ZFHX4作为食管癌预后诊断的生物标志物
阅读：154发布：2020-05-14
专利汇可以提供ZFHX4作为食管癌预后诊断的生物标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于基因工程及 肿瘤 医学技术领域，具体为ZFHX4作为食管癌 预后 诊断的 生物 标志物的用途。本发明通过检测ZFHX4基因的 体细胞 突变来预测食管癌患者预后。本发明确立了ZFHX4基因突变是食管癌预后差的指标之一，也可以作为新的食管癌 治疗 靶点。，下面是ZFHX4作为食管癌预后诊断的生物标志物专利的具体信息内容。
1.一种ZFHX4基因作为食管癌预后诊断生物标志物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，包括：
（1）检测样品中编码ZFHX4基因的DNA和mRNA序列；
（2）检测样品中编码ZFHX4基因的突变位点，去除掉正常组织中携带的突变位点，获得体细胞突变位点；
（3）检测样品中ZFHX4基因表达量。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，根据ZFHX4基因进行突变检测，判断病人的预后。
4.一种检测ZFHX4基因体细胞突变的方法，其特征在于，包括下述步骤:
（1）从食管癌肿瘤组织、癌旁组织或者外周血中分别提取肿瘤DNA和正常组织DNA；
（2）对步骤（1)中提到的两种DNA分别进行全基因组和全外显子组测序，或者进行ZFHX4靶标基因测序；
（3）对步骤（2)中的测序数据进行质量控制，序列比对和体细胞突变检测，获得ZFHX4基因的体细胞突变；
（4）对ZFHX4体细胞突变对蛋白功能影响的评估。
5.生物标志物ZFHX4作为食管癌的治疗靶点的用途，包括向患者给予治疗有效量的所述的生物标志物抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性地结合于所述的生物标志物。
6.生物标志物ZFHX4的抗体或其片段。
ZFHX4作为食管癌预后诊断的生物标志物
技术领域
背景技术
[0002] 食管癌是较为常见的恶性肿瘤，食管癌在临床上是进展较为快速的恶性肿瘤，不同的病人在临床表现和预后方面有比较大的差异。食管癌的预后与确诊时的疾病进程相关，如果在发病早期诊断经手术切除后5年生存率可达90%以上。在过去的几十年中，随着内窥镜等检测技术的引入，手术和放化疗水平的提升，食管癌的诊断和治疗有了很大的改善；然而，依然缺乏有效的早期筛查和预后诊断方法，病人的生存率没有显著提高。一直以来，寻找早期筛查和预后诊断相关的生物标志物是食管癌研究的重点。
[0003] 肿瘤的发生源自于肿瘤细胞中基因组的变异的积累，这些变异以体细胞突变为主，还包括基因结构的变异、表观遗传的改变，以及基因表达的改变等一系列变化。体细胞突变产生于细胞DNA的复制和修复过程中。在很多肿瘤中，体细胞的突变和环境暴露相关，不同的突变产生过程最终会导致肿瘤突变特征的差异。在肿瘤形成和发展过程会有大量的突变参与其中，这些突变很多位于重要的基因功能区域，但是只有很少的基因突变会在肿瘤的形成过程中起至关重要的驱动作用。体细胞突变和驱动基因的研究有助于更深入的理解肿瘤的发生机制，也有助于寻找肿瘤预后相关的分子标志物和治疗靶点。
[0004] 二代测序技术为肿瘤基因组的研究开启了新的篇章。通过基因组测序手段研究食管癌基因组变异，有助于发现新的诊断手段和治疗方法，对肿瘤组织和正常组织的基因组的测序，我们可以获得肿瘤的体细胞突变信息和结构变异等信息。目前很多肿瘤基因组研究都致力于寻找与肿瘤早期诊断、预后和治疗疗效相关的生物标志物。但食管癌与乳腺癌、肺癌、结直肠癌等被广泛研究的癌症不同，其分子机制的研究到迄今为止相对较为薄弱，发生发展机制尚不明确，没有明确的分子分型，也没有明确的药物治疗靶标。因此，基于二代测序技术研究食管癌阐明食管癌的致病机理尤为迫切。
[0005] 目前，针对于中国人群食管癌测序项目已经完成了442例肿瘤组织和配对癌旁组织 (或血液样本) 的基因测序，发现了在食管癌中显著性突变的16个基因，包括TP53, PIK3CA, NOTHC1, CDKN2A, NFE2L2, KMT2D等。这些基因的突变和食管癌的发生发展密切相关。但由于样本量的限制，这些研究仅仅发现了EP300基因的突变和食管癌的预后相关。
[0006] 为了寻找和食管癌预后相关的生物标志物，我们根据整合了442例已经发表的食管癌基因组测序数据，通过整合分析，发现了ZFHX4基因突变和食管癌患者的生存期显著相关。
发明内容
[0007] 本发明目的是提供ZFHX4基因体作为食管癌预后诊断生物标志物的用途。
