用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法
阅读：948发布：2020-09-09
专利汇可以提供用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于 恶性 肿瘤 相关筛查及评估的产品、应用及方法，具体涉及一种通过检测血液中免疫球蛋白G表面双天线复杂型N糖链末端半乳糖变化对恶性肿瘤进行筛查、早期诊断、 预后 评估、 风 险评估、病情监测和/或疗效评估的产品、应用及方法。，下面是用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法专利的具体信息内容。
1.一种用于对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品，所述产品是试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合，所述产品包括：
(A)用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化程度的试剂、仪器和/或系统，其用于测定IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链丰度Gal0、末端连有
1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链丰度Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链丰度Gal2；
(B)用于计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值Gal比的模块和/或处理器；
(C)可选的，用于根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块和/或处理器；
其中，所述恶性肿瘤选自：肝癌、胃癌、肺癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、子宫内膜癌和宫颈癌。
2.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述血液选自：血清、血浆和全血。
3.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述(A)中的用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化程度的试剂、仪器和/或系统是用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；核磁共振NMR。
4.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品还包括选自下组的一种或多种：
a)用于采集和/或处理对象血液样品的试剂和/或仪器；
b)用于分离和/或纯化血清和/或血浆的试剂和/或仪器；
c)用于分离和/或纯化血清/血浆IgG的试剂和/或仪器；
d)用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器，
e)用于存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标的数据库、模块和/或处理器；
f)用于提供判断阈值的模块和/或处理器；
g)用于将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块和/或处理器；
h)用于提供诊断和/或检测结果和/或报告的模块和/或处理器；
j)说明书或使用指南，其中记载了如下一种或多种应用和判断方式：
(i)用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
(ii)用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
(iii)用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
(iv)用于对象群恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
(v)用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
(vi)用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述d)中的用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器是选自下组的分离纯化N糖链方法的试剂和/或仪器：多孔石墨化碳PGC固相萃取法、多糖纯化柱、凝集素亲合法、毛细管电泳、高效液相色谱。
6.如权利要求4所述的产品，其特征在于，(i)～(iv)中的预先设定的阈值由最佳阈值±1％～15％来确定，其中最佳阈值基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定。
7.如权利要求4所述的产品，其特征在于，(i)～(iv)中的预先设定的阈值为0.35～
0.6。
8.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述(v)中，当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于5％～50％，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化。
9.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述(vi)用于疗效评估中，在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于5％～50％，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
10.如权利要求1-9中任一项所述的产品，其特征在于，所述Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值的计算采用选自下组的公式进行：
Gal比值＝Gal0/(Gal1+Gal2)；
Gal比值＝Gal0/(Gal1+2Gal2)；或
其倒数、对数变换形式。
11.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品用于包含如下步骤的检测方法中：
(A')测定对象血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
(B')计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
(C')根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、对病情进行监测和/或对疗效进行评估。
12.如权利要求11所述的产品，其特征在于，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：
(a')采集和/或处理对象血液样品；
(b')分离和/或纯化血清和/或血浆；
(c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；
(d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；
(e')存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标；
(f')提供判断阈值；
(g')将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤、病情监测和/或疗效评估；
(h')提供诊断和/或检测结果和/或报告；
(j')检测其它恶性肿瘤指标，并将所述其它恶性肿瘤指标的检测结果与Gal比检测结果结合。
13.如权利要求1所述的产品，其特征在于，所述产品还包含用于检测其它恶性肿瘤指标的试剂盒、设备、系统和/或它们的组合。
14.如权利要求13所述的产品，其特征在于，所述指标选自：患者的基本情况、肿瘤临床表现、专一性理化检查指标。
15.如权利要求14所述的产品，其特征在于，所述患者的基本情况包括选自下组中的一种或多种：年龄、性别、家族史。
16.如权利要求14所述的产品，其特征在于，所述肿瘤临床表现选自下组中的一种或多种：局部表现、全身表现和内诊；
其中，局部表现包括，肿块及继发症状、疼痛、病理性分泌物、皮肤黏膜溃疡中的一种或多种；
其中，全身表现包括发热、感染、贫血、消瘦、乏力、恶液质中的一种或多种；
其中，内诊包括直肠指检、妇科检查中的一种或多种。
17.如权利要求14所述的产品，其特征在于，所述专一性理化检查指标包括经特定的影像检查所得的指标，其中，所述特定的影像检查选自下组中的一种或多种：核磁、CT、B超、内窥镜、乳腺钼靶。
18.如权利要求14所述的产品，其特征在于，所述专一性理化检查指标包括肿瘤生化指标，其中，所述肿瘤生化指标选自下组中的一种或多种：AFP、CEA、PSA、SF、TSGF、POA、PROGRP、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、NSE、SCC、AFU、EBV-VCA。
