、SCUBE3、胰泌素R、丝氨酸蛋白酶抑制剂A9/中心体蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂E1/PAI-1、血清类淀粉A1、血清类淀粉A4、SEZ6L、SEZ6L2/BSRP-A、Skp2、SLC16A3、SLC45A3/前列腺相关蛋白2抗体、SLC5A5、SLC5A8/SMCT1、SLC7A7、Smad4、SMAGP、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-6、SOD2/Mn-SOD、Soggy-1/DkkL1、SOX11、SOX17、SOX2、SPARC、SPARC样1/SPARCL1、SPINK1、Src、STEAP1、STEAP2、STEAP3/TSAP6、STRO-1、STYK1、存活素、突触结合蛋白-1、粘结蛋白聚糖-1/CD138、突触融合蛋白4、突触核蛋白-γ、端锚聚合酶1、τ、TCF-3/E2A、TCL1A、TCL1B、TEM7/PLXDC1、TEM8/ANTXR1、生腱蛋白C、TFF1、TGF-β1、TGF-β1、2、3、TGF-β1/1.2、TGF-β2/1.2、TGF-βRI/ALK-5、THRSP、胸苷激酶1、胸腺素β10、胸腺素β4、甲状腺球蛋白、TIMP分析试剂盒、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、TLE1、TLE2、TLR2、TM4SF1/L6、TMEFF2/脑肿瘤抑癌蛋白-2、TMEM219、TMEM87A、TNF-α、TOP2A、TopBP1、t-纤维蛋白溶酶原活化剂/tPA、TRA-1-60(R)、TRA-1-85/CD147、TRAF-4、转凝蛋白/TAGLN、胰蛋白酶2/PRSS2、纤溶酶α/TPS1、TSPAN1、UBE2S、uPAR、u-纤维蛋白溶酶原活化剂/尿激酶、硬骨鱼紧张肽-II R、VAP-1/AOC3、VCAM-1/CD106、VEGF、VEGF R1/Flt-1、VEGF R2/KDR/Flk-1、VEGF/PlGF异二聚体、VSIG1、VSIG3、YAP1、ZAG、ZAP70、ZMIZ1/Zimp10和癌胚抗原。在一些实施例中，生物标记物可包括或不包括例如癌症地图中所列示的蛋白质(http://www.proteinatlas.org/search/cancer)。
6、β2-微球蛋白、β-1,3-葡糖醛酸基转移酶1/B3GAT1、β-连环蛋白、β-III微管蛋白、比库宁蛋白(Bikunin)、BMI-1、B-Raf、BRCA1、BRCA2、Brk、C4.4A/LYPD3、CA15-3/MUC-1、c-Abl、钙粘蛋白-13、钙质介素/CALD1、钙调理蛋白1、钙视网膜蛋白、碳酸酐酶IX/CA9、过氧化氢酶、组织蛋白酶D、小窝蛋白-1、小窝蛋白-2、CBFB、CCR7、CCR9、CEACAM-19、CEACAM-20、CEACAM-4、CHD1L、壳多糖酶3样1、胆囊收缩素-B R/CCKBR、绒毛膜促性腺激素α链(αHCG)、绒毛膜促性腺激素α/β(HCG)、CKAP4/p63、密连蛋白-18、簇连蛋白、c-Maf、c-Myc、毛状样蛋白1/CotL1、COMMD1、热休克蛋白58抗体(Cornulin)、皮层肌动蛋白、COX-2、CRISP-3、CTCF、CTL1/SLC44A1、CXCL17/VCC-1、CXCL8/IL-8、CXCL9/MIG、CXCR4、细胞周期蛋白A1、细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、CYLD、Cyr61/CCN1、细胞角蛋白14、细胞角蛋白18、细胞角蛋白19、DAB2、DCBLD2/ESDN、DC-LAMP、Dkk-1、DLL3、DMBT1、DNMT1、DPPA2、DPPA4、E6、E-钙粘蛋白、ECM-1、EGF、EGF R/ErbB1、ELF3、ELTD1、EMMPRIN/CD147、EMP2、内皮因子/CD105、内皮唾液酸蛋白/CD248、烯醇酶2/神经元特异性烯醇酶、EpCAM/TROP1、Eps15、ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ERCC1、ERK1、ERK5/BMK1、Ets-1、多发性外生骨疣蛋白
1、EZH2、埃兹蛋白(Ezrin)、FABP5/E-FABP、肌成束蛋白、FATP3、FCRLA、胎球蛋白A/AHSG、酸性FGF、碱性FGF、FGF R3、FGF R4、纤维蛋白原、纤维母细胞活化蛋白α/FAP、滤泡抑素样1/FSTL1、FOLR1、FOLR2、FOLR3、FOLR4、FosB/G0S3、FoxM1、FoxO3、FRAT2、FXYD5/抗粘附素、GABA-A Rα1、GADD153、GADD45α、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-3BP/MAC-2BP、γ-谷氨酰基环化转移酶/CRF21、Gas1、胃泌素释放肽R/GRPR、胃动蛋白1、钙结合微丝蛋白/GSN、GFAP、GLI-2、谷胱甘肽过氧化酶3/GPX3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、高尔基体糖蛋白1/GLG1、gp96/HSP90B1、GPR10、GPR110、GPR18、GPR31、GPR87、GPRC5A、GPRC6A、GRP78/HSPA5、HE4/WFDC2、类肝素酶/HPSE、丝氨酸穿膜蛋白酶、Her2、HGF R/c-MET、HIF-2α/EPAS1、HIN-1/SCGB3A1、HLA-DR、HOXB13、HOXB7、HSP70/HSPA1A、HSP90、玻尿酸酶1/HYAL1、ID1、IgE、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I R、IGF-II、IGFL-3、IGFLR1、IL-1β/IL-1F2、IL-17E/IL-25、IL-2、IL-6、IMP脱氢酶1/IMPDH1、核转运蛋白α2/KPNA2、ING1、整联蛋白β1/CD29、整联蛋白β
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[0244] 在一些实施例中，生物标记物选自由肾细胞、传染原或寄生因子(parasitic agent)、实体肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或可用于诊断或预后的任何其它细胞表达的标记物。在一些实施例中，生物标记物选自在肾细胞、传染原(例如细菌或病毒)、实体肿瘤细胞或循环肿瘤细胞的表面上或其内表达的标记物。在一些实施例中，在肾细胞表面上或其内表达的生物标记物可包括或不包括例如：KIM-1、白蛋白、β-2微球蛋白、胱抑素C、簇连蛋白、载脂蛋白A-I/ApoA1、CXCL8/IL-8、ERCC1、Ki-67/MKI67、MMP-9或三叶因子-3。
[0245] 在一些实施例中，生物标记物是一或多种针对特定类型的癌症的标记物。在一些实施例中，乳癌的生物标记物可包括或不包括her2-neu、ER、PR、Ki-67和p53。在一些实施例中，肺癌的生物标记物可包括或不包括TTF-1、天冬氨酸蛋白酶A、CK 5/6、p40/63和突触素。在一些实施例中，前列腺癌的生物标记物可包括或不包括AMACR、PSA、CEA和p63。在一些实施例中，结肠直肠癌的生物标记物可包括或不包括MLH1、MSH2、PMS2、MSH6、c-Kit、p16和BRAF V600E。在一些实施例中，肿瘤浸润淋巴细胞的生物标记物可包括或不包括CD4、CD8、CD14、CD20、CD45RO、FoxP3、PD-L和PD-L1。在一些实施例中，泌尿系统(膀胱、肾、尿道)癌症的生物标记物可包括或不包括CK7、p63、CK20、p53、Ki-67、PSA、波形蛋白和PAX8。
[0246] 在一些实施例中，生物标记物具有细胞特异性。细胞可呈健康状态(正常)或患病状态(异常)。单核细胞和巨噬细胞可展现包括或不包括CD14和CD16生物标记物的生物标记物。淋巴细胞B细胞可展现包括或不包括CD20生物标记物的生物标记物。淋巴细胞NK细胞可展现包括或不包括CD56生物标记物的生物标记物。淋巴细胞T细胞可展现包括或不包括CD3生物标记物的生物标记物。T Reg细胞可展现包括或不包括CD4、CD25和FoxP3生物标记物的生物标记物。细胞毒性T细胞可展现包括或不包括CD8生物标记物的生物标记物。辅助T细胞可展现包括或不包括CD4生物标记物的生物标记物。幼稚T细胞可展现包括或不包括CD45RA生物标记物的生物标记物。记忆T细胞可展现包括或不包括CD45RO生物标记物的生物标记物。Tth细胞可展现包括或不包括CXR5生物标记物的生物标记物。Th17细胞可展现包括或不包括CCR6生物标记物的生物标记物。Th2细胞可展现包括或不包括CCR4生物标记物的生物标记物。Th1细胞可展现包括或不包括CXCR3生物标记物的生物标记物。肿瘤细胞可展现包括或不包括PanCK生物标记物的生物标记物。
[0247] 如本文所用的术语“生物标记物结合部分”是可特异性结合到生物标记物的部分。在一些实施例中，生物标记物结合部分可包括或不包括例如抗体或抗体片段、纳米抗体、受体片段、DNA适配体、DNA/RNA寡核苷酸、RNA适配体、PNA适配体、肽适配体、LNA适配体、碳水化合物或凝集素。
[0248] 如本文所用的术语“抗体”是可特异性结合到抗原的蛋白质。在一些实施例中，抗体可包括或不包括例如任何重组或天然免疫球蛋白分子，例如IgG类的成员，例如IgG1；以及任何抗原结合免疫球蛋白片段，例如Fv、Fab和F(ab’)2片段、抗体片段、ScFv(单链可变片段，其是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白，用10到约25个氨基酸的短连接体肽连接)或单域抗体(纳米抗体)和其任何衍生物。在生物标记物结合部分包含抗体的实施例中，抗体可为单克隆或多克隆抗体。
[0249] 如本文所用的术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，其中所述部分保留至少一种和(至多)大部分或所有通常与存在于完整抗体中的所述部分相关的功能。在一些实施例中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点且因此保留结合抗原的能力。在一些实施例中，抗体片段(例如包含Fc区者)保留通常与存在于完整抗体中的Fc区相关的生物学功能中的至少一者，例如FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。在一些实施例中，抗体片段是体内半衰期大体上类似于完整抗体的单价抗体。例如，所述抗体片段可包含连接到能够赋予片段体内稳定性的Fc序列的抗原结合臂。
[0250] “多克隆抗体”或“PAb”是衍生自经抗原或其抗原功能衍生物免疫的动物的血清的抗体分子的异质群体。为产生多克隆抗体，可通过注射任选地补充有佐剂的抗原或抗原偶联物来免疫宿主动物，例如兔、小鼠和山羊。多克隆抗体可为在抗血清中来自其它物种的未纯化的、纯化的或部分纯化的。用于制备和纯化多克隆抗体的技术描述于多个一般和更特定参考文献中，包括(但不限于)卡巴特(Kabat)和迈尔(Mayer)，实验免疫化学(Experimental Immunochemistry)，第2版，(托马斯(Thomas)，伊利诺伊州斯普林菲尔德(Springfield,Ill)(1961))；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies:
A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)，(1988))；和韦尔(Weir)，实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，第5版.(布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Science)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge,Mass.)(1996))。
A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.)，(1988))；和韦尔(Weir)，实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，第5版.(布莱克韦尔科学出版社(Blackwell Science)，马萨诸塞州剑桥(Cambridge,Mass.)(1996))。
[0251] “单克隆抗体”或“MAb”是针对特定抗原的抗体的均质群体且可通过提供抗体分子产生的任何技术、例如通过连续培养细胞系获得。这些技术包括(但不限于)杂交瘤技术(科勒 和米尔斯坦(Milstein)，自然(Nature)，256:495-7(1975)；和美国专利第4,376,110号)、人类B细胞杂交瘤技术(库斯波(Kosbor)等人，今日免疫学(Immunology Today)，4:
72(1983)；科特(Cote)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，80:2026-30(1983))和EBV-杂交瘤技术(科尔(Cole)等人，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy)，艾伦.艾.利斯公司(Alan R.Liss,Inc.)，纽约，第77-
96页(1985))。所述抗体可具有任一免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任一子类。可在体外或体内培养产生本发明MAb的杂交瘤。高效价MAb的体内产生使得此成为当前优选的产生方法。
72(1983)；科特(Cote)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，80:2026-30(1983))和EBV-杂交瘤技术(科尔(Cole)等人，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy)，艾伦.艾.利斯公司(Alan R.Liss,Inc.)，纽约，第77-
96页(1985))。所述抗体可具有任一免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任一子类。可在体外或体内培养产生本发明MAb的杂交瘤。高效价MAb的体内产生使得此成为当前优选的产生方法。
[0252] 可使用经研发用于产生“嵌合抗体”的技术(莫里森(Morrison)等人，国家科学院院刊，81:6851-6855(1984)；武田(Takeda)等人，自然，314:452-54(1985))，其是通过将具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与具有适当生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起来进行。嵌合抗体可为其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠类MAb的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的那些。
[0253] 或者，经描述用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号；伯德(Bird)，科学(Science)242:423-26(1988)；赫斯顿(Huston)等人，美国国家科学院院刊，85:5879-83(1988)；和沃德(Ward)等人，自然，334:544-46(1989))可适于产生适用于本发明的基因-单链抗体。单链抗体通常是通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段、从而产生单链多肽来形成。
[0254] 识别特异性表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，所述片段包括(但不限于)：可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段和可通过还原F(ab′)2片段的二硫桥生成的Fab片段。或者，可构筑Fab表达文库(休斯(Huse)等人，科学，246:1275-81(1989))以容许快速且容易地鉴别出具有所需特异性的单克隆Fab片段。
