lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记
物中的应用
技术领域
[0001] 本
发明属于
肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记物中的应用。
背景技术
[0002] 卵巢癌是一种常见的女性
恶性肿瘤，其发病死亡率超过了
宫颈癌和子宫内膜癌。但由于卵巢癌的早期症状不明显且较难检测，大多数患者在被发现时卵巢肿瘤分期已在III期或III期之后，即使经过长时间的化疗和手术，其五年生存率依然较低，因此开发一种特异性和灵敏性较好的癌症标记物对卵巢肿瘤的发现具有非常重要的指导意义。
[0003] 目前在许多癌症中lncRNAs(long non-coding RNAs，长链非编码RNA)的研究成为热点，最初发现，在很多癌症的发生发展中lncRNAs会出现异常表达：有些lncRNAs的表达如同被解除了控制一样大量表达，而有些lncRNAs的表达像是被抑制了一样表达量下调。该发现预示着lncRNAs可能是肿瘤发生发展过程中的参与者，之后许多的实验结果也表明了lncRNAs具有促进或抑制肿瘤发展和进展的能
力。基于lncRNAs在调控基因表达方面的作用，以及lncRNAs极有可能参与了肿瘤发生，lncRNAs被认为可能是一种有前途的基于组织或血液的癌症生物标志物，在此
基础上将开发出
癌症治疗的新方式。
[0004] 如
申请号为CN201710657458.8的中国发明
专利申请公开了一种长链非编码RNA SMAD5-AS1的siRNA在卵巢癌治疗中的应用，该申请发现SMAD5-AS1在卵巢癌患者的癌组织中的表达
水平显著上调，进而开发了能够抑制SKOV3细胞中SMAD5-AS1表达从而抑制卵巢癌细胞进展的siRNA。
[0005] 癌症的发生和发展机制目前尚不十分明确，癌症的治疗方法也有待进一步开发，而发现更多的癌症生物标记物能够为
癌症治疗提供更多的途径。
发明内容
[0006] 本申请的发明目的是提供一种lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记物中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
[0008] 一种lncRNA UCA1在作为卵巢癌诊断或预后效果检验的生物标记物中的应用，所述的lncRNA UCA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0009] 或者，所述的lncRNA UCA1的核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性。
[0010] 本申请研究发现，lncRNA UCA1在卵巢癌组织和癌旁组织内的表达水平具有显著的差异性，同时，运用RPIseq在线计算lncRNA UCA1与卵巢癌相关蛋白(p53、ER、FGFR-1和BRCA1等)之间潜在的相互作用时，发现lncRNA UCA1与各卵巢癌相关蛋白之间的相关分数都超过0.5，且SVM预测分数均在0.95左右，表明lncRNA UCA1与卵巢癌相关蛋白之间极有可能存在相互作用，并通过调节卵巢癌相关蛋白的表达而影响卵巢癌的进展，因此lncRNA UCA1能够作为诊断卵巢癌的生物标记物，辅助医生对患者是否罹患卵巢癌或卵巢癌分期进行判断；同时也能够作为卵巢癌治疗后预后效果检验的生物标记物，辅助医生对采取治疗手段后卵巢癌的进展进行检验，检验相关治疗手段的预后效果，从而为卵巢癌的治疗提供了新思路和新途径；lncRNA UCA1与其他临床指标结合，能够为卵巢癌的诊断、预后提供准确可信的检验结果。
[0011] 一种lncRNA UCA1在作为卵巢癌预后效果检验的生物标记物中的应用，所述的lncRNA UCA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0012] 所述的lncRNA UCA1的核苷酸序列与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性。
[0013] 预后效果检验本申请还提供了一种用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR引物，该PCR引物包括：
[0014] UCA1上游引物：5’-TCAATCAACCCTGTGACATTCTTCTCCTG-3’；
[0015] UCA1下游引物：5’-GGAAGATTTCTTTTCTGTCACCTTTTCACATAT-3’。
[0016] 本申请还提供了一种用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR
试剂盒，该PCR试剂盒中含有如
权利要求5所述的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR引物，以及用于检测内参基因表达水平的PCR引物。
[0017] 在上述的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR试剂盒中，所述的内参基因为GAPDH基因，所述的用于检测内参基因表达水平的PCR引物包括：
[0018] GAPDH上游引物：5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’；
[0019] GAPDH下游引物：5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。
[0020] 在上述的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR试剂盒中，lncRNA UCA1的实时