19.试剂、仪器、模块和/或处理器在制备用于对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品中的应用，所述产品是试剂盒、设备、系统和/或它们的组合，所述试剂、仪器、模块和/或处理器包括：
(A)用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平的试剂、仪器、模块和/或处理器，其用于测定IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
(B)可选的，用于计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值Gal比的模块或处理器；
(C)可选的，用于根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块或处理器，
其中，所述恶性肿瘤选自：肝癌、胃癌、肺癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、子宫内膜癌和宫颈癌。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述(A)中的用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平的试剂、仪器、模块和/或处理器是用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器、模块和/或处理器：基质辅助激光解析飞行时间质谱MALDI法、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；核磁共振NMR。
21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述产品如权利要求1-18中任一项所述。
22.一种用于恶性肿瘤药物和/或治疗方法筛选的方法，所述方法包括：
(A")测定对象给药和/或治疗之前、之后和/或过程中的不同时间点血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
(B")计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
(C")根据Gal比评估判断所述药物和/或治疗方法的有效性，其中当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围，则表明该药物和/或治疗方法的疗效不佳；
其中，所述恶性肿瘤选自：肝癌、胃癌、肺癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、子宫内膜癌和宫颈癌。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述(C")中，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于5％～50％，则表明该药物和/或治疗方法的疗效不佳。
用于恶性肿瘤相关筛查及评估的产品、应用及方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域。具体而言，本发明涉及一种通过检测血液中免疫球蛋白G表面双天线复杂型N糖链末端半乳糖变化对恶性肿瘤进行筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品及方法。
背景技术
[0002] 肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的疾病之一，其具有长时间、多阶段的特点。当患者有自觉症状到医院就诊时，肿瘤往往已发展到了中晚期，给临床治疗带来了很大的困难。而中晚期肿瘤的死亡率很高，五年生存率往往只有20％。如果能在早期发现肿瘤并监测其发展变化、及时治疗，肿瘤的五年生存率则可达到80％。目前，医学界普遍认为二级预防(早发现、早诊断、早治疗)是降低癌症死亡率的关键环节之一。值得一提的是，从年龄发病率看，45岁以后发病率上升明显。因此，从40岁开始针对恶性肿瘤进行筛查，具有很大的社会意义。
[0003] 目前，恶性肿瘤的筛查手段主要包括影像学检查和血清肿瘤标志物筛查。
[0004] 包括CT、核磁共振、内窥镜等在内的影像学检查一方面由于其费用高、操作专业性等问题使得其难以大面积作为筛查手段普及，另一方面目前这些常规的影像学检查手段是针对组织形态进行识别，往往只能检出已有一定大小的中晚期肿瘤。
[0005] 鉴于血液样本采集的便捷性，血清学肿瘤检测手段更适用于广泛的肿瘤筛查。然而，目前已有的一些血清肿瘤标志物，包括甲胎蛋白(AFP)、癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原15-3(CA15-3)和前列腺特异抗原(PSA)等，它们的敏感性和特异性普遍不高。即使是最为灵敏的AFP，其诊断的阳性率也不到70％。另一方面，这些肿瘤标志物基本都是针对某一种或某一类肿瘤，用于检测时很难全面考量。
[0006] 此外，恶性肿瘤的预后以及高危人群发生恶性肿瘤风险的评估、患者病情监测和/或疗效评估对于临床控制恶性肿瘤的发生、复发、治疗等也具有重要的意义。
[0007] 在这样的背景下，找出一种覆盖面广、敏感性高、特异性好、操作便捷的血液学方法用于恶性肿瘤的早期筛查、预后评估、预测(即风险评估)、病情监测和/或疗效评估显得非常迫切。
[0008] 糖链作为一种生物信息分子，几乎参与了所有生命过程，糖链结构的改变与疾病尤其是肿瘤、自身免疫性疾病、感染等重大疾病的发生、发展紧密相关。在无明显体征的肿瘤发生初期，细胞膜上一些糖蛋白已发生糖基化异常，并释放到血液中，成为肿瘤早期发现的重要线索。多种肿瘤血清诊断生物标志物如CA19-9(消化道肿瘤)、AFP(肝癌)、CA125(卵巢癌)等均为肿瘤发生后机体分泌的糖链或糖蛋白产物。
[0009] 总之，基于糖领域研究的深入为新的血液学肿瘤检测方法的开发提供了契机。
发明内容
[0010] 发明人发现人血清IgG上双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化程度(具体为N糖链末端去半乳糖(Gal0)与半乳糖糖链(Gal1和Gal2)丰度的比值)与多种肿瘤的发生、良恶性以及预后具有普遍相关性。基于此，本发明提供了新的恶性肿瘤筛查、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的方法和产品。
[0011] 在本发明的第一方面中，提供了一种用于对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品，所述产品可为例如试剂盒、设备、可操作系统和/或它们的组合，所述产品包括：
[0012] (A)用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化程度的试剂、仪器和/或系统，其用于测定IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链丰度Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链丰度Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链丰度Gal2；
[0013] 例如，用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器和/或系统：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ESI-MS；液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；核磁共振NMR，优选基质辅助激光解析飞行时间质谱MALDI法；
[0014] (B)用于计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值Gal比的模块和/或处理器；
[0015] (C)可选的，用于根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块和/或处理器。
[0017] 在本发明的一些实施方式中，所述产品还包括选自下组的一种或多种：
[0018] a)用于采集和/或处理对象血液样品的试剂和/或仪器；
[0019] b)用于分离和/或纯化血清和/或血浆的试剂和/或仪器；
[0020] c)用于分离和/或纯化血清/血浆IgG的试剂和/或仪器；
[0021] d)用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器，
[0022] 例如，选自下组的分离纯化N糖链方法的试剂和/或仪器：多孔石墨化碳PGC固相萃取法(优选采用乙腈:水:三氟醋酸＝80:19.9:0.1活化PGC，采用水:三氟醋酸＝99.9:0.1平衡PGC，采用乙腈:水:三氟醋酸＝25:74.95:0.05的混合溶剂洗脱糖链)、多糖纯化柱、凝集素亲合法(如连续凝集素亲合色谱SLAC)、毛细管电泳、高效液相色谱；
