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雌激素受体和使用方法

阅读：340发布：2021-09-03

专利汇可以提供雌激素受体和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了分离的多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO：20具有至少70％同一性，其中该多肽具有ER-α36活性。本发明还提供了鉴别能能结合这样的多肽的试剂的方法，检测这样的多肽的方法，和改变这样的多肽的活性的方法。还提供了能特异性地结合SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体，和制备和使用这样的抗体的方法。，下面是雌激素受体和使用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.分离的抗体，其能特异性地结合SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的免疫原性片段，所述免疫原性片段含有至少5个连续氨基酸。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
4.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化的抗体。
5.权利要求1的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
6.权利要求1的抗体，其中所述抗体共价附着到化合物。
7.权利要求6的抗体，其中所述化合物是化疗剂。
8.权利要求6的抗体，其中所述化合物是检测标记。
9.权利要求8的抗体，其中所述检测标记是荧光标记。
10.组合物，其包含权利要求1的抗体。
11.权利要求10的组合物，还包含药学上可接受的载体。
12.制备抗体的方法，其包括：
给动物施用包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的免疫原性片段的多肽，和从该动物分离抗体，
其中所述免疫原性片段含有至少5个连续的氨基酸，所述分离的抗体能特异性地结合该免疫原性片段。
13.权利要求12的方法，其中所述多肽共价附着到载体多肽上。
14.权利要求12的方法，其中所述分离包含从动物得到能产生该抗体的细胞，该方法还包含使用该细胞制备能产生单克隆抗体的杂交瘤。
15.通过权利要求12的方法生产的多克隆抗体。
16.通过权利要求14的方法生产的单克隆抗体。
17.包含外源编码区的细胞，其中所述编码区能编码包含SEQ IDNO：20的第一个多肽，或包含与SEQ ID NO：20具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二个多肽，其中所述第二个多肽具有ER-α36活性。
18.权利要求17的细胞，其中所述编码区可操作地连接到组成型启动子上。
19.权利要求17的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
20.权利要求17的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
21.能表达外源多肽的细胞，其中所述多肽包含SEQ ID NO：20，或包含与SEQ ID NO：
20具有至少90％同一性且具有ER-α36活性的氨基酸序列。
22.权利要求21的细胞，其中所述编码区可操作地连接到组成型启动子上。
23.权利要求21的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
24.权利要求21的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
25.鉴别能结合多肽的试剂的方法，该方法包含：
组合包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的多肽和试剂，和
检测试剂和多肽之间的复合物形成。
26.权利要求25的方法，其中通过选自下述的方法，检测所述试剂与多肽的结合：直接检测试剂与多肽的结合，和使用竞争结合测定检测试剂与多肽的结合。
27.权利要求25的方法，还包含，确定试剂是否能结合包含SEQID NO：18的多肽。
28.权利要求25的方法，还包含，确定试剂是否能抑制多肽的ER-α36活性。
29.检测多肽的方法，其包括：
提供离体细胞，
确定所述细胞中是否表达具有36kDa分子量且具有如SEQ ID NO：20所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：20具有至少90％同一性的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
30.检测多肽的方法，其包括：
提供离体细胞，
确定所述细胞中是否表达具有36kDa分子量且含有SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
31.权利要求29或30的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
32.权利要求31的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
33.权利要求29或30的方法，其中所述确定包括，使细胞接触能特异性地结合SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体。
34.权利要求33的方法，其中所述抗体共价附着到检测标记上。
35.权利要求34的抗体，其中所述检测标记是荧光标记。
36.权利要求29或30的方法，其中所述确定包括，扩增mRNA多核苷酸，以形成扩增的多核苷酸，其中所述扩增包含，使从细胞得到的多核苷酸接触引物对，后者能扩增mRNA多核苷酸，其包括SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：25，或其组合，其中扩增的多核苷酸的存在表明该细胞表达多肽。
37.权利要求36的方法，其中引物对的一个引物选自SEQ ID NO：22的核苷酸，与SEQ ID NO：25的核苷酸互补的核苷酸，或其组合，且其中每个引物具有至少15个核苷酸。
38.抑制细胞的ER-α36活性的方法，其包括：使能表达包含SEQID NO：1的氨基酸
13-27所述的氨基酸序列的多肽的细胞，接触能抑制ER-α36活性的化合物。
39.权利要求38的方法，其中所述化合物包含权利要求1-9任一所述的抗体。
40.权利要求39的方法，其中所述化合物包含能特异性地结合包含SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗体。
41.权利要求38的方法，其中所述细胞是离体的。
42.权利要求38的方法，其中所述细胞是ER-α66阴性的。
43.权利要求38的方法，其中所述细胞是ER-α46阴性的。
44.权利要求38的方法，其中所述化合物不是抗-雌激素药。
45.在体外抑制细胞中的ERK1/2或MEK1/2磷酸化的方法，其包括：使细胞接触权利要求1-9任一所述的抗体；
其中，所述细胞能表达具有36kDa分子量、能结合雌激素且包含SEQ ID NO：1的氨基酸
13-27所述的氨基酸序列的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得，且所述抗体的剂量能够抑制雌激素和SEQ ID NO：20的结合。
46.权利要求45所述的方法，其中所述抗体能特异性地结合包含SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽。
47.分离的多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸1-27所述的氨基酸序列或其修饰的序列组成，所述修饰的序列是通过添加、取代或缺失一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸来修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸1-27，并且所述修饰的序列能够刺激产生结合SEQ ID NO：1的氨基酸1-27的抗体。
48.分离的多肽，其由SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列或其修饰的序列组成，所述修饰的序列是通过添加、取代或缺失一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸来修饰的SEQ ID NO：1的氨基酸13-27，并且所述修饰的序列能够刺激产生结合SEQ ID NO：
1的氨基酸13-27的抗体。
49.分离的多肽，含有共价附着到载体多肽上的权利要求47或48所述的多肽。
50.分离的多核苷酸，其编码权利要求47-49任一所述的多肽。
51.SEQ ID NO：1的免疫原性片段，含有SEQ ID NO：1中的至少5个连续氨基酸。
52.试剂盒，其包含权利要求1-9任一所述的分离的抗体和包装材料。
53.权利要求1-9任一所述的抗体用于制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于区分雌激素阳性和雌激素阴性的癌症。
54.权利要求53的用途，所述区分雌激素阳性和雌激素阴性的癌症是通过检测细胞中是否表达具有36kDa分子量且能够结合雌激素或抗雌激素的多肽，所述分子量如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得。
55.权利要求1-9任一所述的抗体用于制备药物的用途，所述药物用于治疗个体中雌激素相关的癌症，其中所述抗体能够抑制雌激素与细胞的SEQ ID NO：20的结合。

说明书全文

雌激素受体和使用方法

[0001] 本申请是申请号为200580007467.8(PCT/US2005/007857)，申请日为2005年3月10日的中国发明专利申请“雌激素受体和使用方法”的分案申请。

[0002] 继续申请数据

[0003] 本申请要求享有2004年3月10日提交的美国临时申请系列号60/552,067和2005年1月13日提交的60/643,469的利益，其每篇都在这里引作参考。

[0004] 政府资助

[0005] 本文所述的发明是在健康和人类服务部(Department of Health and Human Services)资助号CA84328的支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

[0006] 发明背景

[0007] 雌激素是在卵巢、睾丸和可能的肾上腺皮质中形成的类固醇化合物的总称。雌激素和具有雌激素活性的化合物的实例包括二乙基己烯雌酚、己烯雌酚二磷酸酯、己雌酚、聚磷酸雌二醇、溴苯雌酚、氯烯雌醚、己二烯雌酚、二乙基己烯雌酚、丙甲雌酚、双醋羟雌酮、6，9-去氢马烯雌酮、马烯雌酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、乙炔雌二醇、美雌醇、mexestrol、雌三醇环戊醚和炔雌醚。雌激素调节生殖组织和乳房、心血管、骨、肝和脑组织中的多种生理过程。
雌激素也用在口服避孕药中。雌激素的其它用途包括，缓解绝经的不适，抑制泌乳，和治疗骨质疏松症、先兆流产和各种功能性卵巢病症。抗雌激素药被用于治疗转移性乳腺癌和晚期前列腺癌。

[0008] 雌激素的作用由雌激素受体介导。在1986年克隆了首个雌激素受体(ER)(Green等，Nature，320：134(1986)和Greene等，Science，231：1150(1986))。在1995年之前，认为仅有一个负责天然的和合成的雌激素和抗雌激素药的所有生理和药理作用的雌激素受体。然而，在1995年，克隆了第二个雌激素受体(Kuiper等，PNAS，93：5925(1996))。发现的首个雌激素受体现在称作雌激素受体-α(ER-α)，而第二个雌激素受体称作雌激素受体-β(ER-β)。

[0009] ER-α和ER-β共有共同的结构体系(Zhang等，FEBS Letters，546：17(2003)和Kong等，Biochem.Soc.Trans.，31：56(2003))。二者都由3个独立的但是能相互作用的功能结构域组成：N-末端A/B结构域、C或DNA-结合结构域和D/E/F或配体-结合结构域(图1)。ER-α的N-末端结构域编码独立于配体的激活功能(AF-1)，即参加与辅激活物的相互作用和靶基因的转录活化的区域。DNA-结合结构域或C结构域含有2个锌指结构，其在受体二聚化和与特定的DNA序列的结合中起重要作用。C-末端D/E/F结构域是一种配体-结合结构域，其能介导配体结合、受体二聚化、核转位和配体-依赖性的反式激活功能(AF-2)。AF-1和AF-2对转录控制的相对贡献以细胞特异性的和DNA 启动子特异性的方式变化(Berry等，EMBO J.，9：2811(1990)和Tzukerman等，Mol.Endocrin.，8：21(1994))。

[0010] 已经表明，缺少ER-α基因的全长基因产物的前173个氨基酸的46-kDa ER-α同种型(A/B或AF-1结构域)，源自跳过外显子1的ER-α基因的可变剪接(Flouriot等，EMBO J.，19：4688(2000))。该可变剪接事件会产生mRNA，其在有利于翻译起始的Kozak序列内具有与原始可读框的剩余部分符合读框的AUG。因此，ER-α的该新同种型称作ER-α46，而原始同种型称作ER-α66(Flouriot等，EMBOJ.，19：4688(2000))。ER-α46形成同二聚体，并结合雌激素反应元件(ERE)，且它也可以与ER-α66形成异二聚体(Flouriot等，EMBO J.，19：4688(2000))。与ER-α66同二聚体相比，ER-α46同二聚体表现出更高的对ERE的亲和力。而且，ER-α46/66异二聚体比ER-α66同二聚体优先形成，且ER-α46竞争地起作用，以抑制由结合了配体的-ER-α66的AF-1结构域介导的反式激活，但是不影响AF-2-依赖性的反式激活(Floutiot等，EMBO J.，19：4688(2000))。因此，认为ER-α46是天然产生的ER-α同种型，其调节由ER-α66的AF-1结构域介导的雌激素信号传导。

[0011] ER-α能在大约15-30％内腔(luminal)上皮细胞中表达，但是根本不在正常人乳房中的任何其它细胞类型中表达。双标记免疫荧光技术揭示，在正常的人和啮齿动物乳腺中，ER-α-表达细胞能与用增殖标记物标记的细胞分开(Clarke等，Cancer Res.，57：4987(1997))。在导管增生的最早期，ER-α表达会增加，甚至随着异型的增加而增加更多，从而在低和中等核级的不典型导管增生和原位导管癌中的大部分细胞含有ER-α(Khan等，Cancer Res.，54：993(1994)和Lawson等，Lancet，351：1787(1994))。随着ER-α表达的增加，受体表达和细胞增殖之间的反相关变得调节异常(Shoker等，Amer.Jour.Path.，
155：1811(1999))。大约70％的侵入性乳腺癌表达ER-α，且这些肿瘤中的大部分含有ER-α-阳性的增殖细胞(Clarke等，Cancer Res.，57：4987(1997))。

[0012] 雌激素受体是能控制许多生理过程的配体-活化的转录因子核受体超家族的成员。该控制经常通过调节基因转录来发生(Katzenellenbogen和Katzenellenbogen，Breast Cancer Res.，2：335(2000)；Hull等，J.Biol.Chem.，276：36869(2001)；McDonnell和Norris，Science，296：1642(2002))。雌激素受体使用多种机理，以激活或抑制它的靶基因的转录。这些机理包括：(a)在雌激素反应元件处，配体-占据的受体与DNA的直接相互作用，随后是转录辅调节物(coregulator)或介质复合物的募集，(b)配体-占据的ER与其它转录因子相互作用，所述其它转录因子例如AP-1(Kushner等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，74：311(2000))、Sp1(Safe，Vitam.Horm.，62：231(2001)) 或 NF-κB(McKay和Cidlowski，Endocr.Rev.，20：435(1999))，或(c)通过隔离一般的/普通的转录组分，间接调节基因转录(Harnish等，Endocrinology，141：3403(2000)和Speir等，Circ.Res.，87：1006(2000))。另外，雌激素受体通过这些不同的机理调节转录的能力，似乎是细胞类型特异性的，可能是由于在每种细胞类型中可得到的转录辅调节因子的补体的差异(Cerillo等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，67：79(1998)；Evans等，Circ.Res.，89：823(2001)；Maret等，Endocrinology，140：2876(1999))。同样，转录调节依赖于配体的性质，其中各种天然的和合成的选择性的雌激素受体调节剂，通过这些不同机理中的每一种，起雌激素受体激动剂或拮抗剂的作用(Shang和Brown，Science，295：2465(2002)；
Katzenellenbogen和Katzenellenbogen，Science，295：2380(2002)；Margeat等，J.Mol.Biol.，326：77(2003)；Dang等，J.Biol.Chem.，278：962(2003))。

[0013] 存在由雌激素介导的另一个信号传导途径，也称作“非经典的”、“非基因组的”或“膜信号传导”途径，其包含胞质蛋白、生长因子和其它膜-启动的信号传导途径(Segars等，Trends Endocrin.Met.，13：349(2002))。已经表明，几种细胞内的信号传导途径能与快速的雌激素-启动的作用通讯：腺苷酸环化酶途径(Aronica等，PNAS，91：8517(1994))、磷脂酶C途径(Le Mellay等，J.Cell.Biochem.，75：138(1999))、G-蛋白-偶联的受体-活化的途径(Razandi等，Mol.Endocrin.，13：307(1999))和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径(Watters等，Endocrinology，138：4030(1997))。但是，迄今为止描述的所有膜形式，都与ER-α有关，但与ER-β无关(Segars等，Trends Endocrin.Met.，13：349(2002))。

[0014] 病理上，雌激素信号传导已经与乳腺癌和子宫内膜癌的高风险相关联(Summer和Fuqua，Semin.Cancer Biol.，11：339(2001)；Turner等，Endocr.Rev.，15：275(1994)；Farhat等，FASEB J.，10：615(1996)；Beato等，Cell，83：851(1995)；Dobrzycka等，Endo.Rel.Cancer，10：517(2003))。结果，已经发现雌激素受体是大多数这样的癌症的开始和发展所必需的。雌激素受体-阳性的乳腺癌的当前内分泌疗法主要针对雌激素水平、雌激素受体水平或雌激素和雌激素受体的活性设计。在早期乳腺癌的管理中，部分的抗雌激素药他莫昔芬的使用，已经清楚地证实了无疾病和总存活的增加。另外，近期的研究证实，他莫昔芬可以用作激素-依赖性的乳腺癌的化学预防剂。使用他莫昔芬的长期疗法的主要问题是它的亲子宫作用，这会导致子宫内膜癌的高风险，和对他莫昔芬的获得性临床抗性。这已经导致了对更好的选择性雌激素受体调节剂(SERM)的迫切寻求，所述调节剂在各种雌激素反应靶组织中表现出最佳的激动或拮抗活性。

[0015] 因此，需要可以用于筛选能调节雌激素信号传导的其它方法和材料，以及可以用于调节雌激素信号传导的方法和材料。

[0016] 发明概述

[0017] 本发明提供了分离的抗体，其能特异性地结合SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段，优选地，SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。任选地，抗体是人源化的抗体。抗体可以共价地附着化合物，例如，化疗剂或检测标记例如荧光标记。抗体可以存在于组合物中，且组合物可以包含药学上可接受的载体。还提供了试剂盒，其包含本发明的抗体。