[0255] 特定来说，本文单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体的相应序列一致或同源，而所述链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体的相应序列一致或同源；以及所述抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可。
[0256] 术语非人类(例如鼠类)抗体的“人类化”形式是包含衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一些实施例中，人类化抗体是如下人类免疫球蛋白(接受者抗体)：其中来自接受者超变区的残基由来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)超变区(供体抗体)的具有所需特异性、亲和力和/或能力的残基代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人类残基代替。此外，人类化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人类化抗体将包含大体上所有的至少一个且通常两个可变域，其中所有或大体上所有的超变环对应于非人类免疫球蛋白的超变环，且所有或大体上所有的FR是人类免疫球蛋白序列的FR。
人类化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。其它细节参见琼斯(Jones)等人，自然321:522-525(1986)；里希曼(Riechmann)等人，自然332:323-329(1988)；和普雷斯塔(Presta)，现代结构生物学观点
(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。
人类化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常为人类免疫球蛋白恒定区)的至少一部分。其它细节参见琼斯(Jones)等人，自然321:522-525(1986)；里希曼(Riechmann)等人，自然332:323-329(1988)；和普雷斯塔(Presta)，现代结构生物学观点
(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。
[0257] 在一些实施例中，生物标记物结合部分可结合到肽、蛋白质、蛋白片段、糖基化部分或模式或碳水化合物。生物标记物结合部分可选自结合到表1中的任一生物标记物的生物标记物结合部分，例如抗体或其片段或其它生物标记物结合部分。在一些实施例中，生物标记物结合部分可选自结合到例如以下各项的生物标记物结合部分：CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT、FMC-7、Pro2PSA、ROMA(HE4+CA-125)、OVA1(多蛋白)、HE4、纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物(DR-70)、AFP-L3％、循环肿瘤细胞(EpCAM、CD45、细胞角蛋白8、18+、19+)、HER2、NEU、前列腺干细胞抗原(PSCA)、上皮特异性抗原(ESA)、上皮细胞粘着分子(EpCAM)、α2β1、VEGFR-1、VEGFR-2、CD133、AC133抗原、p63蛋白、c-Kit、CA19-9、雌激素受体(ER)、助孕酮受体(PR)、HER-2/neu、CA-125、CA15-3、CA27.29、游离PSA、甲状腺球蛋白、核有丝分裂器蛋白(NuMA、NMP22)、α-胎儿蛋白(AFP)b、总PSA和癌胚抗原或本文所述的任一生物标记物。在一些实施例中，当生物标记物结合部分是抗CD45时，所获得的生物标记物签名是白细胞计数。
[0258] 光学对比剂
[0259] 在一些实施例中，使细胞与光学对比剂接触可包含将染料或着色剂添加到细胞。在一些实施例中，光学对比剂可为隐色染料、细胞染色剂或可用于形态分析成像的任何染料，包括例如可用于组织学、细胞学、细胞病理学或组织病理学成像的任何染料。在一些实施例中，光学对比剂通过对细胞差别染色提供细胞的视觉分类和鉴别。组织病理学成像可为用于治疗或诊断临床学的成像方法。隐色染料可为红色隐色染料、亚甲基蓝、结晶紫、酚酞、百里酚酞或亚甲基绿。
[0260] 在一些实施例中，光学对比剂可为选自以下的细胞染色剂：吉姆萨染色剂、赖德染色剂、赖德-吉姆萨染色剂、迈-格林华染色剂、马氏三色、过碘酸-希夫反应染色剂、魏格特氏弹性纤维染色剂、海登汉氏AZAN三色染色剂、地衣红染色剂、马森三色、阿新蓝染色剂、迈-格林华-吉姆萨、万吉森染色剂、汉氏染色剂、网硬蛋白染色剂、革兰氏染色剂、比尔朔夫斯基染色剂、铁蛋白染色剂、丰塔纳-马森染色剂、希尔胶体铁染色剂、五色染色剂、阿赞染色剂、罗克沙尔固蓝染色剂、高尔基氏法(还原银)、还原金、铬钒/苏木素染色剂、艾沙明蓝染色剂、亲银性染色剂、瓦辛斯-泰雷银染色剂、尼氏染色剂、苏丹黑和锇染色剂、四氧化锇染色剂、苏木素染色剂、乙酸双氧铀染色剂、柠檬酸铅染色剂、卡红染色剂、番红精染色剂和齐-尼染色剂。
[0261] 在一些实施例中，光学对比剂可为选自以下的染料或着色剂：伊红Y、伊红B、天青B、派洛宁G、孔雀石绿、甲苯胺蓝、酞菁铜、阿新蓝、金胺-玫瑰红、酸性品红、苯胺蓝、橙黄G、酸性品红、中性红、苏丹黑B、吖啶橙、油红O、刚果红、固绿FCF、波尔斯普鲁士蓝反应、核固红、碱性红霉素B和萘黑。
[0262] 在一些实施例中，可对经光学对比剂标记的细胞选择性脱色。选择性脱色可包含去除染色剂、使染色剂或染料转化成无色形式或降解染料。染色剂可通过洗涤去除。洗涤可在不同于与染色剂接触期间的pH存在下进行，使得经染色蛋白的总电荷发生变化，由此实现染色剂的去除。洗涤可用在改变的pH下溶解染色剂的溶剂系统进行。在一些实施例中，光学对比剂可为隐色染料。在一些实施例中，隐色染料可通过将一或多个电子添加到染料转化成无色形式。电子可通过还原方法添加到染料。还原方法可通过电化学还原、光还原或与还原剂反应来实现。还原剂可为氰基硼氢化钠、硼氢化钠、NADH(原位形成或单独添加)、抗坏血酸(和其盐，例如抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸铵等)或二硫苏糖醇(DTT)。在一些实施例中，隐色染料可通过从染料去除一或多个电子转化成有色形式。一或多个电子可通过氧化方法从染料去除。氧化方法可通过电化学氧化、光氧化或与氧化剂反应来实现。在一些实施例中，氧化剂可为NAD+、NADP+、丙酮酸盐、乙醛、胱氨酸、α-酮戊二酸盐、泛醌、2细胞色素c、2细胞色素c、2细胞色素a3或氧。
[0263] 当样品来自组织时，光学对比剂可为H&E(苏木素和伊红)染色剂。在一方面中，光学对比剂可适于超活染色。在一方面中，光学对比剂可适于活体染色。
[0264] 来自使光学对比剂成像的细胞形态
[0265] 组织病理学分析通常涉及使与光学对比剂接触的样品成像。在一些方面中，细胞形态特征可通过细胞的视觉特性(包括或不包括例如大小、形状或存在和/或不存在有色内体)来鉴别。在一些实施例中，使接触细胞的形态特征成像可包含测量光学对比剂的光学性质。光学对比剂的光学性质可包括或不包括例如吸光度、散射、荧光、光致发光、拉曼发射和光致发光寿命。在优选实施例中，通过光学对比剂检测的光学性质是光的吸光度。所吸收光的波长可为紫外范围到红外范围。优选地，所吸收光的波长在可见范围(300-800nm)内。光学对比剂的光学性质可在显微镜下使用亮视野照明或暗视野照明来测量。
[0266] 在一些实施例中，从细胞鉴别的形态特征可包含细胞表面形状、细胞核形状、染色质形状、核仁形状、核仁数量、癌症等级(与正常细胞的接近度)、细胞排列或前述的组合。在一些实施例中，可比较从个体的细胞鉴别的形态特征与个体的先前获得的细胞以确定细胞是否随时间展现发育不良。
[0267] 在形态上，癌细胞的特征在于大核、具有不规则大小和形状、突出的核仁和稀少的深色或浅色细胞质。细胞核随时间的变化可由细胞表面、体积、核/细胞质比率、形状、密度、结构和均质性成像。可成像的细胞的其它形态特征是与以下各项相关的特性：核分割、内陷、染色质变化(例如异染色质减少、染色质间和周染色质颗粒增多)、核膜孔增大和形成包涵体等。癌细胞的核仁的特征可在于肥大、宏观分离和微分离、其向膜移动、数量增多和在核膜与核仁之间形成核内小管系统。在一些实施例中，恶性癌细胞可展现有丝分裂。在恶性癌细胞中，有丝分裂的次数可增加，且形成有丝分裂纺锤体缺陷的非典型有丝分裂，此产生三倍体或四倍体星体(星形细胞结构，包含微管，在有丝分裂期间在每一中心体周围形成)和染色体的不对称结构和非典型形式。在一些实施例中，癌细胞可展现核变化，其可解释与这些变化相关的不同细胞克隆和遗传异常的存在。
[0268] 癌细胞的细胞质也可发生变化，且出现新结构外观或正常结构消失。在一些实施例中，癌细胞的新结构可为细胞质包涵体。细胞质包涵体可包括奥氏小体(Auer rod)、可染色细胞粒状材料团，其形成在白血病母细胞(部分分化的细胞)的细胞质中可见的细长针状物。在一些肿瘤形式中，发生细胞凋亡，且在细胞质中存在细胞凋亡体。
[0269] 恶性癌细胞具有少量细胞质，通常具有液泡(vacuoles)。
[0270] 在癌细胞中，粒状内质网可展现简化的结构外观。ER可为非晶形，且粒状或丝状材料积聚于扁囊中。在一些实施例中，可观察到片段化和脱粒，且粒状内质网与线粒体之间的连接中断。来自肿瘤细胞的粒状内质网可随着游离核糖体和多核糖体的增多而增多。
[0271] 在癌细胞中，高尔基体可发育不良，此指示缺少肿瘤细胞分化。已完全丧失分化的癌细胞可展现高尔基体。
[0272] 癌细胞线粒体的体积可随着肿瘤发展而减小。线粒体可显示形状和体积的高变异性，且观察到极大线粒体。癌细胞线粒体晶体可不同于正常细胞，且基质中存在包涵体和固缩图像。
[0273] 癌细胞可展现次级溶酶体、髓磷脂结构和脂褐质颗粒。
[0274] 癌细胞膜可展现表面受体数量增加或减少，从而改变细胞对宿主调控机制的敏感性；不再与相应配体反应的蛋白质或表面受体的结构变化；和存在为胚胎组织所特有的新表面分子，其藏于成人细胞的表面上。异常表面分子能够起抗原作用且通过体液和细胞防御机制来识别。肿瘤细胞可被免疫复合物覆盖，此容许补体破坏抗体所覆盖的细胞且容许吞噬细胞攻击被调和的细胞。在一些实施例中，免疫复合物可包含生物标记物。
[0275] 在一些实施例中，在恶性细胞中受体在细胞表面上的分布发生变化，此会改变细胞凝集行为。
[0276] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可进一步包含：(h)基于每一细胞的生物标记物形态轮廓来诊断个体的病况。在一些方面中，个体的病况可包括存在血液癌症、非恶性血液病症、实体肿瘤、肾病、膀胱疾病、肝病或传染病。血液癌症可为白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。非恶性血液病症可为贫血或镰状细胞疾病。实体肿瘤可为乳癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、结肠直肠癌或膀胱癌。当实体肿瘤为乳癌时，生物标记物可为例如Her2或Neu。在一些实施例中，肾病可为急性肾损伤、慢性肾病、狼疮性肾炎、肾排斥或子痫前症。在一些实施例中，传染病可为HIV、肝炎、性传播疾病或败血症。在一些实施例中，血液癌症可进一步包含循环癌细胞。
[0277] 在一些实施例中，当个体的病况是癌症时，个体的病况可进一步通过恶性病谱系来鉴别。例如，恶性病谱系可为阴性、骨髓系、淋巴T细胞系或淋巴B细胞系。
[0278] 使细胞与功能化纳米粒子接触
[0279] 如本文所用的术语“接触”通常是指提供一种组分、试剂、分析物或样品对另一种组分、试剂、分析物或样品的接近(access)。例如，接触可涉及混合包含功能化纳米粒子的溶液与包含细胞的样品。包含一种组分、试剂、分析物或样品的溶液还可包含另一组分或试剂，例如二甲亚砜(DMSO)或清洁剂，其使混合、相互作用、摄取或其它物理或化学现象有利于组分、试剂、分析物和/或样品之间的接触。在本发明的一些实施例中，接触涉及利用递送装置(例如基于吸量管的器件或基于注射器的器件)将包含功能化纳米粒子的溶液添加到包含细胞的样品。
[0280] 可使细胞与功能化纳米粒子反应以产生功能化纳米粒子-细胞复合物。在一些实施例中，可通过使细胞和功能化纳米粒子经受外力以增加功能化纳米粒子和细胞的局部浓度使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触。外力可为重力、电力或磁力。重力可通过离心生成。离心可为脉冲式。脉冲持续时间可为10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、1分钟或2分钟。脉冲持续时间可为1分钟到2分钟、2分钟到3分钟、3分钟到4分钟、4分钟到5分钟或上文所提到时间之间的任一时间段。磁力可通过顺磁性纳米粒子来实现，其中纳米粒子的核心包含顺磁性区域且纳米粒子的外壳可包括或不包括Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se或其混合物或合金。顺磁性区域可包含磁性氧化铁(Fe2O3)。在一些实施例中，可将带电物质添加到包含细胞的溶液，然后使细胞与功能化纳米粒子接触以防止凝聚或增强功能化纳米粒子渗透到细胞中。在一些实施例中，带电物质可为带电聚合物，其可在首先提供包含来自个体的细胞的样品后添加到细胞。
[0281] 当功能化纳米粒子经受高重力时，其可不可逆地凝聚。在一些实施例中，可在与功能化纳米粒子接触期间将电中性有机物添加到细胞以防止/减少/抑制功能化纳米粒子凝聚。电中性有机物可为具有高介电常数的溶剂或电中性表面活性剂。在一些实施例中，电中性表面活性剂可包括或不包括例如吐温(Tween)、布里杰(Brij)、司盘(Span)、IGEPAL、MERPOL、曲通(Triton)或普流尼克(Pluronic)表面活性剂。在一些方面中，吐温表面活性剂可包括或不包括例如吐温20、吐温40、吐温60或吐温85。在一些方面中，普流尼克表面活性剂可包括或不包括例如普流尼克408、普流尼克P-123、普流尼克F-68、普流尼克F-127、普流尼克L31、普流尼克L35、普流尼克F-108、普流尼克L-61、普流尼克L-81、普流尼克L-64、普流尼克L-121、普流尼克10R5、普流尼克17R4、普流尼克31R1或普流尼克188。在一些方面中，布里杰表面活性剂可包括或不包括例如布里杰52、布里杰58、布里杰C10、布里杰L4、布里杰O10、布里杰S10、布里杰S20或布里杰S100。在一些方面中，IDEPAL表面活性剂可包括或不包括例如IGEPAL CA-520、IGEPAL CA-720、IGEPAL CO-520、IGEPAL CO-630、IGEPAL CO-720、IGEPAL CO-890或IGEPAL DM-970。在一些方面中，司盘表面活性剂可为司盘40。在一些方面中，MERPOL表面活性剂可包括或不包括例如MERPOL DA、MERPOL HCS、MERPOL OJ、MERPOL SE、MERPOL SE或MERPOL A。在一些方面中，曲通表面活性剂可包括或不包括例如曲通X-100、曲通X-114或曲通X-405。在一些方面中，表面活性剂可为脱水山梨醇单油酸酯或脱水山梨醇单棕榈酸酯。在一些方面中，具有高介电常数的溶剂可包括或不包括例如DMSO(二甲亚砜)、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、THF(四氢呋喃)、乙醇、异丙醇或任何n-醇，其中n为3到8。
[0282] 功能化纳米粒子的共振光散射检测
[0283] 如本文所用的术语“检测”是指验证给定纳米粒子或粒子存在的任一方法。用于实现此目的的技术可包括(但不限于)共振光散射或等离子体共振。
[0284] 共振光散射是一种物理现象，其中直径小于入射光波长的粒子展现粒子周围的表面等离子体波且所述波与粒子的圆周相干。粒子电子可与入射光同相共振，形成发射呈散射光形式的能量的电磁偶极子。反射(散射)光的波长是组成、形状和粒径的函数。在一些实施例中，粒子的组成可为贵金属，例如金或银。在一些实施例中，粒子的大小低于白光的波长(低于300nm)。
[0285] 可使用来自展现共振光散射效应的粒子的散射光作为超灵敏分析物检测的信号。(岳拉得(Yguerabide),J.等人，分析生物化学(Analytical Biochemistry)，262；137-156(1998))。使用波长小于光波长的粒子的优点是：(a)可在悬浮液中在低浓度下通过眼睛和简单照明器、例如使用暗视野照明检测粒子，(b)作为光源的粒子不会光漂白，(c)可通过改变用于多色多路复用的粒径或组成来改变散射光的色彩，和(d)粒子可与用于特异性分析物检测的生物标记物结合部分偶联。
