宫颈癌标志物EBP50及其应用
阅读：1003发布：2020-08-12
专利汇可以提供宫颈癌标志物EBP50及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及分子 生物 学和 肿瘤 医学领域，涉及一种新型特异的 宫颈 癌 标志物EBP50在 宫颈癌 预后 以及 分子靶向 治疗 中的应用。本发明采用生物信息学联合生物学实验的方法分析发现EBP50在宫颈癌组织中显著低表达，并具有抑制肿瘤 细胞增殖 和周期的能 力 。EGFR通路对于宫颈癌治疗具有重要意义，且EBP50能和EGFR相互作用。我们还发现EBP50能抑制EGFR/ERK通路的激活，在宫颈癌中发挥抑癌基因的作用。最后通过预后分析，明确EBP50可作为一种新型特异的宫颈癌标志物，为宫颈癌发病机制的研究和预测宫颈癌病人的预后提供新思路，也为宫颈癌的治疗提供新的靶点。，下面是宫颈癌标志物EBP50及其应用专利的具体信息内容。
宫颈癌标志物EBP50及其应用
技术领域
背景技术
[0002]宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤。2012年全球新发宫颈癌528 000例，死亡266 000例，其中85％宫颈癌发生于发展中国家。我国是宫颈癌第二高发国家，每年新发病例约13.15万，占全球新发病例的28.7％，死亡人数占全球死亡病例的三分之一，并呈年轻化趋势。可见宫颈癌已严重威胁到我国妇女的身体健康。目前在国内部分地区施行的早期宫颈筛查有助于及时发现宫颈病变而开展治疗，阻断宫颈病变向宫颈癌的恶性转化。但对于偏远贫困地区，早期筛查工作并不能完全覆盖，而患者一旦确诊往往已处于宫颈癌中晚期阶段，并且治疗效果较差。
[0003]相较于其他恶性肿瘤而言，宫颈癌通过早期筛查，如TCT(Thinprepcytologic test，新柏氏液基细胞学技术)细胞学检测、HPV检测、阴道镜检查以及宫颈组织病理学检查等方法可发现宫颈病变。在我国预防及医疗条件较差的地区，患者就诊时多已经发现宫颈细胞癌变，在宫颈癌症状出现三个月后才就诊的患者中约有三分之二已发展为癌症晚期。宫颈癌的手术切除治疗常常由于肿瘤的转移而不能彻底切除肿瘤组织，使得临床治疗比较困难，术后也常常复发(浸润性宫颈癌5年生存率仅为20％-50％、术后复发率约35％)；放射治疗又因肿瘤转移而必须扩大照射范围，相应地增加了对正常机体的损伤，影响预后。所以，有效地预测宫颈癌的预后及寻找新型肿瘤分子靶向药物作为主要治疗手段显得尤为重要。
[0004]发展新型宫颈癌标志物作为预后指标与新型治疗靶点一直是宫颈癌研究的热点。
宫颈癌的手术切除治疗常常由于肿瘤的转移而不能彻底切除肿瘤组织，使得临床治疗比较困难，术后也常常复发(浸润性宫颈癌5年生存率仅为20％-50％、术后复发率约35％)。
因此，预测宫预后并进行相应的辅助治疗是宫颈癌研究急需解决的的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤预测预后和辅助治疗的前提。因此对于找出更好的宫颈癌预后分子标志物，也为宫颈癌的分子靶向治疗提供了重要的理论依据。
宫颈癌的手术切除治疗常常由于肿瘤的转移而不能彻底切除肿瘤组织，使得临床治疗比较困难，术后也常常复发(浸润性宫颈癌5年生存率仅为20％-50％、术后复发率约35％)。
因此，预测宫预后并进行相应的辅助治疗是宫颈癌研究急需解决的的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤预测预后和辅助治疗的前提。因此对于找出更好的宫颈癌预后分子标志物，也为宫颈癌的分子靶向治疗提供了重要的理论依据。
[0005]迄今为止，尚未见有效地预测宫颈癌预后的可供临床应用的分子标志物。以EBP50作为标志物用于宫颈癌检测的试剂和方法，都将为深入研究和大规模验证EBP50与宫颈癌的相关性，对宫颈癌预测预后情况及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要的临床意义。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供EBP50的新用途。本发明提供了EBP50作为宫颈癌预后分子标志物的用途，以及以EBP50为靶标筛选辅助治疗宫颈癌药物的应用，为宫颈癌预后和治疗提供参考依据。
[0007]本发明提供了EBP50作为宫颈癌标志物的用途，主要针对宫颈癌。
[0008]分析比较宫颈癌组织样本与正常对照样本中EBP50的表达量。
[0009]本发明的部分实验结果用基因富集分析(Gene set enrichment analysis，GSEA)研究EBP50在宫颈癌病人中发挥的生物学功能，执行1000次的置换检验，计算FDR值，FDR<0.05认为具有显著统计学意义。
[0010]采用Pull down和Co-IP验证EBP50突变体DD与EGFR相互作用能力。
[0011]采用western blot检测EGFR和ERK磷酸化的情况，发现EBP50在宫颈癌HeLa细胞中明显抑制EGFR及下游的ERK的磷酸化水平。实验结果与生物信息学结果一致，表明EBP50能够调节EGFR/ERK信号通路。从另一个角度说明，本发明中EBP50可以作为筛选宫颈癌药物的新靶点。