[0024] f)用于提供判断阈值的模块和/或处理器；
[0025] g)用于将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块和/或处理器；
[0026] h)用于提供诊断和/或检测结果和/或报告的模块和/或处理器；
[0028] (i)用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0029] (ii)用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0030] (iii)用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0031] (iv)用于对象群(例如高危群体)恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0032] (v)用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0033] (vi)用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳；
[0034] 优选，(i)～(iv)中的阈值为0.35～0.6，更优选0.5。
[0035] 在一些实施方式中，可基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定最佳阈值，且优选的阈值范围可为最佳阈值±1～15％(包括该范围内的任意数值点或子范围)的范围。
[0036] 在一些实施方式中，所述对照选自：获自健康人或非恶性肿瘤患者的样品、或预设的阈值。
[0037] 在本发明的一些实施方式中，所述Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值的计算采用选自下组的公式进行：
[0038] Gal比值＝Gal0/(Gal1+Gal2)；
[0039] Gal比值＝Gal0/(Gal1+2Gal2)；或
[0040] 其倒数、对数等其他变换形式。
[0042] 在本发明的一些实施方式中，所述恶性肿瘤处于选自下组的阶段：癌前病变、临床前癌期、早期癌症、癌症中晚期。
[0044] 在本发明的一些实施方式中，所述产品用于高通量检测，例如用于同时处理96、192、288、384、480、576个或更多个样品。
[0045] 在本发明的一些实施方式中，所述产品用于包含如下步骤的检测方法中：
[0046] (A')测定对象血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0047] (B')计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
[0048] (C')根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、对病情进行监测和/或对疗效进行评估。
[0049] 在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：
[0050] (a')采集和/或处理对象血液样品；
[0051] (b')分离和/或纯化血清和/或血浆；
[0052] (c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；
[0053] (d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；
[0054] (e')存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标；
[0055] (f')提供判断阈值；
[0056] (g')将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤、病情监测和/或疗效评估；
[0057] (h')提供诊断和/或检测结果和/或报告；
[0058] (j')检测其它恶性肿瘤指标，并将所述其它恶性肿瘤指标的检测结果与Gal比检测结果结合。
[0059] 在本发明的一些实施方式中，所述产品还包含用于检测其它恶性肿瘤指标的试剂盒、设备、系统和/或它们的组合，优选所述指标选自：患者的基本情况，如年龄、性别、家族史；肿瘤临床表现，包括局部表现如肿块及继发症状、疼痛、病理性分泌物、皮肤黏膜溃疡，全身表现如发热、感染、贫血、消瘦、乏力、恶液质，内诊如直肠指检、妇科检查；专一性理化检查指标，包括特定的影像检查，如核磁、CT、B超、内窥镜，乳腺钼靶，肿瘤生化指标，如AFP、CEA、PSA、SF、TSGF、POA、PROGRP、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、NSE、SCC、AFU、EBV-VCA等。
[0060] 在本发明的第二方面中，提供了试剂、仪器、模块和/或处理器在制备用于对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品中的应用，所述产品可为例如试剂盒、设备、系统和/或它们的组合，所述试剂、仪器、模块和/或处理器包括：
[0061] (A)用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平的试剂、仪器、模块和/或处理器，其用于测定IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0062] 例如，用于选自下组的一种或多种方法的试剂、仪器、模块和/或处理器：基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ESI-MS；液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；核磁共振NMR，优选基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS；
[0063] (B)可选的，用于计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值Gal比的模块或处理器；
[0064] (C)可选的，用于根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块或处理器。
[0065] 在本发明的一些实施方式中，所述产品如前所述。
[0066] 在本发明的第三方面中，提供了一种用于药物和/或治疗方法筛选的方法，所述方法包括：
[0067] (A")测定对象给药和/或治疗之前、之后和/或过程中的不同时间点血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0068] (B")计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
[0069] (C")根据Gal比评估判断所述药物和/或治疗方法的有效性，其中当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该药物和/或治疗方法的疗效不佳。
[0070] 在本发明的其它方面中，提供了一种用于对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的方法，其特征在于，所述方法采用了本发明的产品或本发明的应用。
[0071] 在一些实施方式中，所述方法包括：
[0072] (A')测定对象血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0073] (B')计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
[0074] (C')根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、对病情进行监测和/或对疗效进行评估。
[0075] 在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括选自下组的一个或多个步骤：
[0076] (a')采集和/或处理对象血液样品；
[0077] (b')分离和/或纯化血清和/或血浆；
[0078] (c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；
[0079] (d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；
[0080] (e')存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标；
[0081] (f')提供判断阈值；
[0082] (g')将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤、病情监测和/或疗效评估；
[0083] (h')提供诊断和/或检测结果和/或报告；