[0018] 本发明也提供了制备抗体的方法。抗体可以是多克隆的或单克隆的。该方法包括，给动物施用具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段，优选地，SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列。该方法还包括从动物分离抗体，其中该分离的抗体能特异性地结合氨基酸序列。多肽或其免疫原性亚基可以共价地附着载体多肽。分离可以包括，从动物得到产生该抗体的细胞，和使用该细胞制备能产生单克隆抗体的杂交瘤。本发明还包括通过该方法生产的多克隆抗体和通过该方法生产的单克隆抗体。

[0019] 本发明也涉及包含外源编码区的细胞，其中该编码区编码包含SEQ ID NO：20的多肽。编码区可以编码具有与SEQ ID NO：20具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，其中该多肽具有ER-α36活性。编码区可以可操作地连接到组成型启动子。细胞可以是真核细胞或原核细胞。本发明还提供了表达这样的多肽的细胞。

[0020] 本发明还提供了鉴别结合多肽的试剂的方法。该方法包括，组合包含SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的多肽和试剂，检测试剂和多肽之间的复合物形成，检测多肽活性的改变，或其组合。通过直接检测试剂与多肽的结合，使用竞争结合测定检测试剂与多肽的结合，或其组合，可以检测试剂与多肽的结合。任选地，该方法也包括，确定试剂是否结合包含SEQ ID NO：18的多肽。

[0021] 本发明还提供了检测多肽的方法。一方面，该方法包括提供细胞，分析细胞中具有ER-α36活性和36kDa分子量的多肽，所述分子量如按照在十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上电泳测得的，和确定细胞是否表达该多肽。细胞可以是离体的(ex vivo)或体内的。细胞可以是，例如，肿瘤细胞，例如乳腺肿瘤细胞。分析可以包括，使细胞接触能特异性地结合SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，或其免疫原性片段的抗体。分析可以包括，扩增mRNA多核苷酸，以形成扩增的多核苷酸。扩增包括，使从细胞得到的多核苷酸接触引物对，后者能扩增mRNA多核苷酸，其包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25，或其组合，其中扩增的多核苷酸的存在表明该细胞表达多肽。引物对的一个引物可以选自SEQ ID NO：22的核苷酸，与SEQ ID NO：25的核苷酸互补的核苷酸，或其组合。

[0022] 本发明也提供了抑制细胞的ER-α36活性的方法。该方法包括，使表达具有SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列的多肽的细胞接触能抑制ER-α36活性的化合物。这样的化合物可以是能特异性地结合具有SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列的多肽的抗体。细胞可以是体内的或离体的，且任选地可以是ER-α66阴性的，ER-α46阴性的，或其组合。在有些方面，化合物不是抗雌激素药。

[0023] 本发明还提供了分离的多肽，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，优选地SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列，更优选地，SEQ ID NO：20所述的氨基酸序列。在另一个方面，分离的多肽与SEQ ID NO：20具有至少70％同一性，其中该多肽具有ER-α36活性。本发明也包括SEQ ID NO：1的免疫原性片段。

[0024] 当这些术语出现在说明书和权利要求书中时，术语“包含”和其变体不具有限制含义。除非另有限定，可互换地使用“一个(a)”、“一个(an)”、“该(the)”和“至少一个”，且指一个或多于一个。

[0025] 附图简述

[0026] 图1解释了人雌激素受体-α(ER-α)同种型的结构域结构代表。显示了结构域(用A-F标记的)、氨基酸序列编号、AF-1和AF-2、DNA结合结构域、配体-结合结构域和二聚化结构域。也指示了磷酸化位点和每个结构域的功能。

[0027] 图2是证实ER-α的膜和基因组信号传导途径之间的可能的通讯的示意图。Cav-1代表小窝蛋白-1，ER-α，雌激素受体-α；RTK，受体酪氨酸激酶；Ras，Ras癌基因；Mek，MAP/ERK激酶；MAPK，促分裂原活化蛋白激酶；PI3K，磷酸肌醇-三磷酸激酶；AKT，蛋白激酶13；PDK1，磷酸肌醇-依赖性的蛋白激酶；RSK，p90核糖体S6激酶。

[0028] 图3是显示在有雌二醇(E2)存在下，pRET-感染的MCF10A细胞在软琼脂中生长成大菌落的照片。ST1克隆在含有E2的软琼脂中表现出快速生长。分别包括MCF7和MCF10A细胞作为阳性和阴性对照。

[0029] 图4是显示pRET-感染的MCF10A细胞中的小窝蛋白-1(Cav-1)表达的下调的蛋白印迹。通过使用兔抗-Cav-1抗体(N20)的蛋白印迹，分析来自不同细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示Cav-1的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。

[0030] 图5是显示pRET-感染的MCF10A细胞中的ER-α表达的下调的蛋白印迹。通过使用针对ER-α(H222)和ER-β的抗体的蛋白印迹，分析来自不同细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示ER-α和ER-β的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。

[0031] 图6是显示pRET-感染的MCF10A细胞中的ERK1/2磷酸化的活化的蛋白印迹。通过使用针对ERK1/2和磷酸化的ERK1/2的抗体的蛋白印迹，分析来自细胞系的等量的全细胞提取物。

[0032] 图7是显示3种ER-α蛋白在Cav-1单倍体不足(haploinsufficient)细胞ST1和ST3和MCF7乳腺癌细胞中的存在的蛋白印迹。通过使用针对ER-α的H222抗体的蛋白印迹，分析来自细胞系的等量的全细胞提取物。用箭标指示ER-α66、ER-α46和ER-α36的位置，且在每个泳道上面指示在每个泳道中分析的细胞提取物。

[0033] 图8描绘了人ER-α基因的基因组组织。用箭标指示多个启动子的位置。用AUG和UGA指示翻译起始和终止位置。用编号的框显示外显子。也用框中的外显子1′显示内含子1。下图显示了ER-α同种型的mRNA结构。用AAA指示聚腺苷酸化位点。

[0034] 图9是琼脂糖凝胶的图片，它显示了通过PCR分离能编ER-α36的可读框的cDNA。用箭标指示cDNA在凝胶中的位置。

[0035] 图10显示了ER-α36可读框的预测的氨基酸序列。用氨基酸序列(SEQ ID NO：20)左侧的编号，指示氨基酸位置。ER-α36独有的最后的27个氨基酸标有下划线(SEQ ID NO：1)。

[0036] 图11显示了ER-α66、ER-α46和ER-α36的蛋白印迹分析。标记为ER-α66、ER-α46和ER-α36的泳道代表着用能编码所述的雌激素受体同种型的表达质粒转染、并在转染后2天裂解的HEK 293细胞的分离的培养物。用抗-ER-α抗体(H222)，免疫检测每种转染子的裂解物。来自MCF7细胞的细胞提取物用作阳性对照。用箭标指示ER-α66、ER-α46和ER-α36的位置。

[0037] 图12显示了：(a)能编码ER-α36且包含ER-α36启动子的基因的5′侧翼序列的DNA序列(SEQ ID NO：22)，和(b)能编码ER-α36且包含由外显子9编码的核苷酸的基因的3′侧翼序列的DNA序列(SEQ ID NO：25)。在5′侧翼序列中，推定的转录结合位点标有下划线，且也指示了能结合核酸序列的蛋白。也用箭标指示了cDNA的起始位点。

[0038] 图13显示了不同的乳腺癌细胞MCF10A、T47D、MCF7和MDA-MB-231中的ER-α36的RNA印迹分析。用箭标指示了ER-α36和肌动蛋白的位置。

[0039] 图14显示了ER-α36对ER-α66和ER-β的AF-1和AF-2结构域介导的转录转反式激活活性的抑制。(+E2)，E2处理的细胞；(-E2)，未用E2处理的细胞。

[0040] 图15显示，ER-α36能介导由E2刺激的膜-启动的MAPK激酶途径。(a)蛋白印迹显示了用雌二醇-17β(E2β)处理ER 36-293细胞，会诱导Mek1/2和ERK1/2的快速磷酸化。P-Mek1/2和P-ERK1/2，分别是Mek1/2和ERK1/2的磷酸化形式。(b)血清(而不是E2β)会诱导对照载体-293细胞中的ERK1/2的磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(c)不同的雌激素和抗雌激素药会诱导ER36-293细胞中的ERK1/2的快速磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。(d)他莫昔芬处理能组成型地刺激ER36-293细胞中的ERK1/2磷酸化。P-ERK1/2是ERK1/2的磷酸化形式。

[0041] 图16表明，ER-α36能介导E2β诱导的MAPK激酶核信号传导，并刺激细胞生长。(a)E2β对MAPK激酶核信号传导的作用。用5XGal4-LUC，即含有5个Gal4 DNA结合位点的萤光素酶报告质粒，和含有与Gal4DNA结合结构域融合的ELK转录活化结构域的Gal-ELK表达载体(上图)，瞬时转染了ER36-293和对照载体-293细胞。转染后，将细胞培养物维持在没有雌激素的培养基中36小时，然后加入E2β(1nM或10nM)12小时。具有标准差的萤光素酶活性代表着一式两份进行的超过3次实验。(b)E2β和抗雌激素药能刺激ER36-293细胞的生长。显示了在490nm的吸光度数据。平均了超过5次独立实验的结果；显示了平均值和SEM。还通过成对的t-检验，评价了这些结果的统计学显著性。ER36-293和载体-293细胞的P-值小于0.001。

[0042] 图17表明，ER-α36主要是基于膜的雌激素受体。(a)蛋白印迹分析ER-α36在不同的确立的乳腺癌细胞系中的表达。剥离相同的印迹，并用抗-肌动蛋白抗体探测，以确保等量装载。(b)ER-α36在ER-α36转染的293细胞中的亚细胞定位。用ER-α36特异性的抗体，免疫印迹不同的亚细胞级分中的ER-α36。W，全细胞裂解物；PM，质膜；C，胞质溶胶；N，核。通过免疫印迹质膜、胞质溶胶、核和高尔基体的各种蛋白标记，检查亚细胞级分纯度。5′NT，5′核苷酸酶；D4-GDI，GDP解离抑制剂；mSin3A，组蛋白重构复合物的组分；COPB，β外被蛋白。

[0043] 图18表明，E2β能促进ER-α66阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231在软琼脂中的生长。在不存在E2β(0)、存在10nM E2β(E2)、存在10nM E2β和10nM他莫昔芬(E2+TAM)和存在单独的10nM他莫昔芬(TAM)的情况下，使MDA-MB-231细胞在软琼脂上生长3周。

[0044] 图19表明，E2β能诱导ER-α66阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231中的膜启动的雌激素信号传导。用雌二醇-17β(E2β)处理MDA-MB-231细胞，会诱导ERK1/2的快速磷酸化。用E2β(10nM)处理细胞不同的时间点，使所述细胞裂解，并使用磷酸化依赖性的和非依赖性的抗体，通过蛋白印迹进行分析。

[0045] 本发明的优选实施方案的详述

[0046] 已经发现，小窝蛋白-1(Cav-1)系统的下调会组成型激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，激活雌激素受体-α(ER-α)的表达，和触发正雌激素信号传导。该发现首次提供了活化的MAPK信号传导和乳房肿瘤发生(尤其是由雌激素刺激的乳腺癌发展)之间的清楚的联系。该发现有力地提示，Cav-1通过协调MAPK和雌激素信号传导途径之间的通讯，在维持乳房上皮细胞的正常生长中起重要作用，且它的下调可能有助于这2个重要途径的调节异常，这最终导致乳腺肿瘤发生。图2显示了雌激素信号传导途径和MAPK信号传导途径的示意图。

[0047] 还已经鉴别和克隆了雌激素受体-α同种型。从位于原始的66-kDaER-α(ER-α66)基因的第一个内含子中的启动子，产生了雌激素受体-α的该36-kDa同种型(ER-α36)。ER-α36不同于ER-α66，因为它缺少2个转录活化结构域(AF-1和AF-2)，但是保留了DNA-结合、二聚化和大部分的配体-结合结构域。ER-α36的结构表明，ER-α36是雌激素信号传导的调节剂。ER-α36也可以介导雌激素信号传导的膜作用，因为它主要在质膜上表达，且也在胞质溶胶和核中表达。

[0048] 已经将ER-β视作ER-α66介导的雌激素信号传导的组成型调节剂。发现缺少AF-1结构域的ER-α46可以二聚化成ER-α66，并抑制由ER-α66的AF-1结构域介导的反式激活活性，这表明ER-α46在由ER-α66的AF-1结构域介导的功能活性中起调节作用。ER-α36缺少AF-1和AF-2结构域。因而，认为ER-α36会抑制由ER-α66的AF-1和AF-2介导的生物功能，以及由ER-α46的AF-2介导的功能。利用ER-α36和ER-α46介导的调节，其二者可能在不同的组织中以不同的水平表达，ER-α66可以在不同的靶组织中不同地起作用。认为这样的机理能解释不同生物过程中的雌激素信号传导的多效性作用。

[0049] 本发明的多肽和肽模仿物(peptidomimetic)

[0050] 本发明提供了多肽。如本文使用的，术语“多肽”泛指通过肽键连接到一起的2个或更多个氨基酸的聚合物。术语肽、寡肽和蛋白都包含在多肽的定义中，且这些术语可互换地使用。应当理解，这些术语不意味着氨基酸聚合物的特定长度，它们也无意暗示或区分多肽是否由重组技术、化学或酶促合成生成，或是天然产生。本文公开和描述了本发明范围内的多肽的多个实例。在天然产生的多肽或多核苷酸的情况下，优选地，分离这样的多肽或多核苷酸，并任选地纯化。“分离的”多肽或多核苷酸是从它的天然环境分开和分离的多肽或多核苷酸。“纯化的”多肽或多核苷酸是至少60％地不含、优选地75％地不含和最优选地90％地不含它们天然地伴随的其它组分的多肽或多核苷酸。认为在它们天然发生的生物外面生产(例如，通过化学或重组方法)的多肽和核苷酸，是定义的分离的和纯化的，因为它们从未存在于天然环境中。“外源多肽”指外来多肽，即通常不存在于细胞中的多肽，或通常存在于细胞中、但是已经通过实验方法导入细胞中(例如，通过导入能编码该多肽的多核苷酸)的多肽。

[0051] 本发明的多肽可以是生物活性的。这样的生物活性在本文中称作“ER-α36活性”。可以用于确定本发明的多肽是否是生物活性的生物测定的实例包含，使能表达该多肽的细胞接触雌激素或抗-雌激素药，并测定在有雌激素或抗-雌激素药存在的情况下，与不表达本发明的多肽的对照细胞中的MAPK活性相比，MAPK途径的活性是增高还是降低。优选地，MAPK活性是ERK 1/2和Mek 1/2的磷酸化，且优选地，在有抗-雌激素药存在的情况下，本发明的多肽诱导的ERK1/2的磷酸化不减少。优选地，ER-α36活性是膜启动的。通过暴露能表达具有对不同配体的ER-α36活性的多肽的细胞，可以测量ER-α36活性。可以使用的配体的实例，包括但不限于，雌酮(E1)、17α-雌二醇(E2α)、17β-雌二醇(E2β)、雌三醇(E3)、雌四醇(estetrol)(E4)或附着到不可透过膜的分子，例如牛血清清蛋白(BSA)的雌激素。通常，当待测ER-α36活性限于膜启动的ER-α36活性时，使用附着到不可透过膜的分子上的雌激素。使用的雌激素的量可以变化，且优选地，在1nM至10nM的范围内。暴露于雌激素的细胞优选地是休眠细胞。该暴露允许发生5-90分钟，然后裂解细胞，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离存在于细胞中的多肽。将分离的多肽转移到膜上后，使用针对非磷酸化和磷酸化形式的ERK 1/2和Mek 1/2的抗体，评价MAPK途径的活化。任选地，可以包括抗-雌激素药，例如他莫昔芬、4OH-他莫昔芬或ICI-182，780，以确定ERK 1/2的磷酸化是否对抗雌激素药不敏感。

