通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法
专利汇可以提供通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种通过 结直肠癌 免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的 预后 进行评价的方法，即首先将结直肠癌患者的组织蜡 块 制成组织芯片，然后进行免疫组化实验、免疫评分，根据免疫评分进行分组，最后将CD8阳性表达量低的一组和CD8阳性表达量高的一组的随访得到的患者生存期作为横坐标，将患者的总生存率作为纵坐标进行作图，根据所得的图形生存期和总生存率的关系进行分析来判定CD8阳性表达量与结直肠癌患者的预后效果，在CD8阳性表达量高的情况下，患者的预后相对较好，在CD8阳性表达量低的情况下，患者的预后相对较差。该评价方法准确、快速的预测结直肠癌患者的预后。，下面是通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法专利的具体信息内容。
1.一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）、首先，将手术切除的64-180个结直肠癌肿瘤组织标本进行石蜡包埋，制成组织蜡块；
（2）、然后，根据HE染色确定步骤（1）所得的蜡块中肿瘤组织的位置，选取其中的肿瘤组织的中央部位制成含有64-180个点位的组织芯片；
（3）、接着，对步骤（2）所得的组织芯片、阳性对照和阴性对照进行免疫组织化学染色；
其中所述的阳性对照使用已证实为阳性组织的肿瘤细胞组织制成的组织芯片；
所述的阴性对照使用相同的组织芯片；
（4）、组织芯片常规脱蜡、水化；
（5）、微波抗原修复；
（6）、灭活内源性过氧化物酶；
（7）、封闭非特异性蛋白；
（8）、滴加一抗
CD8一抗用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀释，至于湿盒里4℃孵育过夜；
阴性对照中以PBS缓冲液代替一抗；
（9）、复温45分钟；
（10）、滴加二抗；
（11）、DAB显色；
（12）、苏木素复染；
（13）、脱水和透明；
（14）、封片；
（15）、结果分析：
阳性信号为棕黄色颗粒，用Olympus光学显微镜在200倍放大倍数下，对上述所得的每个组织位点拍摄两张图片，计数图片中阳性染色细胞的数目；
若阳性染色细胞数为0个，则免疫评分为0分；
若阳性染色细胞数为1-19个，则免疫评分为1分；
若阳性染色细胞数为20-49个，则免疫评分为2分；
若阳性染色细胞数大于49个，则免疫评分为3分；
（16）、根据步骤（15）所得的免疫评分进行分组，免疫评分为0、1的归为一组即为CD8阳性表达量低的一组，免疫评分为2、3的归为一组即为CD8阳性表达量高的一组；
（17）、利用Graph Pad prism 5作图软件，将步骤（16）中CD8阳性表达量低的一组和CD8阳性表达量高的一组的随访得到的患者生存期作为横坐标，将患者的总生存率作为纵坐标进行作图，根据所得的图形生存期和总生存率的关系进行分析来判定CD8阳性表达量与结直肠癌患者的预后效果。
2.如权利要求1所述的一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于步骤（5）所述的微波抗原修复，即将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟×2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次。
3.如权利要求2所述的一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于步骤（6）所述的灭活内源性过氧化物酶，即用30%过氧化氢和甲醇配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次。
4.如权利要求3所述的一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于步骤（7）所述的封闭非特异性蛋白即将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原。
5.如权利要求4所述的一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于步骤（10）所述的滴加二抗即将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时。