[0286] 在一些方面中，来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射可使用瞬逝或非瞬逝光来检测。在一些方面中，非瞬逝光可为透射光。复合纳米粒子的共振光散射可在暗视野照明下成像时进行检测。在一些方面中，经照射的载玻片架可代替显微镜中的暗视野聚光器。经照射的载玻片架可利用全内反射(TIRF)来照射载玻片架。TIRF照明可消除或减少来自衬底表面上的其它光散射元件的散射。TIRF照明不会像透照暗视野照明一样与所述表面碎片相互作用。
[0287] 经TIRF照射的载玻片架可通过TIRF显微术来分析。本发明者已意识到，在本发明中使用TIRF显微术会减少来自焦面外部的背景荧光且可显著改良信号噪声比，并因此改良从纳米粒子散射的共振光的空间分辨率。TIRF显微术将诱导性瞬逝波用于紧邻具有不同折射率的两种介质之间的界面的有限衬底区中。在一些实施例中，所用TIRF界面可为衬底与玻璃盖玻片或组织培养容器之间的接触区域。经照射的载玻片架可包含光纤以将光递送到载玻片的边缘。经照射的载玻片架可为达科莱特垂直式照明器(Darklite Vertical Illuminator)(微视频仪器公司(Micro Video Instruments,Inc)，马萨诸塞州埃文(Avon,MA))。
[0288] 在一些实施例中，暗视野照明器可将有效的低角度照明提供到衬底的靶向区域。暗视野照明器可包含LED(发光二极管)。LED可经定位以提供低角度照明，从而提供高对比度图像。在一些实施例中，暗视野照明器可为来自微扫描系统公司(Microscan Systems,Inc.)(华盛顿州伦顿(Renton,WA))的DF-50、DF-150、DF-200照明器。
[0289] 在一些实施例中，暗视野显微术系统可包含具有高NA(数值孔径)聚光器以及非瞬逝照明、减振和杂散光减少的系统以改良暗视野性能。在一些实施例中，可使用美国专利第6,704,140号中所述的倒置暗视野对比系统，所述专利的全文均以引用方式并入本文中。
[0290] 在一些实施例中，经照射的载玻片架可由透射光照射。在一些实施例中，经照射的载玻片架可由落射照明来照射。在一些实施例中，落射照明源可来自激光。
[0291] 在一些实施例中，可调整询问时间以检测所有纳米粒子，同时最小化任何具体纳米粒子物质的饱和度。一些纳米粒子在询问时间过长时可展现泛光效应。在一些实施例中，可在例如1秒、500毫秒、200毫秒、100毫秒、50毫秒、25毫秒、10毫秒、5毫秒、2毫秒、1毫秒或0.2毫秒下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测。在一些实施例中，可在例如2秒到1秒、1秒到500毫秒、500毫秒到200毫秒、200毫秒到100毫秒、100毫秒到50毫秒、50毫秒到25毫秒、25毫秒到10毫秒、10毫秒到5毫秒、5毫秒到2毫秒、2毫秒到1毫秒、1毫秒到
0.2毫秒或任一前述时间段之间的任何时间下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测。在一些实施例中，暗视野照明可包含具有不同波长的LED。不同波长可以并行或串行方式施加。当不同波长是以串行方式施加时，用于每一不同LED波长的询问时间可发生变化。在一些实施例中，当施加一个LED波长时，可在例如1秒、500毫秒、200毫秒、100毫秒、
50毫秒、25毫秒、10毫秒、5毫秒、2毫秒、1毫秒或0.2毫秒下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测；当施加不同LED波长时，则在例如1秒、500毫秒、200毫秒、100毫秒、50毫秒、25毫秒、10毫秒、5毫秒、2毫秒、1毫秒或0.2毫秒下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测。在一些实施例中，软件控制系统可调整检测时间，比较两次或更多次询问的检测结果，当询问两次或更多次时正规化两个或更多个不同纳米粒子的相对强度，和/或将功能化纳米粒子的结合动力学和/或强度正规化到其目标值。
0.2毫秒或任一前述时间段之间的任何时间下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测。在一些实施例中，暗视野照明可包含具有不同波长的LED。不同波长可以并行或串行方式施加。当不同波长是以串行方式施加时，用于每一不同LED波长的询问时间可发生变化。在一些实施例中，当施加一个LED波长时，可在例如1秒、500毫秒、200毫秒、100毫秒、
50毫秒、25毫秒、10毫秒、5毫秒、2毫秒、1毫秒或0.2毫秒下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测；当施加不同LED波长时，则在例如1秒、500毫秒、200毫秒、100毫秒、50毫秒、25毫秒、10毫秒、5毫秒、2毫秒、1毫秒或0.2毫秒下完成一些所观察到复合纳米粒子的共振光散射的检测。在一些实施例中，软件控制系统可调整检测时间，比较两次或更多次询问的检测结果，当询问两次或更多次时正规化两个或更多个不同纳米粒子的相对强度，和/或将功能化纳米粒子的结合动力学和/或强度正规化到其目标值。
[0292] 在一些实施例中，照明可包含一或多次信号曝光。可存在例如1次、2次、3次、4次或5次信号曝光。每一信号曝光可持续不同时间。软件控制系统可调整检测时间，比较两次或更多次询问的检测结果和/或当询问两次或更多次时正规化两个或更多个不同纳米粒子的相对强度。
[0293] 在一些实施例中，一或多种功能化纳米粒子物质可包含直径为5nm到200nm的纳米粒子。在一些实施例中，纳米粒子可包括或不包括直径为5纳米、7纳米、10纳米、12纳米、15纳米、20纳米、25纳米、30纳米、35纳米、40纳米、45纳米、50纳米、55纳米、60纳米、65纳米、70纳米、75纳米、80纳米、85纳米、90纳米、95纳米、100纳米、105纳米、110纳米、115纳米、120纳米、125纳米、130纳米、135纳米、140纳米、145纳米、150纳米、155纳米、160纳米、165纳米、170纳米、175纳米、180纳米、185纳米、190纳米、195纳米或200纳米(nm)的大小。在一些实施例中，纳米粒子可包括或不包括以下大小：4nm到6nm、6nm到8nm、9nm到11nm、11nm到13nm、
14nm到16nm、19nm到21nm、24nm到26nm、29nm到31nm、34nm到36nm、39nm到41nm、44nm到46nm、
49nm到51nm、54nm到56nm、59nm到61nm、64nm到66nm、69nm到71nm、74nm到76nm、79nm到81nm、
84nm到86nm、89nm到91nm、94nm到96nm、99nm到101nm、104nm到106nm、109nm到111nm、119nm到121nm、124nm到126nm、129nm到131nm、134nm到136nm、139nm到141nm、144nm到146nm、
149nm到151nm、154nm到156nm、159nm到161nm、164nm到166nm、169nm到171nm、174nm到
176nm、179nm到181nm、184nm到186nm、189nm到191nm、194nm到196nm、199nm到201nm或任一前述大小之间。在一些实施例中，纳米粒子的大小分布可小于25％变异系数(CV)、小于20％CV、15％CV、小于10％CV、小于5％CV或小于4％、3％、2％或小于1％CV或任两个所列举百分比之间的任一范围。在一些实施例中，当从侧面轮廓观察时，直径可在粒子各侧之间的最大距离或粒子各侧之间的最小距离处测量。在一些实施例中，纳米粒子可由如本文所述的任一金属或金属组合物制得。
14nm到16nm、19nm到21nm、24nm到26nm、29nm到31nm、34nm到36nm、39nm到41nm、44nm到46nm、
49nm到51nm、54nm到56nm、59nm到61nm、64nm到66nm、69nm到71nm、74nm到76nm、79nm到81nm、
84nm到86nm、89nm到91nm、94nm到96nm、99nm到101nm、104nm到106nm、109nm到111nm、119nm到121nm、124nm到126nm、129nm到131nm、134nm到136nm、139nm到141nm、144nm到146nm、
149nm到151nm、154nm到156nm、159nm到161nm、164nm到166nm、169nm到171nm、174nm到
176nm、179nm到181nm、184nm到186nm、189nm到191nm、194nm到196nm、199nm到201nm或任一前述大小之间。在一些实施例中，纳米粒子的大小分布可小于25％变异系数(CV)、小于20％CV、15％CV、小于10％CV、小于5％CV或小于4％、3％、2％或小于1％CV或任两个所列举百分比之间的任一范围。在一些实施例中，当从侧面轮廓观察时，直径可在粒子各侧之间的最大距离或粒子各侧之间的最小距离处测量。在一些实施例中，纳米粒子可由如本文所述的任一金属或金属组合物制得。
[0294] 在一些实施例中，每一纳米粒子制剂具有窄大小分布。窄大小分布意指个别纳米粒子制剂具有半最大全宽介于5nm到150nm范围内的散射光谱。(参见陈(Chen)等人，生物医学光学期刊(Journal of Biomedical Optics)10(2),024005(2005年3月/4月))。在一些实施例中，个别纳米粒子制剂具有半最大全宽介于5nm到50nm范围内的散射光谱。在一些实施例中，对成像视野中的每一像素收集光散射光谱。然后，通过纳米粒子的空间分布表示每一分子靶标的空间分布，所述纳米粒子的空间分布进而通过在每一像素存在和/或不存在其共振光散射峰来报告。所述大小分布可与每一纳米粒子制剂的组成变化组合来实现更大的多路复用能力。
[0295] 在一些实施例中，纳米粒子可包含贵金属。纳米粒子可包含金属，所述金属可包括或不包括Ag、Au、Pt、Pd、Rh、Ro、Al、Cu、Ru、Cr、Cd、Zn、Si、Se或其混合物或合金。合金可为金(Au)和银(Au)的合金。在一些实施例中，合金可具有铜(Cu)和金(Au)以调节反射光的强度(参见苏(Su),Y.等人，纳米研究快报(Nanoscale Research Letters)，8:408,2013)。在一些实施例中，可调整合金的组成以影响反射光的强度。在一些实施例中，可调整合金组成以调节反射光的波长。纳米粒子可包含离散外壳或层中的所列示金属的混合物。例如，纳米粒子可包含Au核心和Si或SiO2(二氧化硅)外壳。在一些实施例中，核心可为Fe2O3。在一些实施例中，纳米粒子为球形、管形、圆柱形、锥形、立方体形、卵形、t骨形、海胆或玫瑰状(具有尖钉状不均匀表面)或中空形。在一些实施例中，纳米粒子可具有圆形、卵圆形、三角形、正方形、卵形或t骨形横切面。
[0296] 在一些实施例中，纳米粒子可包含一化学基团，可向所述化学基团添加其它官能团，例如链霉抗生物素蛋白、生物素、氨基功能化聚葡萄糖、生物标记物结合部分或寡核苷酸或可释放或可置换纳米粒子系统的其它组分。化学基团可为例如硫辛酸、硫辛酸的还原形式、胺、羧酸、炔烃、叠氮化物或-NHS。
[0297] 在一些实施例中，纳米粒子可为本文所述任一纳米粒子的大小。
[0298] 在一些实施例中，纳米粒子可包括或不包括Pt 30nm、50nm或70nm(纳诺康波西克斯(Nanocomposix)编号PTCN30-25M、PTCN50-25M、PTCN70-25M)；Ag 5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、75nm、80nm、100nm或200nm(纳诺康波西克斯编号AGCN5-25M、AGCN10-25M、AGCN20-25M、AGCN30-25M、AGCN40-25M、AGCN05-25M、AGCN60-25M、AGCN70-25M、AGCN75-25M、AGCN80-25M、AGCN100-25M或AGCN200-25M)；Au 5nm、7nm、10nm、12nm、15nm、
20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm或100nm(纳诺康波西克斯编号AUCN5-25M、AUCN7-
25M、AUCN10-25M、AUCN12-25M、AUCN15-25M、AUCN20-25M、AUC30-25M、AUCN40-25M、AUCN50-
25M、AUCN60-25M、AUCN70-25M、AUCN80-25M或AUCN100-25M)；Ag 75nm或100nm纳米立方体(纳诺康波西克斯编号SCPH75-1M、SCPH100-1M)；550nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN550-25M)；650nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN650-25M)；750nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN750-25M)；850nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号
SPPN850-25M)；950nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN950-25M)；1050nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN1050-25M)；1150nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯定制订单)；660nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN660-25M)、800nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN800-25M)、980nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN980-
25M)；660nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN660-10M)、800nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN800-10M)、980nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN980-10M)；
30nm Au50Ag50合金(50/50)(细胞诊断(Cytodiagnostics)编号GSA-30-20)、30nm
Au80Ag20合金(80/20)(细胞诊断编号GSB-30-20)、30nm Au20Ag80(20/80)(细胞诊断编号GSC-30-20)；来自细胞诊断的金纳米棒(25nm直径、650nm最大绝对值-GRC3K-25-650-25)；
功能化和非功能化纳米海胆状结构(细胞诊断)-50nm(GU-50-20)、60nm(GU-60-20)、70nm(GU-70-20)、80nm(GU-80-20)、90nm(GU-90-20)和100nm(GU-100-20)。
20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm或100nm(纳诺康波西克斯编号AUCN5-25M、AUCN7-
25M、AUCN10-25M、AUCN12-25M、AUCN15-25M、AUCN20-25M、AUC30-25M、AUCN40-25M、AUCN50-
25M、AUCN60-25M、AUCN70-25M、AUCN80-25M或AUCN100-25M)；Ag 75nm或100nm纳米立方体(纳诺康波西克斯编号SCPH75-1M、SCPH100-1M)；550nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN550-25M)；650nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN650-25M)；750nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN750-25M)；850nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号