[0084] (j')检测其它恶性肿瘤指标，并将所述其它恶性肿瘤指标的检测结果与Gal比检测结果结合，优选所述指标选自：患者的基本情况，如年龄、性别、家族史；肿瘤临床表现，包括局部表现如肿块及继发症状、疼痛、病理性分泌物、皮肤黏膜溃疡，全身表现如发热、感染、贫血、消瘦、乏力、恶液质，内诊如直肠指检、妇科检查；专一性理化检查指标，包括特定的影像检查，如核磁、CT、B超、内窥镜，乳腺钼靶，肿瘤生化指标，如AFP、CEA、PSA、SF、TSGF、POA、PROGRP、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、NSE、SCC、AFU、EBV-VCA等。
[0085] 在一些实施方式中，所述方法用于如下所述的用途，且包括如下所述相应步骤：
[0086] (i)用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0087] (ii)用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0088] (iii)用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0089] (iv)用于对象群(例如高危群体)恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0090] (v)用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0091] (vi)用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳；
[0092] 优选，(i)～(iv)中的阈值为0.35～0.6，更优选0.5。
[0093] 在一些实施方式中，可基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定最佳阈值，且优选的阈值范围可为最佳阈值±1～15％(包括该范围内的任意数值点或子范围)的范围。
[0094] 在本发明的一些实施方式中，所述产品和应用用于包括如下步骤的方法中：
[0095] 用IgG纯化柱从对象血清样品中分离和/或纯化血清IgG，优选采用与纯化柱配套的弱碱性结合缓冲溶液和弱酸性淋洗缓冲溶液；
[0096] 用糖苷酶处理分离的IgG以分离IgG的N糖链，优选采用糖苷酶PNGase F；
[0097] 用多孔石墨化碳PGC固相萃取分离的N糖链，优选采用乙腈:水:三氟醋酸＝80:19.9:0.1活化PGC，采用水:三氟醋酸＝99.9:0.1平衡PGC、采用乙腈:水:三氟醋酸＝25:
74.95:0.05的混合溶剂洗脱糖链；
74.95:0.05的混合溶剂洗脱糖链；
[0098] 采用质谱分析法(如基质辅助激光解析飞行时间质谱法)定量分析N-糖链中Gal0、Gal1和Gal2水平；
[0099] 基于对象血清IgG表面Gal比得出对象恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的结果。
[0101] 下面结合附图对本发明作进一步说明，其中所显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0102] 图1：各类恶性肿瘤样本与对照(健康人和良性疾病)的比较；
[0103] A：对照的血清IgG N-糖链代表性质谱图(峰上方的数字表示其分子量)；
[0104] B：恶性肿瘤样本的血清IgG N-糖链代表性质谱图；
[0105] 图2A：各类恶性肿瘤样本与对照(健康人和良性疾病)的比较样本的ROC曲线；
[0106] 图2B：卵巢癌样本与对照(健康人和良性疾病)比较的ROC曲线；
[0107] 图2C：肺癌样本与对照(健康人和良性疾病)比较的ROC曲线；
[0108] 图2D：胃癌样本与对照(健康人和良性疾病)比较的ROC曲线；
[0109] 图2E：肝癌样本与对照(健康人和良性疾病)比较的ROC曲线；
[0110] 图2F：肠癌(包含大肠、小肠、结肠、直肠癌)样本与对照(健康人和良性疾病)比较的ROC曲线；
[0111] 图2G：各类恶性肿瘤样本与良性疾病比较样本的ROC曲线；
[0112] 图2H：早期恶性肿瘤患者样本与对照(健康和良性疾病)样本比较的ROC曲线。
[0113] 附表说明
[0114] 下面进一步结合附表对本发明作进一步说明，其中所显示仅为了说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
[0115] 表1：对照样本分类及样本年龄分布；
[0116] 表2：恶性肿瘤样本分期及分级统计；
[0117] 表3A：Gal比检测在恶性肿瘤患者与对照样本中的统计差异；
[0118] 表3B：肿瘤分类及各种指标检出率比较。
具体实施方式
[0119] 本发明基于发明人在上述领域的研究，提供了一种基于哺乳动物(优选人)血液中免疫球蛋白G(IgG)表面双天线复杂型N糖链末端半乳糖化的变化筛查恶性肿瘤、进行早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的新方法。与现有的肿瘤血清学检测方法相比，本发明的方法具有适用性广、敏感性高、特异性好、操作便捷的特性，对于肿瘤的早期发现、及时诊断和治疗、改善预后、提高生存率有重要的意义。
[0120] 本发明的目的是针对恶性肿瘤与对照血液中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化程度(具体为N糖链末端去半乳糖(Gal0)与半乳糖糖链(Gal1和Gal2)丰度的比值)的不同，通过对该半乳糖化程度的分析，区分恶性肿瘤患者与健康/良性对照，实现对肿瘤的早期筛查、良恶性鉴别、预后检测、病情监测和/或疗效评估，并由此提供一种高灵敏、高特异性的恶性肿瘤筛查方法。
[0121] 发明人发现根据本发明的Gal比与多种肿瘤的发生和良恶性普遍相关。与现有的经典指标相比，本发明在对初诊病患的肿瘤筛查(肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌)和良恶性鉴别诊断中，具有更高的灵敏度、特异度和稳定性；当与现有的经典指标联合应用时，明显提高恶性肿瘤的检出率。
[0122] 具体而言，发明人运用本发明进行了如下的测试并得出了相应的结论：
[0123] 1)对2661例临床样本进行检测，包含924例对照样本、1737例恶性肿瘤样本，证明了本发明的方法、标志物和指标在恶性肿瘤筛查中具有高特异性、灵敏性和准确性；
[0124] 2)本发明的方法可与经典指标联合运用，以提高在特定肿瘤中的检出率；
[0125] 3)对78例行规范手术方案治疗的胃癌患者随访监测研究，对于复发病例的检出率为92.0％；
[0126] 4)对于4217例高危人群的血清样本进行随访检测，Gal比阴性组和阳性组中肿瘤发生率差异显著。
[0127] 以上结果证实Gal比可独立用于恶性肿瘤的筛查、恶性肿瘤的早期发现、恶性肿瘤的预后、病情监测和/或疗效评估，亦可与经典指标联合运用用于恶性肿瘤的检出。
[0128] 相关术语定义
[0129] 本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0130] 如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0131] 如本文所用，术语“Gal比(Gal ratio)”是指对象血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化量变，具体为双天线复杂型N糖链末端去半乳糖(Gal0)与半乳糖糖链(Gal1和Gal2)的丰度比值，其中，Gal0对应于末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链，Gal1对应于末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链，Gal2对应于末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链。
[0132] 如本文所用，术语“双天线复杂型N-糖链”是指：N-糖链中共有的核心五糖上连接入2个非纯甘露糖的分支糖链，宛如天线状(参见查锡良主编，《生物化学》人民卫生出版社，2008年第7版，第454-455页)。
[0133] 示例性的Gal0、Gal1和Gal2结构如下所示，其中，GlcNAc代表N-乙酰葡萄糖胺，Man代表甘露糖，Gal代表半乳糖，Fuc代表岩藻糖。
[0134]
[0135] 如本文所用，术语“特异度”、“灵敏度”、“符合率”均与相对应的医学统计学术语具有相同的含义。“特异度”(specificity)是指诊断为“非癌症”的病例中经试剂盒检测为阴性的比例。“灵敏度”(sensitivity)是指病理学诊断为“癌症”的病例中，经试剂盒检测为阳性的比例。“符合率”(accuracy)是指真阳性样本量与真阴性样本量之和占总样本量的比例，反映试剂盒检测结果与受试者是否罹患癌症的真实情况相符合的程度。
[0136] 如本文所用，术语“阈值”、“cut-off值”、“截断值”、“界值”和“参考值”、可以互换使用，指的是用来判断检测结果的标准，即临界值，检测结果高于阈值即视为阳性，低于阈值即视为阴性。
[0137] 如本文所用，术语“临床获益”，指经过某种治疗达到病情稳定或缓解的情况，其中CR、PR和SD具有与实体瘤疗效评价标准(RECIST标准)中相应术语完全相同的含义，即CR(Complete response)肿瘤完全缓解、PR(Partial response)肿瘤部分缓解和SD(Stable disease)疾病稳定。CR、PR和SD这三项指标作为临床获益人群的界定，与此相反的是PD(Progressive disease)即疾病进展。