[0052] 本发明提供了具有SEQ ID NO：20所述的氨基酸序列的多肽。该多肽，和本文所述的有关多肽，在本文中也称作ER-α36、ER-α36同种型和ER受体α36-亚基。如图1所示，当与ER-α66同种型相比较时，ER-α36同种型缺少氨基-末端氨基酸残基1-183，羧基-末端氨基酸残基430-595，且在它的C-末端具有27个氨基酸残基的添加(见表1)。雌激素受体α异构体包括ER-α36、ER-α46、ER-α66。雌激素受体β异构体包括ER-β。本发明也提供了雌激素受体，其包括ER-α36同种型。无意进行限制，认为ER-α36同种型能通过与ER-α66、ER-α46或ER-β形成二聚体，通过调节雌激素受体功能，来调节细胞对雌激素的反应。而且，认为ER-α36缺少活化因子1(AF-1)和活化因子2(AF-2)活性，并因而缺少内在的转录活性。但是，认为ER-α36保留了完整的二聚化结构域，其允许ER-α36与ER-α46、ER-α66或ER-β二聚化。认为该相互作用允许ER-α36调节含有雌激素受体的ER-α46、ER-α66和ER-β的活性。

[0053] 表1

[0054] 氨基酸和核苷酸序列

[0055]

[0056]

[0057]

[0058] 本发明的多肽包括与SEQ ID NO：20具有至少70％同一性的氨基酸序列的多肽。这样的多肽包括与SEQ ID NO：20具有超过70％的至少单个百分比的同一性的氨基酸序列的多肽，例如与SEQ IDNO：20具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。优选地，多肽包括且有如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列以递增的优选等级，与SEQ ID NO：20具有至少约80％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性。优选地，多肽是生物活性的。优选地，多肽具有36kDa的分子量，如按照十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳测得的。一般，参与ER-α66的磷酸化的残基，例如S236、K302和K303是保守的，参与ER-α66的DNA结合结构域、配体结合结构域和二聚化结构域的功能的那些残基也是如此。在DNA结合、配体结合和/或二聚化中起作用的残基是本领域已知的。

[0059] 通常，通过比对2个氨基酸序列的残基，确定2个多肽序列之间的百分比同一性，以最优化沿着它们的序列长度的相同氨基酸的数目；在进行比对时允许任一个或2个序列中有缺口，以最优化相同氨基酸的数目，尽管每个序列中的氨基酸必须保持它们的正确次序。优选地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序，版本2.0.9，如Tatusova等(FEMS Microbiol.Lett.，174，247-250(1999))所述，且可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html从环球网上得到，来对比2个氨基酸序列。优选地，使用所有BLAST2搜索参数的缺省值，包括矩阵(matrix)＝BLOSUM62；开放缺口罚分(open gap penalty)＝11，延伸缺口罚分(extension gap penalty)＝1，gap x_dropoff＝50，期望(expect)＝10，字长(wordsize)＝3，并任选地，过滤器处于开。在使用BLAST搜索算法对比2个氨基酸序列时，结构相似性称作“同一性”。

[0060] 本发明也提供了作为ER-α36雌激素受体同种型的片段的多肽。优选地，片段是免疫原性的。在有些方面，片段具有ER-α6活性。免疫原性片段的实例是，SEQ ID NO：1的氨基酸13-27所述的氨基酸序列，更优选地，SEQ ID NO：1的1-27。这样的片段可以用于制备能特异性地结合ER-α36雌激素受体同种型的抗体。片段的实例包括已经在N-末端或C-末端或两末端截短1个或多个氨基酸的雌激素受体同种型，只要该片段含有至少5个邻接氨基酸，更优选地至少7个邻接氨基酸，甚至更优选地至少10个邻接氨基酸，和最优选地至少12个邻接氨基酸。

[0061] 本发明提供了融合多肽，其具有偶联到本发明的多肽上的载体多肽。载体多肽可以用于增加或降低融合多肽的溶解度。载体多肽也可以用于增加融合多肽的免疫原性，以增加能结合本发明的多肽的抗体的生产。例如，载体多肽可以融合到本发明的多肽片段上，以促进能特异性地结合ER-α36的抗体的生产。这样的片段的实例是具有SEQID NO：1的氨基酸13-27的多肽。本发明不受用于生成本发明的融合多肽的载体多肽类型的限制。载体多肽的实例包括匙孔血蓝蛋白、牛血清清蛋白、卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、兔血清清蛋白等。载体多肽也可以用于分离或检测融合多肽。这样的载体蛋白的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖-结合蛋白、壳多糖-结合蛋白和具有下述氨基酸序列的多肽：
QFFGLM(SEQ ID NO：2)、EQKLISEEDL(SEQ IDNO：3)、KAEDESS(SEQ ID NO：4)、YPYDVPDYA(SEQ ID NO：5)、DYKDDDDK(SEQ ID NO：6)、YTDIEMNRLGK(SEQ ID NO：7)、MASMTGGQQMG(SEQ ID NO：8)、DTYRYI(SEQ ID NO：9)、TDFYLK(SEQ ID NO：10)、HHHHHH(SEQ ID NO：11)、HPOL(SEQ ID NO：12)、QYPALT(SEQ ID NO：13)、QRQYGDVFKGD(SEQ ID NO：14)、EYMPME(SEQID NO：15)、EFMPME(SEQ ID NO：16)和RYIRS(SEQ ID NO：17)。因此，通过与结合融合多肽的载体多肽部分的其它组分的相互作用，可以检测或分离融合多肽。例如，通过使用已知的方法，可以用生物素检测或分离具有作为载体多肽的抗生物素蛋白的融合多肽。载体多肽也可以用于造成融合多肽在细胞中表达后形成内含体。载体多肽也可以是输出信号，其能造成融合多肽输出细胞，或把融合多肽导向细胞中的隔室，例如周质。

[0062] 本发明也提供了本发明的2种或更多种多肽，其连续连接进单个氨基酸链中。这样的多肽在本文中称作多肽。多肽可以通过接头连接(见Stahl等，美国专利号6,558,924)。可以分离这样的多蛋白，然后切割，以生成本发明的多肽或偶联多肽。通过使用许多方法，例如化学或蛋白酶切割，可以切割多蛋白。因此，可以将接头设计成被特定的蛋白酶或化学试剂切割。可以用于切割本发明的多蛋白的化合物的实例包括化学试剂和酶。化学试剂的实例包括溴化氰、甲酸和加热、羟胺和加热、溶于醋酸中的亚碘酰基苯甲酸-2-(2-硝基苯基)-3-甲基-3-溴代假吲哚等。酶的实例包括Ala-64枯草杆菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、肠激酶、凝血因子Xa、肾素、α-凝血酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶等。多蛋白可以用于增加本发明的多肽的生产效率。生产多蛋白的方法是本领域已知的(见Coolidge等，美国专利号6,127,150)。

[0063] 本发明的多肽包括已经通过添加、取代或缺失一个或多个邻接的或不邻接的氨基酸来修饰的类似物，或已经被化学地或酶促地修饰的类似物，例如通过报告基团的附着，通过N-末端、C-末端或其它官能团修饰或衍生，或通过环化，只要该类似物能保留生物活性或能刺激结合ER-α36的抗体的生产。类似物因而可以在多肽的一个或两个末端包括其它的氨基酸。优选地，类似物是免疫原性的，更优选地，类似物是免疫原性的，且具有ER-α36活性。在有些方面，本发明提供了非类似物的多肽。

[0064] 本发明的多肽中的氨基酸取代优选地是保守取代，其选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，蛋白生物化学领域众所周知，属于具有特定大小或特征(例如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸组的氨基酸，通常可以取代为另一种氨基酸，而基本上不改变多肽的结构。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。优选的保守取代的实例包括Lys取代Arg，反之亦然，以维持正电荷；Glu取代Asp，反之亦然，以维持负电荷；Ser取代Thr，以维持游离的-OH；和Gln取代Asn，以维持游离的NH2。有关的氨基酸(例如3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、高半胱氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、γ-羧基谷氨酸、β-羧基天冬氨酸)、氨基酸酰胺(鸟氨酸、高精氨酸、N-甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、高精氨酸、肌氨酸和羟赖氨酸)和取代的苯丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-氨基辛酸、2-氨基庚酸、statine、β-缬氨酸、萘基丙氨酸、四氢异喹啉-3-羧酸和卤化的酪氨酸，可以被交换成类似的氨基酸。

[0065] 本发明提供了本发明的多肽的肽模仿物。肽模仿物指这样的多肽，其中至少一个肽键已经被替换为非肽键，例如在制药工业中经常用作非肽药物的那些，其具有与模板多肽类似的性质(Fauchere，J.，Adv.Drug Res.，15：29(1986)，Evans等，J.Med.Chem.，30：1229(1987)，和Janda等，美国专利号6,664,372)。肽模仿物在结构上类似于具有肽键的多肽，但是具有一个或多个通过本领域已知的方法任选地被下述键替代的肽键：例如，--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。肽模仿物胜过天然多肽实施方案的优点包括，更经济的生产，更高的化学稳定性，改变的特异性和增强的药理性质，例如半衰期、吸收、效价和功效。

[0066] 用相同类型的D-氨基酸取代多肽或肽模仿物中的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸替代L-赖氨酸)，可以产生多肽和肽模仿物，其例如更稳定，且更能抗内源蛋白酶。

[0067] 通过在氨基-末端和/或羧基-末端添加能减少体内降解的封闭剂，可以修饰本发明的多肽和肽模仿物用于体内用途。这可以用于这样的情形，其中多肽末端倾向于被蛋白酶体内降解。这样的封闭剂包括但不限于，可以附着到本发明的多肽或肽模仿物的氨基和/或羧基末端残基的其它的有关的或无关的肽序列。这可以在化学合成过程中完成，或通过一般技术的人员熟悉的方法，通过重组DNA技术完成。或者，封闭剂例如焦谷氨酸，或本领域已知的其它分子，可以附着到氨基和/或羧基末端残基上，或氨基末端的氨基或羧基末端的羧基可以替换为不同的部分。因此，本发明提供了被封闭的多肽和肽模仿物，和氨基末端、羧基末端或其组合。

[0068] 通过使用许多表达系统，包括但不限于，用其中已经插入了本发明的多核苷酸的重组载体转化的细胞或微生物，可以小规模或大规模地生产本发明的多肽。下面描述了这样的重组载体和其应用方法。这些载体可以用于转化许多生物。这样的生物的实例包括，细菌(例如，大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；酵母(例如，糖酵母属(Saccharomyces)和毕赤氏酵母属(Pichia))；昆虫(例如，杆状病毒)；植物；或哺乳动物细胞(例如，COS、CHO、BHK、293、VERO、HeLa、MDCK、W138和NIH 3T3细胞)。直接从用载体转染的哺乳动物得到的原代或次生细胞，也可以用作宿主细胞。

[0069] 合成方法也可以用于生产本发明的多肽和肽模仿物。这样的方法是本领域已知的和常规的。例如，固相肽合成方法是确定的且广泛使用的方法。通过在免疫亲和或离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅石或阴离子交换树脂例如DEAE上的色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤、配体亲和色谱等，可以容易地纯化多肽。通过使融合多肽结合分离介质，然后切割融合多肽以释放纯化的多肽，也可以容易地纯化多肽。例如，可以生成包含在多肽和载体多肽之间的凝血因子Xa切割位点的融合多肽。融合多肽也可以结合亲和柱，后者上面结合了融合多肽的载体多肽部分。然后，可以用凝血因子Xa切割融合多肽，以释放多肽。这样的系统已经与凝血因子Xa去除试剂盒组合使用，用于纯化本发明的多肽。

[0070] 多核苷酸

[0071] 本发明提供了能编码本发明的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”泛指以5′至3′方向共价连接的2个或更多个核苷酸的聚合物。多核苷酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，包括例如编码序列，和非编码序列，例如调节序列。编码序列、非编码序列和调节序列如下面定义。术语核酸、核酸分子和寡核苷酸包含在多核苷酸的定义内，且这些术语可互换地使用。应当理解，这些术语不意味着核苷酸聚合物的特定长度，它们也无意暗示或区分多核苷酸是否由重组技术、化学或酶促合成生成，或是天然产生。

[0072] 多核苷酸可以是单链的或双链的，且第二个互补链的序列由第一链的序列决定。因此，术语“多核苷酸”应当广义地理解为包括单链的核酸聚合物，它的互补体，和由此形成的双链体。多核苷酸的“互补性”指2个单链多核苷酸彼此碱基配对的能力，其中一个多核苷酸上的腺嘌呤与另一个上的胸苷(或尿嘧啶，在RNA的情况下)碱基配对，而一个多核苷酸上的胞苷与另一个上的鸟嘌呤碱基配对。当一个多核苷酸上的核苷酸序列与第二个多核苷酸上的核苷酸序列碱基配对时，2个多核苷酸彼此互补。例如，5′-ATGC和5′-GCAT是完全互补的，5′-GCTA和5′-TAGC也是如此。

[0073] 本发明的多核苷酸的一个实例是SEQ ID NO：21(见表1，也即存在于GenBank登记号BX640939中的核苷酸序列的核苷酸234-1166)。优选的本发明的多核苷酸也包括具有与能编码根据本发明的多肽的核苷酸序列“基本上互补的”核苷酸序列的多核苷酸，或这样的核苷酸序列的互补体。“基本上互补的”多核苷酸可以包括至少一个碱基对错配，但是2个多核苷酸仍然具有杂交的能力。例如，2个DNA分子5′-AGCAAATAT和5′-ATATATGCT中的每一个的中间核苷酸不能碱基配对，但是这2个多核苷酸仍然是如本文定义的基本上互补的。如果它们在55℃、2X SSC(SSC：150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠，pH7.6)示例的杂交条件下杂交，则2个多核苷酸是基本上互补的。用于本发明目的的基本上互补的多核苷酸优选地共有至少一个至少20个核苷酸长的区域，该共有区域具有至少60％核苷酸同一性、优选地至少80％核苷酸同一性、更优选地至少90％核苷酸同一性和最优选地至少95％核苷酸同一性。特别优选的基本上互补的多核苷酸共有许多这样的区域。优选地，多核苷酸与SEQ ID NO：21具有至少70％同一性的核苷酸序列。更优选地，多核苷酸具有如下核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：21具有超过70％的至少单个百分比的同一性，例如与SEQ ID NO：21具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。甚至更优选地，多核苷酸具有与SEQID NO：21具有至少80％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的核苷酸序列。最优选地，多核苷酸具有与SEQ ID NO：21具有100％同一性的核苷酸序列。与SEQ ID NO：21具有至少70％同一性的多核苷酸具有ER-α36活性。

[0074] 通常，通过比对2个多核苷酸序列的碱基，确定2个多核苷酸序列之间的百分比同一性，以最优化沿着它们的序列长度的相同碱基的数目；在进行比对时允许任一个或2个序列中有缺口，以最优化相同碱基的数目，尽管每个序列中的碱基必须保持它们的正确次序。优选地，使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序，版本2.0.11，也如Tatusova等(FEMS Microbiol.Lett，174，247-250(1999))所述，且可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html从环球网上得到，来对比2个多核苷酸序列。优选地，使用所有BLAST2搜索参数的缺省值，包括匹配奖分(reward for match)＝1，错配罚分(penalty for mismatch)＝-2，开放缺口罚分＝5，延伸缺口罚分＝2，gap x_dropoff＝50，期望＝10，字长＝11，并任选地，过滤器处于开。使用CLUSTALW多序列比对软件(J.Thompson等，Nucl.Acids Res.，22：4673-4680(1994))，其可以在www.ebi.ac.uk/clustalw/从环球网上得到，也可以容易地确定2个多核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的位置和水平。

[0075] 应当理解，能编码本发明的多肽的多核苷酸不限于含有天然产生的基因组或cDNA核苷酸序列的全部或部分的多核苷酸，而是也包括由于遗传密码的简并性，能编码这样的多肽的多核苷酸类别。例如，天然产生的多核苷酸序列SEQ ID NO：21只是能编码具有氨基酸SEQ ID NO：20的多肽的核苷酸序列类别的一个成员。能编码选择的多肽序列的核苷酸序列类别很大但是有限，且参考标准的遗传密码，其中已知不同的核苷酸三联体(密码子)能编码相同的氨基酸，本领域的技术人员能容易地确定类别中的每个成员的核苷酸序列。