荧光定量PCR反应体系包括：5μL的qPCR反应混合物，0.5μL的UCA1上游引物、0.5μL的UCA1下游引物、0.5μL的GAPDH上游引物、0.5μL的GAPDH下游引物、1μL的cDNA，RNase free ddH2O补足至10μL。
[0021] 在上述的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR试剂盒中，lncRNA UCA1的实时荧光定量PCR反应程序为：
[0022] 阶段①：95℃，5min；
[0023] 阶段②：40个循环反应：95℃，10s，60℃，30s；
[0024] 阶段③：95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。
[0025] 上述的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR试剂盒中还含有用于将提取的总RNA逆转录为cDNA的逆转录体系，所述的逆转录体系包括M-MLV(H-)反转录酶、5×RT M-MLV缓冲液，dNTP混合物，浓度为2μM的UCA1下游引物和浓度为40U/μL的RNase
抑制剂；
[0026] 逆转录反应体系包括：2.5μL的总RNA、0.5μL的UCA1下游引物、3μL的5×RT M-MLV缓冲液、0.25μL的dNTP混合物、0.5μL的M-MLV(H-)反转录酶、0.25μL的RNase抑制剂，[0027] 所述的M-MLV(H-)反转录酶配制成浓度为200U/μL的酶溶液后使用。
[0028] 本申请的PCR试剂盒的价值在于通过提取患者组织样品的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，再利用简单的DNA染料法检测卵巢癌相关基因UCA1的表达水平，通过该表达水平的差异程度结合各种临床病理指标，可以更好的了解患卵巢癌的
风险或预后的效果。因此该试剂盒投入生产实践，对辨别卵巢癌及临床辅助检测具有重要的作用，如果能及时地诊断出卵巢癌，患者就有早期治愈的机会，在临床上来说也是一次革命性的突破。
[0029] 与
现有技术相比，本申请的有益效果体现在：
[0030] (1)本申请研究发现，lncRNA UCA1在卵巢癌组织和癌旁组织内的表达水平具有显著的差异性，同时，运用RPIseq在线计算lncRNA UCA1与卵巢癌相关蛋白(p53、ER、FGFR-1和BRCA1等)之间潜在的相互作用时，发现lncRNA UCA1与各卵巢癌相关蛋白之间的相关分数都超过0.5，且SVM预测分数均在0.95左右，表明lncRNA UCA1与卵巢癌相关蛋白之间极有可能存在相互作用，并通过调节卵巢癌相关蛋白的表达而影响卵巢癌的进展，因此lncRNA UCA1能够作为诊断卵巢癌的生物标记物，辅助医生对患者是否罹患卵巢癌或卵巢癌分期进行判断；同时也能够作为卵巢癌治疗后预后效果检验的生物标记物，辅助医生对采取治疗手段后卵巢癌的进展，检验相关治疗手段对卵巢癌预后效果，从而为卵巢癌的治疗提供了新思路和新途径；lncRNA UCA1与其他临床指标结合，能够为卵巢癌的诊断、预后提供准确可信的检验结果。
[0031] (2)本申请提供的用于检测lncRNA UCA1表达水平的PCR引物和PCR试剂盒具有灵敏度高、成本低、检测过程简易等特点。(3)本申请的PCR试剂盒通过提取患者组织样品的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，再利用简单的DNA染料法检测卵巢癌相关基因UCA1的表达水平，通过该表达水平的差异程度结合各种临床病理指标，可以更好的了解患卵巢癌的风险或预后的效果。因此该试剂盒投入生产实践，对辨别卵巢癌及临床辅助检测具有重要的作用，如果能及时地诊断出卵巢癌，患者就有早期治愈的机会，在临床上来说也是一次革命性的突破。
附图说明
[0032] 图1为在TCGA
数据库对606例卵巢癌病例进行差异表达lncRNA筛选的结果；
[0033] 其中，Genetic Alteration表示“遗传学异常”，指具有遗传学变化的lncRNA；Amplification表示“基因扩增”，指该组织样本中相应的lncRNA出现异常表达，mRNA Upregulaion表示“mRNA表达上调”，指该组织样本中总mRNA出现异常表达，No alterations表示“无变化”，指该组织样本中相应的lncRNA没有出现异常表达，Not profiled表示无测试；“*％”表示相应的lncRNA出现异常表达的组织样本占总样本的比例；
[0034] 图2为对lncRNA UCA1与卵巢癌相关蛋白的相互作用进行预测的结果；
[0035] 其中，score表示“分数”，RF表示Random forest classifier
算法，SVM表示Support Vector Machine算法；
[0036] 图3为结合GEO数据库芯片测序结果检测得的lncRNA UCA1在卵巢癌组织和癌旁组织的表达情况；
[0037] 其中，UCA1expression value(log2RMA signal intensity)表示lncRNA UCA1在癌组织与正常组织中表达的差异倍数，Normal表示正常组织，Cancer表示卵巢癌组织，P＜0.01表示lncRNA UCA1在卵巢癌组织和正常组织中存在显著的表达差异。
具体实施方式
[0038] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0039]
实施例1卵巢癌中lncRNA生物标记物的筛选与确定
[0040] 使用TCGA数据库、HGNC数据库、GEO数据库和qRT-PCR技术进行筛选目标lncRNA：
[0041] (1)在HGNC数据库下载所有approved symbol的lncRNA，共2773条；