SPPN850-25M)；950nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN950-25M)；1050nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯编号SPPN1050-25M)；1150nm共振Ag纳米板(纳诺康波西克斯定制订单)；660nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN660-25M)、800nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN800-25M)、980nm共振Au纳米外壳(纳诺康波西克斯编号GSPN980-
25M)；660nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN660-10M)、800nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN800-10M)、980nm共振Au纳米棒(纳诺康波西克斯编号GRCN980-10M)；
30nm Au50Ag50合金(50/50)(细胞诊断(Cytodiagnostics)编号GSA-30-20)、30nm
Au80Ag20合金(80/20)(细胞诊断编号GSB-30-20)、30nm Au20Ag80(20/80)(细胞诊断编号GSC-30-20)；来自细胞诊断的金纳米棒(25nm直径、650nm最大绝对值-GRC3K-25-650-25)；
功能化和非功能化纳米海胆状结构(细胞诊断)-50nm(GU-50-20)、60nm(GU-60-20)、70nm(GU-70-20)、80nm(GU-80-20)、90nm(GU-90-20)和100nm(GU-100-20)。
[0299] 在一些实施例中，纳米粒子可展现240nm到1150nm的纳米粒子等离子体共振的峰值共振波长。在一些实施例中，纳米粒子可展现400纳米到900nm的纳米粒子等离子体共振的峰值共振波长。
[0300] 在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可为2到347种不同种类的功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，高达347种功能化纳米粒子物质可包含高达50种不同类型的纳米粒子，且每一多种功能化纳米粒子物质可包含50种功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可为2到50种不同种类的功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可为2到10种不同种类的功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可为2到5种不同种类的功能化纳米粒子物质。
[0301] 在一些实施例中，每种功能化纳米粒子物质可被不同种类的生物标记物结合部分功能化。在一些实施例中，每种功能化纳米粒子物质被不同的生物标记物结合部分功能化。
[0302] 在一些实施例中，纳米粒子可通过使用链霉抗生物素蛋白-生物素结合功能化。图4、5和6绘示一些实施例，纳米粒子可通过所述实施例功能化。在一些实施例中，可通过图4中所绘示的方法用EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺)活化经羧酸官能团涂布的纳米粒子，然后洗涤以产生EDC功能化纳米粒子。可使用其它酰胺偶合剂来代替EDC，例如DCC(二环己基碳二亚胺)、EDAC·HCl、(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺·HCl)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOOBt(HODhbt)(羟基-3,4-二氢-4-氧代基-1,2,3-苯并三嗪)、HOAt(1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑)、DMAP(4-(N,N-二甲基氨基)吡啶)、BOP(苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基-鏻六氟磷酸盐)、PyOxim(乙基氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯基-O2)-三-(1-吡咯烷基)-鏻六氟磷酸盐)、PyBrOP(7-氮杂-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)、DEPBT(3-(二乙氧基-磷酰基氧基)-1,2,3-苯并[d]三嗪-4(3H)-酮)、TBTU/HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基铵四氟硼酸盐/六氟磷酸盐)、HCTU((2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基铵六氟磷酸盐)、HDMC(N-[(5-氯-1H-苯并三唑-1-基)-二甲基氨基-吗啉基]-脲鎓六氟磷酸盐N-氧化物)、HATU(2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基铵六氟磷酸盐)、COMU(1-[1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代基亚乙基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉基]-脲鎓六氟磷酸盐)、TOTT((2-(1-氧基-吡啶-2-基)-1,1,3,3-四甲基异硫脲鎓四氟硼酸盐)、TFFH(四甲基氟甲脒六氟磷酸盐)、EEDQ(N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉)、T3P(2-丙烷膦酸酐)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐)或CDI(1,1’-羰基二咪唑)。在一些替代性实施例中，偶合可在碱存在下进行。碱可为有机碱或无机碱。无机碱可包括或不包括例如碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。有机碱可为三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲基吗啉(NMM)。
[0303] 洗涤可为pH温和洗涤以不水解NHS部分。温和pH洗涤可使用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水，pH约7.4)进行。然后，可使链霉抗生物素蛋白与EDC功能化纳米粒子反应以产生链霉抗生物素蛋白功能化纳米粒子。可使用其它抗生物素蛋白样分子来代替链霉抗生物素蛋白，例如：已结合一种、两种或三种生物素的抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、超级抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白。在一些实施例中，生物标记物结合部分可经生物素功能化。在一些实施例中，生物标记物结合部分是抗体。抗体可与交联剂(例如磺基-SMCC(皮尔斯(Pierce)))、随后与硫醇偶联的生物素反应以产生生物素化抗体。在替代性实施例中，抗体可与NHS偶联的生物素反应，其中NHS偶联的生物素可与抗体上的任何游离胺(优选地来自赖氨酸残基的游离胺)反应以产生生物素化抗体。在替代性实施例中，抗体可与DTT(二硫赤藻糖醇)反应以使二-硫醇半胱氨酸键断裂，从而产生游离磺酰氢基。磺酰氢基可与马来酰亚胺偶联的生物素反应以产生生物素化抗体。在一些实施例中，可购买具有选自以下的官能团的纳米粒子：羧酸、NHS、链霉抗生物素蛋白、胺、炔烃或醛。生物素化抗体可与链霉抗生物素蛋白功能化纳米粒子反应以产生直接连接的抗体功能化纳米粒子。
[0304] 术语“多核苷酸”和“核酸(分子)”可互换使用且是指任一长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核苷酸可具有任何三维结构，且可执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括单链、双链和三股螺旋分子。“寡核苷酸”通常是指单链或双链核酸、通常DNA的5个与约100个核苷酸之间的多核苷酸。寡核苷酸还称为寡聚物(oligomers或oligos)且可从基因分离或通过业内已知的方法合成(例如化学或酶)。“引物”是指提供3′-羟基末端以引发酶介导的核酸合成的寡核苷酸、通常为单链。以下是多核苷酸的非限制性实施例：基因、基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、具支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。核酸分子还可包含经修饰核酸分子，例如甲基化核酸分子和核酸分子类似物。嘌呤和嘧啶的类似物为业内已知，且包括(但不限于)氮丙啶基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、
5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊氧基尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。使用尿嘧啶取代脱氧核糖核酸中的胸腺嘧啶也视为嘧啶的类似形式。
5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶、5-戊氧基尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。使用尿嘧啶取代脱氧核糖核酸中的胸腺嘧啶也视为嘧啶的类似形式。
[0305] 糖修饰(例如2′-o-甲基、2-氟等)和磷酸酯主链修饰(例如吗啉基、PNA′、硫代酯、二硫代酯、膦酸甲酯等)可单独或组合纳入本发明核酸分子中。在一些实施例中，例如，本发明核酸可包含经修饰糖和经修饰磷酸酯主链。在另一实施例中，本发明核酸可包含糖、碱基和磷酸酯主链的修饰。
[0306] 本发明核酸的核苷酸序列不如需要其执行的功能作用重要。因此，结合对的核酸序列以及核酸组分的长度可显著变化，只要结合对的核酸组分仍可执行需要其执行的功能作用即可。重要的是，结合对的核酸序列和长度并不限于本文所揭示实例性结合对的那些确切序列和长度。因此，结合对的核酸可具有不同长度和或序列。本发明结合对的核酸组分的重要功能是通过与核酸的互补链杂交形成核酸双链体的能力提供生物标记物结合部分与功能化纳米粒子之间的连接体。
[0307] 核酸双链体的稳定性部分取决于双链体的核酸链之间的互补区的长度。核酸之间的较长互补区或重叠会增加所形成双链体的稳定性。相反，较短重叠使得双链体较不稳定。双链体的稳定性可作为熔融温度Tm的函数来测量，其中高度稳定的双链体产生高Tm且较不稳定的双链体产生较低Tm。本发明核酸经设计以具有所定义稳定性，其可通过改变长度、温度、主链组成、碱基对选择、碱基对结构、糖结构、溶剂和其它条件来操纵。影响杂合体稳定性的因素包括(但不限于)经核酸标记的结合对的浓度、盐浓度、温度、有机溶剂(例如乙醇、DMSO)、四甲基铵离子(TMA+)、碱基对失配等。
[0308] 在一些实施例中，可改变寡核苷酸的主链组成以产生具有所选相对双链体强度的寡核苷酸。产生更稳定双链体的寡核苷酸主链可选自：肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或正常脱氧核糖核酸(DNA)。产生较不稳定双链体的寡核苷酸主链可选自：解锁核酸、膦酸甲酯或硫代膦酸酯。PNA具有肽主链而非正常DNA的核糖-磷酸酯主链。PNA主链是由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥(-CH2-)和羰基(-(C＝O)-)连接到PNA主链。因此，PNA主链缺少带电磷酸酯基团。PNA无法容易地由天然核酸酶或蛋白酶识别，此使其能够抵抗酶降解且具pH稳定性。LNA主链包含核糖部分，其经连接2'氧和4'碳的外桥修饰，从而将核糖锁于3'-内式(北方(North))构象中。锁核糖构象增强碱基堆积和主链预组织，显著增加LNA/DNA双链体的双链体稳定性。膦酸甲酯主链代替具有中性膦酸甲酯的带电阴离子磷酸酯。所得主链电荷减少产生相对于正常DNA主链较不稳定的双链体，但仍赋予核酸酶活性抗性。硫代膦酸酯主链包含磷酸酯主链上的非桥接氧以形成硫代磷酸酯(PS)键联。相对于正常DNA主链，硫代膦酸酯主链展现核酸酶抗性和较不稳定的双链体。
[0309] 在一些实施例中，双链体稳定性可通过纳入一或多个非天然碱基对来调整。在一些实施例中，非天然碱基可为异G或异C，如里歇特(Richert),C.等人，美国化学学会会志(J.Am.Chem.Soc.)118,4518-4531(1996)中所述，其是以引用方式并入本文中。在一些实施例中，非天然碱基可为二氟甲苯，如史怀哲(Schweitzer),B.A.等人，美国化学学会会志117,1863-1872(1995)中所述，其是以引用方式并入本文中。在一些实施例中，非天然碱基可为MMO2或SICS，如勒孔特(Leconte),A.M.等人，美国化学学会会志130,2336-2343(2008)中所述，其是以引用方式并入本文中。在一些实施例中，非天然碱基可为Ds或二醇1-Px，如山重(Yamashige),R.等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)40,2793-2806(2012)中所述，其是以引用方式并入本文中。在一些实施例中，非天然碱基可为P或Z，如杨(Yang),Z.等人，美国化学学会会志133,15105-15112(2011)中所述，其是以引用方式并入本文中。在一些实施例中，非天然碱基可为NaM或5SICS，如马里雪夫(Malyshev),D.A.等人，美国国家科学院院刊
109,12005-12010(2012)，其是以引用方式并入本文中。
109,12005-12010(2012)，其是以引用方式并入本文中。
[0310] 在一些实施例中，纳米粒子可通过图4中所绘示的方法经第一寡核苷酸功能化功能化。可使羧酸功能化纳米粒子与EDC/NHS反应，然后进行温和pH洗涤。然后，可使EDC功能化纳米粒子与氨基功能化寡核苷酸反应以产生寡核苷酸功能化纳米粒子，如图5中所显示。在一些实施例中，在通过使未反应的EDC与小分子胺反应混合其它功能化纳米粒子物质时，可使未反应的EDC基团反应以防止与所述物质串扰。小分子胺可为乙醇胺。在另一实施例中，可使EDC功能化纳米粒子与链霉抗生物素蛋白反应以产生链霉抗生物素蛋白功能化纳米粒子。可使链霉抗生物素蛋白功能化纳米粒子与经生物素修饰的寡核苷酸反应以产生寡核苷酸功能化纳米粒子。可通过在混合一种寡核苷酸功能化纳米粒子与其它各种寡核苷酸功能化纳米粒子之前添加游离生物素来阻断未反应的链霉抗生物素蛋白。在一些实施例中，生物标记物结合部分可经第二寡核苷酸功能化，如图5中所显示。在一些实施例中，生物标记物结合部分是抗体。可使抗体与DTT(二硫赤藻糖醇)反应以产生游离磺酰氢基。可使磺酰氢基与马来酰亚胺功能化第二寡核苷酸反应。在一些实施例中，偶联到功能化生物标记物结合部分(例如抗体)的第二寡核苷酸可包含与第一寡核苷酸的一部分互补的部分，且第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交形成包含双链核酸的连接体。在一些实施例中，第一和第二寡核苷酸均可包含与第三寡核苷酸的一部分互补的部分，所述第三寡核苷酸可用作桥接寡核苷酸，如图6中所显示。本文所论述的经修饰寡核苷酸可与修饰剂一起用于3’或5’末端。当第一寡核苷酸在5’末端偶联到纳米粒子时，选择第二寡核苷酸的相应末端使得两个寡核苷酸在直接杂交或通过桥接寡核苷酸间接杂交时在适当方向上互补。