6.如权利要求5所述的一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，其特征在于步骤（11）所述的DAB显色，即将抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的B液即DAB原液和C液即DBA缓冲液按照B液:C液为1：50的比例配置成显色液，每张组织切片加入70ul的显色液，在显微镜下控制显色时间，观察到出现阳性结果又无明显背景着色时中止反应，用蒸馏水冲洗10分钟。
通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者
的预后进行评价的方法
技术领域
背景技术
86.2%，而免疫评分为0分和1分的病例组里有72%的患者复发，五年生存率只有27.5%，此后结直肠癌的免疫细胞浸润与预后评判作用引起广泛关注。
发明内容
（1）、首先，将手术切除的64-180个结直肠癌肿瘤组织标本进行石蜡包埋，制成组织蜡块；
（2）、然后，根据HE染色确定步骤（1）所得的蜡块中肿瘤组织的位置，选取其中的肿瘤组织的中央部位制成含有64-180个点位的组织芯片；
（3）、接着，对步骤（2）所得的组织芯片、阳性对照和阴性对照进行免疫组织化学染色（王光辉2013年Identification of MXRA5 as a novel tissue biomarker for colorectal cancer progression）；
其中阳性对照使用已证实为阳性组织的肿瘤细胞组织制成的组织芯片；
阴性对照使用相同的组织芯片；
（4）、组织芯片常规脱蜡、水化；
（5）、微波抗原修复；
将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟×2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，
5分钟×3次；
（6）、灭活内源性过氧化物酶：
用30%过氧化氢和甲醇配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次；
（7）、封闭非特异性蛋白：
将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原；
（8）、滴加一抗：
CD8一抗（clone c8/144B，Daka）用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀释，至于湿盒里4℃孵育过夜；阴性对照以PBS缓冲液代替一抗；
（9）、复温45分钟；
（10）、滴加二抗
抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒即以下简称二抗试剂盒，将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加二抗试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时；
（11）、DAB显色：
二抗试剂盒即中的B液即DAB原液和C液即DBA缓冲液按照B液:C液为1：50的比例配置成显色液，每张组织切片加入70ul的显色液，在显微镜下控制显色时间，观察到出现阳性结果又无明显背景着色时中止反应，用蒸馏水冲洗10分钟；
（12）、苏木素复染；
（13）、脱水和透明；
（14）、封片；
（15）、结果分析：
阳性信号为棕黄色颗粒，用Olympus光学显微镜在200倍放大倍数下，对上述所得的每个组织位点拍摄两张图片，计数图片中阳性染色细胞的数目，若阳性染色细胞数为0个，则免疫评分为0分；若阳性染色细胞数为1-19个，则免疫评分为1分；若阳性染色细胞数为
20-49个，则免疫评分为2分；若阳性染色细胞数大于49个，则免疫评分为3分；
（16）、根据步骤（15）所得的免疫评分进行分组，免疫评分为0、1的是一组即CD8阳性表达量低的一组，免疫评分为2、3的是一组即CD8阳性表达量高的一组；
（17）、利用Graph Pad prism 5作图软件，将步骤（16）中CD8阳性表达量低的一组和CD8阳性表达量高的一组的随访得到的患者生存期作为横坐标，将患者的总生存率作为纵坐标进行作图，根据所得的图形生存期和总生存率的关系进行分析来判定CD8阳性表达量与结直肠癌患者的预后效果，从图中可以判断出，CD8阳性表达量高的患者生存期长，预后好；CD8阳性表达量低的患者生存期短，预后差。
附图说明
图1c、在200倍放大倍数下肿瘤组织中央区域CD8阳性表达量；
图2a、在50倍放大倍数下肿瘤组织中央区域CD8弱阳性表达量；
图2b、在100倍放大倍数下肿瘤组织中央区域CD8弱阳性表达量；
图2c、在200倍放大倍数下肿瘤组织中央区域CD8弱阳性表达量；
图3a、在50倍放大倍数下肿瘤组织与正常组织交接区域CD8阳性表达量；
图3b、在100倍放大倍数下肿瘤组织与正常组织交接区域CD8阳性表达量；
图3c、在200倍放大倍数下肿瘤组织与正常组织交接区域CD8阳性表达量；
图4、CD8的阳性表达量与患者预后的关系，其中横坐标为患者的生存期，纵坐标患者的总生存率。