[0042] (2)在TCGA数据库
网站对所有的lncRNA进行筛选，选择卵巢肿瘤的基因表达图谱mRNA Expression z-Scores(RNA Seq V2RSEM)，将生成的结果进行排序，选择其中卵巢肿瘤遗传学具有变化率的几条lncRNAs，分别是：UCA1(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，FBXO43和LINC01192(如图1所示)。
[0043] (3)将TCGA数据库初步筛选的结果与GEO数据库卵巢癌芯片测序结果进行比对，去掉一些不具有很明显差异表达的结果，最终确定目标lncRNA UCA1。
[0044] (3)在医院中采集卵巢癌组织和癌旁组织，使用RNA试剂盒提取其总RNA，并使用Nanodrop 2000检测RNA的含量与
质量，统一稀释到100ng/ul，计算反转录所需的体积。
[0045] (4)将提取的RNA反转录为cDNA，反转录反应体系如表1：
[0046] 表1反转录反应体系
[0047]
[0048] (5)在新的200μL光学PCR八联管中进行RT-q PCR，每个样品进行三个复孔重复，RT-q PCR体系如表2：
[0049] 表2 RT-q PCR体系
[0050]
[0051] 将RT-q PCR体系混匀后短暂离心数秒，再置于ABI Prism 7500中进行RT-qPCR反应，反应条件如表3：
[0052] 表3 RT-qPCR反应程序
[0053]
[0054] (6)数据的处理与分析
[0055] 荧光定量PCR定量检测lncRNA的相对表达变化量时，以GAPDH为内参基因，来对目标lncRNA进行归一化处理，以确保在相等的数量的样本中比较目标基因的表达量。表达量倍数的变化的公式为：
[0056] RQ＝2-△△Ct，△△Ct＝(CtlncRNA-CtGAPDH)BC-(CtlncRNA-CtGAPDH)BA，[0057] 其中RQ代表相对表达量(Relative Quantitation)，CtlncRNA和CtGAPDH分别代表荧光定量检测到的目标lncRNA和内参基因GAPDH的Ct值，BC代表卵巢癌组织(Ovarian Cancer tissue)，BA代表与肿瘤组织对应的癌旁组织样本(Ovarian cancer Adjacent tissue)。
[0058] 定量中设置三次重复实验和阴性对照实验：定量样本中每个样本重复3次，阴性对照中不加入样本模板cDNA，而是用水代替，用于检测是否存在PCR污染或者较高的引物二聚体污染。
[0059] 采用SPSS17.0统计学分析
软件对荧光定量PCR得出的数据进行统计学分析，lncRNA UCA1在两个组织样本(卵巢癌组织和癌旁组织)中的相对表达量分析采用levene’s卡方检验和independent-sample t检验，当P值＜0.05时，认为结果在统计学上具有显著性差异。当P值＜0.01时，认为结果在统计学上具有极显著性差异(如图2所示)。
[0060] 实验数据表明，在卵巢癌组织和癌旁组织中lncRNA UCA1表达存在显著差异，可初步作为卵巢癌生物标记物。
[0061] 实施例2
[0062] 运用RPIseq在线计算lncRNA UCA1与卵巢癌相关的
蛋白质(p53、ER、FGFR-1和BRCA1蛋白)潜在的相互作用。
[0063] 在RPIseq计算相互作用的算法中采用了两种不同的计算方法，一种是RPIseq-SVM，即Support Vector Machine；另一种是RPIseq-RF，即Random forest classifier。利用这两种算法所得出的结果(如图3所示)可以看出，lncRNA UCA1与各癌症相关蛋白的分数都超过0.5，且SVM预测分数在0.95左右，这说明UCA1与p53、ER、FGFR-1和BRCA1蛋白有很大的可能存在相互作用，并可能通过调节卵巢癌相关蛋白的表达而影响卵巢癌的进展。
[0064] 实施例3用于检测lncRNA UCA1表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒
[0065] 一种用于检测lncRNA UCA1表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒，包括：
[0066] (1)逆转录体系：M-MLV(H-)反转录酶(200U/μL)以及逆转录体系缓冲液5×RT缓冲液，dNTP混合物(10nm each)，gene specific Primers(2μM)，RNase抑制剂(40U/μL)；其中，gene specific Primers(基因特异性引物)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0067] (2)PCR扩增体系：qPCR反应混合物(High ROX)、UCA1上游扩增引物(如SEQ ID No.2)、UCA1下游扩增引物(如SEQ ID No.3)，GAPDH上游扩增引物(如SEQ ID No.4)，GAPDH下游扩增引物(如SEQ ID No.5)。
[0068] (3)RNase free ddH2O。
[0069] 其中，逆转录体系用于将提取的RNA逆转录为cDNA，逆转录反应体系同表1。而PCR扩增体系的反应体系如表4：
[0070] 表4用于检测lncRNA UCA1表达水平的实时荧光定量PCR试剂盒的PCR扩增体系[0071]
[0072] 将PCR扩增体系的各试剂混匀后简短离心，进行上机操作，反应参数设置为：
[0073] 阶段①：95℃，5min；
[0074] 阶段②：40个循环反应：95℃，10s，60℃，30s；
[0075] 阶段③：95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。