[0311] 在一些实施例中，当纳米粒子包含二氧化硅(SiO2)外壳时，纳米粒子可经功能化硅烷功能化。硅烷可溶解于有机溶剂中。有机溶剂可为乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺。硅烷可为三甲氧基、二甲氧基、单甲氧基、三乙氧基、二乙氧基、单乙氧基、三氯、二氯或单氯硅烷以与二氧化硅外壳反应。在一些实施例中，硅烷可具有烷基、羧酸、经保护羧酸、胺、经保护胺、活化胺(羟基胺、肼、酰肼等)醛、经保护醛、叠氮基、NHS、乙氧基、马来酰亚胺、硫醇或二硫醇官能团。在一些实施例中，可使硅烷与二氧化硅外壳反应，然后进行后续功能化。在一些实施例中，后续功能化可为形成任一前述官能团的反应。在一些实施例中，可使功能化二氧化硅外壳与存在于抗体或功能化寡核苷酸上的官能团反应。在一些实施例中，抗体官能团可为硫基、醛、胺或羧酸。在一些实施例中，寡核苷酸官能团可为叠氮化物、炔烃、醛、胺、活化胺、羧酸、炔基卤化物或硫醇。功能化寡核苷酸可合成或购买。在一些实施例中，当原位合成功能化寡核苷酸时，所述合成可涉及购自盖伦研究(Glen Research)(弗吉尼亚州斯特林(Sterling,VA))的所选功能化核苷酸。在一些实施例中，当购买功能化寡核苷酸时，其可购自IDT(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))、三浩(Trilink)(加利福尼亚州圣地亚哥)或米德兰寡聚物(Midland Oligos)(密歇根州米德兰(Midland,TX))。
[0312] 在一些实施例中，将寡核苷酸或抗体附接到功能化纳米粒子可通过赫曼森(Hermanson),G.，生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)，学术出版社(Academic Press)(1996)中所述的生物偶联方法来实现，所述文献的全文均以引用方式并入本文中。
[0313] 在一些实施例中，当用结合到以下中的一者的生物标记物结合部分(例如抗体或抗体片段或其它生物标记物结合部分)功能化纳米粒子物质时：CD3、CD22、CD79a、κ、λ、Pax-5、ZAP-70、MPO和TdT，纳米粒子物质可进入细胞且结合到其相应细胞内生物标记物。细胞内生物标记物可位于胞质液和/或核中或核膜上或另一细胞隔室或结构中或上。在一些实施例中，功能化纳米粒子小到足以进入细胞而不破坏细胞膜。细胞可用可渗透化处理器处理以容许功能化纳米粒子进入细胞而不破坏细胞膜。在一些实施例中，可渗透化处理器可为表面活性剂。
[0314] 获得每一所观察到细胞的生物标记物签名
[0315] 在一些实施例中，生物标记物签名可通过对每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量或比例计数来获得。可合计、加权或以其它方式测定样品中已鉴别出正常或异常形态轮廓的细胞数或细胞比例。在一些实施例中，样品中已鉴别出正常或异常形态轮廓的细胞数或细胞比例可存储于HIPAA兼容性计算机存储系统中且与来自同一个体的不同样品进行比较。在一些实施例中，来自同一个体的不同样品可在不同时间点获得。在一些实施例中，来自同一个体的不同样品可从个体的不同组织类型获得。HIPAA兼容性计算机系统或存储系统可经特殊配置以符合美国健康保险流通与责任法案(United States Health Insurance Portability and Accountability Act(HIPAA))对计算机系统的要求。
[0316] 在一些实施例中，HIPAA兼容性计算机系统上的软件程序可用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法中。在检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法中用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名的步骤(d)可进一步包含：
[0317] (i)使用软件程序对每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量计数并处理视野中每一细胞的图像；
[0318] (ii)以数字方式移动视野；
[0319] (iii)使用软件程序对下一视野中每个成像细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量计数并重复步骤(ii)和(iii)直到分析整个衬底区为止；
[0320] (iv)以数字方式组合所获得的所有图像以生成覆盖整个所选衬底区的单一图像；和
[0321] (v)根据所获得的整个衬底区的数据(即每个成像细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量)生成每一衬底粘着细胞的生物标记物签名。
[0322] 在一些实施例中，软件程序存储每一成像和/或所观察到细胞的位置信息。
[0323] 在一些实施例中，HIPAA兼容性计算机系统上的软件可对每个细胞的每一功能化物质的数量计数且处理视野中每一细胞的图像。在一些实施例中，软件可通过鉴别从纳米粒子获得的共振光签名来鉴别纳米粒子。软件可鉴别视野中每一纳米粒子的光签名的圆周、光签名的色彩且减少光签名的泛光。在一些实施例中，光签名的色彩可使用光谱鉴别算法来鉴别。在一些实施例中，软件可将一个纳米粒子鉴别为环形光源。
[0324] 在一些实施例中，视野为约0.25μm2到约2.5cm2。在一些实施例中，视野可为约100μm2到约1000mm2。在一些实施例中，视野为5微米×5微米。在一些实施例中，视野为100mm×100mm。在一些实施例中，视野为圆形。在一些实施例中，视野为正方形。正方形视野的边可为0.25微米到2.5厘米。视野可覆盖一个细胞或多个细胞。在一些实施例中，视野可覆盖整个载玻片区域。视野可以数字方式移动以观察先前图像的不同视野。移动可通过电子伺服控制的电动机来进行，所述电动机控制衬底位于其上的样品台。HIPAA兼容性计算机系统上的软件可鉴别衬底内的每一视野。软件随后可对下一视野中每个细胞的每一功能化纳米粒子物质的数量计数并重复步骤(ii)和(iii)直到分析整个所选衬底区为止。所选衬底区可为整个衬底或其一部分。软件可组合整个所选衬底区的每一视野的结果以获得样品的生物标记物签名。
[0325] 在一些实施例中，可使每一衬底粘着细胞的形态特征与接触细胞的生物标记物签名相关联以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。所述关联可通过比较在使光学对比剂性质成像时在形态特征分析中鉴别出的细胞的相应物理位置与同一区域周围的纳米粒子的物理位置来进行。例如，细胞可通过其在亮视野图像中的形态特征鉴别为癌细胞，且可通过测量在暗视野成像过程期间哪些生物标记物结合功能化纳米粒子物质存在于同一相应区域分析哪些生物标记物存在于细胞上或内来确认诊断。在一些实施例中，测量在暗视野成像过程期间哪些生物标记物结合功能化纳米粒子物质存在于同一相应区域包含使特定大小的纳米粒子的共振光签名的色彩与哪个生物标记物结合部分功能化到纳米粒子的所述大小相关联。在一些实施例中，关联是色彩与生物标记物关联。
[0326] 在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可包含使细胞与光学对比剂接触、然后与功能化纳米粒子物质接触的步骤顺序。当检测粘着到衬底的样品的生物标记物形态轮廓时，可储存衬底以供将来分析或再测试。在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可包含：
[0327] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0328] (b)将细胞粘着到衬底；
[0329] (c)使衬底粘着细胞与光学对比剂接触；
[0330] (d)使接触细胞的形态特征成像；
[0331] (e)将光学对比剂转化成无色形式；
[0332] (f)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，以形成纳米粒子-细胞复合物；
[0333] (g)用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名；和
[0334] (h)使接触细胞的形态特征与每一衬底粘着细胞的生物标记物签名相关联以检测每一细胞的生物标记物形态轮廓。
[0335] 在一些实施例中，用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射的步骤可进一步包含释放第一组功能化纳米粒子，使细胞与下一种多个功能化纳米粒子接触，和用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合下一种多个纳米粒子的共振光散射。
[0336] 在一些实施例中，光学对比剂可为隐色染料或本文所述的任一光学对比剂。隐色染料可为亚甲基蓝、亚甲基绿、红色隐色染料、结晶紫、酚酞或百里酚酞。隐色染料可通过将一或多个电子添加到染料或通过本文所述的任一方法转化成无色形式。电子可通过还原方法添加到染料。还原方法可通过电化学还原、光还原或与还原剂反应来实现。在一些实施例中，隐色染料可通过本文所述的任一方法从染料去除一或多个电子转化成有色形式。一或多个电子可通过氧化方法从染料去除。氧化方法可通过本文所述的方法通过电化学氧化、光氧化或与氧化剂反应来实现。
[0337] 生物标记物结合功能化纳米粒子的迭代询问
[0338] 可使用一系列功能化纳米粒子物质来分析细胞。在一些实施例中，所述系列功能化纳米粒子物质可为使用多种功能化纳米粒子的细胞的迭代询问，其中首先使第一多个功能化纳米粒子与细胞接触，然后照射并检测细胞上的第一多个功能化纳米粒子，随后从细胞去除第一多个功能化纳米粒子，之后使细胞与第二多个功能化纳米粒子接触。在一些实施例中，用于检测细胞的生物标记物形态轮廓的方法可进一步包含：(d)(2)去除第一多个功能化纳米粒子；和(d)(3)使细胞与第二多个功能化纳米粒子物质接触。在一些实施例中，第二多个功能化纳米粒子的选择可取决于在细胞上检测到哪些第一多个功能化纳米粒子的结果。例如，如果使第一多个功能化纳米粒子与细胞接触且发现指示存在可指示特定细胞病况或疾病状态的第一生物标记物，那么可用第二生物标记物结合部分功能化欲与细胞接触的第二多个功能化纳米粒子，所述第二生物标记物结合部分结合到确认细胞病况或疾病状态的第二生物标记物。在一些实施例中，可存在使细胞与第三多个功能化纳米粒子接触的额外迭代，其中结合到第三生物标记物的第三生物标记物结合部分也可确认细胞的疾病或病况。在一些实施例中，可存在1到50次用下一种多个功能化纳米粒子连续询问细胞的迭代，其中下一种多个功能化纳米粒子可包含经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子，所述生物标记物结合部分不同于功能化纳米粒子上的先前生物标记物结合部分。在一些实施例中，可存在例如1到2次、1到3次、1到4次、1到5次、1到6次、1到7次、1到8次、1到9次、1到10次、1到11次、1到12次、1到13次、1到14次、1到15次、1到16次、1到17次、1到18次、1到19次、
1到20次、1到25次、1到30次、1到35次、1到40次、1到45次、1到50次、2到50次、3到50次、4到50次、5到50次、6到50次、7到50次、8到50次、9到50次、10到50次、11到50次、12到50次、13到50次、14到50次、15到50次、20到50次、30到50次、40到50次或前述任一范围的用下一种多个功能化纳米粒子连续询问细胞的迭代。
1到20次、1到25次、1到30次、1到35次、1到40次、1到45次、1到50次、2到50次、3到50次、4到50次、5到50次、6到50次、7到50次、8到50次、9到50次、10到50次、11到50次、12到50次、13到50次、14到50次、15到50次、20到50次、30到50次、40到50次或前述任一范围的用下一种多个功能化纳米粒子连续询问细胞的迭代。
[0339] 在一些实施例中，每种功能化纳米粒子物质可经不同的DNA寡核苷酸释放系统功能化。
[0340] 在一些实施例中，可通过从生物标记物结合部分置换第一多个功能化纳米粒子去除第一多个功能化纳米粒子。在一些实施例中，第一多个功能化纳米粒子中的每一纳米粒子物质与其相应生物标记物结合部分之间的连接体包含结合到第一功能化纳米粒子物质的第一寡核苷酸和结合到其相应生物标记物结合部分的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸包含与第一寡核苷酸的至少一部分互补的部分，且在这些寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交形成包含双链核酸的连接体。在一些实施例中，用于第一多个纳米粒子中的每一功能化纳米粒子物质和相应生物标记物结合部分的第一、第二和第三寡核苷酸可相同。每一功能化纳米粒子物质可通过使第三寡核苷酸结合到第一寡核苷酸从其相应生物标记物结合部分置换，其中通过第三寡核苷酸和第一寡核苷酸杂交形成的杂合体展现高于通过第一和第二寡核苷酸杂交形成的双链核酸的熔融温度的熔融温度，如图1中所显示。在其它实施例中，对于每一纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分，与每一功能化纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分相关的第一、第二和第三寡核苷酸可不同。例如，在第一多个功能化纳米粒子中，第二功能化纳米粒子物质可包含第四寡核苷酸，其相应生物标记物结合部分可包含第五寡核苷酸，且置换寡核苷酸可为第六寡核苷酸。
[0341] 在一些实施例中，第一多个功能化纳米粒子包含第一寡核苷酸且生物标记物结合部分包含与第一寡核苷酸杂交形成双链体的第二寡核苷酸，如图1中所显示。在扫描以检测第一多个功能化纳米粒子的共振光散射后，可通过解离双链体使第一多个功能化纳米粒子从生物标记物结合部分置换。在本发明的一些实施例中，解离可通过将复合物加热到高于核酸双链体的熔融温度来实现。在一些实施例中，可加热包含复合物的混合物或使离子强度充分减小以使杂交的双链体解离。在一些实施例中，可将化学或生物药剂添加到复合物来使双链体解离。在一些实施例中，可添加莫耳浓度过量的第三竞争性寡核苷酸以破坏第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的双链体。在此方法中，寡核苷酸杂合体是通过使杂合体对的一个成员竞争性结合到其过量补体来解离。在一些实施例中，可通过置换第一或第二寡核苷酸以与第一寡核苷酸或第二寡核苷酸形成新双链体来破坏所述双链体，如图2中所显示。出于本发明的目的，“置换”或“释放”可通过诸如链置换或水解由具有3′到5′或5’到3’外核酸酶活性的聚合酶催化的置换链等方法来实现。在一些实施例中，在置换第一多个功能化纳米粒子后，可洗掉第一多个功能化纳米粒子以消除来自第一多个功能化纳米粒子的共振光信号(RLS)。然后可使用RLS签名与第一生物标记物结合部分-纳米粒子性质相同的偶联到功能化纳米粒子的第二生物标记物结合部分来分析相同细胞。例如，在置换和洗掉经第一生物标记物结合部分功能化的25nm Au纳米粒子后，可使经第二生物标记物结合部分功能化的下一25nm Au纳米粒子与细胞接触。在一些实施例中，可在置换功能化纳米粒子后对细胞染色并使其成像。
[0342] 在一些实施例中，可通过与第三寡核苷酸间接杂交使包含第一寡核苷酸的功能化纳米粒子连接到包含第二寡核苷酸的生物标记物结合部分，其中第一寡核苷酸的一部分与第三寡核苷酸的一部分互补，且第二寡核苷酸的一部分与第三寡核苷酸的不同部分互补，如图3中所显示。可通过添加莫耳浓度过量的第四寡核苷酸从第一或第二寡核苷酸置换第三寡核苷酸来破坏间接杂交的双链体。在一些实施例中，第四寡核苷酸可与第二寡核苷酸形成比第二寡核苷酸与第三寡核苷酸之间的双链体更强的双链体(相对较高的Tm)，如图3中所显示。在一些实施例中，可添加莫耳浓度过量的第五寡核苷酸，任选地也存在第四寡核苷酸，其中第五寡核苷酸可与第一或第三寡核苷酸互补且在第五与第一或第三寡核苷酸之间形成比第一或第三寡核苷酸与第二寡核苷酸之间更强的双链体。在一些实施例中，可去除置换的功能化纳米粒子。去除可通过用水溶液洗涤细胞来实现。
[0343] 在一些实施例中，询问生物标记物的一或多次迭代可通过与至少第二、第三、直到10个或更多个多种功能化纳米粒子物质连续接触来实现。在一些实施例中，询问生物标记物的一或多次迭代可为例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次、30次、40次或50次或更多次。在使用寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子的实施例中，每一多种功能化纳米粒子物质和相应生物标记物结合部分可包含用于给定多种寡核苷酸-连接体功能化功能化纳米粒子物质中的每一寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质的相同的第一、第二第三寡核苷酸。或者，每一多种寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质中的每一寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质和其相应生物标记物结合部分可包含第一、第二和第三寡核苷酸的独特集合，使得每一生物标记物结合部分与第一、第二和第三寡核苷酸的独特集合相关联。在此实施例中，可进行置换和与新的多种寡核苷酸-连接体功能化纳米粒子物质接触的1个到10个或更多个连续周期。所属领域技术人员将意识到，迭代次数的最终限值将受限于可用于接触连续生物标记物结合部分的细胞区域。限值将较大，这是因为细胞的直径可介于例如1微米到15微米范围内，而生物标记物结合部分(例如抗体)的直径为约150纳米(0.15微米)。