[0138] 如本文所用，术语“健康人/对象”是指无任何已知的良性和恶性疾病、外表正常，无任何可见疾病症状的人/对象。
[0139] 本文所用术语“恶性肿瘤患者”是指经组织病理报告确诊为患有恶性肿瘤的患者。所述恶性肿瘤包括但不限于：肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌。在本发明的一些实例中，所述恶性肿瘤处于选自下组的阶段：早期癌症、中晚期癌症等。
[0140] 如本文所用，术语“非癌相关疾病患者”或“良性疾病患者”是指：经病理学诊断(例如临床生化、影像或组织病理报告)确诊为不是癌症但患有良性相关疾病的患者，如在肺癌试验中指确诊为不是肺癌但患有肺炎、肺结核等肺部良性相关疾病的患者，在肝癌试验中指确诊为不是肝癌但患有肝炎、肝硬化等肝部良性相关疾病的患者，在结直肠癌试验中指确诊为不是结直肠癌但患有炎症、结直肠息肉等结直肠良性相关疾病的患者，在乳腺癌试验中指确诊为不是肺、乳腺癌癌但患有乳腺炎、乳腺增生等乳腺良性相关疾病的患者。
[0141] 如本文所用，术语“非恶样本”是指：健康人以及良性疾病患者(即经病理学诊断确诊为不是癌症但患有良性相关疾病的患者)。
[0142] 如本文所用，术语“高危人群/群体”是指有发生肿瘤的高度危险度的人群/群体，尤指根据年龄和生活习惯等条件筛选出来的自觉没有罹患肿瘤的人群，不以临床指标作为划分依据。在肿瘤的高危人群中发生肿瘤的可能性远远高于一般人群。以肺癌为例，多年吸烟的男性老年人是高危人群；再如肝癌，乙型肝炎病毒感染者为高危人群。
[0143] 如本文所用，术语“恶性肿瘤筛查”是指：通过特定检测方法定期地对健康人群/群体进行检查，将外表健康的可能患病者和处于亚临床症状的人/对象鉴别出来，并期望通过进一步的诊断程序能早期发现患者，经早期治疗达到预防疾病发生或减缓疾病造成的残疾和死亡，使患者获得较好的预后和生存质量(方积乾，柳青，《中国肿瘤》，2002，11(1)：10-11)。
[0144] 如本文所用，术语“恶性肿瘤早期诊断”是指：一种专门针对肿瘤早期患者的诊疗方法，其目的在于早发现早治疗，从而减轻患者痛苦和精神、经济负担，并争取通过肿瘤早期诊断、治疗让肿瘤患者早日康复。
[0145] 血液(包括血清、血浆和全血)IgG及其分离和纯化
[0146] 在本发明的实施方式中，可采集对象的血液样品并用本领域中已知的常规方法分离和保存全血、血清和/或血浆。可采用新鲜或冻存血液、血清或血浆进行本发明的测试。所述血液样品可获自各种哺乳动物对象，优选人、猴、狗、马、牛、羊、猪、鼠、兔等。本领域技术人员可以理解，由于在成分上的区别，当采用受试者的血浆样本和血清样本分别进行检测时，Gal比可能会略有不同。出于便于定量和比较的目的，在本发明中血清样本是优选的。
[0147] 分离IgG的方法是本领域普通技术人员已知的，所述方法包括但不限于：IgG纯化柱、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇置换法、液相层析、亲合层析(例如蛋白A亲合法、聚酰胺复合膜亲合法)，只要所述方法不破坏IgG上所连N-糖链即可。可市售获得IgG分离试剂盒，例如购自Thermo Fisher Scientific。
[0148] 在本发明的一个实施方式中采用了IgG纯化柱来分离样品中的IgG，优选采用蛋白A纯化柱，并采用与纯化柱配套的弱碱性结合缓冲溶液和弱酸性淋洗缓冲溶液，更优选所述纯化柱为高通量纯化柱，例如可同时处理96个样品的纯化柱。
[0149] IgG表面N-糖链及其分离、纯化和分析
[0150] 可采用本领域中已知的方法从IgG上分离N糖链，包括但不限于：酶法，例如采用糖苷酶，优选糖苷酶PNGase F；化学法，例如采用糖蛋白肼解试剂，如ADM0155A肼解试剂盒。
[0151] 从IgG上分离N糖链后，可采用本领域中已知的方法对N糖链进行分离和/或纯化，所述方法包括但不限于：多孔石墨化碳PGC固相萃取法、多糖纯化柱、凝集素亲合法(如连续凝集素亲合色谱SLAC)、毛细管电泳、高效液相色谱等。
[0152] 在本发明的一个实施方式中，采用了多孔石墨化碳PGC固相萃取法分离N糖链，其中采用了乙腈:水:三氟醋酸＝80:19.9:0.1活化PGC，采用水:三氟醋酸＝99.9:0.1平衡PGC，并采用乙腈:水:三氟醋酸＝25:74.95:0.05的混合溶剂洗脱糖链(所述比例为体积比)。
[0153] 可采用本领域中已知的方法对IgG表面水平双天线复杂型N糖链末端去半乳糖(Gal0)、半乳糖糖链(Gal1和Gal2)的丰度进行测定，只要所述方法可对N-糖链中半乳糖化水平进行定量。所述方法包括但不限于：质谱法，例如基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS、快原子轰击质谱FAB-MS、电喷雾质谱ES-MS；液相色谱法；液相色谱-质谱联用法；糖芯片技术；核磁共振NMR或以上方式的任合组合。
[0154] 在本发明中优选采用基质辅助激光解析离子化(MALDI)质谱(MS)技术对IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖化程度进行高通量快速检测。该技术具有如下优点：
[0155] 1)实现了对N-糖链游离后的直接快速检测，与高效液相色谱(HPLC)以及液相色谱-质谱(LC-MS)联用相比，避免了长时间的色谱分离过程；
[0156] 2)与常规的MALDI质谱技术分析糖链相比，无需糖链的衍生化步骤，不但简化了分析步骤，节省了分析时间，特别是避免了衍生化步骤带来的实验误差；
[0157] 3)采用复杂型N糖链末端去半乳糖与含半乳糖的糖链丰度比值作为半乳糖量变指标，可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，减小平行样本进入质谱检测时的误差，确保分析的高重现性和准确性。总之，上述特性使该指标具备快速，通量，准确的特点，为其作为一种潜在的临床诊断指标提供了条件。
[0158] 在本发明的一个实施方式中采用了基质辅助激光解析飞行时间质谱法MALDI-MS，优选所述测试所用质量校正标准品为TOFmix，所用基质为2,5-二羟基苯甲酸DHB和/或所用均一化试剂为乙醇。
[0159] 数据分析方法
[0160] 在本发明中，将Gal比，即对象血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端去半乳糖(Gal0)与半乳糖糖链(Gal1和Gal2)的丰度比值，作为恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的指标。
[0161] 可根据需要采用不同的计算公式来计算Gal比，例如所述公式可选自：
[0162] 公式1：Gal比值＝Gal0/(Gal1+Gal2)；或
[0163] 公式2：Gal比值＝Gal0/(Gal1+2Gal2)；或
[0164] 可显示对象血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端去半乳糖(Gal0)与半乳糖糖链(Gal1和Gal2)的丰度比值的任何其它公式，如其倒数、对数等其他变换形式。
[0165] 值得注意的是，上述用于丰度比值的Gal0、Gal1和Gal2优选均来源于同一样本、同次检测和/或同一谱图。因此，采用该指标可以避免平行样品的预处理等操作过程产生的偏差，从而减小平行样本进入质谱检测时的误差，确保分析的高重现性和准确性，确保了该方法可应用于临床肿瘤筛查、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估。
[0166] 本领域普通技术人员基于本领域常识可根据不同对象群的检测数据绘制相应的ROC曲线，例如本发明的实施例中根据不同人群的数据绘制相应的ROC曲线。根据本领域公知技术，每一条ROC曲线都提供了一系列阈值及与之相对应的灵敏度和特异度。因此，使用这些ROC曲线，本领域技术人员能很容易地查出选取任意阈值(即cut-off值)时该项检测对疾病的识别能力，即诊断相应癌种的灵敏度、特异度和符合率。
[0167] 筛查结果的计算(阈值的计算)取决于特异度和灵敏度。阈值的计算方法包括但不限于：
[0169] 方法2：最大化灵敏度和特异度的值，即[灵敏度％-(1-特异度％)]max对应的Gal比即为最优阈值(最大约登指数，Youden index)。
[0170] 以阈值为界，高于该值判定为阳性，低于该值判定为阴性。
[0171] 在本发明中优选的阈值范围为0.35～0.6，优选0.5。本领域技术人员可以理解，由于受试群体和瘤种的不同，阈值的选取及其对应的灵敏度、特异度和符合率等参数会有所差别，但均包含在本发明限定的阈值范围内。本领域技术人员可以根据实际使用需求，如对特定瘤种、灵敏度、特异度等的要求，从本发明公开的ROC曲线或阈值范围内选取适当的优选阈值。可在确定最佳阈值后，将该最佳阈值±1～15％的范围(包括该范围内的任意数值点或子范围)。
[0172] Gal比指标的应用
[0173] 本发明Gal比指标可应用于恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估等用途中。这些应用包括但不限于：