[0008] 本发明研究了ZFHX4基因细胞体突变(Somatic Mutation)和基因表达在食管癌中的功能和应用。
[0009] 本发明研究表明，ZFHX4基因突变会显著导致食管癌病人的总体生存期缩短。
[0010] 本发明提出的用于食管癌预后诊断的ZFHX4基因突变生物标志物，及其在评估食管癌进展及预后诊断中的应用，包括：（1）检测样品中编码ZFHX4基因的DNA和mRNA序列；
（2）检测样品中编码ZFHX4基因的突变位点，去除掉正常组织中携带的突变位点，获得体细胞突变位点；
（3）检测样品中ZFHX4基因表达量。
（2）检测样品中编码ZFHX4基因的突变位点，去除掉正常组织中携带的突变位点，获得体细胞突变位点；
（3）检测样品中ZFHX4基因表达量。
[0011] 进一步，根据ZFHX4基因进行突变检测，判断病人的预后。
[0012] 本发明还提供一种通过二代测序方法，检测ZFHX4基因突变在食管癌预后诊断中的作用。
[0013] 本发明提供的检测ZFHX4基因体细胞突变的方法，包括下述步骤：（1）从食管癌肿瘤组织和癌旁组织(或者外周血)中分别提取肿瘤DNA和正常组织DNA；
（2）对步骤（1)中提到的两种DNA分别进行全基因组和全外显子组测序，或者进行ZFHX4靶标基因测序；
（3）对步骤（2)中的测序数据进行质量控制，序列比对和体细胞突变检测，获得ZFHX4基因的体细胞突变；
（4）对ZFHX4体细胞突变对蛋白功能影响的评估。
（2）对步骤（1)中提到的两种DNA分别进行全基因组和全外显子组测序，或者进行ZFHX4靶标基因测序；
（3）对步骤（2)中的测序数据进行质量控制，序列比对和体细胞突变检测，获得ZFHX4基因的体细胞突变；
（4）对ZFHX4体细胞突变对蛋白功能影响的评估。
[0014] 此外，从常规临床食管癌肿瘤和癌旁组织样本中的FFPE或组织切片提取的基因组DNA可通过标准的PCR的双脱氧链终止测序法 (Sanger) 进行突变检测。相关引物包括：表1. ZFHX4 测序引物
。
。
[0015] 本发明中，通过对17对食管癌肿瘤组织和配对的癌旁组织基因表达数据分析发现，ZFHX4在肿瘤组织中显著高表达。
[0016] 本发明中，通过siRNA抑制ZFHX4基因在食管癌细胞系KYSE150和TE-1中的表达，利用Transwell实验分析发现ZFHX4基因沉默后的肿瘤细胞侵袭能力显著降低。
[0017] 本发明中，通过细胞划痕实验分析发现ZFHX4基因沉默后的肿瘤细胞的划痕愈合能力显著降低，提示ZFHX4基因表达抑制会影响食管癌细胞的迁移能力。
[0019] 本发明还包括ZFHX4基因突变生物标志物的抗体或其片段。
[0020] 本发明所述的ZFHX4基因在GeneBank的登记号为79776，基因位于8q21.13基因组区域，包含15个外显子。ZFHX4基因的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示， ZFHX4蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
[0021] 本发明的有益效果本发明提供的ZFHX4基因体细胞突变作为食管癌辅助判断的标志物优越性在于：
（1）本发明首次阐明了ZFHX4基因和食管癌的关联，即ZFHX4基因体细胞突变和食管癌病人生存期缩短显著相关；
（2）本发明首次提出了ZFHX4基因表达和食管癌细胞的侵袭和转移相关，可以作为新的食管癌治疗的靶点。
附图说明
（1）本发明首次阐明了ZFHX4基因和食管癌的关联，即ZFHX4基因体细胞突变和食管癌病人生存期缩短显著相关；
（2）本发明首次提出了ZFHX4基因表达和食管癌细胞的侵袭和转移相关，可以作为新的食管癌治疗的靶点。
附图说明
[0022] 图1是生存曲线表示携带ZFHX4基因体细胞突变的食管癌病人，相对于不携带病人的总体生存期显著缩短，p=0.005。442例病人中，有生存信息的病人总数为281，其中28个病人携带ZFHX4基因突变。Log-Rank检验用于计算生存曲线显著性差异P值。
[0023] 图2是ZFHX4基因在17对食管癌病人肿瘤组织和癌旁组织的基因表达变化。ZFHX4基因在肿瘤组织中的表达水平是正常组织中的1.6倍，分析结果有统计学意义，t检验p值=0.0001。
[0024] 图3是siRNA成功干扰ZFHX4基因在食管癌细胞系中的表达。和对照组相比，ZFHX4基因的表达水平在siRNA处理组中显著降低 (p < 0.05)。
[0025] 图4是Transwell实验表明，siRNA抑制ZFHX4基因的表达水平，会导致食管癌细胞的侵袭能力下降 (P < 0.05)。