[0344] 在一些实施例中，在从生物标记物结合部分置换第二或先前多种功能化纳米粒子后，进行以下步骤：
[0345] (i)使结合到细胞的功能化纳米粒子的生物标记物结合部分与经分类的生物标记物结合部分功能化纳米粒子相关联，和
[0346] (ii)使细胞与经不同生物标记物结合部分功能化的下一种多个纳米粒子接触，并用不同生物标记物结合部分功能化下一种多个纳米粒子的每一纳米粒子物质，所述不同生物标记物结合部分结合到怀疑与存在第一生物标记物的样品相关的生物标记物。
[0347] 在一些实施例中，由第二多个功能化纳米粒子物质中的生物标记物结合部分靶向的生物标记物各自结合到怀疑与样品或病况、疾病或病症相关的生物标记物，所述样品或病况、疾病或病症也与第一生物标记物相关。在这个方面中，本发明方法可用于检测相关生物标记物是存在于相同或不同细胞上还是细胞群体上。
[0348] 在一些实施例中，所述方法可用于确定在第一次迭代期间结合的生物标记物与在下一或后续迭代期间结合的生物标记物之间的关联。在一些实施例中，所述关联可由在任一迭代期间结合的生物标记物和在任何其它迭代期间结合的生物标记物组成。在一些实施例中，所述关联可由在任一迭代中结合到细胞的生物标记物的全部或一部分与在不同迭代中结合的生物标记物组成。
[0349] 所述关联可基于基于系统或组织的分析。所述关联可为假定的生物相关性。在一些实施例中，所述方法可确定两种或更多种假设与相同细胞相关的生物标记物是真正与相同细胞相关还是与不同细胞相关。
[0350] 在一些实施例中，可通过裂解纳米粒子与生物标记物结合部分之间的连接体去除第一多个功能化纳米粒子。连接体可包含多核苷酸、经修饰多核苷酸、多核糖核苷酸、经修饰多核糖核苷酸、肽或聚糖。多核苷酸可包含DNA限制酶序列。经修饰多核苷酸可包含多核苷酸序列内的二-硫醇、二醇、无碱基或尿嘧啶部分。
[0351] 在一些实施例中，连接体可包含肽，其进一步包含蛋白酶序列。蛋白酶序列可为胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶识别序列。在一些实施例中，连接体可包含聚糖，其进一步包含α-岩藻糖苷酶识别位点。α-岩藻糖苷酶识别位点可为α-1,2糖苷键。在一些方面中，可用肽酶、DNA酶和/或RNA酶裂解连接体。
[0352] 衬底特征
[0353] 在一些实施例中，衬底可包含二氧化硅玻璃、透明聚合物(塑料)、金或氧化铝。在一些实施例中，衬底可为ITO(氧化铟锡)。在一些实施例中，衬底可为FTO(氟化氧化锡)。衬底可经功能化。衬底功能化可为图案化。衬底功能化可为硅烷连接的细胞生物标记物、聚合物连接的细胞生物标记物、硅烷连接的胺、硅烷连接的羧酸、硅烷连接的生物素、聚氟化烷基连接的胺、聚氟化烷基连接的生物素、聚合物连接的胺、聚合物连接的羧酸、聚乙二醇(PEG)、金、多糖(例如胺功能化聚葡萄糖)、铁氟龙、氟化硅烷、银、氧化铝或二氧化硅玻璃。在一些实施例中，多糖可选自：氨基功能化聚葡萄糖、氨基功能化聚三葡萄糖、氨基功能化糊精和其组合。在一些实施例中，衬底可包含鉴别正在成像的衬底区的特征。所述特征可在衬底的每个区域发生变化以能够鉴别出正在成像的区域。所述特征可包含衬底特定部分处的衬底的物理差异。在一些实施例中，所述特征可为：镜子、线条、点、具体形状、条码、2-D条码或图案或其组合。
[0354] 组合物/组合/试剂盒
[0355] 描述用于检测细胞生物标记物签名的组合物。在一些实施例中，所述组合物可包含多种功能化纳米粒子，其中所述纳米粒子经生物标记物结合部分功能化。在一些实施例中，功能化纳米粒子可进一步包含：经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分，且第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的一部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成杂交双链体。在替代性实施例中，功能化纳米粒子可进一步包含经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分；和第三寡核苷酸，其中第一寡核苷酸与第三寡核苷酸的一部分互补，第二寡核苷酸与第三寡核苷酸的不同部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成与第三寡核苷酸杂交的双链体。
[0356] 在一些实施例中，用于检测细胞生物标记物签名的组合或试剂盒可包含多种生物标记物结合部分功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，功能化纳米粒子物质的组合可进一步包括：结合到第一寡核苷酸的纳米粒子物质和结合到第二寡核苷酸的生物标记物结合部分，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的一部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成杂交双链体。在一些实施例中，功能化纳米粒子物质的组合可进一步包含：经第一寡核苷酸功能化的纳米粒子；经第二寡核苷酸功能化的生物标记物结合部分；和第三寡核苷酸，其中第一寡核苷酸与第三寡核苷酸的一部分互补，第二寡核苷酸与第三寡核苷酸的不同部分互补，且第一和第二寡核苷酸形成与第三寡核苷酸杂交的双链体。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可包含混合物。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质在使用前可为分开的。在一些实施例中，可将多种功能化纳米粒子物质分开到例如各别器皿中且使其单独与细胞接触或在混合物与细胞接触之前组合。
[0357] 在一些实施例中，用于检测细胞形态生物标记物签名的组合或试剂盒可包含多种功能化纳米粒子物质和光学对比剂。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质可包含混合物。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子物质在使用前可为分开的。
[0358] 组合或试剂盒是使用多种经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子的迭代检测细胞形态生物标记物签名的一特征性实施例，其中每一多种经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子物质可通过本文所述的方法释放。每一多种经生物标记物结合部分功能化的纳米粒子物质可与其它多种功能化纳米粒子物质分开。在连续迭代中，多种功能化纳米粒子物质可包含相同的多种纳米粒子，但经不同于包含先前多种功能化纳米粒子物质的功能纳米粒子物质中的生物标记物结合部分的生物标记物结合部分功能化。作为非限制性实例，第一多个功能化纳米粒子可包含包括第一纳米粒子和第一生物标记物结合部分的第一功能化纳米粒子物质、包括第二纳米粒子和第二生物标记物结合部分的第二多个功能化纳米粒子物质和包括第三纳米粒子和第三生物标记物结合部分的第三功能化纳米粒子物质。在使第一、第二和第三种经其相应生物标记物结合部分功能化的纳米粒子与细胞接触且使细胞-功能化纳米粒子复合物成像后，第一、第二和第三功能化纳米粒子可从其相应生物标记物结合部分释放。可使包含以下的下一种多个功能化纳米粒子与细胞接触：包含第一纳米粒子和第四生物标记物结合部分的第四功能化纳米粒子物质、包含第二纳米粒子和第五生物标记物结合部分的第五功能化纳米粒子物质和包含第三纳米粒子和第六生物标记物结合部分的第六功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，第一多个粒子可包含3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或任一整数种直到50种功能化纳米粒子物质。或者，在一些实施例中，包含第四纳米粒子和第四生物标记物结合部分的第四功能化纳米粒子物质、包含第五纳米粒子和第五生物标记物结合部分的第五功能化纳米粒子物质和包含第六纳米粒子和第六生物标记物结合部分的第六功能化纳米粒子物质。
[0359] 组合或试剂盒可包含多种功能化纳米粒子物质，每一多种包含例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个多种功能化纳米粒子物质。试剂盒可包含例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个多种功能化纳米粒子物质。试剂盒中多种功能化纳米粒子物质的数量将取决于欲检测的生物标记物的数量和在每一多路复用分析中检测到的生物标记物的数量以及分析设计中重复、对照或副本的数量。
24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个多种功能化纳米粒子物质。试剂盒中多种功能化纳米粒子物质的数量将取决于欲检测的生物标记物的数量和在每一多路复用分析中检测到的生物标记物的数量以及分析设计中重复、对照或副本的数量。
[0360] 在一些实施例中，组合可包含2到5种功能化纳米粒子物质。在一些实施例中，下一种多个纳米粒子经不同于先前迭代中所用的生物标记物结合部分功能化。在一些实施例中，后一多种功能化纳米粒子物质可包含经先前多种功能化纳米粒子物质中所用的相同或不同生物标记物结合部分功能化的不同多种纳米粒子。此实施例可用于例如使用不同的功能化纳米粒子物质确认生物标记物的存在，所述不同的功能化纳米粒子物质可包含用于不同步骤中所用的不同多种功能化纳米粒子物质中的相同生物标记物的相同或不同的纳米粒子和/或相同或不同的结合部分。在一些实施例中，多种功能化纳米粒子在使用前可为分开的。在一些实施例中，包含每一功能化纳米粒子的每一多种功能化纳米粒子物质可组合于混合物中。或者，包含每一功能化纳米粒子的每一多种功能化纳米粒子物质可分开直到使用或一次一个地或以子混合物形式添加到细胞。
[0361] 如本文所述，“分开”意指在物理上分离。分开的组分可处于各别容器或器皿中，或处于容器的各别部分中，或通过可分离介质分离，所述介质可去除以产生混合物。
[0362] 描述用于检测细胞生物标记物形态轮廓的组合物，所述组合物包含多种功能化纳米粒子和光学对比剂。光学对比剂可为本文所述的光学对比剂。
[0363] 通过本发明方法检测样品中的分析物存在的“试剂盒”可例如包含至少一个容器构件，其中已布置有特异性针对所选分析物的功能化纳米粒子。所述试剂盒可进一步包含包括以下中的一或多种的其它容器构件：预形成细胞的生物形态剖析所需的缓冲液、溶液或其它试剂和材料；和检测与细胞接触的光学对比剂的光学性质所需的缓冲液、溶液或其它试剂和材料。优选地，所述试剂盒进一步包含使用说明书。所述试剂盒如果打算用于诊断应用那么还可包括FDA批准的使用和使用说明书的通告。
[0364] 描述用于检测细胞生物标记物签名的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒可包含多种功能化纳米粒子、光学对比剂和封固剂。封固剂可具有大体上等于经固定细胞的折射率(RI)或在0.1RI内的折射率。在一些实施例中，封固剂可具有1.52的RI。
[0365] 均质分析
[0366] 在一些实施例中，细胞的生物标记物签名可在均质分析中进行检测，所述分析包含以下步骤：
[0367] (a)提供包含来自个体的细胞的样品；
[0368] (b)使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触，每一功能化纳米粒子物质包含生物标记物结合部分，并通过使包含生物标记物结合部分的纳米粒子物质结合到其相应生物标记物形成纳米粒子-细胞复合物；
[0369] (c)将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底；
[0370] (d)用瞬逝光照射纳米粒子-细胞复合物并检测来自每一所观察到复合纳米粒子的共振光散射，以获得每一所观察到细胞的生物标记物签名，
[0371] 其中未从视野去除未结合的功能化纳米粒子。在一些实施例中，不从视野去除未结合的功能化纳米粒子可为不洗涤视野。通常，从靶标洗掉未结合的物质以减少背景噪声。消除洗涤步骤具有缩短整体操作时间的优点。功能化纳米粒子对细胞上的生物标记物具有特异性，且可大体上接触细胞使得对未结合的功能化纳米粒子观察到极少或无法观察到信号。
[0372] 在一些实施例中，当功能化纳米粒子被结合到询问的形态特征中的生物标记物的生物标记物结合部分功能化时，可使用与细胞接触的功能化纳米粒子来鉴别细胞特征和形态。图8b显示功能化纳米粒子接触细胞的展开图像。所述细胞未经洗涤以去除未接触细胞的功能化纳米粒子。根据功能化纳米粒子的相对位置可清晰地鉴别细胞形状。此方法可用于根据功能化纳米粒子的图像鉴别细胞、细胞形态和生物标记物签名。
[0374] 在一些实施例中，可通过自动化机器人系统执行样品处置和检测步骤，包括(但不限于)试剂接触和混合步骤，以及施加外力、复合物形成和检测。在一些实施例中，将外力施加到与功能化生物标记物结合部分接触的细胞可通过自动化机器人系统来处置。在一些实施例中，例如，提供包含来自个体的细胞的样品、使细胞与一或多种功能化纳米粒子物质接触和将功能化纳米粒子-细胞复合物粘着到衬底的步骤可通过自动化液体处置机器人系统来执行。在一些实施例中，使粘着细胞与光学对比剂接触的步骤可通过自动化液体处置机器人系统来执行。自动化液体处置机器人系统可包含控制器、伺服机制、流体线和任选地螺线管。自动化液体处置机器人系统可经程序化以在所选时间经所选持续时间递送本文所述的试剂、以递送所选体积的试剂。在一些实施例中，控制器可使用Labview软件程序化。在一些实施例中，自动化液体处置机器人系统可包括或不包括例如一或多个自动吸量管、一或多个自动吸量管注射泵、哈美顿(Hamilton)Microlab NIMBUS 96通道液体处置机器人、哈美顿Microlab STAR液体处置机器人、哈美顿VANTAGE液体处置系统、帝肯(Tecan)Freedom EVO液体处置系统、帝肯Fluent液体处置系统、贝克曼(Beckman)Biomek液体处置系统、贝克曼BioRAPTR FRD液体处置系统、珀金埃尔默(Perkin Elmer)JANUS液体处置系统、哈德森机器人(Hudson Robotics)SOLO液体处置系统、哈德森机器人Micro10X液体处置系统、QiaCube液体机器人系统、震旦(Aurora)VERSA液体处置系统或艾本德(Eppendorf)epMotion液体处置系统。
[0375] 在一些实施例中，检测细胞-功能化纳米粒子复合物和检测形态图像也可通过具有细胞识别软件的HIPPA兼容性自动化系统来处置。在一些实施例中，获得细胞-功能化纳米粒子复合物的图像和细胞的形态图像且将其存储于电子媒体中，例如存储于HIPPA兼容性系统中。在一些实施例中，图像由医师或病理学家访问或提供到医师或病理学家以在医师或病理学家的办公室中审查。
[0376] 在一些实施例中，与荧光标记系统相比，本发明方法可用于在无需使用暗室的环境条件下获得细胞-功能化纳米粒子复合物的图像。在一些实施例中，可在医师或病理学家的办公室中在显微镜上观察样品。
[0377] 实例
[0378] 本文的揭示内容和实例记载了本发明方法的特征，包括检测细胞-功能化纳米粒子复合物以检测细胞的生物标记物签名和细胞的集成形态生物标记物签名。使用共振光散射检测细胞的生物标记物形态轮廓的当前所揭示方法的操作程序陈述于以下实例中。
[0379] 纳入以下实例以向所属领域技术人员提供实践当前所揭示标的物的代表性实施例的指导。根据本发明和所属领域技术人员的一般水平，所属领域技术人员可了解，以下实例打算仅例示本申请案通篇所述且所属领域技术人员所了解的实施例和特征，且可在不背离当前所揭示标的物的范围下采用多种改变、修改和变化形式。
[0380] 材料和方法
[0381] 概述.