[0076] 能“编码”本发明的多肽的多核苷酸任选地包含编码区和非编码区，且因此应当理解，除非另有相反说明，能“编码”多肽的多核苷酸在结构上不限于能编码多肽的核苷酸序列，而是也包括编码区以外(即，5′或3′)的其它核苷酸序列。“编码区”或“编码序列”是能编码多肽的核苷酸序列，且当置于适当的调节序列的控制下时，其能表达编码的多肽。编码区的边界通常由在它的5′端的翻译起始密码子和在它的3′端的翻译终止密码子决定。“外源编码区”指外来编码区，即通常在细胞中不存在的编码区，或通常存在于细胞中、但是已经通过实验方法导入细胞中、可操作地连接到它通常不可操作地连接的调节区的编码区，或其组合。

[0077] 本发明的多核苷酸在拓扑学上可以是线状的或环状的。多核苷酸可以是，例如，载体的一部分。载体可以提供进一步克隆(多核苷酸的扩增)，即克隆载体，或提供由编码区编码的多肽的表达，即表达载体。载体可以包括，但不限于，质粒、噬菌粒、F因子、病毒、粘粒或噬菌体。载体可以是双链或单链的线状或环状形式。通过整合进细胞基因组或存在于染色体外(例如，作为具有复制起点的自主复制质粒)，载体也可以转化原核或真核宿主。载体中的多核苷酸可以在适当的启动子或用于体外转录或在宿主细胞中转录的其它调节序列的控制下，并与其可操作地连接，所述宿主细胞例如真核细胞，或微生物，例如细菌。优选的真核细胞实例包括MDA-MB-231、Hela、CHO和MCF10A细胞系。调节序列，或调节区，指位于编码序列的上游、中间或下游的核苷酸序列，且可操作地连接编码序列。调节序列的实例包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化信号序列。它们包括天然的和合成的序列，以及可以与合成的和天然的序列相组合的序列。调节序列不限于启动子。但是，在本发明中有用的一些合适的调节序列包括，但不限于，组成型启动子、组织-特异性的启动子、发育-特异性的启动子、诱导型启动子和病毒启动子。术语“可操作地连接”指组分的并列，以便它们处于允许它们以目标方式发挥作用的关系。当以在与调节序列相容的条件下实现编码区的表达的方式连接时，调节序列“可操作地连接”到编码区。

[0078] 载体可以是能在多种宿主中起作用的穿梭载体。载体也可以是克隆载体，其一般含有一个或少数限制性内切核酸酶识别位点，外来DNA序列可以在这里以可确定的方式插入。可以发生这样的插入，而不丧失克隆载体的基本生物功能。克隆载体也可以含有标记基因，其适用于鉴别和选择用克隆载体转化的细胞。标记基因的实例是四环素抗性或氨苄青霉素抗性。许多克隆载体可以商业上得到(例如Stratagene，New England Biolabs，Clonetech)。载体可以是含有调节序列的表达载体，所述调节序列能指导插入表达载体的多核苷酸的表达。许多载体可以商业上得到，且是本领域已知的(Stratagene，La Jolla，CA；New England Biolabs，Beverly，MA)。表达载体可以用于体外转录和翻译测定。

[0079] 将多核苷酸导入载体的方法，是本领域众所周知的(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))。简而言之，用一种或多种限制酶(限制性内切核酸酶)处理要插入多核苷酸的载体，生成线性化的载体，其具有平端，具有5′或3′突出端的“粘性”末端，或上面的任意组合。也可以用限制酶处理载体，随后用另一种修饰酶处理，例如聚合酶、外切核酸酶、磷酸酶或激酶，以生成线性化的载体，其具有对将多核苷酸连接进载体有用的特征。用一种或多种限制酶处理要插入载体的多核苷酸，以生成线性化的片段，其具有平端，具有5′或3′突出端的“粘性”末端，或上面的任意组合。也可以用限制酶处理多核苷酸，随后用另一种DNA修饰酶处理。这样的DNA修饰酶包括，但不限于，聚合酶、外切核酸酶、磷酸酶或激酶，以生成多核苷酸，其具有对将多核苷酸连接进载体有用的特征。

[0080] 然后，根据本领域已知的方法，将处理的载体和多核苷酸连接到一起，以形成含有多核苷酸的构建体(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))。简而言之，可以在有合适的缓冲液和连接酶存在下，组合处理的核酸片段和处理的载体。然后，在适当的条件下，温育混合物，以允许连接酶将核酸片段连接进载体。

[0081] 本发明还提供了制备本发明的多肽的方法和制备能编码它们的多核苷酸的方法。方法包括生物的、酶促的和化学的方法，以及其组合，且是本领域众所周知的。例如，使用标准的重组DNA技术，可以在宿主细胞中表达多核苷酸，使用无细胞的基于RNA的系统，可以体外地酶促合成它，或使用化学技术，例如固相肽合成，可以合成它。当使用重组DNA技术时，宿主细胞可以是，例如，细菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。

[0082] 本发明也提供了具有启动子活性的多核苷酸。一方面，本发明的启动子包括SEQ ID NO：22所述的核苷酸序列，或其一部分。在另一个方面，本发明的启动子具有如下核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：22具有超过70％的至少单个百分比的同一性，例如与SEQ ID NO：22具有71％、72％、73％的同一性，等等，直到100％的同一性。本文描述了确定百分比同一性的方法。甚至更优选地，启动子具有与SEQ ID NO：22具有至少80％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性的核苷酸序列。本发明的启动子具有雌激素受体(ER)调节的活性。如本文使用的，ER调节的活性指在有ER-α66存在下，优选地，在有能结合雌激素的ER-α66存在下，可操作地连接的编码区的增强表达。本发明的启动子以依赖于和非依赖于雌激素的方式表达。本发明的启动子可以可操作地连接到能编码多肽(包括标记多肽)的编码区。标记多肽的实例包括检测标记(例如，荧光蛋白、酶、抗原标记等)和选择标记(能造成药物抗性、药物易感性或营养缺陷或纠正营养缺陷的多肽等)。

[0083] 抗体

[0084] 本发明提供了能特异性地结合本发明的多肽和肽模仿物的抗体。如本文使用的，“能特异性地结合”多肽的抗体是这样的抗体，其仅仅能与诱导该抗体合成的抗原的表位相互作用，或能与结构上有关的表位相互作用。甚至在有多种潜在结合靶存在下，“能特异性地结合”表位的抗体也能在适当的条件下，与表位相互作用。在有些方面，本发明的抗体能特异性地结合ER-α36或其一部分，且不特异性地结合ER-α66或ER-α46。

[0085] 因此，本发明的多肽和肽模仿物和其片段可以用作抗原，来生产抗体，包括脊椎动物抗体、杂合抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、改变的抗体、单价抗体、单克隆和多克隆抗体、Fab蛋白和单结构域抗体。例如，具有SEQ ID NO：1的多肽或其片段，例如SEQ ID NO：1的氨基酸13-27，可以用于产生能特异性地结合ER-α36的抗体。通过将它们共价连接到免疫原性载体上，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清清蛋白、卵清蛋白、小鼠血清清蛋白、兔血清清蛋白等，可以修饰本发明的多肽或肽模仿物或其片段。

[0086] 如果需要多克隆抗体，则可以用需要的抗原免疫选择的动物(例如，小鼠、兔子、山羊、马或鸟，例如鸡)。根据已知且常规的方法，收集并处理来自免疫的动物的血清。如果含有针对本发明的多肽的多克隆抗体的血清，含有对其它抗原的抗体，则可以通过免疫亲和色谱，纯化多克隆抗体。本领域已知用于生产和加工多克隆抗血清的技术(见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pub.1988))。

[0087] 本领域的技术人员也可以容易地生产针对本发明的多肽或肽模仿物或其片段的单克隆抗体。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的(见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Pub.1988)。通过细胞融合，且也可以通过其它技术，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用EB病毒转染，可以生成无限增殖化的抗体生产性细胞系(杂交瘤)。可以筛选针对本发明的多肽和肽模仿物生产的单克隆抗体组的各种性质，例如表位亲和性。制备抗体的其它众所周知的方法，包括使用噬菌体显示技术(见，例如，Kay等，Phage display of peptides and proteins：A laboratory manual.San Diego：Academic Press(1996))。

[0088] 本发明的抗体可以衍生自“人源化的”单克隆抗体。通过将小鼠互补决定区从小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链转移进人可变结构域，然后取代鼠对应物的构架区的人残基，可以生产人源化的单克隆抗体。使用源自人源化的单克隆抗体的抗体组分，消除了与鼠恒定区的免疫原性有关的潜在问题。描述了用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术(Orlandi等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，86：3833(1989)，且也描述了生产人源化的单克隆抗体的技术(Jones等，Nature，321：522(1986)；Riechmann等，Nature，332：323(1988))。

[0089] 通过常规的已知方法，包括抗体的蛋白水解，或通过能编码该片段的多核苷酸在大肠杆菌中的表达，可以制备本发明的抗体片段。通过常规方法(用例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化完整的抗体，可以得到抗体片段。例如，通过用胃蛋白酶酶促切割抗体，提供称作F(ab’)2的5S片段，可以生产抗体片段。使用硫醇还原剂和任选的由二硫键的切割产生的巯基的封闭剂，可以进一步切割该片段，以生成3.5SFab′单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割，会直接产生2个单价的Fab′片段和1个Fc片段。

[0090] 也可以使用切割抗体的其它方法，例如分离重链，以形成单价的轻-重链片段，进一步切割片段，或其它的酶促的、化学的或遗传技术，只要该片段能结合可由完整的抗体识别的抗原。

[0091] 可以筛选抗体，以确定它们所结合的表位的同一性。表位指抗原(例如本发明的多肽)上的抗体互补位结合的部位。表位通常由分子的化学活性的表面基团例如氨基酸或糖侧链组成，且可以具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。可以用于鉴别表位的方法，是本领域已知的(Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，page319(Cold Spring Harbor Pub.1988)。

[0092] 可以筛选抗体特异性地结合本发明的多肽或肽模仿物的能力。例如，通过使用本领域的常规方法，可以选择能特异性地结合ER-α36同种型或其部分、但是不能结合ER-α46或α66同种型的抗体(见Kitajima等，美国专利号6,534,281，和Harlow等，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Pub.1988)。

[0093] 可以将本发明的抗体偶联到多种化合物上。化合物的实例包括检测标记。这样的检测标记的实例包括荧光标记、酶、放射性同位素等，例如抗生物素蛋白或生物素，其允许检测抗体。本领域已知将抗体偶联到检测标记的方法，和有用的检测标记。这样的抗体可以用于检测ER-α36的自动系统中。抗体可以共价地附着到化疗剂。本领域已知可用于治疗癌症例如乳腺癌和前列腺癌的化疗剂。化疗剂的实例包括苯并二氢吡喃、代马孕酮酯、屈洛西芬、艾多昔芬、他莫昔芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、氟维司群(fulvestrant)和faslodex、二膦酸盐、降钙素、tribolone、甲状旁腺素或雷尼酸锶(strontium ranelate)。其它实例包括细胞因子，或毒素，例如白喉毒素A链。

[0094] 组合物

[0095] 本发明也提供了组合物，其包含本发明的多核苷酸、肽模仿物或抗体。这样的组合物一般包含药学上可接受的载体。如本文使用的“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。也可以将其它活性化合物整合进组合物中。

[0096] 可以将本发明的组合物制备成许多形式，包括片剂、硬或软胶囊、水溶液、悬浮液和脂质体，和其它缓释制剂，例如成形的聚合凝胶。可以配制经口剂型，从而使多肽、肽模仿物或抗体在经过胃后释放进肠中。这样的制剂记载在Hong等，美国专利号6,306,434和其中包含的文献中。

[0097] 经口的液体组合物可以是下述形式：例如，水性的或油性的悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或酏剂，或可以作为干燥产品存在，以在使用前与水或其它合适的载体配制。这样的液体组合物可以含有常规添加剂，例如悬浮剂、乳化剂、非水载体(其可以包括食用油)或防腐剂。

[0098] 组合物可以配制成用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如，快速浓注或连续输注)，且可以以单位剂型存在于安瓿、预装注射器、小体积输注容器或具有添加的防腐剂的多剂量容器中。组合物可以采取下述形式：在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

[0099] 可以将适用于直肠施用的组合物制备成单位剂量栓剂。组合物中可以包含的合适的载体包括盐水溶液示例的那些，和本领域经常使用的其它材料。

[0100] 对于吸入施用，可以从吹入器、喷雾器或加压包或其它方便的送递气溶胶喷雾剂的工具，方便地送递组合物。加压包可以包含合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压的气溶胶的情况下，通过提供阀门来送递计量的量，可以确定剂量单位。

[0101] 或者，对于通过吸入或吹入施用，组合物可以采取干粉组合物的形式，例如，调节剂和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型存在，例如在胶囊或药筒中，或例如，明胶或硬质泡沫塑料衬垫包装，在吸入器或吹入器的辅助下，可以从其中施用粉末。对于鼻内施用，可以通过液体喷雾施用组合物，例如通过塑料瓶喷雾器。

[0102] 可以将组合物配制成用于经皮施用。也可以将组合物配制成水溶液、悬浮液或分散体、水性凝胶、油包水乳剂或水包油乳剂。通过将组合物被囊化在聚合物中，也可以制备经皮制剂。可以将剂型直接应用于皮肽，作为洗剂、乳膏、油膏，或通过使用贴剂。

[0103] 本发明的组合物也可以含有其它成分，例如调味剂、着色剂、抗微生物剂和防腐剂。另外，本发明的组合物可以包含药学活性成分，例如激素、抗坏死剂、血管扩张剂、药物试剂等。

[0104] 通过细胞培养物或实验动物中的标准的药学方法，例如测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗上有效的剂量)，可以确定这样的组合物的毒性和治疗功效。毒性和治疗作用之间的剂量比率，是治疗指数，且其可以表达为比率LD50/ED50。能表现出高治疗指数的化合物是优选的。

[0105] 从细胞培养测定和动物研究得到的数据，可以用于配制一定范围的人用剂量。这样的化合物的剂量，优选地在循环浓度的范围内，其包括具有较少或无毒性的ED50。依赖于采用的剂型和使用的施用途径，剂量可以在该范围内变化。对于在本发明的方法中使用的化合物，可以从细胞培养测定，初步估计治疗上有效的剂量。可以在动物模型中配制剂量，以达到包含IC50的循环血浆浓度范围(即，能达到症状的半数最大抑制的实验化合物的浓度)，如在细胞培养中测定的。这样的信息可以用于更准确地确定在人类中有用的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱。一方面，人用的剂量范围是足以产生至少10微摩尔(μM，优选地至少25μM，更优选地50μM的血清浓度的量。

[0106] 可以每天1次或多次至每周1次或多次施用组合物，包括每隔一天1次。熟练的技术人员能明白，某些因素可能影响有效地治疗受试者所需的剂量和时间选择，包括但不限于疾病或障碍的严重性，以前的治疗，受试者的总体健康和/或年龄，和存在的其它疾病。而且，用有效量的组合物治疗受试者，可以包括单一治疗，或优选地，包括系列治疗。