[0174] 1)将Gal比指标应用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险。
[0175] 2)将Gal比指标应用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险。
[0176] 3)将Gal比指标应用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0177] 4)将Gal比指标用于高危群体恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0178] 5)将Gal比指标用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0179] 6)将Gal比指标用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
[0180] 方法与产品
[0181] 基于如前所述的技术，本发明中提供了用恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的方法和产品(如试剂盒、设备和/或系统)。
[0182] 本发明的方法包括如下步骤：
[0183] (A')测定对象血液样本中IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平，所述末端半乳糖基化水平包括：IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0184] (B')计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值，即Gal比；
[0185] (C')根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、对病情进行监测和/或对疗效进行评估。
[0186] 步骤(C')在不同应用时可包括：
[0187] 1)用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险。
[0188] 2)用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险。
[0189] 3)用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0190] 4)用于对象群(例如高危群体)恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0191] 5)用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0192] 6)用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
[0193] 本发明方法中的阈值范围可为0.35～0.6，优选0.5。可根据受试群体和瘤种的不同对阈值范围进行调整，例如基于ROC曲线中斜率最大点或最大化灵敏度和特异度的值来确定相应的阈值范围。
[0194] 此外，本发明的方法还可选的包括选自下组的一种或多种步骤：
[0195] (a')采集和/或处理对象血液样品；
[0196] (b')分离和/或纯化血清和/或血浆；
[0197] (c')分离和/或纯化血清/血浆IgG；
[0198] (d')分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链；
[0199] (e')存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标；
[0200] (f')提供判断阈值；
[0201] (g')将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤、病情监测和/或疗效评估；
[0202] (h')提供诊断和/或检测结果和/或报告。
[0203] 其中，根据不同应用，步骤(h')的判断可如下进行：
[0204] (i')用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0205] (ii')用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0206] (iii')用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0207] (iv')用于对象群(例如高危群体)恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0208] (v')用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0209] (vi')用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
[0210] 其中，(i')～(iv')中的阈值可为0.35～0.6，优选0.5。本领域普通技术人员也可根据具体需要对阈值进行设定。
[0211] 本发明的方法优选是高通量检测方法，例如可同时处理96、192、288、384、480、576个样品。
[0212] 相应的，本发明中还提供了一种恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估、病情监测和/或疗效评估的产品。所述产品可为，例如试剂盒、设备、系统和/或它们的组合。所述产品包括：
[0213] (A)用于测定血液IgG表面双天线复杂型N糖链的末端半乳糖基化水平的试剂和/或仪器，其用于测定IgG表面末端无半乳糖连接的双天线复杂型N-糖链水平Gal0、末端连有1个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal1和末端连有2个半乳糖的双天线复杂型N-糖链水平Gal2；
[0214] (B)可选的，用于计算Gal0与Gal1和Gal2的丰度比值的模块或处理器；
[0215] (C)可选的，用于根据Gal比判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块或处理器。
[0216] 此外，本发明的产品可选的包括选自下组的一种或多种：
[0217] (a)用于采集和/或处理对象血液样品的试剂和/或仪器；
[0218] (b)用于分离和/或纯化血清和/或血浆的试剂和/或仪器；
[0219] (c)用于分离和/或纯化血清/血浆IgG的试剂和/或仪器；
[0220] (d)用于分离、纯化和/或富集血清IgG表面N-糖链的试剂和/或仪器；
[0221] (e)用于存储和/或处理对象血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值作为IgG表面半乳糖化量变指标的数据库、模块或处理器；
[0222] (f)用于提供判断阈值的模块或处理器；
[0223] (g)用于将对象的Gal比与对照比较以判断对象是否罹患恶性肿瘤、对对象进行预后评估和/或罹患肿瘤的风险评估、病情监测和/或疗效评估的模块或处理器；
[0224] (h)用于提供诊断和/或检测结果和/或报告的模块或处理器；
[0225] (j)说明书或使用指南，其中记载了如下一种或多种应用和判断方式：
[0226] (i)用于肿瘤筛查检测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0227] (ii)用于良恶判定：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险；
[0228] (iii)用于预后监测：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象恶性肿瘤复发或具有复发的高风险；
[0229] (iv)用于对象群(例如高危群体)恶性肿瘤发生预期：当Gal比达到或高于预先设定的阈值，则提示对象发生恶性肿瘤的可能性高于其它对象；
[0230] (v)用于癌症患者病情监测：当Gal比高于前次测试所得的Gal比达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该癌症患者的病情有所发展或进一步恶化；
[0231] (vi)用于疗效评估：在治疗前后或治疗过程中的不同时间点测定并计算Gal比值，当Gal比值高于前次测试所得的Gal比值达到或高于预先设定的范围(例如5％～50％或该范围内的任意点或子范围)，则表明该疗法和/或药物的疗效不佳。
[0232] 其中，(i)～(iv)中的阈值可为0.35～0.6，优选0.5。本领域普通技术人员也可根据具体需要对阈值进行设定。
[0233] 本发明的优点
[0234] 本发明的主要优点是：
[0235] 1)适用于各种恶性肿瘤的筛查；
[0236] 2)针对某种特定肿瘤，与现有的临床诊断经典标准相比，具有特异度高、灵敏度高、准确度高的特征；
[0237] 3)与现有的临床诊断经典标准联用，具有更高的检出率；
[0238] 4)检测便捷，耗时短；针对单个样本，检测值重复性好，稳定性佳；可进行高通量检测。
[0239] 本发明符合优秀临床诊断指标在实际检测过程中应满足的操作要求，表明检测血液IgG的Gal比在恶性肿瘤筛查、早期诊断、预后评估、风险评估等方面具有临床应用的实际可行性。
