技术领域
[0001] 本
发明涉及乳腺癌诊断技术领域，具体公开了一种小分子非编码环状RNA circEPSTI1及其在三阴乳腺癌上的应用。
背景技术
[0002] 乳腺癌是全世界发病率最高的女性
恶性肿瘤。中国作为人口大国和独特的老龄化社会形态，乳腺癌发病率增长速度高于其他国家，形势不容乐观。乳腺癌至今仍没有得到充分有效的控制，乳腺癌仍然呈现较高的死亡率，主要原因是其复发和转移，乳腺癌一旦发生转移，平均存活率大概只有4-5年。三阴乳腺癌是指雌
激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人类表皮生长因子受体-2(HER-2)表达均阴性的乳腺癌，占整个乳腺癌群体的15％-20％。三阴乳腺癌临床特征不仅表现为侵袭性强、
组织学分级较高、
预后差、易发生内脏转移，且缺乏内分泌
治疗及针对HER-2的
分子靶向治疗的相应靶点，治疗手段的选择相对于其它分子亚型乳腺癌受到限制。
发明内容
[0003] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种能在三阴性乳腺癌中高表达的环状RNA circEPSTI1。
[0004] 本发明的目的之二是提供了如何通过检测组织中RNA circEPSTI1，对三阴性乳腺癌进行诊断的具体方法。
[0005] 本发明的目的之三是提供了由RNA circEPSTI1制得的
试剂盒，该试剂盒性价比高、易于推广应用。
[0006] 本发明的目的之四是提供了所述RNA circEPSTI1可应用于三阴乳腺癌病人预后预测。
[0007] 本发明是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 一种环状RNA circEPSTI1，所述circEPSTI1为小分子非编码环状，来源于EPSTI1基因的外显子区域，其序列如SEQ No∶1所示。
[0009] RNA circEPSTI1属于内源性非编码RNA的一种，其结构为共价环状闭合的单链RNA。具有结构稳定、丰度高和组织特异性表达等特征。其作为竞争性内源RNA(ceRNA)来发挥基因表达调控的作用。环状RNA利用其microRNA(miRNA)应答元件结合miRNA，以阻断miRNA对其靶标表达的抑制作用，从而调控其他相关RNA的表达
水平。本发明环状RNA circEPSTI1与蛋白编码基因一样，具有主要的
生物学功能，是肿瘤新的判定预后标志物和靶向治疗不错的工具，尤其是在三阴乳腺癌内高表达，为人类战胜三阴性乳腺癌提供新的策略。
[0010] 所述RNA circEPSTI1的应用，将所述circEPSTI1用诊断三阴乳腺癌，具体方法如下：
[0011] (1)组织RNA的抽提
[0012] A取组织标本于研钵中加入液氮
研磨，研磨成匀浆后加入Trizol和氯仿，震荡均匀后
冰上放置；
[0013] B将步骤A中所得
混合液低温离心，取上层水相加入预冷的异丙醇混匀，
冰箱静置后低温离心；弃上清，加入75％DEPC水稀释的
乙醇混匀，低温离心；弃上清，室温干燥后得到RNA；
[0014] C先往步骤B中所得RNA中加入DEPC水溶解，再用分光光度计测RNA的浓度及
质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行EB胶
电泳检测RNA质量，得到所述组织RNA，-70℃保存；
[0015] (2)特异性逆转录
[0016] 使用转录试剂盒和逆转录特异性引物对circEPSTI1进行逆转录，在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录混合液，用
手指轻弹装试剂的管子，将逆转录混合液用移液器吸打几次，不能用
振荡器。
[0017] 较佳地，所述对circEPSTI1进行逆转录使用转录试剂盒和逆转录特异性引物，分别为普洛麦格Promega公司的逆转录试剂盒A3500和上海吉玛生物技术有限公司生产的逆转录特异性引物QPM010。
[0018] 20μL逆转录反应的体系如下：
[0019]
[0020] 逆转录程序：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃10分钟。
[0021] (3)circEPSTI1特异性实时定量PCR
[0022] 先将circEPSTI1逆转录产物分别稀释至2倍，然后混匀；
[0023] circEPSTI1特异性实时定量PCR中，20μL反应体系如下：
[0024]
[0025] circEPSTI1实时定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃12秒，62℃35秒，使用SYBR-Green染料进行实时定量PCR扩增。
[0026] 所述circEPSTI1特异性PCR引物为：
[0027] 正向引物为5′-AAGCTGAAGAAGCTGAACTC-3′
[0028] 反向引物为5′-GTGTATGCACTTGTGTATTGC-3′；
[0029] 所述β-actin特异性PCR引物为：
[0030] 正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′
[0031] 反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。
[0032] (4)△CT指标的测定