[0382] 所有材料均购自所指示供应商，且指示部件号。离心步骤是以1重力单位(“×g”)进行。
[0383] 样品制备
[0384] 通过混合PBS中的0.6mL 10％聚葡萄糖500(西格玛(Sigma)编号31392)、水中的0.16mL 2M草酸钾(西格玛编号P0963)和0.24mL PBS来制备6％聚葡萄糖/0.32M草酸钾的沉降溶液。将5mM EDTA中的全血样品以4:1的比率添加到沉降溶液。培育10分钟后，去除上清液且在500×g下离心5分钟。将上清液去除到10μl(微升)以获得富含白细胞的部分(LRF)。
可通过沉降或通过施加外力形成细胞-功能化纳米粒子复合物，如本文所揭示。可使用其它组合物使细胞与功能化纳米粒子接触，如本发明中所述。
可通过沉降或通过施加外力形成细胞-功能化纳米粒子复合物，如本文所揭示。可使用其它组合物使细胞与功能化纳米粒子接触，如本发明中所述。
[0385] 实例1.
[0386] 用于同步检测形态和表型的细胞标记
[0387] 作为检测细胞的生物标记物形态轮廓的非限制性实例，用α-CD4(BD编号555344)和α-CD8(BD编号555631)纳米粒子标记细胞。可使用本文所述抗体和本文所述纳米粒子的其它组合来检测细胞生物标记物形态轮廓。
[0388] 用抗体涂布粒子-首先通过将1.0mL 150nm Au粒子(细胞诊断编号G150-20)在800×g下离心5分钟将粒子浓缩到100μl，且单独地通过将1mL 100nm Ag粒子(纳诺康波西克斯编号ECP1095)在1200×g下离心5分钟浓缩到100ul。通过超声处理且然后添加500μl(微升)5mM碳酸氢钠来重悬浮粒子。通过离心将粒子再浓缩到100μl(微升)且通过超声处理重悬浮。
[0389] 向Au和Ag浓缩粒子中以约10OD粒子0.1mg/mL Ab分别(单独)添加20μlα-CD4和α-CD8。粒子的OD是在粒子的最大吸光度波长下报告的浓度(每mL)。每15分钟持续1小时对每一溶液进行涡旋且超声处理。添加水中的1％BSA，然后培育30分钟时段。用1％BSA/1％PBS将粒子洗涤三次。洗涤后，对溶液超声处理且涡旋以将粒子重悬浮于100μl(微升)1％BSA/1％PBS的最终体积中。
[0390] 为标记细胞，将粒子以1:10稀释于1％BSA/1％PBS中。向1μL(微升)Au和Ag粒子中添加50μl(微升)(约10,000个细胞)CCRF-CEM细胞(ATCC编号CRM-CCL-119)。CEM细胞系是白血病细胞系。将溶液在500×g下离心1分钟达三次，然后涡旋细胞以重悬浮。
[0391] 通过将2μl(微升)施加到载玻片的1cm2区域中来散布经标记细胞且干燥5分钟。为固定细胞，将载玻片在含有100％MeOH的科普林氏缸(Coplin Jar)中浸渍5分钟。将载玻片转移到含有以1:20稀释于水中的吉姆萨染色剂(丽卡化学(Ricca Chemical)编号3250-16)的管中并保持1分钟。用水洗涤载玻片以去除过量染色剂且风干。
[0392] 图7显示在亮视野中使用20×物镜、奥林巴斯BX60M显微镜和DP71彩色照相机使经染色细胞成像用于形态检测。
[0393] 图8显示使用奥林巴斯BX60M显微镜上的20×物镜在暗视野中利用达科莱特照明器光源使同一视野成像用于表型检测。可观察到未结合到细胞的一些功能化纳米粒子。在此实例性均质分析中，尚未从视野去除引入细胞但未结合到细胞的功能化纳米粒子物质。
[0394] 实例2.
[0395] 细胞染色/脱色
[0396] 通过将2μl细胞悬浮液施加到载玻片的1cm2区域中来散布经标记细胞且干燥5分钟。为固定细胞，将载玻片在含有100％MeOH的科普林氏缸中浸渍5分钟。将载玻片转移到含有以1:20稀释于水中的吉姆萨染色剂(丽卡化学编号3250-16)的管中并保持1分钟。用水洗涤载玻片以去除过量染色剂且风干。可使用如本文所揭示的其它染色剂对细胞染色。
[0397] 图9显示在亮视野中使用20×物镜、奥林巴斯BX60M显微镜和DP71彩色照相机成像用于形态检测的经吉姆萨染色的细胞的初始亮视野图像。
[0398] 然后如下对细胞脱色：通过将50μl(微升)100mM磷酸钠添加到1mL 60％MeOH/40％甘油来制备脱色溶液(pH 11.3)。将500μl脱色剂添加到载玻片，培育30秒，且用水洗涤。在成像前，将3μl DPX封固剂(西格玛编号06522)施加到细胞区域，然后施加18×18mm盖玻片。封固剂是其中使样本悬浮于载玻片与盖玻片之间以供显微镜检查的任何物质。在一些实施例中，封固剂可包含具有细胞的约相似折射率的溶液。在一些实施例中，经固定细胞的折射率为约1.52。在一些实施例中，封固剂可为浸没油。图10显示在亮视野中使用20×物镜、奥林巴斯BX60M显微镜和DP71彩色照相机成像的经脱色细胞。使用奥林巴斯BX60M显微镜上的
20×物镜在暗视野中利用达科莱特照明器光源使同一视野成像用于残余吉姆萨染色(图
11)。
20×物镜在暗视野中利用达科莱特照明器光源使同一视野成像用于残余吉姆萨染色(图
11)。
[0399] 实例3.
[0400] 3色多路复用
[0401] 此实例展示检测包含三种不同纳米粒子的功能化纳米粒子的能力。向0.2mL 1OD粒子中添加10μl 20mM CTPEG混合物(纳诺科斯(Nanocs)编号PG2-CATH-10k)以产生约1mM PEG。CTPEG混合物是硫醇羧酸功能化PEG，分子量为10000。在室温下培育30分钟后，添加0.1％w/v F127(巴斯夫(BASF)编号51181981)且再静置30分钟。 嵌段共
聚物是环氧乙烷和环氧丙烷的合成共聚物，由以下化学结构表示：HO(C2H4O)101(C3H6O)56(C2H4O)101H。将粒子在3000×g下离心10分钟且重悬浮于200μl 5mM MES(pH 6)、0.1％F127中。然后，将蒸馏水中的10mg浓EDC(赛默飞(Thermo)编号77149)溶解于1mL 5mM MES(pH
6)、0.1F127中以产生52mM。添加11.5μl(微升)52mM EDC溶液以产生2mM EDC。将2mg磺基-NHS(赛默飞编号24520)溶解于40μl(微升)5mM MES(pH 6)、0.1％F127中以产生230mM磺基-NHS。再添加6.5μl(微升)230mM磺基-NHS以产生5mM NHS。使其反应5分钟后，将混合物在
3000×g下旋转10分钟，重悬浮于0.2mL 5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127中且添加抗CD45抗体(BD生物科学(Biosciences)编号555480；0.5mg/mL)到100μg/mL(微克/毫升)的最终浓度。使混合物在室温下反应过夜。添加1％BSA且培育1小时。然后，用5mM HEPES(pH 7.4)、
0.1％F127、0.1％BSA洗涤粒子。通过用40×物镜和达科莱特照明器光源成像来检验单分散性。
聚物是环氧乙烷和环氧丙烷的合成共聚物，由以下化学结构表示：HO(C2H4O)101(C3H6O)56(C2H4O)101H。将粒子在3000×g下离心10分钟且重悬浮于200μl 5mM MES(pH 6)、0.1％F127中。然后，将蒸馏水中的10mg浓EDC(赛默飞(Thermo)编号77149)溶解于1mL 5mM MES(pH
6)、0.1F127中以产生52mM。添加11.5μl(微升)52mM EDC溶液以产生2mM EDC。将2mg磺基-NHS(赛默飞编号24520)溶解于40μl(微升)5mM MES(pH 6)、0.1％F127中以产生230mM磺基-NHS。再添加6.5μl(微升)230mM磺基-NHS以产生5mM NHS。使其反应5分钟后，将混合物在
3000×g下旋转10分钟，重悬浮于0.2mL 5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127中且添加抗CD45抗体(BD生物科学(Biosciences)编号555480；0.5mg/mL)到100μg/mL(微克/毫升)的最终浓度。使混合物在室温下反应过夜。添加1％BSA且培育1小时。然后，用5mM HEPES(pH 7.4)、
0.1％F127、0.1％BSA洗涤粒子。通过用40×物镜和达科莱特照明器光源成像来检验单分散性。
[0402] 将抗CD45 40nm Ag粒子(纳诺康波西克斯编号AGCN40-25M)以1:10稀释于5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127、0.1％BSA中。抗CD45 50nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN50-25M)和抗CD45 80nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN80-25M)各自以1:20稀释于相同溶液中。向约10,000个细胞的10μl(微升)浓10×CCRF-CEM(ATCC编号CRM-CCL-119)细胞悬浮液中添加1μl(微升)适当粒子悬浮液。在3000×g下离心1分钟达三次。向载玻片上将1μl(微升)细胞-粒子悬浮液/载玻片施加到约1cm2直径的区域。然后将载玻片在科普林氏缸中在100％MeOH浸渍液中固定1分钟。施加5μl(微升)DPX封固剂，然后施加盖玻片且在暗视野中利用达科莱特照明器光源和40×物镜(200ms曝光)成像，如图12中所显示。
[0403] 可将本申请案中所揭示的任一功能化纳米粒子和或其它特征用于生物标记物签名和/或生物标记物形态轮廓的多路复用检测。
[0404] 实例4.
[0405] 4色多路复用
[0406] 此实例展示检测包含四种不同纳米粒子的功能化纳米粒子的能力。
[0407] 向0.2mL 1OD粒子中添加10μl 20mM CTPEG混合物(纳诺科斯编号PG2-CATH-10k)以产生约1mM PEG。在室温下培育30分钟后，添加0.1％w/v F127(巴斯夫编号51181981)且再静置30分钟。将粒子在3000×g下旋转10分钟且重悬浮于200μl 5mM MES(pH
6)、0.1％F127中。将10mg浓EDC(赛默飞编号77149)溶解于1mL 5mM MES(pH 6)、0.1F127中以产生52mM。添加11.5μl 52mM EDC以产生2mM EDC。将2mg磺基-NHS(赛默飞编号24520)溶解于40μl 5mM MES(pH 6)、0.1％F127中以产生230mM磺基-NHS。再添加6.5μl 230mM磺基-NHS以产生5mM NHS。使其反应5分钟后，将混合物在3000×g下旋转10分钟，重悬浮于0.2mL
5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127中且添加抗CD45抗体(BD生物科学编号555480；0.5mg/mL(毫克/毫升))到100μg/mL(微克/毫升)的最终浓度。使混合物在室温下反应过夜。添加1％BSA且培育1小时。然后，用5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127、0.1％BSA洗涤粒子。通过用40×物镜和达科莱特照明器光源成像来检验单分散性。
6)、0.1％F127中。将10mg浓EDC(赛默飞编号77149)溶解于1mL 5mM MES(pH 6)、0.1F127中以产生52mM。添加11.5μl 52mM EDC以产生2mM EDC。将2mg磺基-NHS(赛默飞编号24520)溶解于40μl 5mM MES(pH 6)、0.1％F127中以产生230mM磺基-NHS。再添加6.5μl 230mM磺基-NHS以产生5mM NHS。使其反应5分钟后，将混合物在3000×g下旋转10分钟，重悬浮于0.2mL
5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127中且添加抗CD45抗体(BD生物科学编号555480；0.5mg/mL(毫克/毫升))到100μg/mL(微克/毫升)的最终浓度。使混合物在室温下反应过夜。添加1％BSA且培育1小时。然后，用5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127、0.1％BSA洗涤粒子。通过用40×物镜和达科莱特照明器光源成像来检验单分散性。
[0408] 含有黄色抗CD45 70nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN70-25M)、橙色抗CD4570nm Au纳米海胆状结构(细胞诊断编号GU70-20)、绿色抗CD45 50nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN50-25M)和蓝色抗CD45 50nm Ag粒子(纳诺康波西克斯编号AGCN50-25M)的多路复用混合剂是通过将粒子分别以1:2:2:4份混合到5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127、
0.1％BSA中来制备。向约1,000个细胞的10μl CCRF-CEM(ATCC编号CRM-CCL-119)细胞悬浮液中添加1μl(微升)多路复用混合剂粒子悬浮液。在3000×g下离心1分钟。
0.1％BSA中来制备。向约1,000个细胞的10μl CCRF-CEM(ATCC编号CRM-CCL-119)细胞悬浮液中添加1μl(微升)多路复用混合剂粒子悬浮液。在3000×g下离心1分钟。
[0409] 然后将经标记细胞添加到200μl(微升)以1:2000稀释于5％BSA/PBS中的全血，且用200μl(微升)5％BSA/PBS在100×g下保持4min洗涤三次。然后将整个样品施加到含有SuperFrost Plus载玻片(费舍尔编号12-550-15)的经组装CytoFuge器件，并使用Cytofuge 12(贝克曼库尔特(Beckman-Coulter)编号X00-006082-001)在1500rpm下旋转3分钟以使细胞粘着到载玻片。然后使载玻片在科普林氏缸中在100％MeOH浸渍液中固定5分钟。施加7μl(微升)HF型浸没油(嘉吉(Cargille)编号16245)，然后施加盖玻片且在暗视野中利用达科莱特照明器光源和40×物镜(100ms曝光)成像(图像显示于图13中)。
[0410] 通过用丙醇洗涤去除盖玻片和油，且将载玻片风干。然后，将400μl(微升)吉姆萨染色剂(丽卡编号3250-16)施加到细胞区域且培育4分钟。通过水洗涤去除染色剂。然后，施加10μl(微升)DPX封固剂(西格玛编号06522)和盖玻片且在亮视野中使用40×物镜(0.1ms曝光)使同一细胞区域成像(图像显示于图14中)。
[0411] 可将本申请案中所揭示的任一功能化纳米粒子和或其它特征用于生物标记物签名和/或生物标记物形态轮廓的多路复用检测。根据本发明方法，应了解，可将包含5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种或最多50种不同纳米粒子的功能化纳米粒子物质用于本发明多路复用方法中。
[0412] 实例5.