[0026] 图5是划痕实验表明，siRNA抑制ZFHX4基因的表达水平，会导致食管癌细胞的迁移能力下降 (P < 0.05)。
[0027] 图6是(A) ZFHX4体细胞突变在基因序列上的分布。(B) ZFHX4突变和肝癌病人的预后显著相关。
[0028] 图7是ZFHX4基因在其他肿瘤中的基因表达情况。ZFHX4基因在食管癌(ESCC)，肺癌(LUSC)，肺腺癌(LUAD)中，相对于正常组织显著高表达。ZFHX4基因在肝癌(LIHC)，乳腺癌(BRCA)，直肠癌(READ)中相对于正常组织显著下调。
具体实施方式
[0029] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。但并不意味着本发明仅限于此。
[0030] 实施例1、 442例食管癌肿瘤基因组测序数据分析发现ZFHX4基因体细胞突变和食管癌病人的预后相关联。
[0031] 本发明实施例中未作特殊说明的操作方法均按照仪器说明书进行操作1．样本和数据来源
食管癌样本均来自于中国医学科学院，按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了之前同意书。病人均没有采取放疗和化疗，手术是第一个治疗方案。所有标本收集后用液氮迅速冻存在-80℃。苏木精-伊红 (HE)染色切片，均由病理医生在显微镜下进行评估。要求肿瘤组织纯度>80%。
食管癌样本均来自于中国医学科学院，按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了之前同意书。病人均没有采取放疗和化疗，手术是第一个治疗方案。所有标本收集后用液氮迅速冻存在-80℃。苏木精-伊红 (HE)染色切片，均由病理医生在显微镜下进行评估。要求肿瘤组织纯度>80%。
[0032] 本研究包含潮汕食管癌病人的17对全基因组和71对外显子组测序，以及山西食管癌病人的14对全基因组和90对外显子组测序。样本测序Reads长度为90 bp，获得原始文件为fastq格式的文件。
[0033] 此外，还整合了两项大规模食管癌肿瘤基因组测序数据(Lin et al，Gao et al)，共包含442例食管癌病人。实验设计是基于中国食管癌患者人群，通过比较癌和血液样本间体细胞突变位点，寻找上述中国食管癌的驱动基因，目的是找到和食管癌发生发展相关的肿瘤突变基因。
[0034] 表2.食管癌肿瘤基因组数据集17例食管癌肿瘤和癌旁组织基因表达数据：
(GSE20347, https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
(GSE20347, https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
[0035] 2.实验材料QIAamp DNA Mini kit (Qiagen)
Bioanalyser (Agilent Technologies)
Covaris E-210 (Covaris)
ABI StepOne plus real-time PCR system
NimbleGenEZ 44M human exome array
HiSeq 2000 (Illumina)。
Bioanalyser (Agilent Technologies)
Covaris E-210 (Covaris)
ABI StepOne plus real-time PCR system
NimbleGenEZ 44M human exome array
HiSeq 2000 (Illumina)。
[0036] 3.实验方法（1）基因组测序
采用QIAamp试剂盒提取肿瘤组织和癌旁组织(外周血)DNA，采用Covaris E-210将DNA序列碎片化，全基因组测序约500bp,全外显子约200-300bp，构建DNA文库；用PCR系统进行序列扩增。外显子测序采用NimbleGenEZ人外显子芯片进行外显子区域序列的富集。测序采用HiSeq 2000平台，测序长度为90bp, 采用双端测序策略。
采用QIAamp试剂盒提取肿瘤组织和癌旁组织(外周血)DNA，采用Covaris E-210将DNA序列碎片化，全基因组测序约500bp,全外显子约200-300bp，构建DNA文库；用PCR系统进行序列扩增。外显子测序采用NimbleGenEZ人外显子芯片进行外显子区域序列的富集。测序采用HiSeq 2000平台，测序长度为90bp, 采用双端测序策略。
[0037] （2）测序数据序质量控制和基因突变分析流程和软件如下：（a）数据质量评估采用FastQC(0.11.2)软件，该软件可以统计测序片段的每个碱基的测序质量分布，GC含量分布，以及测序接头残留和建库过程中的duplication等；FastQC(0.11.2)软件 见http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/；