[0107] 检测方法

[0108] 本发明提供了检测本发明的多肽的方法。该方法一般包括，提供细胞，分析细胞中的本发明的多肽，和确定细胞是否表达该多肽。细胞可以是离体的或体内的。如本文使用的，术语“离体”指已经从受试者的身体取出(例如，分离)的细胞。离体细胞包括，例如，原代细胞(例如，最近已经从受试者取出，且能在组织培养基中进行有限的生长或维持的细胞)和培养的细胞(例如，能在组织培养基中进行长期生长或维持的细胞)。如本文使用的，术语“体内”指在受试者体内的细胞。体内细胞可以是存在于器官或肿瘤中的细胞。细胞优选地是哺乳动物细胞，例如，小鼠、大鼠或灵长类动物(例如，猴子，人)，优选地，人。优选的细胞的实例包括乳房细胞，例如乳腺肿瘤细胞，和前列腺细胞，例如前列腺肿瘤细胞。通过例如，人乳房或前列腺组织的活组织检查，可以从受试者得到细胞。可以使用从几乎所有类型的组织得到的样品。根据本领域已知的方法，可以体外培养对照细胞。不能表达ER-α36kDa雌激素受体并因而可以用作阴性对照的细胞包括HEK293细胞。阳性对照细胞包括，在有血清和BRCA1阴性细胞存在下，可以以低细胞密度生长的细胞。优选地，细胞在有血清存在下以低密度生长。通过例如活组织检查，也可以从组织样品得到对照细胞。

[0109] 一方面，该方法包括，通过使细胞接触本发明的抗体来分析细胞。使用常规的且本领域已知的检测方法，可以测定细胞是否能表达本发明的多肽。免疫测定的实例包括，竞争性的和非竞争性的测定、例如，放射免疫测定、免疫酶测定、免疫荧光测定或酶免疫测定。也可以使用利用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或其它化学发光检测剂的化学发光方法。在本发明的方法中，也可以使用蛋白印迹和色谱测定。用于检测本发明的多肽的本发明的抗体可以偶联检测标记，并从而直接检测，或可以使用第二抗体。当使用允许检测不同细胞区域中的多肽的检测方法时，当多肽主要与质膜和细胞质有关、且少于20％信号与核有关时，一般认为能表达ER-α36的细胞是ER-α36阳性的。

[0110] 在另一个方面，该方法包括，通过扩增多核苷酸，优选地，RNA多核苷酸(例如，mRNA)，以形成扩增的多核苷酸，来分析细胞。优选地，通过聚合酶链反应(PCR)扩增多核苷酸，优选地，通过逆转录酶(RT)PCR。从RNA多核苷酸合成DNA多核苷酸的方法，是本领域已知的和常规的。使从细胞得到的多核苷酸接触引物对，后者能扩增多核苷酸，包括SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25，或其组合。由这样的引物对产生的扩增的多核苷酸的存在，指示着细胞能表达雌激素受体。如本文使用的，术语“引物对”指设计用于侧接要扩增的多核苷酸区域的2个寡核苷酸。一个引物与存在于在要扩增的多核苷酸的一端的有义链上的核苷酸互补，而另一个引物与存在于在要扩增的多核苷酸的另一端的反义链上的核苷酸互补。要扩增的多核苷酸可以称作模板多核苷酸。引物与其互补的多核苷酸的核苷酸可以称作靶序列。引物可以具有至少约15个核苷酸，优选地，至少约20个核苷酸，最优选地，至少约25个核苷酸。通过PCR扩增多核苷酸的条件，依赖于使用的引物的核苷酸序列而变化，且用于确定这样的条件的方法，是本领域常规的。

[0111] 扩增后，可以确定扩增的多核苷酸的存在，例如通过凝胶电泳。通过染色(例如，用溴化乙锭)或用本领域的技术人员已知的合适的标记(包括放射性的和非放射性的标33
记)进行标记，可以显现扩增的多核苷酸。一般的放射性标记包括 P。非放射性的标记包括，例如，配体例如生物素或洋地黄毒苷，以及酶例如磷酸酶或过氧化物酶，或各种化学发光剂(chemiluminescer)例如萤光素，或荧光化合物如荧光素和它的衍生物。

[0112] 任选地，也可以测定ER-α66多肽、ER-α46多肽、ER-β或其组合在细胞中的存在。检测ER-α66、ER-α46、ER-β或其组合的存在的方法包括，使用基于抗体或多核苷酸的检测方法，例如多核苷酸的扩增，来应用免疫检测。当使用允许检测不同细胞区域中的多肽的检测方法时，当多肽主要与细胞核有关，例如超过90％的信号与核有关时，一般认为能表达ER-α66或ER-α46的细胞是ER-α66或ER-α46阳性的。

[0113] 所有乳腺癌中的大约70-80％能表达ER-α66，且称作ER-阳性的乳腺癌。这些肿瘤通常更缓慢地生长，更好地分化，且与更好的总体预后有关(Clark，In：Harris JR，editor.Diseases of the breast，volume 2.Lippincott Williams & Wilkins，38：103-116(2000))。检测本发明的多肽的存在的方法，可以作为诊断标记，用于区分雌激素-阳性的和雌激素-阴性的癌症，优选地，乳腺癌。在本文的实施例中公开的结果强烈表明，由ER-α36介导的雌激素信号传导有助于乳房肿瘤发生，并暗示ER-α36可能参与ER-α66阴性的乳腺癌的肿瘤发生。在本文的实施例中公开的结果也表明，能高度表达本发明的多肽的细胞，比能表达高水平的ER-α66、但是更低水平的ER-α36的细胞，更能耐受低剂量的抗-雌激素药，例如，他莫昔芬。因而，检测本发明的多肽的存在的方法，允许鉴别新的患者类型，即ER-α66-阴性的和ER-α36-阳性的。检测本发明的多肽的存在的方法，也可以用于测定细胞对抗-雌激素药的敏感性，并提供关于例如测定个体的适当的治疗进程的信息。例如，医生可以决定，具有ER-α36-阳性的乳腺肿瘤细胞的受试者，可能需要更高剂量的他莫昔芬，以克服对更低水平的抗性。

[0114] 检测ER-α66、ER-α46、ER-α36、ER-β或其组合的存在，也允许对比雌激素受体的比率。测定2种或更多种雌激素受体的比率，允许预测细胞对抗-雌激素药(例如，他莫昔芬)的敏感性。例如，在本发明的该方面，测定细胞中ER-α36与ER-α46的比率、ER-α36与ER-α66的比率、ER-α36与ER-β的比率或其组合，并与对照细胞中的对应比率进行对比。这样的比率在本文中称作ER-α36比率。在一个实施例中，对照细胞可以是用抗-雌激素药难以治疗的细胞。在另一个实施例中，对照细胞是用抗-雌激素药不难治疗的细胞。如果在实验细胞中测定的上述ER-α36比率与在对照细胞中所述的ER-α36比率相同，则根据对照细胞的状态，分类实验细胞。例如，如果实验细胞中ER-α36与ER-α66的比率与已知能耐他莫昔芬治疗的对照细胞中ER-α36与ER-α66的比率相同，则将实验细胞归入耐他莫昔芬治疗的。但是，如果实验细胞中ER-α36与ER-α66的比率与不能耐他莫昔芬治疗的对照细胞中ER-α36与ER-α66的比率相同，则将实验细胞归入不耐他莫昔芬治疗的。在另一个实例中，将在实验细胞中测定的ER-α36比率与已知能耐他莫昔芬治疗的对照细胞中的对应比率进行对比，并与已知不能耐他莫昔芬治疗的对照细胞中的比率进行对比。然后如上所述，将实验细胞归入耐他莫昔芬治疗的，或不耐他莫昔芬治疗的。已知不耐他莫昔芬治疗的对照细胞的一个实例是MCF7(ATTC保藏登记号HTB-22)。已知耐低剂量他莫昔芬治疗的对照细胞的一个实例是MDA-MB-231。通过对比实验细胞中的ER-α36比率，也可以将已知耐他莫昔芬治疗的乳腺癌细胞用作对照细胞。

[0115] 鉴别能结合本发明的多肽的试剂

[0116] 本发明也提供了鉴别能结合本发明的多肽的试剂的方法。这样的方法也称作筛选测定。该方法包括，组合本发明的多肽和试剂，和测定该试剂是否结合多肽。一般，测定试剂是否结合多肽，包括检测试剂和多肽之间的复合物形成。测定复合物的方法包括，例如，直接检测试剂与多肽的结合，和使用竞争结合测定，检测试剂与多肽的结合。测定可以是无细胞的测定。可以在有或没有雌激素或抗-雌激素药存在下，进行测定。任选地，该方法也包括，测定试剂是否结合ER-α66多肽，例如具有SEQ ID NO：18所述的氨基酸序列的多肽。优选地，试剂不能结合ER-α66多肽。

[0117] 使用本领域已知的组合文库方法中的许多方法的任一种，包括生物学文库，空间上可寻址的平行固相或液相文库，需要解卷积的合成文库方法，“一个珠子一种化合物(one-bead one-compound)”文库方法，和使用亲和色谱选择的合成文库方法，可以得到试剂。生物文库方法包括肽文库，而其它4种方法适用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam，Anticancer Drug Des.12：145(1997))。在本领域可以找到关于合成分子文库的方法的实例(见，例如DeWitt等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909(1993)；Erb等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422(1994)；Zuckermann 等 J.Med.Chem.37：2678(1994)；Cho等 Science 261：1303(1993)；Carrell 等 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059(1994)；Carell 等 Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061(1994)；和 Gal lop 等 J.Med.Chem.37：
1233(1994))。要筛选的潜在试剂的来源包括，例如，细菌和真菌的发酵培养基，和植物和其它增殖体的细胞提取物。

[0118] 化合物文库可以存在于例如溶液中(例如Houghten Bio/Techniques13：412-421(1992))，或珠子上(Lam Nature 354：82-84(1991))，芯片上 (Fodor Nature 364：555-556(1993))，细菌(美国专利号5,223,409)，孢子(美国专利号
5,571,698；5,403,484；和5,223,409)，质粒 (Cull 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
1865-1869(1992))，或噬菌体(Scott等Science 249：386-390(1990)；Devlin Science
249：404-406(1990)；Cwirla 等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382(1990)；和Felici J.Mol.Biol.222：301-310(1991))。

[0119] 通过例如用放射性同位素或酶标记偶联试剂，从而可以通过检测复合物中的标记的化合物，测定试剂与本发明的多肽的结合，来确定试剂结合本发明的多肽的能力。例如，125 35 14 3
可以用 I、S、C或 H直接地或间接地标记试剂，并通过直接计数radioemmission或通过闪烁计数，检测放射性同位素。或者，可以用例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶，酶促地标记试剂，并通过测定适当的底物向产物的转化，检测酶标记。

[0120] 以类似的方式，人们可以测定试剂改变(例如，刺激或抑制)本发明的多肽与多肽的已知配体(例如，本发明的多肽能天然地结合或与其相互作用的分子)的结合的能力。这样的配体的实例是雌激素，以及抗-雌激素药，例如他莫昔芬。在一个优选的方面，通过监控本发明的多肽的活性，可以测定试剂改变本发明的多肽与配体的结合的能力。

[0121] 在另一个方面，本发明的测定包括，使本发明的多肽接触试剂，和测定试剂结合多肽的能力。如上所述，可以直接或间接地测定试剂与多肽的结合。在一个优选的方面，测定包括使本发明的多肽接触配体，已知后者能结合本发明的多肽，以形成测定混合物，并使测定混合物接触试剂，和测定试剂优先结合多肽(与配体相比)的能力。

[0122] 在另一个方面，测定包括，使本发明的多肽接触试剂，和测定试剂改变(例如，刺激或抑制)本发明的多肽的活性的能力。

[0123] 在另一个方面，测定包括，筛选能改变(例如，刺激或抑制)本发明的多肽调节雌激素反应元件的转录反式激活的能力的试剂，所述反式激活包括，例如，由ER-α66的AF-1和/或AF-2结构域介导的活性。优选地，使用融合多肽，其包含本发明的多肽和具有转录活化结构域或转录阻遏结构域的多肽。具有转录活化结构域的多肽的一个实例是VP-16，且具有转录活化结构域或转录阻遏结构域的其它有用多肽是本领域已知的。一般，这样的融合多肽与多核苷酸组合使用，后者具有位于启动子上游的雌激素反应元件，和可操作地连接的编码序列。可以使用许多启动子，包括，例如，胸苷激酶启动子。优选地，可操作地连接的编码区能编码检测标记，例如萤光素酶，或荧光多肽例如绿色荧光蛋白。一方面，在不存在试剂的情况下，在能促进多核苷酸上存在的编码区的表达的条件下，组合具有转录活化结构域的融合多肽、多核苷酸和试剂，并测定试剂改变转录的作用。任选地，ER-α66多肽和/或ERβ多肽也可以存在，且使用该测定来鉴别试剂，后者能改变(例如，刺激或抑制)本发明的多肽调节依赖于配体的和不依赖于配体的ER-α66多肽或ERβ的转录活性的能力。优选地，细胞中存在融合多核苷酸，和包含位于启动子上游的雌激素反应元件和可操作地连接的编码序列的多核苷酸。无意进行限制，预期能改变本发明的多肽调节转录反式激活的能力的试剂，可以包括能改变本发明的多肽的构象的试剂。

[0124] 在测定中，可能需要固定化本发明的多肽，它的配体，或试剂，以促进分离复合的和非复合形式的一种或2种分子，以及实现测定的自动化。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，其能添加结构域，后者允许本发明的多肽结合到基质上。例如，具有谷胱甘肽-S-转移酶的融合多肽可以被吸附到谷胱甘肽琼脂糖珠子(Sigma Chemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽-衍生的微量滴定板上，其再与试剂结合，并在有助于复合物形成的条件下(例如对于盐和pH在生理条件下)，温育混合物。温育后，可以洗涤珠子或微量滴定板孔，以去除任何未结合的组分，并直接或间接地测量复合物形成，例如，如上所述。或者，可以从基质解离复合物，并测定结合水平。

[0125] 在本发明的筛选测定中，也可以使用用于将多肽固定化到基质上的其它技术。例如，使用生物素和链霉抗生物素蛋白的缀合物，可以固定化本发明的多肽。使用本领域众所周知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)，使用生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)，可以生物素化本发明的多肽，和例如，将所述多肽固定化在链霉抗生物素蛋白-涂覆的96-孔平板(Pierce Chemicals)的孔中。或者，可以将能与本发明的多肽反应的抗体衍生到平板的孔中，并通过抗体缀合，将未结合的本发明的多肽捕获进孔中。除了上述的GST-固定化的复合物的那些方法外，检测这样的复合物的方法包括，使用能与特异性地结合本发明的多肽的抗体反应的抗体，免疫检测复合物。

[0126] 本发明也包括通过上述筛选测定鉴别出的新试剂，及其在本文所述的治疗中的用途。

[0127] 治疗方法

[0128] 本发明还涉及治疗受试者中的某些疾病的方法。该受试者是哺乳动物，优选人。如本文使用的，术语“疾病”指显示特征性症状或一组症状的受试者的部分、器官或系统或其组合的正常结构或功能的任何背离或中断。疾病包括依赖于通过类固醇化合物激素受体(例如雌激素受体)的信号传导的癌症。这样的疾病的实例称作雌激素-有关的癌症，且包括乳腺癌和前列腺癌。一般，通过评价与疾病有关的症状，确定受试者是否患有疾病，和受试者是否能对治疗作出响应。如本文使用的，术语“症状”指存在于受试者中的疾病的客观证据。在本文中提及的与疾病有关的症状和这样的症状的评价，是本领域常规的和已知的。依赖于通过类固醇化合物激素受体的信号传导的癌症的症状的实例包括，例如，肿瘤的存在和大小，和生物标记的存在和量。生物标记是存在于受试者中的化合物，一般是多肽，且指示着癌症的进展。生物标记的实例包括，例如，Her-2表达，和细胞周期蛋白D1表达。

[0129] 疾病的治疗可以是预防性的，或者，可以在疾病发展后开始。预防性的治疗，例如在受试者表现出疾病症状之前开始，在本文中称作处于疾病发展的“危险”中的受试者的治疗。处于疾病发展的危险中的受试者的实例，是具有与疾病有关的危险因素(例如遗传标记)的人。能指示受试者具有发展某些癌症(例如乳腺癌或前列腺癌)的素因的遗传标记的实例包括，BRAC1和/或BRAC2基因的改变。在发生本文所述的疾病之前、过程中或之后，可以进行治疗。在发展疾病之后开始的治疗，可能减轻状况之一的症状的严重性，或完全消除症状。