[0413] 封固剂折射率匹配
[0414] 图15显示如实例4中所述与功能化纳米粒子接触的CEM细胞的图像，其中未添加封固剂。20×物镜，100ms曝光，达科莱特。缺少匹配折射率介质产生过量白光散射，由此阻止功能化纳米粒子的RLS信号成像。
[0415] 实例6.
[0416] 使用细胞生物标记物签名的HIV评价
[0417] 在一些实施例中，可使用在细胞上鉴别出的生物标记物来鉴别细胞类型并通过加和展现特定生物标记物的所有经鉴别细胞类型对细胞类型计数。使来自个体血液样品的细胞与含有黄色抗CD3 70nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN70-25M)、橙色抗CD-470nm Au纳米海胆状结构(细胞诊断编号GU70-20)和绿色抗CD8 50nm Au粒子(纳诺康波西克斯编号AUCN50-25M)的多路复用混合剂接触。混合剂包含等份1:1:1的多种功能化纳米粒子中的每一者。在5mM HEPES(pH 7.4)、0.1％F127、0.1％BSA缓冲液中制备粒子。向调整到约1000个细胞的10ul从个体分离的细胞悬浮液中添加1微升混合剂粒子悬浮液。将溶液在3000×g下离心1分钟以加速细胞-功能化纳米粒子接触。使细胞粘着到载玻片且与作为RI匹配的封固剂的HF浸没油接触，如实例4中所述。
[0418] 比较展现所有CD3、CD4和CD8的细胞的总细胞计数与未展现CD4的细胞量。比较呈CD4阳性的细胞量与每体积血液的阈值量。如果细胞量低于阈值数，那么将个体诊断为患有HIV(人类免疫缺陷病毒)。
[0419] 实例7.
[0420] 通过离心增强标记
[0421] 为确定使与功能化纳米粒子接触的细胞经受外力以增加功能化纳米粒子和细胞的局部浓度的效应，将CCRF-CEM细胞(ATCC)以1×106个细胞/mL悬浮于补充有胎牛血清的RPMI培养基(ATCC)中，使其在室温下与生物素化抗CD45抗体(BD生物科学)反应30分钟。然后通过使用PBS+0.1％BSA在500×g下离心5分钟将细胞洗涤5次。将1微升细胞悬浮液施加到显微镜载玻片(SuperFrost Plus)，风干，然后在100％MeOH中固定1分钟且风干。在室温下用PBS中的10％BSA将载玻片封阻10分钟。去除封阻溶液，且将经链霉抗生物素蛋白功能化的70nm Au纳米粒子施加到细胞区域。将1个载玻片置于载玻片架中且在摇摆式吊桶离心机中在500×g下离心2分钟(离心机标记)。在室温下将第二载玻片培育5分钟(被动标记)。用PBS、然后用水充分冲洗两个载玻片且风干。施加DPX封固剂和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使细胞成像。图16显示被动标记载玻片(不使用离心机)，且图
17显示主动标记载玻片(利用离心)。与被动标记载玻片相比，在离心机标记载玻片中显著更多的链霉抗生物素蛋白粒子结合到细胞，此展示使与功能化纳米粒子接触的细胞经受外力会增加功能化纳米粒子的局部浓度，从而增强细胞的标记。
17显示主动标记载玻片(利用离心)。与被动标记载玻片相比，在离心机标记载玻片中显著更多的链霉抗生物素蛋白粒子结合到细胞，此展示使与功能化纳米粒子接触的细胞经受外力会增加功能化纳米粒子的局部浓度，从而增强细胞的标记。
[0422] 实例8.
[0423] 通过离心血液涂片实例增强标记
[0424] 为证实施加外力对标记血液样品中的细胞的效应，从经EDTA处理的新鲜血液获得肤色血细胞层，且在显微镜载玻片上使用楔劈技术制备血液涂片。风乾后，将血液涂片在甲醇中固定10分钟且干燥。施加硅酮接合垫料以产生容纳分析试剂的反应孔。在室温下用PBS中的10％BSA将载玻片封阻10分钟。去除封阻溶液，且施加50μL生物素化抗CD45抗体(碧迪(Becton Dickinson))并在室温下培育2小时。去除抗体溶液，用PBS-吐温-BSA缓冲液充分洗涤载玻片。施加经链霉抗生物素蛋白功能化的70nm Au纳米粒子且将载玻片置于载玻片架中并在摇摆式吊桶离心机中在250×g下离心2分钟(离心机标记)。用PBS-吐温-BSA缓冲液、然后用水充分冲洗载玻片且风干。施加DPX封固剂和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使细胞成像，如图18中所显示。已知均表达CD45表面抗原的淋巴细胞和粒细胞被Au功能化纳米粒子标记，而红细胞未被标记。
[0425] 实例9.
[0426] 血液涂片实例的多路复用标记
[0427] 如下文所述进行用于多路复用标记样品中的细胞的实例性方法。从新鲜EDTA血液获得肤色血细胞层，据此在显微镜载玻片上使用楔劈技术制备血液涂片。风乾后，将血液涂片在中性缓冲福尔马林中固定30分钟，用水冲洗且干燥。施加硅酮接合垫料以产生容纳分析试剂的反应孔。在室温下用PBS中的10％BSA将载玻片封阻10分钟。去除封阻溶液且施加经抗CD3抗体功能化的0.1OD 70nm Au纳米粒子和经抗CD4抗体功能化的0.1OD 50nm Ag粒子。将载玻片置于载玻片架中且在摇摆式吊桶离心机中在500×g下离心1分钟达三次(离心机标记)。用PBS-吐温缓冲液、然后用水充分冲洗载玻片且风干。施加折射率匹配的封固剂和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使细胞成像。去除折射率匹配的介质，且用吉姆萨染色剂将载玻片染色3分钟，用水冲洗且风干。施加封固剂，且使用亮视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使载玻片成像。白细胞首先通过其在经染色亮视野图像中的形态鉴别出，如图19E-19J中可见。在视野中可见若干具有多叶核的嗜中性粒细胞，如图19E中可见。淋巴细胞在亮视野图像中缺少叶核，另外在暗视野图像中可见其与抗CD3Au功能化纳米粒子和抗CD4Ag功能化纳米粒子的结合不同，如图19G-19J中可见。若干已知为CD3+的T细胞结合抗CD3Au功能化纳米粒子，如图19H和图19J中可见。如在图19H中所观察到，一个已知为CD3+和CD4+二者的T辅助细胞结合抗CD3Au功能化纳米粒子和抗CD4Ag功能化纳米粒子二者。一个已知为CD3+但缺少CD4的T细胞结合到抗CD3Au功能化纳米粒子，但并未显著结合抗CD4Ag功能化纳米粒子。如在图19F中所观察到，已知缺少CD3和CD4表面抗原的嗜中性粒细胞未经功能化粒子标记。
[0428] 实例10.
[0429] 全血细胞悬浮液的分析
[0430] 从新鲜EDTA血液获得肤色血细胞层，且通过在500×g下离心2min使细胞交换到PBS中。添加经抗CD3抗体功能化的70nm Au纳米粒子且培育30min并不时混合。在低速离心(70×g)下用人类血浆将经标记细胞洗涤两次以去除未结合的功能化纳米粒子。将3微升细胞悬浮液涂抹于Superfrost载玻片上且风干，然后在100％甲醇中固定5min。施加折射率匹配的封固剂和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使细胞成像。去除折射率匹配的介质，且用吉姆萨染色剂将载玻片染色3分钟，用水冲洗且风干。施加封固剂，且使用亮视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使载玻片成像。在视野中，14个淋巴细胞中的13个显示结合的Au功能化纳米粒子。已知缺少CD3表面抗原的嗜中性粒细胞未经标记。图
20A-D显示(从左侧顶图顺时针：A-D)在视野中Au抗CD3功能化纳米粒子(黄色/亮色)结合到
14个淋巴细胞中的13个。未观察到功能化纳米粒子结合到嗜中性粒细胞。
20A-D显示(从左侧顶图顺时针：A-D)在视野中Au抗CD3功能化纳米粒子(黄色/亮色)结合到
14个淋巴细胞中的13个。未观察到功能化纳米粒子结合到嗜中性粒细胞。
[0431] 实例11.
[0432] 电增强的标记
[0433] 制备在10mM MES缓冲液中的浓度为5毫克/mL的游离BSA溶液的浓度为5微克/mL的BSA-生物素溶液。将BSA-生物素/BSA溶液涂布到导电氧化铟锡(ITO)载玻片(纳诺科斯)上，其是通过将载玻片浸没到溶液中达30分钟、然后将载玻片风干来进行。在一些实施例中，导电载玻片可为ITO。在一些实施例中，导电载玻片可为氟掺杂氧化锡(例如TEC GlassTM材料，来自皮尔金顿(Pilkington)(美国新泽西州(NJ,USA)))。游离BSA和BSA-生物素上的BSA粘着到ITO表面，且远离BSA防止表面上的生物素饱和。将500微米厚的硅酮接合垫料(格雷斯生物实验室公司(Grace Bio-Labs,Inc.))置于BSA-生物素区域周围，且用PBS中的1％酪蛋白将载玻片封阻10分钟。去除封阻溶液后，施加50微升经链霉抗生物素蛋白功能化的0.1OD 70nm Au纳米粒子。将一个载玻片被动培育2分钟，同时用另一导电载玻片覆盖第二载玻片，以使得载玻片的导电表面面向彼此。将电源(BK精密(BK Precision))的接线夹附接到面向彼此的两个导电载玻片，且施加2分钟的400mV电压。在2分钟结束时，用TBS/0.05％吐温-
20、水洗涤被动培育和电增强的载玻片二者且风干。施加成像油和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使每一载玻片上经BSA-生物素涂布的区域成像。电增强的载玻片被大量粒子覆盖，如图21B中所显示，而被动培育的载玻片具有极少粒子附接到其表面，如图21A中所显示。
20、水洗涤被动培育和电增强的载玻片二者且风干。施加成像油和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使每一载玻片上经BSA-生物素涂布的区域成像。电增强的载玻片被大量粒子覆盖，如图21B中所显示，而被动培育的载玻片具有极少粒子附接到其表面，如图21A中所显示。
[0434] 实例12.
[0435] FFPE组织的多路复用标记
[0436] 根据以下程序对经福尔马林固定石蜡包埋的组织分析(美国标美(Biomax-US))脱蜡：将载玻片加热到60℃并保持30分钟，于二甲苯中浸渍10分钟，再于新鲜二甲苯洗液中浸渍10分钟，于100％乙醇中浸渍5分钟，于95％乙醇/水中浸渍5分钟，于70％乙醇/水中浸渍5分钟，然后于水中浸渍5分钟。将500微米厚的硅酮接合垫料(格雷斯生物实验室)置于组织分析周围，且通过在1000×g下离心3分钟将经BSA被动涂布的50nm(绿色)和70nm(黄色)Au功能化纳米粒子施加到组织分析。用TBS/0.05％吐温-20和水洗涤后，将载玻片风干。施加折射率匹配的封固剂和盖玻片，且使用暗视野显微镜和彩色照相机(奥林巴斯)使载玻片成像。两种色彩的功能化纳米粒子(绿色50nm Au和黄色70nm Au)在组织样品中清晰地可见且具有可区分的色彩，如图22中所显示。
[0437] ***
[0438] 本文所述且主张的本发明可具有许多属性和实施例，包括(但不限于)此【具体实施方式】中所陈述或描述或提到的那些。其并不打算为包罗万象的且本文所述且主张的本发明并不限于或受限于此【具体实施方式】中鉴别出的特征或实施例，所述特征或实施例是仅出于说明目的而非限制目的纳入。
[0439] 本文中所提到的所有专利、出版物、科学论文、网站和其它文件和材料指示本发明所属领域技术人员的技术水平，且每一所述提到的文件和材料以引用方式并入本文中，其并入程度如同其已全文逐字并入并全文陈述于本文中一般。申请者保留将来自任一所述专利、出版物、科学论文、网站、以电子形式得到的信息和其它所提到材料或文件的任何和所有材料和信息以物理方式并入本说明书中的权利。
[0440] 本文所述的具体方法和组合物代表优选实施例，且具有实例性且并不打算限制本发明的范围。所属领域技术人员在考虑本说明书时将想到其它目标、方面和实施例，并且涵盖于由权利要求书的范围所界定的本发明精神内。所属领域技术人员将容易地明了，可在不背离本发明的范围和精神下对本文所揭示的本发明作出各种取代和修改。本文以说明方式描述的本发明可适当地在不存在未在本文中具体地揭示为实质性的任一或多种要素或一或多种限制的情况下实践。因此，例如，在本文的每一情况下，在本发明实施例或实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”可被本说明书中的其它两个术语中的任一者代替。另外，术语“包含”、“包括”、含有”等应在广义上解读且无限制性。可适当地以不同步骤顺序实践本文以说明方式描述的方法和工艺，且其不必局限于本文或权利要求书中所指示的步骤顺序。还应理解，除非上下文中另外明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所用的单数形式“一(a、an)”和“所述(the)”包括多个指示物。在任何情况下本专利均不应解释为限于本文所明确揭示的具体实例或实施例或方法。在任何情况下本专利均不应解释为受限于任一审查者或专利商标局(Patent and Trademark Office)的任何其它官员或雇员所作出的任何声明，除非所述声明是申请者在回复书面意见中特定且无限制条件或无保留地明确采用。
[0441] 所采用的术语和表述是以描述形式而非限制形式使用，并且使用所述术语和表述并不打算将所显示和描述的特征或其部分的任何等效物排除在外，而是认为其各种修改均可在所主张的本发明范围内。因此，应理解，尽管已通过优选实施例和可选特征来特定地揭示本发明，但所属领域技术人员还可采取本文所揭示概念的修改和变化形式，并且所述修改和变化形式仍视为在如随附权利要求书所界定的本发明范围内。
[0442] 本发明已经在本文中广泛地且一般性地予以描述。在一般揭示内容内的更窄种和亚属组群中的每一者也形成本发明的一部分。此包括对本发明的一般描述，条件或消极限制是将任何标的物从所述类属中去除，而不管所除去材料是否在本文中具体叙述。
[0443] 其它实施例在随附权利要求书内。另外，在本发明的特征或方面借助马库西群组(Markush group)来描述时，所属领域技术人员将意识到，由此本发明还可借助马库西群组的任一个别成员或成员的亚群来描述。
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