[0033] 当△CT≤5.52时，circEPSTI1表达阳性，即可诊断该组织为三阴乳腺癌组织；所述△CT为circEPSTI1与β-actin的平均CT值的差值。
[0034] 所述RNA circEPSTI1的应用，将所述RNA circEPSTI1应用于三阴乳腺癌检测试剂盒。检测试剂盒包括：
[0035] 异丙醇、三氯甲烷、Trizol、DEPC水或无酶水、双蒸水、5×逆转录缓冲液、25mM氯化镁、10mM三
磷酸碱基脱
氧核苷酸、5U/μl RAN酶
抑制剂、200U/μl MMLV逆转录酶或25U/μl AMV酶、2×实时定量PCR缓冲液、5U/μl Taq聚合酶、5μM circEPSTI1特异性PCR引物、5μMβ-actin特异性PCR引物、10μM环状RNA逆转录引物、10μMβ-actin特异性逆转录引物。
[0036] RNA circEPSTI1的应用，将所述RNA circEPSTI1应用于三阴乳腺癌病人预后预测。
[0037] 本发明中circEPSTI1即hsa_circRNA_000479(chr13：43528083-43544806)，其来源于EPSTI1基因(13q14.11)的外显子区域(图1)。而其所在的第13号
染色体携带若干与乳腺癌有关的基因，包括BRCA2和RB1基因等。实时
荧光定量PCR技术是目前检测组织环状RNA表达权威的检测方法之一。
申请人首先通过实时荧光定量PCR技术检测57例三阴性乳腺癌组织以及其
配对正常乳腺组织中的表达情况，结果发现，circEPSTI1在三阴性乳腺癌组织中呈现高表达(图2)。circEPSTI1在三阴性乳腺癌组织中高表达有统计学意义(P<0.01)。为了更好地判定circEPSTI1三阴性乳腺癌组织中的表达情况，近一步分析circEPSTI1对于三阴乳腺癌患者预后的影响，本申请人运用原位杂交的方式再一次检测了240例三阴乳腺癌患者肿瘤中circEPSTI1的表达水平(图3)。
[0038] 随访资料显示，circEPSTI1高表达的83例三阴性乳腺癌病人中有24例死亡，而circEPSTI1低表达的157例三阴性乳腺癌病人中仅有14例死亡；经Kaplan-Meier统计学分析circEPSTI1高表达的三阴性乳腺癌病人总生存率低于circEPSTI1低表达的病人，差异均有统计学意义(P<0.01)(图4)，提示circEPSTI1在三阴性乳腺癌中高表达，是预测三阴性乳腺癌预后的分子标志。本发明为三阴性乳腺癌预后预测提供了强有
力的技术支持和分子生物学
基础，具有深远的临床意义和推广性。
[0039] 在前期研究工作中，本申请人利用环状RNA高通量芯片(Arraystar HumancircRNA Array V2)在3对三阴乳腺癌组织与配对的癌旁正常组织中筛选三阴性乳腺癌相关环状RNA差异表达谱。根据差异倍数大于2倍，P<0.05标准，发现三阴性乳腺癌相关环状RNA有92个，其中上调环状RNA有68个，下调环状RNA有24个。随后挑取5个上调的环状RNA在51对三阴性乳腺癌组织与配对的癌旁正常组织中进行qRT-PCR验证。结果显示，RNA hsa_circRNA_000479(crEPSTI1)在三阴乳腺癌组织中表达最高，且显著高于对应癌旁组织。与芯片结果一致。
[0040] 通过进一步组织研究，
发明人发现：circEPSTI1在三阴性乳腺癌组织中呈现高表达(参见
附图2，3)。circEPSTI1高表达的三阴性乳腺癌病人总生存率低于circEPSTI1低表达的病人(参见附图4)。这提示circEPSTI1是预测三阴性乳腺癌预后的分子标志。
[0041] 本发明的通过研究证实circEPSTI1在三阴性乳腺癌中高表达，能用于三阴性乳腺癌病人预后预测中的应用，应用于医药领域，提供一种性价比高、易于推广应用的三阴性乳腺癌
诊断试剂盒。
[0043] 图1 circEPSTI1示意图
[0044] 图2实时荧光定量PCR测circEPSTI1在三阴性乳腺癌组织中的表达改变[0045] 图3原位杂交检测circEPSTI1在三阴性乳腺癌组织中的表达改变
[0046] 图4circEPSTI1与三阴性乳腺癌病人预后的关系
[0047] 具体的实施方式
[0048] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明。
[0049] 一、三阴性乳腺癌组织诊断试剂盒组成(50次反应)
[0050] 异丙醇100ml，三氯甲烷100ml，Trizol 50ml，DEPC水或无酶水10ml，双蒸水10ml，5×逆转录缓冲液1ml，25mM氯化镁1ml，10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1ml，5U/μl RAN酶抑制剂500μl，200U/μl MMLV逆转录酶50μl或25U/μlAMV酶50μl，2×实时定量PCR缓冲液2ml，5U/μl Taq聚合酶50μl，
[0051] 5μM circEPSTI1特异性PCR引物50μl，
[0052] 其正向引物为5′-AAGCTGAAGAAGCTGAACTC 3′，
[0053] 其反向引物为5′-GTGTATGCACTTGTGTATTGC-3′。
[0054] 5μMβ-actin特异性PCR引物30μl
[0055] 其正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′
[0056] 其反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′