[0130] 在有些方面，该方法一般包括，使细胞接触组合物，后者包含有效量的能抑制本发明的多肽的活性的试剂，例如，使用本文所述的方法鉴别出的试剂。优选地，这样的试剂能结合本发明的多肽。在有些方面，试剂优选地不是抗-雌激素药。如本文使用的，“有效量”是能有效地在细胞中抑制本发明的多肽的活性、减少与疾病有关的症状、或其组合的量。一方面，组合物可以包括有效量的本发明的抗体。优选地，使抗体共价附着于化疗剂，例如，他莫昔芬。组合物可以任选地包含其它化疗剂。使用离体模型和动物模型，可以评价能否预期试剂或抗体(优选地，抗体)在本发明的该方面起作用。这样的模型是本领域已知的，且通常被公认为疾病或治疗人的方法的代表。这样的动物模型的优选实例是裸鼠。例如，可以将乳腺癌细胞接种进切除卵巢的雌性裸鼠的乳房脂垫中，随后形成损害，并通过例如触诊、游标卡尺测量和肿瘤重量进行评价。转基因动物模型也可以得到。例如，用于研究前列腺癌的模型例如TRAMP模型(见，例如，Greenberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：2429-3443(1995))和用于研究乳腺癌的模型例如MMTV-Wnt-1模型(见，例如，Tsukamoto等，Cell，55：619-625(1988))，被普遍公认为人疾病的模型。

[0131] 在另一个方面，使细胞接触包含多核苷酸的组合物，其中多核苷酸会造成能编码本发明的多肽的编码区的转录后沉默。这样的多核苷酸在本文中称作沉默多核苷酸。可以将该沉默多核苷酸作为RNA多核苷酸，或作为包含能编码和表达RNA多核苷酸的DNA多核苷酸的载体，导入细胞中。可以施用超过一种类型的多核苷酸，例如，可以在本文的方法中，组合和使用设计用于沉默相同的mRNA的2种或更多种多核苷酸。或者，可以一起使用2种或更多种多核苷酸，其中每种多核苷酸各自设计用于沉默不同的mRNA。

[0132] 如本文使用的，术语“多核苷酸”指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸、脱氧核苷酸或其组合)的聚合形式，且包括单链分子和双链的双链体。多核苷酸可以从天然来源直接得到，或可以在重组、酶或化学技术的辅助下制备。优选地，分离本发明的多核苷酸。如本文使用的，“靶编码区”和“靶编码序列”指被沉默多核苷酸抑制其表达的编码区。如本文使用的，“靶mRNA”是由靶编码区编码的mRNA。靶编码区的实例是，能编码ER-α36的核苷酸序列(SEQ ID NO：21)、5′侧翼核苷酸序列(SEQ ID NO：20)或3′侧翼核苷酸序列，包括由外显子9编码的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。

[0133] 沉默多核苷酸包括双链RNA(dsRNA)多核苷酸。沉默多核苷酸的序列包括在本文中称作有义链的一条链，其具有16至30个核苷酸，例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。有义链与靶mRNA基本上相同，优选地相同。如本文使用的，术语“相同”指有义链的核苷酸序列具有与靶mRNA的部分相同的核苷酸序列。如本文使用的，术语“基本上相同”指有义链的序列与靶mRNA的序列存在1、2或3个核苷酸、优选地1个核苷酸的差异，且剩余的核苷酸与mRNA的序列相同。有义链的这1、2或3个核苷酸称作非互补的核苷酸。当沉默多核苷酸包含基本上与靶mRNA相同的有义链时，1、2或3个非互补的核苷酸优选地位于有义链的中央。例如，如果有义链是21个核苷酸长，则非互补的核苷酸一般在核苷酸9、10、11或12处，优选核苷酸10或11处。dsRNA多核苷酸的另一条链，在本文中称作反义链，与有义链互补。术语“互补”指2个单链多核苷酸彼此碱基配对的能力，其中一个多核苷酸上的腺嘌呤与第二个多核苷酸上的胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基配对，而一个多核苷酸上的胞嘧啶与第二个多核苷酸上的鸟嘌呤碱基配对。沉默多核苷酸也包括与dsRNA多核苷酸相对应的双链DNA多核苷酸。还包括与本文公开的有义链和反义链相对应的单链RNA多核苷酸和单链DNA多核苷酸。应当理解，通过用尿嘧啶核苷酸替代每个胸苷核苷酸，可以将本文作为DNA序列公开的序列从DNA序列转化成RNA序列。无意进行限制，本发明的多核苷酸会造成靶编码区的转录后沉默。在沉默中使用的多核苷酸的修饰，是本领域已知的，且可以如此修饰沉默多核苷酸。

[0134] 也可以共价附着本发明的dsRNA沉默多核苷酸的有义和反义链，一般通过由核苷酸制成的间隔区实现。这样的多核苷酸在本领域中经常称作短发夹RNA(shRNA)。在有义和反义链的碱基配对后，间隔区区域形成环。组成环的核苷酸的数目可以变化，且已经报道了3至23个核苷酸的环(Sui等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA，99，5515-5520(2002)，和Jacque等，Nature，418，435-438(2002))。

[0135] 沉默多核苷酸能造成靶编码区表达的转录后抑制，也称作沉默。不希望受理论的限制，导入细胞后，沉默多核苷酸会与靶mRNA杂交，并触发细胞的内切核酸酶以切割靶mRNA。结果是，抑制由mRNA编码的多肽的表达。通过例如测量细胞中靶mRNA的量的减少，测量由mRNA编码的多肽的量的减少，或通过测量由mRNA编码的多肽的活性的降低，可以确定是否抑制了靶编码区的表达。沉默多核苷酸可以存在于载体中。沉默多核苷酸也可以作为2个分开的互补的多核苷酸存在于载体中，其中的每一个都可以被表达，以产生dsRNA的有义和反义链，或作为含有有义链、环区和反义链的单个多核苷酸存在于载体中，其可以被表达，以产生具有dsRNA的有义和反义链的RNA多核苷酸。

[0136] 使用本领域常规且已知的方法，可以设计沉默多核苷酸。例如，通过扫描编码区AA二核苷酸序列，可以鉴别沉默多核苷酸；每个AA和mRNA的下游(3’)连续的16至30个核苷酸可以用作候选多核苷酸的有义链。候选多核苷酸是用于测试以确定其能否降低本发明的多肽之一的表达的多核苷酸。候选多核苷酸可以与位于能编码多肽的区域、或位于mRNA的5′或3′非翻译区中的核苷酸相同。任选地且优选地，修饰候选多核苷酸，以包含1、2或3，优选地1个不互补的核苷酸。其它方法是本领域已知的，且常规地用于设计和选择候选多核苷酸。沉默多核苷酸可以，但不必，在有义链的5′端以二核苷酸AA开始。候选多核苷酸也可以包含1、2或3个核苷酸的突出端，一般在有义链、反义链或二者的3′端。一般，使用可公开得到的算法(例如，BLAST)，筛选候选多核苷酸，以对比候选多核苷酸序列和编码序列。基于其它考虑，一般消除可能与非-靶编码区表达的mRNA形成双链体的那些。然后，可以测试剩余的候选多核苷酸，以确定它们是否能抑制本文所述的多肽之一的表达。

[0137] 通常，通过将候选多核苷酸导入能表达本发明的多肽的细胞，单个地测试候选多核苷酸。可以体外地制备候选多核苷酸，然后导入细胞。体外合成的方法包括，例如，用常规的DNA/RNA合成仪进行化学合成。合成多核苷酸和用于这样的合成的试剂的商业供应商是众所周知的。体外合成的方法也包括，例如，使用在无细胞系统中的环状或线状载体的体外转录。

[0138] 通过将能编码候选多核苷酸的构建体导入细胞，也可以制备候选多核苷酸。这样的构建体是本领域已知的，且包括例如，能编码和表达候选多核苷酸的有义链和反义链的载体，和包含能编码候选多核苷酸的有义链和反义链的序列的RNA表达盒，所述序列侧接可操作地连接的调节序列，例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子，其会导致RNA多核苷酸的生产。细胞可以是离体的或体内的。也可以在动物模型中测试候选多核苷酸。

[0139] 当评价候选多核苷酸是否能起抑制本文所述的多肽之一的表达的作用时，可以测量含有候选多核苷酸的细胞中的靶mRNA的量，并与不含有候选多核苷酸的相同类型的细胞相对比。测量细胞中的mRNA水平的方法，是本领域已知的和常规的。这样的方法包括定量RT-PCR。用于扩增mRNA的引物和特定条件，依赖于mRNA而变化，且可以由熟练的技术人员容易地确定。其它方法包括，例如，RNA印迹和阵列分析。

[0140] 用于评价候选多核苷酸是否能起抑制本文所述的多肽之一的表达的作用的其它方法包括监控多肽。例如，可以使用测定来测量由mRNA编码的多肽的量，或测量由mRNA编码的多肽的活性的降低。用于测量多肽量的减少的方法包括，测定存在于含有候选多核苷酸的细胞中的多肽，并与不含有候选多核苷酸的相同类型的细胞相对比。例如，本发明的抗体可以用于例如蛋白免疫印迹、免疫沉淀或免疫组织化学。针对本文所述的多肽中的每一种的抗体都是可商业上得到的。也可以使用能测量本发明的多肽之一的活性降低的方法。

[0141] 试剂盒

[0142] 本发明提供了试剂盒，其含有可以用于本发明的方法中的试剂，所述方法包括，例如，测定细胞是否能表达本发明的多肽。这样的试剂盒可以含有包装材料和本发明的抗体。医学人员也可以将这样的试剂盒用于配制含有本发明的抗体的组合物，例如药物组合物。

[0143] 包装材料能为抗体提供保护环境。例如，包装材料可以使抗体免受污染。另外，包装材料可以将抗体保持在溶液中，以避免变干。可以用作包装材料的合适的材料的实例包括，玻璃、塑料、金属等。可以使这样的材料硅烷化，以避免抗体向包装材料的粘附。

[0144] 在一个实例中，本发明提供了一种试剂盒，其包含包装材料，能特异性结合本发明的多肽的第一抗体，和能特异性结合ER-α66多肽的第二抗体。试剂盒可以任选地包含其它组分，例如缓冲液、反应容器、第二抗体和注射器。实施例

[0145] 实施例1

[0146] 小窝蛋白-1单倍体不足产生正常乳房上皮细胞的ER-α表达的激活和雌激素刺激的转化

[0147] 使用从Harvard Medical School的Dr.Philip Leder的实验室得到的聚腺苷酸(poly-A)捕获逆转录病毒载体(RET)(Ishida等，Nucl.Acid Res.，27：580(1999))，制备了来自正常人乳房上皮MCF10A细胞的细胞克隆的基因-捕获文库。简而言之，该载体使用改进的聚腺苷酸捕获策略，以有效地鉴别功能基因，而无论它们在靶细胞中的表达状态。强剪接受体和有效的多腺苷酸化信号的组合，确保了“捕获的”基因的功能的完全破坏。在RET载体中包含无启动子的GFP cDNA，允许在活细胞中容易地监控捕获的基因的表达模式。使用含有RET载体的逆转录病毒，感染MCF10A细胞。然后，筛选细胞的G418-抗性，以确立基因-捕获的MCF10A细胞文库。通过G418选择3周后，监控在“捕获的”基因的内源性启动5
子控制下的GFP表达，然后选择G418抗性和GFP表达克隆。该文库代表着3x10 独立的感染的克隆，其中RET载体破坏了功能基因的一个等位基因。

[0148] 认为具有肿瘤抑制活性的基因的表达的丧失，会将转化的表型赋予正常的MCF10A细胞。进行软琼脂克隆测定，并鉴别来自获得的无贴壁依赖性生长(转化的表型的一个特征)的基因-捕获的细胞文库的细胞。超过100个来自G418-抗性的细胞文库的阳性菌落(≥30细胞)能在软琼脂中生长，而亲本MCF10A细胞不能。分离20个细胞克隆，扩增，然-8后再在软琼脂中选择3周，该软琼脂含有正常血清+10 M 17b雌二醇(E2)和糊精包被的活性炭吸附的血清，其缺少类固醇激素。分离和扩增能在含有额外的E2的软琼脂中表现处加速生长的4个细胞克隆(ST1、ST3、ST4和ST6)(图3)。

[0149] 使用3′-RACE，其允许捕获未知的位于候选基因的外显子和聚腺苷酸尾巴之间的3′mRNA序列，来克隆潜在的基因，该基因的破坏会导致MCF10A细胞转化。认为MCF10A细胞的转化，是由于正雌激素信号传导。克隆由RACE方法产生的纯化的PCR片段，并测序。使用BLASTN搜索，来自2个克隆(ST1和ST3)的DNA序列相同地匹配位于染色体7上的小窝蛋白-1(Cav-1)外显子-3的序列(GenBank登记号XM048940)。该结果表明，在至少2个克隆中破坏了Cav-1基因的等位基因。除了Cav-1以外，使用相同的技术，鉴别了2个其它的基因。在克隆ST4中破坏的基因是SPRR1B(GenBank登记号NT-004441.5)，即参与角质化细胞膜的结构组织的角质蛋白/小脯氨酸-富集的蛋白家族的成员。来自克隆ST6的另一个基因是推定的新基因(GenBank登记号6599139)，尚不知其功能。

[0150] 在亲本MCF10A细胞中分析Cav-1蛋白水平，以测试Cav-1的表达水平是否在cav-1基因捕获的细胞中降低。分析了上述的4个细胞克隆(ST1、3、4和6)和MCF10A-Ha-ras(被Ha-ras突变体转化的MCF10A细胞)。与亲本MCF10A细胞中的水平相比，Cav-1蛋白水平为所有转化的细胞的约1/2，如蛋白印迹分析所证实的(图4)。该数据与当仅仅cav-1基因的一个功能等位基因在ST1和ST3细胞中有功能时降低的Cav-1表达相一致。这表明，通过“基因捕获”产生的Cav-1单倍体不足，会导致E2刺激的转化。该数据也表明，Cav-1的下调，也参与由ST4和ST6细胞中的其它基因的破坏引起的转化。

[0151] 为了确定Cav-1单倍体不足产生雌激素-刺激的细胞生长和转化的机理，检查上述转化的细胞中ER-α和ER-β的表达水平。发现所有4种转化的细胞克隆都能以可与Ha-ras转化的细胞相当的水平，表达ER-α，而亲本MCF10A细胞和HBL-100细胞(另一种正常的乳房上皮细胞系)，表达不可检测水平的ER-α(图5)。在所有测试的细胞中，ER-β表达没有任何变化(图5)。该数据表明，ER-α表达被激活，且这些转化的细胞中的雌激素信号传导负责软琼脂上的雌激素-刺激的细胞生长。此前已经表明，Ha-ras转化的细胞中的ER-α表达和雌激素信号传导都被激活(Shekhar等，Int.J.Oncol.，13：907(1998)和Shekhar等，Am.J.of Pathl.，152：1129(1998))。该结果表明，Ras/MAPK途径参与调节ER-α表达和正雌激素信号传导。

[0152] 使用磷酸-特异性的抗体，通过检查ERK1/2的磷酸化水平，分析这些转化的细胞中的MAPK途径的激活。发现ERK1/2在所有转化的细胞中都是高度地且组成型地磷酸化的，但是在MCF10A细胞中不是(图6)。

[0153] 总之，这些数据表明，在人乳腺癌发展过程中，Cav-1/Ras/MAPK途径参与ER-α表达的激活，并与雌激素信号传导途径协作，以刺激转化的细胞增殖。

[0154] 实施例2

[0155] 雌激素受体α的一个同种型(ER-α36)的鉴别、克隆、表达和表征

[0156] 在上述工作的过程中，使用来自Research Diagnostic，INC.的大鼠抗-ER-α抗体(克隆H222)，在蛋白印迹分析中连续观察到3个蛋白条带(66-kDa、46-kDa和36-kDa)。H222抗体能识别ER-α的配体-结合结构域。为了排除46-kDa和36-kDa蛋白条带是ER-α66的降解产物的可能性，如以前报道所暗示的(Abbondanza等，Steroids，58：
4(1993))，使用含有8M脲的缓冲液，在培养平板中裂解细胞，并通过蛋白印迹分析进行测试。在Cav-1单倍体不足的细胞ST1和ST3，和MCF7乳腺癌细胞中，能容易地观察到3个不同的条带(图7)。这些结果指示着共有能被抗体H222识别的类似表位的ER-α同种型的存在。