（b）序列比对软件采用BWA(0.5.9)1，使用默认参数，参考基因组为NCBI hg192。
SAMtools(0.1.18)3用于去除没有比对到人类参考基因组上的Reads，Picard (http://picard.sourceforge.net/)用于标记和去除建库过程中产生的PCR duplication；
（c）体细胞突变(somatic mutation)图谱构建，采用GATK (2.5)4官网提供的标准分析流程(https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices bpm=DNAseq)优化比对结果，包括在人类已知的indel区域的重新比对以及对测序质量分数的矫正，以获得更加准确的基因突变结果。采用SAMtools mpileup3和VarScan2 somatic5获得基因组体细胞变异位点，构建DNA体细胞突变图谱(参数：–min-coverage 10 –min-coverage-normal 10 –min-coverage-tumour 10 –min-var-freq 0.1 –min-avg-qual 0)；
（d）种系突变(germline mutation)图谱构建，采用GATK (2.5)4官网提供的标准分析流程优化比对结果。采用GATK的UnifiedGenotyper模块，以及VarScan2突变检测软件获得所有种系突变和体细胞突变；
（e）突变注释：利用Oncotator 1.9软件对442例病人的体细胞突变进行注释，获得体细胞突变所对应的基因信息，以及体细胞突变对于基因序列和蛋白序列影响等信息；
（f）驱动基因分析：采用MutSigCV算法，寻找和食管癌相关的驱动基因；
（g）利用dbNSFP数据库和CADD算法，评估突变位点对蛋白功能影响；
（h）（生存分析：对于每一个基因，按照是否携带该基因的突变，将病人分为两组，比较两组病人总体生存期的差异。采用Kaplan–Meier生存曲线表示两组病人生存期的差异；
Log-Rank检验生存差异的显著性，计算p值。生存分析采用了R语言的Survival程序包；
（i）差异表达分析：芯片数据的标准化处理采用了Robust Multi-array Average (RMA)算法，随后对表达值进行log2转换。根据倍数变化 (Fold Change) 和显著性t检验统计差异表达基因。差异表达基因的判断标准为基因表达值倍数变化大于1.5，显著性t检验p值小于0.05。
（b）序列比对软件采用BWA(0.5.9)1，使用默认参数，参考基因组为NCBI hg192。
SAMtools(0.1.18)3用于去除没有比对到人类参考基因组上的Reads，Picard (http://picard.sourceforge.net/)用于标记和去除建库过程中产生的PCR duplication；
（c）体细胞突变(somatic mutation)图谱构建，采用GATK (2.5)4官网提供的标准分析流程(https://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices bpm=DNAseq)优化比对结果，包括在人类已知的indel区域的重新比对以及对测序质量分数的矫正，以获得更加准确的基因突变结果。采用SAMtools mpileup3和VarScan2 somatic5获得基因组体细胞变异位点，构建DNA体细胞突变图谱(参数：–min-coverage 10 –min-coverage-normal 10 –min-coverage-tumour 10 –min-var-freq 0.1 –min-avg-qual 0)；
（d）种系突变(germline mutation)图谱构建，采用GATK (2.5)4官网提供的标准分析流程优化比对结果。采用GATK的UnifiedGenotyper模块，以及VarScan2突变检测软件获得所有种系突变和体细胞突变；
（e）突变注释：利用Oncotator 1.9软件对442例病人的体细胞突变进行注释，获得体细胞突变所对应的基因信息，以及体细胞突变对于基因序列和蛋白序列影响等信息；
（f）驱动基因分析：采用MutSigCV算法，寻找和食管癌相关的驱动基因；
（g）利用dbNSFP数据库和CADD算法，评估突变位点对蛋白功能影响；
（h）（生存分析：对于每一个基因，按照是否携带该基因的突变，将病人分为两组，比较两组病人总体生存期的差异。采用Kaplan–Meier生存曲线表示两组病人生存期的差异；