[0057] 10μM环状RNA逆转录引物20μl(上海吉玛生物技术有限公司，QPM010)。
[0058] 10μMβ-actin特异性逆转录引物20μl(上海吉玛生物技术有限公司，QPM010)。
[0059] 二、组织样本中circEPSTI1的检测
[0060] 1、组织RNA的抽提
[0061] 取组织标本与研钵中加入液氮研磨标本；于研钵中加入0.6ml Trizol研钵标本，研磨成匀浆后用药勺加入tube管中；于tube管加入0.4ml Trizol；加氯仿200μl/mlTrizol于Tube中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新tube中，加入预冷的异丙醇0.5ml/mlTrizol混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％DEPC水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.6-1.8之间并进行EB胶电泳检测RNA质量，-70℃保存。
[0062] 2、特异性逆转录：使用普洛麦格Promega公司的逆转录试剂盒(A3500)和上海吉玛生物技术有限公司生产的逆转录特异性引物(QPM010)对circEPSTI1进行逆转录。20μL逆转录反应的体系如下：
[0063]
[0064] 在进行逆转录反应之前须将除了逆转录酶外的各种试剂混合成逆转录混合液，用手指轻弹装试剂的管子，将逆转录混合液用移液器吸打几次，不能用振荡器。
[0065] 逆转录程序：16℃30分钟，42℃30分钟，85℃10分钟。
[0066] 3、circEPSTI1特异性实时定量PCR：先将circEPSTI1逆转录产物分别稀释至2倍，然后混匀。20μL反应体系如下：
[0067]
[0068] circEPSTI1实时定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃12秒，62℃35秒。
[0069] 使用SYBR-Green染料进行实时定量PCR扩增。
[0070] circEPSTI1的PCR特异性引物为：
[0071] 其正向引物为5′-AAGCTGAAGAAGCTGAACTC 3′，
[0072] 其反向引物为5′-GTGTATGCACTTGTGTATTGC-3′。
[0073] β-actin作为内参基因，其PCR引物序列为：
[0074] 其正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′
[0075] 其反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′
[0076] (4)△CT指标的测定：△CT指同一样品中，待检circEPSTI1与内参β-actin平均Ct值的差值。即circEPSTI1△CT＝circEPSTI1MeanCT-control MeanCT，本发明中，△CT为circEPSTI1与β-actin的平均CT值的差值，获得相对定量ΔCT值，并进行判断，结果显示，在检测的57例三阴性乳腺癌组织中，当△CT≤5.52时，circEPSTI1表达阳性有39例，阳性率为68.42％。
[0077] 三、circEPSTI1与三阴性乳腺癌病人的预后关系
[0078] 运用原位杂交技术，申请者检测了240例三阴性乳腺癌组织中circEPSTI1的表达情况，然后对每一例检测的三阴性乳腺癌病人进行预后随访，结果显示circEPSTI1高表达的三阴性乳腺癌病人总生存率低于circEPSTI1低表达的病人(参见附图4)。这提示circEPSTI1是预测三阴性乳腺癌预后的分子标志。
[0079] 以上研究表明，检测三阴性乳腺癌组织中circEPSTI1的表达，具有很好的
稳定性。circEPSTI1可以作为三阴性乳腺癌患者预后预测的特异性分子标志物，circEPSTI1与三阴性乳腺癌预后显著相关，可以用于三阴性乳腺癌病人预后预测中的应用。
[0080] 上述
实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明
权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。
[0081] 序列号
[0082]
发明名称：一种RNAcircEPSTI1及其在三阴乳腺癌上的应用申请人：中山大学肿瘤防治中心
[0083] RNA circEPSTI1序列号
[0084] CACAAGTGCATACACCTTGATAGCACCAAATATAAACCGGAGAAATGAGATACAAAGAATTGCGGAGCAGGAGCTGGCCAACCTGGAGAAGTGGAAGGAGCAGAACAGAGCTAAACCGGTTCACCTGGTGCCCAGACGGCTAGGTGGAAGCCAGTCAGAAACTGAAGTCAGACAGAAACAACAACTCCAGCTGATGCAATCTAAATACAAGCAAAAGCTAAAAAGAGAAGAATCTGTAAGAATCAAGAAGGAAGCTGAAGAAGCTGAACTCCAAAAAATGAAGGCAATTCAGAGAGAGAAGAGCAATAAACTGGAGGAGAAAAAAAGACTTCAAGAAAACCTTAGAAGAGAAGCATTTAGAGAGCATCAGCAATA