[0157] 通过文献检索，发现已经克隆了ER-α的46-kDa同种型，其能起由ER-α66的AF-1结构域介导的反式激活的显性负抑制剂的功能(Flouriot等，EMBO J.，19：4688(2000))。后续检索鉴别出了来自正常人子宫内膜cDNA文库(RZPD克隆编号：
DKFZp686N23123)的克隆，其含有5.4kb cDNA。该cDNA克隆携带310个氨基酸可读框，其理论上可以生产预测分子量为35.7kDa的蛋白。可读框的cDNA序列与ER-α66基因的外显子26的DNA序列100％匹配。cDNA的5′非翻译区(5′UTR)表现出与ER-α66基因的第一个内含子DNA序列734-907的100％同源性(ER-α66基因的34,233bp第一个内含子的第一个碱基对称作1)。因而，确认ER-α36的转录物是从ER-α66基因的第一个内含子中的以前没有鉴别的启动子开始的。

[0158] 来自ER-α66基因的第一个内含子734-907的小的、非编码的新外显子称作“外显子1’”。然后，将外显子1’直接剪接进ER-α66基因的外显子2，并从ER-α66基因的外显子2延续到外显子6。然后，将外显子6剪接到位于ER-α66基因下游64,141bp的外显子(GeneBank登记号AY425004，见表1)。能编码最后27个氨基酸和4,293bp 3′非翻译区的cDNA序列与来自染色体6q24.2-25.3(GeneBank登记号AL078582)上的克隆RP1-1304的基因组序列的连续序列100％匹配，从而表明该新ER-α同种型的剩余cDNA序列是从位于以前报道的ER-α66基因下游的一个4,374bp外显子转录的。因而，该外显子称作外显子9，以反映超过以前报道的8个外显子的额外的外显子(图8)。通过鉴别剪接接合点处的完美的剪接供体和受体，支持了所有这些剪接事件。蛋白ER-α36可以由位于第二个外显子中的完美的Kozak序列生产，即有于生产ER-α46的相同的起始密码子(Flouriot等，EMBO J.，19：4688(2000))。ER-α36与ER-α66的区别在于，缺少转录活化结构域AF-1和AF-2，但是保留了二聚化、DNA-结合和局部的配体-结合结构域。它也具有额外的、独特的27氨基酸结构域，以替代由ER-α66的外显子7和8编码的最后138个氨基酸(图1)。在这里，ER-α的该新的同种型称作ER-α36。

[0159] 根据生产商所述的方法，使用从人胎盘RNA制备的Marathon ReadycDNA(Clonetech)的PCR，得到能编码ER-α36的可读框。根据DKFZp686N23123的cDNA序列，设计PCR引物对。5′引物是在末端具有EcoRI位点的5′-CGGAATTCCGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3′(SEQ IDNO：23)，且3′引物是在末端具有BamHI位点的5′-CGGGATCCAGAGGCTTTAGACACGAGGAAAC-3′(SEQ ID NO：24)。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶上的电泳，并观察到预期的1.1kb DNA片段(图9)。纯化DNA片段，用EcoRI和BamHI消化，克隆进pBluescript载体(pBS-ER-α36)，并完全测序。序列表现出与cDNA克隆DKFZp686N23123的100％同一性，表明ER-α36是可以从另一种来源克隆的ER-α的天然产生的同种型。图
10显示了由可读框编码的预测的氨基酸序列。

[0160] 使用含有ER-α66、ER-α46和ER-α36的表达载体，在人胚肾293细胞中进行瞬时转染测定，以测试克隆的cDNA是否能生产ER-α36蛋白。将来自这些转染的细胞和MCF7细胞的全细胞提取物进行蛋白印迹分析，其中单克隆抗体H222针对ER-α的配体-结合结构域(Abbondanza等，Steroids，58：4(1993))。在ER-α36载体转染的细胞中，生成了能被H222抗体识别的36kDa蛋白(图11)。该蛋白的大小，和它不能与针对ER-α66的B-结构域的抗体H226反应，以及不能与识别ER-α66的C-末端的抗体HC 20反应，表明ER-α同种型缺少ER-α66的N-末端和C-末端，从而导致缺少AF-1和AF-2结构域的ER-α。

[0161] 在ER-α36蛋白上，进行一系列的计算机搜索。FindMod和SCANPROSITE算法预测了ER-α36中的3个豆蔻酰化位点，表明它可能位于外周膜。这与k-毗邻(PSPORT II)算法相一致，后者预测21.7％、34.8％、17.4％和26％的ER-α36分别位于核、细胞质、线粒体和膜级分中。这与关于ER-α46的预测类似(分别是26.1％、30.4％、17.4％和26.1％)。相反地，73.9％ 8.7％、0.1％和17.3％的ER-α66具有可对比的预测。因而，ER-α66、ER-α46和ER-α36的有差异的区室化，表明每个受体的功能位点和主要作用可能是不同的。

[0162] 还在位于ER-α66基因的第一个内含子中的能编码ER-α36的基因的推定的5′侧翼区上，进行了计算机搜索。发现TATA结合蛋白(TBP)识别序列位于cDNA起始位点的上游，且几个Sp1、NF-κB和Ap1结合位点位于5′侧翼区(图12)。在ER-α36的5′上游区，鉴别出了完美的半雌激素反应元件(ERE)，表明ER-α36能进行E2-介导的转录调节。

[0163] 实施例3

[0164] ER-α36介导膜-启动的雌激素信号传导，并在ER-阴性的乳腺癌中表达[0165] 方法

[0166] 细胞培养，稳定的细胞系的确立，和用E2-BSA-FITC进行膜标记。从位于Detroit，MI的Karmanos Cancer Institute，得到MCF10A细胞，并从ATCC得到人胚肾293细胞和所有乳腺癌细胞。在适当的组织培养基中，在37℃、5％CO2气氛中维持所有细胞。为了5
确立能表达重组ER-α36的稳定的细胞，以1x10 细胞/60-mm皿的密度，铺平板HEK293细胞，24小时后，使用FuGene6转染剂(Roche Molecular Biochemicals)，用由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的ER-α36表达载体转染。通过将来自pBS-ER-α36的ER-α36的
1.1-kbEcoRI-BamHI cDNA片段克隆进哺乳动物表达载体pCB6+的EcoRI和BamHI位点，构建ER-α36表达载体。也将空载体转染进细胞，以用作对照。转染后48小时，重新铺平板细胞，并用500μg/ml G418(Invitrogen)选择2周。扩增得到的未克隆的G418-抗性的细胞群体，以产生用于进一步分析的细胞。为了标记能表达重组ER-α36的稳定细胞的细胞表面，在4℃，用共价附着到E2β-半琥珀酸酯上的1μM异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的BSA(Sigma)，标记细胞15分钟，在新鲜制备的4％多聚甲醛中固定，并用含有DAPI的封固溶液进行封固，以用于显微镜评价。

[0167] 用雌激素和抗雌激素药进行细胞刺激，和MTT测定。处理前，在含有2.5％糊精包被的活性炭吸附的胎牛血清的无酚红培养基中，培养细胞48-72小时，然后用PBS洗涤，并置于新鲜的无酚红的、无血清的含有0.1μg/ml BSA和5μg/ml胰岛素的培养基中12小时。在37℃，在无血清的培养基中刺激休眠细胞不同的时间段。不同的雌激素和抗雌激素药购自Steraloids Inc.。BSA-E2β购自Sigma。

[0168] 对于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯基四唑溴化物(MTT)测定，3
将悬浮细胞加入96-孔培养板的每个孔中，达到1X10 细胞/孔的终浓度，并在37℃，在CO2培养箱中培养24小时。将含有10nME2β、10nM他莫昔芬或4OH-他莫昔芬或7.2nM UO126(Calbiochem)的培养基加入每个孔中48小时。如生产商推荐的，用CellTiter96Aqueous One Solution细胞增殖测定试剂盒(Bio Rad)进行MTT测定。使用微量平板读数器(Promega)来测量在490nm的吸光度。

[0169] 细胞分级分离测定。如Marquez等(Oncogene，20，5420-5430(2001))所述，进行细胞分级分离。

[0170] 蛋白印迹分析，间接免疫荧光和抗体。对于蛋白印迹分析，用RIPA缓冲液破碎细胞，在凝胶装载缓冲液中煮沸，并在10％SDS-PAGE凝胶上分离。电泳后，将蛋白转移到PVDF膜(Millipore)。用各种抗体探测滤器，并用适当的HRP-缀合的第二抗体(Santa Cruz Biotechnology)和ECL试剂Perkin Elmer Life Sciences)显现。

[0171] 针对ERK1/2(K-23)的抗体购自Santa Cruz Biotechnology。用于分析MAP激酶途径的活化的抗体包括磷酸化形式的Mekl和ERK1/2，且购自Cell Signaling Technology。大鼠抗-ER-α抗体(H222)购自Research Diagnostic Inc.。COPB(Y-20)的抗体、mSin3A(AK-11)和5′核苷酸酶(H-300)购自Santa Cruz biotechnology Inc.。D4-GDI(克隆97A1015)购自Upstate Biotechnology。

[0172] 在兔子中，产生了多克隆抗-ER-α36抗体，其针对根据ER-α36独有的ER-α36 C-末端区域的最后15个氨基酸的合成肽抗原(Alpha Diagnostic Inc.)。使用用于产生抗体的合成肽的亲和柱，纯化抗体。还已经在不能表达内源ER-α36的ER-α36表达载体转染的HEK293细胞中，测试了抗体的特异性。免疫荧光测定表明，仅仅在具有ER-α36-表达载体的瞬时转染子中，检测到抗-ER-α36抗体的免疫反应信号，但是在能表达缺少C-末端的突变体ER-α36的转染子中没有检测到，表明ER-α36抗体是高度特异性的。

[0173] DNA转染和萤光素酶测定。对于瞬时转染测定，使亚接种(subseed)在6孔皿中的HEK293细胞，在无酚红、含2.5％无类固醇胎牛血清的培养基中生长至60-70％汇合。洗涤细胞，并用共5μg质粒(2μg报告质粒2X ERE-tk-Luc，以及1.5μg表达载体pSG5，单独的1.5μg pSG hERα66或1.5μg pSG hERβ，或连同1.5μg ER-α36表达载体)和FuGene6试剂(Roche Molecular Biochemicals)瞬时转染。使用含有2个置于胸苷激酶启动子上游的ERE(鸡卵黄原蛋白A2基因的-331至-289序列)的报告质粒(2XERE-tk-Luc，从Katarine Pettersson博士，Karolinska Institute，瑞典得到)。也从Katarine Pettersson博士得到含有ER-α66和β的表达载体。从Zafar Nawaz博士(Creighton University Medical Center，Omaha，Nebraska)得到ER-α46的表达载体。在测定萤光素酶活性之前，用或不用E2(10nM)处理细胞12小时。使用来自Promega的萤光素酶测定试剂盒，进行萤光素酶测定。值对应着超过3个分开的转染实验的平均值±标准差。

[0174] RNA提取和RNA印迹分析。根据生产商的说明，使用Trizol(Invitrogen)分离了总细胞RNA。通过电泳，在1.2％甲酰胺/甲醛凝胶上分离10μg总RNA，并印迹在尼龙膜(Hybond-N，Amersham Pharmacia Biotech)上。使印迹预杂交1小时，并在65℃，在Quick-Hybridization溶液(Amersham Pharmacia Biotech)中杂交2小时。探针包含来自ER-α36独有的ER-α363′非翻译区的410bpcDNA片段，和来自BD Clonetech的β-肌动蛋白DNA探针。用32P dCTP和Rediprime II DNA标记试剂盒(Amersham Biotech)标记DNA探针。使用在-70℃过夜的增感屏，使印迹放射自显影。剥离相同的膜，并用标记的β-肌动蛋白DNA探针重新探测，以证实等量装载。

[0175] 乳腺癌标本和免疫组织化学测定。从中国杭州劭逸夫医院病理科得到石蜡-包埋的人乳腺癌标本。根据生产商的说明，使用UltraSensitive S-P试剂盒(Maixin-Bio，中国)，进行免疫组织化学染色，其中分别使用ER-α66特异性的抗体(LabVision Corporation，美国)和ER-α36特异性的抗体作为第一抗体。

[0176] 结果

[0177] 为了进一步证实ER-α36是ER-α66的天然产生的同种型，对来自正常乳房上皮细胞系MCF10A，和ER-阳性的和-阴性的(即，ER-α66-阳性的和-阴性的)乳腺癌细胞的总RNA进行RNA印迹分析。使用RT-PCR方法，用根据ER-α36独有的ER-α363′非翻译区设计的引物对(5′GCAAAGAAGAGAATCCTGAACTTGCATCCT(SEQ ID NO：26)和5′TTAGTCAGGTATTTAATAACTAGGAATTG(SEQ ID NO：27))，合成DNA探针。RNA印迹分析表明，在ER-阳性的(即，ER-α66-阳性的)乳腺癌细胞MCF7中，鉴别出了估计大小为5.6kb的单个的mRNA，但是在MCF10A细胞中没有(图13)。令人惊奇地，ER-α36也在MDA-MB-231细胞中表达，后者是众所周知的ER-阴性的(即，ER-α66-阴性的)乳腺癌细胞系(图13)。该数据表明，在乳腺癌细胞中，且甚至在缺少ER-α66的乳腺癌细胞中，能表达ER-α36mRNA的预测大小的转录物。

[0178] ER-α36能抑制结合配体的-和未结合配体的-ER-α66和-β的反式激活活性。我们首先测试，缺少AF-1和AF-2结构域的ER-α36是否能保留任何转录活性。使用能表达萤光素酶的报告构建体，其含有2个位于胸苷激酶启动子上游的雌激素反应元件(ERE)(2XERE-tk-Luc)，在HEK293细胞中进行瞬时转染测定。选择HEK293细胞系，是因为以前报道，ER-α66的AF-1和-2能在HEK293细胞中同样较好地起作用(Denger等，Mol.Endocrinol.，15，2064-2077(2001))。如图14所示，我们发现，在有和没有E2β存在下，ER-α36没有表现出内在的转录活性，这与ER-α36缺少转录活化结构域的发现相一致。然后，我们估计了ER-α36在由ER-α66的AF-1和-2结构域介导的转录反式激活活性中的调节功能。在有和没有E2β存在下，ER-α36的共表达，强烈抑制了ER-α66的反式激活活性(图14)，表明ER-α36能抑制由ER-α66的AF-1和-2结构域介导的反式激活活性。而且，ER-α36也能抑制ER-β的依赖于配体的和不依赖于配体的反式激活活性(图14)。

[0179] ER-α36能介导膜-启动的雌激素信号传导途径。以前的报道已经表明，E2β能刺激MAPK/ERK途径的迅速活化(Razandi等，Mol.Endocrinol.，13，307-319(1999)，Watters 等，Endocrinol.，138，4030-4033(1997)，和 Migliaccio 等，EMBO J.，15，1292-1300(1996))。为了确定ER-α36是否参与该信号传导途径，我们在不能表达内源ER-α的HEK293细胞中，确立了能表达外源ER-α36的稳定细胞。用不可透过膜的异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的E2β-BSA(E2β-BSA-FITC)，温育全部ER-α36转染的HEK293细胞。用E2β-BSA-FTIC，牢固地标记ER-α36转染的细胞的细胞表面，且不用E2β-BSA-FITC标记用空载体转染的对照细胞。从用或不用E2β(10nM)处理各种时间长度的休眠细胞，制备细胞裂解物。通过使用依赖于和不依赖于磷酸化状态的抗体的免疫印迹，测量ERK活化。
在5分钟内，在用ER-α36表达载体转染的细胞中，观察到持续约45分钟的ERK1/2的磷酸化的10-倍增加，但是在用空载体转染的对照细胞中没有(图15a和15b)。但是，在这些对照细胞中，血清(20％，10分钟)能激活ERK1/2(图15b)，表明MAPK信号传导途径在这些细胞中没有总体缺陷。而且，在ER-α36转染的细胞中，对E2β响应也能激活Mek1，即能磷酸化和激活ERK1/2的激酶(图15a)。为了进一步证实膜-启动的雌激素信号传导能激活ERK1/2，还用E2β-BSA(不可透过膜的形式的E2β)处理了ER-α36转染的细胞。在E2β-BSA处理的细胞中，也观察到了ERK1/2磷酸化的强烈活化(图15a)。