[0240] 实施例
[0242] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
[0243] 除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0244] 概述
[0245] 在本发明如下试验中，运用本发明的方法和指标对如表1所示的以下样本进行检测：
[0246] 1)924例对照样本(包括健康人样本+良性对照样本，即表3A中的非恶样本，其中的良性对照如表3A中所示为404例)；
[0247] 2)1737例恶性肿瘤术前血液样本(包括肝癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、肠癌、食管癌、胰腺癌、胆管癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌)；
[0248] 3)78例恶性肿瘤(胃癌)术后血液样本；
[0249] 4)4217例高危人群的血液样本。
[0250] 判断本发明在恶性肿瘤筛查中具有高度特异性和灵敏性，从而判断本发明的方法和指标具有临床意义。
[0251] 表1.样本分类及样本年龄分布
[0252]
[0253] 材料与方法
[0254] I.血清样品的来源、分类、病理资料采集、保存和操作
[0255] 样本来源：
[0256] 健康人血液样本、良性对照血液样本、恶性肿瘤术前血液样本、癌前病变患者血液样本和恶性肿瘤术后血液样本均取自三级甲等医院的住院和门诊患者。
[0257] 样本分类：
[0258] 恶性肿瘤和癌前病变样本：经过明确病理诊断罹患肿瘤或有明确癌前病变病患的血清样本；其中，肿瘤样本分期及分级统计见表2，分类统计见表3，所参照的标准如下所述(引自《恶性肿瘤INM分类法》手册)。
[0259] 目前国际上常用TNM分期标准。TNM分类方法是依据临床所见对癌症进行病理分期：
[0260] 1.T——原发肿瘤(最初发生的癌症)的大小、浸润范围、有无转移、浸润深达程度，分为(T0至T4)五个等级，数字越大表示癌症进展得越明显，根据癌症发生的不同脏器制定的分类方法也不尽相同。
[0261] 2.N——周围淋巴结的转移程度，分为(N0至N3)四个等级，数字越大表示癌症进展得越明显。
[0262] 3.M——远处转移情况，M0表示没有发生其他脏器转移，M1则表示已经发生了其他脏器转移。
[0263] I期：肿瘤局限一处，没有扩散迹象。II期：肿瘤已扩散到邻近的淋巴结，但没有波及其它器官或组织。III期：肿瘤除了扩散到邻近淋巴结外，还波及附近器官或组织。IV期：肿瘤已扩散到远处的部位。其时期越早，治疗效果越好，患者生存时间越长。如果实施手术方法切除癌症，在术后还要详细检查切除的癌组织标本，对其进行手术后的TNM分期。
[0264] 据癌症细胞分化程度可对癌症进行病理分级：
[0265] 1.Ⅰ级为分化好，恶性程度低；
[0266] 2.II级为分化中等，恶性程度中度；
[0267] 3.III级为分化差，恶性程度高。
[0268] 恶性肿瘤的病理分级提示肿瘤的恶性程度。
[0269] 健康人样本：无任何已知的良性和恶性疾病、外表正常，无任何可见疾病症状的人。
[0270] 良性对照样本：经临床生化、影像或组织病理报告确诊良性疾病而非恶性肿瘤患者的样本。
[0271] 恶性肿瘤患者样本：经组织病理报告确诊为恶性肿瘤患者的样本。
[0272] 高危人群样本：指有发生肿瘤的高度危险度的人群的样本。在肿瘤的高危人群中发生肿瘤的可能性远远高于一般人群。以肺癌为例，多年吸烟的男性老年人是高危人群；再如肝癌，乙型肝炎病毒感染者为高危人群。
[0275] 表2.恶性肿瘤样本分期及分级统计
[0276]分期 例数
Ⅰ 231
Ⅱ 522
Ⅲ 603
Ⅳ 196
Not available 185
分级 例数
1 611
2 246
3 707
Not available 173
Ⅰ 231
Ⅱ 522
Ⅲ 603
Ⅳ 196
Not available 185
分级 例数
1 611
2 246
3 707
Not available 173
[0277] *not available是指肿瘤患者分期及分级未能确定或查取。
[0278] II.仪器及试剂
[0279] 1.IgG纯化用仪器及试剂
[0280] 纯化柱：IgG筛选用蛋白A离心板(Protein A Spin Plate for IgG Screening，96孔)购自Thermo Fisher Scientific公司，货号45202。
[0281] 结合缓冲溶液、淋洗缓冲溶液和BCA试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司。
[0282] 2.糖链分离和纯化用仪器及试剂
[0283] 糖苷酶：糖苷酶PNGase F(500U/μL)购自New England Biolabs公司
[0284] 多孔石墨化碳PGC：购自Grace公司。
[0285] 0.1％的三氟醋酸80％的乙腈水溶液：按乙腈:水:三氟醋酸＝80:19.9:0.1的比例配制，所述比例为体积比。
[0286] 0.1％的三氟醋酸水溶液：按水:三氟醋酸＝99.9:0.1的比例配制，所述比例为体积比。
[0287] 0.05％的三氟醋酸25％乙腈水溶液：按乙腈:水:三氟醋酸＝25:74.95:0.05的比例配制，所述比例为体积比。
[0288] 3.质谱定量用仪器及试剂
[0289] 质谱仪：Axima Resonance MALDI-QIT-TOF质谱仪(Shimadzu公司)。
[0290] 均一化试剂：乙醇，HPLC级(Merck公司)。
[0291] 基质：2,5-二羟基苯甲酸DHB，购自Sigma-Aldrich公司。
[0292] 校正溶液标准品：TOFmix，购自LaserBio Laboratories公司。
[0293] III.方法
[0294] (I)从筛查对象的血液样本中纯化IgG
[0295] 参照Thermo Fisher Scientific Protein A Spin Plate for IgG Screening用户手册实施，具体如下：
[0296] 1.将纯化柱和缓冲溶液(结合缓冲溶液和淋洗缓冲溶液)于室温下平衡30分钟；
[0297] 2.取下纯化柱底部的盖子，将其放置在洗涤板上，取下纯化柱顶部的盖子，在每个孔中加入200μl结合缓冲液平衡；
[0298] 3.将以上组装装置1000g转速离心1分钟；重复步骤(2)和(3)各1次；
[0299] 4.混合10μl血清与10μl结合缓冲溶液，加入纯化柱的孔中；
[0300] 5.震荡器上缓慢震荡孵育纯化柱30分钟；
[0301] 6. 1000g离心纯化柱1分钟，收集样品溶液(置于96孔板)，重复上样1～2次；
[0302] 7.将纯化柱放在洗涤/收集板上，每孔中加入500μl结合缓冲溶液，1000g离心1分钟，本步骤重复3次；
[0303] 8.每个收集板中加入20μl结合缓冲溶液，将纯化柱放在收集板上，并在其每个孔中加入200-400μl淋洗缓冲溶液，缓慢震荡孵育1分钟，以1000g的转速离心1分钟，重复此步骤2次；用BCA试剂盒检测收集样品，确定IgG所处的收集液，收集纯化出的IgG蛋白；
[0304] 9.在纯化柱的每个孔中加入400μl淋洗缓冲溶液，洗涤3次，再用400μl 0.02％的叠氮化钠洗涤三次，使纯化柱再生；
[0305] 10.在纯化柱的每个孔中加入100μl叠氮化钠或结合缓冲溶液，盖上盖子，放入可密封的袋子中4℃保存。
[0306] (II)糖链的分离和纯化
[0307] A.通过糖苷酶处理，从IgG中游离糖链
[0308] 1.预先用70％的乙醇洗涤96孔板一次，再用超纯水洗涤2次；
[0309] 2.混合纯化的IgG样品溶液与糖苷酶(New England Biolabs公司，0705s)，200：1(v/v)；上述混合液加入96孔板(Corning，3504)，每个样品设3复孔；37℃反应12小时游离糖链。
[0310] B.多孔石墨化碳(PGC)固相萃取富集纯化糖链
[0311] 1.含0.1％的三氟醋酸的80％的乙腈水溶液活化含石墨化碳的96孔板；
[0312] 2.用0.1％的三氟醋酸水溶液平衡各孔；
[0313] 4.在酶解反应的96孔板加入去离子水，每孔150μl。然后将此板与含石墨化碳的96孔板组装，1000g离心，重复3次；
[0314] 5. 100μl去离子水洗涤杂质和盐，重复洗涤2次；
[0315] 6.用含0.05％的三氟醋酸的25％乙腈水溶液洗脱糖链并收集洗脱溶液，待分析检测。
[0316] (III)糖链的质谱定量分析
[0317] 取(II)中纯化的1μl N-糖链溶液及1μl基质(2,5-二羟基苯甲酸，10mg/ml溶于ACN/H2O/TFA(50/50/0.1,v/v/v))依次点在质谱靶板上，室温下晾干，再用乙醇重溶均一化，MALDI质谱检测糖链。质谱分析以TOFMix为质量校正标准品。
[0318] MALDI质谱测定条件：采用正离子反射模式；使用337nm的氮气激光源；激光能量设定为125V；样品采集模式为“auto experiment”；每张MS谱图为累计200profiles，2shot/profile；采集m/z范围为500-3000。