Log-Rank检验生存差异的显著性，计算p值。生存分析采用了R语言的Survival程序包；
（i）差异表达分析：芯片数据的标准化处理采用了Robust Multi-array Average (RMA)算法，随后对表达值进行log2转换。根据倍数变化 (Fold Change) 和显著性t检验统计差异表达基因。差异表达基因的判断标准为基因表达值倍数变化大于1.5，显著性t检验p值小于0.05。
[0038] 4.实验结论通过二代测序技术发现大约8.5% (38/442) 的食管癌病人携带ZFHX4基因的体细胞突变。携带ZFHX4突变病人的生存期显著缩短 (p = 0.00506)。此外，ZFHX4基因在肿瘤组织中的表达水平显著高于正常组织。
[0039] 实施例2、TCGA肿瘤基因组数据分析发现ZFHX4基因体细胞突变携带可以导致肝癌患者的生存期明显缩短。
[0040] 1.实验材料整合TCGA项目，共包含13种肿瘤类型和4119个肿瘤病人的肿瘤基因组数据。
[0041] 表3.13种TCGA肿瘤基因组数据集。
[0042]。
[0043] 2.实验方法（a）生存分析：对于每一个基因，按照是否携带该基因的突变，将每一种类型的肿瘤病人分为两组，比较两组病人总体生存期的差异。采用Kaplan–Meier生存曲线表示两组病人生存期的差异。Log-Rank检验生存差异的显著性，计算p值；
（b）差异表达分析：数据的标准化处理采用了FPKM算法，随后对表达值进行log2转换。
根据倍数变化 (Fold Change) 和显著性t检验统计差异表达基因。差异表达基因的判断标准为基因表达值倍数变化大于1.5，显著性t检验p值小于0.05。
（b）差异表达分析：数据的标准化处理采用了FPKM算法，随后对表达值进行log2转换。
根据倍数变化 (Fold Change) 和显著性t检验统计差异表达基因。差异表达基因的判断标准为基因表达值倍数变化大于1.5，显著性t检验p值小于0.05。
[0044] 3. 实验结论通过肿瘤基因组测序数据发现大约肿瘤病人广泛携带ZFHX4基因的体细胞突变。其中，在肝癌患者中，携带ZFHX4突变病人的生存期显著缩短 (p = 0.01)。此外，ZFHX4基因在多个肿瘤组织中表达紊乱。
[0045] 实施例3、Transwell 实验证实ZFHX4基因和食管癌细胞的侵袭能力相关。
[0046] 1.实验材料Kyse150&TE-1细胞 (中科院，China)
HilyMax转染试剂盒 (Dojindo，Japan)
ZFHX4 siRNA (吉玛生物，China)
Transwell板 (Corning，USA)。
HilyMax转染试剂盒 (Dojindo，Japan)
ZFHX4 siRNA (吉玛生物，China)
Transwell板 (Corning，USA)。
[0047] 2.实验方法（a）将培养好的Kyse150 & TE-1细胞接种于6孔培养板中 (2*10^5/孔)，并置于细胞培养箱中培养过夜；
（b）将先一天接种好的细胞用PBS清洗2遍，再加入500ul无血清1640培养基待用；
（c）转染：(1) 加入120ulOpti-MEM培养基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向(1)中培养基中加入ZFHX4 siRNA 80 pmol，用移液器吹打混匀；(3) 加入HilyMax转染试剂 (Dojindo，Japan) 12ul至以上溶液中，并用移液器轻轻吹打混匀；(4) 室温静置15min；(5) 将静置之后的复合体溶液加入到2中准备好的Kyse150和TE-1细胞中并轻轻震荡培养板混匀；
（d）将细胞放入细胞培养箱中孵育6h；
（e）去掉培养板中旧的培养基，加入新鲜的无血清培养基，并置于细胞培养箱中培养过夜；
（f）制备细胞悬液：消化各实验组细胞，离心并弃掉培养液，PBS清洗1遍，再用无血清培养基重悬细胞，调节细胞浓度至5*10^5个/ml；
（g）接种细胞：往每孔小室中加入200ul细胞悬液 (24孔小室)，往下室中加入500ul含
10%FBS的培养基；
（h）培养细胞：常规培养48h；
（i）计数：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；24孔板中加入500μl含10% cck-8试剂的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 3h后取出；吸取100ul溶液至96孔板中，96孔板于酶标仪上测OD值。
（b）将先一天接种好的细胞用PBS清洗2遍，再加入500ul无血清1640培养基待用；