[0180] ER-36能介导由不同雌激素和抗雌激素药刺激的MAPK信号传导途径的活化。我们还用雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2β)、17α-雌二醇(E2α)、雌三醇(E3)或雌四醇(E4)，处理ER-α36转染的细胞10分钟，并发现除了E1以外的所有这些雌激素都能以非常类似的水平激活ERK1/2磷酸化，表明ER-α36可以以类似的水平识别这些雌激素(图15c)。然后，我们在实验中包含了抗雌激素药，包括他莫昔芬、4OH-他莫昔芬、ICI-182，780，以测试ER-α36介导的雌激素信号传导是否对抗雌激素药敏感。他莫昔芬、4OH-他莫昔芬和纯抗-雌激素药ICI-182，780不能阻断由ER-α36介导的ERK1/2活化。相反地，与单独的E2β介导的作用相比，该作用甚至更强烈(图15c)。当用单独的1μM他莫昔芬(可以钝化ER-α66和β的浓度)处理ER-α36转染的细胞时，观察到了持续超过8小时的强烈的且持久的ERK1/2活化(图15d)。但是，相同浓度的他莫昔芬在用空表达载体转染的对照
293细胞中没有作用。

[0181] ER-α36能介导E2-刺激的细胞增殖。为了进一步确定ER-α36介导的雌激素活化的MAPK途径是否可以导致细胞核中的转录信号传导，我们检查了膜-启动的雌激素信号传导激活转录因子Elk(MAPK/ERK信号传导途径的下游效应物)的能力。我们使用ERK-反应性的GAL-Elk嵌合转录因子，其由融合到人Elk1的ERK-反应性的反式激活结构域上的酵母转录因子GAL4的DNA-结合结构域组成，瞬时转染了能表达ER-α36的293细胞，并在有E2β存在下，测量它对GAL4-结合报告基因的表达的体内活性。报告基因是5X Gal4-LUC，即含有5个Gal4 DNA结合位点的萤光素酶报告质粒。使用细菌β-半乳糖苷酶表达载体来控制转染效率。转染后，将细胞培养物维持在无雌激素的培养基中36小时，然后加入E2β(10nM)12小时。具有标准差的萤光素酶活性代表着超过3个一式两份地进行的实验。ER-α36转染的细胞的雌激素治疗，会诱导Elk/Gal4融合蛋白-介导的报告基因的反式激活的约2倍增加，而E2β对用空载体转染的对照细胞中的Elk/Gal4融合蛋白的转录活性没有作用(图16a)。

[0182] 我们接着研究了ER-α36是否可以介导雌激素-刺激的细胞增殖。通过MTT测定，评价了在有和没有E2β存在下，ER-α36转染的细胞和对照细胞的增殖。E2β处理能刺激ER-α36转染的细胞的增殖，而E2β对用空表达载体转染的对照细胞的生长没有作用(图16b)。包含抗雌激素药，包括他莫昔芬和4OH-他莫昔芬，不能阻断E2β-刺激的细胞生长(图16b)。单独的他莫昔芬或4OH-他莫昔芬，能强烈刺激ER-α36转染的细胞的生长。但是，MAPK途径的特异性的抑制剂UO126，能强烈抑制E2β刺激的细胞的生长。这些数据表明，ER-α36-介导的膜雌激素信号传导能通过MAPK/ERK信号传导途径的活化，刺激细胞生长。数据也表明，抗雌激素药也能通过ER-α36刺激细胞生长。

[0183] ER-α36主要是基于膜的雌激素受体。为了进一步表征ER-α36，我们已经成功地开发了多克隆抗-ER-α36抗体，它针对ER-α36独有的ER-α36C-末端区域的15个氨基酸。使用用于产生抗体的合成肽的亲和柱，纯化抗体。使用该抗体蛋白印迹分析从正常的乳房上皮细胞和确定的乳腺癌细胞系制备的蛋白，证实在一些乳腺癌细胞中有37-kDa分子量的单个蛋白条带，但是在正常的乳房上皮细胞中没有(图17a)。ER-α36在MDA-MB-231、MDA-MB436和HB3396细胞，3个众所周知的ER-α66阴性的乳腺癌细胞系中表达，且也在ER-α66阳性的乳腺癌细胞MCF7中表达，但是在T47D中不表达(图17a)，这与我们的ER-α36在ER-α66阴性的乳腺癌细胞中表达的RNA印迹数据相一致。为了进一步评价ER-α36在ER-α66阴性的乳腺癌细胞中表达的可能性，使用抗-ER-α36特异性的抗体在透化的MDA-MB-231细胞中的间接免疫荧光测定和共聚焦显微镜术，表明ER-α36在ER-α66阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231的质膜、细胞质和核上表达。

[0184] 为了进一步估计细胞中的ER-α36区室化，进行亚细胞分级分离测定，以从ER-α36转染的HEK293细胞分离核、质膜和胞质溶胶。通过免疫检测，从不同的级分鉴别ER-α36。高百分比的ER-α36(约50％)位于质膜上，且低百分比位于胞质溶胶(约40％)和核(约10％)中。为了排除不同级分的交叉污染，用不同的标记蛋白，包括mSin3A(核)、GDP解离抑制剂(胞质溶胶)、5′核苷酸酶(质膜)和β-COP(高尔基体)，通过蛋白印迹分析，检查级分纯度。这些结果证实，在不同的级分中没有污染。该实验证实，ER-α36主要是基于膜的雌激素受体(图17b)。

[0185] ER-α36在ER-α66阴性的乳腺癌标本中表达。为了进一步确定ER-α36与人乳腺癌的关联，我们使用特异性的抗-ER-α36抗体，通过免疫组织化学测定，检查了人乳腺癌标本中的ER-α36表达模式。人乳房组织的原位分析表明乳腺癌中ER-α36的上调。对ER蛋白阳性的细胞被染成褐色，且核被苏木精染成蓝色。在35个检查的乳腺癌标本病例中，其中的21个(60％)是对ER-α36染色阳性的，且其中的21个(60％)是对ER-α66阳性的(表2)。与我们的RNA和蛋白印迹分析相一致，对ER-α66染色阴性的14个中的11个(78％)乳腺癌标本是对ER-α36染色阳性的，表明大部分ER-阴性的(即，ER-α66-阴性的)乳腺癌仍能表达ER-α36。在人导管癌中发现的正常组织切片中的ER-α36的原位染色，表明ER-α36仅仅在内腔上皮细胞中表达，且主要定位于细胞质和质膜。肿瘤切片来自人浸润性导管癌和侵入性导管癌。所有21个ER-α36阳性的标本病例都表现出主要在细胞核以外的ER-α36免疫染色模式，这与ER-α66的主要核染色相反。类似于ER-α66，在临近的正常组织中的一些内腔上皮细胞也是对ER-α36染色阳性的。这些结果证实，类似于ER-α66，ER-α36在2/3检查的人乳腺癌中表达，并表明，ER-α36可能参与ER-α66-阴性的乳腺癌的发展。

[0186]

[0187] 在该研究中，已经鉴别、克隆和表征了ER-α的新变体ER-α36。该ER-α同种型是从ER-α66基因的第一个内含子中的以前未鉴别的启动子开始的转录产物。推定的ER-α36的启动子区含有位于ER-α36cDNA起始位点上游的TATA结合蛋白(TBP)识别序列，和几个Sp1、NF-kB和Ap1结合位点(图12)。我们已经克隆了ER-α36的5′侧翼区，并证实它具有强启动子活性。而且，在ER-αα36的5′侧翼区，鉴别出了完美的半个ERE位点，表明ER-α36进行了ER-介导的转录调节。

[0188] ER-α36蛋白与由ER-α66基因的外显子2-6编码的ER-α66蛋白相同。该同种型没有以前鉴别出的具有反式激活活性的结构域，AF-1和-2。实际上，ER-α36反式激活活性的分析，证实ER-α36缺少内在的转录活性。但是，ER-α36能有效地抑制由结合配体的-和未结合配体的-ER-α66和-β的AF-1和-2结构域介导的反式激活活性，表明ER-α36是基因组雌激素信号传导的有效抑制剂。该发现类似于以前的报道，即缺少AF-1结构域的ER-α46能起抑制ER-α66的AF-1活性的有力竞争剂的功能。

[0189] 能触发迅速的雌激素信号传导的基于质膜的ER的存在，是长期有争议的，这是因为尚未确立该受体的分子同一性。以前，Razandi使用转染测定，报道了ER-α66和-β都可以启动膜雌激素信号传导，尽管其中仅仅非常小的百分比在细胞表面上表达(Razandi等，Mol.Endocrinol.，13，307-319(1999))，表明除了它们在基因组雌激素信号传导中的传统作用以外，这些ER可能参与膜-启动的雌激素信号传导。最近，ER-α的46-kDa同种型定位在细胞表面，且发现它能介导雌激素-刺激的eNOS磷酸化(Li等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA，100，4807-4812(2003))。在这里，我们证实了，另一种ER-α变体ER-α36主要定位在质膜上，并介导由膜-启动的雌激素信号传导诱导的MAPK/ERK途径的激活。而且，由于ER-α36完全缺少内在的反式激活活性，且仅仅起基因组雌激素信号传导的调节剂的作用，所以ER-α36可能主要起基于膜的雌激素受体的作用，以介导膜-启动的雌激素信号传导。以前，已经报道，一些E2β-介导的迅速作用发生在ER-α基因敲除的(aERKO)小鼠的神经元中，且这些作用不能被ICI 182，780阻断(Gu等，Endocrinology，140，660-666(1999))，表明存在超过一种膜-启动的雌激素信号传导途径。我们在这里证实，抗雌激素药不能阻断ER-α36-介导的MAPK/ERK激活，表明ER-α36参与以前描述的抗-雌激素药不敏感的信号传导途径。由于通过小鼠ER-α基因的第一个编码外显子(在产生ER-α36的转录物时跳过的外显子)的插入破坏生成了αERKO小鼠，所以ER-α36的小鼠对应物的生产，可能在这些敲除的小鼠中保持正常。因而，ER-α36可能有助于在这些小鼠中观察到的剩余的雌激素作用。近来，Toran-Allerand等(J.Neuroscience 22，8391-8401(2002))报道了估计分子量为63-65kDa的新的质膜-有关的雌激素受体(ER-X)的存在。ER-X表现出与ER-α36的一些相似性，例如与ER-α66的配体-结合结构域的抗体反应，和对E2α和β同样好地响应。但是，这2种受体的分子同一性期待着ER-X的克隆和测序。

[0190] 我们还已经表明，ER-α36能促进MAPK/ERK途径的膜-启动的激活，该激活会导致雌激素-刺激的细胞增殖。因而，缺少内在的转录活性的ER-α36，足以促进雌激素-刺激的细胞生长，这支持了以前的报道，即ER-α66的转录上无活性的突变体会诱导DNA合成。这些数据一起表明，可能不需要ER的转录活性，来促进雌激素-刺激的细胞生长。令人惊奇地，我们也观察到，在实验阶段(48小时)，抗雌激素药例如他莫昔芬，能强烈激活MAPK/ERK信号传导，并刺激细胞生长。该发现与下述观点很好地符合，即他莫昔芬起雌激素信号传导的激动剂和拮抗剂的作用，并暗示ER-α36也可能参与膜-启动的抗-雌激素药信号传导。

[0191] 众所周知，具有ER-α66阳性表型的乳腺癌细胞(ER-阳性的乳腺癌)是更分化的，且具有比ER-α-阴性的肿瘤更低的转移潜力(McGuire，W.L.Prognostic factors in primary breast cancer.Cancer Surv.5，527-536(1986))。有趣地，ER-α36不仅仅在ER-α66-阳性的乳腺癌亚型中表达，而且在大多数检查的ER-α66阴性的乳腺癌中表达。为确认这些结果，已经报道雌激素信号传导能在MDA-MB-231细胞中诱导PI3K/Akt途径的迅速激活，其不能被雌激素拮抗剂阻断(Tsai等，Cancer Res..61，8390-8392(2001))，这可以解释为通过不依赖于ER的途径的雌激素信号传导。还已经表明，高浓度的他莫昔芬能诱导MDA-MB-231细胞的细胞凋亡(Mandleker 等，Apoptosis 6，469-477(2001))。这些数据有力地表明，ER-α66-阴性的乳腺癌仍然可能保持由膜-启动的信号传导介导的雌激素或抗-雌激素药作用。

[0192] 通过用独特的27氨基酸结构域替代ER-α66的12个螺旋中的最后5个螺旋(螺旋8-12)，其可以改变ER-α36的配体-结合特异性和亲和力，ER-α36也具有独特的配体-结合结构域。实际上，我们发现ER-α36能引起膜-启动的信号传导，这与对E2α和β，E 3和E4的响应一样好。因而，ER-α36似乎具有比ER-α66更广的配体-结合谱，这使得ER-α36成为促有丝分裂的信号传导的潜在地更有效的介质。ER-α36的配体-结合特异性和亲和力的进一步分析，有助于设计对ER-α36特异性的抗雌激素药，所述药可以用于治疗ER-α阴性的(即，ER-α66-阴性的)乳腺癌。

[0193] 实施例4

[0194] E2β能促进ER-α66阴性的MDA-MB-231细胞在软琼脂中的生长

[0195] 为了确定在有和没有组合的或分开的E2β和他莫昔芬存在下，在软琼脂中的无贴壁依赖性的生长，将500MDA-MB-231细胞悬浮在3ml 3.5％(wt/vol)琼脂中，后者含有无酚红的添加了10％无E2的胎牛血清的DMEM/F12培养基。然后，将细胞覆盖到5个复制的60mm皿中的0.7％(wt/vol)琼脂上，后者含有无酚红的添加了10％无E2的胎牛血清的DMEM/F12培养基。给软琼脂上的细胞覆盖添加了10％无E2的胎牛血清的培养基，其含有或没有1nM E2β，或与1nM他莫昔芬相组合。3周后，使用倒置显微镜，给菌落打分。如图18所示，我们发现，E2处理能强烈促进ER-α66阴性的MDA-MB-231细胞在软琼脂中的无贴壁依赖性的生长，而抗-雌激素药他莫昔芬会抑制E2β的作用，表明ER-α66阴性的MDA-MB-231细胞能保持对雌激素信号传导的响应性，推测是通过ER-α36。

[0196] 实施例5

[0197] E2β能诱导ER-α66阴性的MDA-MB-231细胞中的膜-启动的雌激素信号传导[0198] 为了确定E2β是否能诱导ER-α66阴性的MDA-MB-231中的膜-启动的雌激素信号传导，用1nM E2β处理血清饥饿的MDA-MB-231细胞不同的时间段。对于蛋白印迹分析，用RIPA缓冲液破坏细胞，在凝胶装载缓冲液中煮沸，并在10％SDS-PAGE凝胶上分离。电泳后，将蛋白转移到PVDF膜(Millipore)。用针对ERK1/2(K-23)的抗体(Santa Cruz Biotechnology)，或针对磷酸化形式的ERK1/2使用的抗体(Cell Signaling Technology)，探测滤器。如图19所示，用雌二醇-17β(E2β)处理MDA-MB-231细胞，会诱导ERK1/2的快速磷酸化。这些数据有力地提示，E2β能刺激ER-α66阴性的MDA-MB-231细胞中的MAPK途径的激活。

[0199] 所有出版物、专利和专利申请，都在本文中引作参考。尽管已经参照其中的某些优选的实施方案，描述了本发明的前面的说明书，且已经阐述了许多细节用于解释目的，但本领域的技术人员能够明白，其它实施方案也能实现本发明，且可以明显改变本文所述的某些细节，而不脱离本发明的基本原理。

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