[0013]图1是宫颈癌组织中EBP50蛋白表达下调并促进细胞增殖和周期图
图2是宫颈癌中EBP50表达与EGFR-ERK通路活性负相关图
图3是EBP50突变体DD削弱了与EGFR结合能力图
图4是EBP50突变体DD削弱对EGFR-ERK通路抑制能力图
图5是EBP50表达可以预测宫颈癌病人预后图
具体实施方法
实施例一：分析宫颈癌组织和正常组织中EBP50蛋白的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
下载The human protein atlas数据库中宫颈癌组织和正常组织的IHC结果
2.方法
用Image Pro Plus 6软件统计免疫组化结果的IOD值，然后通过SPSS对肿瘤组和正常组进行统计学分析。
(二)结果
11例宫颈癌及3例正常组织的标本，通过免疫组化染色观察标本EBP50蛋白的表达情况，如图1A所示，正常组织中均可见EBP50蛋白呈阳性表达，而宫颈癌组织中EBP50蛋白染色接近阴性(图1A)。
实施例二：分析宫颈癌组织和正常组织中EBP50蛋白的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果，以及Molecular Signatures Database中两个gene set(GO:0042127 and GO:0045787)
2.方法
将TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果按EBP50表达量分为EBP50高表达组和低表达组，然后用GSEA软件分析细胞增殖基因集(GO:0042127)和细胞周期基因集(GO:
0045787)中基因表达的富集情况。
(二)结果
细胞增殖基因集和细胞周期基因集中的基因显著富集在宫颈癌中EBP50低表达组(图
1B-C)，表明EBP50可以显著抑制宫颈癌细胞的增殖和周期。
实施例三：分析宫颈癌中EBP50表达对EGFR/ERK信号通路的影响
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果和RPPA的蛋白芯片的结果实验所用细胞系为本实验室构建的稳定敲低EBP50的宫颈癌HeLa细胞系和HeLa细胞系SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗EBP50抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：
1000)和GAPDH抗体(abcam，1：1000)
TBST
二抗(1：10000)
EGF
2.方法
将TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果按EBP50表达量分为EBP50高表达组和低表达组，然后用GSEA软件分析细胞增殖基因集(GO:0042127)和细胞周期基因集(GO:
0045787)中基因表达的富集情况。
接种细胞：在每个6孔板边缘标记实验分组及日期，每孔加入相应处理的稀释好的细胞悬液2ml，即细胞数为15万个/孔。将6孔板放入培养箱(在37℃，5％CO2的条件下)培养中继续培养。第二天血清饥饿24小时后用EGF刺激5分钟，收取细胞。
取细胞裂解液进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗EBP50抗体、pERK抗体、ERK抗体和GAPDH抗体分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用二抗(1：10000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，曝光。
(二)结果
EGFR通路激活下调的基因集显著富集在宫颈癌中EBP50高表达组(图2A)，表明EBP50可以显著抑制宫颈癌中的EGFR信号通路。Pearson相关性和回归分析表明，EBP50的表达水平和c-RAF的磷酸化蛋白表达水平显著负相关(图2B)，提示EBP50确实抑制了EGFR下游信号分子的活性。GSEA分析结果显示，ERK通路基因集显著富集在宫颈癌中EBP50低表达组(图2C)，进一步说明EBP50能抑制EGFR介导的下游ERK通路的激活。Western Blotting结果显示，稳定敲低了EBP50的HeLa细胞在EGF刺激5分钟时ERK的磷酸化水平显著升高，表明EBP50可以抑制EGFR介导的ERK信号通路(图2D)。
实施例四：验证EBP50突变体与EGFR的相互作用能力
(一)材料和方法
1.材料
pBK-CMV-HA-EBP50和pBK-CMV-HA-EBP50 mutant(S279D/S301D，DD)质粒
Lip2000
GST融合蛋白
考马斯亮蓝
Ponceau S染料
HA beads
实验所用细胞系为HeLa和COS7细胞系
一抗HA抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)和GST抗体(abcam，1：1000)TBST
二抗(1：10000)
2.方法