（c）转染：(1) 加入120ulOpti-MEM培养基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向(1)中培养基中加入ZFHX4 siRNA 80 pmol，用移液器吹打混匀；(3) 加入HilyMax转染试剂 (Dojindo，Japan) 12ul至以上溶液中，并用移液器轻轻吹打混匀；(4) 室温静置15min；(5) 将静置之后的复合体溶液加入到2中准备好的Kyse150和TE-1细胞中并轻轻震荡培养板混匀；
（d）将细胞放入细胞培养箱中孵育6h；
（e）去掉培养板中旧的培养基，加入新鲜的无血清培养基，并置于细胞培养箱中培养过夜；
（f）制备细胞悬液：消化各实验组细胞，离心并弃掉培养液，PBS清洗1遍，再用无血清培养基重悬细胞，调节细胞浓度至5*10^5个/ml；
（g）接种细胞：往每孔小室中加入200ul细胞悬液 (24孔小室)，往下室中加入500ul含
10%FBS的培养基；
（h）培养细胞：常规培养48h；
（i）计数：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；24孔板中加入500μl含10% cck-8试剂的完全培养基，将小室置于其中，使膜浸没在培养基中，37℃ 3h后取出；吸取100ul溶液至96孔板中，96孔板于酶标仪上测OD值。
[0048] 3. 实验结论选取代表性的实验结果如图2。结果显示，对KYSE150和TE-1细胞的ZHFX基因进行干扰后，期迁移能力明显降低 (KYSE150 ZFHX4 siRNA: P<0.05；TE-1 ZFHX4 siRNA: P<
0.005)。
0.005)。
[0049] 实施例4、细胞划痕实验证实ZHFX4基因和食管癌细胞的侵袭能力相关。
[0050] 1.实验材料Kyse150&TE-1细胞 (中科院，China)
HilyMax转染试剂盒 (Dojindo，Japan)
ZFHX4 siRNA (吉玛生物，China)。
HilyMax转染试剂盒 (Dojindo，Japan)
ZFHX4 siRNA (吉玛生物，China)。
[0051] 2.实验方法（a）将培养好的KYSE150和TE-1细胞 (中科院，China) 接种于24孔培养板中(1*10^5/孔)，并置于细胞培养箱中培养过夜；
（b）将前一天接种好的细胞去除培养基，用10ul的枪头在接种好的细胞表面划出一道痕迹，并做好标记，用PBS清洗2遍，再加入500ul 1640培养基 (gibco，USA) 待用；
（c）转染：(1) 加入30ul Opti-MEM培养基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向a培养基中加入ZHFX4基因的siRNA 20pmol，用移液器吹打混匀；(3) 加入HilyMax转染试剂 (Dojindo，Japan) 3ul至以上溶液中，并用移液器轻轻吹打混匀；(4) 室温静置15min；(5) 将静置之后的复合体溶液加入到2中准备好的KYSE150和TE-1细胞中并轻轻震荡培养板混匀；
（d）将细胞放入细胞培养箱中孵育6h；
（e）去掉培养板中旧的培养基，加入新鲜的完全培养基，并置于细胞培养箱继续培养；
（f）分别在转染后0h，24h对划痕处进行拍照。
（b）将前一天接种好的细胞去除培养基，用10ul的枪头在接种好的细胞表面划出一道痕迹，并做好标记，用PBS清洗2遍，再加入500ul 1640培养基 (gibco，USA) 待用；
（c）转染：(1) 加入30ul Opti-MEM培养基 (gibco，USA) 至ep管；(2) 向a培养基中加入ZHFX4基因的siRNA 20pmol，用移液器吹打混匀；(3) 加入HilyMax转染试剂 (Dojindo，Japan) 3ul至以上溶液中，并用移液器轻轻吹打混匀；(4) 室温静置15min；(5) 将静置之后的复合体溶液加入到2中准备好的KYSE150和TE-1细胞中并轻轻震荡培养板混匀；
（d）将细胞放入细胞培养箱中孵育6h；
（e）去掉培养板中旧的培养基，加入新鲜的完全培养基，并置于细胞培养箱继续培养；
（f）分别在转染后0h，24h对划痕处进行拍照。
[0052] 3.实验结论选取代表性的实验结果如图3。结果显示，对KYSE150和TE-1细胞的ZHFX4基因进行干扰后，期迁移能力明显降低 (KYSE150 ZFHX4 siRNA: P<0.001；TE-1 ZFHX4 siRNA: P<
0.05)。
0.05)。
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