具体实施方式
表3 试剂配制
实施例1
一种通过结直肠癌免疫学指标CD8阳性表达量对结直肠癌患者的预后进行评价的方法，具体包括如下步骤：
（1）、首先，将手术切除的156个结直肠癌肿瘤组织标本进行石蜡包埋，制得156个结直肠癌肿瘤组织的蜡块；
（2）、然后，根据HE染色确定组织类型，选取肿瘤组织由上海生物芯片有限公司制作成两张组织芯片，每张芯片上有78个肿瘤组织位点；
将上述步骤（2）免疫组化实验所得的组织芯片在Olympus光学显微镜下观察，选取肿瘤中央位置进行拍摄，分别在50、100和200倍下进行观察，可以看出CD8在部分肿瘤中央呈阳性表达，且表达量较高，具体如图1a、图1b和图1c所示；CD8在部分肿瘤中央呈弱阳性表达，表达量较低，具体如图2a、图2b和图2c所示；在部分肿瘤和正常组织的交界处也可以观察到CD8的阳性表达，具体如图3a、图3b和图3c。
（4）、切片常规脱蜡水化：
组织切片依次经过二甲苯洗涤2次，每次10分钟、无水乙醇洗涤2次，每次5分钟、95%酒精洗涤2次，每次5分钟、75%酒精洗涤2次，每次5分钟，使组织切片表面的石蜡脱掉并充分水化，之后用自来水冲洗切片1min，用PBS缓冲液洗1分钟×3次；
（5）、微波抗原修复：
将组织切片浸于由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的抗原修复液中，于微波炉中高火档加热3分钟，然后中低火档加热4分钟×2次，取出后室温下冷却，用PBS缓冲液洗涤，
5分钟×3次；
（6）、灭活内源性过氧化物酶：
用30%过氧化氢和甲醇配成的灭活液，将组织切片浸泡在灭活液中30分钟，以灭活内源性过氧化物酶后，用PBS缓冲液洗涤，5分钟×3次；
（7）、封闭非特异性蛋白：
将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升的封闭液即5%的BSA水溶液，孵育30分钟，封闭非特异性抗原；
（8）、滴加一抗：
按照抗体说明书推荐的一抗稀释比例用5%的牛血清白蛋白水溶液按1:50稀释抗体，至于湿盒里4℃孵育过夜，按实验设计以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，以已知阳性组织作为阳性对照；
（9）、第二天将组织切片至于37℃烘箱中复温45分钟；PBS缓冲液洗涤，10分钟×3次；
（10）、滴加二抗：
抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒即以下简称二抗试剂盒，将切片置入湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加二抗试剂盒中的A液即辣根过氧化物酶聚合物一滴，室温下孵育半小时；
（11）、DAB显色：
二抗试剂盒即中的B液即DAB原液和C液即DBA缓冲液按照B液:C液为1：50的比例配置成显色液，每张组织切片加入70ul的显色液，在显微镜下控制显色时间，观察到出现阳性结果又无明显背景着色时中止反应，用蒸馏水冲洗10分钟；
（12）、复染：
苏木素复染30秒，蒸馏水冲洗10分钟；
（13）、脱水和透明：
将组织切片依次经过75%酒精洗涤2次，每次5分钟、95%酒精洗涤2次，每次5分钟、无水乙醇洗涤2次，每次5分钟、二甲苯洗涤2次，每次10分钟；
（14）、通风橱内放置5min，使组织切片上的二甲苯挥发，然后用中性树胶封片，封片之后在烘箱内放置1小时，使树胶尽快凝固；
（15）、将步骤（14）所得的每个组织位点在Olympus光学显微镜下进行图片拍摄，放大倍数选用200倍，每个组织位点拍摄两张图片，计数图片中阳性染色细胞的数目；
根据阳性染色细胞数为0个，则免疫评分为0分；
阳性染色细胞数为1-19个，则免疫评分为1分；
阳性染色细胞数为20-49个，则免疫评分为2分；
阳性染色细胞数大于49个，则免疫评分为3分；
最终上述的156个结直肠癌组织的评分分布情况见下表：
免疫评分 例数 百分比
0分 5/156 3.2%
1分 20/156 12.8%
2分 35/156 22.4%
3分 96/156 61.6%
（16）、根据步骤（15）的免疫评分，将免疫评分为0分和1分的归为一组即CD8阳性表达量低的一组，免疫评分为2、3的归为一组即CD8阳性表达量高的一组；
（17）、分析CD8阳性表达量多少与患者总生存率的关系
利用Graph Pad prism 5作图软件，将步骤（16）中CD8阳性表达量低的一组与CD8阳性表达量高的一组的随访得到的患者生存期作为横坐标，将总生存率作为纵坐标进行作图，结果见图4，图中CD8低表达即表示CD8阳性表达量低的一组，CD8高表达表示CD8阳性表达量高的一组，根据所得的图形生存期和总生存率的关系进行分析来判定CD8阳性表达量与结直肠癌患者的预后效果。
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