HeLa或COS-7细胞瞬时转染后每个培养皿用1ml细胞裂解液收集至1.5ml离心管中，4℃旋转孵育40-60min；4℃、13000rpm离心15min，取上清至新的离心管中，留取少量用作免疫印迹对照；在剩余样品中加入30μl HA beads，4℃旋转孵育3h；洗涤缓冲液漂洗后加入适量蛋白上样缓冲液，95℃加热5min，离心吸取上清，得到免疫印迹分析样品；将样品进行免疫印迹分析。
(二)结果
GST-Pull down和Co-IP实验都表明EBP50突变体DD与EGFR的相互作用减弱(图3)。
实施例五：Western Blotting检测EBP50突变体对EGFR/ERK信号通路的影响(一)材料和方法
1.材料
Lip2000
实验所用细胞系为HeLa细胞系
SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗pEGFR抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：
1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：1000)、一抗HA抗体(CST，1：1000)和GAPDH抗体(abcam，1：
1000)
TBST
二抗(1：10000)
EGF
2.方法
取细胞裂解液进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗pEGFR抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：1000)、一抗HA抗体(CST，1：1000)和GAPDH抗体(abcam，1：1000)分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用二抗(1：10000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，曝光。
(二)结果
与EGFR相互作用能力减弱的EBP50突变体DD能促进EGFR和ERK的磷酸化水平升高(图
4)，表明EBP50通过与EGFR的相互作用来调节EGFR及下游信号分子的活性。
实施例六：K-M曲线分析EBP5对宫颈癌患者预后的影响
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果和临床病人信息
2.方法
使用Prism5分析EBP50的表达水平对于EGFR基因组没发生变异的以及没进行过放化疗的患者积累生存概率
的影响。
(二)结果
分析结果发现，EBP50低表达组的患者预后更差(图5)，表明EBP50在EGFR基因组没发生变异的患者中确实可以作为宫颈癌的预后分子标志物。
图2是宫颈癌中EBP50表达与EGFR-ERK通路活性负相关图
图3是EBP50突变体DD削弱了与EGFR结合能力图
图4是EBP50突变体DD削弱对EGFR-ERK通路抑制能力图
图5是EBP50表达可以预测宫颈癌病人预后图
具体实施方法
实施例一：分析宫颈癌组织和正常组织中EBP50蛋白的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
下载The human protein atlas数据库中宫颈癌组织和正常组织的IHC结果
2.方法
用Image Pro Plus 6软件统计免疫组化结果的IOD值，然后通过SPSS对肿瘤组和正常组进行统计学分析。
(二)结果
11例宫颈癌及3例正常组织的标本，通过免疫组化染色观察标本EBP50蛋白的表达情况，如图1A所示，正常组织中均可见EBP50蛋白呈阳性表达，而宫颈癌组织中EBP50蛋白染色接近阴性(图1A)。
实施例二：分析宫颈癌组织和正常组织中EBP50蛋白的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果，以及Molecular Signatures Database中两个gene set(GO:0042127 and GO:0045787)
2.方法
将TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果按EBP50表达量分为EBP50高表达组和低表达组，然后用GSEA软件分析细胞增殖基因集(GO:0042127)和细胞周期基因集(GO:
0045787)中基因表达的富集情况。
(二)结果
细胞增殖基因集和细胞周期基因集中的基因显著富集在宫颈癌中EBP50低表达组(图
1B-C)，表明EBP50可以显著抑制宫颈癌细胞的增殖和周期。
实施例三：分析宫颈癌中EBP50表达对EGFR/ERK信号通路的影响
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果和RPPA的蛋白芯片的结果实验所用细胞系为本实验室构建的稳定敲低EBP50的宫颈癌HeLa细胞系和HeLa细胞系SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗EBP50抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：
1000)和GAPDH抗体(abcam，1：1000)
TBST
二抗(1：10000)
EGF
2.方法
将TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果按EBP50表达量分为EBP50高表达组和低表达组，然后用GSEA软件分析细胞增殖基因集(GO:0042127)和细胞周期基因集(GO:
0045787)中基因表达的富集情况。
接种细胞：在每个6孔板边缘标记实验分组及日期，每孔加入相应处理的稀释好的细胞悬液2ml，即细胞数为15万个/孔。将6孔板放入培养箱(在37℃，5％CO2的条件下)培养中继续培养。第二天血清饥饿24小时后用EGF刺激5分钟，收取细胞。
取细胞裂解液进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗EBP50抗体、pERK抗体、ERK抗体和GAPDH抗体分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用二抗(1：10000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，曝光。
(二)结果
EGFR通路激活下调的基因集显著富集在宫颈癌中EBP50高表达组(图2A)，表明EBP50可以显著抑制宫颈癌中的EGFR信号通路。Pearson相关性和回归分析表明，EBP50的表达水平和c-RAF的磷酸化蛋白表达水平显著负相关(图2B)，提示EBP50确实抑制了EGFR下游信号分子的活性。GSEA分析结果显示，ERK通路基因集显著富集在宫颈癌中EBP50低表达组(图2C)，进一步说明EBP50能抑制EGFR介导的下游ERK通路的激活。Western Blotting结果显示，稳定敲低了EBP50的HeLa细胞在EGF刺激5分钟时ERK的磷酸化水平显著升高，表明EBP50可以抑制EGFR介导的ERK信号通路(图2D)。
实施例四：验证EBP50突变体与EGFR的相互作用能力
(一)材料和方法
1.材料
pBK-CMV-HA-EBP50和pBK-CMV-HA-EBP50 mutant(S279D/S301D，DD)质粒
Lip2000
GST融合蛋白
考马斯亮蓝
Ponceau S染料
HA beads
实验所用细胞系为HeLa和COS7细胞系
一抗HA抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)和GST抗体(abcam，1：1000)TBST
二抗(1：10000)
2.方法
HeLa或COS-7细胞瞬时转染后每个培养皿用1ml细胞裂解液收集至1.5ml离心管中，4℃旋转孵育40-60min；4℃、13000rpm离心15min，取上清至新的离心管中，留取少量用作免疫印迹对照；在剩余样品中加入30μl HA beads，4℃旋转孵育3h；洗涤缓冲液漂洗后加入适量蛋白上样缓冲液，95℃加热5min，离心吸取上清，得到免疫印迹分析样品；将样品进行免疫印迹分析。
(二)结果
GST-Pull down和Co-IP实验都表明EBP50突变体DD与EGFR的相互作用减弱(图3)。
实施例五：Western Blotting检测EBP50突变体对EGFR/ERK信号通路的影响(一)材料和方法
1.材料
Lip2000
实验所用细胞系为HeLa细胞系
SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗pEGFR抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：
1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：1000)、一抗HA抗体(CST，1：1000)和GAPDH抗体(abcam，1：
1000)
TBST
二抗(1：10000)
EGF
2.方法
取细胞裂解液进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗pEGFR抗体(CST，1：1000)、一抗EGFR抗体(CST，1：1000)、一抗pERK抗体(abcam，1：1000)、一抗ERK抗体(abcam，1：1000)、一抗HA抗体(CST，1：1000)和GAPDH抗体(abcam，1：1000)分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用二抗(1：10000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，曝光。
(二)结果
与EGFR相互作用能力减弱的EBP50突变体DD能促进EGFR和ERK的磷酸化水平升高(图
4)，表明EBP50通过与EGFR的相互作用来调节EGFR及下游信号分子的活性。
实施例六：K-M曲线分析EBP5对宫颈癌患者预后的影响
(一)材料和方法
1.材料
下载TCGA数据库中宫颈癌的RNA Seq v2的测序结果和临床病人信息
2.方法
使用Prism5分析EBP50的表达水平对于EGFR基因组没发生变异的以及没进行过放化疗的患者积累生存概率
的影响。
(二)结果
分析结果发现，EBP50低表达组的患者预后更差(图5)，表明EBP50在EGFR基因组没发生变异的患者中确实可以作为宫颈癌的预后分子标志物。
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