[0319] 三种类型半乳糖化糖链信号的确定方法：在质谱图中，不同半乳糖化的糖链(Gal0、Gal1、Gal2)有不同质荷比(m/z)，表现为不同的峰(见图1)。图1中Gal0峰出现在m/z 1485处，Gal1峰出现在m/z 1647处，Gal2峰出现在m/z 1809处。
[0320] 半乳糖化程度的判断方法：利用MALDI质谱技术对筛查对象血清IgG表面双天线复杂型N糖链末端半乳糖化程度进行定量分析比较，根据峰高或峰面积的大小计算血清的双天线复杂型N糖链末端去半乳糖与半乳糖糖链丰度比值(Gal ratio，Gal比)，并以此作为IgG表面半乳糖化量变指标。以下实施例中所用计算公式为：
[0321] Gal比值＝[Gal0/(Gal1+2*Gal2)]
[0322] 实施例1.Gal比用于恶性肿瘤的筛选/筛查
[0323] 采用如上所述的材料和方法测定对照血清样品(n＝924)和恶性肿瘤患者血清样品(n＝1737)中IgG半乳糖化程度。检测结果如下：
[0324] 1.通过观察总计2661例血清IgG N-糖链的MS谱图，可以发现Gal比在恶性肿瘤患者与对照之间存在明显差异。代表性谱图如图1所示。
[0325] 2.对2661例样本Gal比进行比较，同时进行受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)分析。结果显示：用Gal比作为肿瘤筛查指标，AUC为0.9385(95％置信区间：0.9125～0.9608)，在控制灵敏度为90％的情况下，相应特异度高达88％(见图2A)。参照AUC的判定标准(如下)，本指标作为诊断指标高度准确。
[0326] AUC的判定标准(Clin.Chem.2007，53：1615-22.)：ROC曲线在临床中常用于比较判断诊断指标对疾病的识别能力。理论上，当AUC(area-under-the-curve)≥0.9时，该诊断指标被认为是“高度准确”；当AUC介于0.7-0.9和0.5-0.7时，分别为“适用”和“无效”。
[0327] 3.从数值上看，恶性肿瘤患者的Gal比与对照样本差异极其显著(p值<0.0001)(见表3A)。
[0328] 4.同时，以阈值0.5(下文其它实施例中所做判断也均基于该阈值)作为判定该受试者患有恶性肿瘤或具有罹患恶性肿瘤的风险的标准，结果发现(见表3B)：
[0329] 1)在上述样本中，恶性肿瘤检出率可达88.72％左右；
[0330] 2)对某种特定肿瘤的检出率也明显高于现有经典指标，例如：
[0331] 在肝癌病例中，以Gal比与AFP作为独立诊断指标，检出率分别为93.98％和59.72％，在AFP阴性(<20ng/ml)的87例肝癌血清样本进行检测，本发明方法可检出72例；
[0332] 在卵巢癌中，以Gal比与CA125作为独立诊断指标，检出率分别为92.34％和69.79％，在CA-125阳性(>35U/ml)的249例妇科良性疾病患者血清中，本发明方法可检出
218例。
218例。
[0333] 表3A Gal比在恶性肿瘤患者与对照样本中的统计表
[0334]
[0335] *非恶样本：为健康人+良性对照
[0336] **P<0.0001表明具有统计学上极其显著差异
[0337] 表3B.肿瘤分类及各种指标检出率比较
[0338]
[0339] 注：其它癌症包括乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌。
[0340] 联合指标是指：将本发明的Gal比指标与现有经典指标联合用于检验
[0341] 以上结果表明，采用Gal比能高灵敏度、高特异性的有效地利用于恶性肿瘤的筛查，与现有经典标准相比，本发明的方法和指标具有更高的准确性。并且，将本发明的方法和指标与现有经典标准联合使用可进一步提高恶性肿瘤的检出率。
[0342] 实施例2.Gal比用于区分卵巢癌患者与对照(健康和良性疾病)
[0343] 获自卵巢癌患者的样本(n＝235)与对照(n＝924)所得AUC＝0.9486(95％置信区间：0.9329，0.9644)，参见图2B。
[0344] 卵巢癌患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)。(参见表3A)。
[0345] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分卵巢癌患者和对照。
[0346] 实施例3.Gal比用于区分肺癌患者与对照
[0347] 获自肺癌患者的样本(n＝206)与对照(健康人和良性疾病)(n＝924)所得AUC＝0.9578(95％置信区间：0.9433，0.9724)，参见图2C。
[0348] 肺癌患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)(参见表3A)。
[0349] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分肺癌患者与对照。
[0350] 实施例4.Gal比用于区分胃癌患者与对照
[0351] 获自胃癌患者的样本(n＝158)与对照(健康人和良性疾病)(n＝924)所得AUC＝0.9477(95％置信区间：0.9304，0.9650)，参见图2D。
[0352] 胃癌患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)(参见表3A)。
[0353] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分胃癌和对照。
[0354] 实施例5.Gal比用于区分肝癌患者与对照
[0355] 获自肝癌患者的样本(n＝216)与对照(健康和良性疾病)(n＝924)所得AUC＝0.9497(95％置信区间：0.9327，0.9667)，参见图2E。
[0356] 肝癌患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)(参见表3A)。
[0357] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分肝癌和对照。
[0358] 实施例6.Gal比用于区分肠癌患者与对照
[0359] 获自肠癌患者的样本(n＝204)与对照(健康和良性疾病)(n＝924)所得AUC＝0.9468(95％置信区间：0.9289，0.9647)，参见图2F。
[0360] 肠癌患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)(参见表3A)。
[0361] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分肠癌和对照。
[0362] 实施例7.Gal比用于区分各类恶性肿瘤与良性对照
[0363] 获自恶性肿瘤患者的样本(n＝1737)与良性疾病样本(n＝404)所得AUC＝0.9099(95％置信区间：0.8924～0.9275)(参见图2G)。
[0364] 恶性肿瘤患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)(参见表3A)。
[0365] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分恶性肿瘤患者和良性对照。
[0366] 实施例8.Gal比与经典指标联合使用具有更高的诊断价值
[0367] 如表3B所述，当Gal比与经典指标联合运用后能够提高在特定肿瘤中的检出率。在216例肝癌患者中，Gal比与AFP联合运用，检出率达到95.83％(两个指标中有一个阳性即判定为阳性)，高于Gal比(93.98％)与AFP(59.72％)分别独立检测；在158例胃癌患者中，Gal比与CEA联合运用，检出率达到91.14％，高于Gal比(88.61％)与CEA(59.49％)分别独立检测。
[0368] 综合上述数据，Gal比可与经典指标联合使用，增加恶性肿瘤检出率。
[0369] 实施例9.Gal比应用于早期诊断
[0370] 获自早期恶性肿瘤患者(即表2中肿瘤分期为Ⅰ)的样本(n＝231)与对照(健康和良性疾病)(n＝924)所得AUC＝0.8958(95％置信区间：0.8724，0.9192)，参见图2H。
[0371] 早期恶性肿瘤患者的Gal比均值与对照样本相比差异极其显著(t检验，p<0.0001)。
[0372] 上述分析证实了本发明的血清IgG半乳糖化指标能以高灵敏度和特异度有效地筛查并区分早期恶性肿瘤和对照。
[0373] 实施例10.Gal比应用于监测肿瘤预后
[0374] 对78例行规范手术方案治疗的胃癌患者随访监测研究，以检验血液中Gal比与患者病情变化的相关性，检测周期为每3个月一次。
[0375] 根据病理学诊断、临床生化以及影像学资料评价术后肿瘤的复发情况。结果表明，在术后3年时间内，共有25例复发，其中在明确肿瘤复发诊断前，有23例Gal比阳性(检出率为92.0％)。
[0376] 以上数据证明了本发明方法在肿瘤的预后检测中具有重要的价值。
[0377] 实施例11.Gal比用于预测恶性肿瘤的发生
[0378] 对于4217例高危人群的血清样本进行监测，并进行6个月到3年不等的有效跟踪随访，随访结果发现Gal比阴性组3780人中无肿瘤患者发现，阳性组437人中发现肿瘤病人47例，两组肿瘤发生率差异显著。
[0379] 据此，Gal比检测可用于预测恶性肿瘤的发生。
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